JP2003501006A - 組換え体アデノ随伴ウイルスを製造するための方法、そのために適した手段、および医薬を製造するための使用 - Google Patents

組換え体アデノ随伴ウイルスを製造するための方法、そのために適した手段、および医薬を製造するための使用

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JP2003501006A
JP2003501006A JP2000598652A JP2000598652A JP2003501006A JP 2003501006 A JP2003501006 A JP 2003501006A JP 2000598652 A JP2000598652 A JP 2000598652A JP 2000598652 A JP2000598652 A JP 2000598652A JP 2003501006 A JP2003501006 A JP 2003501006A
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ヘーラー，マルクス
ハレク，ミヒャエル
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メディジーン・アクチェンゲゼルシャフト
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Abstract

(57)【要約】 本発明は組換え体アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を製造するための方法に関しており、ヘルパー構築物およびさらにベクター構築物が適した細胞内に異なった時間に導入され、および好適にはヘルパー構築物は、特にＡＡＶプロモーターを除いて、少なくとも一つのＲｅｐタンパク質が本質上特異的に結合できる核酸配列を含んでおらず、および好適にはベクター構築物はフロップ配向性でＩＴＲ配列を含んでいる。本発明に従って製造された組換え体アデノ随伴ウイルスは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＢ７．２をコードしている追加の核酸が導入されている腫瘍細胞の製造に特に適しており、それは癌処置のための医薬の形で使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は組換え体アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を製造するための方法に関
しており、ヘルパー構築物およびさらにベクター構築物が適した細胞内に異なっ
た時間に導入され、および好適にはヘルパー構築物は、特にＡＡＶプロモーター
を除いて、少なくとも一つのＲｅｐタンパク質が本質上特異的に結合できる核酸
配列を含んでおらず、および好適にはベクター構築物はフロップ配向性でＩＴＲ
配列を含んでいる。本発明に従って製造された組換え体アデノ随伴ウイルスは、
ＧＭ−ＣＳＦおよびＢ７．２をコードしている追加の核酸が導入されている腫瘍
細胞の製造に特に適しており、それは癌処置のための医薬の形で使用できる。
【０００２】 例えば、腫瘍ワクチンとして使用されるであろう治療的に活性な細胞の遺伝子
修飾のためには、細胞の遺伝子修飾を起こす核酸（即ち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）
を導入するための適した方法が必要である。導入されるべき核酸は、たとえそれ
ら自身は遺伝子として機能しなくとも（例えば、”アンチセンス核酸”の場合）
、しばしば”導入遺伝子”と称されている。”裸の核酸”の直接遺伝子導入のほ
かにも、遺伝子が修飾されたウイルスもまた遺伝子導入に適していることが証明
されている。現在のところ、レトロウイルス、アデノウイルスまたは特にアデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ）が、遺伝子導入のための導入遺伝子の担体（ウイルスベ
クター）として使用できるように遺伝子修飾されている。適したウイルスベクタ
ーを開発する場合に必須な点は、遺伝子治療における該ベクターの応用が安全で
あることである。この理由のため、一般的に”複製不全”ウイルス、即ち、細胞
に感染でき、および細胞内へ導入遺伝子を導入することができるが、しかし、該
細胞内ではそれら自身は増殖できないウイルスが開発された。このことは、例え
ば、ウイルスの増殖に重要な遺伝子（例えば、構造タンパク質をコードしている
遺伝子）を欠失させ、および適切にはその場所に導入遺伝子を取り込ませること
により達成される。遺伝子治療での使用に適した多量の増殖不能ウイルスの製造
には、細胞中の増殖不能ウイルスの欠陥を補償する”ヘルパー遺伝子”が必要と
される。
【０００３】 例えばＡＡＶは、ゲノム内へ組み込まれたプロウイルスの形で存在するかまた
は、溶菌感染を起こすヒトウイルスである。従って、ＡＡＶは哺乳動物細胞の一
般的形質導入ベクターとして興味を持たれている。ＡＡＶはパルボウイルスファ
ミリーの一員であり、現在のところ６つの異なった血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−
２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５およびＡＡＶ−６が知られている。例
えば、ＡＡＶ−２は約４．７キロ塩基（ｋｂ）長の一本鎖直線状ＤＮＡを含んで
いる。３つのウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）から構成され
るウイルス粒子は、一つの極性（＋）かまたは他の極性（−）を持つウイルスＤ
ＮＡ鎖を含んでいる。
【０００４】 ウイルス形質導入ベクターとしてＡＡＶを使用する際には、一般的に比較的多
量の組換え体ＡＡＶ粒子が必要とされる。比較的多量のｒＡＡＶ粒子を製造する
ために都合の良い方法は、真核細胞の混合物の形の２つの組換え体ＡＡＶプラス
ミドでのコトランスフェクションおよびヘルパーウイルスの感染である（Ｃｈｉ
ｏｒｉｎｉ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ，６，１５３１）。第一の組換え体ＡＡＶプラスミドは２つのＩＴＲ領
域と境を接する（即ち、隣接する）導入遺伝子（単数または複数）を含んでいる
。本発明に従えば、該ＡＡＶプラスミドもまたベクター構築物と称される。第二
の組換え体ＡＡＶプラスミドは粒子の生成に必要とされるＡＡＶ遺伝子（ｒｅｐ
およびｃａｐ遺伝子）を含んでいる。本発明に従うと、このベクターもまたヘル
パー構築物と称される。ヘルパー構築物中のＩＴＲ領域の不在はＡＡＶ粒子内へ
のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子のパッケージングを、従って、望まれない野生型Ａ
ＡＶの形成を防止するはずである。その後、組換え体ＡＡＶ構築物およびヘルパ
ーウイルスの両方に対して許容性、即ち受容可能である適した細胞は二つのＡＡ
Ｖ構築物でトランスフェクトされる。トランスフェクトされたパッキング細胞を
アデノウイルスで感染させた後にＡＡＶ遺伝子が発現され、導入遺伝子ＤＮＡは
複製され、組換え体ＡＡＶ粒子（ｒＡＡＶ粒子）はパッケージングされ組み立て
られる。ｒＡＡＶ粒子は両側にＩＴＲ領域が隣接する導入遺伝子を、一本鎖ＤＮ
Ａの形で含んでいる。同時に、ヘルパーウイルスが該細胞中で複製され、ヘルパ
ーウイルスがアデノウイルスの場合、一般には数日後に感染細胞の溶解および死
が生じる。形成されたｒＡＡＶ粒子およびヘルパーウイルスはこの状況において
部分的に細胞培養上清に放出されるか、または溶解した細胞内に残存する。哺乳
類細胞のための一般的導入ベクターとしてのＡＡＶ使用についての総説は例えば
、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．によるＣｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｇｏｙ １５８，９７（１９９２
）に与えられている。
【０００５】 ｒＡＡＶ粒子産生の本質的欠点は野生型ＡＡＶ形成の付随、およびヘルパーウ
イルスの存在である。組換え体ＡＡＶ粒子の使用の安全性に関して（例えば、遺
伝子治療において）、以下のような理由で調製試料はヘルパーウイルスおよび野
生型ＡＡＶを本質的に含んでいないことが必要である：ヘルパーウイルスとして
のアデノウイルスは細胞溶解性であり、アデノウイルスタンパク質に対する細胞
性免疫応答を起こす。加えて、アデノウイルスは非特異的かぜ徴候を惹起するの
でヒト病原体である。複製−許容野生型ＡＡＶは、例えば、アデノウイルスまた
はＨＳＶのようなヘルパーウイルスの存在下で増殖でき、病原性であるわけでは
ないが、生物体中で拡散できる。加えて、そのような条件下でｒｅｐおよびｃａ
ｐ遺伝子が発現されるであろうし、それは順に同一の細胞中でｒＡＡＶゲノムを
増幅し、新しいｒＡＡＶ粒子内へパッケージングする。このことはｒＡＡＶ遺伝
子が全生物体に拡散することを可能にする。
【０００６】 従って、本発明の目的は野生型ＡＡＶの形成を本質的に防止する方法および適
した構築物を提供することである。 異なった時間に一つまたはそれ以上のヘルパー構築物（第一の構築物）および
ベクター構築物（第二の構築物）での細胞のトランスフェクション（ヘルパー構
築物またはベクター構築物のどちらが最初にトランスフェクトされるかに関係な
