JP2003503322A - 植物衛生品及び／又は肥料としてのグリクロン酸多糖（ｇｌｙｃｕｒｏｎｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）及びオリゴ糖の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ酵素を増幅するための活性に関連する適用での植物衛生品として、並びに／あるいは１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ酵素、及び／又は１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又はキシログルカンエンドトランスグリコラーゼを増幅する活性に関連する適用での生物肥料としての、１，４−β−Ｄ−グルクロナン、並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマーから誘導される糖単位の数が約３０未満のグリクロン酸多糖、並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマー又は前記オリゴ糖誘導体に対応するエステル及び／又はエーテル、から選択される化合物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、植物衛生品及び／又は肥料としての、１，４−β−Ｄ−グルクロナ
ンポリマー及び誘導したグリクロン酸オリゴ糖の使用に関する。

【０００２】 酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼは、植物における防御機構の標識物質であ
る。病原体（細菌、真菌、ウイルス）への過剰感作により引き起こされる反応の
間、植物は、「ＰＲ蛋白質」と呼ばれる特異的蛋白質の合成を誘導することによ
り反応する（Sintzi A. et al. (1993) Biochimie, 75, 687-706）。これらの蛋
白質はその他の分子（サリチル酸など）と共に病因に結合して、病原体への耐性
の発達に寄与する。これらの蛋白質は、生化学的性質及び生理学的機能に応じて
複数の群に列挙される。それらは、以下の特徴を持つ：低分子量、組成（単量体
が最も多い）、蛋白質分解への耐性、酸媒体又は極限温度での安定性、原形質膜
又は小胞体膜との会合、及び壁面という位置。これらのＰＲ蛋白質のうち群２は
、１，３−β−Ｄ−グルカン鎖を基質として認識する１，３−β−Ｄ−グルカナ
ーゼ酵素を構成要素とする。植物の防御におけるこれらの蛋白質の役割は、１，
３−β−Ｄ−グルカン（1,3β-D-glucanes）に豊富な、病原体の壁を溶解する能
力に基づいている（Boller T. (1993) In Mechanism of Plant Defences Respon
ses. Fritig B. Legrand M. eds. Kluwer. Academic Publishers Dordrecht, 39
2-400）。

【０００３】 しかしこの酵素活性は、植物の防御に関与するだけではない。それは、実際に
は植物ホルモンによって調節することができ、それは植物の発育のある段階で誘
導することができる。これに基づいて、酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼは、
植物における成長及び／又は細胞分化の標識物質となっている。

【０００４】 この酵素は、多数のＰＲ蛋白質（蛋白質阻害物質、キチナーゼ、オスモチンを
コードする遺伝子の発現を調節する蛋白質）と同様に、成長及び／又は細胞分化
、あるいは環境への適応の過程に関連する。これらの蛋白質の中には、タバコモ
ザイクが混入するタバコから単離される１，３−β−Ｄ−グルカナーゼに対する
抗体によって認識されるものものある（Kauffmann et al. (1990) Plant Mol. B
iol. 14(3): 381-90）。

【０００５】 １，３−β−Ｄ−グルカナーゼ又はこれらの蛋白質をコードする遺伝子の活性
は、発芽、並びに花芽及び果実の発育の途中で誘導される（del Campillo E., L
ewis L N. (1992) Plant Physiology 99, 1015-1020; Neale et al. (1990) Pla
nt Cell 2, 7, 673-684）。詳細には、これらの反応は、異化的変化（内乳核、
花粉管、茎部離層帯、花柄など）により、又は有糸分裂（やく、柱頭、茎の場合
）の間、組織内で発生する。それらは、ホルモン（オーキシン、一般にサイトキ
ニン、詳細にはアブシシン酸）に依存し、そして果実の成熟を制御するエチレン
又は開花を制御するサリチル酸のような分子も誘導物質である。最後に、１，３
−β−Ｄ−グルカナーゼ酵素は、植物の低温及び高レベルのオゾンへの適応の機
能が記録されている（Hincha et al. (1997) Plant Physiology 114, 1077-1083
）。

