JP2003504414A - Ｐｓｃａ：前立腺幹細胞抗原およびその使用 - Google Patents

Ｐｓｃａ：前立腺幹細胞抗原およびその使用

Info

Publication number
JP2003504414A
JP2003504414A JP2001510481A JP2001510481A JP2003504414A JP 2003504414 A JP2003504414 A JP 2003504414A JP 2001510481 A JP2001510481 A JP 2001510481A JP 2001510481 A JP2001510481 A JP 2001510481A JP 2003504414 A JP2003504414 A JP 2003504414A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
psca
pharmaceutical composition
antibody
cells
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2001510481A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3895988B2 (ja
Inventor
ロバート レイター，
オウエン ウィッテ，
ダグラス シー． サフラン，
アヤ ジャコボヴィッツ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Original Assignee
THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA filed Critical THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Publication of JP2003504414A publication Critical patent/JP2003504414A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3895988B2 publication Critical patent/JP3895988B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/106—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from kidney or bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1072—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from the reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes or prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）と命名された新規な前立腺細胞表面抗原を提供し、これは、高い段階の前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、アンドロゲン依存性前立腺腫瘍およびアンドロゲン非依存性前立腺腫瘍を含む、前立腺癌の全段階にわたって越えて広範に過剰発現される。本発明の１つの実施形態において、被験体における前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の血清レベルを減少させるための薬学的組成物が提供され、この薬学的組成物は、成熟前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）タンパク質を認識し結合する抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントを含有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願を通して、種々の刊行物が括弧内で言及される。これらの刊行物の開示
は、それにより、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】 （発明の背景） 癌は、冠状動脈疾患に次いで２番目の、人の主な死因である。世界中で、何百
万もの人々が、毎年、癌によって死んでいる。米国だけでは、癌は、毎年約５０
万人をゆうに超える人々の死亡を引き起こし、１年あたりほぼ１４０万の新たな
症例が診断される。心臓疾患による死亡は顕著に減少しているとはいえ、癌によ
る死亡は徐々に増加している。次世紀の初めには、癌は、主な死因になると予測
されている。
【０００３】 世界中で、いくつかの癌が、主な致命的なものとして突出している。特に、肺
、前立腺、乳房、結腸、膵臓および卵巣の癌は、癌による死亡の主な原因を表す
。これらの、および実質的に全ての他の癌は、共通の致死的特徴を共有する。非
常に少ない例外があるが、癌からの転移性疾患が致死的である。さらに、その原
発性癌を最初に生き伸びる癌患者についてさえも、肝臓が劇的に変更されるとい
う共通の経験が示された。多くの癌患者は、再発または処置の失敗の可能性に気
付くことによって強い不安を経験する。多くの癌患者は、処置後の顕著な身体的
衰弱を経験する。
【０００４】 一般的にいって、最も死にそうな（ｄｅａｄｌｉｅｓｔ）癌の管理における基
本的問題は、有効でかつ非毒性の全身治療がないことである。分子薬剤は、その
乳児期において非常に多いが、これらの癌が管理される方法を再検討することを
約束する。疑いなく、癌の診断および処置に対する新規な分子的アプローチの開
発を目的とした、世界中でのかなりの努力が存在する。例えば、診断および予後
のマーカーおよび／または治療の標的もしくは薬剤として用いられ得る、本当に
腫瘍特異的な遺伝子およびタンパク質を同定することに大きな興味がある。これ
らの領域における研究努力は助長されており、そして有用な分子技術の利用可能
性が増加し続けていることは、癌についての意義のある知識の獲得を加速した。
それにもかかわらず、進歩はゆっくりであり、そして一般に一様でない。
【０００５】 近年、種々の免疫治療ストラテジーまたは低分子処置ストラテジーのための標
的として有用であり得る、細胞表面の腫瘍特異的抗原を同定することに特に強力
な興味が存在している。多数のこのような細胞表面抗原が報告されており、そし
ていくつかは、１以上の癌と信頼性良く関連することが証明されている。これら
の抗原を標的とする新規な治療ストラテジーの開発に多くの注目が集中している
。しかし、真に有効な免疫学的癌治療はほとんどもたらされていない。
【０００６】 固形癌の処置における腫瘍特異的抗原または過剰発現される抗原に対するモノ
クローナル抗体の使用は有用である。抗体治療はほぼ２０年間充分に調査されて
いるが、非常にごく近年になって対応する薬剤が実現した。１つの例は、ＨＥＲ
２／ｎｅｕレセプターを過剰発現する転移性乳がんの処置における使用が近年承
認された、ヒト化抗ＨＥＲ２／ｎｅｕモノクローナル抗体であるＨｅｒｃｅｐｔ
ｉｎである。別の例は、非ホジキンリンパ腫の処置について承認された、ヒト／
マウスキメラ抗ＣＤ２０／Ｂ細胞リンパ腫抗体Ｒｉｔｕｘａｎである。いくつか
の他の抗体は、上皮増殖因子レセプターについて特異的な、キメラの、および完
全にヒトの、ＩｇＧ２モノクローナル抗体を含めて、臨床試験または前臨床研究
において癌の処置について評価されている（Ｓｌｏｖｉｎら、１９９７、Ｐｒｏ
ｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６：３１１；Ｆａｌｃｅｙら、１
９９７、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６：３８３；Ｙａ
ｎｇら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：１２３６）。明らかに、抗体
治療は、長い胎児段階から最終的に出現している。それにもかかわらず、抗体お
よび他の生物学的治療の適用のための、新たな、より特異的な腫瘍抗原について
の非常に大きな必要性が存在する。さらに、できれば、より早期の診断およびよ
り大きな予後判断の精度の開発をもたらす、抗体に基づく診断方法および画像化
方法のためのマーカーとして有用であり得る腫瘍抗原についての対応する必要性
が存在する。
【０００７】 以下で考察するように、前立腺癌の管理は、分子生物学が、診療所における真
の進歩へと移される制限された程度の良好な例として役立つ。限られた例外はあ
るが、この状況は、上記の他の主要な癌についても多かれ少なかれ同じである。
【０００８】 世界中で、前立腺癌は、ヒトにおいて４番目に有病率の高い癌である。北アメ
リカおよび北ヨーロッパでは、前立腺癌は、男性の断然最も普通の癌であり、そ
してヒトにおける癌による２番目の主な死因である。米国だけで、４０，０００
万人をゆうに超える人々がこの疾患によって毎年死亡しており、肺癌だけについ
て２番目である。これらの数字の大きさにもかかわらず、転移性前立腺癌につい
ての有効な処置は依然として存在しない。外科的前立腺切除、放射線療法、ホル
モン除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）治療、および化学療法は、主な処置様式として残
っている。不幸にも、これらの処置は多くについては明らかに無効である。さら
に、これらの処置はしばしば、かなりの望ましくない結果を伴う。
【０００９】 診断の前面では、血清ＰＳＡアッセイが非常に有用なツールである。それにも
かかわらず、ＰＳＡの特異性および一般的有用性は、いくつかの点を欠くと広範
に考えられている。ＰＳＡ試験も、他の任意の試験も生物学的マーカーのいずれ
も、初期段階の疾患を信頼性高く同定し得ると証明されている。同様に、代表的
に致死的な転移性段階のこの疾患の出現を予測するために利用可能なマーカーは
存在しない。転移性前立腺癌の診断は、開放的外科的骨盤リンパ切除または腹腔
鏡下骨盤リンパ切除、全身放射性核種スキャン、骨格Ｘ線撮影、および／または
骨病巣生検分析によって達成される。明らかに、より良好な画像化および他のよ
り侵襲性でない診断方法は、患者に対してこれらの手順が与える困難を容易にす
る見込み、ならびに治療選択肢を改善する見込みを提供する。しかし、初期の疾
患を信頼性良く同定し得る前立腺腫瘍マーカー、転移に対する感受性を予測する
こと、および腫瘍を正確に画像化することが存在するまでは、前立腺癌の管理は
極めて困難であり続ける。従って、より特異的な分子腫瘍マーカーは、前立腺癌
の管理において明確に必要とされる。
【００１０】 前立腺において主に発現される、いくつかの公知のマーカー（例えば、前立腺
特異的膜抗原（ＰＳＭ）、ラットニューロペプチダーゼに対する８５％同一性を
有するヒドロラーゼ）が存在する（Ｃａｒｔｅｒら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７４９；Ｂｚｄｅｇａら、１９９７、
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：２２７０）。しかし、小腸および脳（Ｉｓｒａ
ｅｌｉら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１８０７）におけるＰＳＭ
の発現は、脳における神経ペプチド異化におけるその潜在的役割と同様に、抗Ｐ
ＳＭ治療を用いた潜在的神経毒性の関心を高める。再発性の前立腺癌を画像化す
るためにインジウム−１１１で標識した抗ＰＳＡモノクローナル抗体を用いた予
備的な結果は、いくらかの見込みを示す（Ｓｏｄｄｅら、１９９６、Ｃｌｉｎ
Ｎｕｃ Ｍｅｄ ２１：７５９−７６６）。より近年同定された前立腺癌マーカ
ーとしては、ＰＣＴＡ−１（Ｓｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７２５２）が挙げられる。ＰＣＴＡ−１は、新規なガ
レクチンであり、発現する細胞の培地中に大部分が分泌され、そして前立腺癌に
ついての診断血清マーカーとしての見込みを保持し得る（Ｓｕら、１９９６）。
前立腺癌についてのワクチンもまた、ＰＳＭおよびＰＳＡを含めて、種々の抗原
を用いて活発に探索されている。
【００１１】 （発明の要旨） 本発明は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）と称され、高い程度の前立腺上皮内
新形成（ＰＩＮ）、アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の前立腺腫
瘍を含むすべての段階の前立腺癌で広く過剰発現する、新規の前立腺細胞表面抗
原を提供する。ＰＳＣＡ遺伝子は、グリコシルホスファチジルイノシトール（Ｇ
ＰＩ）係留細胞表面抗原のＴｈｙ−１／Ｌｙ−６ファミリーのメンバーである幹
細胞抗原−２（ＳＣＡ−２）に対して３０％の相同性を示し、アミノ末端シグナ
ル配列、カルボキシ末端ＧＰＩ係留配列、および複数のＮ−グリコシル化部位を
有する１２３アミノ酸のタンパク質をコードする。ＰＳＣＡ ｍＲＮＡ発現は、
アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の両方の前立腺癌の異種移植片
において、高度に上方制御される。インサイチュでのｍＲＮＡ分析は、前立腺の
推定幹細胞区画である基底細胞上皮にＰＳＣＡ発現を位置決定する。フローサイ
トメトリー分析は、ＰＳＣＡが主に細胞表面で発現され、そしてＧＰＩ連結によ
り係留されることを実証する。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション分析は
、８０％を超える前立腺癌において得られる対立遺伝子（ａｌｌｅｌｉｃ ｇａ
ｉｎ）領域である、染色体８ｑ２４．２に対してＰＳＣＡ遺伝子を位置決定する
。
【００１２】 ＰＳＣＡは、その細胞表面位置、前立腺癌細胞のような特定の型の癌における
非常に上方制御された発現の観点から最適な治療標的であり得る。この点におい
て、本発明は、そのような癌細胞の増殖を破壊もしくは阻害するために、または
ＰＳＣＡ活性をブロックするために治療的に使用できるＰＳＣＡに結合可能な抗
体を提供する。加えて、ＰＳＣＡタンパク質およびＰＳＣＡコード核酸分子は、
ＰＳＣＡを発現する腫瘍の免疫媒介破壊または増殖阻害を促進する種々の免疫治
療方法に使用され得る。
【００１３】 ＰＳＣＡはまた、理想の前立腺癌マーカーを示し得、それは、悪性の前立腺癌
と、正常な前立腺と非悪性新形成とを識別するために使用され得る。例えば、Ｐ
ＳＣＡは、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）と比較して前立腺癌で非常に高いレベ
ルで発現される。対照的に、広範に使用される前立腺癌マーカーＰＳＡは、正常
な前立腺およびＢＰＨの両方で高いレベルで発現されるが、前立腺癌ではより低
いレベルで発現され、ＰＳＡ発現をＢＰＨまたは正常な腺と悪性の前立腺癌とを
区別するために役に立たなくする。ＰＳＣＡの発現は、本質的にＰＳＡの発現の
逆であるから、ＰＳＣＡの発現の分析は、非悪性状態と前立腺癌とを区別するた
めに使用され得る。
【００１４】 ヒトおよびマウスの両方のＰＳＣＡコード遺伝子が単離され、そしてそれらの
コード配列は本明細書中で解明され、そして提供される。ヒトおよびマウスの両
方のＰＳＣＡのアミノ酸配列もまた提供される。本発明はさらに、核酸に基づい
たアッセイおよび免疫学的なアッセイを含む、前立腺癌の検出、モニタリング、
および予後のための種々の診断アッセイを提供する。ＰＳＣＡ特異的モノクロー
ナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに前立腺癌の処置の免疫治療方法お
よび他の治療方法もまた提供される。本発明のこれらの局面および他の局面は、
さらに以下に記載される。 （発明の詳細な説明） 本発明は、前立腺幹細胞抗原（本明細書中以降「ＰＳＣＡ」）に関する。ＰＳ
ＣＡは新規の、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−固着細胞表
面抗原であり、これは、正常な細胞（例えば、前立腺細胞、尿路上皮、腎集合管
、結腸神経内分泌細胞、胎盤、正常な膀胱細胞および尿管移行上皮細胞）におい
て発現される（図１６）。正常な細胞に加えてＰＳＣＡはまた、アンドロゲン依
存性前立腺癌細胞およびアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞の両方（図９〜１１
）、骨に転移する前立腺癌（図２０〜２４および２６〜３２）、膀胱癌腫（図６
、２５および２６）ならびに膵臓癌腫（図６３および６４）によって過剰発現さ
れる。癌（例えば、前立腺癌および膀胱癌）におけるＰＳＣＡの発現は、増加す
る悪性度分類（ｇｒａｄｅ）と相関するようである。さらに、癌（例えば、前立
腺癌）を罹患する患者におけるＰＳＣＡの過剰発現（すなわち、正常な細胞にお
いて見い出される発現より高い発現）は、不良な予後の指標であるようである。
【００１５】 ＰＳＣＡ ｍＲＮＡはまた、正常な前立腺において基底細胞のサブセットによ
り発現される。基底細胞上皮は、末期の分化型分泌細胞についての前駆体細胞を
含むと考えられる（Ｂｏｎｋｈｏｆｆら、１９９４，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２４：
１１４〜１１８）。サイトケラチンマーカーを使用した最近の研究は、基底細胞
上皮が少なくとも２つの異なる細胞部分集団を含み、１つはサイトケラチン５お
よび１４を発現し、そしてもう一方は、サイトケラチン５、８および１８を発現
することを示唆する（ＢｏｎｋｈｏｆｆおよびＲｅｍｂｅｒｇｅｒ、１９９６、
Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２８：９８〜１０６）。ＰＳＣＡは、基底細胞の１つのサブ
セットにしか発現されないという知見は、ＰＳＣＡが、それら２つの基底細胞系
統のうちの１つに対するマーカーであり得ること示唆する。
【００１６】 ＰＳＣＡの生物学的機能は知られていない。Ｌｙ−６遺伝子ファミリーは、シ
グナル伝達および細胞−細胞の接着を含む、多様な細胞機能に関与する。ＳＣＡ
−２を通じたシグナル伝達は、未成熟の胸腺細胞におけるアポトーシスを妨ぐこ
とが示されている（Ｎｏｄａら、１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２３
５５〜２３６０）。Ｔｈｙ−１は、Ｔ細胞の活性化に関与し、ｓｒｃ様チロシン
キナーゼを通じてシグナルを伝達する（Ｔｈｏｍａｓら、１９９２，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２３１７〜１２３２２）。Ｌｙ−６遺伝子は、腫瘍形
成および同型の細胞の接着の両方に関係している（ＢａｍｅｚａｉおよびＲｏｃ
ｋ，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４２９
４〜４２９８；Ｋａｔｚら、１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５９：６８
４〜６９１；Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆら、１９９５，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１
２９：１６７７〜１６８９）。基底細胞、および基底細胞における制限された発
現とそのＳｃａ−２との相同性に基づいて、本発明者らは、ＰＳＣＡが、幹細胞
機能／前駆体細胞機能（例えば、自己再生（抗アポトーシス）および／または増
殖）において役割を果し得るという仮説を立てた。
【００１７】 ＰＳＣＡは、マウスおよびヒトにおいて高度に保存される。前立腺に主に制限
される保存された遺伝子の同定は、ＰＳＣＡが正常な前立腺の発達において重要
な役割を果し得るという仮説を支持する。
【００１８】 種々の局面において、以下に詳細に記載されるように、本発明は、ＰＳＣＡタ
ンパク質、抗体、核酸分子、組換えＤＮＡ分子、形質転換宿主細胞、産生方法、
アッセイ、免疫的治療法、トランスジェニック動物、免疫学的アッセイおよび核
酸に基づくアッセイ、ならびに組成物を提供する。
【００１９】 （ＰＳＣＡタンパク質） 本発明の１つの局面は、種々のＰＳＣＡタンパク質、およびそのペプチドフラ
グメントを提供する。本明細書中で使用される場合、ＰＳＣＡは、図１Ｂおよび
３に提供されるような、ヒトＰＳＣＡのアミノ酸配列、図３に提供されるような
マウスＰＳＣＡホモログのアミノ酸配列、または他の哺乳動物のＰＳＣＡホモロ
グのアミノ酸配列を有するタンパク質、ならびにＰＳＣＡ活性を有するそれらタ
ンパク質の対立遺伝子改変体、および保存的置換変異体をいう。本発明のＰＳＣ
Ａタンパク質には、具体的に同定され、かつ特徴づけられた本明細書中に記載さ
れる改変体ならびに下記に要約される以下の方法に従って過度の実験をせずに単
離／産生され、そして特徴づけられ得る対立遺伝子改変体、保存的置換改変体お
よびホモログが挙げられる。便宜のため、全てのＰＳＣＡタンパク質は集合的に
ＰＳＣＡタンパク質、本発明のタンパク質、またはＰＳＣＡといわれる。
【００２０】 用語「ＰＳＣＡ」は、図１Ｂおよび３に提供されるような、ヒトＰＳＣＡの全
ての天然に存在する対立遺伝子改変体、アイソフォーム、および前駆体、ならび
に図３に提供されるようなマウスのＰＳＣＡを含む。一般的に、例えば、天然に
存在するヒトＰＳＣＡの対立遺伝子改変体は、図１Ｂおよび３において提供され
るＰＳＣＡアミノ酸配列と有意な相同性（例えば、７０〜９０％）を共有する。
対立遺伝子改変体は、わずかに異なるアミノ酸配列を有するが、ＧＰＩ結合タン
パク質として前立腺細胞の表面で発現され得るか、または分泌され得るか、もし
くは解離され得る。典型的に、ＰＳＣＡタンパク質の対立遺伝子改変体は、本明
細書中に記載のＰＳＣＡ配列からの保存的アミノ酸の置換を含むか、またはＰＳ
ＣＡホモログ（例えば、本明細書中に記載のマウスＰＳＣＡホモログ）に対応す
る位置からのアミノ酸の置換を含む。
【００２１】 ＰＳＣＡ対立遺伝子改変体の１つのクラスは、図１Ｂおよび３に示されるＰＳ
ＣＡアミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高い程度の相同性を共有するタンパ
ク質であるが、さらにその配列由来の遊離基離脱（例えば、非保存的置換、短縮
、挿入またはフレームシフト）を含む。このような対立遺伝子は、ＰＳＣＡの変
異体対立遺伝子と呼ばれ、そして典型的に、同じ生物学的機能を行わないタンパ
ク質を表す。
【００２２】 保存的アミノ酸置換は、タンパク質中において、しばしばタンパク質の高次構
造またはタンパク質の機能のいずれかを変化させずになされ得る。このような変
化には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のいずれか
への、これらの疎水性アミノ酸の他の任意のアミノ酸の置換；グルタミン（Ｅ）
のアスパラギン酸（Ｄ）への置換、およびその反対の置換；アスパラギン（Ｎ）
のグルタミン（Ｑ）への置換、ならびにその反対の置換；およびスレオニン（Ｔ
）のセリン（Ｓ）への置換、およびその反対の置換が挙げられる。特定のアミノ
酸の環境、およびタンパク質の三次構造におけるそのアミノ酸の役割に依存して
、他の置換はまた、保存的であるとみなされ得る。例えば、グリシン（Ｇ）とア
ラニン（Ａ）は互換可能で有り得、しばしばアラニン（Ａ）とバリン（Ｖ）も互
換可能であり得る。比較的疎水性のメチオニン（Ｍ）は、しばしばロイシンおよ
びイソロイシン、そして時にはバリンと互換され得る。リジン（Ｋ）およびアル
ギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の有意な特徴がその電荷であり、かつこれら２つ
のアミノ酸残基の異なったｐＫが有意でない位置においてしばしば互換可能であ
る。なお他の変化は、特定の環境中において「保存的」であるとみなされ得る。
【００２３】 ヒトＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸配列は、図１Ｂおよび３に提供される。ヒ
トＰＳＣＡは、１２３個のアミノ酸の単一のサブユニットから構成され、そして
アミノ末端シグナル配列、カルボキシ末端ＧＰＩ固着配列および多重Ｎグリコシ
ル化部位を含む。ＰＳＣＡは、造血発達の最初期段階を特徴付ける細胞表面タン
パク質の群であるＴｈｙ−１／Ｌｙ−６遺伝子ファミリーのメンバーである幹細
胞抗原−２（ＳＣＡ−２）と３０％の相同性を示す。マウスＰＳＣＡホモログの
アミノ酸配列は、図３に示される。マウスのＰＳＣＡは、ヒトＰＳＣＡおよび類
似構造の生物とおよそ７０％の相同性を有する１２３個のアミノ酸の単一のサブ
ユニットタンパク質である。
【００２４】 ＰＳＣＡタンパク質は、多くの形態で、好ましくは単離された形態で具体化さ
れ得る。本明細書中で使用される場合、タンパク質は、物理的方法、機械的方法
または化学的方法を使用して、通常タンパク質に付随する細胞構築物からＰＳＣ
Ａタンパク質を除去した場合、単離されたと言われる。当業者は、標準的精製方
法を容易に使用し、単離されたＰＳＣＡタンパク質を入手し得る。精製されたＰ
ＳＣＡタンパク質分子は、抗体または他のリガンドへのＰＳＣＡの結合を損なう
他のタンパク質または分子を実質的に含まない。単離および精製の性質ならびに
程度は、意図された使用に依存する。ＰＳＣＡタンパク質の実施形態は、精製さ
れたＰＳＣＡタンパク質および機能的な可溶性のＰＳＣＡタンパク質を含む。機
能的な可溶性のＰＳＣＡタンパク質の１つの例は、図１Ｂにおいて示されるアミ
ノ酸配列、またはそのフラグメントを有する。１つの形態において、そのような
機能的な可溶性のＰＳＣＡタンパク質またはそのフラグメントは、抗体または他
のリガンドを結合する能力を保持する。
【００２５】 本発明はまた、図１Ｂおよび３に示されるヒトおよびマウスのＰＳＣＡアミノ
酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含むペプチドを提供する。例えば、本
発明は、アミノ酸配列ＴＡＲＩＲＡＶＧＬＬＴＶＩＳＫを有するペプチドフラグ
メント、アミノ酸配列ＶＤＤＳＱＤＹＹＶＧＫＫおよびＳＬＮＣＶＤＤＳＱＤＹ
ＹＶＧＫを有するペプチドフラグメントを提供する。
【００２６】 本発明のペプチドは、ＰＳＣＡに関連するエピトープと特異的に結合する抗体
の産生を誘導する能力のような、ＰＳＣＡの特性を示す。ＰＳＣＡタンパク質の
そのようなペプチドフラグメントは、標準のペプチド合成技術および本明細書中
に開示されるヒトＰＳＣＡタンパク質またはマウスＰＳＣＡタンパク質のアミノ
酸配列を用いて産生され得る。あるいは、組換え方法が、このＰＳＣＡタンパク
質のフラグメントをコードする核酸分子を産生するために使用され得る。この点
に関して、本明細書中に記載されるＰＳＣＡコード核酸分子は、ＰＳＣＡの規定
されたフラグメントを産生するための手段を提供する。
【００２７】 以下に議論されるように、ＰＳＣＡのペプチドフラグメントは、：ドメイン特
異的抗体の産生；ＰＳＣＡまたはＰＳＣＡドメインに結合する因子の同定；ＰＳ
ＣＡまたはＰＳＣＡドメインに結合する細胞因子の同定；およびヒトＰＳＣＡの
ホモログまたは他の対立遺伝子型の単離において、特に有用である。特に興味深
い構造を含むＰＳＣＡペプチドは、当該分野で周知の種々の分析技術（例えば、
Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ分析、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ分析、Ｋｙｔｅ−
Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ分析、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ分析、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕ
ｌｔｚ分析またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析、あるいは免疫原性に基づく方
法が挙げられる）を使用して予想および／または同定され得る。例として、ヒト
ＰＳＣＡの疎水性プロットおよびＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎプロットは、それぞれ
、図４および５に提供される。そのような残基を含むフラグメントは、サブユニ
ット特異的抗ＰＳＣＡ抗体の産生またはＰＳＣＡに結合する細胞因子の同定にお
いて特に有用である。
【００２８】 ＰＳＣＡタンパク質の様々な領域は、抗ＰＳＣＡ抗体に結合し得る。このＰＳ
ＣＡタンパク質の領域は、例えば、Ｎ末端領域、中間領域、およびＣ末端領域を
含み得る（実施例１８、図４９）。このＮ末端領域は、アミノ酸残基２−５０、
好ましくは、残基１８−５０に含まれるＰＳＣＡタンパク質の任意の部分を含む
。この中間領域は、アミノ酸残基４６−１０９、好ましくは、残基４６−９８に
含まれるＰＳＣＡタンパク質の任意の部分を含む。このＣ末端領域は、アミノ酸
残基８５〜１２３、好ましくは、残基８５〜９８に含まれるＰＳＣＡタンパク質
の任意の部分を含む。
【００２９】 本発明のＰＳＣＡタンパク質は、以下に挙げられる使用を含む、種々の目的に
対して有用であり得るが、これらの使用に限定されない：前立腺癌の診断および
／または予後のマーカーとして、抗体の産生を誘導するための能力の診断および
／または予後のマーカーとして、ならびに以下にさらに記載されるような種々の
治療的物理療法に対する標的として。ＰＳＣＡタンパク質はまた、ＰＳＣＡに結
合するリガンドおよび他の因子を同定および単離するために使用され得る。正常
な前立腺において、ＰＳＣＡは、基底細胞のサブセットにもっぱら発現し、これ
は、ＰＳＣＡが、基底上皮内の特定の細胞系に関してマーカーとして使用され得
ることを示唆する。さらに、本出願者らの結果は、基底細胞のこのセットが、悪
性形質転換の標的を表すことを示唆する。従って、例えば、形質転換の原因であ
る分子因子を除去または調節するように設計された治療的な戦略は、ＰＳＣＡ細
胞表面タンパク質を介して細胞のこの集団を特異的に指向し得る。
【００３０】 （ＰＳＣＡ抗体） 本発明はさらに、ＰＳＣＡに結合する抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体）を提供する。最も好ましい
抗体は、選択的にＰＳＣＡへ結合し、そして非ＰＳＣＡタンパク質に結合しない
（またはより弱く結合する）。最も好ましい抗体は、ＰＳＣＡに特異的に結合す
る。用語「特異的に結合する」は、抗体が優性にＰＳＣＡに結合することを意味
することが意図される。特に意図された抗ＰＳＣＡ抗体は、モノクローナル抗体
およびポリクローナル抗体ならびにそれらのフラグメント（例えば、組換えタン
パク質）を含み、このフラグメントは、抗原結合ドメインおよび／またはこれら
の抗体の１つ以上の補体決定領域を含む。これらの抗体は、任意の供給源（例え
ば、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、マウス、およびヒト）由来であり得る。
【００３１】 １つの実施形態において、このＰＳＣＡ抗体は、例えば、初代病巣および前立
腺癌骨転移由来の前立腺癌細胞の細胞表面上のＰＳＣＡタンパク質の細胞外ドメ
インに特異的に結合する。用語「細胞外ドメイン」は、細胞の形質膜に対して外
部であるＰＳＣＡタンパク質の任意の部分を意味することが意図される。他の実
施形態において、このＰＳＣＡ抗体は、ＰＳＣＡタンパク質または前駆体（例え
ば、Ｎ末端領域、中間領域、またはＣ末端領域の部分；図４９）の他のドメイン
に特異的に結合する。当業者によって理解されるように、抗体が指向するＰＳＣ
Ａタンパク質の領域またはエピトープは、意図された適用により変化し得る。例
えば、生存可能な前立腺癌細胞上の膜結合ＰＳＣＡの検出のためのイムノアッセ
イにおける使用を意図される抗体は、膜結合ＰＳＣＡ上の到達可能なエピトープ
に指向されるべきである。そのような抗体の例は、以下の実施例に記載される。
他のエピトープを認識する抗体は、損傷した細胞または瀕死の細胞中のＰＳＣＡ
の同定のため、分泌されたＰＳＣＡタンパク質またはそのフラグメントの検出の
ために有用であり得る。本発明はまた、ＰＳＣＡタンパク質を特異的に認識する
抗体フラグメントを含む。本明細書中で使用される場合、抗体フラグメントとは
、その標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも部分（すなわ
ち、抗原結合領域）であるとして定義される。免疫グロブリンの定常領域のいく
つかが、含まれ得る。
【００３２】 例えば、アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の前立腺癌細胞の両
方におけるＰＳＣＡの過剰発現、およびＰＳＣＡの細胞表面位置は、スクリーニ
ングアッセイ、診断アッセイ、予後アッセイおよび追跡（ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ）
アッセイおよび画像化方法のための優れたマーカーの特徴を示す。さらに、これ
らの特徴は、ＰＳＣＡが、標的抗体療法、免疫療法、および遺伝子療法のような
治療方法のための優れた標的であり得ることを示す。
【００３３】 本発明のＰＳＣＡ抗体は、前立腺癌の治療技術における診断アッセイ、画像化
方法論、および治療的方法において、特に有用であり得る。本発明は、ＰＳＣＡ
タンパク質の検出および前立腺癌の診断に有用な、種々の免疫学的アッセイを提
供する。そのようなアッセイは、一般的に、ＰＳＣＡタンパク質を認識し結合し
得る１つ以上のＰＳＣＡ抗体を含み、そして以下に挙げられる当該分野で周知の
種々の免疫学的アッセイ形式を含むが、これらに限定されない：種々の型の沈降
、凝集、補体結合、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光測定法（ＥＬＩＦＡ）（Ｈ．Ｌｉｕら、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：４０５５−４０６０（１９９８））、免疫組織
化学的分析など。さらに、前立腺癌を検出し得る免疫学的画像化方法もまた、本
発明によって提供され、標識したＰＳＣＡ抗体を用いた放射性シンチグラフィー
（ｒａｄｉｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ）画像化方法を含むがこれに限定され
ない。このようなアッセイは、前立腺癌の検出、モニタリングおよび予後におい
て、臨床的に有用であり得る。
【００３４】 １つの実施形態において、ＰＳＣＡ抗体およびそのフラグメント（例えば、Ｆ
ｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）は、前立腺癌、膀胱癌腫、前立腺癌の骨転移、
ＰＩＮ、またはＰＳＣＡタンパク質を発現する基底上皮細胞の存在を検出するこ
とに使用される。種々の生物学的サンプル（血清、前立腺および他の組織生検標
本、骨のような他の組織、尿などが挙げられる）中の、そのようなＰＳＣＡ陽性
（＋）細胞の存在は、ＰＳＣＡ抗体を用いて検出され得る。さらに、ＰＳＣＡ抗
体は、インジウム−１１１（または他の同位体）結合抗体を用いた免疫シンチグ
ラフィーのような、種々の画像化方法論において使用され得る。例えば、Ｉｎ−
１１１結合抗ＰＳＭＡ抗体を用いる最近記載されたプロトコールに類似した画像
化プロトコールを、再発性および転移性の前立腺癌腫の検出に使用し得る（Ｓｏ
ｄｅｅら、１９９７、Ｃｌｉｎ Ｎｕｃ Ｍｅｄ ２１：７５９−７６６）。例
えば、ＳＰＭＡのような前立腺癌の他のマーカーに関連して、ＰＳＣＡは、アン
ドロゲン非依存性の前立腺癌細胞の標的化のために特に有用であり得る。ＰＳＣ
Ａ抗体はまた、ＰＳＣＡ機能を阻害するために治療的に使用され得る。
【００３５】 ＰＳＣＡ抗体はまた、ＰＳＣＡタンパク質およびペプチドの精製のための方法
ならびにＰＳＣＡホモログおよび関連する分子の単離のための方法において使用
され得る。例えば、１つの実施形態において、ＰＳＣＡタンパク質を精製する方
法は、以下の工程を包含する：固体マトリックス結合したＰＳＣＡ抗体を、ＰＳ
ＣＡを含む溶解物または他の溶液とともに、そのＰＳＣＡ抗体がＰＳＣＡに結合
することを可能にする条件下でインキュベートする工程；不純物を除去するため
に固体マトリックスを洗浄する工程；そしてそのＰＳＣＡを結合した抗体から溶
出する工程。さらに、ＰＳＣＡ抗体は、細胞ソーティング（ｓｏｒｔｉｎｇ）お
よび精製技術を用いてＰＳＣＡ陽性細胞を単離するために使用され得る。前立腺
腫瘍細胞上のＰＳＣＡ（単独または他の細胞表面マーカーとの組み合わせ）の存
在は、ヒト前立腺癌細胞を他の細胞から区別し、そして単離するために使用され
得る。特に、ＰＳＣＡ抗体は、抗体に基づく細胞ソーティングまたはアフィニテ
ィー精製技術を使用して異種移殖腫瘍組織、培養中の細胞などから前立腺癌細胞
を単離するために使用され得る。本発明のＰＳＣＡ抗体の他の使用は、ＰＳＣＡ
タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体の産生を含み、例えば、モノクロー
ナル抗イディオタイプ抗体は、１Ｇ８、２Ａ２、２Ｈ９、３Ｃ５、３Ｅ６、３Ｇ
３および４Ａ１０のような本発明の任意のモノクローナル抗体上のイディオタイ
プと反応性である。
【００３６】 多量の比較的に純粋なヒトＰＳＣＡ陽性前立腺癌細胞（これは、組織培養にお
いて増殖し得るかまたは動物モデル（例えば、ＳＣＩＤマウスまたは他の免疫不
全マウス）における異種移植腫瘍として増殖し得る）を産生する能力は、多くの
利点を提供し、例えば、前立腺癌細胞の比較的に均質な集団の増殖または他の表
現型特徴に対する種々の導入遺伝子または候補治療的化合物の評価を可能にする
ことが挙げられる。さらに、本発明の特徴はまた、種々の分子操作のために十分
な量の、ヒトＰＳＣＡ陽性前立腺癌特異的核酸の非常に濃縮した調製物の単離を
可能にする。例えば、多量なそのような核酸調製物は、前立腺癌疾患の進行に生
物学的に関連した珍しい遺伝子の同定を補助する。
【００３７】 本発明のこの局面の別の価値がある適用は、局所的に進行した疾患または転移
性の疾患を有する個体患者からクローン化した生存可能なＰＳＣＡ陽性前立腺癌
細胞の比較的に純粋な調製物を単離し、分析しそしてそれを用いて実験する能力
である。このようにして、例えば、個々の患者の前立腺癌細胞は、制限された生
検サンプルから増殖され得、次いで、潜在的に混乱させる混入している細胞とい
う変数を伴わずに、診断および予後の遺伝子、タンパク質、染色体異常、遺伝子
発現プロフィール、または他の関連する遺伝型および表現型の特徴の存在につい
て試験される。さらに、そのような細胞は、動物モデルにおいて、新生物の攻撃
性および転移性能力について評価され得る。同様に、患者特異的な前立腺癌ワク
チンおよび細胞性免疫治療剤が、そのような細胞調製物から作製され得る。
【００３８】 抗体の調製についての種々の方法が当該分野で周知である。例えば、抗体は、
単離形態または免疫結合体形態でＰＳＣＡタンパク質、ペプチド、またはフラグ
メントを用いて適切な哺乳動物宿主に免疫されることによって調製され得る（Ｈ
ａｒｌｏｗ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９））。さらに、ＰＳＣＡの融合タンパク質（例えば
、はまた、ＰＳＣＡ ＧＳＴ融合タンパク質）もまた、使用され得る。ＰＳＣＡ
を発現または過剰発現する細胞ＰＳＣＡもまた、免疫のために使用され得る。同
様に、ＰＳＣＡを発現するように操作された任意の細胞が、使用され得る。この
戦略は、内因性ＰＳＣＡを認識する能力が増強されたモノクローナル抗体の産生
をもたらし得る。例えば、実施例５に記載の標準技術および標準のハイブリドー
マプロトコール（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ））を使用することによって、モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマが生成された。このハイブリドーマは、１Ｇ８（ＡＴＣＣ
番号 ＨＢ−１２６１２）、２Ａ２（ＡＴＣＣ番号 ＨＢ−１２６１３）、２Ｈ
９（ＡＴＣＣ番号 ＨＢ−１２６１４）、３Ｃ５（ＡＴＣＣ番号 ＨＢ−１２６
１６）、３Ｅ６（ＡＴＣＣ番号 ＨＢ−１２６１８）、および３Ｇ３（ＡＴＣＣ
番号 ＨＢ−１２６１５）、４Ａ１０（ＡＴＣＣ番号 ＨＢ−１２６１７）と呼
ばれる。これらの抗体は、１９９８年１２月１１日、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒ
ｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ ２０８５２に寄託された
。
【００３９】 本発明のキメラ抗体は、ヒト部分および非ヒト部分を含む、免疫グロブリン分
子である。キメラ抗体の抗原結合領域（可変領域）は、非ヒト供給源（例えば、
マウス）に由来し得、そしてその免疫グロブリンに生物学的エフェクター機能を
与えるキメラ抗体の定常領域は、ヒト供給源由来であり得る。このキメラ抗体は
、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性およびこのヒト抗体分子により付与されるエ
フェクター機能を有するはずである。
【００４０】 一般的に、キメラ抗体を産生するために使用される手順は、以下の工程を含み
得る： ａ）抗体分子の抗原結合部分をコードする正確な遺伝子セグメントの同定および
クローニング；この遺伝子セグメント（重鎖についてＶＤＪ領域（可変領域、多
様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）領域および接合（ｊｏｉｎｉｎｇ）領域）または軽
鎖についてＶＪ領域（可変領域、接合領域）として公知であるか、または単にＶ
領域または可変領域として公知）は、ｃＤＮＡ形態またはゲノム形態のいずれか
であり得る； ｂ）定常領域またはその所望される部分をコードする遺伝子セグメントのクロー
ニング； ｃ）完全なキメラ抗体が転写され得かつ翻訳され得る型でコードするように可変
領域を定常領域と連結； ｄ）この構築物を、選択可能なマーカー、ならびにプロモーター、エンハンサー
およびポリ（Ａ）付加シグナルのような遺伝子制御領域を含む、ベクター中に連
結； ｅ）細菌中でこの構築物の増幅； ｆ）真核生物細胞（最も頻繁には、哺乳動物リンパ球）へのこのＤＮＡの導入（
トランスフェクション）； ｇ）選択可能なマーカーを発現する細胞の選択； ｈ）所望するキメラ抗体を発現する細胞についてのスクリーニング；および ｋ）適切な結合特異性およびエフェクター機能についての抗体の試験。
【００４１】 幾つかの異なる抗原結合特異性の抗体が、キメラタンパク質を産生するための
これらのプロトコールにより操作された［例えば、抗ＴＮＰ：Ｂｏｕｌｉａｎｎ
ｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；および抗腫瘍抗原：Ｓａｈ
ａｇａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６（１９８６）］。同様に、
幾つかの異なるエフェクター機能が、この抗原結合領域をコードする配列に対す
る新規の配列を連結することによって達成された。これらの幾つかは酵素［Ｎｅ
ｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４（１９８４）］、別の種由来
の免疫グロブリンの定常領域、および別の免疫グロブリン鎖の定常領域［Ｓｈａ
ｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３０９：３６４（１９８４）；Ｔａｎら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１３５：３５６５−３５６７（１９８５）］を含む。さらに、抗体分
子を改変するため、および遺伝子改変を目標とするための相同組換えを用いたキ
メラ抗体分子の産生についての手順は、記載されている（Ｆｅｌｌら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８５０７−８５１１（１９８９
））。
【００４２】 これらの抗体は、例えば、前立腺癌細胞の細胞表面上のＰＳＣＡに結合し得、
これによって、ＰＳＣＡの細胞表面位置が確認される。これらのｍＡｂが、細胞
表面の外側のエピトープを認識するので、これらのｍＡｂは、前立腺癌の診断お
よび治療のための有用性を有する。例えば、これらのｍＡｂは、転移性の疾患の
部位を位置付けるために使用された（実施例６）。別の可能性は、ｍＡｂが、単
独あるいは放射性同位体または他の毒素と結合されて使用される際、前立腺癌細
胞を治療学的に標的化するために（例えば、全身的に）使用され得ることである
。
【００４３】 ＰＳＣＡ ｍＡｂは、細胞表面を斑点状の様式で染色し（実施例５参照）、こ
れは、ＰＳＣＡが、細胞表面の特定の領域に局在し得ることを示唆する。ＧＰＩ
に固着されたタンパク質は、細胞表面の界面活性剤不溶性の糖脂質に富んだマイ
クロドメイン（ＤＩＧＳ）において密集することが公知である。小胞およびスフ
ィンゴ脂質（ｓｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）−コレステロールラフを含むこれらのマ
イクロドメインは、シグナル伝達および分子輸送において重要な役割を果たすと
考えられている。ＰＳＣＡの相同体であるＴｈｙ−１は以前、脂質−マイクロド
メインにおける相互作用を介してｓｒｃキナーゼへシグナルを伝達することが示
された。本発明者らの研究室における細胞下分画実験は、ＤＩＧＳ中のＰＳＣＡ
の存在を確認する。
【００４４】 さらに、本発明のいくつかの抗体は、内部移行する抗体であり、すなわち、こ
の抗体は、結合の際または結合の後に、細胞内へ内部移行する。用語「内部移行
する」とは、抗体が細胞に取り込まれることを意味することが意図される。さら
に、いくつかの抗体は、ＰＳＣＡ陽性癌細胞の増殖の阻害を誘導する。
【００４５】 例えば、前立腺癌の検体におけるこれらの抗体の特徴は、ＰＳＣＡタンパク質
が、正常細胞と比較して前立腺癌において過剰発現していること、そしてこの発
現が、前立腺癌の進行および転移の間にアップレギュレートされるようであるこ
とを示す。これらの抗体は、ＰＳＣＡ生物学および機能研究、ならびにＰＳＣＡ
関連癌（例えば、ヒト前立腺癌、前立腺癌の骨への転移、および膀胱癌腫）のイ
ンビボ標的化において有用である。
【００４６】 ＰＳＣＡタンパク質の細胞外ドメインを特異的に認識しそして結合するＰＳＣ
ＡｍＡｂｓが、本明細書中に記載される。これらのいくつかは、細胞表面量で発
現されるとネイティブのＰＳＣＡに結合することが示されており、そしていくつ
かは前立腺腫瘍細胞のインビボ増殖を阻害することが示されている。
【００４７】 本明細書中に示されるＰＳＣＡのアミノ酸配列は、抗体を産生するためのＰＳ
ＣＡタンパク質の特異的領域を選択するために使用され得る。例えば、このＰＳ
ＣＡアミノ酸配列の親水性および疎水性の分析は、ＰＳＣＡの構造における疎水
性領域を同定するために使用され得る。免疫原性構造を示すＰＳＣＡタンパク質
の領域ならびに他の領域およびドメインは、当該分野で公知の種々の他の方法（
例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ分析、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ分析、Ｋ
ｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ分析、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ分析、Ｋａｒｐｌｕｓ−
Ｓｃｈｕｌｔｚ分析またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析）を用いて容易に同定
され得る。これらの残基を含むフラグメントは、特定のクラスの抗ＰＳＣＡ抗体
の産生に特に適する。特に有用なフラグメントには、配列ＴＡＲＩＲＡＶＧＬＬ
ＴＶＩＳＫおよびＳＬＮＣＶＤＤＳＱＤＹＹＶＧＫが挙げられるが、これらに限
定されない。
【００４８】 以下の実施例２に記載されるように、ウサギポリクローナル抗体を、合成ペプ
チドとして調製した前者のフラグメントに対して産生し、そしてＰＳＣＡ−グル
タチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を用いたアフィニティー精製をし
た。この抗体によるＰＳＣＡの認識は、ＰＳＣＡを用いてトランスフェクトした
２９３Ｔ細胞の抽出液およびＧＳＴ−ＰＳＣＡ融合タンパク質の、イムノブロッ
ト分析および免疫沈降分析によって確立した。この抗体はまた、ＰＳＣＡでトラ
ンスフェクトされた２９３Ｔ細胞およびＬＡＰＣ−４細胞におけるＰＳＣＡの細
胞表面発現を、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を用いて同定した。
【００４９】 さらに、ヒツジのポリクローナル抗体を、合成ペプチドとして調製した後者の
フラグメントに対して産生し、そしてペプチドＡｆｆｉ−ゲルカラムを用いてア
フィニティー精製した（実施例２の方法にもよる）。この抗体によるＰＳＣＡの
認識は、ＰＳＣＡを用いてトランスフェクトしたＬＮＣａＰ細胞の抽出液のイム
ノブロット分析および免疫沈降分析によって確立された。この抗体はまた、蛍光
細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）および免疫組織化学的分析を用いて、ＰＳＣＡで
トランスフェクトされたＬＮＣａｐ細胞におけるＰＳＣＡの細胞表面の発現を同
定した。
【００５０】 免疫原としての使用のためのタンパク質を調製するための方法、およびキャリ
ア（例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨ、または他のキャリアタンパク質）とのタンパク質
の免疫原性結合体を調製するための方法は、当該分野で周知である。いくつかの
状況において、例えば、カルボジイミド試薬の使用による直接的な結合が、使用
され得、他の場合において、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃ
ｋｆｏｒｄ、ＩＬによって供給されるような結合試薬は、効果的であり得る。Ｐ
ＳＣＡ免疫原の投与は、当該分野で一般的に理解されるように、適切な期間に渡
って、適切なアジュバントの使用と共に、注射によって一般的に行なわれる。免
疫スケジュールの間、抗体の力価が、抗体形成の適切さを決定するために得られ
得る。
【００５１】 この方法で産生されるポリクローナル抗血清は、いくつかの適用にとって十分
であり得るが、薬学的組成物については、モノクローナル抗体調製物が好ましい
。所望するモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、一般的に公知である
ように、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的な方法、またはリンパ球
細胞および脾細胞の不死化をもたらす改変形を使用して調製され得る。所望する
抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原がＰＳＣＡタンパク質またはＰＳＣＡフラ
グメントであるイムノアッセイによってスクリーニングされる。所望の抗体を分
泌する適切な不死化細胞培養物が同定された場合、その細胞は、インビトロで培
養され得るか、または腹水中の産生により培養され得るかのいずれかである。
【００５２】 次いで、所望のモノクローナル抗体を、培養上清または腹水上清から回収する
。本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清の、免疫学的に重要
な部分（すなわち、ＰＳＣＡを認識し、そして結合する部分）を含むフラグメン
ト（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖフラグメント、融合タンパク質）を
、アンタゴニスト、およびインタクトな抗体として使用し得る。ＰＳＣＡに対す
るヒト化抗体もまた、有用である。本明細書中において使用する場合に、ヒト化
ＰＳＣＡ抗体とは、ＰＳＣＡに結合し得、そしてヒト免疫グロブリンのアミノ酸
配列を実質的に有するＦＲ領域、および非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列ま
たはＰＳＣＡを結合するよう操作された配列を実質的に有するＣＤＲを含む、免
疫グロブリン分子である。１つ以上の非ヒト抗体ＣＤＲを対応するヒト抗体配列
に置換することによって、マウスおよび他の非ヒト抗体をヒト化するための方法
は、周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５
２２−５２５；Ｒｅｉｃｈｍｎａｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２
３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５
３４−１５３６を参照のこと）。また、Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５およびＳｉｍｓら、１９
９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６を参照のこと。
【００５３】 免疫学的に反応性のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ
’）2フラグメント）の使用は、特に治療の観点において、しばしば好ましい。
なぜならこれらのフラグメントは、一般に、免疫グロブリン全体より免疫原性が
低いからである。さらに、２つ以上のエピトープに特異的な二重特異性抗体が、
当該分野において一般的に公知の方法を使用して、生成され得る。さらに、抗体
エフェクター機能が、癌に対するＰＳＣＡ抗体の治療効果を増強するように、改
変され得る。例えば、システイン残基がＦｃ領域内に操作されて、鎖間ジスルフ
ィド結合の形成およびホモダイマー（これは、インターナリゼーション、ＡＤＣ
Ｃおよび／または相補体により媒介される細胞殺傷の増強された能力を有し得る
）の生成を可能にし得る（例えば、Ｃａｒｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１７６：１１９１−１１９５；Ｓｈｏｐｅｓ、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１４８：２９１８−２９２２を参照のこと）。ホモダイマー抗体はまた、当
該分野において公知の架橋技術によって、生成され得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら
、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）。本発明はまた、本発明
のモノクローナル抗体または抗イデオタイプモノクローナル抗体を有する、薬学
的組成物を提供する。
【００５４】 細胞表面ＰＳＣＡに結合し得るモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成を、実施
例５に記載する。これらのｍＡｂのエピトープマッピングは、これらがＰＳＣＡ
タンパク質上の異なるエピトープを認識することを示す。例えば、あるものはカ
ルボキシ末端領域内のエピトープを認識し、そして他のものはアミノ末端領域内
のエピトープを認識する。このようなＰＳＣＡ抗体は、これらの異なるエピトー
プ結合特性を考慮すると、サンドイッチ形式のＥＬＩＳＡにおける使用に特に良
好に適切であり得る。
【００５５】 抗体またはフラグメントはまた、現在の技術を使用して、組換え手法により生
成され得る。ＰＳＣＡタンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域もまた、
多様な種を起源とするキメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体の状況において生成され
得る。本発明は、本発明のいずれかのモノクローナル抗体のＰＳＣＡに対する免
疫特異的結合を競合的に阻害する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を含む。
【００５６】 あるいは、ファージディスプレイおよびトランスジェニック方法を包含する、
完全ヒトモノクローナル抗体を生成するための方法は、公知であり、そしてヒト
ｍＡｂの生成のために、使用され得る（概説については、Ｖａｕｇｈａｎら、１
９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５３５−５３９を
参照のこと）。例えば、完全ヒト抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体は、大ヒトＩｇ
遺伝子無作為配列ライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を使用する
クローニング技術を使用して、生成され得る（ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏ
ｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｍｍｕｎｅ
ｓｙｓｔｅｍ：ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄ
ｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａ
ｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ
Ｍａｎ．Ｃｌａｒｋ，Ｍ．（編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ａｃａｄｅｍｉｃ
、４５〜６４頁（１９９３）；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｎｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒ
ｉｅｓ．同書、６５〜８２頁）。完全ヒト抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体はまた
、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／２４８９３（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９７年
１２月３日公開）に記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むよう
操作されたトランスジェニックマウスを使用して、生成され得る（Ｊａｋｏｂｏ
ｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ７（４）
：６０７−６１４もまた参照のこと）。この方法は、ファージディスプレイ技術
に関して必要とされるインビトロ操作を回避し、そして高親和性真正ヒト抗体を
効率的に生成する。
【００５７】 標的抗原に対する抗ＰＳＣＡ ｍＡｂの反応性は、適切であるように、ＰＳＣ
Ａタンパク質、ペプチド、ＰＳＣＡ発現細胞またはその抽出物を使用して、多数
の周知の手段（ウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳ分
析を含む）によって確立され得る。抗ＰＳＣＡ ｍＡｂはまた、種々のインビト
ロアッセイ（相補体により媒介される腫瘍細胞溶解、抗体依存性細胞細胞傷害性
（ＡＤＣＣ）、抗体依存性マクロファージ媒介性細胞傷害性（ＡＤＭＭＣ）、腫
瘍細胞増殖などを含む）において、特徴付けられ得る。このようなインビトロア
ッセイの例を、以下の実施例１９に提供する。
【００５８】 本発明の抗体またはそのフラグメントは、これが結合する細胞に対して、細胞
増殖抑制性であり得る。用語「細胞増殖抑制性」とは、その抗体が、ＰＳＣＡ陽
性細胞の増殖を阻害し得るが、必ずしも殺傷する必要はないことを意味すること
が、意図される。
【００５９】 本発明の抗体またはそのフラグメントは、検出マーカーを用いて標識され得る
か、または第２の分子（例えば、それによって免疫結合体を生じる治療剤（例え
ば、細胞毒因子））と結合体化され得る。例えば、この治療剤としては、抗腫瘍
薬物、毒素、放射性因子、サイトカイン、二次抗体または酵素が挙げられるがこ
れらに限定されない。さらに、本発明は、本発明の抗体がプロドラッグを細胞毒
薬物に変換する酵素と連結される、実施形態を提供する。
【００６０】 免疫結合体は、ＰＳＣＡ陽性細胞に対してこの第２の分子を標的とするために
使用され得る（Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．ら、１９９３、Ｉｍｍｎｏｔｏｘｉｎ
ｔｈｅｒａｐｙ，ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．、Ｖ．Ｔ．ら編、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第４
版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２６
２４−２６３６）。
【００６１】 細胞毒因子の例としては、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビ
シン、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノ
ポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチ
ン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ
鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニ
ン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レトストリクト
シン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ
）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、キュリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロ
チン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリーチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、
サパオナリアオフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ
）インヒビター、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、およびグル
ココルチコイドならびに他の化学療法剤、ならびに放射性同位元素（例えば、21 2 Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、および186Ｒｅ）が挙げられるがこれらに限定さ
れない。適切な検出マーカーとしては、放射性放射性同位元素、蛍光化合物、生
物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるがこれ
らに限定されない。抗体はまた、プロドラッグをその活性形態に変換し得る、抗
癌プロドラッグ活性化酵素に結合体化され得る。例えば、米国特許第４，９７５
，２８７号を参照のこと。
【００６２】 さらに、本発明の任意のモノクローナル抗体の抗原結合領域を含む本発明の組
換えタンパク質は、癌を処置するために使用され得る。このような状況において
、組換えタンパク質の抗原結合領域は、治療的活性を有する第２のタンパク質の
少なくとも機能的に活性な部分と結合される。この第２のタンパク質としては、
酵素、リンホカイン、オンコスタチンまたは毒素が挙げられ得るがこれに限定さ