く）は、両方の構築物の同時コトランスフェクションと同一のパッケージング効
率を本質的に達成できることが見いだされたが、それは二つの構築物の相同的ま
たは非相同的組換えの減少によって、野生型ＡＡＶ形成の可能性を著しく、特に
は約１０分の１に減少させることが可能である。好適には、細胞は最初にヘルパ
ー構築物、および次にベクター構築物でトランスフェクトされ、それは驚くこと
にパッケージング効率を約１．５−３倍増加させることが可能であった。
【０００７】 従って、本発明は組換え体アデノ付随ウイルスを製造する方法に関しており、
そこでは異なった時間に、少なくとも一つのＲｅｐタンパク質（好適にはＲｅｐ
６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０、特にＲｅｐ６８およびＲｅｐ５２）および
Ｃａｐタンパク質をコードしている核酸配列を含んでいる一つまたはそれ以上の
ヘルパー構築物、およびまたＡＡＶとは異種でありおよびＩＴＲ配列が隣接して
いる一つまたはそれ以上の核酸を含んでいるベクター構築物が適した細胞内へ導
入される。
【０００８】 ここでｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は一つおよび同一のヘルパープラスミド上に
、または複数のヘルパープラスミド上に位置しているであろう（例えば、一つの
ヘルパープラスミドは少なくとも一つのＲｅｐタンパク質をコードしており、第
二のヘルパープラスミドはＣａｐタンパク質をコードしている）。複数のヘルパ
ープラスミドを使用する利点は、望まれないｗｔＡＡＶを与えるにはすべてのプ
ラスミドの組換えに複数の組換え（例えば、ヘルパープラスミド間および組換え
ヘルパーおよびベクタープラスミド間の別の組換え）が必要とされることである
。複数の必要とされる組換えはｒＡＡＶベクターのパッケージング間の望まれな
いｗｔＡＡＶの発生をさらにより起こりそうもないようにしている。
【０００９】 適した細胞は一般的には該構築物に許容的である細胞であり、好適には哺乳類
細胞、例えば、ＣＯＳ−７、ヒーラー、Ｃ３３ａまたは２９３細胞である。構築
物を導入するために適した方法は、例えば、古典的または修飾形（Ｃｈｅｎ，Ｃ
．＆ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７（
８），２７４５）のリン酸カルシウムトランスフェクション法である。修飾リン
酸カルシウムトランスフェクション法の利点は、本発明の方法と組み合わせると
１００％に及ぶトランスフェクトされた細胞が得られる非常に高いトランスフェ
クション効率を再現性よく達成することが可能であることである。
【００１０】 本発明では、核酸とは一般的に、ＡＡＶカプシドの形にパッケージングするこ
とができ、および適した細胞内へ導入されるのに都合がよいＤＮＡまたはＲＮＡ
およびそれらの変異体を意味している。変異体の例は、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ
，Ｅ．＆ Ｐｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
，９０，５４３−５８４，Ｎｏ．４、に掲げられている。
【００１１】 好適な態様において、細胞は第一の構築物を導入した後、および第二の構築物
を導入する前に精製される。精製は例えば、培地を交換することによる簡単な様
式で実施されるであろう。しかしながら、内部移行されていない第一の構築物の
残りを実質的に完全に除去するため、第二工程の前に細胞を溶液、例えば、ＰＢ
Ｓ緩衝液（リン酸−緩衝化塩化ナトリウム溶液）ですすぐほうが好都合である。
【００１２】 ｒＡＡＶ粒子はその後、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシ
ニアウイルスのような適したヘルパーウイルスを添加することによりまたはそれ
らのヘルパー遺伝子の存在下で生成される。アデノウイルスのヘルパー遺伝子は
Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４、Ｅ２ＡおよびＶＡである。もしくは、例えば、構成的に
Ｅ１Ａ細胞を発現する２９３細胞のように、ヘルパー遺伝子産物を構成的に発現
する細胞を使用することも可能である。ここで遺伝子産物Ｅ１ＢおよびＥ４はＡ
ＡＶ ｍＲＮＡ蓄積を促進するために働き、遺伝子産物Ｅ２ＡおよびＶＡはＡＡ
Ｖ ｍＲＮＡスプライシングおよび翻訳を促進するために働いている。個々のヘ
ルパー遺伝子の代わりにヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスＡｄ−５）
を使用することは、ヘルパーウイルス存在下でのＡＡＶ増殖の本来の状態へおそ
らく対応しており、それ故、組換え体ＡＡＶ粒子のパッケージングが非常に効率
がよいので特に都合がよい。
【００１３】 個々の工程間の時間間隔は、好適にはおよびお互いに独立して、少なくとも約
１時間、好適には少なくとも約１２時間、特には少なくとも約１日、とりわけ約
１から２日である。その後、ｒＡＡＶ粒子がＤＭＥＭのような無血清培地中でｒ
ＡＡＶを損失することなく都合よく製造でき、その結果、本質的にタンパク質の
夾雑がないので、例えば、１０％血清分画からの、ｒＡＡＶ粒子のさらなる精製
における精製工程を省くことができる。
【００１４】 細胞の生成時間は約４から６日であり、アデノウイルス媒介細胞溶解のため、
ｒＡＡＶベクターは約３日後から上清中に放出される。しかしながら、細胞中に
ｒＡＡＶ粒子の一部が観察される可能性も常に存在する。培地中に放出されるｒ
ＡＡＶカプシドの比率は一般に９０％までであり、少なくとも約１０％は細胞中
に残存している。それ故、細胞および上清の両方からｒＡＡＶ粒子を採取および
精製するのが有利である。
【００１５】 続いての精製は、例えば、ＣｓＣｌ濃度勾配により（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ，Ｊ．
Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５），上記文献）または好適には濾過の助けをかりて
（ＷＯ ９８／３９２０を参照されたい）実施されるであろう。精製後、本質的
にヘルパーウイルスを含んでいないｒＡＡＶ粒子の調製試料が得られる。ｒＡＡ
Ｖ粒子は次に限外濾過法により濃縮でき、保存される。
【００１６】 本発明の方法に使用するためのヘルパー構築物（単数または複数）はＲｅｐタ
ンパク質および／またはＣａｐタンパク質の少なくとも一つをコードしている核
酸配列を含んでいる。既知のＲｅｐタンパク質はＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅ
ｐ５２およびＲｅｐ４０である。既知のＣａｐタンパク質はＶＰ１、ＶＰ２およ
びＶＰ３である。それらの遺伝子およびＩＴＲ配列は野生型ＡＡＶから単離でき
、それらは一般にクローンの形で入手可能である。例えば、クローンｐＳＭ６２
０はＳａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，２０７７に、クローンｐＡＶ１はＬａｕｇ
ｈｌｉｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｇｅｎｅ，２３，６５に、または
クローンｓｕｂ２０１はＳａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６１，３０９６に記載されている。
【００１７】 本発明の好適な態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子はそれらの天然のプ
ロモーターｐ５、ｐ１９およびｐ４０により制御されている。天然に存在するＡ
ＡＶプロモーターがＲｅｐ結合部位を含んでいるのみでなく、Ｒｅｐ結合部位は
また構築物の別の部分、例えば、ベクターｐＵＣ１９またはベクターｐＢＲ３２
２のベクター主鎖中に存在することもわかっており（ＭｃＣａｒｔｙ，Ｄ．Ｍ．
ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８，４９８８）、その結合部位
が非相同的組み換え、従って野生型ＡＡＶの形成の原因となっているのであろう
。
【００１８】 大きなＲｅｐタンパク質、例えば、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８はタンパク質
複合体を形成することができ、それは同時に複数のＲＢＳ配列を結合することが
できる。Ｒｅｐのエンドヌクレアーゼおよびヘリカーゼ活性のため、ＲＢＳ部位
領域中の二つの核酸配列の組み換えが可能である。
【００１９】 従って本発明は、少なくとも一つのＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質
をコードしている核酸配列を含んでいる一つまたはそれ以上の（好適には二つ）
ヘルパー構築物、および好適には少なくとも一つのＲｅｐタンパク質（好適には
Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８）が本質的に特異的に結合できる核酸配列
を含んでいない（ＡＡＶプロモーターを除いて）ヘルパー構築物（単数または複
数）にも関している。ＲＢＳ共通配列は例えば、ＭｃＣａｒｔｙ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ
ａｌ．（１９９４），上記文献、に記載されており、ＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣ
ＴＣＡＣＴＧＡである。
【００２０】 Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）へのＲｅｐタンパク質の結合は、例えば、ｒｅｐプ
ロモーターｐ５およびｐ１９における三つの既知のＲＢＳが、個々にまたは種々
の組み合わせで突然変異を起こされることにより（好適にはこの結果としてＲｅ
ｐアミノ酸配列を変えることなしに）減少または防止される。
【００２１】 特に好適な態様において、Ｒｅｐタンパク質はＲｅｐ６８、Ｒｅｐ５２および
Ｒｅｐ４０であるが、Ｒｅｐ７８ではなく、なぜなら、驚くべきことにＲｅｐ５
２、Ｒｅｐ４０および三つのＣａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タン
パク質のほかにＲｅｐ６８のみの追加の発現がＡＡＶベクターのパッケージング
十分であることが発見されている。該Ｒｅｐ７８欠失ヘルパー構築物の利点は、
細胞のパッケージングに最も毒性があるこのＲｅｐタンパク質が全く発現されな
いことである。さらに、Ｒｅｐ７８はＲｅｐタンパク質の間でも例えば、転写の
ような細胞過程を阻害する最も強い活性を持っていることが発見された。それ故
、このヘルパー構築物を使用すると、Ｒｅｐ７８が欠けているため、パッケージ
ング効率を増加させることが可能である。同様に、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク
質を発現する安定な細胞株の生成が、最も毒性のあるタンパク質Ｒｅｐ７８が発
現されないので単純化される。Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８の両方が天然の系で
はプロモーターｐ５により発現される。このＲｅｐ７８欠失ヘルパー構築物の使
用は、Ｒｅｐ７８と比較して、Ｒｅｐ６８がアデノウイルス感染細胞においてＡ
ＡＶプロモーターｐ１９およびｐ４０のより強いトランス活性化を示すのでさら
に都合がよい（Ｈｏｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，
５４８５−５４９６；Ｗｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
７１，８４３７−８４４７）。その結果、このＲｅｐ７８欠失ヘルパー構築物を
使用すると、より小さいＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ４０およびＲｅｐ５２およびそ
のカプシドタンパク質の発現が増加し、所望のより高いパッケージング効率が得
られる。最後に、Ｒｅｐ７８欠失ヘルパー構築物のクローニングに必要とされる
ｒｅｐ遺伝子またはｒｅｐ遺伝子の一部の重複のため、ＡＡＶ遺伝子の過大な大
きさは、ベクター構築物での組換え後にｗｔＡＡＶの形成を防止する。
【００２２】 本発明の範囲内で、トランスフェクトされた細胞の溶解および死を生じる過渡
的なトランスフェクション実験だけでなく、宿主細胞のゲノム内へのヘルパー構
築物の標的化または無作為組み込みにより達成されるＣａｐおよびＲｅｐタンパ
ク質の永続的な（＝安定な）発現にも本発明のヘルパー構築物、特にＲｅｐ７８
欠失ヘルパー構築物を使用することが可能である。ここでも再び、Ｒｅｐ７８の
毒作用のため、タンパク質Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０を発現する
ことに特別な優越性が得られる。
【００２３】 すでに説明した過渡的および安定なトランスフェクションのほかに宿主細胞内
へ本発明のヘルパー構築物を導入する別の可能性は、ヘルパー構築物担体（vehi
cle：ビヒクルともいう）としてウイルスを使用する感染である。このためには
、ウイルスは宿主細胞とその細胞表面を経て相互作用し（付着）、その後ウイル
ス中にパッケージングされている核酸、特に本発明のヘルパー構築物および特に
好適にはＲｅｐ７８欠失ヘルパー構築物が宿主細胞内へ取り込まれる（挿入）。
例えば、Ｅ１Ａ捕捉細胞中でＥ１Ａ領域を本発明のヘルパー構築物と置き換える
ことにより組換えアデノウイルスを生成させることが可能である。
【００２４】 さらに好適な態様において、ヘルパー構築物（単数または複数）は、少なくと
も一つのＲｅｐタンパク質をコードしている核酸配列およびＣａｐタンパク質を
コードしている核酸配列間に、ＡＡＶカプシド内へのヘルパー構築物のパッケー
ジングを害する追加の核酸配列を含んでいる。ここで追加の核酸配列はＡＡＶ構
築物の全体の長さを増加するように働き、その結果、効率的なパッケージングが
害され、またはさらには妨げられる。パッケージングの阻害は一般に、もし４６
８０塩基対の野生型ＡＡＶ ＤＮＡサイズを著しく超過した場合に達成される。
このことは、もし追加の核酸配列が少なくとも約３００ヌクレオチド、特に少な
くとも約５００ヌクレオチド、特別には少なくとも約６００から約７００ヌクレ
オチド長であれば好適に達成される。
【００２５】 野生型ＡＡＶ中でのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の重複のため、該追加の核酸を
持っているヘルパー構築物の調製試料は例えば以下のように調製できる：第一の
工程において、Ｒｅｐ Ｃ末端および、ｃａｐ配列およびｐ４０に必須なすべて
の制御配列を含んでいるＡＡＶ ｐ４０プロモーターを含む１６９１から２３２
８までのＡＡＶ配列が複製され、スプライスされたｒｅｐ体のための終止コドン
の後ろにクローン化される（２３２９位）。その後、ｒｅｐ遺伝子中のｐ４０プ
ロモーターがＲｅｐアミノ酸配列を変化させることなく破壊される。このことは
ｐ４０ ＴＡＴＡボックスの突然変異により保証されうる。全体として、Ｒｅｐ
およびＣａｐアミノ酸配列を変化させることなく以下のＡＡＶヌクレオチドがク
ローニング工程のために改変できる：１６９３（Ｔ→Ａ）、１６９４（Ｔ→Ｇ）
、２３３０（Ｇ→Ｃ）、２３３１（Ｇ→Ｔ）、２３３２（Ｇ→Ａ）、１６２５（
Ｃ→Ｔ）、１６２８（Ａ→Ｇ）、１８２６（Ａ→Ｃ）、１８２７（Ａ→Ｔ）およ
び１８２８（Ｇ→Ｃ）。
【００２６】 ｒＡＡＶ生成間の野生型ＡＡＶ形成の可能性をさらに減少させるためには、ベ
クター構築物に相同的であり、相同的組換えを可能にする核酸配列を含んでいな
いヘルパー構築物を調製するのが好都合である。このことは、例えば、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により野生型ＡＡＶからＡＡＶヌクレオチド１９０か
ら１０６０を増幅することにより実施されるであろう。これに関連して、５’プ
ライマーは、１９９位に単一のＸｂａＩ切断部位が導入されるように選択される
べきである。そうするとＰＣＲ断片をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同様
に切断されているベクター（例えば、ｐＵＣ１９）内へクローン化することが可
能である。ＡＡＶゲノム中の１９９位は、すべての重要なｐ５プロモーター要素
がヘルパープラスミド中に存在することを保証する。その後、野生型ＡＡＶはＢ
ａｍＨＩおよびＳｎａＢＩで切断され、挿入断片は次に中間体のＢａｍＨＩおよ
びＳｍａＩ位内へクローン化される。この方法で、例えば、ｐＵＣ”Ｒｅｐ／Ｃ
ａｐ”と称されるヘルパー構築物を製造することが可能である。このヘルパー構
築物はＡＡＶ配列の２０１から４４９７を含んでおり、一方ベクター構築物はＡ
ＡＶ配列の１から１９１（左ＩＴＲ）および４４９８から４６７１（右ＩＴＲ）
を有する。このようにして、もはや構築物中では相同的ＡＡＶ配列重複は存在し
ない。
【００２７】 さらに好適な態様において、例えばｐＵＣ”Ｒｅｐ／Ｃａｐ”において、ＡＡ
Ｖ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の至適発現に必要とされないＡＡＶゲノム３’末
端の約３７塩基まで（好適にはＡＡＶ−２塩基４４６１−４４９７）を欠失させ
ることが可能である。本発明に従うと、生じたヘルパー構築物はｐＵＣ”Ｒｅｐ
／Ｃａｐ”Δ３７と称され、２０１から４４６０位の最小化ＡＡＶ配列を含んで
いる。
【００２８】 Ｒｅｐ７８−欠失ヘルパー構築物ｐＵＣ”Ｒｅｐ６８，５２，４０Ｃａｐ”（
ＲＢＳ）Δ３７（図６参照）はイントロン配列の欠失を含んでいるヌクレオチド
２０１からヌクレオチド４４９７まで、およびヌクレオチド６５８からヌクレオ
チド４４６０までのＡＡＶ配列を細菌発現プラスミドｐＵＣ１９内へクローニン
グすることにより調製され、その過程において本配列のＲｅｐタンパク質のため
の結合部位が削除された。この戦略を応用することにより、転写終止のための自
身のポリ（Ａ）配列を持っている二つのｒｅｐ遺伝子およびまた少なくとも二つ
のｃａｐ遺伝子が、各々場合において、交互に配置される。第一の部分（ＡＡＶ
配列ヌクレオチド２０１からヌクレオチド４４９７）から出発するとＲｅｐタン
パク質Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０、およびまたＣａｐタンパク質ＶＰ２および
ＶＰ３が発現でき、一方、第二の部分（ＡＡＶ配列ヌクレオチド６５８からヌク
レオチド４４６０）から出発するとＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４