【０００６】 酵素１，４−β−Ｄ−グルカナーゼは、植物の発育及び／又は細胞分化の標識
物質である。この酵素は、β（１，４）で結合するグルカンの直鎖を基質として
認識する。それは、セルロース、βグルカン（１，４）（１，６）、及びキシロ
グルカンを加水分解することができる。こうしてそれは、成長過程での植物細胞
壁の超微細構造の変化において、１つの役割を演じる。それの誘導及び／又は特
異的遺伝子の誘導は、植物細胞壁の溶解、やく、果実、および花の離層帯の崩壊
を含む工程で明らかにされている（Hayaschi T., Oshimi C. (1994) Plant Cell
Physiology 35(3), 419-424; Brummel D. A. et al. (1997) Plant Biol. Mol.
33, 1, 97-195）。それは、エチレンにより、アビシシン酸又はオーキシンのよ
うなホルモンにより制御される。

【０００７】 キシログルカンエンドトランスグリコラーゼ活性は、機械的圧迫、風、暗さ、
及び熱衝撃のような環境刺激に反応して、植物細胞壁のキシログルカンの改変を
誘導する（Xu et al. (1996) Plant J. 9(6), 879-89; Antosiewiez et al. (19
97, 115(4), 1319-28)）。

【０００８】 本発明は、「１，４−β−Ｄ−グルクロンナン及び後者から誘導されるグリク
ロン酸オリゴ糖は、酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ及び／又は酵素１，４−
β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又は酵素キシログルカンエンドトランスグリコラ
ーゼを増幅する活性を有する」という事実の本発明者による実証に発し、これに
基づいて、植物衛生的使用又は肥料という観点から使用され得る「惹起」化合物
として記載する。

【０００９】 １，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーは、既に本発明の上述のものとは全体
的に異なる使用分野（即ち食物、薬剤、ヒト又は家畜の治療、化粧品、あるいは
水の精製（詳細にはゲル化剤、増粘剤、水和剤、安定剤、キレート剤、又は凝集
剤として）の領域に加えてオリゴ糖の調製）に関係する、１９９２年３月３日の
フランスの特許ＦＲ−Ｂ−２６８８２２２に記載されている。

【００１０】 本発明は、肥料（きゅう肥、生物学的肥料、又は生物肥料）及び植物衛生品の
組成に含まれる「惹起物質」として用いられ得る化合物を提供するという目的を
有する。

【００１１】 本発明の目的の１つは、詳細には環境への毒性がある炭汁及び硝酸塩を基にし
た市販製品に加える栄養素の刺激物質として、又はその市販品の代替物として、
及び／あるいは植物の発育の１段階以上の調節物質として用いられ得る新しい生
物肥料を提供することである。

【００１２】 本発明の別の目的は、詳細には環境への毒性がある殺虫剤に加える生物性又は
非生物性ストレスの防御及び耐性反応の活性化物質として、又はその市販品の代
替物として用いられ得る新しい植物衛生品を提供することである

【００１３】 本発明は、 ＊酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを増幅する活性に関連する使用という枠内
での植物衛生品として、 ＊並びに／あるいは酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又は１，４−β
−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又はキシログルカンエンドトランスグリコラーゼを
増幅する活性に関連する使用という枠内での生物肥料としての、 −以下の式（Ｉ）：

【００１４】

【化３】

【００１５】 （式中、ｎは約２５００という大きさになり得る整数であり、有利には約３００
〜約２５００であり、ＲはＨ又はＣＯＣＨ₃を表す）の１，４−β−Ｄ−グルク
ロナンポリマー、 −並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマーから誘導され、糖単位の数が約３０未満
、好ましくは２〜１５のβ（１−４）鎖グリクロン酸オリゴ糖、 −並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマー又は上述のオリゴ糖誘導体に対応するエ
ステル及び／又はエーテル、から選択される化合物の使用を対象として有する。

【００１６】 本発明の観点から処理され得る植物には、以下のものが挙げられる：つる、果
樹、穀物、及び市販の園芸品、又はいずれか別の経済的関心のある植物。

【００１７】 本発明は、より詳細には病原体又は捕食者からの（特に細菌、ウイルス、真菌
、昆虫、線虫からの）植物の保護、又は非生物性ストレスへの植物の適応（詳細
には低温又は高レベルのオゾンへの適応）など、酵素１，３−β−Ｄ−グルカナ
ーゼを増幅する活性に関連する使用という枠内での植物衛生品としての、上述の
ものから選択される化合物の上述の使用を対象として有する。