れない。適切な毒素としては、上記のものが挙げられる。
【００６３】 抗体に対して、治療剤を結合体化または結合するための技術は、周知である（
例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏ
ｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、（編）、２４３−５６頁
（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、（編）
、６２３−５３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏ
ｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ
Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら、
（編）、４７５−５０６頁（１９８５）；およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと）。治療剤として
のＰＳＣＡ抗体の使用は、以下の小節「ＰＲＯＳＴＡＴＥ ＣＡＮＣＥＲ ＩＭ
ＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ」においてさらに記載される。
【００６４】 （ＰＳＣＡをコードする核酸分子） 本発明の別の局面は、ＰＳＣＡタンパク質およびそのフラグメントをコードす
る種々の核酸分子を、好ましくは単離された形態において（ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、ＰＳＣＡをコードする配列に相補
的な核酸分子またはその一部、ならびにＰＳＣＡ遺伝子またはＰＳＣＡコード核
酸とハイブリダイズするものを含む）提供する。特に好ましい核酸分子は、本明
細書中で開示されるヒトＤＮＡ配列またはマウスＤＮＡ配列と実質的に同一のヌ
クレオチド配列または相補的なヌクレオチド配列を有する。ゲノムＤＮＡ、ｃＤ
ＮＡ、リボザイム、およびアンチセンス分子、ならびに天然供給源由来であろう
と合成由来であろうと、代替の骨格に基づいた核酸または代替の塩基を含む核酸
が、特に意図される。
【００６５】 例えば、アンチセンス分子は、ＲＮＡ、または塩基対依存様式（ｂａｓｅ ｐ
ａｉｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ）においてＤＮＡもしくはＲＮＡを
特異的に結合する他の分子（ペプチド核酸（ＰＮＡ）または非核酸分子（例えば
、ホスホロチオエート誘導体）を含む）であり得る。当業者は、本明細書中に記
載されているＰＳＣＡ配列を使用して、これらのクラスの核酸分子を容易に獲得
し得る。便宜上、ＰＳＣＡコード核酸分子は、本明細書中で、ＰＳＣＡコード核
酸分子、ＰＳＣＡ遺伝子またはＰＳＣＡ配列といわれる。
【００６６】 ヒトＰＳＣＡの１つの対立遺伝子形態をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配
列は、図１Ａにおいて提供される。マウスＰＳＣＡホモログをコードするｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列（「マウスＰＳＣＡ」）は、図２において提供される。ヒ
トＰＳＣＡおよびマウスＰＳＣＡのゲノムクローンはまた、実施例４において記
載されるように単離された。ヒトゲノムクローンおよびマウスゲノムクローンの
両方が、ＰＳＣＡ遺伝子の翻訳領域および３’非翻訳領域をコードする３つのエ
キソンを含む。５’非翻訳領域をコードする４番目のエキソンが、Ｌｙ−６遺伝
子ファミリーおよびＴｈｙ−１遺伝子ファミリーの他のメンバーに対するＰＳＣ
Ａの相同性に基づいて、存在を推定される（図８）。
【００６７】 ヒトＰＳＣＡ遺伝子は、染色体８ｑ２４．２に位置する。ヒト幹細胞抗原２（
ＲＩＧ−Ｅ）、ならびに１つの他の最近同定されたヒトＬｙ−６ホモログ（Ｅ４
８）もまた、この領域に局在し、関連遺伝子の大きなファミリーが、この遺伝子
座に存在し得ることを示唆する（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆら、１９９５、前出；Ｍ
ａｏら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５
９１０−５９１４）。興味深いことに、染色体８ｑは、進行した前立腺癌および
再発した前立腺癌の大部分において、対立遺伝子の増加および対立遺伝子の増幅
の領域であることが報告されている（Ｃｈｅｒら、１９９４、Ｇｅｎｅｓ Ｃｈ
ｒｏｍ．Ｃａｎｃｅｒ １１：１５３−１６２）。ｃ−ｍｙｃは、染色体８ｑ２
４のＰＳＣＡの近位に局在し、そしてｃ−ｍｙｃの過剰コピー（対立遺伝子の増
加または対立遺伝子の増幅のいずれかを介して）が、初期前立腺腫瘍の６８％お
よび転移の９６％において見出された（Ｊｅｎｋｉｎｓら、１９９７、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．５７：５２４−５３１）。
【００６８】 本発明のＰＳＣＡコード核酸分子の実施形態は、プライマー（これは、本発明
の核酸分子またはその任意の特異的部分の特異的な増幅を可能にする）、および
本発明の核酸分子またはその任意の部分と選択的にまたは特異的にハイブリダイ
ズするプローブを含む。この核酸プローブは、検出マーカーを用いて標識され得
る。検出マーカーの例としては、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物
、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるがこれらに限定され
ない。このような標識プローブは、ＰＳＣＡタンパク質を発現している細胞を診
断するための手段としてＰＳＣＡタンパク質の存在を診断するために使用され得
る。ＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブを生成するための技術は、周知である
。
【００６９】 本明細書中で使用されるように、核酸分子は、この核酸分子がＰＳＣＡ以外の
ポリペプチドをコードする夾雑核酸分子から実質的に分離される場合、「単離さ
れる」と言われる。当業者は、単離されたＰＳＣＡコード核酸分子を獲得するた
めに核酸単離手順を容易に用い得る。
【００７０】 本発明は、本発明のＰＳＣＡコード核酸分子のフラグメントをさらに提供する
。本明細書中で使用されるように、ＰＳＣＡコード核酸分子のフラグメントは、
ＰＳＣＡコード配列全体の小さい部分をいう。このフラグメントの大きさは、そ
の意図された使用により決定される。
【００７１】 例えば、このフラグメントが、ＰＳＣＡタンパク質の活性部分（活性ドメイン
、エフェクター結合部位またはＧＰＩ結合ドメインのような）をコードするよう
に選択される場合、このフラグメントは、ＰＳＣＡタンパク質の機能的領域をコ
ードするのに十分に大きいことが必要とされる。このフラグメントが核酸プロー
ブまたはＰＣＲプライマーとして使用される場合、このフラグメントの長さは、
プローブ化／プライミング化の間に比較的少数の疑陽性物を獲得するように選択
される。
【００７２】 選択的ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして特に有
用であるヒトＰＳＣＡのフラグメントは、当該分野で公知の方法を使用してＰＳ
ＣＡ配列全体から容易に同定され得る。ＲＴ−ＰＣＲ分析のために有用であるＰ
ＣＲプライマーの１つのセットは、５’−ＴＧＣＴＴＧＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴＧ
ＧＣＡＧ−および３’−ＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＧＣＡ−を含
む。
【００７３】 （他のＰＳＣＡコード核酸分子を単離するための方法） 本明細書中で記載されるＰＳＣＡコード核酸分子は、ＰＳＣＡホモログ、ある
いはＰＳＣＡタンパク質のスライスされたアイソフォーム、対立遺伝子改変体、
および変異体形態、ならびにそれらのコード配列および遺伝子配列の単離を可能
にする。ＰＳＣＡホモログの最も好ましい供給源は、哺乳動物生物である。
【００７４】 例えば、本明細書中に記載されるＰＳＣＡコード配列の部分が、合成され得、
そしてヒト以外の生物、本明細書中に記載されるヒトＰＳＣＡタンパク質の対立
遺伝子改変体、およびＰＳＣＡ遺伝子を含むゲノム配列由来のＰＳＣＡファミリ
ーのタンパク質の１つのメンバーをコードするＤＮＡを回収するためのプローブ
として使用され得る。およそ１８〜２０ヌクレオチドを含むオリゴマー（約６〜
７アミノ酸ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）をコードする）が、ストリンジェント
な条件または過度のレベルの擬陽性物を除去するために十分にストリジェンシー
な条件下で、ハイブリダイゼーションを獲得するためのゲノムＤＮＡライブラリ
ーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために調製され、そして使
用される。特定の実施形態において、ヒトＰＳＣＡをコードするｃＤＮＡが、本
明細書中の実施例３に記載されるように、マウスＰＳＣＡホモログをコードする
全長ｃＤＮＡを単離するために、使用された。マウスクローンは、ヒトＰＳＣＡ
に対して７０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする。
【００７５】 さらに、ヒトＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸配列は、細胞から調製される発現
ライブラリーをスクリーニングするための抗体プローブを生成するために使用さ
れ得る。典型的に、哺乳動物（例えば、精製されたタンパク質（以下に記載され
るような）を用いて免疫化されたウサギ）由来のポリクローナル抗血清またはモ
ノクローナル抗体が、ＰＳＣＡホモログのための適切なコード配列を獲得するた
めに、標的生物から調製された発現ライブラリーをプローブ化するために使用さ
れ得る。クローンニングされたｃＤＮＡ配列が、融合タンパク質として発現され
得るか、それ自身の制御配列を使用して直接発現され得るか、またはその酵素の
発現のために使用される特定の宿主に対して適切な、制御配列を使用して発現カ
セットを構築することにより発現され得る。
【００７６】 ＰＳＣＡ遺伝子を含むゲノムクローンが、当該分野において周知の分子クロー
ニング方法を使用して、獲得され得る。１つの実施形態において、ＰＳＣＡ遺伝
子のエキソン１〜４を含むおよそ１４ｋｂのヒトゲノムクローンが、本明細書中
の実施例４でより完全に記載されるように、ヒトＰＳＣＡ ｃＤＮＡプローブを
用いたλファージライブラリーをスクリーニングすることにより獲得された。別
の実施形態において、マウスＰＳＣＡ遺伝子を含むおよそ１０ｋｂのゲノムクロ
ーンが、マウスＰＳＣＡ ｃＤＮＡ（実施例４にもまた記載される）を用いたマ
ウスＢＡＣ（バクテリア人工染色体）ライブラリーをスクリーニングすることに
より獲得された。
【００７７】 さらに、対のオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＳＣＡコード核酸分子また
はそのフラグメントを選択的に増幅／クローンニングするために、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）における使用のために調製され得る。このようなＰＣＲプラ
イマーを使用するためのＰＣＲの変性／アニーリング／伸長サイクルは、当該分
野において周知であり、そして、他のＰＳＣＡコード核酸分子を単離する際の使
用のために容易に適用され得る。プローブとしてまたはプライマーとしての使用
のために特に十分に適切なヒトＰＳＣＡ遺伝子の領域は、容易に同定され得る。
【００７８】 ＰＳＣＡの非ヒトホモログ、ＰＳＣＡの天然に存在する対立遺伝子改変体、お
よびゲノムＰＳＣＡ配列は、本明細書中に記載されるヒトＰＳＣＡ配列と高度な
相同性を共有する。一般に、このような核酸分子は、ストリンジェントな条件下
でヒトＰＳＣＡ配列にハイブリダイズする。このような配列は、代表的に、ヒト
ＰＳＣＡ配列に対して少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％
の相同性、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を含む。
【００７９】 ストリンジェントな条件は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温を用
いる（例えば、５０℃で０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ硝酸ナトリウ
ム／０．１％ＳＤＳ）、または（２）ハイブリダイゼーションの間、ホルムアミ
ドのような変性剤（例えば、４２℃で、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％
Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウムを含有するｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
を含有する、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド）を用いる条件である。
【００８０】 別の例は、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．
８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理された
サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキス
トラン（４２℃で、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中において洗浄）の使
用である。当業者は、明瞭かつ検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを獲
得するために適切な、ストリンジェンシー条件を容易に決定し得、そして変更し
得る。
【００８１】 （ＰＳＣＡコード核酸を含む組換えＤＮＡ分子） 本明細書中に記載されるようなＰＳＣＡコード配列またはそのフラグメントを
含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）もまた提供される。本明細書中において使用
されるように、ｒＤＮＡ分子は、インビトロの分子操作に供されたＤＮＡ分子で
ある。ｒＤＮＡ分子を生成するための方法は、当該分野において周知であり、例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）
を参照のこと。本発明の好ましいｒＤＮＡ分子において、ＰＳＣＡタンパク質ま
たはＰＳＣＡのフラグメントをコードするＰＳＣＡコードＤＮＡ配列は、１つ以
上の発現制御配列および／またはベクター配列と作動可能に連結される。ｒＤＮ
Ａ分子は、ＰＳＣＡタンパク質全体をコードし得るかまたはＰＳＣＡタンパク質
のフラグメントをコードし得るかのいずれかである。
【００８２】 ＰＳＣＡコード配列が作動可能に連結されるベクター配列および／または発現
制御配列の選択は、当該分野において周知のように、所望される機能的特性（例
えば、タンパク質発現）、および形質転換されるべき宿主細胞に直接的に依存す
る。本発明により意図されるベクターは、少なくとも複製または宿主染色体への
挿入を指向することが可能であり、そして好ましくはｒＤＮＡ分子に含まれるＰ
ＳＣＡコード配列の発現もまた可能である。
【００８３】 作動可能に連結されるタンパク質コード配列の発現を調節するために使用され
る発現制御エレメントは、当該分野において公知であり、そして誘導プロモータ
ー、構成性プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーターお
よび他の調節エレメントが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、容
易に制御される誘導プロモーター（例えば、宿主細胞培地における栄養素に応答
性である）が、使用される。
【００８４】 １つの実施形態において、ＰＳＣＡコード核酸分子を含むベクターは、それを
用いて形質転換される原核生物レプリコン（すなわち、原核生物宿主細胞（例え
ば、細菌宿主細胞）において、染色体内に自律的複製および組換えＤＮＡ分子の
維持を指向する能力を有するＤＮＡ配列）を含む。このようなレプリコンは、当
該分野において周知である、さらに、原核生物レプリコンを含むベクターはまた
、発現が薬物耐性のような検出マーカーを付与する遺伝子を含み得る。代表的な
細菌性薬物耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を
付与する遺伝子である。
【００８５】 原核生物レプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
）におけるＰＳＣＡコード配列の発現（転写および翻訳）を指向し得る原核生物
プロモーターまたはウイルスプロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、
ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こること可能にするＤＮＡ配列により
形成される発現制御エレメントである。細菌宿主と適合性のプロモーター配列は
、代表的に、本発明のＤＮＡセグメントの挿入のための都合の良い制限部位を含
むプラスミドベクターにおいて提供される。当業者に周知である種々のウイルス
ベクター（例えば、多くの周知のレトロウイルスベクター）もまた使用され得る
。
【００８６】 真核生物細胞に適合性の発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合性のあ
る発現ベクターはまた、ＰＳＣＡコード配列を含むｒＤＮＡ分子を改変するため
に用いられ得る。真核生物細胞発現ベクターは、当該分野で周知であり、そして
いくつかの商業的な供給源から入手可能である。代表的に、そのようなベクター
は、所望のＤＮＡセグメントの挿入に関して都合のよい制限部位を含んで、供給
される。このようなベクターの代表は、ＰＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ，＃３１２
５５）、本明細書中に記載されるベクターｐＣＤＭ８、および真核発現ベクター
のようなベクターである。
【００８７】 本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために使用される真核細胞発現ベクターは、
真核細胞において効果的である選択マーカー、好ましくは薬物耐性選択マーカー
をさらに含み得る。好ましい薬物耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性
を生じる遺伝子（すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）
遺伝子）である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ Ｍｏｌ Ａｎａｌ Ｇｅｎｅｔ（１
９８２）１：３２７−３４１）。あるいは、選択マーカーは、別のプラスミド上
に存在し得、その２つのベクターは、宿主細胞の同時トランスフェクションによ
り導入され、そして選択マーカーに対して適切な薬物の存在下で培養することに
より選択される。
【００８８】 本発明の実施に従い、ベクターは、上記で議論されたｃＤＮＡ分子をコードし
ているプラスミド、コスミドまたはファージベクターであり得る。さらに、本発
明は、適切な真核宿主細胞中にトランスフェクトされるプラスミド、コスミド、
またはファージベクターを含む宿主ベクター系を供給する。適切な真核宿主細胞
の例は、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞のような動物細胞を含む。適
切な細胞の例は、ＬｎＣａＰ、ＬＡＰＣ−４、および他の前立腺癌細胞株を含む
。この宿主ベクター系は、ＰＳＣＡタンパク質の産生のために有用である。ある
いは、宿主細胞は、細菌細胞のような真核細胞であり得る。
【００８９】 （形質転換された宿主細胞） 本発明は、ＰＳＣＡタンパク質またはそのフラグメントをコードしている核酸
分子で形質転換された宿主細胞をさらに提供する。この宿主細胞は、原核生物細
胞または真核生物細胞のいずれかであり得る。ＰＳＣＡタンパク質の発現に有用
である真核生物細胞は、細胞株が、細胞培養方法に対して適合性があり、そして
発現ベクターの増殖およびＰＳＣＡ遺伝子の発現に適合性のある限り、限定され
ない。好ましい真核生物宿主細胞は、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞、好ま
しくはマウス、ラット、サルまたはヒト繊維芽細胞株に由来するような脊椎動物
細胞を含むが、これらに限定されない。ＬｎＣａＰ、ＬＡＰＣ−４細胞株のよう
な前立腺癌細胞株もまた、使用され得る。任意の原核宿主が、使用され、ＰＳＣ
ＡをコードしているｒＤＮＡ分子を発現し得る。好ましい原核宿主は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉである。
【００９０】 本発明のｒＤＮＡ分子を用いる、適切な細胞宿主の形質転換は、使用したベク
ターの型および利用された宿主系に代表的に依存した周知の方法により達成され
る。原核宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーションおよび塩処理
方法が、代表的に使用される（例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ（１９７２）６９：２１１０；およびＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｅ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）を参照のこと）。ｒＤＮＡを含むベ
クターを用いる脊椎動物細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーション、
陽イオン性脂質または塩処理方法が代表的に利用される（例えば、Ｇｒａｈａｍ
ら、Ｖｉｒｏｌ（１９７３）５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７９）７６：１３７３−７６を参照のこと
）。
【００９１】 首尾よく形質転換された細胞、すなわち本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、
周知の技術により同定され得る。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入から生じる細
胞は、クローニングされ、単一のコロニーを産生し得る。それらのコロニー由来
の細胞は、回収され得、溶解され得、そしてそれらのＤＮＡ成分は、Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９７５）９８：５０３、もしくはＢｅｒｅｎ
ｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈ（１９８５）３：２０８により記載されるような方法、ま
たは免疫学的方法を介してアッセイされる細胞から産生されるタンパク質を使用
して、ｒＤＮＡの存在について実験され得る。
【００９２】 （ＰＳＣＡタンパク質を産生する組換え方法） 本発明は、本明細書中に記載されるＰＳＣＡをコードしている核酸分子の１つ
を使用してＰＳＣＡタンパク質を産生するための方法をさらに提供する。大まか
に言えば、組換え型ＰＳＣＡタンパク質の生成は、代表的に以下の工程を含み得
る（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）。
【００９３】 第一に、図１Ａに示される核酸分子のような、ＰＳＣＡタンパク質またはそれ
らのフラグメントをコードする核酸分子が、得られる。次いで、ＰＳＣＡをコー
ドしている核酸分子は、上記のように、適切な制御配列と共に作動可能に連結し
て好ましくは、配置され、ＰＳＣＡコード配列を含む発現ユニットを産生する。
この発現ユニットは、適切な宿主を形質転換するために用いられ、そして形質転
換された宿主は、ＰＳＣＡタンパク質の産生を可能にする条件下で培養される。
必要に応じて、そのＰＳＣＡタンパク質は、培地から、または細胞から単離され
；いくつかの不純物が許容され得るいくつかの場合は、このタンパク質の回収お
よび精製は不必要であり得る。
【００９４】 前述の工程の各々は、種々の方法で行われ得る。例えば、所望のコード配列は
、ゲノムフラグメントから得られ得、そして適切な宿主において直接的に使用さ
れ得る。種々の宿主において作動可能である発現ベクターの構築は、レプリコン
および制御配列の適切な組み合わせを使用して達成される。この制御配列、発現
ベクター、および形質転換方法は、遺伝子を発現するために用いられる宿主細胞
の型に依存しており、そして以前に詳細に議論された。適切な制限部位は、通常
的には入手不可能な場合、切除可能な遺伝子を供給してこれらのベクター中へ挿
入するために、コード配列の末端に付加され得る。当業者は、ＰＳＣＡタンパク
質を産生するＰＳＣＡコード配列を用いる用途のために、当該分野で公知の任意
の宿主／発現系を容易に適合させ得る。
【００９５】 続く実施例に記載される特定の実施形態において、ＰＳＣＡの分泌形態は、Ｃ
末端６ＸＨｉｓおよびＭＹＣタグ（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ、Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）でＰＳＣＡをコードするＣＭＶ駆動発現ベクターでトランスフェ
クトされた２９３Ｔ細胞に都合よく発現され得る。培養培地中の分泌されたＨＩ
ＳでタグされたＰＳＣＡは、標準の技術を利用するニッケルカラムを用いて精製
され得る。
【００９６】 （ＰＳＣＡリガンドおよび他の結合剤を同定するためのアッセイ） 本発明の別の局面は、ＰＳＣＡに結合するＰＳＣＡリガンドおよび他の因子な
らびに細胞成分を、検出および同定するために使用され得るアッセイおよび方法
に関する。具体的に、ＰＳＣＡに結合するＰＳＣＡリガンドおよび他の因子なら
びに細胞成分は、ＰＳＣＡに結合するＰＳＣＡリガンドもしくは他の因子または
細胞成分の能力、ならびに／またはＰＳＣＡ活性を阻害／刺激する能力により同
定され得る。ＰＳＣＡタンパク質を使用するＰＳＣＡ活性（例えば、結合）のた
めのアッセイは、高処理能スクリーニング方法における使用に関して適切である
。
【００９７】 １つの実施形態では、このアッセイは、ＰＳＣＡを試験剤または細胞の抽出物
と混合する工程を包含する。この因子または抽出物の成分とＰＳＣＡの結合を可
能にする条件下での混合後、その混合物は、分析され、因子／成分がＰＳＣＡに
結合するか否かを決定する。結合因子／成分は、ＰＳＣＡに対して結合し得るも
のとして同定される。あるいはまたは継続して、ＰＳＣＡ活性は、ＰＳＣＡ活性
のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための手段として、直接的に評価
され得る。
【００９８】 あるいは、ＰＳＣＡタンパク質に結合する標的は、酵母ツーハイブリッド系（
Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＳｏｎｇ，Ｏ．（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ ３４０
：２４５−２４６）を使用して、または結合−捕獲アッセイ（Ｈａｒｌｏｗ、前
出）を使用して、同定され得る。酵母ツーハイブリッド系において、２つのサブ
ユニット転写因子の１つのサブユニットおよびＰＳＣＡタンパク質から作製され
る融合タンパク質をコードしている発現ユニットは、酵母細胞に導入され、そし
て発現される。この細胞は、（１）その発現が、発現のために２つのサブユニッ
ト転写因子を必要とする、検出可能なマーカーをコードしている発現ユニット、
ならびに（２）転写因子の第二のサブユニットおよびＤＮＡのクローン化セグメ
ントから作製される融合タンパク質をコードしている発現ユニット、を含むよう
にさらに改変される。ＤＮＡのクローン化されたセグメントが、ＰＳＣＡタンパ
ク質に結合するタンパク質をコードする場合、その発現は、ＰＳＣＡとそのコー
ドされるタンパク質との相互作用を生じる。このことは、転写因子の２つのサブ
ユニットを近位で結合させ、転写因子の再構築を可能にする。このことは、検出
可能なマーカーの発現を生じる。酵母ツーハイブリッド系は、ＰＳＣＡの細胞の
結合パートナーに関する、ｃＤＮＡをコードしているセグメントのライブラリー
のスクリーニングにおいて、特に有用である。
【００９９】 上記アッセイにおいて使用され得るＰＳＣＡタンパク質は、単離されたＰＳＣ
Ａタンパク質、ＰＳＣＡタンパク質のフラグメント、ＰＳＣＡタンパク質を発現
するために改変された細胞、またはＰＳＣＡタンパク質を発現するために改変さ
れた細胞の画分を含むが、それらに限定されない。さらにＰＳＣＡタンパク質は
、ＰＳＣＡタンパク質の全体またはＰＳＣＡタンパク質の限定されたフラグメン
トであり得る。ＰＳＣＡタンパク質が、結合している因子について、例えば、分
子量または活性におけるシフトによりアッセイされ得る限り、本アッセイは使用
され得ることが当業者には明白である。
【０１００】 薬剤／細胞の成分がＰＳＣＡタンパク質に結合するか否かを同定するために使
用されるこの方法は、使用されるＰＳＣＡタンパク質の性質に主に基づく。例え
ば、ゲル遅延アッセイは、因子がＰＳＣＡまたはそのフラグメントに結合するか
否かを決定するために使用され得る。あるいは、免疫検出およびバイオチップ技
術は、ＰＳＣＡタンパク質を用いる用途に適合され得る。当業者は、特定の因子
がＰＳＣＡタンパク質に結合するか否かを決定するための多くの当該分野で公知
の技術を容易に利用し得る。
【０１０１】 因子および細胞の成分は、無細胞アッセイ系または細胞アッセイ系を使用して
、ＰＳＣＡタンパク質の活性を調節する能力についてさらに試験され得る。ＰＳ
ＣＡタンパク質の活性がより限定的になる場合、同定される活性に基づく機能的
アッセイが利用され得る。
【０１０２】 本明細書において使用されるように、薬剤がＰＳＣＡ活性を減少する場合、そ
の薬剤は、ＰＳＣＡ活性をアンタゴナイズするといわれる。好ましいアンタゴニ
ストは、他の細胞性タンパク質のいずれにも影響せずに、選択的にＰＳＣＡをア
ンタゴナイズする。さらに、好ましいアンタゴニストは、ＰＳＣＡ活性を５０％
を超えるまで、より好ましくは、９０％を超えるまで、最も好ましくは全てのＰ
ＳＣＡ活性を除去するまで減少させる。
【０１０３】 本明細書において使用されるように、薬剤がＰＳＣＡ活性を増加する場合、そ
の薬剤は、ＰＳＣＡ活性をアゴナイズするといわれる。好ましいアゴニストは、
他の細胞性タンパク質のいずれにも影響せずに、選択的にＰＳＣＡをアゴナイズ
する。さらに、好ましいアンタゴニストは、ＰＳＣＡ活性を５０％を超えるまで
、より好ましくは、９０％を超えるまで、最も好ましくは二倍のＰＳＣＡ活性を
超えるまで増加させる。
【０１０４】 上記の方法においてアッセイされる薬剤は、無作為に選択され得るか、あるい
は合理的に選択または設計され得る。本明細書中で使用されるように、因子がＰ
ＳＣＡタンパク質の特異的配列を考慮すること無しに無作為に選択される場合、
この因子は、無作為に選択されると言われる。無作為に選択された因子の例は、
化学的ライブラリーまたはペプチドコンビナトリアルライブラリーの使用、ある
いは生物抽出物または植物抽出物の増殖培養物である。
【０１０５】 本明細書において使用されるように、因子が標的部位の配列および／あるいは
その因子の作用と関連するそのコンフォメーションを考慮する非無作為な基準に
基づいて選択される場合、この因子は、合理的に選択または設計されると言われ
る。因子は、ＰＳＣＡタンパク質を構成するペプチド配列を利用することにより
、合理的に選択、または合理的に設計され得る。例えば、合理的に選択されるペ
プチド剤は、アミノ酸配列がＰＳＣＡタンパク質のフラグメントに対して同一で
あるペプチドであり得る。
【０１０６】 本発明の方法において試験される因子は、例として、ペプチド、小分子、およ
びビタミン誘導体、ならびに糖質であり得る。当業者は、本スクリーニング方法
において使用される因子の構造的性質に関しては制限が存在しないことを容易に
認識し得る。本発明の因子の１つのクラスは、そのアミノ酸配列がＰＳＣＡタン
パク質のアミノ酸配列に基づいて選択されるペプチド剤である。小ペプチド剤は
、ＰＳＣＡタンパク質アセンブリの競合的インヒビターとして働き得る。
【０１０７】 ペプチド剤は、当該分野で公知のような標準の固相（または液相）ペプチド合
成方法を使用して調製され得る。さらに、それらのペプチドをコードしているＤ
ＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成機器を使用して合成され得、そして標準
の組換え産生系を使用して組換え的に産生され得る。非遺伝子コードアミノ酸が
含まれている場合、この固相ペプチド合成を使用した産物が、必要とされる。
【０１０８】 本発明の薬剤の別のクラスは、ＰＳＣＡタンパク質の重要な位置に対して免疫
反応性の抗体である。上記のように、抗体は、抗原性領域として、抗体により標
的化されるように意図されるＰＳＣＡタンパク質の部分を含むペプチドを用いた
適した哺乳動物被検体の免疫化により得られる。重要な領域は、図１５において
同定されるドメインを含み得る。このような薬剤は、競合的結合研究において使
用され得、第二世代の抑制性薬剤を同定する。
【０１０９】 本発明の方法において試験される細胞の抽出物は、例えば細胞または組織の水
性抽出物、細胞または組織の有機抽出物、あるいは部分的に精製された細胞画分
であり得る。当業者は、本発明のスクリーニング方法において使用される細胞抽
出物の供給源には制限がないことを容易に認識し得る。
【０１１０】 ＰＳＣＡ抗体のようなＰＳＣＡタンパク質に結合する因子は、ＰＳＣＡの活性
を調節するため、抗癌剤を適切な哺乳動物細胞に標的化するため、またはＰＳＣ
Ａとの相互作用をブロックする因子を同定するために使用され得る。ＰＳＣＡを
発現する細胞は、ＰＳＣＡに結合する因子を使用することにより標的化あるいは
同定され得る。
【０１１１】 どのようにＰＳＣＡ結合剤が使用されるかは、ＰＳＣＡ結合剤の性質に依存す
る。例えば、ＰＳＣＡ結合剤は、ＰＳＣＡ発現細胞にジフテリア毒素、コレラ毒
素、リシンまたはシュードモナス外毒素のような複合毒物を送達するため；ＰＳ
ＣＡ活性を調節するため；ＰＳＣＡ発現細胞を直接的に殺傷するため；または競
合的結合剤を同定するためのスクリーニングにおいてに使用され得る。例えば、
ＰＳＣＡ阻害薬剤は、ＰＳＣＡ発現細胞の増殖を直接的に阻害するために使用さ
れ得、一方、ＰＳＣＡ結合剤は診断的薬剤として使用され得る。
【０１１２】 本発明の複数の診断的用途が存在する。例えば、本発明は、被検体（例えば、
動物被検体またはヒト被検者）において、ＰＳＣＡタンパク質の存在と関連する
癌を診断するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、本
発明の抗体の任意の１つまたは組み合せを使用して、サンプル（例えば、細胞ま
たは生物学的液体サンプル）中のＰＳＣＡタンパク質の数を定量的に決定する工
程を包含する。次いで、そうして決定されるその数は、正常な被検体由来のサン
プル中の量と比較され得る。このサンプル中のはっきりと異なる量の存在（すな
わち、その試験サンプル中のＰＳＣＡの数が正常なサンプル由来の数を超える）
は、癌の存在を示す。試験サンプル中のＰＳＣＡの数が正常なサンプル由来の数
を超える場合、ＰＳＣＡは、細胞で過剰発現される。
【０１１３】 別の実施形態では、診断は、本発明の核酸を使用して、被検体由来のサンプル
においてＰＳＣＡタンパク質をコードしているＲＮＡの量を定量的に決定するこ
とを含む。そうして決定された量は、正常な被検体由来のサンプル中のＲＮＡの
量と比較され得る。ここでも、はっきりと異なる量の存在は、癌の存在を示す。
【０１１４】 さらに、本発明は、種々の時点で被検体由来のサンプルにおけるＰＳＣＡの量
を測定することにより、被検体中のＰＳＣＡと関連する癌（例えば、前立腺癌、
前立腺癌の骨転移、膀胱癌、膵臓癌）または障害の経過をモニタリングするため
の方法を提供する。このことは、サンプルにおけるＰＳＣＡの量の変化を決定す
る（例えば、その変化が量的に小さな変化であるかまたは大きな変化（すなわち
、ＰＳＣＡの過剰発現）であるかを決定する）目的で行われる。１つの実施形態
では、この方法は、被検体由来の第一のサンプルにおいて、ＰＳＣＡタンパク質
の存在を定量的に決定する工程、およびそのように決定された量をその被検体由
来の第二のサンプル中に存在する量と比較する工程を包含し、ここでそのような
サンプルは、異なる時点で取り出されており、その決定された量における差は癌
の経過を示している。
【０１１５】 別の実施形態では、モニタリングは、被検体由来の第一のサンプルにおいてＰ
ＳＣＡのＲＮＡの存在を定量的に決定すること、およびそのように決定された量
をその被検由来の第二のサンプル中に存在する量と比較することにより達成され
、ここでそのようなサンプルは、異なる時点で取り出されており、その量におけ
る決定された差は癌（例えば、前立腺癌、前立腺癌の骨転移、膀胱癌、および膵
臓癌）の経過を示唆している。
【０１１６】 さらなる実施形態として、ＰＳＣＡと関連する疾患または障害は、ＰＳＣＡ遺
伝子コピー数における増加または増加したＰＳＣＡ遺伝子コピー数を検出するこ
とにより、サンプルにおいてモニタリングされ得る。ＰＳＣＡ遺伝子コピー数に
おける増加または増加したＰＳＣＡ遺伝子コピー数は、重要である。なぜならば
、乏しい結果と関連し得るからである。
【０１１７】 このサンプルは、動物またはヒト由来であり得る。さらに、このサンプルは、
細胞のサンプルであり得る。例えば、本発明の方法を使用して、前立腺組織、膵
臓組織、膀胱組織、神経内分泌組織および骨（癌腫が転移し得る任意の組織、例
えば、節、肺、肝臓、膵臓）は、癌または転移病巣の存在について評価され得る
。あるいは、そのサンプルは、生物学的液体（例えば、尿、血清または血漿）で
あり得る。
【０１１８】 本発明の実施に従って、検出は、組織学、ブロッティング、ＥＬＩＳＡおよび
ＥＬＩＦＡを含む免疫学的検出手段により達成され得る。サンプルが組織サンプ
ルまたは細胞サンプルである場合、そのサンプルは、ホルマリン固定、パラフィ
ン包埋または凍結され得る。
【０１１９】 本発明は、正常組織由来の組織切片におけるＰＳＣＡの量および分布と比較し
て、試験される新生物形成組織由来の組織切片中のＰＳＣＡの量および分布にお
ける差異を決定する方法を、さらに提供する。１つの実施形態において、この方
法は、試験される組織と正常組織の両方を、ＰＳＣＡとの複合体を特異的に形成
するモノクローナル抗体と接触させる工程、それによって、ＰＳＣＡの量および
分布における差異を検出する工程を包含する。
【０１２０】 さらに、本発明は、被験体における新生物形成状態または前新生物状態を診断
する方法を提供する。この方法は、組織のサンプルを被験体から得る工程、上記
の方法の使用においてＰＳＣＡの量および分布の差異（このような新生物形成状
態または前新生物状態を示している明瞭な測定可能な差異）を検出する工程を包
含する。
【０１２１】 本発明の実施に従って、抗体は、本発明のモノクローナル抗体のいずれかが指
向するエピトープに対して指向され得る。さらに、組織切片は、膀胱、前立腺、
骨、リンパ組織、膵臓、他の器官、または筋肉由来であり得る。
【０１２２】 本発明はまた、生物学的な流体サンプル中の、ＰＳＣＡの濃度を検出し、そし
て定量的に決定する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、モ
ノクローナル抗体が固体支持体の表面に付着することを可能にする条件下で、Ｐ
ＳＣＡと複合体を形成する（好ましくは、特異的に形成する）過剰の１つ以上の
モノクローナル抗体と、固体支持体を接触させる工程を包含する。次いで、モノ
クローナル抗体が付着する得られた固体支持体が、生物学的な流体サンプルと接
触され、その結果、生物学的な流体中のＰＳＣＡが抗体と結合し、そしてＰＳＣ
Ａ−抗体複合体を形成する。この複合体は、検出可能なマーカーで、直接的また
は間接的に標識され得る。あるいは、ＰＳＣＡまたは抗体のいずれかが、複合体
の形成前に標識され得る。次いで、この複合体が検出および定量的に決定され、
それによって、生物学的な流体サンプル中のＰＳＣＡの濃度を検出および定量的
に決定し得る。正常細胞と比較したサンプル中の高濃度のＰＳＣＡは、新生物形
成状態または前新生物状態を示す。
【０１２３】 本発明の実施に従って、生物学的な流体は、組織抽出物、尿、血液、血清およ
び痰を含むが、これらに限定されない。さらに、検出可能なマーカーは、酵素、
ビオチン、発蛍光団、発色団、重金属、常磁性同位体または放射性同位体を含む
が、これらに限定されない。
【０１２４】 さらに、本発明は、ＰＳＣＡを認識および結合する抗体（抗ＰＳＣＡ抗体）；
ならびに検出可能な標識の結合体、ならびに抗ＰＳＣＡ抗体の特異的結合パート
ナーを含む診断キットを提供する。本発明の実施に従って、標識は、酵素、放射
性標識、発色団および蛍光剤を含むが、これらに限定されない。
【０１２５】 （癌免疫療法） ＰＳＣＡタンパク質は、多くの癌（前立腺腫瘍、前立腺腫瘍の転移（例えば、
骨転移）、膀胱癌、および膵臓癌を含むが、これらに限定されない）に発現また
は過剰発現されるので、癌免疫療法の標的である。これらの免疫療法方法として
は、抗体治療、インビボワクチンおよびエキソビボ免疫療法アプローチの使用が
挙げられる。
【０１２６】 １つのアプローチにおいて、本発明は、癌（例えば、前立腺癌、膀胱癌および
膵臓癌）を処置するために全身的に用いられ得るＰＳＣＡ抗体を提供する。ＰＳ
ＣＡ抗体はまた、種々の他の良性腫瘍および悪性腫瘍の処置に有用であり得る。
ＰＳＣＡの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体が、好ましい。腫瘍細胞を標
的化するがその周りの非腫瘍の細胞および組織は標的化しない抗体が、好ましい
。従って、本発明は、ＰＳＣＡ抗原を発現する癌に感受性であるかまたはこのよ
うな癌を有する患者の処置方法を提供し、この方法は、上記の患者に有効量の抗
体（この抗体は、ＰＳＣＡの細胞外ドメインに特異的に結合する）を投与する工
程を包含する。別のアプローチにおいて、本発明は、ＰＳＣＡを発現する腫瘍細
胞の増殖の阻害方法を提供し、この方法は、患者へＰＳＣＡの細胞外ドメインに
特異的に結合する抗体をその腫瘍細胞の増殖を阻害するのに効果的な量で投与す
る工程を包含する。ＰＳＣＡ ｍＡｂはまた、ＰＳＣＡ抗原を発現する細胞の増
殖を選択的に阻害するかまたはこのような細胞を選択的に殺傷するための方法に
使用され得、この方法は、ＰＳＣＡ抗体免疫結合体またはイムノトキシンを、こ
の細胞の増殖を阻害するかまたはこの細胞を殺傷するのに有効な量でこの細胞と
反応させる工程を包含する。
【０１２７】 例えば、非結合体化ＰＳＣＡ抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体
、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体およびそのフラグメント（例えば、
組換えタンパク質）を含む）が、患者に導入され得、その結果、補体媒介性細胞
溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害性、ＰＳＣＡの生理学的機能の変化、および／
またはリガンド結合もしくはシグナル伝達経路の阻害を含み得る機構によって、
抗体が、癌細胞上のＰＳＣＡに結合し、そしてこのような細胞および腫瘍の増殖
阻害（この破壊を含む）を媒介する。本発明の非結合体化ＰＳＣＡ抗体、そのフ
ラグメントおよび組換えタンパク質に加えて、リシンのような毒物と結合体化さ
れたＰＳＣＡ抗体がまた、治療的に用いられ、毒物を、ＰＳＣＡ保有腫瘍細胞へ
直接的に送達し得、それによって、腫瘍を破壊する。
【０１２８】 ＰＳＣＡ抗体を用いた癌免疫療法は、結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒ
ｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：１３３−１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚ
ａｋｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：３１７９−３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａ
ｒｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：２４３７−２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐ
ｒｙｚｙｋら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２：２７７１−２７７６）
、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ Ｉｍｍｕｎｔｈｅｒ
Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：９３−１０１）、白
血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ ２０：５８１−５８９）、
結腸直腸癌（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４：６１６０−
６１６６；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：４３９
８−４４０３）および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ １１：１１７−１２７）を含むが、これらに限定されない他の型の
癌に関して、首尾よく利用されている種々のアプローチから生じた技術に従い得
る。
【０１２９】 例えば、臨床的に抗腫瘍モノクローナル抗体を適用するための１つの方法は、
抗腫瘍活性（例えば、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性）ならびに／またはインビ
トロおよび／もしくは動物モデルにおいて内部移行化する能力を提示する、本発
明のモノクローナル抗体を用いて、改変されない形態でその抗体を投与すること
である（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９−１５０２（１９８５）を参照のこと）。ＡＤＣＣ
活性およびＣＤＣ活性を検出するために、モノクローナル抗体が、４時間のイン
キュベーション時間にわたり、培養された51Ｃｒ標識化腫瘍標的細胞の溶解につ
いて試験され得る。標的細胞は、51Ｃｒで標識され、次いで、エフェクター細胞
（リンパ球分離培地の使用によって精製されたヒトリンパ球の形態で）と抗体と
の組み合わせに４時間曝露され得、これは例えば、０．１μｇ／ｍｌと１０μｇ
／ｍｌの間で変化する濃度で添加される。標的細胞からの51Ｃｒの放出が、腫瘍
細胞溶解（細胞傷害）の証拠として測定される。コントロールは、標的細胞単独
の、または別々にリンパ球もしくはモノクローナル抗体のいずれかとの標的細胞
のインキュベーションを含む。放出され得る51Ｃｒの総量が測定され、そして単
独でインキュベートされる標的細胞と比較して、ＡＤＣＣが、モノクローナル抗
体およびエフェクター細胞を用いて観察される標的細胞のパーセント殺傷として
算出される。ＣＤＣについての手順は、補体の供給源としてのヒト血清（１：３
から１：６に希釈された）が、エフェクター細胞の代わりに添加されることを除
いて、ＡＤＣＣを検出するために用いたものと同一である。
【０１３０】 本発明の方法の実施において、細胞表面上にＰＳＣＡを発現する癌細胞の増殖
を阻害し得る抗ＰＳＣＡ抗体は、癌患者（この患者の腫瘍は、ＰＳＣＡを発現す
るかまたは過剰発現する）に治療有効量で投与される。本発明の抗ＰＳＣＡ ｍ
Ａｂ治療方法は、インビボにおいて前立腺癌の顕著な腫瘍増殖阻害を示す。従っ
て、本発明は、前立腺癌の特異的、効果的かつ長期必要とされる処置を提供する
。本発明の方法はまた、ＰＳＣＡを発現するかまたは過剰発現する他の癌（膀胱
癌および膵臓癌を含むがこれらに限定されない）の処置についても有用であり得
る（なぜなら、これら両方の癌は、上昇したレベルのＰＳＣＡを発現するからで
ある）。本発明の抗体治療法法は、化学療法、照射および／または他の治療レジ
メンと組み合わされ得る。
【０１３１】 以下の実施例１８Ａに記載するように、個々のマウス抗ＰＳＣＡ ｍＡｂなら
びにこれらの抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体の組み合わせは、異種の前立腺癌Ｓ
ＣＩＤマウスモデルを用いてインビボにおいて、前立腺癌増殖を有意に阻害し得
る。ある研究において、ヒト前立腺癌異種移植片の注射を受けたＳＣＩＤマウス
の集団は、いくつかのマウス抗ＰＳＣＡ ｍＡｂの組合せで処置された。この研
究の結果によって、この処置が、腫瘍注射後６１日でさえ、これらのマウス全て
において腫瘍形成が完全にブロックされ得たことが示された。対照的に、同じ前
立腺腫瘍異種移植片を受けたがコントロールマウスのＩｇＧで処置されたＳＣＩ
Ｄマウスのコンロトール群中の全ての動物は、その研究の間に有意かつ進行性の
より大量の腫瘍を生じた。抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ調製物を用いたこれらの動物の処
置と関連する明らかな毒性は存在しなかった。なぜなら、処置群の全てのマウス
は実験の間中、生存しかつ健康なままであったからである。本研究に使用された
異種移植片（ＬＡＰＣ−９）は、ホルモン難治性性転移性前立腺癌を有する患者
の骨腫瘍生検から作製され、非常にアンドロゲン感受性の表現型によって特徴付
けられ（ＰＳＡレベルは、レシピエントＳＣＩＤマウスにおける去勢後、ゼロま
で低下する）、特に進行性の増殖特性、およびＰＳＣＡの高レベルの過剰発現に
よって特徴付けられる。ＬＡＰＣ−９は、さらに他の文献において記載される（
ＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／１６６２８，Ｓａｗｙｅｒｓら、１９９８年４月２３
日）。これらの結果は、実施例１８Ｂに記載される第２のインビボ研究において
確認された。さらに、さらなるインビボ研究によって、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂは、
単独で使用される場合に治療的に有効であることが示された（実施例１８Ｃ１、
Ｃ２）。これら全てのインビボ研究において、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ処置を受ける
マウスにおける腫瘍は、有意に低速な増殖速度、より長い潜伏期間を有し、そし
てコントロール抗体の処置を受けるマウスにおける腫瘍と比較してより小さいサ
イズであった。血清ＰＳＡレベルはまた、コントロール処置された動物に対して
より低く、そして腫瘍阻害と相関していた。さらに、異なるＰＳＣＡエピトープ
を認識する抗体ならびに異なるＩｇＧアイソタイプを有する抗体は、治療的に有
効である。１つの研究において、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂは、インビボにおいて、確
立された前立腺癌の増殖を効果的に阻害した（実施例１８、Ｃ４）。この特定の
研究において処置されたマウスの数匹は、ＰＳＣＡ処置後に腫瘍の後退を示した
（実施例１８）。
【０１３２】 さらに、腫瘍保有マウスに投与された３Ｃ５抗体は、ＰＳＣＡを発現する腫瘍
細胞を標的化した。ＬＡＰＣ−９腫瘍を保有するＳＣＩＤマウス（例えば、発現
されたＰＳＣＡ）は、３Ｃ５抗体で処置された。腫瘍は、外植され、そして免疫
組織化学分析によって３Ｃ５抗体の存在について調べられた（実施例２６、図７
１）。固定された組織切片を、ヤギ抗マウスＩｇＧを用いてプローブした。３Ｃ
５抗体は、ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞の塊に局在し（図７１）、そしてこの腫瘍を通
じて検出し得た。ＳＣＩＤマウスは免疫グロブリンを産生しないので、この腫瘍
組織中で検出された抗体は、おそらく３Ｃ５処置に由来する。３Ｃ５抗体の局在
を確認するために、ウエスタンブロット分析を、同じマウス由来の腫瘍外植片に
対して実施した。このブロットは、腫瘍外植片由来のタンパク質抽出物、コント
ロールＩｇＧ抗体および３Ｃ５抗体を含んだ。そしてこのブロットを、ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体でプローブした。ＩｇＧの重鎖および軽鎖が、３Ｃ５処
置マウス由来の腫瘍溶解物中で容易に検出された（図７２）。
【０１３３】 異なる研究結果によってまた、抗ＰＳＣＡ抗体がＰＳＣＡ発現腫瘍を標的化し
得ることが示された。確立されたＬＡＰＣ−９腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスを
、１Ｇ８抗体で処置した。外植された腫瘍を、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体
をプローブとして用いたウエスタンブロット分析によって、１Ｇ８抗体の存在に
ついて調べた（実施例２６、図７２）。重鎖および軽鎖は、１Ｇ８処置されたマ
ウスにおいて容易に検出可能であった。これらの結果により、被験体に投与され
た抗ＰＳＣＡが、循環し得、そしてＰＳＣＡ発現腫瘍を標的化することが示され
る。これは、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体が、循環し得、そして腫瘍（これは
、局所であり、局所的に再発し、そして転移性である）においてＰＳＣＡ発現細
胞を標的化し得ることを示唆する。さらに、これは、結合体化抗ＰＳＣＡモノク
ローナル抗体が、ＰＳＣＡを発現する細胞を標的化し得、そしてこの腫瘍細胞を
殺傷し得ことを示唆する。
【０１３４】 以下の実施例２４に記載するように、個々の抗ＰＳＣＡ ｍＡｂは、異種前立
腺癌ＳＣＩＤマウスモデルにおいてインビボで前立腺癌増殖を阻害し得る。例え
ば、ＳＣＩＤマウスの２つの集団は、ＬＡＰＣ−９の注射を受け、そして、１Ｇ
８または３Ｃ５で処置された。これらの結果により、１Ｇ８または３Ｃ５を単独
で用いた処置が、腫瘍保有マウスにおける腫瘍増殖を阻害したことが示された。
対照的に、同じ前立腺癌異種移植片を受けたがマウスＩｇＧまたはリン酸緩衝液
で処置されたコンロトール群中のマウスは、その研究の間により大きい腫瘍を発
生した。さらに、抗ＰＳＣＡ処置は、コントロールマウスに比べて、抗体処置を
受けたマウスの生命を有意に延長した。抗体処置されたマウスの延長した生命は
、腫瘍増殖の減少と関連し、血清ＰＳＡレベルのレベルに影響を与えた。これら
の結果により、抗ＰＳＣＡ抗体を用いた処置が、腫瘍増殖を阻害することによっ
て腫瘍保有動物の生命を延長し得ることが示される。
【０１３５】 細胞毒性の薬剤と組み合わせた抗ＰＳＣＡ ｍＡｂの効果をまた、試験した。
以下の実施例２５に記載されるように、ＳＣＩＤマウスの２つの集団は、ＰＳＣ
Ａを発現するように操作されたＰＣ３細胞の注射を受け、そして、このマウスを
、１Ｇ８単独でか、またはドキソルビシンとの組合せた１Ｇ８で処置した。この
結果により、１Ｇ８を用いた処置が、ＰＳＣＡ陽性ＰＣ３細胞の腫瘍増殖を阻害
し、そして、１Ｇ８とドキソルビシンとの組合せが、リン酸緩衝液またはドキソ
ルビシン単独で処置されたマウスにおける腫瘍と比較して、腫瘍増殖の阻害に対
して相乗効果を有することが示された。
【０１３６】 従って、実施例２４の結果は、異なるアイソタイプを有する抗ＰＳＣＡモノク
ローナル抗体が、確立されたアンドロゲン依存性腫瘍の増殖阻害に効果的である
ことを示す。例えば、ＬＡＰＣ−９異種移植片を、ホルモン難治性転移性前立腺
癌を有する患者の骨腫瘍生検から作製した。１Ｇ８抗体は、マウスγ−１のアイ
ソタイプの中性抗体である、これは、ＰＳＣＡ抗原と直接相互作用する。３Ｃ５
抗体は、マウスγ−２Ａアイソタイプの抗体であり、これは、細胞および補体に
結合する。従って、１Ｇ８抗体は、抗体依存性の細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
機構を介して、アンドロゲン依存性腫瘍の細胞の細胞傷害性に向くことができ、
そして３Ｃ５抗体は、腫瘍に対して強力な免疫応答を開始することができる。同
様に、実施例２５の結果によって、抗ＰＳＣＡ抗体が、確立されたアンドロゲン
依存性腫瘍の処置において効果的であることが示される。
【０１３７】 患者は、腫瘍中のＰＳＣＡ過剰発現の存在およびＰＳＣＡ過剰発現のレベルに
ついて評価され得、これは、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学評価、定量的
ＰＳＣＡ画像化、またはＰＳＣＡ発現の存在およびＰＳＣＡ発現の程度を容易に
示し得る他の技術を用いる。腫瘍生検または外科的検体の免疫組織化学分析が、
本目的に対して好ましい。腫瘍組織の免疫組織化学分析に関する方法は、当該分
野で周知である。サンプル中のＰＳＣＡ過剰発現のレベルを検出するのに有用な
免疫組織化学分析技術の例は、以下の実施列の節に記載される。
【０１３８】 癌の処置に有用な抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体としては、腫瘍に対して強力
な免疫応答を開始し得るモノクローナル抗体、および細胞傷害性を指向し得るモ
ノクローナル抗体が挙げられる。この点に関して、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂは、補体
媒介の細胞の細胞傷害性機構または抗体依存性の細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
機構（これらの両方は、エフェクター細胞Ｆｃレセプター部位との相互作用のた
めの免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分または補体タンパク質を必要と
する）のいずれかによって、腫瘍細胞溶解を誘発し得る。さらに、腫瘍増殖に対
する直接的な生物学的効果をもたらす抗ＰＳＣＡ ｍＡｂが、本発明の実施に有
用である。このようなｍＡｂは、この効果をもたらすために完全な免疫グロブリ
ンを必要としなくてもよい。このような直接的な細胞傷害性ｍＡｂによって作用
し得る潜在的な機構としては、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍新脈管形
成因子プロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗
ＰＳＣＡ ｍＡｂが抗腫瘍効果をもたらすこの機構は、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、
補体媒介細胞溶解などを決定するように設計された任意の数のインビトロアッセ
イ（例えば、以下の実施例１９に記載されるもの）を用いて評価され得る。
【０１３９】 特定の抗ＰＳＣＡ ｍＡｂまたは抗ＰＳＣＡ ｍＡｂの組み合わせの抗腫瘍活
性は、好ましくは、適切な動物モデルを用いて評価される。異種癌モデル（ここ
で、ヒト癌外植片または継代された異種移植片組織は、免疫易感染性動物（ｉｍ
ｍｕｎｅ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ａｎｉｍａｌ）（例えば、ヌードマウスま
たはＳＣＩＤマウス）に導入される）が、特に適切であり、そして公知である。
ヒト前立腺癌の異種移植モデル（原発性腫瘍の発生、微小転移巣の発生、および
後期疾患の特徴である骨芽細胞転移の形成を再発し得る）の例は、Ｋｌｅｉｎら
、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２−４０８およびＰＣ
Ｔ特許出願ＷＯ９８／１６６２８、Ｓａｗｙｅｒｓら、１９９８年４月２３日刊
行に記載される。本明細書中の例は、インビボにおいて抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ調製
物の抗腫瘍能力を評価するための詳細な実験プロトコールを提供する。確立され
た腫瘍の後退、転移の発生の妨害などを測定する他のインビボアッセイが、意図
される。
【０１４０】 マウスまたは他の非ヒトのモノクローナル抗体およびキメラｍＡｂの使用が、
数人の患者において強力な免疫応答に対する緩和を誘導し得ることに注意すべき
である。最も重篤な場合、このような免疫応答は、強力に腎不全をもたらし得る
免疫複合体の大規模な形成を導き得る。従って、本発明の治療方法の実施に使用
される好ましいモノクローナル抗体は、完全なヒトモノクローナル抗体またはヒ
ト化モノクローナル抗体のいずれか、および標的ＰＳＣＡ抗原と高い親和性で特
異的に結合するが患者において低い抗原性を示すかもしくは抗原性を示さないモ
ノクローナル抗体である。
【０１４１】 本発明の方法は、単一の抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ、ならびに異なるエピトープを認
識するもののような異なる個々のｍＡｂの組合わせ（すなわち、カクテル）の投
与を意図する。このようなｍＡｂカクテルは、これらが異なるエピトープに結合
するｍＡｂを含み、そして／または異なるエフェクター機構を活用するか、もし
くは細胞傷害性ｍＡｂと、免疫エフェクター機能に依存するｍＡｂとを直接組合
わせるｍＡｂを含む限り、特定の利点を有し得る。組合わせたこのようなｍＡｂ
は、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂの投与は、他の治
療薬剤（種々の化学療法剤、アンドロゲンブロッカー、および免疫モジュレータ
ー（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられるが、これらに限定されない
）と組合わせられ得る。抗ＰＳＣＡ ｍＡｂは、それらの「裸の」または結合体
化されていない形態で投与され得るか、または治療薬剤が抗ＰＳＣＡ ｍＡｂに
結合体化された状態であり得る。
【０１４２】 本発明の方法の実施において用いられる抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体は、所
望の送達方法に適切なキャリアを含む薬学的組成物に処方され得る。適切なキャ
リアとしては、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂと組合わせた場合に、抗体の抗腫瘍機能を保
持し、そして被験体の免疫系と非反応性である任意の物質が挙げられる。例とし
ては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：任意の多くの標準的薬学的
キャリア（例えば、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水溶液、静菌水など）（一般には
、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
，１６版、Ａ．Ｏｓａｌ編，１９８０を参照のこと）。
【０１４３】 抗ＰＳＣＡ抗体処方物は、腫瘍部位に抗体を送達し得る任意の経路を介して投
与され得る。潜在的に有効な投与経路としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内など。好ましい投与経路
は、静脈内注射による。静脈内注射のための好ましい処方物は、保存された静菌