０、およびまたＣａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が発現される。従
って、全体として、Ｒｅｐ７８を除くすべてのＡＡＶ ２−タンパク質がコード
化されている。
【００２９】 同様に、Ｒｅｐ７８−欠失ヘルパー構築物ｐＵＣ”ΔＲｅｐ７８Ｃａｐ”（Ｒ
ＢＳ）Δ３７（図７参照）は該ＡＡＶ配列（ｎｔ ２０１−２３１０；ｎｔ ６
５８−４４６０、イントロン配列の欠失を含んでいる）の細菌発現プラスミドｐ
ＵＣ１９内への同様なクローニングにより調製された。その過程においてプラス
ミド配列中のＲｅｐタンパク質のための結合部位が再び削除された。この方法に
おいて、ｒｅｐ遺伝子は部分的に二重にされた。この方法により得られたヘルパ
ー構築物はただ一つのポリ（Ａ）配列しか含んでいないので、すべてのｍＲＮＡ
転写体は同一の３’末端を持っている。第一の部分（ＡＡＶ配列ヌクレオチド２
０１からヌクレオチド２３１０）から出発するとＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ６８お
よびＲｅｐ４０が発現でき、一方、第二の部分（ＡＡＶ配列ヌクレオチド６５８
からヌクレオチド４４６０）から出発するとＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２および
Ｒｅｐ４０、およびまたＣａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が発現さ
れる。このベクター構築物もまた、全体として、Ｒｅｐ７８を除くすべてのＡＡ
Ｖ ２−タンパク質をコードしている。
【００３０】 本発明に従うと、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現を制御している同種の
ＡＡＶプロモーターを異種のプロモーターおよび／またはエンハンサーで、お互
いに独立して置き換えることも可能である。以下により詳細に説明されるように
、一般的に、ベクター構築物（導入遺伝子）中の異種核酸配列の発現も制御する
同一のプロモーターまたはエンハンサーを使用することが可能である。特にヒー
ラーおよびＣ３３ａ細胞で特に高い活性を持っているＨＰＶ１８エンハンサーが
特に他より優位である（Ｂｕｔｚ，Ｋ．＆ Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，Ｆ．（
１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７，６４７６−６４８６；Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙ
ｌｅｒ，Ｆ．＆ Ｂｕｔｚ，Ｋ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，１
０，１３４−１４１）。
【００３１】 本発明に従うと、本発明の方法に最適化され、および第一に複製タンパク質を
コードしているｒｅｐ遺伝子および第二に外殻（coat:コ−トともいう）タンパ
ク質をコードしているｃａｐ遺伝子を含むヘルパー構築物が得られる。本発明の
特に好適なヘルパー構築物は、ＩＴＲ配列を含んでいないので複製不適格である
。加えて、ヘルパー構築物は前に記載された都合の良い修飾のため、野生型ＡＡ
Ｖの形成を減少または本質的に防止することが可能なように最適化されている。
しかしながら、一般的にはＡＡＶプロモーターからのＩＴＲ配列の分離はヘルパ
ー構築物におけるｒｅｐおよびｃａｐ発現の脱制御を導く。
【００３２】 都合がよいことに、ベクター構築物中の修飾は、本質的にベクター構築物のパ
ッケージング効率に負の影響を及ぼすことができないように、しかし逆にベクタ
ー構築物を安定化するように実施され、望ましくない組換えを減少または本質的
に避け、および／または組み込まれた導入遺伝子の発現率の増加を導いている。
【００３３】 １４５塩基対の長さであるＡＡＶ−２ ＩＴＲ配列は、大きなパリンドローム
（Ａ）および二つのより小さい内部パリンドローム（ＢおよびＣ）から成ってい
ることが知られている。ＩＴＲ配列の最初の１２５塩基はＴ形のヘアピン構造を
形成している（例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２），上記文献、を参
照されたい）。末端配列は二つの内の一つのコンフィギュレーションで存在する
であろう。第一のコンフィギュレーションは”フリップ”とも称され、Ｂパリン
ドロームが３’末端により近く、および第二のコンフィギュレーションは”フロ
ップ”とも称され、Ｃパリンドロームが３’末端により近い（Ｓｒｉｖａｓｔａ
ｖａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５（２），５５５も参
照されたい）。
【００３４】 驚くことに、ベクター構築物中の両方のＩＴＲ配列のフロップ−フロップ配向
がフリップ−フロップまたはフリップ−フリップ配向よりも明白により安定であ
ることが発見された。加えて、フロップ−フロップ配向はフリップ−フロップ配
向よりも望ましくない組換えをより起こしにくい。
【００３５】 それ故本発明はさらに、ＡＡＶに対して異種であり、およびＩＴＲ配列（ＩＴ
Ｒ配列はフロップ配向で存在している）が隣接している一つまたはそれ以上の核
酸を含んでいるベクター構築物に関している。
【００３６】 好適な態様において、異種核酸の発現はＡＡＶに対して異種であるプロモータ
ーにより制御されている。驚くべきことに、発現率は３’に位置しているＩＴＲ
配列に向かっている異種プロモーターの配向により増加できることが発見された
。
【００３７】 適したプロモーターはＡＡＶに対して同種、および好適には異種であるすべて
のプロモーターである。ＡＡＶに対して同種のプロモーターはプロモーターｐ５
、ｐ１９および／またはｐ４０であり、ＡＡＶに対して異種の適したプロモータ
ーは真核細胞、好適には哺乳類細胞中で活性であるすべての構成的に活性なまた
は誘導可能なプロモーターである。例えば、これらにはＳＶ４０−プロモーター
（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，３８２２）
、ＳＶ４０ｏｒｉ−エンハンサー、ＣＭＶ−プロモーター／エンハンサー（Ｖｉ
ｎｃｅｎｔ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ，９０，３５３
）またはＬＴＲ−プロモーター（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｓ．（１９８８）Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，３９８８）が含まれる。特に好適であるのはＣ
ＭＶ−プロモーター／エンハンサーである。
【００３８】 ヘルパー構築物の助けによるＡＡＶカプシド内へのベクター構築物の有効なパ
ッケージングのためには、ベクター構築物の大きさは実質的に約４７００塩基対
±５％以下でも以上でもないものが都合がよい。例えば、プラスミドｐＡＶ２（
Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）上記文献）を制限エンド
ヌクレアーゼＢｇｌＩＩで切断し、これにより得られたＡＡＶ配列をベクターｐ
ＵＣ１９（Ｙａｎｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｇｅ
ｎｅ，３３，１０３）内へサブクローンすることが可能である。このことは例え
ば、ｐＵＣ１９をＢａｍＨＩで切断し、それをｐＡＶ２のＢｇｌＩＩ断片と直接
的に結合することにより実施される。ＩＴＲの対照配列決定は、左ＩＴＲは２位
での塩基交換（Ｔ→Ｇ）を除いて完全に無傷であるが、一方、右ＩＴＲは８つの
末端塩基が欠けていることを示している。しかしながら、この欠陥は構築物が２
つの無傷のＩＴＲを有することができるようにＡＡＶゲノムの複製の間に修復で
きるので、構築物の複製能力に不利な影響を及ぼさない。
【００３９】 その後、ＡＡＶ配列１９２から４４９７が除去でき、ＣＭＶポリＡ発現カセッ
トで置き換えられうる。この目的のためには、例えば、ベクターｐＣＩ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＣＭＶ−プロモー
ター／エンハンサーの前またはポリＡ部位の後ろに、二本鎖突然変異発生により
ＰｐｕＭＩおよびＥｃｏＲＶ切断部位を導入し、ＣＭＶポリＡ発現カセットを切
り出し、ＰｐｕＭＩおよびＳｎａＢＩで切断したベクター構築物内へ直接的にク
ローン化する。発現カセットの最適な配向は、例えば、ルシフェラーゼレポータ
ー遺伝子の助けを借りて決定できる。すでに前に説明したように、異種プロモー
ター（特にＣＭＶ−プロモーター／エンハンサー）が右ＩＴＲに向いて、即ち３
’に位置しているＩＴＲ配列に向いているならば、発現率が最も高い。
【００４０】 本発明のヘルパー構築物および／またはベクター構築物は、本発明の方法にお
ける組換えたＡＡＶ粒子の製造に特に良好に適している。以下の方法は特に好都
合であることが証明された： 第一に、適した細胞、例えばヒーラー細胞を約１−２ｘ１０8細胞の好適な量で
約１０％の血清を含む培地に播種する。好適には次の日、特にリン酸カルシウム
トランスフェクション法により細胞をヘルパー構築物でトランスフェクトする。
細胞は次に、好適には次の日、緩衝液（例えば、ＰＢＳ緩衝液）ですすぎ、約１
０％の血清を含む新しい培地を加える。同時にまたはすぐその後、細胞を好適に