【００１８】 本発明は、より詳細には、植物衛生品としての、式（Ｉ）（式中、ｎは約３０
０〜約２５００の整数であり、ＲはＨを表す）の１，４−β−Ｄ−グルクロナン
ポリマーの使用を対象として有する。

【００１９】 本発明は、より詳細には、植物衛生品としての、式（Ｉ）（式中、ｎは約３０
０〜約２５００の整数であり、ＲはＨ又はＣＯＣＨ₃を表し、ＣＯＣＨ₃の重量％
は好ましくは０〜３０．５である）の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーの
使用も対象として有する。

【００２０】 本発明は、植物衛生品としての、ＤＰ（重合度）が３０未満、好ましくは２〜
１５のβ（１−４）鎖グリクロン酸オリゴ糖（オリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロ
ナン、オリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン、及びオリゴ１，４−β−Ｄ−グル
ロナンなど）の使用にも関する。

【００２１】 以下では、表現「重合度ｘ（ＤＰｘ）のオリゴ糖」は、同数ｘの糖単位で作ら
れたオリゴ糖を意味するものと理解し、表現「平均重合度ｘ（平均ＤＰｘ）のオ
リゴ糖」は、平均がｘに対応する様々な数の糖単位で作られたオリゴ糖を意味す
るものと理解する。

【００２２】 植物衛生品として好ましいグリクロン酸オリゴ糖誘導体は、以下の： −ＤＰ８及び平均ＤＰ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン、 −ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン、 ―ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナン、から選択される。

【００２３】 本発明は、上述の病原体に耐性の植物、又は非生物性ストレス（特に低温、高
レベルのオゾン）に適応する植物を得ることを考慮し、上記定義の１，４−β−
Ｄ−グルクロナンポリマー及び／又はグリクロン酸オリゴ糖による植物の処理方
法も対象として有する。

【００２４】 本発明は、酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又は酵素１，４−β−
Ｄ−グルカナーゼ、及び／又は酵素キシログルカンエンドトランスグリコラーゼ
を増幅する活性に関連する使用という枠内での生物肥料としての、上に列挙され
たものから選択される化合物の使用にも関する。

【００２５】 本発明は、より詳細には、酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ及び／又は酵素
１，４−β−Ｄ−グルカナーゼを増幅する活性に関連する使用という観点、特に
植物の発育の１段階以上の制御（果実の熟成、器官離脱、雌ずいの成長、又はや
くの成熟の制御など）という枠内での生物肥料としての、ＤＰが約３０未満、好
ましくは２〜１５のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナンの上述の使用を対象と
して有する。

【００２６】 本発明は、更に詳細には、生物肥料としてのＤＰ８及び平均ＤＰ８のオリゴ１
，４−β−Ｄ−グルクロナンの上述の使用を対象として有する。

【００２７】 本発明は、より詳細には、酵素キシログルカンエンドトランスグリコラーゼを
増幅する活性に関連する使用という観点、特にある器官（胚軸、子葉、葉、花粉
管、及び果実）の組織（維管束の部分又は柔組織）の膨張時の細胞壁の構成の制
御という枠内での生物肥料、及び植物細胞壁を強化してそれらを環境刺激（風、
熱又は水の衝撃、あるいは機械的圧迫など）に適応させる生物肥料として、ＤＰ
が約３０未満、好ましくは２〜１５のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナンの上
述の使用を対象として有する。

【００２８】 本発明は、発育（果実の成熟、器官離脱、雌ずいの成長、又はやくの成熟など
）の１段階以上が、時間に応じて制御できる植物を得ることを考慮し、上記定義
のグリクロン酸オリゴ糖による植物の処理方法も対象として有する。