水、滅菌の保存されていない水の溶液中に、および／または０．９％ 滅菌注射
用塩化ナトリウム（米国薬局方）を含むポリ塩化ビニルもしくはポリエチレンの
バッグ中に希釈された抗ＰＳＣＡ ｍＡｂを含む。抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ調製物は
、凍結乾燥され得、そして好ましくは減圧下で滅菌粉末として保存され得、次い
で、注射前に、例えば、ベンジルアルコール防腐剤を含む静菌水または滅菌水中
に再構成され得る。
【０１４４】 処置は、一般に、受容可能な投与経路（例えば、静脈内注射（ＩＶ））を介し
た有効用量の抗ＰＳＣＡ抗体調製物の反復投与を含む。投薬量は、当業者によっ
て一般に理解される種々の因子に依存する。これらの因子としては、以下が挙げ
られるが、これらに限定されない：ガンおよび重篤度の型、悪性度分類（ｇｒａ
ｄｅ）、すなわちガンの病期、使用したｍＡｂの結合親和性および半減期、患者
におけるＰＳＣＡ発現の程度、循環している遊離（ｓｈｅｄ）ＰＳＣＡ抗原の程
度、所望の安定期抗体濃度レベル、処置の頻度、ならびに本発明の処置方法と組
合わせて用いられる化学療法剤の影響。代表的な１日用量は、約０．１〜１００
ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。１０〜５００ｍｇ ｍＡｂ／週の範囲の用量が有
効かつ十分に寛容であるが、より高い１週間毎の用量ですら、適切かつ／または
／または十分に寛容され得る。適切な用量を規定する際の重要な決定因子は、特
定の状況において治療的に有効であるために必要な特定の抗体の量である。反復
投与は、腫瘍阻害または後退を達成するために必要であり得る。最初の負荷用量
は、より高くてもよい。最初の負荷用量は、注入として投与され得る。周期的な
維持用量は、同様に投与され得るが、ただし、初期用量は十分に寛容されている
。
【０１４５】 ＰＳＣＡ ｍＡｂの直接投与もまた可能であり、そして特定の状況において利
点を有し得る。例えば、膀胱癌の処置のために、ＰＳＣＡ ｍＡｂは、膀胱に直
接注射され得る。膀胱に直接投与されたＰＳＣＡ ｍＡｂは、患者から迅速に消
失するので、抗原性の有意な合併症無く、非ヒトまたはキメラ抗体を効率的に使
用することもまた可能であり得る。
【０１４６】 患者は、最も有効な投薬レジメンおよび関連する因子の決定を補助するために
、血清ＰＳＣＡについて評価され得る。実施例２０（後述）に記載のＰＳＣＡ捕
捉ＥＬＩＳＡまたは類似のアッセイは、処置前に患者の循環ＰＳＣＡレベルを定
量するために用いられ得る。このようなアッセイはまた、治療全体を通してモニ
ターする目的で使用され得、そして血清ＰＳＡレベルのような他のパラメーター
の評価と組合わせて治療結果を測定するために有用であり得る。
【０１４７】 本発明は、ＰＳＣＡタンパク質またはそのフラグメントを含むように処方され
たワクチンを、さらに提供する。抗癌治療における使用についての、体液性免疫
および細胞媒介性免疫を産生するためのワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当
該分野で周知であり、そして例えば、ヒトＰＳＭＡ免疫原および齧歯類ＰＡＰ免
疫原を用いた前立腺癌において、利用されている（Ｈｏｄｇｅら、１９９５、Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：２３１−２３７；Ｆｏｎｇら、１９９７、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３−３１１７）。このような方法は、ＰＳＣＡ
タンパク質もしくはそのフラグメント、または、ＰＳＣＡ免疫原を発現および適
切に提示し得るＰＳＣＡをコードする核酸分子および組換えベクターの利用によ
って容易に実施され得る。
【０１４８】 例えば、ウイルス遺伝子の送達系が、ＰＳＣＡをコードする核酸分子の送達に
使用され得る。本発明のこの局面の実施において用いられ得る種々のウイルス遺
伝子の送達システムとしては、ワクシニア、鶏痘、カナリア痘、アデノウイルス
、インフルエンザ、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスおよ
びシンドビスウイルス（ｓｉｎｄｂｕｓ ｖｉｒｕｓ）が挙げられるが、これら
に限定されない（Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．８：６５８−６６３）。非ウイルス性送達システムがまた、患者に導入さ
れた（例えば、筋肉内に）ＰＳＣＡタンパク質またはそのフラグメントをコード
する裸のＤＮＡの使用によって利用され、抗腫瘍応答を誘導し得る。１つの実施
形態において、全長のヒトＰＳＣＡ ｃＤＮＡが利用され得る。別の実施形態に
おいて、特定の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードするＰＳＣ
Ａ核酸分子が、利用され得る。ＣＴＬエピトープが、特定のアルゴリズム（例え
ば、Ｅｐｉｍｅｒ，Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いて決定され、特
異化されたＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得るＰＳＣＡタンパク質内のペプチ
ドを同定し得る。
【０１４９】 種々のエキソビボ戦略がまた、利用され得る。１つのアプローチは、樹状細胞
の使用を含み、患者の免疫系に対してＰＳＣＡ抗原を提示する。樹状細胞は、Ｍ
ＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７同時刺激因子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａ
ｔｏｒ）ならびにＩＬ−１２を発現し、従って、高度に特異化された抗原提示細
胞である。前立腺癌においては、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドを
用いてパルスされた自己樹状細胞が、第Ｉ相臨床試験において用いられ、前立腺
癌患者の免疫系を刺激する（Ｔｊｏａら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２８：
６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９：３７１−３
８０）。樹状細胞は、ＰＳＣＡペプチドをＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラ
スＩＩ分子の状況におけるＴ細胞に提示するために用いられ得る。１つの実施形
態において、自己樹状細胞は、ＭＨＣ分子と結合し得るＰＳＣＡペプチドを用い
てパルスされる。別の実施形態において、樹状細胞は、完全なＰＳＣＡタンパク
質を用いてパルスされる。さらに別の実施形態は、アデノウイルス（Ａｒｔｈｕ
ｒら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レト
ロウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６
：３７６３−３７７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトラン
スフェクション（Ｒｉｂａｓら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２８
６５−２８６９）および腫瘍誘導性ＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙ
ら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２）のような、
当該分野において公知の種々の実行（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）ベクターを用
いた樹状細胞におけるＰＳＣＡ遺伝子の過剰発現を操作する工程を包含する。
【０１５０】 抗イディオタイプ抗ＰＳＣＡ抗体はまた、ＰＳＣＡタンパク質を発現する細胞
に対する免疫応答を誘導するためのワクチンとして、抗癌治療において用いられ
得る。特に、抗イディオタイプ抗体の産生は、当該分野で周知であり、そして、
ＰＳＣＡタンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗ＰＳＣＡ抗体
を産生するために、容易に適応され得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３３−４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ Ｃｌｉｎ
Ｉｎｖｅｓｔ ９６：３３４−３４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ４３：６５−７６を参照のこと
）。このような抗イディオタイプ抗体は、腫瘍抗原に対して指向される他の抗イ
ディオタイプ抗体を用いて現在実施される場合に、抗イディオタイプ治療におい
て用いられ得る。
【０１５１】 遺伝的免疫化方法は、ＰＳＣＡを発現する癌細胞に対して指向される、予防的
または治療的体液性免疫応答および細胞性免疫応答を産生するために、利用され
得る。本明細書中で記載されるＰＳＣＡをコードするＤＮＡ分子を用いて、ＰＳ
ＣＡタンパク質／免疫原および適切な調節配列をコードするＤＮＡを含む構築物
が、個体の筋肉または皮膚に直接的に注入され得、その結果、筋肉または皮膚の
細胞が、構築物を利用して、そしてコードされたＰＳＣＡタンパク質／免疫抗原
を発現する。ＰＳＣＡタンパク質／免疫原は、細胞表面タンパク質として発現さ
れ得るかまたは分泌され得る。ＰＳＣＡタンパク質／免疫原の発現は、前立腺癌
に対して、予防的または治療的な体液性免疫および細胞性免疫の産生を生じる。
当該分野で公知の、種々の予防的および治療的な遺伝的免疫化技術が用いられ得
る（概説については、インターネットアドレスｗｗｗ．ｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍで
公開される情報および参考文献を参照のこと）。
【０１５２】 本発明は、その細胞表面上の複数のＰＳＣＡ抗原を発現する細胞の細胞活性（
例えば、細胞増殖、細胞活性化または細胞繁殖）を阻害するための方法をさらに
提供する。この方法は、本発明の免疫結合体（例えば、異種混合物または同種混
合物）を細胞と反応させ、その結果、細胞表面上のＰＳＣＡ抗原が、免疫結合体
との複合体を形成する工程を包含する。細胞表面上のＰＳＣＡ抗原の数が増加す
る程、用いられ得るＰＳＣＡ抗体複合体の数も増加する。ＰＳＣＡ抗体複合体の
数が増加する程、阻害される細胞活性も増加する。細胞活性の阻害が細胞死を生
じる場合、新生物形成状態または前新生物形成状態を有する被験体が、この方法
に従って、処置され得る。
【０１５３】 異種混合物は、異なるエピトープまたは同一のエピトープを認識するＰＳＣＡ
抗体（各々の抗体は、同一の治療薬剤または異なる治療薬剤と結合体化されてい
る）を含む。同種混合物は、同一のエピトープを認識する抗体（各々の抗体は、
同一の治療薬剤と結合体化される）を含む。
【０１５４】 本発明は、ＰＳＣＡがそのリガンドと結合することをブロックすることによっ
て、ＰＳＣＡの生物学的活性を阻害するための方法をさらに提供する。この方法
は、ＰＳＣＡ免疫結合体またはＰＳＣＡ抗体複合体を可能にする条件下で、ある
量のＰＳＣＡを、本発明の抗体または免疫結合体と接触させ、それによって、Ｐ
ＳＣＡがそのリガンドと結合することをブロックし、そしてＰＳＣＡの活性を阻
害する工程を包含する。
【０１５５】 別の実施形態において、本発明は、本発明の免疫結合体のいずれか１つまたは
組み合わせを、細胞を阻害するに十分な量で細胞と反応させることによって、Ｐ
ＳＣＡ抗原を発現する細胞を選択的に阻害する方法を提供する。このような量は
、細胞を殺傷する量、または細胞成長または細胞増殖を阻害するに十分な量を含
む。すでに議論した通り、用量および投薬レジメンは、ＰＳＣＡ、その集団、抗
体が指向されるべき部位、特定の免疫毒素の特徴および患者に関連した処置され
るべき疾患または障害の性質に依存する。例えば、免疫結合体の量は、０．１〜
２００ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲であり得る。
【０１５６】 （ＰＳＣＡタンパク質ならびにＰＳＣＡ遺伝子およびＲＮＡを同定するための
方法） 本発明は、ＰＳＣＡタンパク質またはＰＳＣＡ遺伝子を発現する、細胞、組織
または器官を同定するための方法を提供する。このような方法は、インビボまた
はインビトロでＰＳＣＡタンパク質を発現する、細胞または器官の存在を診断す
るために用いられ得る。本発明の方法は、特に、前立腺の病理学的状態を媒介す
る細胞の存在の決定において有用である。特に、ＰＳＣＡタンパク質の存在は、
ＰＳＣＡタンパク質またはＰＳＣＡタンパク質をコードする核酸が発現されるか
否かを決定することによって、同定され得る。ＰＳＣＡタンパク質の発現は、Ｐ
ＳＣＡタンパク質またはＰＳＣＡ遺伝子を発現する、細胞、組織または器官の存
在を診断するための手段として、用いられ得る。
【０１５７】 種々の免疫学的および分子遺伝学的技術が、ＰＳＣＡタンパク質が、特定の細
胞またはサンプル中で発現／産生されるか否かを決定するために、用いられ得る
。一般に、核酸分子を含む抽出物またはタンパク質を含む抽出物が調製される。
次いで、抽出物は、ＰＳＣＡタンパク質またはＰＳＣＡをコードする核酸分子が
細胞中で産生されるか否かを決定するために、アッセイされる。
【０１５８】 当該分野で周知の種々のポリヌクレオチドを基にした検出方法が、ＰＳＣＡを
コードする核酸分子の検出のため、および生物学的試料中のＰＳＣＡ発現細胞の
検出のために、利用され得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＰＳＣＡのｍＲＮＡ
またはそのフラグメントを選択的に増幅するために用いられ得、そしてこのよう
な方法は、後述の実施例１において記載されるように、ＰＳＣＡを発現する細胞
を同定するために、利用され得る。特定の実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲは、
微小転移性の前立腺癌細胞、膀胱癌細胞もしくは膵臓癌細胞または循環性の前立
腺癌細胞、膀胱癌細胞もしくは膵臓癌細胞を検出するために用いられる。種々の
他の増幅型検出方法（例えば、分枝ＤＮＡ方法のような）およびＤＮＡプローブ
またはＲＮＡプローブを用いた種々の周知のハイブリダイゼーションアッセイは
また、ＰＳＣＡをコードするポリヌクレオチドまたはＰＳＣＡ発現細胞の検出の
ために用いられ得る。
【０１５９】 タンパク質の検出のための種々の方法は、当該分野で周知であり、そしてＰＳ
ＣＡタンパク質およびＰＳＣＡ発現細胞の検出のために利用され得る。タンパク
質に基づいた診断試験を行うために、適切なタンパク質サンプルが得られ、そし
て従来技術を用いて調製される。タンパク質サンプルは、例えば、単にＳＤＳと
ともにサンプルをボイルすることによって調製され得る。次いで、抽出されたタ
ンパク質は、公知の方法を用いて、ＰＳＣＡタンパク質の存在を決定するために
分析され得る。例えば、特異的なサイズのタンパク質の改変体または特異的に荷
電したタンパク質の改変体の存在は、電場における移動度を使用して同定され得
る。あるいは、抗体は、検出の目的のために用いられ得る。当業者は、公知のタ
ンパク質分析方法を容易に適応し、サンプルがＰＳＣＡタンパク質を含むか否か
を決定し得る。
【０１６０】 あるいは、ＰＳＣＡ発現はまた、ＰＳＣＡ遺伝子の発現のレベルを減少させる
薬剤を同定するための方法において、用いられ得る。例えば、ＰＳＣＡタンパク
質を発現する、細胞または組織が、試験薬剤と接触され、ＰＳＣＡ発現に対する
薬剤の効果を決定し得る。ＰＳＣＡ発現を活性化する薬剤は、ＰＳＣＡ活性のア
ゴニストとして用いられ得、一方、ＰＳＣＡ発現を減少させる薬剤は、ＰＳＣＡ
活性のアンタゴニストとして用いられ得る。
【０１６１】 （ＰＳＣＡプロモーターおよび他の発現調節エレメント） 本発明は、発現ベクターおよびトランスジェニック動物を産生するために用い
られ得る形態において、新規に同定されたＰＳＣＡ遺伝子の５’側で見出された
、発現制御配列をさらに提供する。特に、ＰＳＣＡプロモーター（ＰＳＣＡ遺伝
子におけるＡＴＧ開始コドンから５’側にあると容易に同定され得、そして作動
可能に連結された、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現を指向するために
用いられ得る）のようなＰＳＣＡ発現制御エレメント。ＰＳＣＡ発現が、前立腺
細胞において主に発現されるため、発現制御エレメントは、組織特異的様式にお
いて誘導された導入遺伝子の発現の指向において、特に有用である。当業者は、
当該分野で公知の方法を用いて、発現ベクターにおける、ＰＳＣＡ遺伝子プロモ
ーターおよび他の調節エレメントを容易に使用し得る。
【０１６２】 真核生物細胞において、調節配列は、遺伝子のコード領域の上流、下流および
内部で見出され得る。真核生物調節配列は、プロモーター配列、そして時折、少
なくとも１つのエンハンサー配列を含む。代表的な真核生物遺伝子において、プ
ロモーター配列は、遺伝子のコード領域に対して上流および近接して存在し、そ
して１方向に方向付けられて、遺伝子の発現を制御するはずである。代表的な真
核生物遺伝子において、エンハンサー配列は、遺伝子のコード領域の上流、下流
および内部にさえも存在し得、そして遺伝子の発現を増強するような方向または
抑制するような方向のいずれかに向き得る。
【０１６３】 本発明はＰＳＣＡコード領域の上流の９ｋｂの配列を含むＤＮＡフラグメント
を提供する。このＰＳＣＡフラグメントが作動可能に連結された導入遺伝子の発
現を駆動する能力は、細胞にトランスフェクトされた一連のキメラレポーター構
築物を用いて試験された。そのキメラレポーター構築物は、ネイティブな内因性
ＰＳＣＡと同様の発現パターンを示し、そしてそのＰＳＣＡフラグメントは順配
向で連結した場合に、導入遺伝子の発現を駆動する。従って、このＰＳＣＡフラ
グメントは、プロモーター様の活性を示すＰＳＣＡ上流の調節領域を含む。
【０１６４】 ＰＳＣＡ転写物はまた、前立腺腫瘍細胞中に有意に高いレベルで存在するが、
良性の前立腺過形成中には存在しない。従って、ＰＳＣＡ転写物は、前立腺優勢
の様式において検出可能であり、そして前立腺腫瘍サンプルにおいてより高いレ
ベルで検出可能である。有意により高いレベルのＰＳＣＡ転写物、または当該分
野で公知のような過剰発現は、正常な前立腺における検出可能なＰＳＣＡ転写物
の量の測定および、前立腺腫瘍サンプルとの比較によって決定され得る。この比
較は、ノーザン分析およびＲＴ−ＰＣＲアッセイを含む、当該分野で周知の方法
によって行われ得、そして転写物レベルにおける相異が定量され得る。従って、
サンプルにおける測定可能な程に異なる量のＰＳＣＡ転写物（すなわち、正常な
サンプルからのＰＳＣＡ転写物の数を超える、試験サンプルにおけるＰＳＣＡ転
写物の数）の存在は、前立腺癌の存在を示すのに使用され得る。
【０１６５】 ＰＳＣＡ発現はまた、他のヒトのガン（特に、膀胱および膵臓の癌腫）におい
て観察され得る。膀胱癌腫の場合において、ＰＳＣＡ発現の程度は、疾患の重篤
度と相関するようであり、侵襲性膀胱癌における過剰発現の最高レベルに達する
（以下の実施例１７を参照のこと）。
【０１６６】 ＰＳＣＡの転写物およびタンパク質の蓄積のパターンは公知であり、そしてＰ
ＳＣＡ上流調節領域が単離され、そして特徴付けられた。導入遺伝子に作動可能
に連結したＰＳＣＡ上流調節領域を含む一連のキメラ構築物が、試験された。そ
のＰＳＣＡ上流調節領域は、種々の前立腺細胞および細胞株、ならびに膀胱にお
いて、導入遺伝子の発現を駆動し、そして腎臓においてより低い程度に駆動する
。従って、ＰＳＣＡ上流領域は、前立腺優勢な様式において導入遺伝子の発現を
駆動する。
【０１６７】 好ましい実施形態において、図４２に示される様な、ＰＳＣＡ遺伝子の５’上
流領域由来の９ｋｂ、６ｋｂ、３ｋｂ、および１ｋｂのＤＮＡフラグメントが、
本明細書で記載される技術によって産生された。９ｋｂのＰＳＣＡ上流領域（ｐ
ＥＧＦＰ−ＰＳＣＡ）は、遺伝子調節活性に関係し、そして１９９９年５月１７
日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ
ＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，
ＭＤ ２０８５２に寄託され、そしてそこで、以下のＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−８０
として同定される。この９ｋｂのフラグメントはＴ７プライマーおよびＲＩｈＰ
ＳＣＡ３’−５（５’−ｇｇｇａａｔｔｃｇｃａｃａｇｃｃｔｔｃａｇｇｇｔｃ
−３’）を用いた増幅によって得られた。
【０１６８】 （遺伝子調節活性を有するフラグメントの使用） 本発明は、細胞／部位に対して、目的の遺伝子を標的化し、その結果、その遺
伝子によりコードされたタンパク質が発現され得、それにより、疾患状態を直接
または間接的に回復させるための方法（例えば、遺伝子治療法）を提供する。
【０１６９】 感受性の細胞が、腫瘍細胞において有意に増大した遺伝子発現活性を有するＰ
ＳＣＡ上流領域の制御下で導入遺伝子（例えば、治療遺伝子）を発現する発現ベ
クターと共に導入される。腫瘍細胞において優勢に治療遺伝子を発現する発現ベ
クターの使用は、前立腺、膀胱および、膵臓腫瘍細胞のような標的細胞において
治療遺伝子を発現させる。
【０１７０】 感受性細胞を感染した後、導入遺伝子（例えば、治療遺伝子）が、その導入遺
伝子によってコードされたタンパク質を発現するベクターにおいて、増大した遺
伝子発現活性を有するＰＳＣＡ上流領域によって駆動される。かなり特異的な前
立腺特異的遺伝子ベクターの使用は、標的細胞（例えば、前立腺癌細胞）におけ
る特定の遺伝子の選択的な発現を可能にする。
【０１７１】 増大した遺伝子発現活性を有するＰＳＣＡ領域は、誘導体分子を産生するため
に、例えば配列の変異、欠失、および挿入によって改変され得る。改変は、前立
腺細胞に特異的な調節タンパク質に結合し得る配列の数の増加、および遺伝子発
現活性を有するＰＳＣＡ領域において機能しない配列の欠失を含む。他の改変は
、エンハンサーの付加を含み、それによって、プロモーター活性を有するＰＳＣ
Ａ領域の効率が改善される。エンハンサーは、位置独立的な様式において機能し
得、そして、転写される領域の上流、内部または下流に位置し得る。
【０１７２】 誘導体分子は、増大した遺伝子発現活性を有するＰＳＣＡ上流領域の機能特性
を保持する。すなわち、このような置換を有する分子は、フラグメントの３’に
位置する目的の遺伝子の前立腺組織特異的な発現を、実質的に、なお可能にする
。改変は、誘導体分子が、プロモーター活性のみを有するＰＳＣＡフラグメント
と比較して、実質的に前立腺特異的な様式で遺伝子発現を駆動するその能力を保
持している限り、許容される。
【０１７３】 好ましい実施形態において、ベクターは、プロモーター活性を有するＰＳＣＡ
上流領域の下流に異種配列（治療遺伝子）を挿入することによって、構築された
。
【０１７４】 治療遺伝子の例には、自殺遺伝子（ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ）が挙げられる
。これらは、その発現によって、腫瘍細胞の増殖または腫瘍細胞の死（例えば、
前立腺腫瘍細胞）を阻害するタンパク質または因子が産生される遺伝子配列であ
る。自殺遺伝子には、酵素（例えば、プロドラッグ酵素）をコードする遺伝子、
癌遺伝子、癌抑制遺伝子、毒素をコードする遺伝子、サイトカインをコードする
遺伝子、またはオンコスタチンをコードする遺伝子が挙げられる。治療遺伝子の
目的は、癌細胞の増殖を阻害するか、または癌細胞を殺傷すること、あるいはサ
イトカインまたは直接もしくは間接的に癌細胞の増殖を阻害するか、もしくは前
立腺癌細胞を殺傷する他の細胞傷害性因子を産生することである。
【０１７５】 適切なプロドラッグ酵素には、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来
のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）遺伝子、
またはＥ．Ｃｏｌｉのシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、もしくはヒポキサンチン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）が挙げられる。
【０１７６】 適切な癌遺伝子および癌抑制遺伝子には、ｎｅｕ、ＥＧＦ、ｒａｓ（Ｈ ｒａ
ｓ、Ｋ ｒａｓ、およびＮ ｒａｓを含む）、ｐ５３、網膜芽癌抑制遺伝子（Ｒ
ｂ）、ウィルムス腫瘍遺伝子産物、ホスホチロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓ
ｅ）、およびｎｍ２３が挙げられる。適切な毒素には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
体外毒素ＡおよびＳ；ジフテリア毒素（ＤＴ）；Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＴ毒素、Ｓｈ
ｉｇａ毒素、Ｓｈｉｇａ様毒素（ＳＬＴ−１、−２）、リシン、アブリン、スポ
リン、およびゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）が挙げられる。
【０１７７】 適切なサイトカインには、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦインターロイキン
、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（Ｗｏｎｇ Ｇら、Ｈｕｍａｎ ＧＭ−ＣＳＦ：Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ
ＤＮＡ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ
ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９
８５；２２８：８１０）；ＷＯ９３２３０３４（１９９３）；Ｈｏｒｉｓｂｅｒ
ｇｅｒ ＭＡら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｅ
ｓ ｏｆ ｃＤＮＡｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ− ａｎｄ ｖｉｒｕｓ
−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｕｍａｎ Ｍｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｖｅａｌ ｔｈ
ａｔ ｔｈｅｙ ｃｏｎｔａｉｎ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕ
ｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅ
ｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０年３月，６４（３）：
１１７１−８１；Ｌｉ ＹＰら、Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋ
ｉｎｅｓ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ａｎｄ
ＩＬ−６，ｂｕｔ ｎｏｔ ＩＬ−１，ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ
ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２年２月１日，１４８（３）：７８８−９４
；Ｐｉｚａｒｒｏ ＴＴら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ ａｌｐｈａ
ａｎｄ ＴＮＦ ｂｅｔａ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ
ｃａｒｄｉａｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｌｌｏｇｒａｆｔ
ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９３年８月，５
６（２）：３９９−４０４）が挙げられる。（Ｂｒｅｖｉａｒｉｏ Ｆら、Ｉｎ
ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｅｎｄｏｔ
ｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅ ｒ
ｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｓｅｒ
ｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２年１１月５日，２６７（３１
）：２２１９０−７；Ｅｓｐｉｎｏｚａ−Ｄｅｌｇａｄｏ Ｉら、Ｒｅｇｕｌａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅｓ
ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅ
ｃｔｓ ｏｆ ＩＬ−２ ａｎｄ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２年１１月１日，１４９（９）：２９６１−８
；Ａｌｇａｔｅ ＰＡら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌ
ｅｕｋｉｎ−３（ＩＬ−３）ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ＩＬ−３ ｉｎ ｔｈｅ
ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＦＬ５．１２ ｃｅｌｌ ｌｉｎ
ｅ．Ｂｌｏｏｄ，１９９４年５月１日，８３（９）：２４５９−６８；Ｃｌｕｉ
ｔｍａｎｓ ＦＨら、ＩＬ−４ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＩＬ−２−，
ＩＬ−３−，ａｎｄ ＧＭ−ＣＳＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅ
ｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏ
ｎｏｃｙｔｅｓ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９４年６月
，６８（６）：２９３−８；Ｌａｇｏｏ，ＡＳら、ＩＬ−２，ＩＬ−４，ａｎｄ
ＩＦＮ−ｇａｍｍａ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｒｓｕｓ ｓｅ
ｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ
ｃｅｌｌｓ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｏｓｔｉ
ｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏ
ｌｅｃｕｌｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４年２
月１５日，１５２（４）：１６４１−５２；Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＯＭら、ＩＬ−
２ ａｎｄ ＩＬ−５ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎ
ｓｅ ｔｏ ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ａｌｌｏｇｒａｆｔ
ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ
ｔｉｏｎ，１９９３年５月，５５（５）：１１５９−６６；Ｐａｎｇ Ｇら、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ，ＩＬ−１ ａｌｐｈａ，ＩＬ−１ ｂｅｔａ，ＩＬ−６，ＩＬ−８
，ＩＬ−１０，ＩＣＡＭ−１ ａｎｄ ＶＣＡＭ−１ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａ
ｎ ｄｕｏｄｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉ
ｔｈ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＩＬ−１ ａｌｐｈａ ａｎｄ
ＴＮＦ−ａｌｐｈａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４年６月，９６（３）：４３７−４３；Ｕｌｉ
ｃｈ ＴＲら、Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅ
ｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．ＩＩＩ．ＩＬ−６ ｍＲＮＡ
ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ
ｉｎ ｖｉｖｏ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＩＬ−６
．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１年４月１日，１４６
（７）：２３１６−２３；Ｍａｕｖｉｅｌ Ａら、Ｌｅｕｋｏｒｅｇｕｌｉｎ，
ａ Ｔ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ，ｉｎｄｕｃｅｓ ＩＬ
−８ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ
ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌ
ａｓｔｓ．Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＮＦ−ｋａ
ｐｐａ Ｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ−ｄｒｉｖｅｎ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，１９９２年１１月１日，１４９（９）：２９６９−７６）。
【０１７８】 成長因子には、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦα）およびβ（Ｔ
ＧＦβ）、サイトカインコロニー刺激因子（Ｓｈｉｍａｎｅ Ｍら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｇ−ＣＳＦ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔ
ｉｏｎｓ，１９９４年２月２８日，１９９（１）：２６−３２；Ｋａｙ ＡＢら
、Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔ
ｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３（ＩＬ−
３），ＩＬ−４，ＩＬ−５，ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈ
ａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ｉｎ ａｌｌ
ｅｒｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌａｔｅ−ｐｈａｓｅ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｒ
ｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｔｏｐｉｃ ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９１年３月１日，１
７３（３）：７７５−８；ｄｅ Ｗｉｔ Ｈら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒ
ｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ−ＣＳＦ ａｎｄ ＩＬ−６ ｇｅｎｅ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９４年２月，８６（２）：
２５９−６４；Ｓｐｒｅｃｈｅｒ Ｅら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１
ｂｅｔａ，ＴＮＦ−ａｌｐｈａ，ａｎｄ ＩＬ−６ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ ｉｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌ
ｌｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｅｘｕｄａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉ
ｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒ
ｕｓ−１．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９２，１２６（１
−４）：２５３−６９）。
【０１７９】 本発明の方法における使用に適切なベクターは、アデノウイルス、レンチウイ
ルス、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のベクターを含
むウイルス性ベクターである。
【０１８０】 好ましくは、選択されたウイルス性ベクターは、以下の基準を満たすべきであ
る：１）そのベクターは、腫瘍細胞に感染し得なければならず、従って、適切な
宿主範囲を有するウイルス性ベクターが選択されなければならない；２）転移さ
れる遺伝子は、長期間細胞中で持続し得、そして発現され得るべきである；そし
て３）そのベクターは、宿主に対して安全であるべきであり、そして最少の細胞
の形質転換を引き起こすべきである。レトロウイルスベクターおよびアデノウイ
ルスは、哺乳動物細胞に、外来の遺伝子を効率的に導入し、そして発現する、効
率的で有用な、そして現在では最もよく特徴付けられた手段を提供する。非常に
広い宿主および細胞型の範囲を有するこれらのベクターは、遺伝子を安定に、か
つ効率的に発現する。これらのベクターの安全性は、多くの研究グループによっ
て証明された。実際、その多くが臨床試験にある。
【０１８１】 障害の補正のために細胞に遺伝子を転移するために使用され得る他のウイルス
ベクターには、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）のようなレトロ
ウイルス；ＪＣ、ＳＶ４０、ポリオーマのようなパポバウイルス；エプスタイン
−バーウイルス（ＥＢＶ）；パピローマウイルス（例えば、ウシパピローマウイ
ルスＩ型（ＢＰＶ））；ワクシニアおよびポリオウイルスならびに他のヒトおよ
び動物のウイルスが挙げられる。
【０１８２】 アデノウイルスは、それ自身をクローニングビヒクルとして魅力的にするいく
つかの特性を有する（Ｂａｃｈｅｔｔｉｓら、Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｇｅｎ
ｅ ｆｏｒ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｈｕｍ
ａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ
ｖｉｒａｌ ＤＮＡ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１９７７ ７４：１５９０；Ｂｅｒｋ
ｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖ
ｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕ
ｓ ｇｅｎｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８ ６：６１６；Ｇｈｏ
ｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｇら、Ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｇｅｎｅ １９８６；５０：１６１；Ｈａｇ
−Ａｈｍａｎｄ Ｙら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｅｌｐｅｒ−ｉ
ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａ
ｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅ
ｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ
ｇｅｎｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９８６；５７：２５７；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ Ｍ
ら、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ α1−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｇｅｎｅ ｔｏ ｔ
ｈｅ ｌｕｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １
９９１；２５２：４３１）。
【０１８３】 例えば、アデノウイルスは、細胞核において複製する中間のサイズのゲノムを
有し：多くの血清型が臨床的に無害であり；アデノウイルスゲノムは、外来の遺
伝子を挿入するが、安定なようであり：外来の遺伝子は、欠失または再配列する
ことなく維持されるようであり；そしてアデノウイルスは、４週間から数ヶ月ま
での発現期間を有する高いレベルの一過性発現ベクターとして使用され得る。広
範な生化学および遺伝的研究は、ネイティブのアデノウイルス配列への７〜７．
５ｋｂまでの異種配列の置換によって、生存可能で、条件的な、ヘルパー独立性
ベクターを作製可能であることを示唆する（Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．：ｉｄｅ
ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｎｅｃｅｓｓａ
ｒｙ ｆｏｒ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔ
ｒｏｌ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｃＤＮＡ ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１９８５ ８２：６８
９）。
【０１８４】 ＡＡＶは、約５ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを有する小さなヒトパルボウイルス
である。このウイルスは、いくつかのヒト細胞型において、組込み型プロウイル
スとして増殖され得る。ＡＡＶベクターは、ヒトの遺伝子治療にとっていくつか
の利点を有する。例えば、ＡＡＶベクターはヒト細胞に対して栄養性であるが、
他の哺乳動物細胞にもまた感染し得る；（２）ヒトまたは他の動物において、Ａ
ＡＶに関連する疾患はない；（３）組込まれたＡＡＶゲノムは、その宿主細胞内
で安定であるようである；（４）ＡＡＶの組込みが、宿主の遺伝子もしくはプロ
モーターの発現を変化させるか、またはその再配列を促進するという証拠がない
；（５）導入された遺伝子は、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスの感染
によって、宿主細胞から奪還され得る。
【０１８５】 ＨＳＶ−１ベクター系は、非有糸細胞への実質的にいかなる遺伝子の導入をも
容易にする（Ｇｅｌｌｅｒら、ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ
ｍｕｔａｎｔ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａ ｄｅｆｅｃｔ
ｉｖｅ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｐｏｔ
ｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈ
ｅｒａｐｙ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．ＰＮＡＳ Ｕ
ＳＡ，１９９０ ８７：８９５０）。
【０１８６】 哺乳動物遺伝子の転移のための別のベクターは、ウシパピローマウイルスに基
づくベクターである（Ｓａｒｖｅｒ Ｎら、Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ
ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９８１；１：４８６）。
【０１８７】 ワクシニアおよび他のポックスウイルスに基づくベクターは、哺乳動物遺伝子
転移系を提供する。ワクシニアウイルスは、１２０キロダルトン（ｋｄ）のゲノ
ムサイズの巨大な二本鎖ＤＮＡウイルスである（Ｐａｎｉｃａｌｉ Ｄら、Ｃｏ
ｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ａｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ：Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎ
ａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｉ
ｎｔｏ ｔｈｅ ＤＮＡ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉ
ｒｕｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８２；７９：４
９２７；Ｓｍｉｔｈら、ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８
３ ３０２：４９０）。
【０１８８】 レトロウイルスは、ウイルス遺伝子の宿主細胞への挿入のために設計されたパ
ッケージである（Ｇｕｉｌｄ Ｂら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｔｒ
ｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖ
ｏ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９８８；６２：７９５；Ｈｏｃｋ ＲＡら、Ｒｅｔｒｏ
ｖｉｒｕｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ
ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ
１９８６；３２０：２７５）。
【０１８９】 基本的なレトロウイルスは、プロウイルスのタンパク質中にパッケージングさ
れたＲＮＡの２つの同一鎖からなる。そのコアはエンベロープと呼ばれる保護被
膜によって囲まれ、そのエンベロープは、ウイルスによって寄与される糖タンパ
ク質で改変される以外は、前の宿主の膜に由来する。
【０１９０】 好ましくは、例えば、前立腺における細胞の欠損、疾患または損傷の処置にの
ために、本発明のベクターは、治療遺伝子または導入遺伝子（例えば、ＴＫをコ
ードする遺伝子）を含む。その遺伝的に改変されたベクターは、欠損、疾患（例
えば、前立腺癌をインビボで改善効果を有する内因性分子の産生を増大する治療
遺伝子産物の前立腺への導入によって）を処置するために前立腺に投与される。
この同じ原理は、他の癌（例えば、ＰＳＣＡを発現する膵臓癌、膀胱癌または他
の癌）の処置に関して適用される。
【０１９１】 本発明の方法のこの実施形態における基本的な課題は、目的の遺伝子の単離、
遺伝子調節活性を有するフラグメントへの目的遺伝子の結合、目的の遺伝子を身
体に送達するための適切なベクタービヒクルの選択、目的の遺伝子を有するベク
ターの身体への投与、および標的細胞への目的遺伝子の適切な発現の達成である
。本発明は、クローン化された遺伝子（すなわち、目的の遺伝子）を、この遺伝
子を必要とする患者の血流または関連する器官に直接注射され得るような様式で
のパッケージングを提供する。そのパッケージングは、外来のＤＮＡを、免疫系
による排除から保護し、そしてそれを適切な組織または細胞へ指向させる。
【０１９２】 ヒトまたは動物の目的の遺伝子と共に、別の遺伝子（例えば、選択可能マーカ
ー）が挿入され得、改変されたレトロウイルスを取り込んだ細胞の同定が容易と
なる。遺伝子治療のプロセス上の重大な焦点は、新しい遺伝子が、標的細胞にお
いて、発現の十分な持続期間を有し、適切なレベルで発現されなければならない
ことである。
【０１９３】 ベクターを改変するための、および標的器官（例えば、前立腺）にこのような
改変されたベクターを投与するための以下に記載の方法は、単に例証の目的であ
り、そして使用され得る方法の典型である。しかし、他の手順もまた、当該分野
で理解されるように使用され得る。
【０１９４】 ベクターなどを構築するために使用される大部分の技術は、当該分野で広く実
施されており、そして大部分の専門家は、特定の条件および手順を記載する標準
的な供給源の試料に精通する。しかし、簡便のために、以下の段落が、ガイドラ
インとして役立ち得る。
【０１９５】 （ベクター構築のための一般的方法） 所望の治療的遺伝子コード配列および制御配列を含む適切なベクターの構築は
、当該分野で十分に理解されている、標準的連結および制限技術（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照のこと）を使用する。単離されたプラスミ
ド、ＤＮＡ配列、または合成されたオリゴヌクレオチドを、所望の形態に切断し
、改変し、そして再連結する。
【０１９６】 部位特異的なＤＮＡ切断を、当該分野で一般的に理解されている条件下で、適
切な制限酵素を用いて処理すること、およびこれらの市販されている制限酵素の
製造業者によって特定化される詳細により、実行する（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと）。
概して、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列を、約２０μｌの緩衝溶液中で
１単位の酵素により切断する。代表的に、過剰の制限酵素は、ＤＮＡ基質の完全
な消化を保証するために使用される。
【０１９７】 変更を行い得るが、約３７℃での約１時間〜２時間のインキュベーション時間
は、実行可能である。各々のインキュベーションの後、タンパク質をフェノール
／クロロホルムを用いた抽出により除去し、そして続いてエーテル抽出し得、そ
して核酸を、エタノールを用いた沈殿により水相から回収する。所望の場合、切
断したフラグメントのサイズ分離を、標準的な技術を使用するポリアクリルアミ
ドゲルまたはアガロースゲル電気泳動によって実行し得る。サイズ分離の一般的
記述は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５：４９９−５６０
（１９８０）中に見出される。
【０１９８】 制限切断されたフラグメントを、４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェ
ート（ｄＮＴＰ）の存在下、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、６ｍＭ ＤＴＴおよび５〜１０μＭ ｄＮＴＰ中
で２０℃〜２５℃、約１５〜２５分のインキュベーション時間を用いて、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）の大きなフラグメントを用いて
処理することにより、平滑断端にし得る。このＫｌｅｎｏｗフラグメントは、４
種類のｄＮＴＰが存在しても、５’粘着末端で充填するが、突出した３’一本鎖
を消化する。所望される場合、選択的な修復を、粘着末端の性質により指示され
る制限内で、ｄＮＴＰの一種類のみを提供することにより、または選択されたｄ
ＮＴＰを用いて実行し得る。Ｋｌｅｎｏｗを用いた処置の後、この混合物をフェ
ノール／クロロホルムを用いて抽出し、そしてエタノールを用いて沈殿する。Ｓ
１ヌクレアーゼまたはＢａｌ−３１を用いた適切な条件下での処理により、任意
の一本鎖部分の加水分解が生じる。
【０１９９】 連結を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、次の標準条件および温度の下で、１
０〜１５μｌの容量において実行する。連結プロトコルは、標準である（Ｄ．Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ（編）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９１））。
【０２００】 「ベクターフラグメント」を使用するベクター構築において、ベクターフラグメ
ントを、５’ホスフェートを除去し、そしてベクターの再連結を妨害するために
、一般的に、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）または子ウシ腸アルカリホ
スファターゼ（ＣＩＰ）を用いて処理する。あるいは、再連結を、好ましくない
フラグメントのさらなる制限酵素消化により二重に消化されるベクターにおいて
、妨害し得る。
【０２０１】 適切なベクターは、ウイルスベクター系（例えば、ＡＤＶ、ＲＶ、およびＡＡ
Ｖ（Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ 「Ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編（１９９１））
を含む。
【０２０２】 機能的ＤＮＡ導入遺伝子を細胞へ挿入するための多くの方法は、当該分野で公
知である。例えば、非ベクター的方法としては、細胞へのＤＮＡの非ウイルス性
物理的トランスフェクションが挙げられ；例えば、マイクロインジェクション（
ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ ６：６６２−６８０（
１９８８））；リポソーム媒介トランスフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９
８７），ＦｅｌｇｎｅｒおよびＨｏｌｍ、Ｆｏｃｕｓ １１：２１−２５（１９
８９）およびＦｌｅｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｗｅｓｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓ
ｏｃ．３２：１１５−１２１（１９８９））および当該分野で公知の他の方法。
【０２０３】 （改変されたベクターの被験体への投与） 標的細胞へＤＮＡを入れるための１つの方法は、膜結合された、嚢（ｓａｃ）
または小胞（例えば、スフェロプラストまたはリポソーム）の中へＤＮＡを加え
ることであるか、またはリン酸カルシウム沈殿（ＣａＰＯ4）による（Ｇｒａｈ
ａｍ Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５
６ １９７３；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ Ｍ．ら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ
ａｓ ｇｅｎｅ ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ Ｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋ
ｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８２；２１５：１６６；Ｓｔａｖ
ｒｉｄｉｓ ＪＣら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉ
ｎ−ｃｏａｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｎｓ
ｐｏｒｔ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＤＮＡ ｔｏ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ
ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ． Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ １９８６；１６４：５６８−５７２）。
【０２０４】 ベシクルを、その膜が標的細胞の外膜と融合するような方法において構築し得
る。ベシクル中の本発明のベクターは、標的細胞の中へ向かわせ得る。スフェロ
プラストは、ポリエチレングリコールのような融合剤（ｆｕｓｏｇｅｎ）を用い
て哺乳動物標的細胞を通して融合され得るまで、高いイオン強度の緩衝液中で保
持される。
【０２０５】 リポソームは、人工のリン脂質ベシクルである。ベシクルは、０．２〜４．０
μｍの範囲の大きさであり、そして高分子を含む緩衝水溶液の１０％〜４０％を
包括し得る。このリポソームは、ヌクレアーゼからＤＮＡを保護し、そして標的
細胞へのその導入を容易にする。トランスフェクションはまた、エレクトロポレ
ーションを介して生じ得る。
【０２０６】 投与の前に、改変されたベクターを、注入のために選択された濃度で完全なＰ
ＢＳ中に懸濁する。ＰＢＳに加えて、任意の浸透圧的に均衡の取れた溶液（この
溶液は、被験体に対して生理学的に適合する）を使用し、改変されたベクターを
懸濁し得、そして宿主へ注入し得る。
【０２０７】 注入のために、細胞の懸濁液をシリンジの中へ引き上げ、麻酔したレシピエン
トへ投与する。多重注入をこの手順を用いて行い得る。ウイルス懸濁手順は、従
って、遺伝子改変されたベクターを、標的器官（例えば、前立腺）の任意の予定
された部位へ投与することを可能にし、比較的非外傷性であり、同じウイルス懸
濁液を用いる、いくつかの異なる部位または同じ部位における同時の多重投与を
可能にする。多重注入は、治療的遺伝子の混合物からなり得る。
【０２０８】 （改変されたベクターの使用） 本発明は、発現活性を有するフラグメントを用いる治療的遺伝子の発現を保持
および増加するための方法を提供する。
【０２０９】 本発明の方法は、治療的遺伝子を保有する改変されたベクターが、被験体へ注
入される実施形態によって例証される。
【０２１０】 第１の実施形態において、宿主においてタンパク質を産生するように本発明の
宿主ベクター系を増殖させる工程、およびそのようにして産生されたタンパク質
を回収する工程を包含するタンパク質生成物が、発現される。この方法は、単細
胞生物および多細胞生物の両方において目的の遺伝子の発現を可能にする。例え
ば、インビボのアッセイにおいて、目的の遺伝子（例えば、ｒａｓ遺伝子）を含
む本発明のベクターを有する前立腺細胞を、ｒａｓ遺伝子産物に対して無制限の
ようにマイクロタイターウェルにおいて使用し得る。被験体由来のサンプルを、
ｒａｓ遺伝子に対して指向された抗体の存在を検出するためにこのウェルへ加え
る。このアッセイは、被験体の免疫系が、上昇したレベルのｒａｓと関連する疾
患と闘っているか否かの臨床的評価に対して、サンプル中のｒａｓ抗体の存在の
定量的決定および定性的決定を補助し得る。
【０２１１】 第２の実施形態において、転移性の前立腺癌を、遺伝子治療、すなわち本発明
の核酸分子の使用を通してインビボでの疾患表現型の補正を介して処置する。
【０２１２】 本発明の実施に従って、遺伝子治療の被験体は、ヒト被験体、ウマ被験体、ブ
タ被験体、ウシ被験体、マウス被験体、イヌ被験体、ネコ被験体、またはトリ被
験体であり得る。他の哺乳動物をまた、本発明において含む。
【０２１３】 本発明の分子について投与および投与計画の最も有効な形態は、処置される前
立腺腫瘍の正確な位置、癌の重症度および経過、処置に対する被験体の健康およ
び応答、ならびに処置する内科医の判断による。従って、この分子の投与量を、
個々の被験体に対して滴定すべきである。これらの分子を、別の細胞（自系細胞
が好ましいが、異種細胞は本発明の範囲内に包含される）を介して直接または間
接的に送達し得る。
【０２１４】 表面積のｍｇ／ｍ2に基づく、種々の大きさおよび種の動物ならびにヒトに対
する投与量の相互関係は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒ．，Ｒｅｐ．５０（４）：２１９−２４４（１９６６）によっ
て記載される。投与計画における調節は、腫瘍細胞増殖を阻害または殺傷する応
答を最適化するようになされ得、例えば、用量を毎日の基準に対して分割または
投与し得るか、または用量を状況に依存して比例的に減少し得る（例えば、いく
つかの分割された用量を、特異的な治療的状況に従って毎日投与するか、または
比例的に減少し得る）。
【０２１５】 処置を達成するために必要とされる本発明の分子の用量は、計画の最適化とも
にさらに改変され得ることは明かである。
【０２１６】 （トランスジェニック動物の産生） 本発明の別の局面は、ＰＳＣＡ核酸を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物
を提供する。例えば、１つの適用において、ＰＳＣＡ欠失非ヒト動物を、ＰＳＣ
Ａホモログを不活性化するように標準ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）手順
を用いて産生し得るか、またはこのような動物が生存不可能な場合、誘導性のＰ
ＳＣＡホモログアンチセンス分子を使用して、ＰＳＣＡホモログ活性／発現を調
節し得る。あるいは、動物を、ヒトＰＳＣＡコード核酸分子あるいはＰＳＣＡタ
ンパク質またはアンチセンス分子の発現を組織特異的様式に指向するアンチセン
スＰＳＣＡの発現単位を含むように変え得る。このような使用において、ＰＳＣ
Ａホモログ遺伝子の発現が、不活性化もしくは活性化によって変化し、そして／
またはヒトＰＳＣＡ遺伝子によって置換される、非ヒト哺乳動物（例えば、マウ
スまたはラット）を、産生する。このことを、標的化された組換えのような当該
分野で公知の種々の手順を用いて達成し得る。一旦、産生されると、ＰＳＣＡホ
モログ欠失動物、組織特異的様式でＰＳＣＡ（ヒトもしくはホモログ）を発現す
る動物、またはアンチセンス分子を発現する動物、を使用して（１）ＰＳＣＡタ
ンパク質によって媒介される生物学的プロセスおよび病理学的プロセスを同定し
得、（２）ＰＳＣＡタンパク質と相互作用するタンパク質および他の遺伝子を同
定し得、（３）ＰＳＣＡタンパク質の欠失を克服するように外因的に提供され得
る薬剤を同定し得、そして（４）活性を増加または減少するＰＳＣＡ遺伝子の中
の変異を同定するための適切なスクリーンとして役立ち得る。
【０２１７】 例えば、組織特異的様式でＰＳＣＡをコードするヒトミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇ
ｅｎｅ）を発現するトランスジェニックマウスを産生し得、そして通常はＰＳＣ
Ａタンパク質を含まない、組織および細胞においてタンパク質の過剰発現の効果
を試験し得る。このストラテジーは、他の遺伝子、すなわちｂｃｌ−２（Ｖｅｉ