は同量のベクター構築物でトランスフェクトする。しばらくした後、好適には次
の日、細胞にヘルパーウイルス（好適にはアデノウイルス、例えば、Ａｄ−５）
を感染させる。好適には次の日、培地を無血清培地に再び置き換える。次に細胞
および培地上清からｒＡＡＶ粒子を採取する前に細胞をインキュベートする（例
えば、さらに３日）。
【００４１】 本発明の方法の重要な利点は、偽野生型ＡＡＶを与える両方の構築物の組換え
の実質的減少および１．５−３倍が達成できるパッケージング効率の改良である
。ｒＡＡＶ粒子の収量は約１０12から１０13であり、導入ｒＡＡＶ粒子の収量は
少なくとも１０9−１０10である。本発明の方法の別の重要な利点は、特に混合
物中に望まれないタンパク質分画を含む血清含有培地が本質的に存在しないので
（無血清培地との交換による）、続いてのｒＡＡＶ粒子の精製が実質的により容
易であることである。
【００４２】 本発明に従うと、本質的に任意のコードおよびまた非コード核酸配列の異種核
酸配列を使用することが可能である：例えば、医薬として活性なタンパク質、例
えば、エリスロポエチン（例えば、ＥＰ ０ １４８ ６０５ Ｂ１を参照され
たい）またはインシュリン（例えば、ＥＰ ０ ００１ ９２９ Ｂ１を参照さ
れたい）をコードしている遺伝子または血液凝固因子、インターフェロン、サイ
トカイン、ホルモン、増殖因子、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ｐ
５３またはγインターフェロン（例えば、ＷＯ９４／１６７１６を参照されたい
）、抗生物質などをコードしている遺伝子、または非コード核酸の例としては”
アンチセンスオリゴヌクレオチド”。複製不全ベクター構築物内へ一つまたはそ
れ以上の異種核酸配列（単数または複数）を導入することは他よりも優位である
。複製不全ベクターを使用することは、細胞においてヘルパーおよびベクター構
築物の飽和濃度近くで働かせることを含んでいる。ヘルパーおよびベクター構築
物の好適な量の例は約２−３ｘ１０8細胞に対して約３．５−４ｍｇの構築物で
ある。
【００４３】 しかしながら、例えば上記のタンパク質のような医薬として活性なタンパク質
をコードしている遺伝子を使用する場合、一般的に、特にヘルパープラスミドと
して、例えば、ＳＶ４０ｏｒｉを有する自己複製構築物を使用することが可能で
ある（好適には選択されたトランスフェクション法では個々の構築物での飽和が
不可能である場合）。ＳＶ４０ｏｒｉ核酸配列（Ｍｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（
１９８１）Ｃｅｌｌ，２７，２７９−２８８）およびＳＶ４０ Ｔ抗原をコード
している核酸配列（Ｇｅｒａｒｄ，Ｒ．Ｄ．＆ Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．（１９８
５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．，５，３２３１−３２４０）の両方を含んでい
る構築物を使用するのが特に好適であり、その結果、例えば、ＣＯＳ−７のよう
な安定にＴ抗原を発現している細胞から独立して複製が達成される。同様に、例
えば、ＥＢＶ（エプスタインバールウイルス）のウイルス複製開始点ｏｒｉＰま
たはＥＢＶ複製タンパク質ＥＢＮＡのための発現カセットのようなプラスミド複
製のための他の既知配列もまたヘルパーおよび／またはベクタープラスミド内へ
取り込ませることが可能である。
【００４４】 例えば、ＷＯ９８／０６７４６は、例えば、ＧＭ−ＣＳＦを発現している遺伝
子修飾されたメラノーマ細胞株がワクチンとして使用できたことを開示している
。ＷＯ９４／１６７１６は少なくとも一つのサイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳ
ＦまたはＢ７および／または腫瘍関連抗原を使用する癌治療における組換え体ウ
イルスの使用を開示している。ここでＢ７遺伝子とは”Ｂ７．１”遺伝子を意味
している。ＷＯ９４／０４１９６は、サイトカインおよびさらにＢ７（ここでも
Ｂ７．１を意味している）をコード化した、腫瘍治療のためのＤＮＡ構築物を開
示している。ＷＯ９２／０００９２はＢ７．１をコードする核酸配列を開示して
おり、ＷＯ９４／０３４０８およびＷＯ９５／０６７３８はＢ７．２をコードす
る核酸配列を開示しており、およびＥＰ−Ｂ１−０ １８８ ４７９はＧＭ−Ｃ
ＳＦのための核酸配列を開示している。
【００４５】 本発明のベクター構築物に関連し、インビトロ研究では、Ｂ７．２と対照的に
、インターフェロン−ガンマまたはＩＬ−１２はＴリンパ球の活性化に対してＢ
７．１と関連して阻害効果を持っていることが示されているので（Ｒｕｄｙ ｅ
ｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，９，８５３）、Ｂ７．２の使
用が特に好都合である。ＧＭ−ＣＳＦをコードしている第二の導入遺伝子の存在
下、Ｂ７分子（Ｂ７．１またはＢ７．２）の腫瘍破壊作用が増強できる。
【００４６】 本発明はそれ故さらに、ＧＭ−ＣＳＦおよびＢ７．２をコードする異種核酸配
列が導入されている腫瘍細胞（好適にはメラノーマ細胞）、および特に癌（特に
メラノーマのような悪性癌）の処置のための医薬としてのそれらの使用に関して
いる。
【００４７】 より容易な操作のため、ＧＭ−ＣＳＦをコードしている核酸配列およびＢ７．
２をコードしている核酸配列の両方を含んでいる”二重ベクター”は特に他より
も優位である。二重ベクターの使用は特にパッケージング過程の数を減少させる
。驚くことに、本発明の二重ベクターは両方の導入遺伝子の有効な発現を可能に
し、それは二つの単一ベクターの同時感染に匹敵している。
【００４８】 好適には、原発腫瘍、特に新しく単離された原発腫瘍、または確立された増殖
性腫瘍細胞株に本発明に従った組換え体ＡＡＶ構築物が導入される。腫瘍ワクチ
ンとしての使用に先立って、好適には導入前に、その必須の免疫刺激特性を失わ
ない程度に腫瘍細胞を破壊するために通常腫瘍細胞を照射する（例えば、約１０
０Ｇｙから３００Ｇｙの総線量で）。その後、好適には３回、約１ｘ１０6から
約１ｘ１０9腫瘍細胞（好適にはメラノーマ細胞）、特に約１ｘ１０6から約１ｘ
１０7腫瘍細胞、例えば、約３ｘ１０6腫瘍細胞が患者に投与される。腫瘍細胞（
原発腫瘍または腫瘍細胞株）は処置される患者から（自己由来）、または他の患
者から（同種異系）のものであろう。
【００４９】 本発明の構築物はまた一般的には任意の障害、好適には、例えば、前により詳
細にすでに説明した悪性メラノーマに加えて卵巣、乳房、結腸、前立腺、気管支
、頭部および／または頚部のような腫瘍の処置にも使用されるであろう。適した
治療遺伝子は例により上で説明された遺伝子である。患者から取り出された細胞
（例えば、腫瘍細胞のような）の生体外(ex vivo)修飾の他さらに、好適には本
発明の方法に従った本発明の構築物を使用し、本発明の構築物の助けによって患
者がインビボでも処置されるであろう（例えば、Ｕ．Ｓ．５，８５８，３５１ま
たはＵ．Ｓ．５，８４６，５２８を参照されたい）。
【００５０】 以下の図および実施例は本発明をさらに詳細に例示することが意図されたもの
であり、本発明を制限するものではない。 実施例 １．ヒーラー−ｔ細胞の再活性化 ヒーラー−ｔ細胞のボトル（ボトルｍｌ当たり５ｘ１０6細胞）を３７℃にて
水浴で融解した。細胞はすぐ約１０ｍｌの冷ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改良イー
グル培地）上にピペットで加え、２００ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレット
は１０ｍｌのＤＭＥＭに再懸濁し、細胞を２００ｇで再びペレットとした。最後
に、細胞を２０ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、ｐｅｎ／ｓｔ
ｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン）およびグルタミンを補給）に懸濁し
、ＮｕｎｃＴ８０ボトル中、３７℃、５％ＣＯ2、で培養した。
【００５１】 ２．ヒーラー−ｔ細胞の前培養および培養 ヒーラー−ｔ細胞を増殖させおよびボトルサイズを保つため、コンフルエント
培養ボトルを１：１０（再びコンフルエントになるまで３日）から１：２０（再
びコンフルエントになるまで４日）に分割した。Ｔ８０からＴ１７５ボトルへ移
す場合は細胞を１：５から１：１０に分割した。これは細胞が剥がれるまで約５
分間、３７℃で細胞をトリプシンで処理することにより実施された。剥がれた細
胞は過剰の培地（約５容量）に懸濁し、２００ｇで６分間遠心分離し、必要なら
新鮮培地にとり、新しい培養ボトル内へ分配した。コンフルエントＴ８０ボトル
を使用する場合（新しく融解した細胞の第一継代）、細胞を最初にトリプシンで
処理し、１：１０で５つのＴ１７５ボトルへ分配した（各々の場合５０ｍｌの培
地）。3日後、細胞はボトル中で再びコンフルエントまで増殖した。次に、５つ
すべてのＴ１７５ボトルの細胞をトリプシンで処理し、積み重ねトレー（１０レ
ベル、６３２０ｃｍ2の培養領域、９００ｍｌの培地）（約１−２ｘ１０8ヒーラ
ー−ｔ細胞）に播種した。この目的のため、積み重ねトレーはチューブシステム
により滅菌ガラス容器と連結され、積み重ねトレーへの供給チューブは最初は閉
じられている。ガラス容器は９００ｍｌのＤＭＥＭ細胞懸濁液で満たされた。懸