【００２９】 本発明は、組織の膨張時の細胞壁の構成が制御された植物、及び植物細胞壁が
強化されてそれらを環境刺激（風、熱又は水の衝撃、あるいは機械的圧迫）に適
応される植物を得ることを考慮し、上記定義のグリクロン酸オリゴ糖による植物
の処理方法も対象として有する。

【００３０】 本発明は、 −上述の式（Ｉ）（式中、ｎは約３００〜約２５００の整数であり、ＲはＨ又は
ＣＯＣＨ₃を表す）の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー、 −並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマーから誘導される糖単位の数が約３０未満
のβ（１−４）鎖グリクロン酸オリゴ糖、 −並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマー又は上述のオリゴ糖誘導体に対応するエ
ステル及び／又はエーテル、から選択される化合物を少なくとも１つ含むことを
特徴とする植物衛生品及び／又は生物肥料にも関する。

【００３１】 本発明は、詳細には式（Ｉ）（式中、ｎは約３００〜約２５００の整数であり
、ＲはＨを表す）の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーを少なくとも１つ含
む植物衛生品を対象として有する。

【００３２】 本発明は、式（Ｉ）（式中、ｎは約３００〜約２５００の整数であり、ＲはＨ
又はＣＯＣＨ₃を表し、ＣＯＣＨ₃の重量％は好ましくは０〜３０．５である）の
１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーを少なくとも１つ含む植物衛生品にも関
する。

【００３３】 本発明は、ＤＰ（重合度）が３０未満、好ましくは２〜１５のβ（１−４）鎖
グリクロン酸オリゴ糖（オリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン、オリゴ１，４−
β−Ｄ−マンヌロナン、及びオリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナンなど）を少なく
とも１つ含む植物衛生品も対象として有する。

【００３４】 本発明は、より詳細には、以下の： −ＤＰ８及び平均ＤＰ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン、 −ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン、 ―ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナン、から選択されるグリクロン酸オ
リゴ糖誘導体を少なくとも１つ含む植物衛生品を対象として有する。

【００３５】 本発明は、より詳細には、ＤＰが約３０未満、好ましくは２〜１５のオリゴ１
，４−β−Ｄ−グルクロナンを少なくとも１つ含む生物肥料、好ましくはＤＰ８
及び平均ＤＰ８の１，４−β−Ｄ−グルクロナンを含む生物肥料に関する。

【００３６】 本発明は、更に詳細には、ＤＰが約３０未満、好ましくは２〜１５のオリゴ１
，４−β−Ｄ−マンヌロナンを少なくとも１つ含む生物肥料、好ましくはＤＰ４
のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナンを含む生物肥料に関する。

【００３７】 本発明による１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー及び誘導されたグリクロ
ン酸オリゴ糖の調製、加えて酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ及び／又は酵素
１，４−β−Ｄ−グルカナーゼを増幅する特性の実証についての以下の詳細な説
明によって、本発明を更に説明する。