ｓら、Ｃｅｌｌ １９９３ ７５：２２９）に対して首尾良く使用されてきた。
このようなアプローチは、ＰＳＣＡタンパク質／遺伝子へ容易に適用され得、そ
して特定の組織におけるＰＳＣＡタンパク質の潜在的に有益なまたは有害な効果
の問題に取り組むために使用され得る。
【０２１８】 さらに、他の実施形態において、本発明は、癌遺伝子を含む、生殖細胞および
体細胞を有するトランスジェニック動物を提供し、この癌遺伝子は、癌遺伝子に
関連する癌のプロモーションに対して上記マウスの組織における上記遺伝子の発
現に対して有効なＰＳＣＡ上流領域へ連結され、それによってその癌のマウスモ
デルを産生する。
【０２１９】 （組成物） 本発明は、本発明のＰＳＣＡ核酸分子またはＰＳＣＡタンパク質をコードする
かもしくはそのフラグメントをコードする発現ベクター、および必要に応じて、
適切なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、さらに、ＰＳＣＡタ
ンパク質を認識および結合する、抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成
物を提供する。１つの実施形態において、抗体またはそのフラグメントは治療薬
剤または細胞毒性薬剤へ結合または連結される。
【０２２０】 薬学的組成物のための適切なキャリアは、任意の物質を含み、本発明の核酸ま
たは他の分子と合わされる場合、この物質は、この分子の活性を保持し、そして
被験体の免疫系と反応性でない。例としては、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、水
、水中油滴型エマルジョンのようなエマルジョン、および種々の型の湿潤剤のよ
うな任意の標準の薬学的キャリアが挙げられるが、これらに限定されない。他の
キャリアとしてはまた、無菌溶液、コーティングされた錠剤およびカプセル剤を
含む錠剤が挙げられる。代表的に、このようなキャリアは、デンプン、牛乳、砂
糖、ある型の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネ
シウムまたはステアリン酸カルシウム、滑石、植物性脂肪または植物性油、ゴム
、グリコールあるいは他の公知の賦形剤のような賦形剤を含む。このようなキャ
リアとしてはまた、香味添加剤および彩色添加剤または他の成分が挙げられ得る
。このようなキャリアを含む組成物は、周知の慣習的な方法によって処方される
。このような組成物はまた、例えばリポソームのような種々の脂質組成物および
ポリマーミクロスフェアのような種々のポリマー組成物中に処方され得る。
【０２２１】 本発明はまた、ＰＳＣＡ核酸分子を含む診断用組成物、本発明の核酸分子もし
くはその任意の部分へ特異的にハイブリダイズするプローブ、またはＰＳＣＡ抗
体もしくはそのフラグメントを提供する。核酸分子、プローブまたは抗体もしく
はそのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識され得る。検出可能なマーカ
ーの例としては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物
、金属キレート剤または酵素が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、本
発明は、ＲＴ−ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応方法論を用いてＰＳＣＡコ
ード配列を増幅し得るＰＳＣＡ特異的プライマー対を含む診断用組成物を提供す
る。
【０２２２】 （実施例） （実施例１：新規な前立腺細胞表面抗原（ＰＳＣＡ）の同定および分子的特性
付け） （材料および方法） （ＬＡＰＣ−４異種移植片） ＬＡＰＣ−４異種移植片を、Ｋｌｅｉｎら、１
９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：４０２−４０８に記載のように産生した。
【０２２３】 （ＲＤＡ、ノーザン分析およびＲＴ−ＰＣＲ） アンドロゲン依存性ＬＡＰＣ
−４腫瘍およびアンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ−４腫瘍の表象差異分析（ｒｅｐ
ｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を、
以前に記載（Ｂｒａｕｎら、１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４
６２３−４６３０）のように実行した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って
Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ（登録商標）ＲＮＡ単離システム（Ｂｉｏｔｅｃｘ，Ｈｏｕ
ｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いて単離した。ノーザンフィルターを、コード配列および
ＰＳＣＡの３’非翻訳配列の部分に相当する６６０ｂｐＲＤＡフラグメントまた
はＰＳＡの約４００ｂｐフラグメントを用いてプローブした。ヒト多重組織ブロ
ットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得、詳述されるようにプローブした。逆転写酵素
（ＲＴ）−ＰＣＲ分析について、第１鎖ｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ
ＰＣＲコアキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｒｏｃｈｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓ
ｅｙ）を用いて全ＲＮＡから合成した。ヒトＰＳＣＡ転写物のＲＴ−ＰＣＲにつ
いて、プライマー５’−ｔｇｃｔｔｇｃｃｃｔｇｔｔｇａｔｇｇｃａｇ−および
３’−ｃｃａｇａｇｃａｇｃａｇｇｃｃｇａｇｔｇｃａ−を、約３２０ｂｐフラ
グメントを増幅するために使用した。熱サイクルを、９５度で３０秒間、６０度
で３０秒間および７２度で１分間の２５〜２５サイクル、続いて７２度で１０分
間の伸長によって実行した。ＧＡＰＤＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）についてのプライ
マーを、コントロールとして使用した。マウスＰＳＣＡについて、使用したプラ
イマーは、５’−ｔｔｃｔｃｃｔｇｃｔｇｇｃｃａｃｃｔａｃ−および３’−ｇ
ｃａｇｃｔｃａｔｃｃｃｔｔｃａｃａａｔ−であった。
【０２２４】 （ＰＳＣＡ ｍＲＮＡについてのインサイチュハイブリゼーションアッセイ） ｍＲＮＡインサイチュハイブリゼーションのために、全長のＰＳＣＡ遺伝子を
含む組換えプラスミドｐＣＲＩＩ（１μｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ，ＣＡ）を線状にし、センスジゴキシゲニンおよびアンチセンスジゴキ
シゲニン標識したリボプローブを産生した。インサイチュハイブリゼーションを
、以前に記載（Ｍａｇｉ−Ｇａｌｌｕｚｚｉら、１９９７，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．７６：３７−４３）のように自動化した機器（Ｖｅｎｔａｎａ Ｇｅｎ Ｉ
Ｉ，Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）上で実行した。前立腺
標本を、約１３０標本にまで拡大された以前に記載されたデータベース（Ｍａｇ
ｉ−Ｇａｌｌｕｚｚｉら、前出）から得た。スライドを、盲検的な様式において
、二人の病理学者によって読み取り、そして点数化した。０〜３の点数を、陽性
な細胞のパーセンテージ（０＝０％；１＝＜２５％；２＝２５〜５０％；３＝＞
５０％）および染色の強度（０＝０；１＝１＋；２＝２＋；３＝３＋）に従って
割り当てた。２つの点数を掛けて、０〜９の全体の点数を所与した。
【０２２５】 （結果） （ヒトＰＳＣＡ ｃＤＮＡ） 表象差異分析（ＲＤＡ）（ＰＣＲに基づく差し
引きハイブリダイゼーション技術）を、ヒト前立腺癌異種移植片（ＬＡＰＣ−４
）のホルモン依存性改変体とホルモン非依存性改変体との間で、遺伝子発現を比
較するため、およびアンドロゲン−非依存性ＬＡＰＣ−４亜系統においてアップ
レギュレートされたｃＤＮＡを単離するために、使用した。複数の遺伝子を、ク
ローニングし、配列決定し、そして示差的発現について調べた。一つの６６０ｂ
ｐフラグメント（クローン番号１５）を同定し、このフラグメントは、正常の前
立腺と比較した場合、異種移植片腫瘍において高度に過剰発現されることが見出
された。正常な前立腺および異種移植片腫瘍における、このクローンの発現とＰ
ＳＡの発現との比較は、クローン番号１５が、比較的癌特異的であることを示唆
した（図９）。
【０２２６】 配列分析は、クローン番号１５がデータベースで正確に適合するものを有さな
いが、幹細胞抗原２（グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アン
カー型細胞表面抗原のＴｈｙ−１／Ｌｙ−６スーパーファミリーのメンバー）と
３０％のヌクレオチド相同性を共有するということを明らかにした。クローン番
号１５は、１２３アミノ酸のタンパク質をコードし、このタンパク質は、ＳＣＡ
−２（ＲＩＧ−Ｅとも呼ばれる）と３０％同一であり、そしてＬｙ−６／Ｔｈｙ
−１遺伝子ファミリーに特徴的な、多数の高度に保存されたシステイン残基を含
む（図３）。ＧＰＩ−アンカー型タンパク質のファミリーとのその相同性と一致
して、クローン番号１５は、アミノ末端疎水性シグナル配列、および小さなアミ
ノ酸の群（ＧＰＩ結合についての切断／結合部位を規定する）に続く疎水性アミ
ノ酸のカルボキシ末端ストレッチの両方を含む（ＵｄｅｎｆｒｉｅｎｄおよびＫ
ｏｄｕｋｕｌａ、１９９５、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：５６３−
５９１）。これはまた、四つの推定Ｎ−グリコシル化部位も含む。幹細胞抗原−
２に対するその強い相同性のために、クローン番号１５は、前立腺幹細胞抗原（
ＰＳＣＡ）と改名された。次いで、５’および３’ＰＣＲ ＲＡＣＥ分析を、Ｌ
ＡＰＣ−４アンドロゲン非依存性異種移植片から得られたｃＤＮＡを使用して行
い、そして全長ｃＤＮＡヌクレオチド配列（コード領域および非翻訳領域を含む
）を得た。ヒトＰＳＣＡをコードする全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、図１
Ａに示され、翻訳されたアミノ酸配列は図１Ｂおよび図３に示される。
【０２２７】 （ＰＳＣＡは前立腺細胞において発現される） 正常ヒト組織中のＰＳＣＡ
ｍＲＮＡの分布を、ノーザンブロット分析により調べた。その結果（図９Ｂに示
される）は、ＰＳＣＡが前立腺において優性に発現され、胎盤においてはより低
レベルの発現が存在することを実証する。少量のｍＲＮＡを、長い露光の後、前
立腺組織で見られたレベルの約１００分の１のレベルで、腎臓および小腸におい
て検出し得る。正常ヒト組織におけるＰＳＣＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析はまた、
ＰＳＣＡ発現が制限されることを実証する。正常な組織のパネルにおいて、高レ
ベルのＰＳＣＡ ｍＲＮＡ発現を前立腺で検出し、有意の発現を、胎盤および扁
桃で検出した（図７Ａ）。種々の前立腺癌異種移植片の前立腺癌細胞株およびそ
の他の細胞株、ならびに正常な前立腺におけるＰＳＣＡ ｍＲＮＡ発現のＲＴ−
ＰＣＲ分析は、正常な前立腺、ＬＡＰＣ−４およびＬＡＰＣ−９前立腺癌異種移
植片、ならびに卵巣癌細胞株Ａ４３１に限定される高レベルの発現を示した（図
７Ｂ）。正常な前立腺における主要なＰＳＣＡ転写物は、約１ｋｂである（図９
Ｂ）。マウスのＰＳＣＡ発現を、マウスの脾臓、肝臓、肺、前立腺、腎臓、およ
び精巣におけるＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ヒトＰＳＣＡと同様に、マウスの
ＰＳＣＡは、前立腺で優性に発現される。発現はまた、ヒト組織のうち胎盤で見
られたレベルと同様のレベルで、腎臓において検出され得る。
【０２２８】 前立腺癌細胞株および異種移植片におけるＰＳＣＡ、ＰＳＭＡおよびＰＳＡの
発現を、ノーザンブロット分析により比較した。図１０に示されるその結果は、
ＰＳＣＡおよびＰＳＭＡの両方の高レベルの前立腺癌に特異的な発現を実証する
一方、ＰＳＡ発現は前立腺癌特異的ではない。
【０２２９】 （ＰＳＣＡは正常な前立腺における基底細胞のサブセットにより発現される） 正常な前立腺は、二つの主要な上皮細胞集団（分泌性管腔細胞および下の基底
細胞）を含む。インサイチュハイブリダイゼーションを、その発現を局在化する
ために、ＰＳＣＡに特異的なアンチセンスリボプローブを使用して、正常な前立
腺の複数の部分で行った。図１１に示されるように、ＰＳＣＡは、正常基底細胞
のサブセットにおいて排他的に発現される。支質、分泌性細胞または浸潤性リン
パ球において、染色はほとんど見られない。センスＰＳＣＡリボプローブを用い
るハイブリダイゼーションは、バックグランド染色を示さなかった。ＧＡＰＤＨ
についてのアンチセンスプローブを用いるハイブリダイゼーションは、全ての細
胞の型におけるＲＮＡがインタクトであるということを確証した。基底細胞は、
最終分化分泌性細胞の推定前駆細胞を表すため、これらの結果は、ＰＳＣＡが前
立腺特異的な幹細胞／前駆細胞のマーカーであり得るということを示唆する（Ｂ
ｏｎｋｈｏｆｆら、１９９４、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２４：１１４−１１８）。さ
らに、基底細胞はアンドロゲン非依存性であるため、ＰＳＣＡの基底細胞との関
連は、ＰＳＣＡが、アンドロゲン非依存性前立腺癌の進行において役割を果たし
得るという可能性を生じる。
【０２３０】 （ＰＳＣＡは、前立腺癌細胞において過剰発現される） 正常な前立腺および
ＬＡＰＣ−４異種移植片腫瘍におけるＰＳＣＡの発現を比較する初期の分析は、
ＰＳＣＡが前立腺癌において過剰発現されることを示唆した。図９に示されるよ
うな、ノーザンブロット分析により明らかにされたように、ＬＡＰＣ−４前立腺
癌腫瘍は、ＰＳＣＡを強く発現するが、ＢＰＨのサンプルにおいて検出可能な発
現はほとんど無い。対照的に、ＰＳＡ発現は、正常な前立腺において明確に検出
可能であり、ＬＡＰＣ−４腫瘍において見られたレベルの２〜３倍のレベルであ
る。従って、前立腺癌におけるＰＳＣＡの発現は、ＰＳＡで見られた発現の逆で
あるようである。ＰＳＡは、悪性の前立腺組織よりも正常な前立腺組織において
、より強く発現されるが、ＰＳＣＡは、前立腺癌においてより高度に発現される
。
【０２３１】 前立腺癌の診断におけるＰＳＣＡの発現とその値を確かめるために、１２６個
のパラフィンに包埋された前立腺癌の標本を、ＰＳＣＡ発現についてｍＲＮＡイ
ンサイチュハイブリダイゼーションにより分析した。標本を、一つを除く全ての
場合において、根治的な前立腺切除または経尿道切除により除去された初期の腫
瘍から得た。全ての標本を、バックグランド染色を制御するためにセンス構築物
およびアンチセンス構築物の両方でプローブした。材料および方法に記載するよ
うに、スライドには複合スコアが与えられ、６から９のスコアは強い発現を示し
、４のスコアは穏やかな発現を意味する。１２６個のうち１０２個（８１％）の
癌がＰＳＣＡについて強く染色されたが、１２６個のうち別の９個（７％）は穏
やかな染色を示した（図１１Ｂおよび図１１Ｃ）。高段階の前立腺上皮内新形成
（侵襲性前立腺癌の推定の前駆病変）は、標本の８２％（１１８個のうち９７個
）においてＰＳＣＡについて強く陽性に染色された（図１１Ｂ）（Ｙａｎｇら、
１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０：６９３−７０３）。正常な腺は、一貫
して悪性腺より弱く染色された（図１１Ｂ）。９個の標本を、手術の前にホルモ
ン除去治療で処置された患者から得た。これらの残りの推定アンドロゲン非依存
性の癌の９個のうち７個（７８％）は、ＰＳＣＡを過剰発現し、パーセントは未
処置の癌で見られたものに類似であった。このような高いパーセントの標本が、
ＰＳＣＡ ｍＲＮＡを発現したため、ＰＳＣＡ発現と腫瘍病期および悪性度分類
のような病理学的特徴との間に、統計学的相関はあり得ない。これらの結果は、
ＰＳＣＡ ｍＲＮＡの過剰発現が、アンドロゲン依存性および非依存性の前立腺
癌に共通の特徴であるということを示唆する。
【０２３２】 （ＰＳＣＡは、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株において発現される）Ｐ
ＳＣＡを差し引きハイブリダイゼーションを使用して初めにクローニングしたが
、ノーザンブロット分析は、アンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片腫瘍お
よびアンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片腫瘍の両方における強いＰＳ
ＣＡ発現を実証した（図９）。さらに、ＰＳＣＡ発現を、全ての前立腺癌異種移
植片（ＬＡＰＣ−４異種移植片およびＬＡＰＣ−９異種移植片を含む）において
検出した。
【０２３３】 アンドロゲン非依存性の、アンドロゲンレセプター陰性前立腺癌細胞株ＰＣ３
およびＤＵ１４５におけるＰＳＣＡの発現をまた、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖
反応分析により検出した。これらのデータは、ＰＳＣＡが、機能的アンドロゲン
レセプターの非存在下で発現され得るということを示唆する。
【０２３４】 （実施例２：ＰＳＣＡの生化学的特徴付け） この実験は、ＰＳＣＡが、グリコシル化された、ＧＰＩアンカー型細胞表面タ
ンパク質であることを示す。
【０２３５】 （材料および方法） （ポリクローナル抗体および免疫沈降）ウサギポリクローナル抗血清を、合成
ペプチド−ＴＡＲＩＲＡＶＧＬＬＴＶＩＳＫ−に対して生成し、そしてＰＳＣＡ
グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質を使用してアフィニティー精
製した。２９３Ｔ細胞を、ＰＳＣＡ、ＣＤ５９、Ｅ２５を含むｐＣＤＮＡ ＩＩ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）発現ベクターまたはベク
ターのみを用いてリン酸カルシウム沈殿により一過的にトランスフェクトした。
免疫沈降を以前に記載されたように（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ））行った。簡単にいうと、細胞を
、５００ｕＣｉのトランス３５Ｓ標識（ＩＣＮ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を用いて
６時間標識化した。細胞溶解産物および馴化培地を、１ｕｇの精製されたウサギ
抗ＰＳＣＡ抗体および２０ｕｌのプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｗｅｄｅｎ）とともに２時間インキュベート
した。脱グリコシル化のために、免疫沈降物を１ｕのＮ−グリコシダーゼＦ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３７℃で一晩処理するか、ま
たは０．１ｕのノイラミニダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で１
時間処理した後、２．５ｍＵのＯ−グリコシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ）中で一晩処理した。
【０２３６】 （フローサイトメトリー） ＰＳＣＡ細胞表面発現のフローサイトメトリー分
析のために、単一細胞懸濁液を、２ｕｇ／ｍｌの精製された抗ＰＳＣＡ抗体およ
び１：５００希釈のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化抗ウ
サギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖ
ｅ、ＰＡ）で染色した。データをＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ）で取得し、ＬＹＳＩＳ ＩＩソフトウェアを使用して分析した。コント
ロールサンプルを、二次抗体のみを用いて染色した。グリコシルホスファチジル
イノシトール結合を、２×１０6の細胞を０．５ユニットのホスファチジルイノ
シトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ）を用いて３７℃で９０分間消化することにより、分析した。細胞
を、ＦＡＣＳスキャニングまたはイムノブロット法のいずれかによって、消化の
前および後で分析した。
【０２３７】 （結果） （ＰＳＣＡは、細胞表面に発現されたＧＰＩアンカー型糖タンパク質である） 推定ＰＳＣＡアミノ酸配列は、ＰＳＣＡが高度にグリコシル化され、そしてＧ
ＰＩ機構により細胞表面上に係留されているということを予測する。これらの予
測を試験するために、本発明者らは、固有のＰＳＣＡペプチドに対して惹起され
た、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体を産生した（材料および方法
を参照のこと）。このペプチドは、グリコシル化部位を含まず、ＣＤ５９（別の
ＧＰＩアンカー型ＰＳＣＡホモログ）の三次元構造との比較に基づいて、成熟タ
ンパク質の露出された部分にあると推測された（Ｋｉｅｆｅｒら、１９９４、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．３３：４４７１−４４８２）。アフィニティー精製された抗体に
よるＰＳＣＡの認識を、ＰＳＣＡおよびＧＳＴ−ＰＳＣＡ融合タンパク質でトラ
ンスフェクトされた２９３Ｔ細胞の抽出物のイムノブロット分析および免疫沈降
分析により、実証した。このポリクローナル抗体は、ＰＳＣＡトランスフェクト
細胞からの２４ｋｄのバンドを優性に免疫沈降したが、偽トランスフェクト細胞
からは免疫沈降しなかった（図１２Ａ）。３つの小さなバンドも存在し、最小の
ものは、約１０ｋｄであった。この免疫沈降物を、これらのバンドがＰＳＣＡの
グリコシル化形態を表すか否かを決定するために、ＮおよびＯ特異的グリコシダ
ーゼで処理した。Ｎ−グリコシダーゼＦはＰＳＣＡを脱グリコシル化したが、Ｏ
−グリコシダーゼは、全く効果が無かった（図１２Ａ）。いくつかのＧＰＩアン
カー型タンパク質は、膜結合形態および分泌形態の両方を有することが公知であ
る（ＦｒｉｔｚおよびＬｏｗｅ、１９９６、Ａｍ．Ｊ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７０
：Ｇ１７６−Ｇ１８３）。図１２Ｂは、いくつかのＰＳＣＡが、２９３Ｔ過剰発
現系において分泌されるということを示す。ＰＳＣＡの分泌形態は、細胞表面結
合形態よりも低い分子量で移動し、これはおそらく共有結合性ＧＰＩ結合の非存
在を反映する。この結果は、高レベルの２９３Ｔ細胞株における発現を反映し得
、前立腺癌細胞株およびインビボにおいて確認される必要がある。
【０２３８】 蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を、ＰＳＣＡ発現を、細胞表面に局在化
するために使用した。非透過化処理した偽トランスフェクト２９３Ｔ細胞、ＰＳ
ＣＡ発現２９３Ｔ細胞およびＬＡＰＣ−４細胞を、アフィニティー精製された抗
体または二次抗体のみで染色した。図１２Ｃは、ＰＳＣＡをトランスフェクトし
た２９３Ｔ細胞およびＬＡＰＣ−４細胞におけるＰＳＣＡの細胞表面発現（偽ト
ランスフェクト細胞では生じない）を示す。この細胞表面発現が、共有結合性Ｇ
ＰＩ結合によって媒介されていることを確認するために、細胞を、ＧＰＩ特異的
ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）で処理した。ＰＬＣによる細胞表面からのＰＳＣＡ
の放出が、蛍光強度における１ｌｏｇ換算（ｏｎｅ ｌｏｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏ
ｎ）より大きいことによって示された。消化後の馴化培地におけるＰＳＣＡの回
収をまた、イムノブロット法により確認した。ＧＰＩアンカー型タンパク質に対
するホスホリパーゼＣ消化の特異性を、ＧＰＩ結合抗原ＣＤ５９またはＧＰＩ非
結合膜貫通タンパク質Ｅ２５ａでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に同じ実
験を行うことで確認した（Ｄｅｌｅｅｒｎｉｊｄｅｒら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９４７５−１９４８２）。ＰＬＣ消化は、ＣＤ５９の
細胞表面発現をＰＳＣＡと同じ程度まで減少させるが、Ｅ２５には影響しなかっ
た。これらの結果は、ＰＳＣＡが、グリコシル化された、ＧＰＩアンカー型細胞
表面タンパク質であるという予測を支持する。
【０２３９】 （実施例３：ｃＤＮＡをコードするマウスＰＳＣＡホモログの単離） ヒトＰＳＣＡ ｃＤＮＡを、潜在的トランスジェニック実験およびノックアウ
ト実験のためのホモログを同定するために、マウスＥＳＴデータベースを検索す
るために使用した。マウス胎児から得られた一つのＥＳＴおよび新生児腎臓から
得られたもう一つのＥＳＴは、ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルの両方
で、ヒトｃＤＮＡと７０％同一であった。マウスクローンとヒトＰＳＣＡとの間
の相同性は、ヒトＰＳＣＡとそのＧＰＩアンカー型ホモログとの間の相違の領域
を含み、このことは、これらのクローンがＰＳＣＡのマウスホモログをおそらく
表すということを示す。これらのＥＳＴの整列化およびＲＡＣＥ−ＰＣＲを使用
する５’伸長は、そのコード配列全体を提供した（図２）。
【０２４０】 （実施例４：ヒトおよびマウスＰＳＣＡ遺伝子の単離） この実験は、ＰＳＣＡが、第８染色体、バンドｑ２４．２に位置することを示
す。
【０２４１】 （材料および方法） （ゲノムクローニング）ヒトＰＳＣＡ遺伝子を含むλファージクローンを、ヒ
トＰＳＣＡ ｃＤＮＡプローブを用いてヒトゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）をスクリーニングすることにより得た（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８
９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ））。マウスＰＳＣＡ遺伝子を含むＢＡＣ（細菌性人工染色体）クローンを
、マウスＰＳＣＡ ｃＤＮＡプローブを用いてマウスＢＡＣライブラリー（Ｇｅ
ｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をスクリー
ニングすることにより得た。１４ｋｂのヒトＮｏｔＩフラグメントおよび１０ｋ
ｂマウスＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）にサブクローニングし、配列決定し、そして制限酵素地図を作成した。
【０２４２】 （蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによる染色体マッピング） 蛍光
インサイチュ染色体分析（ＦＩＳＨ）を、以前記載されたように、オーバーラッ
プヒトλファージクローンを使用して行った（Ｒｏｗｌｅｙら、１９９０、ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ ８７：９３５８−９３６２、Ｈ．Ｓｈｉｚｕｙａ、ＰＮＡＳ Ｕ
ＳＡ、８９：８７９４）。
【０２４３】 （結果） （ＰＳＣＡ遺伝子の構造） それぞれ約１４ｋｂおよび１０ｋｂのヒトおよび
マウスゲノムクローンを得て、制限酵素地図を作成した。ヒトおよびマウスのＰ
ＳＣＡおよびＬｙ−６／Ｔｈｙ−１の遺伝子構造の概略図を、図８に示す。ヒト
ゲノムクローンおよびマウスゲノムクローンの両方は、ＰＳＣＡ遺伝子の翻訳領
域および３’非翻訳領域をコードする３つのエキソンを含む。Ｌｙ−６およびＴ
ｈｙ−１遺伝子ファミリーの他のメンバーに対するＰＳＣＡの相同性に基づいて
、５’非翻訳領域をコードする第４のエキソンの存在が推測される（図８）。
【０２４４】 （染色体８ｑ２４．２に対するヒトＰＳＣＡ遺伝子地図） ＬＡＰＣ−４ゲノ
ムＤＮＡのサザンブロット分析は、ＰＳＣＡが、単一コピーの遺伝子によりコー
ドされるということを明らかにした。他のＬｙ−６遺伝子ファミリーのメンバー
は４つのエキソンを含み、この４つのエキソンは、５’非翻訳領域をコードする
第一のエキソン、ならびに翻訳領域および３’非翻訳領域をコードするさらに３
つのエキソンを含む。その推定の５’第一エキソン以外の全てを含むヒトおよび
マウスＰＳＣＡのゲノムクローンを、λファージライブラリーのスクリーニング
により得た。マウスおよびヒトＰＳＣＡクローンは、類似のゲノム構成を有して
いた。このヒトクローンを、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション分析によ
りＰＳＣＡを局在化するために使用した。オーバーラップヒトＰＳＣＡλファー
ジクローンの同時ハイブリダイゼーションは、第８染色体のみの特異的標識を生
じた（図１３）。検出されたシグナルの９７％は、染色体８ｑ２４に局在化し、
そのうちの８７％は、染色体８ｑ２４．２に特異的であった。これらの結果は、
ＰＳＣＡが第８染色体のバンドｑ２４．２に位置していることを示す。
【０２４５】 （実施例５：ＰＳＣＡの異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体の生
成） （材料および方法） （モノクローナル抗体の生成および産生） ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＳＣＡ
アミノ酸２２〜９９（図１Ｂ）を含む、精製されたＰＳＣＡ−グルタチオンＳ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を用いて３回免疫化した。簡単に
いうと、ヒトＰＳＣＡアミノ酸配列のアミノ酸１８〜９８に対応するＰＳＣＡコ
ード配列を、以下のプライマー対
【０２４６】
【化１】 を使用して、ＰＣＲ増幅した。
【０２４７】 増幅されたＰＳＣＡ配列を、ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクロー
ニングし、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用しそして融合タンパク質を単
離した。
【０２４８】 脾臓細胞を、標準ハイブリドーマ技術を使用して、ＨＬ−１骨髄腫細胞と融合
した。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析によりＰＳＣＡについて陽性であったハイ
ブリドーマ（結果を参照のこと）を、サブクローニングした。腹水をＣ．Ｂ．１
７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスにおいて産生し、そしてモノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）をプロテインＧアフィニティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して精製した。ＰＳＣＡ ｍＡｂ
１Ｇ８をまた、Ｃｅｌｌ−Ｐｈａｒｍ Ｓｙｓｔｅｍ １００で、製造業者（
Ｕｎｉｓｙｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）により
推奨されるように、生産した。
【０２４９】 （ハイブリドーマスクリーニングのためのＥＬＩＳＡ） ＧＳＴまたはＰＳＣ
Ａ−ＧＳＴを、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ無水マレイン酸活性化ポリスチレンプレ
ート（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に固定化した。５０ｕｌのハイ
ブリドーマ培地をそれぞれのウェルに添加し、そして、１時間、室温でインキュ
ベートした。ウェルを、０．１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
２００ｕｌのＰＢＳで３回洗浄し、そして、アルカリホスファターゼ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で標識した１００ｕｌの抗マウスＩｇＧ（１：
４０００）と共に１時間インキュベートした。プレートをアルカリホスファター
ゼ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて発色させた。
【０２５０】 （細胞培養） ＬＮＣａＰをＡＴＣＣより入手し、ＰＳＣＡを含むｐＣＤＮＡ
ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）発現ベクター、または単独のベクターで安定にト
ランスフェクトした（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒら、１９９８）。一過性にＰＳＣＡまた
はベクターのみでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、以前に記載されたよう
に（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒら、１９９８）調製した。１％プロナーゼ中で室温で１８
分間消化した後、ＬＡＰＣ−９異種移植片の外殖片を、ＰｒＥＧＭ培地（Ｃｌｏ
ｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中で増殖した。ＦＡＣＳ分析の前に
、ＬＡＰＣ−９細胞を４０ｕｍのセルストレーナーに通し、単一の細胞懸濁物を
得た。
【０２５１】 （免疫蛍光） 細胞を、ポリ−Ｌ−リジンでコートしたカバーガラス上で増殖
させた。免疫蛍光アッセイを、透過化処理した、および透過化処理していない固
定細胞について行った。固定のため、細胞を、２％のパラホルムアルデヒドのＰ
ＢＳ−ＣＭ（ＰＢＳ、１００ｕＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2）溶液で３０
分間、暗所で処理し、５０ｕＭのＮＨ4ＣｌのＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡ（ＰＢＳ、
１００ｕＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２％ ＢＳＡ）溶液で１０分
間クエンチし、そしてＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡで２回洗浄した。透過化処理のため
、細胞をさらにＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡ−Ｓａｐｏｎｉｎ（０．０７５％のサポニ
ン（Ｓｉｇｍａ）のＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡ溶液）で１５分間、室温で処理した。
一次ｍＡｂをＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡ（透過化処理の場合には、サポニンを追加）
中、２〜５ｍｇ／ｍｌで６０分間添加し、そしてＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡで２回洗
浄した。ＦＩＴＣと結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＰＢＳ−ＣＭ−ＢＳＡ＋
／−サポニンに１：５００で希釈；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を３０分間添加し、そしてＰＢＳ−ＣＭで
３回洗浄した。スライドをベクターシールド（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）に載せた。
【０２５２】 （フローサイトメトリー） 細胞（１×１０6）を、２％のウシ胎児血清また
はハイブリドーマ馴化培地を含むＰＢＳ中、２ｕｇ／ｍｌで、１００ｕｌのｍＡ
ｂと共に３０分間、４℃で、インキュベートした。洗浄後、細胞をＦＩＴＣと結
合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）の１：５００希釈液で染色した。ＦＡＣＳｃａｎ
（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でデータを得、そしてＬＹＳＩＳ ＩＩ
ソフトウエアを用いることにより分析した。
【０２５３】 （イムノブロット法および免疫沈降）免疫沈降を、記載のように（Ｈａｒｌｏ
ｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、１９８８）行った。簡単には、細胞を５００ｕ
Ｃｉのトランス３５標識（ＩＣＮ）で６時間、標識した。細胞溶解産物を、３ｕ
ｇのｍＡｂおよび２０ｕｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に、２時間インキュベートした。イ
ムノブロット法のため、細胞を１× ＳＤＳ Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中
に溶解し、そして５分間、煮沸することによりタンパク質抽出物を調製した。タ
ンパク質を１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミド上で分離し、そしてニトロセル
ロース膜に転写し、洗浄し、そして１０ｍｌのブロッキング緩衝液（ＴＢＳＴ中
５％無脂肪乳）中の２ｕｇ ｍＡｂと共にインキュベートした。ブロットをＡｍ
ｅｒｓｈａｍ増強化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏ
ｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて発光させた。
【０２５４】 （免疫組織化学） 正常な、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織サンプル
を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｔ Ｂｅｔｈ−Ｉ
ｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ−Ｈａｒｖａ
ｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌおよびＵＣＬＡから入手した。初期の根治
的前立腺切除術の標本を、以前に記載されたデータベースから選択した（Ｍａｇ
ｉ−Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ｃら、１９９７）。骨転位およびそれに一致する初期の
生検標本を、ＵＣＬＡ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙから
入手した。再現性を保証するため、２つの研究所で独立に、正常組織を染色し、
そしてスコア付けした。ＵＣＬＡから入手した標本を、以前に記載された免疫ペ
ルオキシダーゼ技術（Ｓａｉｄ，Ｊ．Ｗ．ら、１９９８）の改変法で染色した。
抗原の検索を、業務用蒸し器および０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を
用いて、パラフィン切片で行った。ＰＳＣＡ ｍＡｂｓとの５０分間のインキュ
ベーションの後（以下を参照のこと）、スライドガラスを、ウサギ抗マウスＩｇ
Ｇ、ブタ抗ウサギＩｇＧおよびウサギ抗ブタＩｇＧ（全てビオチン結合している
）で続けて処理した。次いで、スライドガラスをストレプトアビジン−ペルオキ
シダーゼと共にインキュベートし、そしてジアミノベンジジン反応を用いて抗体
局在化を行った。Ｂｅｔｈ−Ｉｓｒａｅｌ−Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ−Ｈａｒｖａｒ
ｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌから入手した標本を、以前に記載した自動化
Ｖｅｎｔａｎａ ＮｅｘＥＳ機器（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）を用いて染色した（Ｍａｇｉ−Ｇａｌｌｕｚｚｉ
，Ｃら、１９９７）。７５０Ｗでのマイクロ波により、１５分間、ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８．０５）において、抗原の検索を行った。ＳＣＩＤ腹水から約１ｕｇ／ｕｌ
の濃度で精製したｍＡｂｓを、以下の濃度で用いた：１Ｇ８＝１：２０；３Ｅ６
＝１：３０；２Ｈ９＝１：５０；４Ａ１０＝１：１００；３Ｃ５＝１：１００。
ｍＡｂ１Ｇ８をＣｅｌｌＰｈａｒｍ Ｓｙｓｔｅｍ １００中に産生し、１：１
０の濃度で使用した。陽性コントロールはＬＡＰＣ−９およびＬＮＣａＰ−ＰＳ
ＣＡを含み、そして陰性コントロールはＬＮＣａＰ、およびアイソタイプが一致
した無関係な抗体であった。最初の生検標本は、骨転位を有する３人の患者につ
いて入手可能であった。脱石灰の状態に近づけるため、ＰＳＣＡ ｍＡｂｓで染
色する前に、これらの標本からのスライドガラスを２０分間、Ｄｅｃａｌ−Ｓｔ
ａｔ（Ｌｅｎｇｅｒｓ、ＮＹ）中で処理した。
【０２５５】 モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を、ＰＳＣＡのアミノ末端およびカルボキシ
ル末端のシグナル配列の両方を欠くＰＳＣＡ−ＧＳＴ融合タンパク質に対して惹
起した。ＰＳＣＡ−ＧＳＴ融合タンパク質およびＧＳＴのみを用いるＥＬＩＳＡ
によって、陽性の融合物を選別した。スクリーニングされた４００のハイブリド
ーマの内、２８はＰＳＣＡ−ＧＳＴ融合物を認識したが、ＧＳＴのみは認識しな
かった。これらの融合物を、ＰＳＣＡでトランスフェクトした透過化処理してい
ない２９３Ｔ細胞および偽トランスフェクトした２９３Ｔ細胞のフローサイトメ
トリーにより二次スクリーニングした。ＦＡＣＳによる二次スクリーニングは、
細胞表面上のＰＳＣＡを認識可能なクローンが、後にインビボ標的化適用に有用
であることを仮定して、それらを選別するために行った。７つの陽性融合物をこ
のように同定し（ｍＡｂ ２Ａ２、３Ｇ３、４Ａ１０、１Ｇ８、３Ｅ６、３Ｃ５
および２Ｈ９）、そのうちの５つ（ｍＡｂ ４Ａ１０、１Ｇ８、３Ｅ６、３Ｃ５
および２Ｈ９）をサブクローン化し、そして精製した。
【０２５６】 ｍＡｂを、ＰＳＣＡを免疫沈降する能力、および／またはイムノブロット上の
ＰＳＣＡを認識する能力について試験した。全てのｍＡｂは、２９３Ｔ−ＰＳＣ
Ａ細胞に由来する、ならびに、高レベルの内因性ＰＳＣＡを発現するＬＡＰＣ−
９前立腺癌異種移植片腫瘍に由来する、ＰＳＣＡを免疫沈降し得た（図３７）。
同様に、全てのｍＡｂは、イムノブロットによりＰＳＣＡを検出した。しかし、
ｍＡｂｓ ２Ｈ９および３Ｅ６は、約１２ｋｄの脱グリコシド化形態のＰＳＣＡ
しか認識しなかった（図３４）。
【０２５７】 ５つのｍＡｂにより認識されるエピトープのＰＳＣＡ上の位置を、３つの短縮
型ＰＳＣＡ−ＧＳＴ融合タンパク質を用いるイムノブロット分析により決定した
。ｍＡｂ ４Ａ１０、２Ｈ９および３Ｃ５は、ＰＳＣＡのアミノ末端部分に存在
するエピトープ（すなわち、アミノ酸２１〜５０）を認識し；ｍＡｂ １Ｇ８は
ＰＳＣＡの中間部分に存在するエピトープ（すなわち、アミノ酸４６〜８５）を
認識し；そして、ｍＡｂ ３Ｅ６はＰＳＣＡのカルボキシル末端（アミノ酸８５
〜９９）において反応する（図１５）。５つ全てのｍＡｂは、図１５に記載する
ようにＩｇＧである。これらの結果は、５つのｍＡｂが、複合アッセイにおいて
ＰＳＣＡを検出することができ、そして少なくとも３つの異なるＰＳＣＡ上のエ
ピトープを認識し得ることを示す。
【０２５８】 （ＰＳＣＡ ｍＡｂは前立腺癌細胞の細胞表面上を染色する） ＰＳＣＡ生物学を研究するための、およびインビボ標的化適用のような潜在的
臨床適用のためのｍＡｂの有用性は、原形質膜上で目的の抗原を認識するそれら
の能力に依存する（Ｌｉｕ，Ｈ．ら、１９９７；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｐ．ら
、１９９８；Ｗｕ，Ｙ．ら、１９９５；Ｔｏｋｕｄａ，Ｙ．ら、１９９６）。ｍ
Ａｂ ２Ｈ９、３Ｅ６、１Ｇ８、４Ａ１０およびＣ５が、特に前立腺癌細胞の細
胞表面上のＰＳＣＡを認識する能力を決定するため、ＰＳＣＡでトランスフェク
トしたＬＮＣａＰ細胞（ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡ）およびＬＡＰＣ−９細胞をフロ
ーサイトメトリーおよび間接的免疫蛍光により調べた。２９３Ｔ−ＰＳＣＡ細胞
についてと同様、５つ全てのｍＡｂｓは、透過化処理していないＬＮＣａＰ−Ｐ
ＳＣＡおよび／またはＬＡＰＣ−９細胞の細胞表面上のＰＳＣＡを、フローサイ
トメトリーにより検出し得た（図３３）。偽トランスフェクト（ｍｏｃｋ−ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔｅｄ）したＬＮＣａＰ、およびネオマイシン単独を含むベクター
（ＬＮＣａＰ−ｎｅｏ）でトランスフェクトしたＬＮＣａＰ（いずれも検出可能
なＰＳＣＡ ｍＲＮＡを発現しない）は、共に陰性であった。
【０２５９】 免疫蛍光分析を、ＰＳＣＡタンパク質が細胞表面に局在するか否かを確認する
ために、透過化処理した細胞および透過化処理していない細胞の両方で行った（
Ｌｉｕ，Ｈ．ら、１９９７）。透過化処理していないＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡは、
ｍＡｂ １Ｇ８、３Ｅ６、４Ａ１０および３Ｃ５に対して明らかな細胞表面反応
性を示したが、ｍＡｂ ２Ｈ９に対しては染色されなかった（ｍＡｂ ２Ｈ９は
また、ＦＡＣＳによりＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡ細胞上のＰＳＣＡを検出しなかった
）。ＬＡＰＣ−９細胞は、５つ全てのｍＡｂに対して細胞表面反応性を示した（
図３５）。ＬＮＣａＰ−ｎｅｏは、予想されたように、透過化処理の有無に関わ
らず陰性であった。ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡおよびＬＡＰＣ−９の透過化処理は、
膜染色および細胞質染色の両方を生じた。全てのｍＡｂは、細胞表面上に斑点の
染色パターンを生じたが、それはｍＡｂ ３Ｅ６、３Ｃ５および４Ａ１０に関し
て最も顕著であった（図３５）。このパターンは、ＰＳＣＡの細胞表面の領域へ
の凝集またはクラスター化を反映し得る。これらの結果は、５つ全てのｍＡｂが
インタクトな前立腺癌細胞の細胞表面上ＰＳＣＡと反応することを示す。
【０２６０】 （正常前立腺中のＰＳＣＡの免疫組織化学的染色） ＰＳＣＡ ｍＲＮＡは、正常前立腺中の基底細胞のサブセットに位置し、この
ことはＰＳＣＡが前立腺の幹細胞／前駆細胞に対する細胞表面マーカーであり得
ることを示唆する（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒ．ら、１９９８）。ＰＳＣＡタンパク質が
基底細胞のマーカーであり得る可能性を試験するため、正常前立腺のパラフィン
包埋切片において、ＰＳＣＡ発現を免疫組織化学的に調べた。ｍＡｂ １Ｇ８お
よび２Ｈ９は基底細胞および分泌細胞の両方の細胞質を染色し、一方でｍＡｂ
３Ｅ６は基底細胞と主に反応した（図３８）。基底細胞サイトケラチンを発現す
る萎縮性腺は、全ての３つのｍＡｂで強く染色された（図３８）（Ｏ’Ｍａｌｌ
ｅｙ，Ｆ．Ｐ．ら、１９９０）。ｍＡｂ ３Ｃ５および４Ａ１０は、パラフィン
切片において強いバックグラウンド染色および／または非特異的な核染色を生じ
、さらには使用されなかった。これらの結果は、ＰＳＣＡ ｍＲＮＡが基底細胞
において特異的に検出されるが、ＰＳＣＡタンパク質は前立腺の上皮細胞層の両
方（すなわち、基底および分泌）において検出され得ることを示唆する。しかし
、それぞれの抗体の染色パターンにいくらかの違いはある。
【０２６１】 （正常組織の免疫組織化学的分析） 本発明者らの初期の研究は、男性におけるＰＳＣＡ発現が、腎臓および小腸に
おいて検出可能なＲＮＡが低レベルであり、主に前立腺特異的であることを示し
た。ＰＳＣＡ ｍＲＮＡを、胎盤においてもまた検出した。ＰＳＣＡタンパク質
発現の前立腺特異性を、ｍＡｂ １Ｇ８を用いて、２０の組織の免疫組織化学染
色により試験した（表１を参照のこと）。ｍＡｂ １Ｇ８での陽性の組織染色は
、異なるエピトープに対するｍＡｂとの再現性を保証するため、ｍＡｂ ２Ｈ９
および／または３Ｅ６で確認された。染色はまた、結果を確認するため、２つの
研究所で独立に行い、そしてスコア付けした。ＲＮＡ分析から予想されたように
、胎盤は試験した全てのｍＡｂについて陽性であり、細胞質染色が栄養膜で検出
された（図３９Ａ）。腎臓において、染色は集合尿細管および遠位曲尿細管にお
いて検出されたが、糸球体においては検出されなかった（図３９Ａ）。膀胱およ
び尿管の移行上皮（以前は、ｍＲＮＡレベルで調べていなかった）は、試験した
全てのｍＡｂについて陽性であった（図３９Ａ）。有意な免疫反応性を有する他
の唯一の組織は結腸であり、陰窩の奥深くで単一の細胞が強く陽性に染色された
（図３９Ａ）。クロモグラニンを用いた二重染色は、これらの細胞が神経内分泌
由来であることを示した。
【０２６２】 膀胱におけるｍＡｂの反応性がＰＳＣＡを表すことを確認するため、根治的膀
胱切除で得られた３つの正常な膀胱サンプルに対してノーザンブロット分析を行
い、前立腺、腎臓およびＬＡＰＣ−９異種移植片におけるＰＳＣＡ発現と比較し
た（図３９Ｂ）。ＰＳＣＡ ｍＲＮＡは、膀胱において、前立腺において見られ
たより低いレベルで検出され、免疫組織化学的結果を確証した。３つの腎臓標本
において、シグナルは検出されず、腎臓におけるＰＳＣＡ発現は前立腺よりも有
意に低いという本発明者らの以前の結果と首尾一貫していた（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒ
．ら、１９９８）。骨転位から樹立された前立腺癌異種移植片ＬＡＰＣ−９は、
正常な膀胱および前立腺と比較して非常に高いレベルのＰＳＣＡ ｍＲＮＡを発
現する（Ｗｈａｎｇ，Ｙ．Ｅ．ら、１９９８）。これらの結果は、男性における
ＰＳＣＡ発現が主に前立腺優性であることを確証するが；尿路上皮、腎臓の集合
尿導管および結腸の神経内分泌細胞における検出可能なＰＳＣＡタンパク質発現
もまた存在する。
【０２６３】 （ＰＳＣＡタンパク質は、局在化した前立腺癌の大部分で発現される） 本発明者らの以前の研究において、ｍＲＮＡは約８０％の腫瘍において発現し
、そして悪性腺よりも正常腺においてより高度に発現するようである（Ｒｅｉｔ
ｅｒ，Ｒ．ら、１９９８）。ＰＳＣＡタンパク質が前立腺癌において検出され得
るか否か、およびＰＳＣＡタンパク質レベルが良性腺と比較して悪性腺において
増加するか否かを決定するため、初期転位性前立腺癌のパラフィン包埋の病理標
本をｍＡｂ １Ｇ８で免疫染色した（図２１および２８）。単離された場合もま
た、染色の特異性を確認するために、ｍＡｂ ３Ｅ６または２Ｈ９で染色した。
１５の初期癌の内、１２は陽性に染色された（図２１）（高い段階の前立腺の上
皮内新形成の病巣を含む２つの症例のうち２つを含む）。染色強度は異なり、７
つの症例は癌および隣接する正常な腺において同等な染色を示し、そして５つは
癌において有意に強い染色を示した。いくつかの場合においては、悪性腺におい
て強い発現が存在し、そして隣接した正常組織において検出可能な発現は存在し
なかった（図２１；患者１）。また、染色が不均一であり、いくつかの悪性腺に
ついて、他と比べてより強く染色されるいくつかの症例も存在した（図２１；患
者２）。全体的に、あまり分化していない腫瘍は、十分に分化した腫瘍より強く
染色され、このことはＰＳＣＡ過剰発現が腫瘍段階の増進と相関し得ることを示
唆した（図２１；患者３）。これらの結果はＰＳＣＡタンパク質が前立腺癌にお
いて発現することを示す。本発明者らのインサイチュ研究における以前のｍＲＮ
Ａと一致して、ＰＳＣＡは、おそらく増進する腫瘍の段階と一致して、有意な割
合の癌において過剰に発現すると思われる。
【０２６４】 本研究は、ＰＳＣＡに対する５つのモノクローナル抗体を用いたＰＳＣＡタン
パク質発現の最初の特徴付けを記載する。これらのｍＡｂは細胞表面の外側のエ
ピトープを認識するので、これらは前立腺癌診断および治療のための有用性を有
し得る（Ｌｉｕ，Ｈ．ら、１９９７）。１つの可能性は、ＰＳＭＡに対する抗体
を使用するＰｒｏｓｔａｓｃｉｎｔスキャンと同様に、これらのｍＡｂが転位性
疾患の部位を位置決めするために用いられ得ることである（Ｓｏｄｅｅ，Ｄ．Ｂ
．ら、１９９６）。別の可能性は、それらが、単独でか、または放射性同位体も
しくは他の毒素と結合されるかのいずれかで、前立腺癌細胞を治療的に標的化す
るために用いられ得ることである。同様のアプローチは、現在、ＰＳＭＡ上の細
胞外エピトープに対する抗体を用いて評価されている（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｐ．
ら、１９９８；Ｌｉｕ，Ｈ．ら、１９９７；Ｌｉｕ，Ｈ．ら、１９９８）。
【０２６５】 ＰＳＣＡ ｍＡｂは、細胞表面を斑点状に染色し、ＰＳＣＡが細胞表面の特定
の領域に局所化し得ることを示唆する。ＧＰＩ−アンカー型タンパク質は、細胞
表面の界面活性剤の不溶性の糖脂質富化ミクロドメイン（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−
ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｉｃｒｏｄ
ｏｍａｉｎ）（ＤＩＧＳ）においてクラスター化することが公知である（Ｖａｒ
ｍａ，ＲおよびＭａｙｏｒ，Ｓ．，１９９８）。カベオラおよびスフィンゴ脂質
−コレステロールラフト（ｒａｆｔ）を含むこれらのミクロドメインは、シグナ
ル伝達および分子輸送において重要な役割を果たすと考えられている（Ａｎｄｅ
ｒｓｏｎ，Ｒ．Ｃａｖｅｏｌａｅ，１９９３；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｏｎ，Ｔ．
およびＫｕｒｚｃｈａｌｉａ，Ｔ．Ｖ．，１９９８；Ｈｏｅｓｓｌｉ，Ｄ．Ｃ．
およびＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，１９９８）。Ｔｈｙ−１（ＰＳＣＡの相同
体）は以前、脂質−ミクロドメインにおける相互作用を介してｓｒｃキナーゼに
シグナルを送ることが示された（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｍ．およびＳａｍｕｅｌｓ
ｏｎ，Ｌ．Ｅ．，１９９２；Ｓｔｅｆａｎｏｖａ，Ｉ．ら、１９９１）。本発明
者らの実験室における予備的な亜細胞分画実験は、ＤＩＧＳ中のＰＳＣＡの存在
を確認する（Ｘａｖｉｅｒ，Ｒ．ら、１９９８）。
【０２６６】 ＧＰＩ−アンカー型タンパク質はまた、プロスタソーム（ｐｒｏｓｔａｓｏｍ
ｅ）（前立腺上皮細胞より放出された、膜結合保存小胞）に局在化すると報告さ
れた（Ｒｏｎｑｕｉｓｔ，Ｇ．およびＢｒｏｄｙ，Ｉ．、１９８５）。ＣＤ５９
（補体媒介性細胞溶解のＧＰＩアンカー型インヒビター）は、正常な前立腺上皮
細胞のプロスタソームおよび前立腺分泌物中に高濃度で見出される（Ｒｏｏｎｅ
ｙ，Ｉ．ら、１９９３）。ＰＳＣＡタンパク質は、前立腺分泌細胞中に検出され
る。
【０２６７】 ＰＳＣＡ ｍＲＮＡが独占的に基底細胞に局在化するという本発明者らの以前
の発見に反して、本結果は、ＰＳＣＡタンパク質が基底細胞および分泌細胞の両
方に存在し得ることを示唆する。前立腺におけるｍＲＮＡとタンパク質局在性と
の間の同様の違いは、ＰＳＭＡおよびアンドロゲンレセプターについて記載され
ている（Ｍａｇｉ−Ｇａｌｕｚｚｉ，Ｃ．ら、１９９７；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｍ
．およびＮａｋａｙａｍａ，Ｊ．，１９９７）。分泌細胞中のＰＳＣＡタンパク
質の存在についての１つの可能な説明は、ＰＳＣＡ ｍＲＮＡが基底前駆細胞に
おいて転写されるが、そのＰＳＣＡタンパク質発現は、基底細胞が分泌細胞へ分
化する際に存続するということである。別の可能性は、ＰＳＣＡタンパク質が基
底細胞から分泌細胞へ翻訳後に移され得ることである。
【０２６８】 ｍＡｂ ３Ｅ６、１Ｇ８および２Ｈ９による基底細胞および分泌細胞の染色強
度における違いは、基底および分泌細胞において抗体および／またはＰＳＣＡの
翻訳後修飾における違いにより認識される異なるエピトープを反映し得る。この
可能性を支持するのは、５つのｍＡｂが、全てのアッセイまたは細胞株において
ＰＳＣＡと同等には反応しない、という知見である。ｍＡｂ ２Ｈ９は、ＬＡＰ
Ｃ−９の細胞表面上のＰＳＣＡを認識するが、ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡは認識しな
い。このことは、この抗体により認識されるエピトープが、後者の細胞型におい
て改変され得るか、または覆い隠され得ることを示唆する。本発明者らはまた、
ｍＡｂ ３Ｅ６が、いくつかの場合、ｍＡｂ １Ｇ８および２Ｈ９と同じように
強く癌を染色しないことを観測した。このことは、ｍＡｂ ３Ｅ６がＰＳＣＡの
特定の型と優先的に反応し得ることを示唆する。
【０２６９】 男性においては大部分は前立腺特異的であるが、ＰＳＣＡはまた、尿路上皮、
直腸の神経内分泌細胞、ならびに腎尿細管および集合管において低レベルで発現
される。腎尿細管および集合管において見られる染色は、これらの構造が発生学
的に中腎管の尿管芽に由来することにおいて興味深く、腎臓において見られる染
色パターンに対する考えられ得る理由を示唆する。検出可能なＰＳＣＡ ｍＲＮ
Ａの腎臓検体における非存在は、低レベルの発現、または集合管が腎髄質中に位
置するが故に、このサンプルが腎皮質から主に得られたという可能性のいずれか
を反映し得る。
【０２７０】 前立腺特異的な細胞表面遺伝子を同定するための主な起動力は、選択的な、無
毒性の治療を開発することが望まれる。ＰＳＭＡ（別の「前立腺制限」タンパク
質）はまた、十二指腸、結腸の神経内分泌細胞、および近位尿細管において発現
されることが示されている（Ｓｉｌｖｅｒ，Ｄ．Ａ．ら、１９９７）。ＰＳＭＡ
ワクチン治療の先の報告は、有意な毒性を生じていない（Ｔｊｏａ，Ｂ．Ａ．ら
、１９９８）。
【０２７１】 尿路上皮および腎臓におけるＰＳＣＡの発現は、正常な前立腺における発現よ
り低く、そして評価された多くの前立腺癌において見られる発現よりも顕著に低
いようである。ＰＳＣＡに対して指示される治療は、それ故、Ｈｅｒ−２／ｎｅ
ｕを過剰発現する乳癌を主に標的にするＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗体と同程度に、癌
に対して相対的に選択的であり得る（Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．およびＣｈｅｅｖｅ
ｒ，Ｍ．Ａ．，１９９７）。
【０２７２】 尿路上皮および腎臓におけるＰＳＣＡの発現は、それが移行細胞癌および腎臓
細胞癌において発現され得る可能性をもたらす。検査された２つの膀胱癌はＰＳ
ＣＡを発現し、１つはＬＡＰＣ−９と同様のレベルであり、これはＰＳＣＡが移
行細胞癌のいくつかの場合において過剰発現され得ることを示唆する。膀胱癌検
体のより完全な調査が、この可能性を試験するために必要とされる。
【０２７３】 本明細書中のデータは、ＰＳＣＡが前立腺癌の大多数において発現されるとい
う本発明者らの初期の知見を支持する。同様に、ＰＳＣＡタンパク質は、隣接す
る正常な腺と比較した場合に、いくつかの前立腺腫瘍において過剰発現され、前
立腺癌治療のための標的としてのその使用を支持している。ｍＲＮＡのインサイ
チュ研究と対照的に、現在の結果はＰＳＣＡタンパク質発現が、癌の段階および
／または癌の程度と相関し得ることを示唆する。ＲＮＡとタンパク質発現との間
の同様の差異は、チモシンＢｅｔａ−１５について記載されている（Ｂａｏ，Ｌ
．ら、１９９６）。
【０２７４】 （表１．正常組織におけるＰＳＣＡ発現） （染色） （組織） 陽性 前立腺（上皮） 膀胱（移行上皮） 胎盤（栄養膜） 結腸（神経内分泌細胞） 腎臓（尿細管および集合管）* 陰性 腎臓（糸球体） 前立腺（間質） 膀胱（平滑筋） 精巣 子宮内膜 小腸 肝臓 膵臓 乳房 胆嚢 骨格筋 脳 末梢神経 骨髄 胸腺 脾臓 肺 気管支 心臓* ｍＡｂ ３Ｅ６は遠位曲尿細管と反応し、一方ｍＡｂ １Ｇ８は遠位尿細管と
反応し、そしていくつかの場合には、近位尿細管と反応する。** 引続く実験分析はまた、正常な胃組織におけるＰＳＣＡ発現を示す。
【０２７５】 （実施例６） （前立腺癌の骨転移におけるＰＳＣＡ発現） 本実験は、ＰＳＣＡ発現が前立腺癌の骨転移において増幅されることを示す。
【０２７６】 （材料および方法） ウマ血清（ＮＨＳ）（ＧＩＢＣＯ ＃２６０５０−０７０）を１％カゼイン、
ＰＢＳＴ中に希釈した（１／２０希釈）。ＰＳＣＡを認識する本発明の抗体を、
１／１００ＮＨＳ、ＰＢＳＴ中に希釈した。
【０２７７】 検出システムは、ＨＲＰ−ウサギ抗マウスＩｇ（ＤＡＫＯ Ｐ２６０）、ＨＲ
Ｐ−ブタ抗ウサギＩｇ（ＤＡＫＯ Ｐ２１７）、ＨＲＰ−ウサギ抗ブタＩｇ（Ｄ
ＡＫＯ Ｐ１６４）を含んだ。それぞれを、１／１００ＮＨＳ、ＰＢＳＴ中１／
１００に希釈した。
【０２７８】 ３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）（Ｆｌｕｋａ
）ストックを、１３５ｍｌの０．０５Ｍトリス（ｐＨ７．４）中に５ｇｍ溶解す
ることにより作製した。ＤＡＢを、１ｍｌ／バイアル中に等分し、そして−２０
℃で凍結した。ＤＡＢの検量用溶液を、１ｍｌのＤＡＢを４０ｍｌのＤＡＢ緩衝
液および４０マイクロリットルの５０％Ｈ2Ｏ2に加えることにより作製した。
【０２７９】 ＤＡＢ緩衝液を、１．３６ｇｍのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ ＃Ｉ−０１２５
）と１００ｍｌのＤ2−Ｈ2Ｏを混合し、次いで５Ｎ ＨＣｌでｐＨを７．５に調
整することにより調製した。ｐＨ調整後、２０ｍｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ
７．４および８０ｍｌのＤ2−Ｈ2Ｏを加えた。
【０２８０】 抗体に対して陽性であることが既知であり、そしてそのことが先に示された組
織／腫瘍の切片を、患者のスライドと共に実行した。このスライドは、その抗体
に対する「陽性のコントロール」として役立つ。患者の試験検体の切片を、一次
抗体の代わりに陰性のコントロール抗体とインキュベートした。このスライドは
、試験のための「陰性のコントロール」として役立つ。
【０２８１】 染色手順は以下のとおりである。骨サンプルをスライドに適用した。次いで、
このスライドを、６０℃で一晩ベーキングした。スライドを、５分間ずつ４交換
のキシレン中で脱パラフィン化し、そして段階的な一連のエチルアルコール（１
００％×４、９５％×２）から水道水までを通過させ、次いでＮＢＦに移し、そ
して３０分間固定した。固定されたスライドを、流水道水中に１５分間置き、３
％Ｈ2Ｏ2−ＭｅＯＨに移し、１０分間インキュベートし、そして流水道水で５分
間洗浄し、次いで脱イオン水でリンスした。
【０２８２】 次いで、スライドを０．０１Ｍクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０に供し、４５℃で
２５分間加熱し、１５分間冷却し、次いでＰＢＳで洗浄した。次いで、このスラ
イドをＰＢＳでリンスし、そして以下の４工程のプログラムを用いるプログラム
されたＤＡＫＯ自動染色機に配置した。この４工程のプログラムは以下の通りで
ある。スライドをＰＢＳでリンスし、そしてＰＢＳＴ中１％カゼイン中の１／２