濁液はクランプを開けることにより積み重ねトレーへ移された。圧力は空気フィ
ルターを使用することにより釣り合いが保たれた。
【００５２】 ３．トランスフェクション溶液の調製 （１）ＣａＣｌ2保存溶液 ３モルＣａＣｌ2保存溶液が調製され、使用前に２６０ｍＭに希釈され、
濾過滅菌された。
【００５３】 （２）２ｘＢＢＳトランスフェクション緩衝液 ２倍のトランスフェクション緩衝液は以下のように構成されている： ２８０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＢＥＳ、０．７５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4 および０．７５ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．８−８．０）。
【００５４】 ４．ベクタープラスミドの調製 出発プラスミドは修飾ｐＢＲ３２２ベクター中にＡＡＶゲノムを含むプラスミ
ドｐＡＶ２（ＡＴＣＣ ３７２１６；Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．
（１９８３）Ｇｅｎｅ，２３（１），６５）である。ＡＡＶ ＩＴＲの完全性は
配列決定により検査された。ｐＡＶ２をＢｇｌＩＩで加水分解後、ＡＡＶ配列を
ｐＵＣ１９内へサブクローン化することが可能になった。この目的のために、ｐ
ＣＵ１９はＢａｍＨＩで切断され，ｐＡＶ２のＡＡＶ含有ＢｇｌＩＩ断片と直接
的に結合された。それらから得られたプラスミドはｐＵＣＡＶ２と名付けられた
。ｐＵＣＡＶ２およびｐＡＶ２中のＩＴＲの配列決定から、左ＩＴＲは２位の一
つの塩基交換（Ｔ→Ｇ）を除いて完全に無傷であるが、一方、右ＩＴＲにおいて
は８つの末端塩基が失われていることが明らかにされた。
【００５５】 その後、ｐＵＣＡＶ２はＰｐｕＭＩおよびＳｎａＢＩで切断され、その結果、
ＡＡＶ発現カセットに相当するＡＡＶ配列１９２から４４９７が除去された。こ
れらの配列はｐＣＩからのＣＭＶ ポリＡ発現カセット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇｍ
ｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により置き換えられた。このために
は、最初にｐＣＩのＣＭＶプロモーターの前およびポリＡ切断部位の後ろに二本
鎖突然変異発生によりＰｐｕＭＩおよびＥｃｏＲＶ切断部位が導入され、これは
両方の配向で行われた（ＣＭＶの前のＰｐｕＭＩおよびポリＡの後ろのＥｃｏＲ
Ｖおよび逆もまた同様に）。発現カセットが次にＰｐｕＭＩおよびＥｃｏＲＶに
よる二つの加水分解によりｐＣＩから切り出され、ＰｐｕＭＩ、ＳｎａＢＩで切
断されたｐＵＣＡＶ２ベクター断片内へ両方の配向で直接クローン化された（各
々のｐＣＩ配列：配向１（右ＩＴＲのＣＭＶ）：（４００２から４００８）＋（
１から１３５１＋５新規塩基）および各々配向２（左ＩＴＲのＣＭＶ）：（４０
０１から４００８）＋（１から１３５１＋７新規塩基）。異なった導入遺伝子は
次にこれらの基礎ベクター内へクローン化された。
【００５６】 発現カセットの最適配向はルシフェラーゼレポーター遺伝子の助けを借りて決
定された。結果は、配向はベクター構築物のパッケージング効率には明らかに何
の影響も与えなかったことを示した；しかしながら、もしＣＭＶプロモーターが
右ＩＴＲに向かって配向されていると発現カセットはより活性であった。すべて
のクローニングおよび配列決定において、ベクタープラスミドにおける両方のＩ
ＴＲ構造のフロップ−フロップ配向はフリップ−フロップ配向よりも明白に安定
であることが観察された。フロップ−フロップ配向は細菌においてずっとより安
定であり、フリップ−フロップ配向よりも望まれない組換えをより起こしにくか
った。理論的に可能なフリップ−フリップ配向はどのクローンにも観察されなか
った。この理由としては、すべての導入遺伝子が、そのＩＴＲがフロップ−フロ
ップ配向を持つ基礎ベクター内へクローン化されたからである（図４）。
【００５７】
【表１】 *＝６μｇのベクタープラスミドが４ｘ１０5ヒーラー−ｔ細胞内へトランスフェ
クトされた。トランスフェクションして４０時間後、細胞を溶解し、プロモータ
ー活性がルシフェラーゼを計数することにより決定された。相対プロモーター活
性（１＝２ｘ１０8カウント）で示されている。** ＝４μｇのベクタープラスミドが１２μｇのヘルパープラスミド（ｐＵＣ”ｒ
ｅｐ／ｃａｐ”）と一緒に１ｘ１０6ヒーラー−ｔ細胞内へトランスフェクトさ
れた。２日後、細胞をＡｄＶ−５（ＭＯＩ＝２）に感染させた。感染３日後、凍
結−融解溶解により細胞を培地中で破壊し、細胞破片はペレット化し、ｒＡＡＶ
溶解物を６０℃で１０分間熱不活性化した。３ｘ１０5照射ヒーラー−ｔ細胞（
１００Ｇｙ）を１０％溶解物で感染させた。細胞をｒＡＡＶで感染させて４０時
間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性が決定された。相対的活性（１＝１ｘ
１０6カウント）が与えられている。
【００５８】 カラム４（構築物の過渡的トランスフェクション後の相対プロモーター活性）
は直接的におよびカラム５は間接的にＡＡＶゲノム内位置の相対関係としてＣＭ
Ｖプロモーター活性を反映している。表から推測できるように、該プロモーター
が３’ＩＴＲに位置している場合に約１．５−３倍プロモーター活性が増加する
。種々のクローンをパッケージングした後に得られたｒＡＡＶ力価はおおよそ一
致している（ゲノム力価はドットブロット分析により決定された）。このことは
、ＩＴＲの配向（フリップ−フロップ）またはＩＴＲに対するＣＭＶプロモータ
ーの配向は、γＡＡＶ粒子内へパッケージングされるべき構築物の能力には何ら
役割を持っていないことを意味している。ＩＴＲのフリップ−フロップ配向を持
つクローン（１、３ｂおよび１１）はフロップ−フロップ配向を持つクローンよ
りも非常により稀であると観察されたことをさらに触れておかなければならない
。
【００５９】 ５．ヘルパープラスミドの調製 ＡＡＶ塩基１９０から１０６０はＰＣＲ法により野生型ＡＡＶ ＤＮＡから増
幅された。これに関連して、５’プライマーは１９９位に単一のＸｂａＩ切断部
位が導入されるように選択された。ＰＣＲ断片は次にＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ
で切断され、同様に切断されているベクターｐＵＣ１９内へクローン化された。
ＡＡＶゲノム中の１９９位は、すべての重要なｐ５プロモーター要素がヘルパー
プラスミド中に存在することを確実にするために選択された。対照配列決定後、
野生型ＡＡＶ ＤＮＡはＢａｍＨＩおよびＳｎａＢＩで切断され、挿入断片は続
いて中間体のＢａｍＨＩおよびＳｍａＩ位内へクローン化された。このように基
礎ヘルパープラスミドｐＵＣ”ｒｅｐ／ｃａｐ”が得られた（図２）。このヘル
パープラスミドはＡＡＶ配列２０１から４４９７を含んでおり、一方、上記のベ
クタープラスミドはＡＡＶ配列１から１９１および、各々１−６０／８３−１９
１（左ＩＴＲ）および４４９８から４６７１（右ＩＴＲ）を有する。このように
、プラスミド中に相同的ＡＡＶ配列重複が存在しないことを確実にした。その後
、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の最適発現には必要とされない、ｐＵＣ”
ｒｅｐ／ｃａｐ”中のＡＡＶゲノムの３’末端のΔ３７塩基が削除された。得ら
れたヘルパープラスミドはｐＵＣ”ｒｅｐ／ｃａｐ”Δ３７と表示され、２０１
から４４６０位の最小化されたＡＡＶ配列を含んでいる（図２）。
【００６０】 続いて、その位置での非相同的組換えを避けるため、ｐＵＣ１９ベクター主鎖
中のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）（６８４から７０８を含んで；配列：
【００６１】
【化１】 ）が削除された。このプラスミドはｐＵＣ”ｒｅｐ／ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７
と称された。いくつかのプラスミドにおいて、ｒｅｐ遺伝子中の３つのＲＢＳ（
ｐ５およびｐ１９プロモーター）はさらに個々におよび種々の組み合わせで、Ｒ
ｅｐタンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく突然変異された（図２）。
【００６２】 ６３８塩基対の長さの”機能的分離”配列（ｆｓ）が別のヘルパープラスミド
のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子間に導入された。この目的のためには、最初に、ｒ
ｅｐＣ末端およびｃａｐ配列およびｐ４０に必須なすべての制御配列を含んでい
るＡＡＶ ｐ４０プロモーターを含むＡＡＶ配列１６９１から２３２８を複製し
、スプライスされたｒｅｐ体のための終結コドン後（２３２９位）にクローン化
した。その結果、ｃａｐ遺伝子を制御するＡＡＶ ｐ４０プロモーターが二重に
され、ｒｅｐ遺伝子の後ろに挿入された。その後、ｒｅｐ遺伝子中のｐ４０プロ
モーターがＲｅｐアミノ酸配列を変化させることなく破壊された。このことはｐ
４０ ＴＡＴＡボックスを突然変異させることにより確実にされた。全体として
、以下のＡＡＶヌクレオチドがＲｅｐおよびＣａｐアミノ酸配列を変化させるこ
となくクローニング工程に必要なように修飾された：１６９３（Ｔ→Ａ）、１６