【００３８】

【実施例】

Ａ）ウロン酸ポリマー及び／又はそれらのオリゴ糖の調製 化学的突然変異及び／又は遺伝子操作により改変されている可能性がある（又
はない）根圏（Rhyzobium, Sinorhyzobium Agrobacterium, Pseudonomas, Burko
lderia etc.）から単離した細菌の菌株の発酵処理を用いて、１，４−β−Ｄ−
グルクロナンポリマーを得た。 １，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーは、こうして種々の文献（Painter T.
J., 1977, Preparation and periodate oxidation of C-6-oxycellulose: conf
ormational interpretation of hamlacetal stability. Carbohy. Res. 55, 95-
103; Chang P. S. and Robyt J. F., Oxidation of primary alchohol groups o
f naturally occurring polysaccharides with 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperid
ine oxoammonium ion. J. Carbohydr. Chem., 15, 819-830; Isogai, A and Kat
o, Y., 1998, Preparation of polyuronic acid from cellulose by TEMPO-medi
ated oxidation, Cellulose, 5, 153-164）に記載される方法によるセルロース
の選択的酸化から得ることができた。 必要に応じて、こうして得られたポリマーを、発酵時又は発酵後処理で化学的
及び／又は酵素的手段により改変及び／又は分解した。 ・１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー 例示として、１９９２年３月３日のフランスの特許ＦＲ−Ｂ−２６８８２２２
に記載のプロトコールに従って、Rhizobium melilotiの変異株の発酵により１，
４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーを得た。 ・平均ＤＰ８の１，４−β−Ｄ−グルクロナンオリゴマー これまでの自然なポリマー（即ち、Ｃ２及びＣ３にアセチル化されたグルクロ
ン酸ユニットを少なくとも５０％含む）を、酵素的加水分解に供与した。酵素は
、種々の供給源の（特にアワビの膵臓から抽出した、又は真菌源の）グルクロン
酸分解酵素（Dantas L. et al., Carbohydr. Res., 265 (1994) 303-310）、又
は細菌（Rhizobiaceaeの菌株など）の培地に存在するグルクロン酸分解酵素（Mi
vhaud P., et al., Int. J. Hiol. Macromol. 21 (1997) 3-9）であった。こう
して得られたオリゴ糖の混合物を、基本的処理（ＮａＯＨ）で脱アシル化し、そ
の後ＢｉｏＧｅｌ Ｐ６カラムを用いたゲル透過クロマトグラフィーにより、重
合度（ＤＰ）に基づいて分別した（Dantas L. et al., 上述）。 ・ＤＰ４の１，４−β−Ｄ−マンヌロナン及び１，４−β−Ｄ−グルロナンオリ
ゴマー 開始ポリマーは、マンヌロン酸（Ｍ）及びグルロン酸（Ｇ）の直鎖状共重合体
のアルギン酸塩（ここでのＭ／Ｇ比及び配列様式は供給源に依存した）であった
。そのアルギン酸塩は、調製されるオリゴマーの種類に基づいて選択した。加水
分解は、酵素的方法（オリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナンではアワビ源のアル
ギン酸分解酵素（Heyraud A. et al., Carbohydr. Res., 291 (1996) 115-126）
、オリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナンでは細菌源のアルギン酸分解酵素（１９９
７年３月１１日の特許ＦＲ９７０３２１８））で実施した。ゲル透過クロマトグ
ラフィーでＤＰにより分離された異なるオリゴ糖は、その後上述のHeyraund et
al.,による文献に記載の方法に従って、高速液体クロマトグラフィーでのイオン
クロマトグラフィーにより、それらの構造に応じて精製した。

【００３９】 Ｂ）Rubusの原形質体で誘導された１，３−β−Ｄ−グルカナーゼの反応 実験条件：（１）Rubus fruticosus Lの細胞懸濁液からの原形質膜の調製；（
２）「惹起物質」（１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー及び１，４−β−Ｄ
−ガラクツロナン（４００μg／Ｌ）ポリマー、平均ＤＰ８の１，４−β−Ｄ−
グルクロナンオリゴマー、平均ＤＰ４の１，４−β−Ｄ−マンヌロナンオリゴマ
ー、並びにＤＰ４の１，４−β−Ｄ−グルクロナンオリゴマー（５０nM））の存
在下での２・１０⁶原形質体サンプルｎ個のインキュベーション（又はそれを行
わない）；（３）２０分後に、処理の有無に関わらず原形質体を酵素抽出に供与
した。酵素試験毎、及びインキュベーション期間毎に、蛋白質２μgを用いた。
原形質体の生存性は、６時間の実験期間では９５％を維持した；用いたエバンス
ブルー生死判別試験は、原形質膜の完全性を証明した。 方法：活性（１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ）の測定は、加水分解時に放出さ
れる基質分解単位（substrate-reducing units）（ラミナリンからの分解６量体
）の比色定量（colorimetric dosage）（フェリシアンテスト）に基づいた。発
生した動力学（kinetics）を基にして曲線を描き、それの等式により酵素反応の
速度を計算することができた。試料毎及び実験の「組」毎に、少なくとも２つの
動力学が生じた。一般に、２つの独立した「組」の試料から８つの運動学（kine
matics）が生じる。 結果：原形質体で惹起された酵素活性を、対照の活性への％として表した。結
果を表１に要約する。