０ ＮＨＳを用いて１０分間ブロックする。次いで、一次抗体を適用し、そして
３０分間インキュベートし、続いて緩衝液でリンスする。次いで、ＨＲＰ−ウサ
ギ抗マウスＩｇを適用し、そして１５分間インキュベートし、続いて別の緩衝液
でリンスする。ＨＲＰ−ブタ抗ウサギＩｇを適用し、そして１５分間インキュベ
ートし、続いて緩衝液でリンスする。ＨＲＰ−ウサギ抗ブタＩｇを適用し、そし
て１５分間インキュベートし、続いて緩衝液でリンスする。
【０２８３】 次いで、ＤＡＢをこのスライドに適用し、そして５分間インキュベートし、続
いて緩衝液でリンスする。第二のＤＡＢを適用し、そして５分間インキュベート
し、続いて緩衝液でリンスする。
【０２８４】 このスライドを、自動染色機（Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ）から取り出して、そ
してスライドホルダー中に置き、水道水でリンスし、そしてＨａｒｒｉｓヘマト
キシリンで対比染色する（１５秒）。次いで、このスライドを水道水で洗浄し、
酸アルコールに浸漬し、水道水で洗浄し、炭酸水素ナトリウム溶液に浸漬し、そ
して水道水で洗浄する。次いで、このスライドを、段階的なエチルアルコール（
９５％×２、１００％×３）およびＰｒｏｐａｒ×３で脱水し、そしてＰｅｒｍ
ｏｕｎｔでカバーガラスをする。
【０２８５】 （ＰＳＣＡタンパク質は、前立腺癌の骨への転移において強力に発現される） 前立腺癌は、優先的に骨に転移し、そして骨芽細胞の応答を誘導するその傾向
において、ヒトの腫瘍の中でも独特である。前立腺癌の骨転移の９個の切片が、
免疫組織化学的に検査された（図２８）。全てが、ｍＡｂ １Ｇ８（および／ま
たは３Ｅ６）と強烈にそして均一に反応した。２つの例において、微小転移はヘ
マトキシリンで容易に検出可能ではなく、そしてｍＡｂ １Ｇ８を用いる染色後
に、エオシン切片が見られ得る（図２８；患者５）。全体的に、骨転移における
染色は、原発性腫瘍における染色よりも強力で、そしてより均一であった。３つ
の場合において、原発性腫瘍由来の生検試料は、比較のために利用可能である。
対応する骨転移と比較した場合、全てはＰＳＣＡに対して弱く陽性であり、この
ことは、ＰＳＣＡ発現が骨で増加することを示唆した。１つの生検試料において
は、悪性の腺の小さな病巣のみにおいて弱い染色が現れ、一方で残りの腫瘍は陰
性であった（図２１および２８；患者４）。２つの場合においては、生検試料は
骨転移の１０年前および１５年前に得られ、原発性病変の発生と転移病変の発生
との間の長い潜伏期間を示した。骨における強力な染色が骨切片を調製するため
に用いられる脱灰プロセスにより引き起こされたという可能性を除外するため、
３つの原発性生検試料をまた脱灰緩衝液で処理する。この処理はバックグラウン
ド染色を増加させたが、それは上皮の反応性を顕著には変化させず、このことは
、骨における強力なシグナルは脱灰プロセスにより引き起こされたのではなさそ
うだということを示す。これらの結果は、ＰＳＣＡが骨への前立腺癌の転移にお
いて選択され得るかまたは上方制御され得ることを示唆する。
【０２８６】 図２１〜２３は、前立腺癌の骨転移の骨サンプルがＰＳＣＡに対して陽性であ
ったことを示す。前立腺癌の骨転移の９つの切片が検査された。一貫して、強烈
な染色が９つの前立腺癌の骨転移において見られ、そして全てがｍＡｂ １Ｇ８
（および／または３Ｅ６）と強烈にそして均一に反応した。２つの例において、
病理学者は、１Ｇ８を用いる染色が病変を強調するまで転移を容易に同定し得な
い。全体的に、骨転移における染色は、原発性腫瘍における染色よりも強力にそ
してより均一に現れた。
【０２８７】 これらの結果は、ＰＳＣＡが骨への前立腺癌の転移において非常に過剰発現さ
れ得ることを示唆する。Ｓｃａ−２（ＰＳＣＡの近いホモログ）が骨髄において
破骨細胞活性を抑制することが最近報告されたので、これは特に興味深い。ＰＳ
ＣＡが同様の活性を有する場合、破骨細胞活性の阻害は骨形成における骨の活性
のバランスを傾けるので、ＰＳＣＡの活性は、前立腺癌転移が破骨細胞応答を生
じる傾向についての、１つの説明を提供し得る。別の可能性は、他のＬｙ−６／
Ｔｈｙ−１ファミリーのメンバーが同様のプロセスにおいて関与するので、ＰＳ
ＣＡが骨への接着に関与し得ることである。多数の原発性前立腺癌におけるＰＳ
ＣＡの異種の発現が存在した。これらの結果は、進行した疾患のための新規の標
的としてのＰＳＣＡの用途をさらに支持する。
【０２８８】 本研究の最も興味深い結果の１つは、一貫して、強烈な染色が９つの前立腺癌
の骨転移において見られたことである。ＬＡＰＣ−９（骨の転移より定着された
異種移植片）はまた、ＰＳＣＡについて強烈に染色される。３人の患者において
、対応する原発性生検試料は骨の転移と比較して低レベルのＰＳＣＡ発現を示し
た。検査された３人の患者の原発性腫瘍における強力なＰＳＣＡ発現の領域は、
生検のみが分析のために利用可能であるので、避けられ得た。ＰＳＣＡの異質な
発現は、少なくとも１つの対応する原発性腫瘍、および対応する転移病変が利用
可能ではなかったいくつかの原発性腫瘍において検出された。また、２つの場合
において、原発性腫瘍は、骨転移の少なくとも１０年前にサンプリングされ、そ
れは、原発性腫瘍内に高レベルのＰＳＣＡを発現するクローンが、初期の生検に
続いて発生し得る可能性を生じた。これらの結果は、明らかに骨転移におけるＰ
ＳＣＡ発現を示し、さらに、進行した疾患についての新規な標的としてそれを支
持する。
【０２８９】 （実施例７：膀胱癌および膵臓癌におけるＰＳＣＡ過剰発現） 本実験は、ＰＳＣＡ発現が、膀胱癌において通常の膀胱よりも高いことを示す
。
【０２９０】 前立腺、膀胱、腎臓、精巣、および小腸由来の組織（前立腺癌ならびに膀胱癌
および腎臓癌を含む）を患者から得た。次いで、これらの組織を、以下の通りに
ノーザンブロット分析およびウエスタンブロット分析を用いて、ＰＳＣＡへの結
合について検査した。
【０２９１】 ノーザンブロット分析については、組織サンプルを切除し、そして０．５×０
．５ｃｍより小さい組織サンプルを、液体窒素で急速冷凍した。これらのサンプ
ルを、Ｂｉｏｔｅｃｘにより提供されたプロトコルを用いるｐｏｌｙｔｒｏｎホ
モジナイザー（ＵｌｔｒａｓｐｅｃTM ＲＮＡ単離システム、Ｂｉｏｔｅｃｘ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ：２７，１９９２）を用いて、７ｍｌのＵｌｔｒａｓｐ
ｅｃ（Ｂｉｏｔｅｃｘ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ）中でホモジナイズした。
【０２９２】 定量した後、各サンプル由来の２０μｇの精製ＲＮＡを、１％アガロースホル
ムアルデヒドゲル上にロードした。運転条件およびブロッティング条件は、実施
例１において用いられた条件と同じであった。フィルターを、標識化ＰＳＣＡお
よび内部標準（アクチン）で、別々にプローブした。フィルターを洗浄し、そし
て数時間〜終夜で曝した。
【０２９３】 ウエスタンブロット分析については、組織サンプルを切除し、そして０．５×
０．５ｃｍより小さい組織サンプルを取り出して、そして素早くミンスし、そし
て同容積の熱い２Ｘ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５％ＳＤＳ、２０％グリセ
ロール）中でボルテックスした。サンプルを１００℃で５分間インキュベートし
、３０分間ボルテックスし、そして透明にした。タンパク質濃度を、Ｂｉｏｒａ
ｄ’ｓ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）
により決定した。４０μｇ／サンプルを、１２％ポリアクリルアミドタンパク質
ゲル上でロードした。ニトロセルロースフィルターへの転写を標準的な方法（Ｔ
ｏｗｂｉｎら、ＰＮＡＳ ７６：４３５０（１９７９）により行った。ウエスタ
ンブロットを、フィルターをＩＧ８一次抗体、続いてＩＧ８二次抗体（すなわち
、ヤギαマウスＩｇＧ ＨＲＰ）とともにインキュベートすることにより行った
。検出は、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ａｒｌｉｎ
ｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）によった。
【０２９４】 １Ｇ８は、ウエスタンブロット分析において、ＬＡＰＣ９および膀胱癌（指定
された膀胱（Ｒｏｂ））の細胞表面上のＰＳＣＡを認識し、結合した（図６）。
図６において、ＬＡＰＣ９を除く全ての組織は正常であった。ノーザンブロット
分析によって、膀胱癌組織（指定された膀胱（Ｒｏｂ）（Ｒｏｂ’ｓ Ｋｉｄ
ＣＡともいう）およびＬＡＰＣ９）における増強したＰＳＣＡを確認した（図２
５）。
【０２９５】 ノーザンブロット分析を実施して、以下の膵臓癌細胞株から単離した転写物を
試験した：ＰＡＮＣ−１（類上皮、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４６９）、ＢｘＰＣ
−３（腺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＣ（類上皮腺癌、ＡＴＣ
Ｃ番号ＣＲＬ−２１１９）、およびＣａｐａｎ−１（腺癌、肝臓転移、ＡＴＣＣ
番号ＨＴＢ−７９）。ノーザンブロットをＰＳＣＡの全長ｃＤＮＡクローンを用
いてプローブして、２つの膵臓癌細胞株（ＨＰＡＣおよびＣａｐａｎ−１）にお
けるＰＳＣＡ転写物を検出した（図６３）。
【０２９６】 ＰＳＣＡ ｍＡｂ １Ｇ８を用いたウエスタンブロット分析は、ＨＰＡＣ細胞
株において、高レベルのＰＳＣＡタンパク質を検出し、そしてＣａｐａｎ−１お
よびＡＳＰＣ−１（腺癌、腹水、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６８２）においては、
より低レベルを検出した（図６４）。
【０２９７】 （実施例８） （前立腺癌におけるＰＳＣＡ遺伝子増幅） 本実験は、ＰＳＣＡ遺伝子コピー数がｃ−ｍｙｃのコピー数の増加と同様に増
加することを示す（図１７）。ｃ−ｍｙｃ増幅は不幸な結果と相関するので、こ
れは重要である。従って、このデータは、ＰＳＣＡ増幅はまた、不幸な結果に対
する前兆となり得ることを示唆する。
【０２９８】 （染色体列挙プローブおよびｃ−Ｍｙｃに対するプローブを用いるＦＩＳＨ） ＦＩＳＨの方法は周知である（Ｑｉａｎ，Ｊ．ら、「Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ
Ａｎｏｍａｌｉｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌ
ｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ａｎｄ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，５５：５４０８−５４１
４）。手短には、組織切片（サンプル３４および７５は２人の患者由来であった
）を脱パラフィン化し、脱水し、２Ｘ ＳＳＣ中７５℃で１５分間インキュベー
トし、３７℃で１５分間ペプシン溶液中（０．９％ＮａＣｌ（ｐＨ１．５）中４
ｍｇ／ｍｌ）で消化し、室温で５分間２Ｘ ＳＳＣでリンスし、そして空気乾燥
した。
【０２９９】 ＰＳＣＡに対しておよび８ｑ２４（ｃ−ｍｙｃ）領域に対して直接的に標識さ
れた蛍光ＤＮＡプローブを選択した。ＰＳＣＡ ｃＤＮＡ（図１）を、製造者の
プロトコル（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）に従ったＦＩＳＨ分析
において次に用いられる、１３０ｋｂの細菌性人工染色体（ｂａｃ）クローン（
ＰＳＣＡプローブ）を同定するために用いた。このように同定され、ＦＩＳＨ分
析において用いられたｂａｃクローンは、ＢＡＣＨ−２６５Ｂ１２（Ｇｅｎｏｍ
ｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．コントロール番号１７４２４）であった。
【０３００】 ＳＧ標識ＰＳＣＡプローブと共に、８ｑ２４（ｃ−ｍｙｃ）に対するＳＯ標識
プローブを用い、連続的な５μｍ切片上でデュアルプローブハイブリダイゼーシ
ョンを行った。プローブおよび標的ＤＮＡを、８０℃のオーブンで５分間、同時
に変性させ、そしてそれぞれのスライドを３７℃で一晩インキュベートした。
【０３０１】 １．５Ｍ尿素／０．１Ｘ ＳＳＣ中、４５℃で３０分間、および２Ｘ ＳＳＣ
中、室温で２分間、ハイブリダイゼーション後の洗浄を行った。核を、４，６−
ジアミジノ−２−フェニルインドールおよびａｎｉｌｆａｄｅ化合物ｐ−フェニ
レンジアミンで対比染色した。
【０３０２】 ＦＩＳＨシグナルの数を、トリプルパスフィルター（Ｉ０２−１０４−１０１
０；ＶＹＳＩＳ）を装備したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡を用いて数え
た。ｃ−ｍｙｃシグナルおよびＰＳＣＡシグナルの数を、各々の核について数え
、そしてｃ−ｍｙｃ：ＰＳＣＡ比の全体的な平均値を計算した。結果を図１７に
示す。
【０３０３】 この結果は、ＰＳＣＡ遺伝子コピー数が、前立腺癌サンプルにおいて増加した
ことを示す（図７）。ＰＳＣＡ遺伝子は、８ｑ２４．２に位置する。遺伝子コピ
ー数の増加は、第８染色体の増加、およびＰＳＣＡ遺伝子の増幅の両方による（
図１７）。興味深いことには、ＰＳＣＡ遺伝子コピー数の増加は、これもまた８
ｑ２４に位置するｃ−ｍｙｃの遺伝子コピー数の増加と類似する（図１７）。先
の研究は、第８染色体の増加およびｃ−ｍｙｃの増幅は、前立腺癌の進行の潜在
的なマーカーであることを示した（Ｒ Ｂ Ｊｅｎｋｉｎｓら １９９７ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：５２４−５３１）。
【０３０４】 （実施例９） （ルシフェラーゼ発現を駆動するためのｈＰＳＣＡ ９ｋｂ上流領域を使用し
たレポーター遺伝子構築物） 実施例４に記載されるように、ヒトＰＳＣＡ遺伝子をコードする１４ｋｂ Ｎ
ｏｔＩゲノムフラグメントを、全長ヒトＰＳＣＡ ｃＤＮＡプローブでライブラ
リーをスクリーニングすることにより、ヒトゲノムＤＮＡ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ)をコードするλＦ［ＸＩ］ライブラリーから単離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）。１４ｋｂ ヒトＰＳＣＡゲノムフラグメントはレポーター遺伝
子の発現を駆動するために使用された９ｋｂのＰＳＣＡ上流配列を含む。
【０３０５】 レポーター遺伝子ベクターは図４２に示され、そして以下のように構築した。
１４ｋｂ ＮｏｔＩフラグメントをλベクターからＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ
ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ヘサブクローニングし、ｐＢＳＫＳ−ＰＳＣ
Ａ（１４ｋｂ）構築物を生じた。ＰＳＣＡ上流配列を、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベ
クターの中に含まれるＴ７配列に対応するプライマーおよびＰＳＣＡエクソン１
の中に含まれる配列に対応するプライマー（プライマーＨ３ｈＰＳＣＡ３’−５
、このプライマーの配列は以下の通りである：Ｈ３ｈＰＳＣＡ３’−５の配列は
５’−ｇｇｇａａｇｃｔｔｇｃａｃａｇｃｃｔｔｃａｇｇｇｔｃ−３’である）
を使用して、ＰＣＲ増幅によりｐＢＳＫＳ−ＰＳＣＡ（１４ｋｂ）からサブクロ
ーニングした。ＰＳＣＡエクソン１に対応するプライマーは、ＰＣＲ増幅後のさ
らなるサブクローニングを可能にするために導入されたＨｉｎｄＩＩＩ配列を含
んだ。生じた増幅されたフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして、ｐ
ＧＬ３−基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中にサブクローニングし、ルシフェ
ラーゼ遺伝子と作動可能に連結された種々の長さのＰＳＣＡ上流配列を含む一連
の欠失レポーター遺伝子構築物を生成するのに使用されたｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（
７ｋｂ）を生成した（図４２）。ＰＳＣＡ上流領域の欠失された部分をｐＧＬ３
−ＰＳＣＡ（７ｋｂ）から制限フラグメントをサブクローニングすることにより
得た。−９ｋｂと−７ｋｂの間のＰＳＣＡ上流領域をｐＢＳＫＳ−ＰＳＣＡ（１
４ｋｂ）構築物からサブクローニングし、ＮｏｔＩ部位をＫｌｅｎｏｗによって
平滑末端へ変換し、そして、そのフラグメントをｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（９ｋｂ）
構築物を得るためにｐＧＬ−ＰＳＣＡ（７ｋｂ）のＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部
位にクローニングした。ＰＳＣＡコード領域の上流配列に対する表示は（例えば
−９ｋｂおよび−６ｋｂ（など））ＡＴＧ翻訳開始コドンと関連する。レポータ
ー遺伝子構築物ｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（９ｋｂ）、ｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（６ｋｂ）
、ｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（３ｋｂ）およびｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（１ｋｂ）をルシフ
ェラーゼ遺伝子と作動可能に連結した（図４２）。プラスミド、ｐＧＬ３−ＣＭ
Ｖは、ルシフェラーゼ遺伝子に連結されたサイトメガロウイルスプロモーター（
Ｂｏｓｈａｒｔ，Ｍ．ら、１９８５ Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０）を含み
、そして陽性コントロールとして使用した。また、プラスミドｐＧＬ３はプロモ
ーター配列を含まず、そしてこれをネガティブコントロールプラスミドとして使
用した。
【０３０６】 （実施例１０） （ｈＰＳＣＡ上流領域を含むレポーター遺伝子構築物を使用したトランスフェ
クションアッセイ） 前立腺細胞株および非前立腺細胞株の３通りの皿を、Ｔｆｘ５０（Ｂｏｅｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）により、ＰＳＣＡ構築物ｐＧＬ３−ＰＳＣＡ（９ｋ
ｂ）または陽性コントロール構築物であるｐＧＬ３−ＣＭＶ（両方とも上記実施
例９に記載される）を用いてトランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ活性に
ついてアッセイした（図４３）。トランスフェクトされた細胞および細胞株には
、ＰｒＥＣ（アンドロゲン非依存性前立腺基底細胞）、ＬＮＣａＰ（アンドロゲ
ン依存性前立腺分泌細胞株）、ＬＡＰＣ４（アンドロゲン依存性前立腺細胞株）
、ＨＴ１３７６（膀胱細胞株）および２９３Ｔ（腎臓細胞株）が挙げられる。そ
の構築物の発現活性はＣＭＶプロモーターの活性の割合として表される。標準誤
差がバーの上に示される。
【０３０７】 結果は、９ｋｂのヒトＰＳＣＡ上流配列が、図１０に示された天然ｈＰＳＣＡ
に見られるｍＲＮＡ発現パターンと類似する組織特異的様式においてルシフェラ
ーゼ遺伝子の発現を駆動することを示す（実施例１）。ルシフェラーゼは、アン
ドロゲン依存性前立腺細胞株およびアンドロゲン非依存性前立腺細胞株ならびに
膀胱の両方において容易に検出可能であった。ルシフェラーゼもまた、低レベル
ではあるが、腎臓細胞で検出可能であった。
【０３０８】 （実施例１１） （ＰＳＣＡ上流領域内の調節エレメントの同定） ＰｒＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）またはＬＮＣａＰ細胞の３通りの皿を、上記
実施例９に記載されたレポーター遺伝子構築物または陽性コントロール構築物で
トランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。レポーター遺
伝子構築物は、ルシフェラーゼ遺伝子に作動可能に連結された種々の長さのｈＰ
ＳＣＡ上流領域を含む。陽性コントロール構築物であるｐＧＬ３−ＣＭＶは、ル
シフェラーゼに作動可能に連結されたＣＭＶプロモーターを含む。その細胞をＴ
ｆｘ５０トランスフェクション系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、トランスフェ
クトした。トランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼの発現をＤｕａ
ｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）を使用して、アッセイし、ルシフェラーゼ発現のレベルを相対的
単位（ＲＬＵ）で測定した。
【０３０９】 種々の長さのｈＰＳＣＡ上流領域がルシフェラーゼ発現を駆動する能力は、Ｃ
ＭＶプロモーターを含む陽性コントロール構築物の活性の割合として表される。
標準誤差を示す。
【０３１０】 図４４に示される結果は、ＰｒＥｃ細胞およびＬＮＣａＰ細胞の両方において
３ｋｂのｈＰＳＣＡ上流配列はルシフェラーゼの発現を駆動することを実証する
が、ＰｒＥＣ細胞と比較して、ＬＮＣａＰ細胞における検出可能なルシフェラー
ゼのレベルは６倍高い。この比較は検出可能なルシフェラーゼのレベルに基づい
た。対照的に、１ｋｂのｈＰＣＳＡ上流配列は、いずれの細胞株のルシフェラー
ゼの発現をも駆動しなかった。
【０３１１】 （実施例１２） （標的ベクター） 標的ベクターを相同組換えによって、内因性ＰＳＣＡコード領域を欠失するよ
うに設計した。図４０は、マウスＰＳＣＡ遺伝子の標的ベクター、およびマウス
細胞に含まれる内因性ＰＳＣＡ遺伝子を欠失させるためにこの標的ベクターを使
用するためのストラテジーを示す。標的ベクターは、マウスＰＳＣＡ上流配列を
含む１２ｋｂ ＳｐｅＩフラグメント、ｐＧＴ−Ｎ２９ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ）由来のｎｅｏr遺伝子に作動可能に連結された
ＰＧＫプロモーターを含むＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント、およびマウスＰ
ＳＣＡ下流配列を含む３．５ｋｂＢｓｔＸＩ／ＸｈｏＩフラグメントを含む。ネ
オマイシン耐性遺伝子の構成的発現はＰＧＫプロモータにより制御され、標的ベ
クターを含む標的細胞の抗生物質選択を可能にする。
【０３１２】 当業者に理解されているように、本明細書に記載される標的ベクターとしては
、標的ベクターを含むか、または選択レポーター遺伝子を含み得ない細胞の選択
のためのｎｅｏr遺伝子が挙げられるがこれに限定されない。標的ベクターはま
た、トランスジェニックマウス（当該分野で公知の、それぞれ標的ベクターがレ
ポーター遺伝子を含むか否かに依存する、ノックインマウスまたはノックアウト
マウス）の生成に使用され得る。トランスジェニックマウスは、マウスの前立腺
発達におけるＰＳＣＡ遺伝子の機能を研究するための動物モデルとして使用され
得る。
【０３１３】 限定することを意図しない１つの例として、標的ベクターを使用して、欠失さ
れたＰＳＣＡ遺伝子を含む、ヘテロ接合性の細胞を生成するために、胚性幹細胞
（ＥＳ）細胞中の野生型内因性ゲノムマウスＰＳＣＡコード配列を欠失させた。
例えば、標的ベクターを使用して生成したヘテロ接合性細胞は、図４０に結果と
して示されるようなＰＳＣＡ＋／ｎｅｏrである。ヘテロ接合性細胞またはトラ
ンスジェニックマウスの表現型は野生型ＰＳＣＡ細胞または動物と比較され得る
。
【０３１４】 標的ベクターは以下のように構築される。ＰＳＣＡ上流およびエキソン１配列
の一部を含む１２ｋｂ ＳｐｅＩフラグメントの末端を、平滑末端化し、そして
ネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＧＴ−Ｎ２９（Ｂｉｏ Ｌａｂｓ）由来の平滑
末端化されたＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントに連結した。ネオマイシン耐性
遺伝子の３’末端を、ＰＳＣＡ エキソン３の一部および下流配列を含む平滑末
端化された３．５ｋｂＢｓｔＸＩ／ＸｈｏＩフラグメントに連結した。生じたフ
ラグメントを、標的ベクターｐＧＴ−Ｎ２９−ｍＰＳＣＡ５’／３’を生成する
ためにｐＧＴ−Ｎ２９へクローニングした。
【０３１５】 標的ベクターを、以下に記載される方法を使用して、エレクトロポレーション
によりＥＳ細胞へトランスフェクトした：Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ
ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）。ネオマ
イシン耐性細胞を、選択し、そしてゲノムＤＮＡを選択された細胞から単離した
。ゲノムサザン分析を実施して、相同組換え反応の結果を決定した。相同組換え
反応および非標的ＥＳ細胞由来の１０μｇのＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そし
てサザンブロット法によって分析した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、ＥＭ １９７５ Ｊ
．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３）。ブロットをＰＳＣＡコード領域に対
する配列３’を含むＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを用いてプローブした。
その結果は、このプローブが、ＰＳＣＡ＋／ＰＳＣＡ＋であるコントロール非標
的細胞に対応する１０ｋｂフラグメントおよびヘテロ接合性であり、そしてＰＳ
ＣＡ＋／ｎｅｏrを含む標的細胞に対応する４ｋｂフラグメントを検出すること
を示す。
【０３１６】 （実施例１３） （前立腺癌についてのトランスジェニックマウスモデル） 本発明は、前立腺基底細胞における腫瘍形成を誘導するために、オンコジーン
の発現を駆動するようにＰＳＣＡ遺伝子の上流領域を使用して、前立腺癌につい
てのトランスジェニックマウスモデルを作製するためのストラテジーを意図する
。図４１に示されるように、このストラテジーは、投与（例えば、腫瘍形成を誘
導する遺伝子産物をコードする導入遺伝子に作動可能に連結されたＰＳＣＡ遺伝
子の上流領域を含む、キメラオンコジーンベクターのマイクロインジェクション
）を含む。他の研究者らは、オンコジーンに作動可能に連結された異なる前立腺
調節配列および非前立腺調節配列を使用する、この技術を使用してきた。例えば
、Ｃ３（１）は、前立腺優勢調節配列であり（Ｍｏｒｏｕｌａｋｏｕら、１９９
４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１１２３６〜１１２４０）、
そしてプロバシン（ｐｒｏｂａｓｉｎ）は、前立腺特異的調節配列であり（Ｇｒ
ｅｅｎｂｅｒｇら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：３
４３９〜３４４３）、そしてこれらの両方の調節配列は、前立腺分泌細胞におい
て、導入遺伝子の発現を駆動する。クリプトジン（ｃｒｙｐｔｄｉｎ）２は、前
立腺内分泌細胞におけるオンコジーンの発現を引き起こした小腸優勢調節配列で
ある（Ｇａｒａｇｅｎｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：
１５３８２〜１５３８７）。対照的に、本発明は、前立腺癌についてのトランス
ジェニックマウスモデルを作製するために、前立腺基底細胞におけるオンコジー
ンの発現を駆動するＰＳＣＡ上流領域を使用することを意図する。
【０３１７】 誘導された前立腺腫瘍の臨床的特徴は、キメラオンコジーンベクターを構築す
る際に使用される特定のオンコジーンにより生じる腫瘍の既知の特徴を用いて分
析および比較され得る。さらに、トランスジェニックマウスの種々の組織および
器官は、そのキメラオンコジーンベクターの存在および発現パターンを確認する
ために、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析およびタンパク質分析により分析され得る。
【０３１８】 （実施例１４） （ｈＰＳＣＡ上流配列および導入遺伝子を含むキメラベクターを保有するトラ
ンスジェニックマウス） ｈＰＳＣＡ上流領域の制御下における導入遺伝子の発現パターンを試験する。
この目的のために、ｈＰＳＣＡ上流配列および導入遺伝子を含むキメラベクター
を保有するキメラマウスを作製した。導入遺伝子と作動可能に連結された９ｋｂ
または６ｋｂのｈＰＳＣＡ上流配列を含むキメラベクターを構築し、そしてそれ
は、図４５において図式的に表されている。その導入遺伝子としては、ＳＶ４０
ポリアデニル化配列と連結された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）ｃＤＮＡ（ＰＳＣＡ（９ｋｂ）−ＧＦＰおよびＰＳＣＡ（６ｋｂ）−ＧＦＰ
）、ｍＲＮＡに安定性を与えるイントロンカセットを含むヒト成長ホルモンの３
’領域と連結された緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ（ＰＳＣＡ（９ｋｂ）−ＧＦＰ
−３’ｈＧＨおよびＰＳＣＡ（６ｋｂ）−ＧＦＰ−３’ｈＧＨ）（Ｂｒｉｎｓｔ
ｅｒら、１９８８ ＰＮＡＳ ８５：８３６〜８４０）ならびにイントロンを含
む、ＳＶ４０小Ｔ抗原およびＳＶ４０大Ｔ抗原をコードするゲノムフラグメント
（ＰＳＣＡ（９ｋｂ）−ＳＶ４０ＴＡＧおよびＰＳＣＡ（６ｋｂ）−ＳＶ４０Ｔ
ＡＧ）（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８４ Ｃｅｌｌ ３７：３６７〜３７９）が
挙げられる。
【０３１９】 キメラベクターを使用して、始祖トランスジェニックマウスの系統を作製した
。線状キメラベクターを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｘ Ｃ３Ｈハイブリッドマウスの異種
交配に由来するマウス受精卵内に微量注入した。キメラベクターを保有する始祖
マウスを、プローブとしてＧＦＰｃＤＮＡまたはＳＶ４０ゲノムＤＮＡを使用し
て、テールＤＮＡのサザン分析によって同定した。各々のトランスジェニックマ
ウス系統の始祖数は、図４５の右パネルに示される。
【０３２０】 （実施例１５） （ｈＰＳＣＡ上流配列は、トランスジェニックマウスの導入遺伝子の発現を駆
動する） ＰＳＣＡ（９ｋｂ）−ＧＦＰ導入遺伝子を保有する、２匹の独立始祖マウスを
Ｂａｌｂ／ｃマウスと交配させて、その子孫を得た。８週齢および１２週齢にお
いて、雄性および雌性のトランスジェニック同腹子または非トランスジェニック
同腹子を屠殺した。屠殺後、全ての泌尿生殖組織および他の組織を、蛍光性照明
下において、固定された組織を観察することによって、ＧＦＰ発現について試験
した。図４６に示される結果は、非トランスジェニックマウスおよびトランスジ
ェニックマウスに由来する前立腺組織、膀胱組織および皮膚組織の緑色蛍光画像
を示す。２つの始祖系統のうち１つの系統が、前立腺、膀胱および皮膚において
ＧＦＰタンパク質を発現した（図４６）。ＧＦＰを発現しなかった組織としては
、精嚢、肝臓、胃、腎臓、肺、脳、精巣、膵臓、心臓、骨格筋、小腸、結腸、胎
盤が挙げられる。
【０３２１】 （実施例１６） （ヒト組織およびマウス組織におけるＰＳＣＡの転写発現パターン） 図４７の上部パネルは、全長ヒトＰＳＣＡ ｃＤＮＡプローブを用いて検出さ
れた、複数のヒト組織のノーザンブロットを示す（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈより入手
）。この結果は、ヒトＰＳＣＡ転写物は、前立腺に豊富に存在し、そして胎盤に
は容易に検出可能であるがあまり豊富に存在せず、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、小
腸、結腸、末梢血白血球（ＰＢＬ）、心臓、脳、肺、肝臓、筋肉、腎臓および膵
臓においては検出不可であるということを実証している。
【０３２２】 図４７の下部パネルは、種々のマウス組織におけるマウスＰＳＣＡ転写発現パ
ターンのＲＴ−ＰＣＲ分析のエチジウムブロマイド染色したアガロースゲルを示
す。そのＲＴ−ＰＣＲを、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ．ＲＮＡ（Ｂｉｏｔｅｘ）および
ｃＤＮＡサイクルキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製した。ＰＳＣ
Ａのエキソン１およびエキソン３内の領域に対応するプライマーを使用して、３
２０ｂｐフラグメントを増幅した。エキソン１プライマー配列は以下の通りであ
る：５’プライマー：５’−ＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣ−３’
。エキソン３プライマー配列は以下の通りである：３’プライマー：５’−ＧＣ
ＡＧＣＴＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＴ−３’。コントロールとして、種々のマ
ウス組織から単離されたＲＮＡサンプルの完全性を実証するために、３００ｂｐ
のＧ３ＰＤフラグメントを増幅した。
【０３２３】 図４７の下部パネルに示される結果は、マウスＰＳＣＡ転写物は、背側／外側
前立腺、腹側前立腺、膀胱、胃（噴門、本体および幽門）ならびに皮膚において
検出可能であるということを実証している。対照的に、マウスＰＳＣＡ転写物は
、前方前立腺、腹側前立腺、精嚢、尿道、精巣、腎臓、十二指腸、小腸、結腸、
唾液腺、脾臓、胸腺、骨髄、骨格筋、心臓、脳、眼、肺および肝臓において検出
されない。このＧ３ＰＤＨの結果は、種々のマウス組織から単離された転写物が
インタクトであったということを実証している。
【０３２４】 （実施例１７） （膀胱癌におけるＰＳＣＡの高レベルの過剰発現の免疫組織化学的証拠） 以下の実施例は、ＰＳＣＡ ｍＡｂ １Ｇ８を使用して、パラフィン包埋した
膀胱組織切片および膀胱癌組織切片の免疫組織化学染色によって決定される場合
、ＰＳＣＡタンパク質は、種々の段階の膀胱癌において高度に過剰発現されてい
るということを実証している。詳細には、以下の４組織を試験した：（Ａ）正常
膀胱、（Ｂ）非浸潤性表面乳頭（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｓｕｐｅｒｆｉｃ
ｉａｌ ｐａｐｉｌｌａｒ）、（Ｃ）上皮内癌（高段階の前癌性病変）、（Ｄ）
浸潤性膀胱癌。
【０３２５】 その結果は、図６２に示される。ＰＳＣＡは、正常膀胱組織の移行上皮におい
て低レベルで発現される。非常に高いレベルの発現が、全ての細胞層において、
上皮内癌サンプルにおいて検出された。浸潤性膀胱癌サンプルにおいて、非常に
強い染色が、再び全ての細胞において観察された。低レベルの染色が、表面乳頭
サンプルにおいて観察された。これらの結果は、ＰＳＣＡ発現レベルは、段階が
進むことと相関し得ることを示唆する。
【０３２６】 上記の研究に加えて、多数の膀胱組織標本および膀胱癌組織標本におけるＰＳ
ＣＡ発現の免疫組織化学的分析に由来する予備結果は、以下を示す：（１）正常
膀胱は、移行上皮において低レベルのＰＳＣＡを発現する；類似の発現レベルが
低い段階の乳頭状非浸潤性病変において観察される；（２）上皮内癌（高い段階
の、しばしばかなり急速進行性の前癌性病変）は、全ての細胞において、ＰＳＣ
Ａに対してほとんどいつも（９０％）極度に陽性である；（３）ＰＳＣＡは、約
３０％の浸潤性癌によって、極度に発現される（すなわち、正常膀胱と比較した
場合、過剰発現されている）；そして（４）転移は、ＰＳＣＡについて極度に陽
性である。
【０３２７】 （実施例１８） （ＰＳＣＡモノクローナル抗体は、インビボにおいて前立腺腫瘍の阻害を媒介
した） 以下の実施例は、非結合体化ＰＳＣＡモノクローナル抗体が、単独または組み
合わせて投与された場合の両方で、ＳＣＩＤマウスにおいて増殖するヒト前立腺
腫瘍異種移植片の増殖を阻害するということを実証している。
【０３２８】 （Ａ．複数の非結合体化ＰＳＣＡ ｍＡｂを使用する腫瘍阻害−研究１） （材料および方法） （抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体） マウスモノクローナル抗体を、標準的なモノクローナル抗体産生方法を利用し
て、ＰＳＣＡアミノ酸配列のＰＳＣＡアミノ酸残基１８〜９８（図１Ｂ）を含み
、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させたＧＳＴ−ＰＳＣＡ融合タンパク質に対
して惹起した。以下の７つの抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体（１９９８年１２月
１１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
に寄託された対応するハイブリドーマ細胞株によって産生される）をこの研究に
使用した： 抗体 アイソタイプ ＡＴＣＣ Ｎｏ． １Ｇ８ ＩｇＧ１ ＨＢ−１２６１２ ２Ｈ９ ＩｇＧ１ ＨＢ−１２６１４ ２Ａ２ ＩｇＧ２ａ ＨＢ−１２６１３ ３Ｃ５ ＩｇＧ２ａ ＨＢ−１２６１６ ３Ｇ３ ＩｇＧ２ａ ＨＢ−１２６１５ ４Ａ１０ ＩｇＧ２ａ ＨＢ−１２６１７ ３Ｅ６ ＩｇＧ３ ＨＢ−１２６１８ 。
【０３２９】 抗体は、ＰＳＣＡを結合する能力について、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット
、ＦＡＣＳ、および免疫沈降により特徴づけされた。図４９は、添付の図面説明
に記載されるように、ＥＬＩＳＡおよびウェスタン分析により決定される場合の
上記の７つの抗ＰＳＣＡ ｍＡｂについてのエピトープマッピングデータを示す
。これは、７つの抗体がＰＳＣＡタンパク質上の異なるエピトープを認識するこ
とを実証する。これらの抗体を用いる前立腺癌組織および細胞の免疫組織学的分
析は、以下の実施例５および６に記載される。
【０３３０】 （抗体処方物：） 上記のモノクローナル抗体は、プロテインＧＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラ
フィーによりハイブリドーマ組織培養上清から精製され、ＰＢＳに対して透析さ
れ、そして−２０℃で保存された。タンパク質決定をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により行った。
【０３３１】 以下の表２に示されるような、７つの個別のモノクローナル抗体の混合物を含
む治療用抗体カクテルを調製し、そしてＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍異種移植片の皮
下注射を受けているＳＣＩＤマウスの処置に用いた。マウスＩｇＧ（ＩＣＮ（Ｃ
ｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）から購入）を、非特異的コントロール抗体として用
いた。マウスへの注射の前に、全ての抗体を０．２２μのフィルターを用いて滅
菌した。
【０３３２】 （表２：抗ＰＳＣＡ抗体カクテル）
【０３３３】
【表２】 （前立腺癌異種移植片のＳＣＩＤマウスへの導入） ヒト前立腺癌異種移植片株ＬＡＰＣ−９（これは、非常に高レベルのＰＳＣＡ
を発現する）は、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍を生成するために用いた（ＰＣＴ
出願番号ＷＯ９８／１６６２８、前出、Ｋｌｅｉｎら、１９８７、前出）。
【０３３４】 ＩｃＲ−ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗ
ｎ，ＮＹ）への注射のために、ＬＡＰＣ−９の単一細胞懸濁液を、以下のように
調製した。約２．０ｇの大きさのＬＡＰＣ−９異種移植片腫瘍を、ＳＣＩＤマウ
スから収集し、ハサミまたはピンセットを用いて微小片へと切り刻み、ＲＰＭＩ
中で１回洗浄し、そしてプロナーゼの１％溶液中で２０分間消化した。消化の後
、細胞懸濁液を、ＲＰＭＩ中で２回洗浄し、そして１０ｍｌのＰｒＥＧＭ培地（
Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中に再懸濁した。一晩
のインキュベーションの後、細胞を収集し、ＰｒＥＧＭ中で１回洗浄し、次いで
２００μのナイロンフィルターを通過させて大きな凝集塊および細片を取り除い
た。フィルターを通過した細胞を、収集し、遠心分離し、そしてＰｒＥＧＭ培地
中に再懸濁した。次いで、細胞を計数し、そして適切な数の細胞を、新しいチュ
ーブに移し、遠心分離し、そして２Ｘ濃度でＲＰＭＩに再懸濁した。次いで、当
量の氷冷マトリゲルを細胞懸濁液に添加し、そしてその懸濁液を注射まで氷上に
保った。注射のために、雄性ＩｃＲ−ＳＣＩＤマウスは、その側腹を剃毛し、そ
して各マウスは、右側腹に１００μｌの容量中に１×１０6細胞の単回の皮下（
ｓ．ｃ．）注射を受けた。腫瘍細胞を注射したマウスを、以下に記載されるよう
に、コントロール抗体かまたは抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体調製物のいずれか
を用いて処置した。
【０３３５】 （処置プロトコル：） 腫瘍細胞を注射した２０匹のＳＣＩＤマウスを、以下のように、コントロール
抗体（マウスＩｇＧ）かまたは抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体カクテル（上記）
のいずれかを用いて処置した。１０匹のマウスを、マウスＩｇＧコントロール抗
体で処置し、そして１０匹のマウスを抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体調製物で処
置した。マウスＩｇＧコントロール抗体または抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体カ
クテルの２００μｇの注射物を、腫瘍細胞の注射に対して、−１日、＋３日、＋
７日、＋１１日、＋１４日、および＋２１日目に腹腔内投与した。ＬＡＰＣ−９
腫瘍の増殖を、カリパス測定により追跡して、腫瘍細胞の注射に対して、＋３２
日、＋３５日、＋３９日、＋４２日、＋４７日、＋５４日、および＋６１日目に
腫瘍容積を決定した。さらに、マウスを、市販のＰＳＡ試験（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｑｕａｌｅｘ，Ｓａｎ Ｃｌｅｍｅｎｔ，ＣＡ）を用いて循環ＰＳＡレベルを
アッセイするために、周期的に採血した。
【０３３６】 コントロール群（マウス＃２）のマウスの１匹は、研究の期間の間に死に、そ
してこの時点で検出可能な腫瘍は有していなかった。
【０３３７】 （結果） ＬＡＰＣ−９前立腺癌異種移植片の皮下注射を受けているＳＣＩＤマウスを、
上記のように、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ調製物またはマウスＩｇＧコントロール抗体
のいずれかで処置した。明白な腫瘍は、腫瘍細胞注射後４週間で、マウスＩｇＧ
コントロール群において始めに現れた。腫瘍容積測定を、＋３２日目に開始した
。
【０３３８】 結果（以下の表３に作表され、そして図４８に図示される）は、コントロール
ｍＡｂ処置マウスの全てが腫瘍を発症した（生存する９匹の内９匹、マウス＃１
、＃３−１０）ことを示すが、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ処置マウスは、検出可能な腫
瘍増殖を発症しなかった（１０匹の内０匹、マウス＃１１−２０）こと示す。コ
ントロール処置動物は、殆どの例において有意な腫瘍を急速に発症し、そしてこ
れらのマウスは、時間と共に、次第により大きな腫瘍サイズになる、一定の腫瘍
増殖を経験した。５４日目までに、全てのコントロール処置マウスは、検出可能
な腫瘍を発症した。コントロール処置群に対して際立って対照的には、抗ＰＳＣ
Ａ ｍＡｂ調製物で処置した１０匹のマウスは、異種移植片注射の６１日後でさ
え、検出可能な腫瘍を発症しなかった。
【０３３９】 （表３：記録した腫瘍容積（ｍｍ3）測定）
【０３４０】
【表３】 *マウス＃１−１０は、マウスＩｇＧコントロール抗体を用いて処置した群を示
す。マウス＃１１−２０は、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂカクテルを用いて処置した群を
示す。* 腫瘍容積は、長さ（Ｌ）×幅（Ｗ）×高さ（Ｈ）測定（ｍｍ）に対応する。図
１に示される楕円体容積（これは、腫瘍質量を正確に示す（Ｔｏｍａｙｋｏおよ
びＲｅｙｎｏｌｄｓ，１９８９））を決定するために、本発明者らは、式Ｌ×Ｗ
×Ｈ×１／２を用いた。
【０３４１】 臨床的に、コントロール処置マウスは、全て、腫瘍が発症および拡大した場合
、次第に不健康な視覚的症状を示した。対照的に、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ処置群の
マウスは、処置期間を通じて、外見上は、活発（ａｃｔｉｖｅ）、強健（ｖｉｇ
ｏｒｏｕｓ）、かつほぼ健康なままであった。このことは、明かな毒性または明
白な副作用がこの処置に付随しないことを示唆する。
【０３４２】 腫瘍容積に加えて、マウスを循環ＰＳＡの決定のために採血した。循環ＰＳＡ
レベルは、コントロール群における腫瘍容積の漸増と相関したが、検出可能なＰ
ＳＡは、実験を通じて抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ処置群において観察されなかった。
【０３４３】 （Ｂ．複数の非結合体化ＰＳＣＡ ｍＡｂを用いる腫瘍阻害−研究２） 実施例１８、前出、に記載の結果を検証するために、新規に調製した抗ＰＳＣ
Ａ ｍＡｂカクテルを、本質的に上記のように、インビボでのＬＡＰＣ−９腫瘍
異種移植片の増殖阻害について評価した。簡単に言えば、各ｍＡｂの新規のバッ
チを調製し、そして表４に示した比率に従って共に混合した。全ての抗体を、Ｐ
ＳＣＡ反応性について試験した。ＳＣＩＤマウスは、上記のようにＬＡＰＣ−９
異種移植片細胞の皮下注射を受けた。マウスを、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂのカクテル
またはマウスＩｇＧのコントロール調製物、または精製したウシＩｇＧのいずれ
かで処置した。ウシＩｇＧコントロール群をこの研究に入れて、プロテインＧ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにおける抗ＰＳＣＡ抗体を用いて共精製したウシＩｇＧの効
果を研究した。２００マイクログラムの抗体を、腫瘍細胞の注射に対して−１日
、＋３日、＋７日、＋１１日、＋１４日、および＋２１日目に腹腔内注射により
各マウスに投与した。長さ（Ｌ）×（Ｗ）×（Ｈ）（ｍｍ）に対応する腫瘍容積
を、カリパス測定によりモニターし、そして血清を週間隔で収集した。腫瘍の楕
円体容積（これは、腫瘍質量を正確に示す）を決定するために、本発明者らは、
式Ｌ×Ｗ×Ｈ×１／２（ＴｏｍａｙｋｏおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ，１９８９）を
用いた。
【０３４４】 （表４：抗ＰＳＣＡ抗体カクテル２）
【０３４５】
【表４】 *このカクテルを処方するために用いたモノクローナル抗体調製物の１つである
、３Ｇ３は、弱い反応性を示した。
【０３４６】 本研究の結果を、図５３に示し、そしてこれは前出の実施例１８−Ａに記載し
た研究から生じた結果を確かめる。抗ＰＳＣＡ処置群の動物は、コントロール群
の両方と比較して、腫瘍細胞増殖の有意な阻害を経験した。腫瘍増殖における検
出可能な差異は、ウシＩｇＧまたはマウスＩｇＧのいずれを受けたマウスにおい
ても、観察されなかった。コントロール群における腫瘍は、等しい速度で増殖し
、そして類似の潜伏期を有した。対照的に、抗ＰＳＣＡ抗体反応混液を受けたマ
ウスにおけるＬＡＰＣ−９腫瘍は、実験の最後に、より長い潜伏期で、有意に遅
い増殖速度およびより小さなサイズを示した。最終時点での平均の腫瘍容量は、
マウスＩｇＧで処置したマウス（４６日）で１，１３９ｍｍ3であり、ウシＩｇ
Ｇで処置したマウス（４２日）で１０９１ｍｍ3であり、そして抗ＰＳＣＡ処置
マウス（４６日）で３９１ｍｍ3であった。ウシＩｇＧ処置群における大きな腫
瘍サイズに起因して、これらのマウスを、他の群のマウスよりも早く屠殺した。
さらに、腫瘍容量は、処置マウスの血清中のＰＳＡレベルに相関した。抗ＰＳＣ
Ａ抗体を受けたいくらかのマウスは、前出の実施例１に記載した研究において以
前に観察されたように、非常に小さな腫瘍を示すかまたは全く腫瘍増殖を示さず
、実施例１８−Ａに記載した研究と一貫して、この抗体反応混液調製物のいずれ
の投与も、明らかな毒性を付随しなかった。
【０３４７】 （Ｃ．単一の非結合体化ＰＳＣＡ ｍＡｂを用いるインビボ腫瘍阻害） （材料および方法：） 本明細書中に記載のモノクローナル抗体のいくつかを、以前に記載した腫瘍チ
ャレンジアッセイ（上記の実施例１８−Ａおよび１８−Ｂを参照のこと）を使用
して、その非結合体化（すなわち「裸の」）形態での、前立腺腫瘍異種移植片の
増殖を阻害するその能力について研究した。一般にこの研究は、アッセイした抗
体の各々について以下で示す結果の節に記載するようなわずかな改変を伴って、
上記のように行った。
【０３４８】 （Ｃ１：ＰＳＣＡ ｍＡｂ １Ｇ８） 抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体１Ｇ８は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体である。
１Ｇ８の抗腫瘍効果を、ＬＡＰＣ−９異種移植片およびコントロールとしてマウ
スＩｇＧを使用して評価した。図５４に示す結果は、１Ｇ８抗体でのマウスの処
置が、腫瘍増殖を阻害したことを実証する。詳細には、コントロール群について
の最終時点での平均腫瘍容量は、１Ｇ８抗体処置群の平均腫瘍容量が３３５ｍｍ 3 であることに対して８５４ｍｍ3であった。これらの結果は、１Ｇ８モノクロー
ナル抗体が、単独で使用される場合に前立腺腫瘍の増殖を阻害し得ることを示す
。前出に記載された研究を用いる場合、１Ｇ８ ｍＡｂで処置したこれらの動物
の処置には、明らかな毒性を付随しなかった。
【０３４９】 ＰＣ−３細胞を用いて作製された前立腺癌の増殖に対する１Ｇ８モノクローナ
ル抗体の効果もまた、決定した。ＰＣ−３細胞は、ＰＳＣＡを発現しない。図６
５に示されるように、１Ｇ８抗体は、ＰＳＣＡ発現ＬＡＰＣ−９異種移植片に対
するその効果とは著しく対照的に、ＰＣ−３異種移植片腫瘍の発達に対して効果
を有さなかった。これらの結果は、１Ｇ８抗体が、ＰＳＣＡ抗原を介して腫瘍の
細胞増殖を阻害することを明瞭に示す。
【０３５０】 （Ｃ２：ＰＳＣＡ ｍＡｂ ２Ａ２および２Ｈ９） 異なるアイソタイプの２つの抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体を、前立腺腫瘍増
殖のインビボ阻害について同時に評価した。抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ ２Ａ２（Ｉｇ
Ｇ２ａアイソタイプ）および２Ｈ９（ＩｇＧ１アイソタイプ）を、直前に記載し
た実施例１８−Ｃ１に記載するような前立腺腫瘍の阻害について試験した。図５
５に示すこの結果は、コントロール群に対して、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ処置群にお
ける腫瘍細胞増殖の著しい阻害を実証する。詳細には、最終時点での平均腫瘍容
量は、マウスＩｇＧで処置したマウス（４２日）について４８３ｍｍ3であり、
２Ａ２ ｍＡｂで処置したマウス（４２日）について４９ｍｍ3であり、そして
２Ｈ９ ｍＡｂで処置したマウス（４２日）について７２ｍｍ3であった。より
顕著には、腫瘍発生率は、２Ａ２処置群について２／７および２Ｈ９処置群につ
いて１／７であったのに対して、マウスＩｇＧコントロール群において６／６マ
ウスであった。２Ａ２処置群において、最初の腫瘍は２５日で現れ、そして第２
の腫瘍は４２日で現れた。２Ｈ９処置群において、１つの腫瘍の存在は２１日で
現れた。マウスＩｇＧコントロール群において、マウスの４／６が２１日で腫瘍
を発達した。上記のインビボ研究を用いる場合、２Ａ２または２Ｈ９ ｍＡｂで
のこれらの動物の処置は、明らかな毒性を付随しなかった。
【０３５１】 処置マウスの血清におけるＰＳＡレベルは、コントロールマウスよりも有意に
低く、そして腫瘍の容量に直接相関した（図５６）。６週目で、マウスＩｇＧコ
ントロール群における平均ＰＳＡ血清レベルは３５ｎｇ／ｍｌであり、２Ａ２群
では２ｎｇ／ｍｌであり、そして２Ｈ９群では８ｎｇ／ｍｌであった。
【０３５２】 この研究は、単一の「裸の」抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体が、抗腫瘍活性に
十分であるという結論をさらに支持する。さらに、これらのデータは、異なるＰ
ＳＣＡエピトープを認識するｍＡｂが有効であり、そして抗腫瘍効果は、単一の
ＩｇＧアイソタイプに依存しない（なぜなら、ＩｇＧ１（ＩＧ８、２Ｈ９）ｍＡ
ｂおよびＩｇＧ２ａ（２Ａ２）ｍＡｂの両方が、腫瘍増殖を阻害したからである
）ことを実証する。
【０３５３】 （Ｃ３：ＰＳＣＡ ｍＡｂは、特異的にＰＳＣＡを介して増殖阻害効果を及ぼ
す） ＰＳＣＡ ｍＡｂが、特異的にＰＳＣＡタンパク質を介して腫瘍増殖阻害を及
ぼすことを実証するために、１Ｇ８ ｍＡｂおよびＰＣ−３腫瘍異種移植片を用
いて腫瘍阻害研究を行った。ＰＣ−３細胞は、内因性ＰＳＣＡを発現しない。こ
の研究は、上記の実施例のＣ１節に記載されるように行った。図６５に示される
この結果は、ＰＳＣＡ ｍＡｂ １Ｇ８が、４０日の期間にわたって、マウスの
ＰＣ−３腫瘍の増殖に効果を有さないことを示す。比較のために、ＬＡＰＣ−９
前立腺腫瘍異種移植片（実施例Ｃ１，上記）に対する１Ｇ８の効果の並行研究と
一緒に、この結果を示す。
【０３５４】 （Ｃ４：ＰＳＣＡ ｍＡｂ ３Ｃ５は、確立したＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍の増
殖をインビボで阻害する） ＰＳＣＡ ｍＡｂが、確立した腫瘍の増殖に影響し得るか否かを決定するため
に、以下の研究を行った。手短に言うと、本質的に実施例Ｃ１およびＣ２に記載
されるように、ＳＣＩＤマウスの同齢集団に１０6のＬＡＰＣ−９細胞ＳＱを注
射した。腫瘍が約１００立方ミリメートルのサイズに達した後、マウスを２つの
群（マウスＩｇＧを受けたコントロール群およびＰＳＣＡ ｍＡｂ ３Ｃ５を受
けた処置群）に分けた。各マウスに、以下のプロトコルに従ってコントロールＩ
ｇＧまたは３Ｃ５ ｍＡｂを用いてＩＰ注射した：注射１回当たり１ｍｇ、最初
の２週間は１週当たり３回、続いて３週目は１週当たり２回。腫瘍の容量および
ＰＳＡ測定を、上記のようにして決定した。図５７に示すこの結果は、３Ｃ５
ｍＡｂが、確立したＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍の増殖をインビボ阻害することを示
す。処置群のマウス少なくとも数匹において、腫瘍の最初の前処理したサイズの
５０％までの腫瘍の後退を観察した。
【０３５５】 （実施例１９：） （ＰＳＣＡモノクローナル抗体を特徴付けるためのインビトロアッセイ） （１９−Ａ：抗体依存性細胞傷害性アッセイ） 抗ＰＳＣＡ ｍＡｂが、腫瘍細胞をＡＤＣＣに対して感作するか否かを決定す
るために、以下のアッセイを実施した。第１に、ＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣについて
、ＳＣＩＤマウス由来の脾臓細胞を、Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇら、１９９５，Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：２６２７−２６３４に記載されるように、インビトロで
５日間培養する。次いで、活性化細胞を、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂまたはコントロー
ルマウスＩｇＧのいずれかの存在下で、51Ｃｒ標識ＬＡＰＣ−９、ＬＮＣａＰ−
ＰＳＣＡ、またはＬＮＣａＰ標的細胞と共に４時間共存培養した。ＬＮＣａＰは
、全てのアッセイにおいてネガティブコントロールとして役立つ。なぜなら、こ
れはＰＳＣＡを発現しないからである。単一のｍＡｂを使用する場合、それぞれ
のマウスＩｇＧアイソタイプコントロールをまた、使用する。活性化脾臓細胞の
ＮＫ活性を、マウスＮＫ感受性標的ＹＡＣ−１とのインキュベーションによって
決定する。全ての場合において、死滅は、培地への51Ｃｒの放出によって決定す
る。自発的放出を、標識細胞のみのインキュベーションの後に決定し、そして全
放出を、５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００との標識細胞のインキュベーションに
よって決定する。特定の細胞の溶解のパーセントを、以下によって決定する： ％細胞溶解 ＝ 実験の51Ｃｒ放出−自発的51Ｃｒ放出 全51Ｃｒ放出−自発的51Ｃｒ放出 （１９−Ｂ：抗体依存性マクロファージ媒介細胞傷害性アッセイ） 抗ＰＳＣＡ ｍＡｂが、腫瘍細胞をＡＤＭＭＣに対して感作するか否かを決定
するために、以下のアッセイを実施する。腹膜マクロファージを、Ｌａｒｓｏｎ
ら、１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４２：８７７−８８２に記載される
ように、Ｂｒｅｗｅｒのチオグリコレート培地でのＳＣＩＤマウスの腹腔内注射
によって活性化する。４日後、細胞を腹腔内洗浄によって収集し、そして活性化
マクロファージのパーセントを、Ｍａｃ−１染色によって決定する。アッセイの
ために、活性化マクロファージを、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂまたはコントロールマウ
スＩｇＧのいずれかの存在下で、3Ｈ−チミジン標識ＬＡＰＣ−９、ＬＮＣａＰ
−ＰＳＣＡ、およびＬＮＣａＰ標的細胞と共に４８時間共存培養する。アッセイ
の最後に、上清をウェルから収集し、そして上記の51Ｃｒ放出について記載した
ように、放出された3Ｈ−チミジンの量によって死滅を決定する。
【０３５６】 （１９−Ｃ：補体媒介腫瘍細胞溶解アッセイ） 補体依存性溶解による腫瘍標的の破壊を、Ｈｕａｎｇら、１９９５，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．５５：６１０−６１６に記載される方法に従って実施し得る。例
えば、ＬＡＰＣ−９、ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡ、およびＬＮＣａＰ細胞を、51Ｃｒ
で標識し、次いで、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂまたはマウスＩｇＧコントロールのいず
れかと共に氷上で３０分間インキュベートする。洗浄して未結合の抗体を除去し
た後、この細胞を、ウサギ補体と共に３７℃で２時間インキュベートし、そして
細胞溶解を、上清への51Ｃｒ放出によって測定する。細胞溶解のパーセントを、
上記のように決定する。
【０３５７】 （１９−Ｄ：細胞増殖アッセイ） 細胞増殖に対する抗ＰＳＣＡ ｍＡｂの効果を、ＭＴＴアッセイによって決定
し得る。手短に言うと、ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡまたはＬＮＣａＰ細胞を、抗ＰＳ
ＣＡ ｍＡｂまたはコントロールとしてのマウスＩｇＧのいずれかの種々の量と
共に、７２時間培養する。インキュベーション期間の最後に、この細胞を洗浄し
、そしてＭＴＴの溶液中で４時間インキュベートする。増殖は、ＭＴＴ溶液の、
紫色へのデヒドロゲナーゼ媒介転換によって示され、そして５７０ｎｍの波長で
測定される。
【０３５８】 （１９−Ｅ：ソフトアガーにおけるコロニー形成についてのアッセイ） 抗ＰＳＣＡ ｍＡｂの存在下でのコロニー形成を、ソフトアガー中の細胞の増
殖によって測定し得る。要するに、１×１０4のＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡ細胞また
はＬＮＣａＰ細胞を、Ｎｏｂｅｌアガーを含む培地にプレートする。次いで、抗
ＰＳＣＡ ｍＡｂの一連の希釈物をプレートに２連で添加し、コロニー増殖に対
する効果を決定する。マウスＩｇＧを、コントロールとして使用する。巨視的コ
ロニーを、培養物中で１４〜２１日後に計数する。
【０３５９】 （実施例２０：） （ＰＳＣＡ捕捉ＥＬＩＳＡ） ＰＳＣＡ捕捉ＥＬＩＳＡを、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂでの処理前の血清中のＰＳＣ
Ａレベルを測定するために開発し、そしてこれは、治療投薬レジメンの決定にお
いて有用な情報を提供する。このアッセイはまた、治療に応答して患者をモニタ
リングする際に有用であり得る。
【０３６０】 このアッセイ形式の概略図を、図５０Ｂに示す。手短に言うと、アフィニティ
ー精製した抗ＰＳＣＡペプチドヒツジポリクローナル抗体（ＰＳＣＡタンパク質
のアミノ酸６７〜８１に対する）および抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体１Ｇ８を
、捕捉抗体として使用し、そしてマイクロタイターウェルにコートする。コーテ
ィング後、試験抗原の一連の希釈物とのインキュベーションを、標準曲線を作製
するために行う。患者の血清をウェルに添加し、そして室温でインキュベートす
る。インキュベーション後、結合していない抗体をＰＢＳで洗浄する。抗ＰＳＣ
Ａモノクローナル抗体２Ａ２、３Ｃ５および４Ａ１０（ＩｇＧ２ａアイソタイプ
）（これらは、ＰＳＣＡタンパク質上の異なるエピトープを認識する）を検出抗
体として使用し、そしてウェルに添加し、インキュベートし、そしてウェルを洗
浄して、結合していない抗体を除去する。次いで、この捕捉反応を、抗マウスＩ
ｇ２ａ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体の添加、その後の３，３’
５，５’テトラメチルベンジジンベース基質での発色によって可視化し、ＯＤ測
定を行う。
【０３６１】 標準化の概略図およびコントロール抗原を、図５０Ａに示す。手短に言うと、
ＰＳＣＡのアミノ酸１８〜９８をコードするＧＳＴ融合タンパク質を、未知サン
プルの定量化のための標準曲線を作製するために使用する。ＰＳＣＡの分泌組換
え哺乳動物発現形態を、このＥＬＩＳＡアッセイの質的制御のために使用する。
このタンパク質は、この組換えタンパク質の分泌を指向するためのＩｇリーダー
配列、ならびにアフィニティー精製のためのＭＹＣおよび６×ＨＩＳエピトープ
タグを含む。
【０３６２】 ＰＳＣＡを発現および分泌するよう操作された２９３Ｔ細胞から分泌された組
換えＰＳＣＡの定量化を、図５１に示す。
【０３６３】 （実施例２１：） （ＰＳＣＡ ｍＡｂ遺伝子の配列） マウスモノクローナル抗体１Ｇ８、４Ａ１０および２Ｈ９の重鎖可変領域をコ
ードする遺伝子のヌクレオチド配列を、Ｃｏｌｏｍａら、１９９２，Ｊ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５３：８９−１０４に記載の方法を使用して決定
した。ｍＡｂ １Ｇ８および４Ａ１０の重鎖可変領域配列決定のためのプライマ
ーは、以下のとおりであった：
【０３６４】
【化２】 ｍＡｂ ２Ｈ９の重鎖可変領域配列決定のためのプライマーは、以下のとおり
であった：
【０３６５】
【化３】 総ＲＮＡを、トリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｇｉｂｃｏ
−ＢＲＬ カタログ番号１５５９６）を使用して、１Ｇ８、２Ｈ９および４Ａ１
０ハイブリドーマ細胞から単離した。５μｇのＲＮＡに対する第１鎖合成反応物
を、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素反応（製造