９４（Ｔ→Ｇ）、２３３０（Ｇ→Ｃ）、２３３１（Ｇ→Ｔ）、２３３２（Ｇ→Ａ
）、１６２５（Ｃ→Ｔ）、１６２８（Ａ→Ｇ）、１８２６（Ａ→Ｃ）、１８２７
（Ａ→Ｔ）および１８２８（Ｇ→Ｃ）。生じたヘルパープラスミドはｐＵＣ”ｒ
ｅｐ／ｆｓ／ｃａｐ”Δ３７と表示される（図２）。
【００６３】 同様に、追加の配列がｐＵＣ”ｒｅｐ／ｃａｐ” （ＲＢＳ）Δ３７内へ挿入
されてｐＵＣ”ｒｅｐ／ｆｓ／ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７と表示されるヘルパー
プラスミドが得られた（図２）。
【００６４】 別のＲｅｐ７８欠失ヘルパー構築物はヘルパー構築物ｐＵＣ”ｒｅｐ／ｃａｐ
”（ＲＢＳ）Δ３７（図２参照）ＡＡＶヌクレオチド１９０７から２２２７（ｒ
ｅｐイントロンに対応する）を二本鎖突然変異発生により削除することにより調
製され、その結果、プラスミドｐＵＣＡＡＶＳｐｌｅｉｓｓが中間体として得ら
れた。プラスミドｐＵＣＡＡＶＳｐｌｅｉｓｓは制限酵素ＮｄｅＩで直線化され
、例えば、ヤエナリヌクレアーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，
Ｇｅｒｍａｎｙ）のようなエキソヌクレアーゼで処理し、次に制限酵素ＳｐｈＩ
を加えた。このようにして得られた４２２２ｂｐ長の断片は、連結反応によりベ
クター断片と連結され、Ｒｅｐ７８欠失ヘルパー構築物ｐＵＣ”Ｒｅｐ６８，５
２，４０Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７（１０６５７ｂｐ）が得られた（図６参照）
。該ベクター断片は、例えば、ｐＵＣ”ｒｅｐ／ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７を使
用することにより得ることができ、制限酵素ＮｒｕＩおよびＳｐｈＩで処理後、
６４３５ｂｐの長さとして得られる。
【００６５】 同一のベクター断片は別のＲｅｐ７８欠失ヘルパー構築物ｐＵＣ”ΔＲｅｐ７
８Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７を調製するためにさらに使用できる（図７参照）。
このためには、中間体ｐＵＣＡＡＶＳｐｌｅｉｓｓを制限酵素ＡｓｅＩ、Ｂｓｒ
ＢＩおよびＳｐｈＩで処理した。１８０８ｂｐ ＢｓｒＢＩ−ＳｐｈＩ断片を連
結反応により６４３５ｂｐベクター断片へ連結すると、全体の長さが８２４３ｂ
ｐの該ヘルパー構築物ｐＵＣ”ΔＲｅｐ７８Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７が得られ
た。このクローニング戦略は、両方のＲｅｐ７８欠失ヘルパー構築物中のｒｅｐ
遺伝子を部分的に複製し、そのため、両方のｒｅｐ遺伝子からのＲｅｐタンパク
質Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０の増加した発現が可能にされる。
【００６６】 すべての前記ヘルパープラスミドは図２に概略が描かれており、ほとんど同等
のパッケージング能力を持っている。 コトランスフェクション実験の構成内で、１ｘ１０6のヒーラー−ｔ細胞内へ
４μｇのベクタープラスミド（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ）が１２μｇのヘルパープラス
ミドと一緒にコトランスフェクトされた。（ｓｅｑ）で示された実験の場合のみ
、最初に１６μｇのヘルパープラスミド、および次の日に１６μｇのベクタープ
ラスミドが連続的にトランスフェクトされた。（第一の）トランスフェクション
の２日後、細胞をＡｄＶ−５ （ＭＯＩ＝２）に感染させた。３日後、凍結／融
解溶解により細胞を培地中で破壊し、細胞破片はペレット化し、ｒＡＡＶ溶解物
を６０℃で１０分間熱不活性化した。３ｘ１０5照射ヒーラー−ｔ細胞（１００
Ｇｙ）を種々の希釈の溶解物で感染させた。細胞をｒＡＡＶで感染させて４０時
間後、細胞をＧＦＰ発現についてＦＡＣＳフロー［ｌａｃｕｎａ］で分析し、こ
れから導入ｒＡＡＶ粗溶解物力価が決定された。各々のヘルパープラスミドは少
なくとも５回の独立した実験でアッセイされた。表は平均値を掲げている。
【００６７】
【表２】 下記の実験１から３のパッケージングおよび力価決定は前記のように実施され
た。実験１および３は連続的トランスフェクションであり、実験２はヘルパー構
築物およびベクター構築物のコトランスフェクションである。
【００６８】 ヘルパー構築物およびベクター構築物の連続的トランスフェクションにおいて
（実験１および３、下記の表に記載されている）、Ｒｅｐ７８欠失ヘルパー構築
物はＲｅｐ７８コードヘルパー構築物と比較してかなり均一に良好なパッケージ
ング効率を示している。すべての導入力価は同一の対数領域であった。実験２に
おいてはコトランスフェクションが実施され、その結果、別の実験条件が選択さ
れ、パッケージング効率に関して実験２と実験１および３を比較することは不可
能である。これらの実験の結果は次の表に示されている。
【００６９】
【表３】 ６．組換え体ＡＡＶベクターのパッケージング １日目：積み重ねトレーでのヒーラー−ｔ細胞の播種 前により詳細に説明したように、１つのＮｕｎｃ積み重ねトレー（１０レベル
、６３２０ｃｍ2の培養領域）を９００ｍｌのＤＭＥＭに加えた約２ｘ１０8のヒ
ーラー−ｔ細胞で満たし、３７℃、５％ＣＯ2で一夜培養した。
【００７０】 ２日目：Ｃｈｅｎ，Ｔ．＆ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．（１９８７）、上記文献、
に従った、ヘルパープラスミドでのヒーラー−ｔ細胞のリン酸カルシウムトラン
スフェクション： １８００μｇのヘルパープラスミドを４５ｍｌの滅菌２６０ｍＭ ＣａＣｌ2
と混合し、４５ｍｌの滅菌２ｘＢＢＳを加え、注意深く混合し、室温で１５分間
インキュベートした。培地は次に積み重ねトレーから１から２ｌの大きさの滅菌
容器へ移し、ピペッティングによりトランスフェクション混合物を加え、培地を
再び積み重ねトレーに戻した。トランスフェクションは３５℃、３％ＣＯ2で一
夜実施された。
【００７１】 ３日目：ベクタープラスミドによるヒーラー−ｔ細胞のトランスフェクション
： ヘルパープラスミドによるトランスフェクションの１８時間後、細胞を３７℃
、５％ＣＯ2に調節し、さらに３から５時間後、培地を新しい培地（１０％ＦＣ
Ｓ、グルタミンおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含む９００ｍｌのＤＭＥＭ）に置き
換え、前記ヘルパープラスミドでより詳細にすでに説明したように、新鮮培地内
へベクタープラスミドを移した。
【００７２】 ４日目：アデノウイルスによるヒーラー−ｔ細胞の感染： ベクタープラスミドによるトランスフェクションの１８時間後、細胞を再び３
７℃、５％ＣＯ2に調節し、さらに３から５時間後、アデノウイルスに感染させ
た。このためには、培養培地を９００ｍｌのＤＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ、グル
タミンおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ）に置き換え、それに２から３
ｘ１０9（ＭＯＩ＝５）アデノウイルス（Ａｄ−５）を加えた。培養は３７℃、
５％ＣＯ2で一夜実施された。
【００７３】 ５日目：培地の交換 次の日、培養培地を９００ｍｌのＤＭＥＭ培地（グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒ
ｅｐおよびゲンタマイシンを含むが、ＦＣＳは含まれていない）に置き換えた。
【００７４】 ８日目：ｒＡＡＶ粒子の採取 ８日目、ｒＡＡＶ粒子が採取された。ｒＡＡＶ粒子は全部の積み重ねトレーを
−２０℃で凍結させおよび４℃で再び融解させることを連続的に３回繰り返すこ
とにより採取する。溶解物は滅菌遠心ビーカーに移し、５０００ｇで遠心分離す
ることにより細胞破片を除去する。透明な溶解物が続いての精製工程の出発物質
である。
【００７５】 ７．Ｂ７．２導入メラノーマ細胞によるＴ細胞の活性化 メラノーマ細胞株Ｍｅ１６３を照射し（１００Ｇｙ）、ｒＡＡＶ−Ｂ７．２を
導入した。４８時間後、導入メラノーマ細胞Ｍｅ１６３−ｒＡＡＶ−Ｂ７．２、
ウェル当たり１０4）を健康な供与者の抹消血リンパ球（ウェル当たり１０5）と
インキュベートした。リンパ球増殖は５日目における放射性チミジン取り込み法
により測定された。Ｂ７．２導入はＴ細胞活性化を起こしたが、一方、Ｔリンパ
球は刺激無し（培地）または非修飾Ｍｅ１６３細胞（Ｍｅ１６３）とのインキュ
ベーション後では増殖しない。該反応は、Ｔリンパ球をメラノーマ細胞株Ｍｅ１
６３のＢ７．１+およびＢ７．２+安定発現変異体とインキュベートした後に観察
された反応と同じくらい強かった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はｒＡＡＶ粒子を製造するための個々の進行工程、およびメ
ラノーマ処置のための自己由来ワクチンを製造するためのその使用の大要を示し
ている。
【図２】 図２は本発明のヘルパー構築物の選択を図式で示している。
【図３】 図３は野生型ＡＡＶ（ｗｔＡＡＶ）、ヘルパー構築物（＝ヘルパ
ープラスミド）およびベクター構築物（＝ベクタープラスミド）のゲノム構造の
比較を示している。
【図４】 図４は単および二重発現ベクターを図式で示している。
【図５】 図５はフリップおよびフロップコンフィグレーションを持つＡＡ