【００４０】

【表１】 表１：「惹起物質」（（ａ）１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー（４００μ
g／Ｌ）、（ｂ）平均ＤＰ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン（５０nM）
、（ｃ）１，４−β−Ｄ−ガラクツロナン（４００μg／Ｌ）、（ｄ）平均ＤＰ
４のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン（５０nM）、（ｅ）ＤＰ４のオリゴ１
，４−β−Ｄ−グルクロナン（５０nM））により誘導された反応（１，３−β−
Ｄ−グルカナーゼ）の比較分析

【００４１】 酵素抽出を行わせる蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動分析を実行した
。タバコモザイクが混入するタバコから単離された１，３−β−Ｄ−グルカナー
ゼ（Ori et al. (1990) EMBO J., 9(11), 3429-36）を認識する血清でプリント
（prints）上の蛋白質を標識することにより、ＰＲ蛋白質の存在を確認した。 ナノモル濃度で用いた平均ＤＰ８の１，４−β−Ｄ−グルクロナンオリゴマー
及びポリグルクロナンは、植物の原形質体の１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ活性
を２０分以内にそれぞれ１．５倍及び１．３倍に増幅させた。テストしたその他
の製品のうち、ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナンが最も効果的であっ
た。

【００４２】 ｃ）Rubusの原形質体で誘導された１，４−β−Ｄ−グルカナーゼの反応 実験的惹起条件：上に報告したものと同等である。 方法：活性（１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ）の測定は、加水分解時に放出さ
れる基質分解単位（分解されたセロペンタオース）の上記の比色定量（フェリシ
アンテスト）に基づいた。 結果：結果を表２に示す。

【００４３】

【表２】 表２：「惹起物質」（（ａ）１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー（４００μ
g／Ｌ）、（ｂ）平均ＤＰ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン（５０nM）
、（ｃ）１，４−β−Ｄ−ガラクツロナン（４００μg／Ｌ）、（ｄ）ＤＰ４の
オリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン（５０nM）、（ｅ）ＤＰ４のオリゴ１，４
−β−Ｄ−グルクロナン（５０nM））により誘導された反応（１，４−β−Ｄ−
グルカナーゼ）の比較分析

【００４４】 ナノモル濃度で用いた平均ＤＰ８の１，４−β−Ｄ−グルクロナンオリゴマー
は、植物の原形質体の１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ活性を２０分以内に１．２
倍に増幅させた。

【００４５】 Ｄ）Rubusの原形質体で誘導されたキシログルカンエンドトランスグリコラーゼ
の反応 実験的惹起条件：トリス塩酸緩衝液（pH４．８）１ml中の２・１０⁶個の原形
質体を、惹起物質（５０nM）又はホルモン（５０nM）（ＤＰ４のマンヌロナンオ
リゴマー、又はＤＰ８のグルクロナンオリゴマー、又はジベレリンＧＡ₃）の存
在下（又は非存在下）でインキュベートした。相互作用の２０、４０、６０、１
００、及び１２０分後に、遠心分離により原形質体を回収し、その後酵素抽出に
供与した。 方法：ＸＥＴ活性の測定は、マイクロタイトレーション用プレートのウェルに
おいて４段階で実施した。段階１：受容体（即ち、ネオグリコプロテインＸＸＬ
Ｇ＝ＢＳＡ）の固定化。段階２：反応媒体（トリス塩酸緩衝液（pH７、２５mM）
中のＤＩＧを標識したＸＥＴ酵素抽出用基質（蛋白質１μgと当量）、即ちＸＧ
＝ＤＩＧ）の導入。段階３：ペルオキシダーゼ配列標識抗ＤＩＧ、ペルオキシダ
ーゼ標識抗ペルオキシダーゼによる免疫標識。段階４：クエン酸−リン酸緩衝液
（５０nM、pH５．５）でのペルオキシダーゼ活性の定量。 ペルオキシダーゼ活性は、４９２nmで測定した。実験条件毎に、少なくとも３
つのペルオキシダーゼ活性曲線を描き、３つの原形質体懸濁液を用いて実験を実
施した。ＸＥＴ活性は、９つのペルオキシダーゼ反応速度曲線からの線形回帰に
より推定された曲線の傾き（ΔＡ４９２）により測定した。 略語： ＤＩＧ：ジゴキシゲニン ＸＥＴ：キシログルカンエンドトランスグリコラーゼ、ＸＧ：キシログルカン
ポリマー、ＸＸＬＧ：非フコシル化キシログルカンオリゴマー 結果：結果を図１に示す。 ＤＰ４（ＭＡＮ）のマンヌロナンオリゴマーは、強力なＸＥＴ反応を誘導した
（２０分以内に２．１２倍に増幅）；ＤＰ８のグルクロナンオリゴマー（ＧＬＵ
Ｃ）及びホルモン（ＧＡ３）は、効果が低かった（２０分以内にそれぞれ１．６
２倍及び１．１２倍に増幅）。参照のＸＥＴ活性は、非惹起の原形質体（ＣＯＮ
ＴＲＯＬ）のものであった。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＸＥＴ活性をＹ軸に示し、時間をＸ軸に示している；「△」を用いた曲線は、
ＤＰ４のマンヌロナンオリゴマー（ＭＡＮ）で得られた結果に対応し、「×」を
用いた曲線は、ＤＰ８のグルクロナンオリゴマー（ＧＬＵＣ）で得られた結果に
対応し、「○」を用いた曲線は、ホルモン（ＧＡ３）で得られた結果に対応し、
「□」を用いた曲線は、対照で得られた結果に対応する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エロー，アラン フランス国、エフ−38113 ヴュレ−ヴォ ロワーズ、コート・デュ・ヴェルダレ ６ (72)発明者 セヴェヌ，オリヴィエ イギリス国、ケグワース・ディーイー74・ ２ディーエー、ハイト・ストリート １ Ｆターム(参考） 4H011 AB03 BA01 BB08 BB19 BB21 BB22 DD03 DH10 4H061 AA01 CC60