業者のプロトコルに従って）およびＣＨ３’を使用して生成した。この３０μｌ
の第１鎖反応物のうちの２μｌを、可変領域を増幅するためのＰＣＲにおいて使
用した。
【０３６６】 第１鎖ｃＤＮＡを、重鎖の定常領域由来のプライマー（ＣＨ３’）を使用して
、ハイブリドーマＲＮＡから合成した。可変領域を、ＣＨ３’およびリーダー配
列に対して設計されたプライマー（ＨＬＥＡＤ．１およびＨＬＥＡＤ．２）を使
用して増幅した。得られたＰＣＲ産物を配列決定し、そして相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）を、Ｋａｂａｔの法則を使用して決定した。これらの配列を、図５８、５
９および６０に示す。これら３つのｍＡｂのＣＤＲのアミノ酸アライメントを、
図６１に示す。
【０３６７】 （実施例２２：） （ＰＳＣＡ ｍＡｂ結合親和性） ＰＳＣＡモノクローナル抗体１Ｇ８（上記）の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅTM装
置（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して決定した。この装置は、表面プ
ラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｗｅｌｆｏｒｄ Ｋ．１９９１，Ｏｐｔ．Ｑｕａｎｔ．
Ｅｌｅｃｔ．２３：１＋ＭｏｒｔｏｎおよびＭｙｓｚｋａ，１９９８，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２９５：２６８）を使用し、リアルタイ
ムで生体分子の相互作用をモニターする。製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によ
って概要された一般手順に基づいて、この抗体の速度論分析を、センサ表面上に
低密度（３０ＲＵ）で固定した組換えＰＳＣＡを使用して行った。組換えＰＳＣ
Ａは、以下のように生成した。一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞また
はＣ末端６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグを有するＰＳＣＡをコードするＣＭＶ駆動
発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を安
定に発現する２９３細胞を、精製のための分泌可溶性ＰＳＣＡタンパク質の供給
源として使用した。このＨＩＳタグ化ＰＳＣＡタンパク質を、標準的な技術を使
用して、ニッケルカラム上で精製した。会合速度および解離速度を、製造業者に
よって提供されたソフトウェアを使用して決定した。以下に作表した（表５）結
果は、１Ｇ８が１ナノモルのＫDを有することを示し、これはＰＳＣＡ抗原に対
する強い親和性を示す。
【０３６８】
【表５】 本発明は、本明細書中に開示される実施形態によって範囲を限定されず、これ
らの実施形態は、本発明の個々の局面の単一の例示として意図され、そして機能
的に等価な任意のものが、本発明の範囲内にある。本明細書中に記載されるもの
に加え、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変が、前述の記載および教
示から当業者に明らかであり、そして本発明の範囲内にあることが同様に意図さ
れる。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神から
逸脱することなく実施され得る。
【０３６９】 （実施例２３：） （免疫組織化学的分析） 本実施例は、上記の７つの抗ＰＳＣＡ ｍＡｂを用いた、種々のホルマリン固
定したパラフィン包理組織の免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析を記載する。
【０３７０】 （材料および方法） ７つの抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体の各々を、以下に対して試験した：（１
）ＰＳＣＡを過剰発現するＬＮＣａＰ細胞、ＬＮＣａＰ親細胞および２９３Ｔ細
胞からなる細胞ペレット；（２）ＬＡＰＣ９ＡＤ異種移植片；および（３）良性
前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺癌および正常前立腺組織。全ての組織染色を、Ｑ
ｕａｌＴｅｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｓａ
ｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）によって行った。組織ブロックを４ミクロンで
切片化し、そして正に荷電したＣａｐｉｌｌａｒｙ Ｇａｐ顕微鏡スライド（Ｖ
ｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａ
Ｚ）上にプレートした。キシレン中での脱ろう化、その後の一連のアルコールで
の水和後、組織切片を、抗体反応性を最適化するために、クエン酸ナトリウム（
１０ｍＭ、ｐＨ６．０）の存在下で２０分間スチーマー中で前処理した。
【０３７１】 ５分間の冷却後、スライドを、ＡＢＣペルオキシダーゼ技術を使用して免疫染
色した。手短に言うと、スライドを、ブロッキング血清（正常ヤギ）中で５分間
その後、２μｇ／ｍｌの抗ＰＳＣＡモノクローナル一次抗体または２μｇ／ｍｌ
のマウスＩｇＧ（ネガティブコントロールとして）中（２５分）、ビオチン化二
次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ中（２５分）およびペルオキシダーゼ酵素に結合体化
したアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌ
ｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）中（２５分）で、インキュベートした。これらのインキュ
ベーション工程の間、切片を緩衝液中でリンスした。ＤＡＢ−ジアミノベンジジ
ン色素原（ＱｕａｌＴｅｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌａｂｓ）を使用してこの反
応を発色させた（褐色沈殿物を生じる）。引き続いて、スライドをヘマトキシリ
ンで対比染色し、次いでカバーガラスをかけた。染色を、ＴｅｃｈＭａｔｅ １
０００自動染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）上、室温で行った。
【０３７２】 （結果） 図５２は、細胞ペレット、ＬＡＰＣ９ＡＤ異種移植片、ＢＰＨサンプルおよび
前立腺癌組織（左パネル）における、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体３Ｃ５につ
いてのＩＨＣ結果を示す。細胞ペレット混合物は、３つの細胞型を含み、その１
つのみ（ＬＮＣａＰ−ＰＳＣＡ細胞）が、抗ＰＳＣＡモノクローナルで染色され
ると予測される。予測されたように、３Ｃ５は、これらの細胞の約１／３を強く
染色した。この染色は、同じスライド上の陽性染色および陰性染色している細胞
型を都合よく示す。ＬＡＰＣ９ＡＤ異種移植片は、３Ｃ５抗体で非常に強く染色
される。ＢＰＨ組織の管における基底細胞および上皮細胞は、よく染色するが、
基底細胞が特に優性である。最後に、前立腺癌組織は、腫瘍性の管における強い
染色を示す。右側のパネルは、免疫前マウス血清からなるバックグラウンドコン
トロールを表す。評価したいかなるサンプルにおいても、バックグラウンド染色
は検出されなかった。
【０３７３】 （実施例２４：） 抗ＰＳＣＡ抗体処置後の確立されたＬＡＰＣ−９腫瘍増殖の阻害および長期の
生存。ホルモン抵抗性転移性前立腺癌を有する患者の骨腫瘍生検材料から、ＬＡ
ＰＣ−９異種移植片を生成した。
【０３７４】 以下の実施例は、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体である、１Ｇ８および３Ｃ５
が、ＳＣＩＤマウスにおいて確立された同所ＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍の増殖を阻
害し、有意にそれらの生存を延ばしたことを実証する。腫瘍の増殖を、血清ＰＳ
Ａのレベルを追跡することによってモニタリングした。
【０３７５】 （同所注入） ＬＡＰＣ−９腫瘍の単一の細胞懸濁液を、実施例１８−Ａに記載の方法に従っ
て調製した。細胞懸濁液を、１：１の希釈でＭａｔｒｉｇｅｌと混合した。細胞
懸濁液を、同所注入の前に氷上に置いた。同所注入を、ケタミン／キシラジンを
使用した麻酔下の雄性ＩｃＲ−ＳＣＩＤマウスに対して行った。麻酔されたマウ
スの下腹部を剪毛し、５〜８ｍｍの切開を、ペニスのちょうど上に作製し、腹壁
および筋肉を露出させた。切開を腹筋を貫いて作製し、膀胱および精嚢を露出さ
せ、次いで膀胱および精嚢を切開部を通して摘出し、背側の前立腺を露出させた
。ＬＡＰＣ−９細胞懸濁液を、５００μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用し
て、各背側の葉に注入した。各葉に、約５×１０5細胞に対応する、１０μｌの
細胞懸濁液を注入した。注入の後、両方の切開を直線（ｒｕｎｎｉｎｇ）縫合を
用いて閉じ、そしてマウスを回復のためにヒートランプの下に維持した。注入の
後、ＰＳＡの血清レベルをモニタリングした。マウスを、ＰＳＡの血清レベルに
依存して、１Ｇ８抗体または３Ｃ５抗体の異なるレジメンで処置した。抗体処置
の後、マウスを生存させ続けて、腫瘍の増殖の測度としてＰＳＡレベルを決定し
、そして各処置群におけるマウスの生存を決定した。
【０３７６】 （ＰＳＡの血清レベルのモニタリング：） 血清ＰＳＡのレベルを、腫瘍サイズを追跡するために使用した。マウスを、ほ
ぼ毎週基準で採血し、血清ＰＳＡのレベルをモニタリングした。血清ＰＳＡのレ
ベルを、市販のＰＳＡキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ，Ｓａｎ Ｃｌ
ｅｍｅｎｔｅ，ＣＡ）を使用して測定した。マウスを、血清ＰＳＡのレベルに基
づいて２つの処置群に分離した。例えば、これらの群としては、以下が挙げられ
る：低レベルのＰＳＡ（例えば、２〜３ｎｇ／ｍｌ；図６６Ａ）；および中程度
のレベルのＰＳＡ（例えば、６４〜７８ｎｇ／ｍｌ；図６６Ｂ）。血清ＰＳＡレ
ベルを、腫瘍が腹部にわたって目に見えるまでモニタリングした。
【０３７７】 血清ＰＳＡレベルを、腫瘍細胞の注入の日に対して、＋９、＋１５、＋２２、
＋３０、＋３７、＋４４、および＋５１日目にモニタリングした（図６６Ａ）。
同様に、血清ＰＳＡレベルを、＋１３、＋２１、＋２７、および＋３４日目に（
図６６Ｂ）、＋９、＋１６、＋２２、＋２９、および＋３６日目に（図６８Ａ）
、そして＋７、＋１４、＋２１、および＋２８日目に（図６８Ｂ）、モニタリン
グした。
【０３７８】 （１Ｇ８を用いた処置：） 同所性の腫瘍を保有するマウスを、上記の方法に従って確立した。（ｉ）低レ
ベルの血清ＰＳＡ（２〜３ｎｇ／ｍｌ）、または（ｉｉ）中程度のレベルの血清
ＰＳＡ（６４〜７８ｎｇ／ｍｌ）を示す２群の動物を、処置のために選択した。
【０３７９】 低レベルのＰＳＡ（例えば、２〜３ｎｇ／ｍｌ）を有するマウスを、１週間の
１週あたり３回の、２ｍｇの１Ｇ８抗体の腹腔内注入、それに続く、次の２週間
の１週あたり３回の、１ｍｇの１Ｇ８、それに続く、次の３週間の１週あたり１
回の、１ｍｇの１Ｇ８で処置した（図６６Ａにおいて矢印によって示されるよう
に）。
【０３８０】 中程度のレベルのＰＳＡ（例えば、６４〜７８ｎｇ／ｍｌ）を有するマウスを
、３週間連続で１週あたり３回の１ｍｇの１Ｇ８抗体の、腹腔内注入、それに続
く、翌週の１ｍｇの１Ｇ８の単回注入で処置した（図６６Ｂにおいて矢印によっ
て示されるように）。
【０３８１】 低レベルまたは中程度のレベルのＰＳＡを有するコントロールマウスを、約０
．５〜０．８ｍｌのリン酸緩衝溶液（Ｇｉｂｃｏ）で処置した（図６６Ａおよび
Ｂ）。
【０３８２】 （３Ｃ５を用いた処置：） 同様の処置を、３Ｃ５抗体を使用して、同所腫瘍を保持するマウスに対して行
った。第１の実験において、１ｍｇの３Ｃ５抗体を、３週間連続で１週あたり３
回、腹腔内に投与し、それに続いて１ｍｇの３Ｃ５を単回注入した（図６８Ａ）
。第２の実験において、２ｍｇの３Ｃ５を第１週に１週あたり３回投与し、それ
に続いて次の２週間に１週あたり３回の、１ｍｇを投与した（図６８Ｂ）。注入
を、図６８ＡおよびＢにおいて矢印で示される日に投与した。
【０３８３】 （結果−１Ｇ８を用いた処置は、腫瘍の増殖の阻害および生存の増大を生じる
） 腫瘍保有マウスの血清ＰＳＡレベルを、腫瘍の増殖を追跡するために使用した
。なぜなら、血清ＰＳＡレベルは、腫瘍サイズに非常に関連するからである。抗
ＰＳＣＡモノクローナル抗体である１Ｇ８で処置されたＬＡＰＣ−９ ＡＤ腫瘍
を保有するマウスは、血清ＰＳＡレベルの増加速度の減少を示した（図６６Ａお
よびＢ）。この結果は、１Ｇ８が、ＰＳＣＡを発現する腫瘍の増殖を阻害するこ
とを示す。
【０３８４】 図６６Ａにおいて、各データポイントは、ＰＢＳ（ｎ＝６）または１Ｇ８（ｎ
＝６）を受けたマウスについての平均ＰＳＡレベルを表す。マウスを、ＰＳＡ定
量のためにＸ軸に示される日に採血した。
【０３８５】 図６６Ｂに示されるように、マウスを、ＰＳＡの定量のためにＸ軸に示される
日に採血した。各データポイントは、ＰＢＳ（ｎ＝４）または１Ｇ８（ｎ＝５）
を受けたマウスの平均ＰＳＡレベルを表す。図６７において、ＰＢＳ処置群にお
けるマウスは４匹であり、そして１Ｇ８処置群におけるマウスは５匹である。
【０３８６】 さらに、１Ｇ８抗体で処置した、より低い血清ＰＳＡレベルを有するマウスは
、１Ｇ８抗体で処置した、より高い血清ＰＳＡレベルを有するマウスと比較して
、血清ＰＳＡのレベルの増加速度の減少を示した（例えば、図６６ＡおよびＢに
おいて
【０３８７】
【化４】 によって記載されるデータと比較して）。この結果は、１Ｇ８抗体が、本研究の
投与プロトコル下で、より小さな腫瘍身体負荷量が存在した場合に、腫瘍の増殖
を減少させるのにより有効であったことを示唆する。
【０３８８】 腫瘍保有マウスの生存に対する１Ｇ８処置の影響をまた、モニタリングした。
一般的に、ＰＢＳのみで処置されたマウスは、局所的な腫瘍の増殖および転移の
ために、注入後５〜６週間以内に死亡し始めた。対照的に、１Ｇ８抗体で処置さ
れたマウスは、長期の生存を示した。例えば、生存への影響は、低い血清ＰＳＡ
レベルを有するマウスにおいて、より劇的であり（図６７Ａ）、ここでＰＢＳ処
置マウスにおける中間生存時間は、５６．５日（４２〜７１日の範囲）であり、
そして、１Ｇ８処置マウスにおける中間生存時間は、８９日（７７〜１０１日の
範囲）であった。中程度の血清ＰＳＡレベルを有するマウスにおいて（図６７Ｂ
）、ＰＢＳ処置マウスにおける中間生存時間は、４０日（３２〜４８日の範囲）
であり、これに比較して、１Ｇ８処置マウスにおける中間生存時間は、７８．５
日（５２〜１０５日）であった。このことは、１Ｇ８処置マウスにおける３８．
５日の中間生存時間の増加を示唆する。
【０３８９】 腫瘍の増殖の阻害は、長期の生存に関連する。まとめると、これらの結果は、
１Ｇ８処置が、腫瘍の増殖を阻害し、そして同所腫瘍を保有するマウスの生存時
間を増加したことを実証する。従って、これらの結果は、１Ｇ８を用いた処置が
、腫瘍の増殖を阻害することによって生存時間を増加させたことを示唆する。
【０３９０】 １Ｇ８を用いた処置は、より小さな同所腫瘍に対する腫瘍の増殖を効果的に阻
害した。従って、１Ｇ８は、再発性の局所疾患（一次処置の後）および転移性腫
瘍の形成における、最小の残存性疾患のための効果的な治療処置を表し得る。
【０３９１】 ３Ｃ５抗体で処置されたマウスの結果は、１Ｇ８抗体で処置されたマウスから
得られたデータと同様である。抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体である３Ｃ５で処
置された、ＬＡＰＣ−９ ＡＤ腫瘍を保有するマウスは、血清ＰＳＡレベルの減
少を示した。この結果は、３Ｃ５が、ＰＳＣＡを発現する腫瘍の増殖を阻害する
ことを示す。
【０３９２】 ２つの別の実験を、３Ｃ５処置の効果を評価するために行った。３Ｃ５抗体で
処置されたマウスは、リン酸緩衝溶液で処置されたマウスに比べると、血清ＰＳ
Ａのレベルのより低い増加速度を示した（図６８ＡおよびＢ）。この結果は、３
Ｃ５抗体が、腫瘍の増殖を阻害したことを示唆する。
【０３９３】 図６８Ａにおいて、各データポイントは、ＰＢＳ（ｎ＝４）または３Ｃ５（ｎ
＝５）を受けたマウスについての平均ＰＳＡレベルを表す。図６８Ｂにおいて、
各データポイントは、ＰＢＳ（ｎ＝６）または３Ｃ５（ｎ＝６）を受けたマウス
についての平均ＰＳＡレベルを表す。
【０３９４】 ３Ｃ５抗体で処置されたマウスは、ＰＢＳで処置されたマウス（図６９Ｂ）と
比較して、長期の生存を示した（図６９Ａ）。第１の実験において、ＰＢＳ処置
マウスの中間生存時間は、５２日（４５〜５９日の範囲）であり、これに比較し
て、３Ｃ５処置群における中間生存時間は、９２日以上（５９〜＋１２５日の範
囲）（図６９Ａ）（１匹のマウスはまだ生存している）であった。第２の実験に
おいて、ＰＢＳ処置マウスにおける中間生存時間は、４３日（２９〜５７日の範
囲）であり（図６９Ｂ）、これに比較して、３Ｃ５処置マウスにおける中間生存
時間は、５７．５日（３３〜８２日の範囲）であった。
【０３９５】 腫瘍増殖の阻害は、長期の生存に関連した。まとめると、これらの結果は、３
Ｃ５処置が、腫瘍の増殖を阻害し、それによって同所腫瘍保有マウスの生存時間
を増加したことを実証した。従って、これらの結果は、３Ｃ５での処置が、腫瘍
の増殖を阻害することによって、生存時間を増加したことを示す。
【０３９６】 （実施例２５：） 単独またはドキソルビシンと組み合わされた抗ＰＳＣＡ抗体処置後の確立され
たＰＣ３−ＰＳＣＡ腫瘍の増殖の阻害および長期の生存。
【０３９７】 以下の実施例は、１Ｇ８（抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体）が、ＳＣＩＤマウ
スにおいて増殖する確立された皮下のＰＣ３−ＰＳＣＡ前立腺腫瘍（ＡＩ）の増
殖を阻害したことを実証する。さらに、１Ｇ８は、単独またはドキソルビシンと
組み合わされて投与される場合、前立腺腫瘍の増殖を阻害した。さらに、１Ｇ８
を用いた処置は、単独またはドキソルビシンと組合されて投与される場合に、こ
れらのマウスの生存を延ばす。１Ｇ８およびドキソルビシンを用いた処置は、腫
瘍の増殖および生存に対する相乗的な阻害効果を生じるようである。
【０３９８】 （ＰＳＣＡ発現ＰＣ３細胞） ＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞を、レトロウイルス遺伝子移入によって得た。簡潔には
、ＰＳＣＡ ｃＤＮＡを、レトロウイルスベクターｐＳＲ−α（Ｍｕｌｌｅｒら
、１９９１ Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：１７８５−１７９２）中
に挿入した。アンホトロピックレトロウイルスを、ＰＳＣＡ含有ｐＳＲ−αおよ
びアンホトロピックエンベロープタンパク質含有レトロウイルスヘルパープラス
ミドでの２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションによって生成した。引き続い
て、ＰＣ３細胞に、このＰＳＣＡ含有アンホトロピックレトロウイルスを感染さ
せ、そして感染後４８時間目に、ＰＣ３細胞を、ネオマイシン類似体Ｇ４１８を
含有する培地における増殖によって選択した。選択および増大の２〜３週間後、
ウェスタンブロットを実施して、ＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞がＰＳＣＡタンパク質を
発現することを確認した。ＰＳＣＡを含まない空のベクターを感染させた、親の
ＰＣ３またはＰＣ３細胞は、両方ともＰＳＣＡタンパク質発現について陰性であ
った。
【０３９９】 （皮下注射） ＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞を、注射前に、Ｔ−１５０フラスコ内においてＤＭＥＭ
＋１０％ＦＢＳ中で増殖させた。細胞を、対数期まで増殖させ、収集し、洗浄し
、カウントし、次いで、１：１の希釈度でマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）と混
合し、そして氷上で維持した。注射のために、雄性ＩｃＲ−ＳＣＩＤマウスを、
それらのフラスコ内で剪毛し、そして右側のフラスコにおいて、各マウスに、１
００μｌ容量中約１×１０6細胞の単回皮下注射を与えた。ＰＣ３−ＰＳＣＡ腫
瘍の増殖に次いで、増殖腫瘍のカリパス測定を行った。皮下注射後約９日目に腫
瘍が１００〜２００ｍｍ3のサイズに到達した場合に、処置のためにマウスを選
択した。腫瘍サイズを、注射後＋９日目、＋１５日目、＋２３日目、＋２９日目
、＋３６日目、および＋４３日目に測定した。
【０４００】 （ＰＢＳでの処置） コントロールマウスを、約０．５〜０．８ｍｌのリン酸緩衝化溶液（Ｇｉｂｃ
ｏ）で処置した（図６６ＡおよびＢ）。
【０４０１】 （１Ｇ８での処置） １Ｇ８で処置されたマウスは、連続３週間にわたって１週間あたり３回、１ｍ
ｇの１Ｇ８を投与された。
【０４０２】 （ドキソルビシンでの処置） ドキソルビシンの最大耐量を決定するために、ＬＤ50実験を実施した。ドキソ
ルビシン（Ｓｉｇｍａ）を、滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。ドキソルビシンを、以
下の用量：５０μｇ、２５μｇ、１２．５μｇ、および６．７５μｇで、腹腔内
注射によって投与した。最高用量である５０μｇでは、すべてのマウスが２週間
以内に死滅した。より低い用量範囲では、マウスは、４週間より長く生存した。
最大耐量は２５μｇであった。
【０４０３】 ドキソルビシンのみで処置されたマウスは、連続３週間にわたって１週間あた
り１回、２５μｇを投与された。
【０４０４】 （１Ｇ８およびドキソルビシンでの処置） １Ｇ８およびドキソルビシンで処置されたマウスは、連続３週間にわたって１
週間あたり３回、１ｍｇの１Ｇ８を投与され（図７０；１Ｇ８＝矢印）、そして
連続３週間にわたって１週間あたり１回、２５μｇのドキソルビシンを投与され
た（図７０；ドキソルビシン＝（ ））。
【０４０５】 （結果−１Ｇ８単独での処置またはドキソルビシンとの組み合わせにおける１
Ｇ８での処置は、腫瘍増殖の阻害を生じる） 抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体、１Ｇ８単独、またはドキソルビシンとの組み
合わせにおける１Ｇ８で処置された、ＰＣ３−ＰＳＣＡ腫瘍保有マウスは、リン
酸緩衝化溶液またはドキソルビシン単独で処置されたマウスと比較して、腫瘍増
殖の減少を示した（図７０）。これらの結果は、１Ｇ８が、ＰＳＣＡを発現する
腫瘍の増殖を阻害することを示す。これらの結果はまた、１Ｇ８とドキソルビシ
ンとの組み合わせが、相乗作用的に、腫瘍増殖を阻害するように作用することを
示唆する。
【０４０６】 各データポイントは、ＰＢＳ（ｎ＝５）、ドキソルビシン（ｎ＝６）、１Ｇ８
（ｎ＝６）、または１Ｇ８＋ドキソルビシン（ｎ＝６）を受容したマウスの平均
腫瘍体積を示す。
【０４０７】 ドキソルビシンで処置されたマウスは、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して
、わずかにより低い腫瘍増殖率を示した（例えば、４３日目に４％の増殖阻害）
。対照的に、１Ｇ８抗体単独で処置されたマウスは、ＰＢＳで処置されたマウス
と比較して、腫瘍増殖率において、より大きな減少を示した（例えば、４３日目
に２０％の増殖阻害）。１Ｇ８およびドキソルビシンの組み合わせで処置された
マウスは、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して、腫瘍増殖率において、わずか
により大きな減少を示した（例えば、４３日目に３６％の増殖阻害）。
【０４０８】 ＰＣ３−ＰＳＣＡ異種移植片を用いるこの皮下モデルにおいて、１Ｇ８単独で
の処置は、確立されたアンドロゲン非依存性腫瘍（例えば、ＰＣ３細胞は、ホル
モン難治性である）における腫瘍増殖を効率的に阻害した。さらに、１Ｇ８とド
キソルビシンとの組合せは、腫瘍増殖阻害効果の増大を示した。従って、１Ｇ８
とドキソルビシンとの組合せでの処置は、ホルモン除去療法（ｈｏｒｍｏｎｅ
ａｂｌａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）に失敗した、転移性疾患を有する前立腺癌
患者に対する有効な治療的処置を示す。
【０４０９】 （実施例２６） （抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体は循環し、そしてＰＳＣＡ発現腫瘍を標的化
する） １つの研究では、上記の実施例１８ Ｃ４に記載の確立された皮下ＬＡＰＣ−
９ ＡＤ腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスを、コントロールマウスＩｇＧまたは記
載のような３Ｃ５抗ＰＳＣＡ ｍＡｂのいずれかで処置した。３４日目（最後の
抗体処置の６日後）に、マウスを屠殺し、そして腫瘍を外植した。異なる研究で
は、腫瘍保有ＳＣＩＤマウスを、コントロールマウスＩｇＧまたは１Ｇ８で処置
した。両方の研究からの腫瘍サンプルにおける抗体の存在を、ウェスタンブロッ
ト分析または免疫組織化学（ＩＨＣ）のいずれかによって検出した。
【０４１０】 （免疫組織化学） 外植した腫瘍をホルマリン中で固定し、そして免疫組織化学分析のためにパラ
フィン中に包埋した（ＱｕａｌＴｅｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌａｂｓ、Ｓａｎ
ｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡによって実施された）。このパラフィンブロックを
スライスし、このスライスをスライド上に固定し、そしてこのスライドを、ビオ
チン化ヤギ抗マウスＩｇＧ、次いでペルオキシダーゼ酵素に結合体化されたアビ
ジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａ
ｍｅ、ＣＡ）で探索した。ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）色素原を使用して、こ
の反応（これは、褐色沈殿を生じる）を現像した。引き続いて、スライドを、ヘ
マトキシリンで対比染色し、次いで、カバーガラスをかけた。染色を、室温でＴ
ｅｃｈＭａｔｅ １０００自動化染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）において実施した（図７１）
。
【０４１１】 （結果−免疫組織化学） 図７１は、３Ｃ５抗体が、コントロールＩｇＧ処置マウスではなく、３Ｃ５処
置マウス由来のＬＡＰＣ−９ ＡＤ腫瘍に局在化したことを示す。さらに、抗体
は、腫瘍全体を通して検出され得た。
【０４１２】 （ウェスタンブロッティング） ＩｇＧ処置群および３Ｃ５処置群における３匹のマウス（例えば、上記実施例
１８ Ｃ４に記載のようなマウス）から外植された腫瘍を、沸騰したＳＤＳサン
プル緩衝液中に溶解した。細胞溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気
泳動し、ニトロセルロースフィルターに転写し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗
体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で探索
し、そして増強された化学発光によって可視化した。マウスＩｇＧコントロール
抗体および３Ｃ５もまた、コントロールとしてゲルにおいて泳動した（図７２）
。
【０４１３】 同様の実験において、ＬＡＰＣ−９ ＡＤ皮下腫瘍保有マウスを、コントロー
ルマウスＩｇＧまたは１Ｇ８抗ＰＳＣＡ ｍＡｂのいずれかで処置した。３０日
目（最後の抗体処置の７日後）に、マウスを屠殺し、そして腫瘍を外植した。ウ
ェスタンブロット分析を、各群の３匹のマウスから外植された腫瘍において実施
した。この外植された腫瘍を、沸騰したＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解した。細
胞溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気泳動し、ニトロセルロースに
転写し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で探索し、そして増強された化学発光によって
可視化した。マウスＩｇＧコントロール抗体および１Ｇ８もまた、コントロール
としてゲルにおいて泳動した（図７３）。
【０４１４】 （結果−ウェスタンブロッティング） 図７２は、ＩｇＧの重鎖および軽鎖が、マウスＩｇＧコントロール処置マウス
においてではなく、３Ｃ５処置マウス由来の腫瘍溶解産物において容易に検出さ
れ得たことを実証する。
【０４１５】 図７３は、ＩｇＧの重鎖および軽鎖が、マウスＩｇＧコントロール処置マウス
においてではなく、１Ｇ８処置マウス由来の腫瘍溶解産物において容易に検出さ
れ得たことを実証する。
【０４１６】 これらの結果は、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ（例えば、３Ｃ５および１Ｇ８）が、腫
瘍保有マウスへの投与後に、循環し得、そしてＰＳＣＡ発現腫瘍を標的化し得る
ことを実証する。さらに、抗体の局在性は特異的であった。なぜなら、ＰＳＣＡ
を認識しないコントロールマウスＩｇＧには、腫瘍が存在しないか、または抗Ｐ
ＳＣＡ処置マウス由来の腫瘍と比較して非常に低いレベルで存在するかのいずれ
かであるからである。これらの結果は、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂが、癌患者において
、身体を通して循環し、そして原発性および転移性のＰＳＣＡ発現腫瘍に局在化
する能力を有することを示唆する。さらに、結合体化された抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ
は、局所的に再発しかつ転移性の疾患に対して、ＰＳＡＣ発現腫瘍を局所で効率
的に破壊し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ヒトＰＳＣＡをコードするｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ名称２０９６１２）の
ヌクレオチド配列（Ａ）および翻訳されたアミノ酸配列（Ｂ）である。
【図２】 図２は、マウスＰＳＣＡホモログをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列で
ある。
【図３】 図３は、ヒトＰＳＣＡ、マウスＰＳＣＡおよびヒト幹細胞抗原−２（ｈＳＣＡ
−２）のアミノ酸配列のアラインメントである。影の領域は、保存されたアミノ
酸を強調する。保存されたシステインを太字で示す。ＰＳＣＡにおける４つの予
測されたＮ−グリコシル化部位を星印で示す。タンパク質の最初および最後の下
線のアミノ酸は、それぞれ、Ｎ末端の疎水性シグナル配列およびＣ末端ＧＰＩ係
留配列を示す。
【図４】 図４は、ヒトＰＳＣＡの疎水性プロットである。
【図５】 図５は、ヒトＰＳＣＡのＣｈｏｕ−Ｆａｓｓｍａｎ分析である。
【図６】 図６は、モノクローナル抗体１Ｇ８が、ＬＡＰＣ９（ＰＳＣＡ陽性コントロー
ル）および膀胱（Ｒｏｂ）と称される移行上皮癌（膀胱癌）に結合することを示
すウェスタンブロットである。
【図７】 図７は、正常組織および癌組織におけるＰＳＣＡ ｍＲＮＡの制限された発現
である。Ａ：前立腺、胎盤、および扁桃で高度な発現を示す正常ヒト組織におけ
るＰＳＣＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。示された組織由来の１ｎｇの逆転写された
第１鎖ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を、ＰＳＣＡ
遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。示されたデータは、３０サイクルの
増殖からである。Ｂ：前立腺癌異種移植片および正常組織における高いレベルを
実証する、ＰＳＣＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。示された組織由来の逆転写された
ｃＤＮＡの５ｎｇがＰＳＣＡ遺伝子特異的プライマーを用いて増幅された。β−
アクチン遺伝子特異的プライマーを用いた増幅は、種々のサンプルの第１鎖ｃＤ
ＮＡの規準化を示す。示されたデータは、２５サイクルの増幅からである。ＡＤ
、アンドロゲン依存性；ＡＩ、アンドロゲン非依存性；ＩＴ、脛骨内異種移植片
；Ｃ．Ｌ．、細胞株。
【図８】 図８は、ヒトＰＳＣＡ、マウスＰＳＣＡ、およびヒトＴｈｙ−１／Ｌｙ−６遺
伝子構造の模式図である。
【図９Ａ】 図９Ａは、ＰＳＣＡ ＲＮＡの発現のノーザンブロット分析である。Ａ：正常
の前立腺およびＬＡＰＣ−４アンドロゲン依存性（ＡＤ）前立腺癌異種移植片お
よびＬＡＰＣ−４アンドロゲン非依存性（ＡＩ）前立腺癌異種移植片由来の総Ｒ
ＮＡを、ＰＳＣＡ特異的プローブまたはＰＳＡ特異的プローブを使用して分析し
た。等しいＲＮＡローディングおよびＲＮＡ統合性を、１８Ｓ ＲＮＡおよび２
８Ｓ ＲＮＡのエチジウム染色により別々に示した。
【図９Ｂ】 図９Ｂは、ＰＳＣＡ ＲＮＡの発現のノーザンブロット分析である。Ｂ：ＰＳ
ＣＡ ＲＮＡのヒトの複数の組織のノーザンブロット分析。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）よりフィルターを得た。そしてこのフィルターは、
それぞれのレーンに２μｇのポリＡ ＲＮＡを含む。
【図１０−１】 図１０−１は、前立腺癌異種移植片および腫瘍細胞株におけるＰＳＣＡ、ＰＳ
ＭＡおよびＰＳＡのＲＮＡの発現のノーザンブロット比較である。ＰＳＣＡおよ
びＰＳＭＡは、高いレベルの前立腺癌特異的な遺伝子発現を示す。示された組織
由来の１０μｇの総ＲＮＡが、アガロース／ホルムアルデヒドゲルにおいてサイ
ズ分画され、ニトロセルロースに移され、そして続いてＰＳＣＡ、ＰＳＭＡおよ
びＰＳＡのｃＤＮＡフラグメントを表す32Ｐで標識されたプローブと順次ハイブ
リダイズされた。膜の４時間および７２時間のオートラジオグラフィーの露出、
およびサンプルの等しいローディングを示す臭化エチジウムゲルを示す。ＢＰＨ
、良性前立腺過形成；ＡＤ、アンドロゲン依存性；ＡＩ、アンドロゲン非依存性
；ＩＴ、脛骨内異種移植片；Ｃ．Ｌ．細胞株。
【図１０−２】 図１０−２は、前立腺癌異種移植片および腫瘍細胞株におけるＰＳＣＡ、ＰＳ
ＭＡおよびＰＳＡのＲＮＡの発現のノーザンブロット比較である。ＰＳＣＡおよ
びＰＳＭＡは、高いレベルの前立腺癌特異的な遺伝子発現を示す。示された組織
由来の１０μｇの総ＲＮＡが、アガロース／ホルムアルデヒドゲルにおいてサイ
ズ分画され、ニトロセルロースに移され、そして続いてＰＳＣＡ、ＰＳＭＡおよ
びＰＳＡのｃＤＮＡフラグメントを表す32Ｐで標識されたプローブと順次ハイブ
リダイズされた。膜の４時間および７２時間のオートラジオグラフィーの露出、
およびサンプルの等しいローディングを示す臭化エチジウムゲルを示す。ＢＰＨ
、良性前立腺過形成；ＡＤ、アンドロゲン依存性；ＡＩ、アンドロゲン非依存性
；ＩＴ、脛骨内異種移植片；Ｃ．Ｌ．細胞株。
【図１０−３】 図１０−３は、前立腺癌異種移植片および腫瘍細胞株におけるＰＳＣＡ、ＰＳ
ＭＡおよびＰＳＡのＲＮＡの発現のノーザンブロット比較である。ＰＳＣＡおよ
びＰＳＭＡは、高いレベルの前立腺癌特異的な遺伝子発現を示す。示された組織
由来の１０μｇの総ＲＮＡが、アガロース／ホルムアルデヒドゲルにおいてサイ
ズ分画され、ニトロセルロースに移され、そして続いてＰＳＣＡ、ＰＳＭＡおよ
びＰＳＡのｃＤＮＡフラグメントを表す32Ｐで標識されたプローブと順次ハイブ
リダイズされた。膜の４時間および７２時間のオートラジオグラフィーの露出、
およびサンプルの等しいローディングを示す臭化エチジウムゲルを示す。ＢＰＨ
、良性前立腺過形成；ＡＤ、アンドロゲン依存性；ＡＩ、アンドロゲン非依存性
；ＩＴ、脛骨内異種移植片；Ｃ．Ｌ．細胞株。
【図１１】 図１１は、正常前立腺標本および悪性前立腺標本におけるヒトＰＳＣＡ ＲＮ
Ａに対するアンチセンスリボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーション
である。Ａ：ＰＳＣＡ ＲＮＡは、基底細胞上皮内の基底細胞の部分集合により
発現される（黒矢印）が、前立腺管の内側を覆う最後まで分化した分泌細胞によ
り発現されない（拡大率４００×）。Ｂ：ＰＳＣＡ ＲＮＡは、高い程度の前立
腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）により強く発現され（黒矢印）、侵襲性前立腺癌腺によ
り強く発現される（黄矢印）が、正常の上皮においては、拡大率４０倍で検出可
能でない（緑矢印）。Ｃ：高い程度の癌の場合におけるＰＳＣＡ ＲＮＡの強い
発現（拡大率２００×）。
【図１２Ａ】 図１２Ａは、ＰＳＣＡタンパク質の生化学的分析である。Ａ：ＰＳＣＡタンパ
ク質を、材料および方法に記載されたように、ＰＳＣＡ構築物を用いて一時的に
トランスフェクトされ、次いで、Ｎ−グリコシダーゼＦまたはＯ−グリコシダー
ゼのどちらかを用いて消化した２９３Ｔ細胞から免疫沈降した。
【図１２Ｂ】 図１２Ｂは、ＰＳＣＡタンパク質の生化学的分析である。Ｂ：ＰＳＣＡタンパ
ク質をトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞、ならびこれらの細胞の訓化培地か
ら免疫沈降した。細胞関連ＰＳＣＡは、１５％ポリアクリルアミドゲルにおいて
、分泌されたＰＳＣＡまたは脱落したＰＳＣＡより速く移動する。
【図１２Ｃ】 図１２Ｃは、ＰＳＣＡタンパク質の生化学的分析である。Ｃ：アフィニティー
精製されたポリクローナル抗ＰＳＣＡ抗体を使用して、偽トランスフェクトされ
た２９３Ｔ細胞、ＰＳＣＡをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞およびＬＡＰ
Ｃ−４前立腺癌異種移植片細胞のＦＡＣＳ分析。細胞は、表面の発現のみを検出
するために透過処理されなかった。ｙ軸は、相対的な細胞数を示し、そしてｘ軸
は、対数的なスケールにおける蛍光染色強度を示す。
【図１３】 図１３は、フィトヘマグルチニンで刺激した末梢血液リンパ球由来のヒト分裂
中期細胞に対するビオチン標識ＰＳＣＡプローブのインサイチュハイブリダイゼ
ーションである。第８染色体ホモログは、矢印で同定される；特異的標識が、８
ｑ２４．２に観察された。はめ込み図は、８ｑ２４．２での特異的な標識を例示
する２つの第８染色体ホモログの部分的な核型を示す（矢尻）。画像は、冷却式
電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラを連結したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕
微鏡を使用して得た。ＤＡＰＩ染色した染色体およびハイブリダイゼーションシ
グナルの別々の画像が、画像分析ソフトウェア（ＮＵ２００およびＩｍａｇｅ１
．５７）を使用して合わされた。
【図１４】 図１４は、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体１Ｇ８（緑）および３Ｅ６（赤）、
マウス抗ＰＳＣＡポリクローナル血清（青）、またはコントロールの２次抗体（
黒）を使用した、前立腺癌異種移植片（ＬＡＰＣ−９）、前立腺癌細胞株（ＬＡ
ＰＣ−４）および正常な前立腺上皮細胞（ＰｒｅＣ）についての細胞表面ＰＳＣ
Ａタンパク質発現のフローサイトメトリー分析である。詳細は、実施例５を参照
のこと。
【図１５】 図１５は、（ａ）７つの開示された抗体のそれぞれのエピトープ地図である。
（ｂ）抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体のエピトープマッピングを、ＧＳＴ−ＰＳ
ＣＡ融合タンパク質のウエスタンブロット分析により行った。
【図１６】 図１６は、ＰＳＣＡが、ＧＰＩ係留タンパク質であることを示す模式図である
。
【図１７】 図１７は、前立腺癌におけるＰＳＣＡおよびｃ−ｍｙｃの遺伝子コピー数のＦ
ＩＳＨ分析を示す写真である。
【図１８】 図１８は、ＦＩＴＣ標識された１Ｇ８抗体が、ＰＳＣＡでトランスフェクトさ
れたＬＮＣＡＰ細胞上のＰＳＣＡタンパク質に強く結合することを示す写真であ
る。
【図１９】 図１９は、ＦＩＴＣ標識された１Ｇ８抗体がＰｒｅＣ細胞に弱く結合すること
を示す写真である。
【図２０】 図２０は、正常な前立腺基底細胞におけるＰＳＣＡのインサイチュＲＮＡハイ
ブリダイゼーションを示す写真である。
【図２１】 図２１は、原発性前立腺癌におけるＰＳＣＡの免疫染色である。４人の患者由
来の代表的なパラフィン包埋切片は、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂを用いて染色された。
患者１由来の標本は、グリースングレード（Ｇｌｅａｓｏｎ ｇｒａｄｅ）４の
腫瘍（矢印）におけるＰＳＣＡタンパク質の過剰発現を示し、そしてＰＳＣＡ
ｍＡｂ １Ｇ８を使用して隣接する正常な腺（矢尻）におけるＰＳＣＡの検出不
可能な発現を示す。陽性染色の癌は、正常な腺を完全に包囲する。患者２由来の
標本は、グリースングレード３＋３／４の癌における異質な染色を示す。グリー
スンパターン３の腺（矢尻）は、より大きな癌と比較して弱く染色し、さらなる
有孔形態はグリースンパターン３／４の腺（矢印）を表す。患者３由来の標本は
、ｍＡｂ １Ｇ８を用いた弱く分化したグリースン５（矢印）の腫瘍によってＰ
ＳＣＡの強い発現を示す。患者４は、弱く分化した腫瘍（矢尻）の大部分におい
てＰＳＣＡが染色していないこと、および標本中で同定された有孔形態の病巣に
おいて極度に弱く染色していることを示している生検標本である。患者４由来の
一致した骨性転移は、図２８に示される。
【図２２】 図２２は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンに連結し
たビオチン化された１Ｇ８モノクローナル抗体により決定された場合の、前立腺
癌の骨性転移を示す骨サンプルの写真である。
【図２３】 図２３は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンに連結し
たビオチン化された１Ｇ８モノクローナル抗体により決定された場合の、前立腺
癌の骨性転移を示す骨サンプルの写真である。
【図２４】 図２４は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンに連結し
たビオチン化された３Ｅ６モノクローナル抗体により決定された場合の、前立腺
癌の骨性転移を示す骨サンプルの写真である。
【図２５】 図２５は、ＬＡＰＣ９および進行型膀胱癌の移行細胞癌におけるＰＳＣＡ Ｒ
ＮＡの増加したレベルを示すノーザンブロットである。
【図２６】 図２６は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンに連結し
たビオチン化された３Ｅ６モノクローナル抗体により決定された場合の初期段階
にある前立腺癌の組織の写真である。
【図２７】 図２７は、ヘマトキシリン染色された３Ｅ６モノクローナル抗体により決定さ
れた場合の前立腺癌の骨性転移を示す骨サンプルの写真である。
【図２８】 図２８は、骨性転移の前立腺癌におけるＰＳＣＡの免疫染色である。上のパネ
ルは、患者５由来の骨性病巣（ｂｏｎｙ ｌｅｓｉｏｎ）のヘマトキシリン染色
およびエオシン染色（左）ならびにＰＳＣＡ（右）染色を示す。癌の疑いがある
単一の病巣（矢印）は、Ｈ切片およびＥ切片において同定され、そして抗ＰＳＣ
Ａ ｍＡｂ １Ｇ８を用いて強烈に染色することによって確認された（矢印）。
下のパネルは、患者４由来の骨性病巣のＨ染色およびＥ染色（左）ならびにＰＳ
ＣＡ染色を示す。患者４由来の原発性病巣は、図２１に示される。Ｈ染色および
Ｅ染色ならびにＰＳＣＡ染色の両方は、前立腺癌（矢印）による拡散性の骨性併
発を示す。また、骨性転移におけるＰＳＣＡ免疫染色は均一かつ強烈である。
【図２９】 図２９は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンに連結し
たビオチン化された１Ｇ８モノクローナル抗体によって決定された場合の、前立
腺癌の初期段階にある組織の写真である。
【図３０】 図３０は、ヘマトキシリン染色により決定された場合の、１Ｇ８が、ＬＡＰＣ
９細胞に結合することを示す写真である。
【図３１】 図３１は、１Ｇ８が、ＰＳＣＡでトランスフェクトされたＬｎＣａＰ細胞に結
合することを示す写真である。
【図３２】 図３２は、１Ｇ８が、ＬｎＣａＰ細胞（ＰＳＣＡでトランスフェクトされてい
ない）に結合しないことを示す写真である。
【図３３】 図３３は、ｍＡｂ １Ｇ８、２Ｈ９、３Ｈ６、３Ｃ５、および４Ａ１０を使用
した非透過化処理したＬＡＰＣ−９ヒト前立腺癌細胞の細胞表面上のＰＳＣＡの
フローサイトメトリー認識である。染色は、無関係のアイソタイプコントロール
抗体と比較された。
【図３４】 図３４は、ＰＳＣＡを用いて一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞お
よびＰＳＣＡモノクローナル抗体を用いてイムノブロットされた２９３Ｔ細胞を
示す写真である。モノクローナル抗体２Ｈ９および３Ｅ６は、２９３Ｔ細胞にお
いて、脱グリコシル化されたＰＳＣＡに結合するが、グリコシル化されたＰＳＣ
Ａには結合しない。対照的に、モノクローナル抗体１Ｇ８、３Ｃ５および４Ａ１
０はグリコシル化されたＰＳＣＡを認識する。
【図３５】 図３５は、非透過化処理した前立腺癌細胞におけるＰＳＣＡの細胞表面発現を
示す免疫蛍光分析である。ＬＮＣａＰ細胞は、安定してＰＳＣＡでトランスフェ
クトされ、そしてｍＡｂ １Ｇ８、３Ｅ６、３Ｃ５および４Ａ１０を用いて染色
された。ネガティブコントロールは、無関係のアイソタイプ抗体を含み、そして
ＬＮＣａＰ細胞はコントロールベクターを用いてトランスフェクトされ、その全
ては、延長した曝露後でさえ、染色を示さなかった。
【図３６】 図３６は、ＬＡＰＣ９細胞に結合するモノクローナル抗体２Ｈ９を示す写真で
ある。
【図３７】 図３７は、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂの免疫学的反応性を示す写真である。（Ａ）ｍ
Ａｂ １Ｇ８、２Ｈ９、３Ｃ５、３Ｅ６および４Ａ１０を用いてＰＳＣＡで一過
性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞由来のＰＳＣＡの免疫沈降。コントロ
ールは、無関係のマウスＩｇＧ ｍＡｂであった。（Ｂ）５つの抗ＰＳＣＡ ｍ
Ａｂを使用したＰＳＣＡを用いて一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞
のイムノブロット分析。ｍＡｂ １Ｇ８、３Ｃ５および４Ａ１０は全て、ＰＳＣ
Ａの等分子形態を認識し、ここで、このアッセイにおいてｍＡｂ ２Ｈ９および
３Ｅ６は、２９３Ｔ−ＰＳＣＡ細胞におけるＰＳＣＡの脱グリコシル化された形
態をわずかに認識するのみである。
【図３８】 図３８は、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂを用いた正常な前立腺の免疫組織化学的染色で
ある。実施例は、ネガティブコントロールとして、無関係のアイソタイプ抗体を
用いて染色された正常腺（矢印）、ＰＳＣＡ ｍＡｂ ３Ｅ６およびｍＡｂ １
Ｇ８を含むことを示した。分泌細胞（矢尻）と比較した場合、ＰＳＣＡ ｍＡｂ
３Ｅ６は、優先的に基底細胞（矢印）を染色したが、一方、ｍＡｂ １Ｇ８は
、基底細胞（矢印）および分泌細胞（矢尻）の両方を等しく染色する。ＰＳＣＡ
ｍＡｂ ２Ｈ９を用いて染色された正常前立腺標本由来の萎縮性の単一層状腺
の強い染色もまた示される。
【図３９】 図３９は、正常な組織におけるＰＳＣＡタンパク質の発現である。（Ａ）パネ
ルａは、ｍＡｂ １Ｇ８を用いた膀胱の一過性の上皮の染色を示す。パネルｂは
、ｍＡｂ １Ｇ８を用いて染色した結腸神経内分泌細胞を示す。クロモグラニン
を用いた二重染色は、陽性細胞が、神経内分泌起源であることを明らかにした（
示さず）。パネルｃは、ｍＡｂ ３Ｅ６を用いた集合管（矢印）および細管の染
色を示す。パネルｄは、ｍＡｂ ３Ｅ６を用いた胎盤栄養膜の染色を示す。（Ｂ
）ＰＳＣＡ ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析。正常な前立腺、腎臓、膀胱
およびＬＡＰＣ−９前立腺癌異種移植片に由来する総ＲＮＡは、ＰＳＣＡ特異的
プローブを使用して分析された（上のパネル）。同膜は、負荷差異のコントロー
ルに対してアクチンを用いてプローブされた（下のパネル）。
【図４０】 図４０は、マウスＰＳＣＡ遺伝子の標的化である。（Ａ）パネルａは、ＰＳＣ
Ａ標的化ベクターを作製するためのストラテジーを示す模式図である。（Ｂ）パ
ネルｂは、野生型（＋／＋）ＥＳ細胞および異種接合型（＋／−）ＥＳ細胞の回
復を示す３’プローブを使用したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析の写真であ
る。
【図４１】 図４１は、上のパネルが、前立腺癌のトランスジェニックマウスのモデルを産
生するためのストラテジーの模式図である。下のパネルは、前立腺癌の既存のト
ランスジェニックマウスのモデルの一覧表である。
【図４２】 図４２は、トランスフェクションアッセイのためのレポーター遺伝子構築物を
示す模式図である。
【図４３】 図４３は、増加した遺伝子発現活性を有する、９ｋｂヒトＰＳＣＡ上流調節領
域の組織優勢発現（前立腺細胞および膀胱細胞）を示す棒グラフである。
【図４４】 図４４は、増加した遺伝子発現活性を有する、ＰＳＣＡ上流領域（すなわち、
９ｋｂ、６ｋｂ、３ｋｂおよび１ｋｂのＰＳＣＡ領域）中の前立腺優勢発現エレ
メントを同定する棒グラフである。
【図４５】 図４５は、検出可能なマーカーに作動可能に連結した９ｋｂまたは６ｋｂのヒ
トＰＣＳＡ上流領域のいずれかを含むトランスジェニックベクターの設計を示す
模式図である。
【図４６】 図４６は、９ｋｂ ＰＳＣＡ上流領域が、インビボで前立腺、膀胱および皮膚
におけるレポーター遺伝子の発現を駆動することを示す写真である。
【図４７】 図４７は、ヒトおよびマウスのＰＳＣＡ ＲＮＡの組織特異的発現パターンを
示す多組織ノーザンブロット分析の写真である。
【図４８】 図４８は、抗ＰＳＣＡモノクロナール抗体での処置によるＳＣＩＤマウスにお
けるＬＡＰＣ−９前立腺腫瘍増殖の完全な阻害である。上のパネルは、ＬＡＰＣ
−９が皮下注射され、マウスＩｇＧコントロールを用いて処置されたマウスを示
し、一方、下のパネルにおいて、マウスに、ＬＡＰＣ−９を皮下注射したが、抗
ＰＳＣＡ ｍＡｂカクテルを用いて処置した。各データ点は、実施例１８−Ａ（
前出）に記載された特定の時点における腫瘍の楕円体容量を示す。抗ＰＳＣＡ群
において、２０の任意の値は、線を書くために全てのデータ点について与えられ
たが、実際の腫瘍容量は、０であった（実施例１８−Ａ（前出））。
【図４９】 図４９は、実施例１８に記載されるインビボ腫瘍チャレンジ研究において利用
される抗ＰＳＣＡモノクロナール抗体の特徴である。（Ａ）アイソタイプおよび
エピトープマップ：ＰＳＣＡタンパク質のうちの、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂによって
認識される領域は、ＰＳＣＡの示されたアミノ酸をコードするＧＳＴ融合タンパ
ク質（５０ｎｇ／ウェル）を用いてＥＬＩＳＡ分析によって決定された。ハイブ
リドーマ上清とともにウェルをインキュベートした後、抗マウスＨＲＰ結合体抗
体が添加され、そして反応性が、３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン塩
基（ＴＭＢ）基質の添加によって決定された。光学密度（４５０ｎｍ）は、二連
の決定の平均である。（Ｂ）ウエスタン分析によって決定されたエピトープマッ
プ：５０ｎｇの示されたＧＳＴ−ＰＳＣＡ融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分離され、そしてニトロセルロースに転写された。ウエスタン分析は、
ハイブリドーマ上清、続いて抗マウスＨＲＰ二次Ａｂを用いてブロットをインキ
ュベーションして、そして増強された化学発光によって可視化することにより行
われた。
【図５０】 図５０は、ＰＳＣＡ捕獲ＥＬＩＳＡの概略図である。（Ａ）標準化抗原および
コントロール抗原：ＰＳＣＡタンパク質のアミノ酸１８〜９８をコードするＧＳ
Ｔ融合タンパク質が、未知サンプルの定量のための標準曲線を作成するために使
用される。ＥＬＩＳＡにおいて使用される抗ＰＳＣＡモノクロナール抗体および
抗ＰＳＣＡポリクロナール抗体のおおよそのエピトープ結合領域もまた示される
。ＰＳＣＡの分泌された組換え哺乳動物発現形態が、ＥＬＩＳＡアッセイの品質
制御のために使用される。このタンパク質は、組換えタンパク質の分泌を指向す
るＩｇリーダー配列ならびにアフィニティー精製のためのＭＹＣエピトープタグ
および６×Ｈｉｓエピトープタグを含む。（Ｂ）ＥＬＩＳＡ形式の図。
【図５１】 図５１は、組換え分泌ＰＳＣＡタンパク質の定量である。（Ａ）ＰＳＣＡ捕獲
ＥＬＩＳＡ標準曲線。（Ｂ）哺乳動物細胞によって分泌されたＰＳＣＡタンパク
質の定量。空のベクターまたは組換え分泌ＰＳＣＡ（ｓｅｃＰＳＣＡ）をコード
するベクターを用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞由来の２日間馴化組
織培養物上清を、ＰＢＳまたは正常ヒト血清（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ）のいずれかの等量と混合し、そしてＰＳＣＡタンパク質の存在について分析
した。データは、二連の決定の平均±範囲である。ＮＤは、検出不可能である。
【図５２】 図５２は、抗ＰＳＣＡモノクロナール抗体３Ｃ５を用いる細胞ペレット、ＬＡ
ＰＣ９ＡＤ異種移植片、ＢＰＨサンプル、および前立腺癌組織の免疫組織化学的
分析である。
【図５３】 図５３は、抗ＰＳＣＡモノクロナール抗体によるＬＡＰＣ−９腫瘍増殖の阻害
である。上のパネルは、１×１０6 ＬＡＰＣ−９を皮下注射し、そしてマウス
ＩｇＧコントロールを用いて処置したマウス（ｎ＝１０）を示す。中のパネルは
、ＬＡＰＣ−９を皮下注射し、そして抗ＰＳＣＡ ｍＡｂカクテルを用いて処置
したマウス（ｎ＝１０）を示す。下のパネルは、ＬＡＰＣ−９を皮下注射し、そ
してウシＩｇＧを用いて処置したマウス（ｎ＝５）を示す。各データ点は、実施
例１８−Ｂに記載される特定の時点における腫瘍の楕円体容量を示す。
【図５４】 図５４は、抗ＰＳＣＡモノクロナール抗体１Ｇ８によるＬＡＰＣ−９腫瘍増殖
の阻害である。上のパネルは、１×１０6 ＬＡＰＣ−９を皮下注射し、そして
マウスＩｇＧコントロールを用いて処置したマウス（ｎ＝６）を示し、一方、下
のパネルにおいて、マウスは、ＬＡＰＣ−９を皮下注射したが、抗ＰＳＣＡ ｍ
Ａｂ １Ｇ８を用いて処置した（ｎ＝７）。各データ点は、特定の時点における
腫瘍の楕円体容量を示す。
【図５５】 図５５は、抗ＰＳＣＡモノクローナル抗体２Ａ２および２Ｈ９によるＬＡＰＣ
−９腫瘍増殖の阻害である。上のパネルは、１×１０6ＬＡＰＣ−９を皮下に注
射され、そしてマウスＩｇＧコントロール（ｎ＝６）または２Ａ２ ｍＡｂ（ｎ
＝７）のいずれかで処置されたマウスを表す。下のパネルは、ＬＡＰＣ−９を皮
下に注射され、そして同じマウスＩｇＧコントロール（ｎ＝６）または２Ｈ９
ｍＡｂ（ｎ＝７）で処置されたマウスを表す。全てのデータ点は、特定の時点に
おける腫瘍の平均楕円体体積（ｍｍ3）を表す。エラーバーは、平均値の標準誤
差（ＳＥＭ）を表す。
【図５６】 図５６は、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ ２Ａ２およびｍＡｂ ２Ｈ９で処置された後
のＬＡＰＣ−９腫瘍注射マウスにおける循環ＰＳＡレベルである。上のパネルは
、１×１０6ＬＡＰＣ−９を皮下に注射され、そしてマウスＩｇＧコントロール
（ｎ＝６）または２Ａ２ ｍＡｂ（ｎ＝７）のいずれかで処置されたマウスを表
す。下のパネルは、ＬＡＰＣ−９を皮下に注射され、そして同じマウスＩｇＧコ
ントロール（ｎ＝６）または２Ｈ９ ｍＡｂ（ｎ＝７）のいずれかで処置された
マウスを表す。各々のデータ点は、週毎の時点におけるマウスの血清から決定さ
れた平均ＰＳＡレベルを表す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表
す。
【図５７】 図５７は、確立されたＬＡＰＣ−９前立腺癌異種移植片のＰＳＣＡモノクロー
ナル抗体３Ｃ５による阻害である。詳細については実施例１８−Ｃ４を参照のこ
と。
【図５８】 図５８は、ＰＳＣＡモノクローナル抗体１Ｇ８の重鎖可変ドメイン領域のアミ
ノ酸配列である。ＣＤＲは、ラベルされそして下線を付されている。
【図５９】 図５９は、ＰＳＣＡモノクローナル抗体４Ａ１０の重鎖可変ドメイン領域のア
ミノ酸配列である。ＣＤＲは、ラベルされそして下線を付されている。
【図６０】 図６０は、ＰＳＣＡモノクローナル抗体２Ｈ９の重鎖可変ドメイン領域のアミ
ノ酸配列である。ＣＤＲは、ラベルされそして下線を付されている。
【図６１】 図６１は、ＰＳＣＡ ｍＡｂ １Ｇ８、ＰＳＣＡ ｍＡｂ ４Ａ１０およびＰ
ＳＣＡ ｍＡｂ ２Ｈ９のＣＤＲのアミノ酸配列整列である。
【図６２】 図６２は、正常な膀胱および種々の膀胱癌組織におけるＰＳＣＡタンパク質発
現を示す、ＰＳＣＡ ｍＡｂ １Ｇ８を用いたパラフィン包埋サンプルの免疫組
織化学的染色を使用した写真である。
【図６３】 図６３は、いくつかの膵臓癌細胞株におけるＰＳＣＡ発現のノーザンブロット
分析である。正常な前立腺およびいくつかの前立腺癌異種移植片におけるＰＳＣ
Ａ発現のノーザンブロット分析は、比較のために並べて示される。全てのサンプ
ル間のＲＮＡレベルを、正規化した。
【図６４】 図６４は、前立腺癌細胞株および膵臓癌細胞株におけるＰＳＣＡタンパク質発
現の、ＰＳＣＡ ｍａｂ １Ｇ８を使用するウエスタンブロット分析である。
【図６５】 図６５は、ＰＳＣＡ ｍＡｂが、ＰＳＣＡタンパク質による増殖阻害効果を発
揮する。ＬＡＰＣ−９およびＰＣ−３前立腺腫瘍に対するＰＳＣＡ ｍＡｂ １
Ｇ８の増殖阻害効果が比較される。ＰＣ−３腫瘍（これはＰＳＣＡ抗原を発現し
ない）に対しては全く効果が示さないが、ＬＡＰＣ−９腫瘍（これはＰＳＣＡ抗
原を発現する）における有意な増殖阻害が示される。詳細については、実施例１
８−Ｃ１、１８−Ｃ３を参照のこと。
【図６６】 図６６は、確立されたＬＡＰＣ−９（ＡＤ）同所腫瘍の、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ
１Ｇ８による増殖阻害である。（Ａ）低レベルの血清ＰＳＡを有するマウス。
２ｍｇの１Ｇ８をこれらのマウスに１０日目、１３日目、および１５日目に投与
し、次いで、矢印でしめされるように、１ｍｇを１７、２０、２２、２５、２７
、２９、３４、４１、および４９日目に投与した。（Ｂ）中程度のレベルの血清
ＰＳＡを有するマウス。１ｍｇの１Ｇ８を、矢印で示されるように、１２、１３
、１４、１９、２０、２２、２５、２７、２９、および３３日目に投与した。
【図６７】 図６７は、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ １Ｇ８での処置が、確立されたＬＡＰＣ−９
（ＡＤ）同所腫瘍を保有するマウスの生存率を増加する。（Ａ）図６６Ａにおけ
るマウス（１Ｇ８で処置された）は、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して生存
率の増加を示した。（Ｂ）図６６Ｂのマウス（１Ｇ８で処置された）は、ＰＢＳ
で処置されたマウスと比較して増加した生存率を示した。
【図６８】 図６８は、確立されたＬＡＰＣ−９ ＡＤ同所腫瘍の、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ
３Ｃ５による増殖阻害である。（Ａ）１ｍｇの３Ｃ５を、矢印で示されるように
、６、８、１０、１３、１５、１７、２０、２２、２４、および２９日目に腫瘍
保有マウスに投与した。これらのマウスを、ＰＳＡ測定のためにＸ軸上に示され
る日に採血した。（Ｂ）２ｍｇの３Ｃ５を腫瘍保有マウスに、９、１２、および
１５日目に投与し、次いで矢印で示されるように、１８、２０、２２、２５、２
７および２９日目に１ｍｇを投与した。これらのマウスをＰＳＡ測定のためにＸ
軸上に示される日に採血した。
【図６９】 図６９は、抗ＰＳＣＡ ｍＡｂ ３Ｃ５での処置が、ＬＡＰＣ−９ ＡＤ同所
腫瘍を保有するマウスの生存率を増加させる。（Ａ）図６８Ａにおけるマウス（
３Ｃ５で処置された）は、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して、生存率の増加
を示した。ＰＢＳ処置した群には４匹のマウスが存在し、そして３Ｃ５処置した
群には５匹のマウスが存在する。（Ｂ）図６８Ｂのマウス（３Ｃ５で処置された
）は、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して生存率の増加を示した。ＰＢＳ処置
した群および３Ｃ５処置した群の両方に６匹のマウスが存在した。
【図７０】 図７０は、確立されたＰＣ３−ＰＳＣＡ腫瘍の、１Ｇ８単独またはドキソルビ
シンと組合せた１Ｇ８による増殖阻害である。１ｍｇの１Ｇ８を、腫瘍保有マウ
スに、矢印で示されるように９、１１、１４、１６、１８、２１、２３、２５お
よび２８日目に投与した。２５μｇのドキソルビシンを、（・）印で示されるよ
うに、９、１６および２３日目に投与した。
【図７１】 図７１は、腫瘍保有マウスに投与された抗ＰＳＣＡ抗体が、循環し、そしてＰ
ＳＣＡを発現する腫瘍を標的化する。Ａ）確立されたＰＳＣＡ発現腫瘍を保有し
、３Ｃ５で処置されたマウス由来の腫瘍外植片の免疫組織化学。Ｂ）確立された
ＰＳＣＡ発現腫瘍を保有し、マウスＩｇＧで処置されたマウス由来の腫瘍外稙片
の免疫組織化学。
【図７２】 図７２は、腫瘍保有マウスに投与された抗ＰＳＣＡ抗体が、循環し、そして腫
瘍発現ＰＳＣＡを標的化する。図７１に記載されるマウスから外稙された腫瘍由
来の腫瘍溶解産物の、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を用いて調べられたウエ
スタンブロット分析。
【図７３】 図７３は、腫瘍保有マウスに投与された抗ＰＳＣＡ抗体が、循環し、そして腫
瘍発現ＰＳＣＡを標的化する。確立されたＰＳＣＡ発現腫瘍を保有し、１Ｇ１８
で処置されたマウスから外稙された腫瘍由来の腫瘍溶解産物のウエスタンブロッ
ト分析。このブロットを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を用いて調べた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 レイター， ロバート アメリカ合衆国 カリフォルニア 90024 −6017， ロス アンジェルス， キナー ド アベニュー 10511 (72)発明者 ウィッテ， オウエン アメリカ合衆国 カリフォルニア 91403， シャーマン オークス， サットン ス トリート 14727 (72)発明者 サフラン， ダグラス シー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 90049， ロス アンジェルス， ベラジオ ロー ド 11720 (72)発明者 ジャコボヴィッツ， アヤ アメリカ合衆国 カリフォルニア 90210， ビバリー ヒルズ， ハットン ドライ ブ 3135 Ｆターム(参考） 4C085 AA13 AA14 AA15 AA16 BB41 BB43 BB44 CC32 DD33 DD62 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 EA10 MA01 MA02 MA04 NA14 ZB26 ZC75