Ｖベクター構築物の５’に位置しているＩＴＲ配列を図式で示している。
【図６】 図６はＲｅｐ７８欠失ヘルパープラスミドｐＵＣＲｅｐ６８，５
２，４０Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７を図式で示している。
【図７】 図７は別のＲｅｐ７８欠失ヘルパープラスミドｐＵＣ”ΔＲｅｐ
７８Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７を図式で示している。
【図８】 図８はＢ７．１、Ｂ７．２およびＧＦＰをコードしている種々の
構築物を含む導入Ｍｅ１６３細胞による、Ｔ細胞増殖の結果を示している。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年４月６日（２００１．４．６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA03 EA02 EA04 FA02 FA06 GA11 HA20 4B065 AA93X AA95Y AB01 BA02 CA44 4C084 AA02 AA13 BA01 BA08 DA01 DA19 MA02 MA66 ZB262 4C087 AA01 AA02 BB65 BC83 MA02 MA66 NA14 ZB26

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 組換え体アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を製造するための
    方法であって、少なくとも一つのＲｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパ
    ク質をコードしている核酸配列を含んでいる一つまたはそれ以上のヘルパー構築
    物（第一の構築物）、およびまたＡＡＶとは異種でありおよびＩＴＲ配列が隣接
    している一つまたはそれ以上の核酸配列を含んでいるベクター構築物（第二の構
    築物）が適した細胞内へ異なった時間に導入され、最初にヘルパー構築物を適し
    た細胞内へ導入することが優位であることで特徴付けられる前記方法。
  2. 【請求項２】 該第一の構築物を導入した後、および該第二の構築物を導入
    する前に細胞が精製されることで特徴付けられる請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 別の工程においてヘルパーウイルスが異なった時間に加えら
    れることで特徴付けられる請求項１−２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】 個々の工程間の時間の差がお互いに独立して少なくとも約１
    時間、好適には少なくとも約１２時間、特には少なくとも約１日、とりわけ約１
    −２日であることで特徴付けられる請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 遺伝子修飾された細胞が無血清培地で培養されることで特徴
    付けられる請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 少なくとも一つのＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質
    をコードしている核酸配列を含んでいるヘルパー構築物であって、ヘルパー構築
    物が、好適にはＡＡＶプロモーターを除いて、少なくとも一つのＲｅｐタンパク
    質が本質上特異的に結合できる核酸配列を含んでいないことで特徴付けられるヘ
    ルパー構築物。
  7. 【請求項７】 構築物がベクター主鎖中に式ＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡ
    ＣＴＧＡの配列を含んでいないことで特徴付けられる請求項６に記載のヘルパー
    構築物。
  8. 【請求項８】 Ｒｅｐタンパク質がＲｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４
    ０、特にはＲｅｐ６８およびＲｅｐ５２であること、およびそれと独立して、Ｃ
    ａｐタンパク質がＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３であることで特徴付けられる請求
    項６または７に記載のヘルパー構築物。
  9. 【請求項９】 少なくとも一つのＲｅｐタンパク質をコードしている核酸配
    列を含むヘルパー構築物であって、Ｒｅｐタンパク質はＲｅｐ６８、Ｒｅｐ５２
    および／またはＲｅｐ４０であり、および特に、Ｒｅｐ７８ではないことで特徴
    付けられるヘルパー構築物。
  10. 【請求項１０】 ＡＡＶカプシド内へのヘルパー構築物のパッケージングを
    害する追加の核酸配列が、ＲｅｐおよびＣａｐをコードしている核酸配列間に取
    り込まれていることで特徴付けられる請求項６−９のいずれか１項に記載のヘル
    パー構築物。
  11. 【請求項１１】 追加の核酸配列が少なくとも約３００ヌクレオチド、好適
    には少なくとも約５００ヌクレオチド、特には少なくとも約６００−７００ヌク
    レオチドの長さであることで特徴付けられる請求項１０に記載のヘルパー構築物
    。
  12. 【請求項１２】 ヘルパー構築物が、ベクター構築物に相同的でありおよび
    相同的組換えを可能にする核酸配列を含んでいないことで特徴付けられる請求項
    ６−１１のいずれか１項に記載のヘルパー構築物。
  13. 【請求項１３】 ＡＡＶ−２塩基４４６１−４４９７が欠失されていること
    で特徴付けられる請求項６−１２のいずれか１項に記載のヘルパー構築物。
  14. 【請求項１４】 Ｒｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパク質の発現
    がＡＡＶプロモーターまたは異種プロモーターおよび／またはエンハンサーで制
    御されることで特徴付けられる請求項６−１３のいずれか１項に記載のヘルパー
    構築物。
  15. 【請求項１５】 ＡＡＶに対して異種でありおよびＩＴＲ配列が隣接してい
    る一つまたはそれ以上の核酸を含んでいるベクター構築物であって、ＩＴＲ配列
    がフロップ配向で存在していることで特徴付けられるベクター構築物。
  16. 【請求項１６】 異種核酸の発現がＡＡＶに対して異種であるプロモーター
    および／またはエンハンサーで制御されることで特徴付けられる請求項１５に記
    載のベクター構築物。
  17. 【請求項１７】 異種プロモーターおよび／またはエンハンサーが３’に位
    置しているＩＴＲ配列に向かって配向していることで特徴付けられる請求項１６
    に記載のベクター構築物。
  18. 【請求項１８】 構築物が複製不全であることで特徴付けられる請求項６−
    １７のいずれか１項に記載の構築物。
  19. 【請求項１９】 構築物が自己複製することで特徴付けられる請求項６−１
    ７のいずれか１項に記載の構築物。
  20. 【請求項２０】 構築物がＳＶ４０ｏｒｉ核酸配列およびＳＶ４０ Ｔ抗原
    をコードしている核酸配列の両方を含むか、または、代替的に、ＥＢＶ ｏｒｉ
    Ｐ核酸配列およびＥＢＶ ＥＢＮＡ配列の両方を含んでいることで特徴付けられ
    る請求項１９に記載の構築物。
  21. 【請求項２１】 ｒＡＡＶを製造するための、請求項６−１４のいずれか１
    項に記載の少なくとも一つのヘルパー構築物および／または請求項１５−１７の
    いずれか１項に記載のベクター構築物および／または請求項１８−２０のいずれ
    か１項に記載の構築物の使用。
  22. 【請求項２２】 請求項１−５のいずれか１項に記載の方法における請求項
    ２１に記載の使用。
  23. 【請求項２３】 ＧＭ−ＣＳＦおよびＢ７．２をコードしている一つまたは
    それ以上の異種核酸配列が腫瘍細胞内に導入されていることで特徴付けられる腫
    瘍細胞、好適にはメラノーマ細胞。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の腫瘍細胞を含んでいる医薬。
  25. 【請求項２５】 ＧＭ−ＣＳＦおよびＢ７．２をコードしている一つまたは
    それ以上の核酸配列が腫瘍細胞内に導入されていることで特徴付けられる、請求
    項２３に記載の腫瘍細胞を製造するための方法。
  26. 【請求項２６】 該核酸配列が、請求項１−５のいずれか１項に記載した方
    法に従って製造できる組換え体アデノ随伴ウイルスの助けによって導入されるこ
    と、および腫瘍細胞は好適には放射線照射で処理されることで特徴付けられる請
    求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 癌、特には悪性癌、好適にはメラノーマ、の処置のための
    請求項２３に記載の腫瘍細胞の使用。
  28. 【請求項２８】 障害、好適には腫瘍、特に悪性メラノーマおよび卵巣、乳
    房、結腸、前立腺、気管支、頭部および／または頸部の腫瘍の処置のための請求
    項６−２０のいずれか１項に記載の構築物の使用。
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