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＊酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを増幅する活性に関連
   する使用という枠内での植物衛生品として、 ＊並びに／あるいは酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又は酵素１，４
   −β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又はキシログルカンエンドトランスグリコラー
   ゼを増幅する活性に関連する使用という枠内での生物肥料としての、 −以下の式（Ｉ）： 【化１】 （式中、ｎは約３００〜約２５００の整数であり、ＲはＨ又はＣＯＣＨ₃を表す
   ）の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー、 −並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマーから誘導される糖単位の数が約３０未満
   のβ（１−４）鎖グリクロン酸オリゴ糖、 −並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマー又は上述のオリゴ糖誘導体に対応するエ
   ステル及び／又はエーテル、から選択される化合物の使用。
2. 【請求項２】 病原体に対する（特に細菌、ウイルス、真菌からの）植物の
   保護、又は非生物性ストレス（詳細には低温又は高レベルのオゾン）への植物の
   適応など、酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを増幅する活性に関連する使用と
   いう枠内での植物衛生品としての、請求項１に記載されたものから選択される化
   合物の請求項１記載の使用。
3. 【請求項３】 ｎが、約３００〜約２５００の整数であり、ＲがＨを表す、
   式（Ｉ）の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーの、請求項１又は２記載の使
   用。
4. 【請求項４】 ｎが約３００〜約２５００の整数であり、ＲがＨ又はＣＯＣ
   Ｈ₃を表し、ＣＯＣＨ₃の重量％が好ましくは０〜３０．５である、式（Ｉ）の１
   ，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマーの請求項１又は２記載の使用。
5. 【請求項５】 ＤＰが３０未満、好ましくは２〜１５のβ（１−４）鎖グリ
   クロン酸オリゴ糖（オリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン、オリゴ１，４−β−
   Ｄ−マンヌロナン、及びオリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナンなど）の請求項１又
   は２記載の使用。
6. 【請求項６】 以下の： −ＤＰ８及び平均ＤＰ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン、 −ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン、 ―ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナン、から選択されるグリクロン酸オ
   リゴ糖の請求項５記載の使用。
7. 【請求項７】 酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又は酵素１，４
   −β−Ｄ−グルカナーゼ、及び／又はキシログルカンエンドトランスグリコラー
   ゼを増幅する活性に関連する使用という枠内での生物肥料としての、請求項１に
   記載されたものから選択される化合物の、請求項１記載の使用。
8. 【請求項８】 植物の発育の１段階以上の制御（果実の熟成、器官離脱、雌
   ずいの成長、若しくはやくの成熟の制御など）という観点、及び／又は組織の膨
   張（expansion）時の細胞壁の編成の制御という枠内での生物肥料、及び／又は
   植物細胞壁を強化してそれらを環境刺激に適応させる生物肥料としての、請求項
   １に記載されたものから選択される化合物の請求項７記載の使用。