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 被験体における前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の血清レベルを
    減少させるための薬学的組成物であって、成熟前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）タ
    ンパク質を認識し結合する抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントを含有
    する、薬学的組成物。
  2. 【請求項２】 配列番号２に記載される前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）タン
    パク質を発現する癌を有する被験体の寿命を延長させるための薬学的組成物であ
    って、該癌細胞の増殖を阻害し、それによって該被験体の寿命を延長させるのに
    十分な量の成熟ＰＳＣＡタンパク質を認識し結合する抗体またはその免疫学的に
    活性なフラグメントを含有し、該ＰＳＣＡタンパク質を発現する癌が膀胱癌また
    は膵臓癌である、薬学的組成物。
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記成熟
    ＰＳＣＡタンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸２２〜９９、１８〜９８、
    または２１〜９９を含有する、薬学的組成物。
  4. 【請求項４】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記ＰＳ
    ＣＡタンパク質を発現する癌が、局所的腫瘍、局所再発性腫瘍または転移性腫瘍
    である、薬学的組成物。
  5. 【請求項５】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、ホルモン
    除去治療、ホルモンアンタゴニスト治療、または放射線療法と同時に使用するた
    めの薬学的組成物。
  6. 【請求項６】 前記抗体がキメラ抗体である、請求項１または２に記載の薬
    学的組成物。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の薬学的組成物であって、前記キメラ抗体が
    、マウス免疫グロブリン可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を含む、薬
    学的組成物。
  8. 【請求項８】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記抗体
    がヒト抗体である、薬学的組成物。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の薬学的組成物であって、前記ヒト抗体が、
    ヒト免疫グロブリン定常領域を含む、薬学的組成物。
  10. 【請求項１０】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記免
    疫学的に活性なフラグメントが、ＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメン
    トである、薬学的組成物。
  11. 【請求項１１】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記免
    疫学的に活性なフラグメントが成熟ＰＳＣＡタンパク質を認識し結合するモノク
    ローナル抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質である、薬学的組成物。
  12. 【請求項１２】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記抗
    体または免疫学的に活性なフラグメントが、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）タン
    パク質を発現する細胞によって内在化される、薬学的組成物。
  13. 【請求項１３】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記抗
    体または免疫学的に活性なフラグメントが、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）タン
    パク質を発現する細胞の増殖を阻害する、薬学的組成物。
  14. 【請求項１４】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記抗
    体または免疫学的に活性なフラグメントが、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）タン
    パク質を発現する細胞を殺す、薬学的組成物。
  15. 【請求項１５】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記抗
    体または免疫学的に活性なフラグメントが、放射標識、酵素、発色団、および蛍
    光剤からなる群から選択される化合物を用いて検出可能なシグナルを直接的また
    は間接的に生成するために標識される、薬学的組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記抗
    体または免疫学的に活性なフラグメントが、治療薬剤に結合される、薬学的組成
    物。
  17. 【請求項１７】 請求項１１に記載の薬学的組成物であって、前記組換えタ
    ンパク質が、治療薬剤に結合体化される、薬学的組成物。
  18. 【請求項１８】 請求項１６または１７に記載の薬学的組成物であって、前
    記治療薬剤が、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソ
    ール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビン
    クリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、
    アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌体外毒素（Ｐ
    Ｅ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、ゲ
    ロニン、ミトゲリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、キ
    ュリシン、クロチン、カリーチアマイシン、サパオナリアオフィシナリスインヒ
    ビター、マイタンシノイド、および糖質コルチコイドからなるより選択される、
    薬学的組成物。
  19. 【請求項１９】 請求項１６または１７に記載の薬学的組成物であって、前
    記治療薬剤が、放射性同位体である、薬学的組成物。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の薬学的組成物であって、前記放射性同
    位体が、212Ｂｉ、131Ｉ、90Ｙおよび186Ｒｅからなる群より選択される、薬学
    的組成物。
  21. 【請求項２１】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記モ
    ノクローナル抗体の組み合わせ、前記モノクローナル抗体および前記免疫学的に
    活性なフラグメントの組み合わせ、または前記免疫学的に活性なフラグメントの
    組み合わせを含む、薬学的組成物。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の薬学的組成物であって、前記モノクロ
    ーナル抗体の組み合わせが、少なくとも２つの異なるイディオタイプのモノクロ
    ーナル抗体を含む、薬学的組成物。
  23. 【請求項２３】 請求項２１に記載の薬学的組成物であって、前記モノクロ
    ーナル抗体の組み合わせが、異なるエピトープ特異性を有するモノクローナル抗
    体を含む、薬学的組成物。
  24. 【請求項２４】 請求項２１に記載の薬学的組成物であって、前記組み合わ
    せのモノクローナル抗体が、アメリカンタイプカルチャーに寄託され、ＨＢ−１
    ２６１２（１Ｇ８）、ＨＢ−１２６１３（２Ａ２）、ＨＢ−１２６１４（２Ｈ９
    ）、ＨＢ−１２６１６（３Ｃ５）、ＨＢ−１２６１８（３Ｅ６）、ＨＢ−１２６
    １５（３Ｇ３）、またはＨＢ−１２６１７（４Ａ１０）と指定されたハイブリド
    ーマによって産生される、薬学的組成物。
  25. 【請求項２５】 請求項２１に記載の薬学的組成物であって、前記組み合わ
    せの免疫学的に活性なフラグメントが、アメリカンタイプカルチャーに寄託され
    、ＨＢ−１２６１２（１Ｇ８）、ＨＢ−１２６１３（２Ａ２）、ＨＢ−１２６１
    ４（２Ｈ９）、ＨＢ−１２６１６（３Ｃ５）、ＨＢ−１２６１８（３Ｅ６）、Ｈ
    Ｂ−１２６１５（３Ｇ３）、またはＨＢ−１２６１７（４Ａ１０）と指定された
    ハイブリドーマによって産生される抗原結合領域モノクローナル抗体を含む、薬
    学的組成物。
  26. 【請求項２６】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記モ
    ノクローナル抗体または免疫学的に活性なフラグメントが、配列番号１１に記載
    されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、薬学的組成物。
  27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の薬学的組成物であって、前記重鎖可変
    領域が、配列番号１０に記載されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコ
    ードされる、薬学的組成物。
  28. 【請求項２８】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記モ
    ノクローナル抗体または免疫学的に活性なフラグメントが、配列番号１３に記載
    されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、薬学的組成物。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の薬学的組成物であって、前記重鎖可変
    領域が、配列番号１２に記載されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコ
    ードされる、薬学的組成物。
  30. 【請求項３０】 請求項１または２に記載の薬学的組成物であって、前記モ
    ノクローナル抗体または免疫学的に活性なフラグメントが、配列番号１５に記載
    されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、薬学的組成物。
  31. 【請求項３１】 請求項３０に記載の薬学的組成物であって、前記重鎖可変
    領域が、配列番号１４に記載されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコ
    ードされる、薬学的組成物。
  32. 【請求項３２】 モノクローナル抗体であって、配列番号１１に記載される
    アミノ酸配列またはその免疫学的に活性なフラグメントを有する重鎖可変領域を
    含む、モノクローナル抗体。
  33. 【請求項３３】 請求項３２に記載のモノクローナル抗体または免疫学的に
    活性なフラグメントであって、前記重鎖可変領域が、配列番号１０に記載される
    ヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、モノクローナル抗体ま
    たは免疫学的に活性なフラグメント。
  34. 【請求項３４】 モノクローナル抗体であって、配列番号１３に記載される
    アミノ酸配列またはその免疫学的に活性なフラグメントを有する重鎖可変領域を
    含む、モノクローナル抗体。
  35. 【請求項３５】 請求項３４に記載のモノクローナル抗体または免疫学的に
    活性なフラグメントであって、前記重鎖可変領域が、配列番号１２に記載される
    ヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、モノクローナル抗体ま
    たは免疫学的に活性なフラグメント。
  36. 【請求項３６】 モノクローナル抗体であって、配列番号１５に記載される
    アミノ酸配列またはその免疫学的に活性なフラグメントを有する重鎖可変領域を
    含む、モノクローナル抗体。
  37. 【請求項３７】 請求項３６に記載のモノクローナル抗体または免疫学的に
    活性なフラグメントであって、前記重鎖可変領域が、配列番号１４に記載される
    ヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、モノクローナル抗体ま
    たは免疫学的に活性なフラグメント。
JP2001510481A 1999-07-20 2000-07-20 Ｐｓｃａ：前立腺幹細胞抗原およびその使用 Expired - Lifetime JP3895988B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35932699A 1999-07-20 1999-07-20
US09/359,326 1999-07-20
US09/564,329 2000-05-03
US09/564,329 US6541212B2 (en) 1997-03-10 2000-05-03 Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
PCT/US2000/019967 WO2001005427A1 (en) 1999-07-20 2000-07-20 Psca: prostate stem cell antigen and uses thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006204010A Division JP4602948B2 (ja) 1999-07-20 2006-07-26 Ｐｓｃａ：前立腺幹細胞抗原およびその使用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2003504414A true JP2003504414A (ja) 2003-02-04
JP3895988B2 JP3895988B2 (ja) 2007-03-22

Family

ID=27000436

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001510481A Expired - Lifetime JP3895988B2 (ja) 1999-07-20 2000-07-20 Ｐｓｃａ：前立腺幹細胞抗原およびその使用
JP2006204010A Expired - Lifetime JP4602948B2 (ja) 1999-07-20 2006-07-26 Ｐｓｃａ：前立腺幹細胞抗原およびその使用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006204010A Expired - Lifetime JP4602948B2 (ja) 1999-07-20 2006-07-26 Ｐｓｃａ：前立腺幹細胞抗原およびその使用

Country Status (6)

Country Link
US (18) US6541212B2 (ja)
EP (1) EP1200125A1 (ja)
JP (2) JP3895988B2 (ja)
AU (1) AU776716B2 (ja)
CA (1) CA2378946C (ja)
WO (1) WO2001005427A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009531324A (ja) * 2006-03-20 2009-09-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌標的化のための操作された抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
US8772459B2 (en) 2009-12-02 2014-07-08 Imaginab, Inc. J591 minibodies and Cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (PSMA) and methods for their use
US8940298B2 (en) 2007-09-04 2015-01-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
US8951737B2 (en) 1996-05-06 2015-02-10 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US9701754B1 (en) 2002-10-23 2017-07-11 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
US10517969B2 (en) 2009-02-17 2019-12-31 Cornell University Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
US11254744B2 (en) 2015-08-07 2022-02-22 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules

Families Citing this family (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6960443B2 (en) * 1997-03-10 2005-11-01 The Regents Of The University Of California Methods of detecting prostate stem cell antigen in cancer
US20080318254A9 (en) * 1997-03-10 2008-12-25 The Regents Of The University Of California PSCA antibodies and hybridomas producing them
US6541212B2 (en) * 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
US7361336B1 (en) * 1997-09-18 2008-04-22 Ivan Bergstein Methods of cancer therapy targeted against a cancer stem line
DE60039448D1 (de) * 1999-10-29 2008-08-21 Genentech Inc Gegen das prostata-stammzellantigen (psca) gerichtete antikörper und deren verwendung
US6824780B1 (en) 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
JP2001195491A (ja) * 1999-11-02 2001-07-19 Matsushita Electric Works Ltd 住空間関連商品の販売支援方法と課金方法及びそのためのシステムと記録媒体
US7491801B2 (en) 2000-09-01 2009-02-17 International Bioimmune Systems, Inc. Identification and development of specific monoclonal antibodies to squamous cell carcinoma
SE0100595D0 (sv) * 2001-02-22 2001-02-22 Lena Carlsson Immunological detection of prostate diseases and prostatic-related diseases
DK1411962T3 (da) * 2001-03-15 2011-04-04 Neogenix Oncology Inc Terapi for pancreacancer med monoklonalt stof
US20060088899A1 (en) * 2002-05-31 2006-04-27 Alvarez Vernon L Combination chemotherapy with chlorotoxin
US6888543B2 (en) * 2003-03-07 2005-05-03 Children's Medical Center Corporation Method and apparatus for displaying information
AU2004235298A1 (en) * 2003-04-25 2004-11-11 Janssen Pharmaceutica N.V. Preservation of RNA in a biological sample
US7541442B2 (en) * 2003-05-30 2009-06-02 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
CN101090729B (zh) 2003-05-30 2014-07-23 艾更斯司股份有限公司 前列腺干细胞抗原(psca)变体及其序列
US7595379B2 (en) * 2003-05-30 2009-09-29 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
SI1725249T1 (sl) 2003-11-06 2014-04-30 Seattle Genetics, Inc. Spojine monometilvalina, sposobne konjugacije na ligande
WO2005062977A2 (en) * 2003-12-23 2005-07-14 The Regents Of The University Of California Prostate cancer specific internalizing human antibodies
PL1753871T3 (pl) * 2004-05-28 2016-01-29 Agensys Inc Przeciwciała i powiązane cząsteczki, które wiążą się z antygenem komórek macierzystych prostaty (PSCA)
BRPI0520902B1 (pt) * 2004-05-28 2021-11-30 Agensys, Inc Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a proteínas psca para diagnóstico de câncer, método para produção dos mesmos, hibridoma, polinucleotídeo, vetor, composição, ensaio para detectar a presença de uma proteína psca e método de detecção de uma proteína psca
EP2286844A3 (en) 2004-06-01 2012-08-22 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US7713693B1 (en) 2004-09-01 2010-05-11 University Of Louisiana At Monroe Human cancer cell specific gene transcript
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
WO2006034488A2 (en) 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US7985575B2 (en) * 2004-11-04 2011-07-26 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Single protein production in living cells facilitated by a messenger RNA interferase
CN101223191B (zh) * 2005-04-14 2012-09-05 阿根西斯公司 与psca蛋白结合的抗体和相关分子
EP1874822A1 (en) * 2005-04-14 2008-01-09 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to psca proteins
WO2006114115A1 (de) 2005-04-26 2006-11-02 Trion Pharma Gmbh Kombination von antikörpern mit glukokortikoiden zur behandlung von krebs
US8088908B2 (en) 2005-05-10 2012-01-03 City Of Hope Humanized anti-prostate stem cell antigen monoclonal antibody
WO2007086932A2 (en) * 2006-01-13 2007-08-02 The Johns Hopkins University Prostate stem cell antigen vaccines and uses thereof
US20080118518A1 (en) * 2006-09-07 2008-05-22 Cirrito Thomas P Cancer stem cell-targeted cancer therapy
PT2486938T (pt) 2006-09-26 2018-06-12 Infectious Disease Res Inst Composição para vacina contendo adjuvante sintético
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
CN101678082B (zh) 2007-03-26 2013-06-19 再生医药有限公司 使用cxcl9和抗cxcl9抗体促进骨髓保护和再生的方法
JP2011520914A (ja) 2008-05-15 2011-07-21 トランスモレキュラー， インコーポレイテッド 転移腫瘍の処置
US20100069616A1 (en) * 2008-08-06 2010-03-18 The Regents Of The University Of California Engineered antibody-nanoparticle conjugates
US20100076185A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Nils Adey Selective Processing of Biological Material on a Microarray Substrate
US20100088768A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Invensys Systems, Inc. Industrial process visualization application having an operating system locale-based regionally limited license
TWI494125B (zh) 2009-06-05 2015-08-01 Infectious Disease Res Inst 合成的葡萄吡喃糖基脂質佐劑
US20110045053A1 (en) * 2009-08-18 2011-02-24 Shen Michael M Isolated population of luminal stem cells that give rise to prostate cancer and methods of using same
AU2010292172A1 (en) 2009-09-09 2012-05-03 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
WO2011084605A1 (en) * 2009-12-16 2011-07-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Anti-prostate cancer antibodies and methods of detection and treatment of prostate cancer using the same
CN102844044B (zh) 2010-02-04 2016-10-26 摩尔弗泰克有限公司 氯毒素多肽和结合物及其应用
PE20130342A1 (es) 2010-04-15 2013-04-20 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas
RU2012153241A (ru) * 2010-05-11 2014-06-20 Авео Фармасьютикалз, Инк. Антитела к fgfr2
EP2579897A1 (en) 2010-06-08 2013-04-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
ES2544608T3 (es) 2010-11-17 2015-09-02 Genentech, Inc. Conjugados de anticuerpo y de alaninil-maitansinol
EP3138581B1 (en) 2011-03-17 2019-01-02 The University of Birmingham Re-directed immunotherapy
AU2012243039B2 (en) 2011-04-08 2017-07-13 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
CA2833212C (en) 2011-05-12 2020-06-09 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
DE102011118022B4 (de) 2011-06-30 2018-01-18 Gemoab Monoclonals Gmbh Antikörper gegen das Prostata-spezifische Stammzellenantigen und dessen Verwendung
HUE025661T2 (en) 2011-10-14 2016-04-28 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and their conjugates
PL2811981T3 (pl) 2012-02-07 2019-09-30 Infectious Disease Research Institute Ulepszone formulacje adiuwantowe zawierające agonistę TLR4 oraz sposoby ich zastosowania
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
RU2737765C2 (ru) 2012-05-04 2020-12-02 Пфайзер Инк. Простатоассоциированные антигены и иммунотерапевтические схемы на основе вакцин
EA034351B1 (ru) 2012-05-16 2020-01-30 Иммьюн Дизайн Корп. Трехкомпонентная вакцина против впг-2 и способы ее применения
NZ707486A (en) 2012-10-12 2018-09-28 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine - anti-psma antibody conjugates
EP2906297B1 (en) 2012-10-12 2017-12-06 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2014057114A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
DK2906251T3 (da) 2012-10-12 2017-11-20 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepin-anti-CD22-antistofkonjugater
PL2766048T3 (pl) 2012-10-12 2015-05-29 Medimmune Ltd Pirolobenzodiazepiny i ich koniugaty
MX364328B (es) 2012-10-12 2019-04-23 Medimmune Ltd Conjugados del anticuerpo pirrolobenzodiazepina.
NZ707534A (en) 2012-10-12 2018-08-31 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
CA2894959C (en) 2012-12-21 2022-01-11 Spirogen Sarl Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
CN110452242A (zh) 2012-12-21 2019-11-15 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
AU2014244245C1 (en) 2013-03-13 2018-04-19 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US20160031887A1 (en) 2013-03-13 2016-02-04 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN105142674B (zh) 2013-03-13 2018-11-13 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓和其结合物
CN105518018B (zh) 2013-03-15 2020-04-03 细胞基因公司 修饰的t淋巴细胞
BR112015025709A2 (pt) 2013-04-18 2017-07-18 Immune Design Corp monoterapia com gla para uso em tratamento de câncer
US9463198B2 (en) 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis
EA201690195A1 (ru) 2013-08-12 2016-05-31 Дженентек, Инк. Конъюгатные соединения антитело-лекарство на основе димера 1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1h-бензо[e]индола и способы применения и лечения
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10010624B2 (en) 2013-10-11 2018-07-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015052534A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
MX2016007578A (es) 2013-12-16 2016-10-03 Genentech Inc Compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco dimerico de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1h-benzo [e] indol, y metodos de uso y tratamiento.
CN105873614B (zh) 2013-12-16 2020-10-30 基因泰克公司 肽模拟化合物及其抗体-药物缀合物
EP3082875B1 (en) 2013-12-16 2020-11-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
PT3089754T (pt) 2013-12-31 2021-07-23 Infectious Disease Res Inst Formulações de vacina de dose única
EP3193940A1 (en) 2014-09-10 2017-07-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2016040825A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AR101844A1 (es) 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos y conjugados modificados genéticamente con cisteína
JP2017533887A (ja) 2014-09-17 2017-11-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピン類及びその抗体ジスルフィドコンジュゲート
KR20170101895A (ko) 2014-11-25 2017-09-06 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 피롤로벤조디아제핀-항체 접합체
KR20170086121A (ko) 2014-12-03 2017-07-25 제넨테크, 인크. 4급 아민 화합물 및 그의 항체-약물 접합체
US10557857B1 (en) * 2015-03-23 2020-02-11 Intelligent Optical Systems, Inc. System and method for bone loss assay
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
JP6943872B2 (ja) 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
PL3458101T3 (pl) 2016-05-20 2021-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania
JP7022080B2 (ja) 2016-05-27 2022-02-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 部位特異的抗体－薬物複合体の特徴付けのための生化学分析的方法
AU2017273650B2 (en) 2016-06-01 2022-08-18 Access To Advanced Health Institute Nanoalum particles containing a sizing agent
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
EP3496763A1 (en) 2016-08-11 2019-06-19 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
WO2018065501A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for preparing antibody drug conjugates
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
US11331380B2 (en) 2016-10-20 2022-05-17 Celgene Corporation Cereblon-based heterodimerizable chimeric antigen receptors
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
AU2018217926B2 (en) 2017-02-08 2019-10-03 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3612537B1 (en) 2017-04-18 2022-07-13 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine conjugates
US20200129637A1 (en) 2017-04-20 2020-04-30 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
KR102442736B1 (ko) 2017-06-14 2022-09-16 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 항-cd19 adc의 투여를 위한 투약량 체제
US10636512B2 (en) 2017-07-14 2020-04-28 Cofactor Genomics, Inc. Immuno-oncology applications using next generation sequencing
JP7220203B2 (ja) 2017-08-18 2023-02-09 メドイミューン・リミテッド ピロロベンゾジアゼピン複合体
CA3078223A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 Infectious Disease Research Institute Liposomal formulations comprising saponin and methods of use
IL273387B2 (en) 2017-09-20 2023-10-01 Ph Pharma Co Ltd Thylanstatin analogs
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
EP3870235A1 (en) 2018-10-24 2021-09-01 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
CN113227119A (zh) 2018-12-10 2021-08-06 基因泰克公司 用于与含Fc的蛋白质进行位点特异性缀合的光交联肽
EP3897851A2 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Revitope Limited Twin immune cell engager
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
MX2021014363A (es) 2019-05-25 2022-02-21 Infectious Disease Res Inst Composicion y metodo para secar por pulverizacion una emulsion de vacuna adyuvante.
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
IT202000031838A1 (it) * 2020-12-22 2022-06-22 Saverio Alberti Piattaforma per ottenere anticorpi monoclonali diretti contro antigeni processati tumore-specifici
WO2024138128A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS56145222A (en) * 1980-04-28 1981-11-11 Toshiyuki Hamaoka Improved antibody and its preparation
US4474893A (en) * 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4867973A (en) * 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
JPS5920244A (ja) * 1982-07-22 1984-02-01 Kao Corp ４−ホモイソツイスタン−３−カルボン酸の製造法
DE3684578D1 (de) 1985-12-17 1992-04-30 Eastern Virginia Medical Autho Monoklonale antikoerper mit bindungsspezifitaet fuer menschliche prostatatumorantigene und methoden fuer ihre verwendung.
US5001225A (en) * 1986-12-08 1991-03-19 Georgetown University Monoclonal antibodies to a pan-malarial antigen
US5162504A (en) * 1988-06-03 1992-11-10 Cytogen Corporation Monoclonal antibodies to a new antigenic marker in epithelial prostatic cells and serum of prostatic cancer patients
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5980896A (en) * 1989-06-30 1999-11-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies reactive with human carcinomas
US5194596A (en) * 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5571894A (en) * 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE69232395T2 (de) * 1991-11-26 2002-11-14 Jenner Technologies Walworth Antitumorvakzine
US5719032A (en) * 1992-01-31 1998-02-17 University Of British Columbia Melanoma and prostate cancer specific antibodies for immunodetection and immunotherapy
US5728815A (en) * 1992-03-30 1998-03-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Bone and prostate-derived protein factors affecting prostate cancer growth, differentiation, and metastasis
US5359836A (en) * 1993-02-01 1994-11-01 Control Concepts, Inc. Agricultural harvester with closed loop header control
US5650836A (en) * 1996-07-02 1997-07-22 Hudson Universal Ltd. Hanger with temple support for display of eyeglasses
US5856136A (en) 1996-07-03 1999-01-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human stem cell antigens
EP2314625B1 (en) * 1996-12-03 2014-05-07 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US6258939B1 (en) * 1997-03-10 2001-07-10 The Regents Of The University Of California PSCA antibodies and hybridomas producing them
US6261789B1 (en) * 1997-03-10 2001-07-17 The Regents Of The University Of California Methods for detecting the presence of a PSCA protein using PSCA antibodies
US6960443B2 (en) * 1997-03-10 2005-11-01 The Regents Of The University Of California Methods of detecting prostate stem cell antigen in cancer
US6541212B2 (en) * 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
US20080318254A9 (en) * 1997-03-10 2008-12-25 The Regents Of The University Of California PSCA antibodies and hybridomas producing them
EP2343085B1 (en) * 1997-03-10 2014-12-10 The Regents of The University of California Antibody against prostate stem cell antigen (PSCA)
AU771026B2 (en) * 1998-03-10 2004-03-11 Regents Of The University Of California, The PSCA: prostate stem cell antigen and uses thereof
US6261791B1 (en) * 1997-03-10 2001-07-17 The Regents Of The University Of California Method for diagnosing cancer using specific PSCA antibodies
US6130043A (en) * 1997-05-02 2000-10-10 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US6890749B2 (en) * 1997-05-15 2005-05-10 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
WO1998051824A1 (en) * 1997-05-15 1998-11-19 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting disease of the urinary tract
US6194152B1 (en) * 1997-08-20 2001-02-27 Dendreon Corporation Prostate tumor polynucleotide compositions and methods of detection thereof
US6207380B1 (en) * 1997-09-15 2001-03-27 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the urinary tract
US7442776B2 (en) * 1999-10-08 2008-10-28 Young David S F Cancerous disease modifying antibodies
US6824780B1 (en) * 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
AU2002220265A1 (en) * 2000-11-03 2002-05-15 University Of Vermont And State Agricultural College Compositions for inhibiting grb7
US6739044B2 (en) * 2002-07-16 2004-05-25 Unit Industries, Inc. Electrical terminal tinning process
US7393531B2 (en) * 2003-01-21 2008-07-01 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP
US7595379B2 (en) 2003-05-30 2009-09-29 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
US7541442B2 (en) 2003-05-30 2009-06-02 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
CN101090729B (zh) * 2003-05-30 2014-07-23 艾更斯司股份有限公司 前列腺干细胞抗原(psca)变体及其序列
US8088908B2 (en) 2005-05-10 2012-01-03 City Of Hope Humanized anti-prostate stem cell antigen monoclonal antibody
US8940871B2 (en) * 2006-03-20 2015-01-27 The Regents Of The University Of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting
JP6126773B2 (ja) 2007-09-04 2017-05-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌のターゲッティングおよび検出のための高親和性抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8951737B2 (en) 1996-05-06 2015-02-10 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US9701754B1 (en) 2002-10-23 2017-07-11 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
US9765155B2 (en) 2002-10-23 2017-09-19 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
JP2009531324A (ja) * 2006-03-20 2009-09-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌標的化のための操作された抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
JP2013116897A (ja) * 2006-03-20 2013-06-13 Regents Of The Univ Of California 癌標的化のための操作された抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
US8940871B2 (en) 2006-03-20 2015-01-27 The Regents Of The University Of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting
US8940298B2 (en) 2007-09-04 2015-01-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
US9527919B2 (en) 2007-09-04 2016-12-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
US10517969B2 (en) 2009-02-17 2019-12-31 Cornell University Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
US8772459B2 (en) 2009-12-02 2014-07-08 Imaginab, Inc. J591 minibodies and Cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (PSMA) and methods for their use
US11180570B2 (en) 2009-12-02 2021-11-23 Imaginab, Inc. J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (PSMA) and methods for their use
US11254744B2 (en) 2015-08-07 2022-02-22 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules

Also Published As

Publication number Publication date
US20050169930A1 (en) 2005-08-04
JP3895988B2 (ja) 2007-03-22
US20030153016A1 (en) 2003-08-14
US20030113820A1 (en) 2003-06-19
US20090104631A1 (en) 2009-04-23
US20020136689A1 (en) 2002-09-26
WO2001005427A9 (en) 2002-08-29
US8524460B2 (en) 2013-09-03
US20080318253A9 (en) 2008-12-25
US7527786B2 (en) 2009-05-05
US6979730B2 (en) 2005-12-27
US7462691B2 (en) 2008-12-09
US20160347855A1 (en) 2016-12-01
AU6364100A (en) 2001-02-05
US20040018571A1 (en) 2004-01-29
US20050152909A1 (en) 2005-07-14
WO2001005427A8 (en) 2003-10-23
US6881822B2 (en) 2005-04-19
AU776716B2 (en) 2004-09-16
US20140364591A1 (en) 2014-12-11
US6790939B2 (en) 2004-09-14
JP4602948B2 (ja) 2010-12-22
CA2378946A1 (en) 2001-01-25
WO2001005427A1 (en) 2001-01-25
US20120063999A1 (en) 2012-03-15
US20020119157A1 (en) 2002-08-29
US20010055751A1 (en) 2001-12-27
US20030228318A1 (en) 2003-12-11
WO2001005427B1 (en) 2001-05-17
US20020141941A1 (en) 2002-10-03
US8759006B2 (en) 2014-06-24
US20030113818A1 (en) 2003-06-19
US6756036B2 (en) 2004-06-29
US7407656B2 (en) 2008-08-05
US7485296B2 (en) 2009-02-03
US6825326B2 (en) 2004-11-30
US7417113B2 (en) 2008-08-26
CA2378946C (en) 2018-05-15
US20020102666A1 (en) 2002-08-01
JP2007001983A (ja) 2007-01-11
US6541212B2 (en) 2003-04-01
US20050059099A1 (en) 2005-03-17
EP1200125A1 (en) 2002-05-02
US20050003465A1 (en) 2005-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4602948B2 (ja) Ｐｓｃａ：前立腺幹細胞抗原およびその使用
JP4527883B2 (ja) Ｐｓｃａ：前立腺幹細胞抗原およびそれの使用
US6960443B2 (en) Methods of detecting prostate stem cell antigen in cancer
AU2166800A (en) Psca: prostate stem cell antigen and uses thereof
JP2010265323A (ja) Ｐｓｃａ：前立腺幹細胞抗原およびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20051122

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060222

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20060222

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20060403

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060726

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20060908

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20061012

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20061016

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20061120

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20061215

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Ref document number: 3895988

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091222

Year of fee payment: 3

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091222

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101222

Year of fee payment: 4

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111222

Year of fee payment: 5

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121222

Year of fee payment: 6

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121222

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131222

Year of fee payment: 7

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term