9. 【請求項９】 酵素１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ及び酵素１，４−β−Ｄ
   −グルカナーゼを増幅する活性に関連する使用という観点、つまり植物の発育の
   １段階以上の制御（果実の熟成、器官離脱、雌ずいの成長、又はやくの成熟の制
   御など）という枠内での生物肥料としての、ＤＰが約３０未満、好ましくは２〜
   １５のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナンの、請求項７又は８記載の使用。
10. 【請求項１０】 平均ＤＰ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナンの、請
    求項９記載の使用。
11. 【請求項１１】 酵素キシログルカンエンドトランスグリコラーゼを増幅す
    る活性に関連する使用という観点、つまり組織の膨張時に細胞壁の編成の制御と
    いう枠内での生物肥料、及び／又は植物細胞壁を強化してそれらを環境刺激に適
    応させる生物肥料としての、ＤＰが約３０未満、好ましくは２〜１５のオリゴ１
    ，４−β−Ｄ−マンヌロナンの、請求項７又は８記載の使用。
12. 【請求項１２】 ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナンの請求項１
    １記載の使用。
13. 【請求項１３】 植物衛生品及び／又は生物肥料であって、それらが、 −以下の式（Ｉ）： 【化２】 （式中、ｎは約３００〜約２５００の整数であり、ＲはＨ又はＣＯＣＨ₃を表す
    ）の１，４−β−Ｄ−グルクロナンポリマー、 −並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマーから誘導される糖単位の数が約３０未満
    のβ（１−４）鎖グリクロン酸オリゴ糖、 −並びに／あるいは式（Ｉ）のポリマー又は上述のグリクロン酸オリゴ糖誘導体
    に対応するエステル及び／又はエーテル、 から選択される化合物を少なくとも１つ含むことを特徴とする植物衛生品及び／
    又は生物肥料。
14. 【請求項１４】 請求項１３記載の植物衛生品であって、それらが、式（Ｉ
    ）（式中、ｎは約３００〜約２５００の整数であり、ＲはＨを表す）の１，４−
    β−Ｄ−グルクロナンポリマーを少なくとも１つ含むことを特徴とする、植物衛
    生品。
15. 【請求項１５】 請求項１３記載の植物衛生品であって、それらが、ＤＰが
    ２０未満、好ましくは５〜１５のβ（１−４）鎖グリクロン酸オリゴ糖（オリゴ
    １，４−β−Ｄ−グルクロナン、オリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン、及びオ
    リゴ１，４−β−Ｄ−グルロナンなど）を少なくとも１つ含むことを特徴とする
    植物衛生品。
16. 【請求項１６】 請求項１５記載の植物衛生品であって、それらが、以下の
    ： −ＤＰ８及び平均ＤＰ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナン、 −ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン、 ―ＤＰ４のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルロナン、から選択されるグリクロン酸オ
    リゴ糖を少なくとも１つ含むことを特徴とする植物衛生品。
17. 【請求項１７】 請求項１３記載の生物肥料であって、それらが、ＤＰが約
    ３０未満、好ましくは２〜１５のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン（平均Ｄ
    Ｐ８のオリゴ１，４−β−Ｄ−グルクロナンなど）を少なくとも１つ含むことを
    特徴とする、生物肥料。
18. 【請求項１８】 請求項１１記載の生物肥料であって、それらが、ＤＰが３
    ０未満、好ましくは２〜１５のオリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナン（ＤＰ４の
    オリゴ１，４−β−Ｄ−マンヌロナンなど）を少なくとも１つ含むことを特徴と
    する、生物肥料。