JP7254777B2 - 誘導性のＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子 - Google Patents

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Description

本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８をコードする核酸を含む宿主細胞であって、内部ＡＡＶプロモーターｐ１９が、上記Ｒｅｐ７８タンパク質及び上記Ｒｅｐ６８タンパク質の機能性を維持する１つ以上の突然変異により不活性化されている、宿主細胞に関する。本発明は更に、それぞれの核酸及び該核酸を含むベクター、並びにＡＡＶの産生のためのそれぞれの方法に関する。
近年、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のベクターに基づく遺伝子療法試験及び製品の数が急速に増加している。遺伝子療法におけるＡＡＶベクターの利点は、良好な安全性プロファイル、このようなベクターが病原性でないこと、すなわち、いかなる疾患にも関連しないこと、導入遺伝子の安定的な発現、そして分裂細胞だけでなく非分裂細胞にも形質導入が可能なことである。
組み換えＡＡＶの産生は、とりわけ、トランスで供給される組み換えウイルスの産生のための、通常ＡＡＶゲノムによってコードされるＡＡＶのＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質の発現を必要とする。さらに、様々なヘルパーウイルスに由来し得るヘルパー遺伝子を使用せねばならず、その際、最も一般的なのは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６又はＶＡ ＲＮＡ等のアデノウイルス（ＡＶ）から取得されたヘルパーウイルス遺伝子である。さらに、対象遺伝子（ＧＯＩ）を含むトランスファーベクターが必要とされる。
ＡＡＶのための現在の産生系は、ほとんどが以下の技術に頼っているが、それらは幾つかの不利点を有する。例えば対象遺伝子を含むトランスファーベクターと、アデノウイルス性ヘルパー機能を有するプラスミドと、キャプシド及びレプリカーゼ機能を提供するプラスミドとを含む３プラスミド系を使用するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の一過性トランスフェクションは、拡張性、ロバスト性、再現性を欠き、そしてＧＭＰグレードのＤＮＡの高い費用がかかる。ほとんどがＨｅＬａ細胞を基礎とするプロデューサー細胞株は、ヘルパーウイルスによる感染を依然として必要とするため、大規模な精製及びヘルパーウイルスが存在しないことの費用のかかる検査が必要とされる。ｐ１９プロモーターの下流のｒｅｐ遺伝子座への終止カセットの挿入によるＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の誘導性発現は、２つのｌｏｘＰ部位に挟まれた終止シグナル（例えば、ＳＶ４０ ポリ（Ａ））を含む人工イントロンの挿入を必要とする。さらに、細胞はｌｏｘＰ部位を認識して終止カセットを切り出すＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。Ｃｒｅリコンビナーゼは、誘導的に又は改変アデノウイルスベクターによって供給される必要があり、そのためヘルパーウイルスが存在しないことの費用のかかる検査が必要とされる。さらに、Ｃｒｅ媒介組み換えはしばしば低い効率しか示さない。
したがって、現在のＡＡＶ産生系は、拡張性、ロバスト性、再現性、使いやすさ、及び費用効率の点で制限される。こうして、一過性トランスフェクション又はヘルパーウイルスを必要としないＡＡＶベクターの安定的な産生のための拡張可能な系が大いに望まれている。
したがって、本発明の基礎をなす技術的課題は、それぞれの宿主細胞、核酸、ベクター及びそのような系を構成する方法を提供することである。
上記の技術的問題の解決は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施の形態により達成される。
特に、第１の態様では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８をコードする核酸を含む宿主細胞であって、内部ＡＡＶプロモーターｐ１９が、前記Ｒｅｐ７８タンパク質及び前記Ｒｅｐ６８タンパク質の機能性を維持する１つ以上の突然変異により不活性化されている、宿主細胞に関する。
この文脈では、Ｒｅｐタンパク質は細胞にとって毒性であるため、ＡＡＶの産生のための安定的なプロデューサー細胞株を作製することは困難である。Ｒｅｐタンパク質の発現は、ＡＡＶ産生のためにも必要なＥ１Ａによって調節される。ＣＡＰ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はＰｅｒ．Ｃ６細胞等の細胞株では、Ｅ１Ａは既に構成的に発現されている。ｐ５プロモーターから発現される２つの長いＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８）と、長いＲｅｐタンパク質のコーディング領域内に位置する内部ｐ１９プロモーターから発現される２つの短いＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０）との、合計で４つのＲｅｐタンパク質が存在する（概略図については図１を参照）。
ｐ５プロモーターを誘導性プロモーターによって置き換えることができるが、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８のコーディング領域の一部である内部ｐ１９プロモーターは置き換えることができない。したがって、Ｅ１Ａを構成的に発現する細胞に基づくパッケージング細胞株／プロデューサー細胞株の作製は不可能である。それというのも、この細胞は毒性レベルのＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０の構成的発現をもたらすこととなるからである。ＥＡ１を構成的に発現しない他の細胞株は、例えばアデノウイルスでの感染による誘導性のＥ１Ａ又はＥ１Ａの供給を必要し、これは上記の不利点を伴う。
上記課題は、構成的なＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０の発現を妨げる一方で、同時に上記Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ６８タンパク質の機能性を維持する突然変異による内部ＡＡＶ ｐ１９プロモーターの不活性化に基づく本発明により有利に解決される。
本明細書で使用される「アデノ随伴ウイルス」及び「ＡＡＶ」という用語は、特定のＡＡＶ血清型に限定されない。この文脈では、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は異なるＡＡＶ血清型の間で高度に保存されていることに留意すべきである。特定の実施の形態では、上記用語は、アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）を指す。
本明細書で使用される「上記Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ６８タンパク質の機能性を維持する」という言い回しは、本発明による突然変異が上記タンパク質の機能的活性を減少させないこと、又は上記活性を最大で３０％、好ましくは最大で２５％、最大で２０％、最大で１５％、最大で１２．５％、最大で１０％、最大で７．５％、最大で５％、最大で４％、最大で３％、最大で２％又は最大で１％減少させることを指す。
好ましい実施の形態では、本発明による１つ以上の突然変異は、ｐ１９プロモーターの調節部位の少なくとも１つの範囲内、好ましくはＳＰ１－５０領域内（ヌクレオチド８１７～ヌクレオチド８２９）、ＴＡＴＡ－２０領域内（ヌクレオチド８４３～ヌクレオチド８４９）又はＴＡＴＡ－３５領域内（ヌクレオチド８３０～ヌクレオチド８３５）にある。具体的には、上記１つ以上の突然変異は、ＳＰ１－５０領域内、ＴＡＴＡ－２０領域内、ＴＡＴＡ－３５領域内、ＳＰ１－５０領域とＴＡＴＡ－２０領域との両方の範囲内に、ＳＰ１－５０領域とＴＡＴＡ－３５領域との両方の範囲内に、ＴＡＴＡ－２０領域とＴＡＴＡ－３５領域との両方の範囲内に又は３つ全ての領域内に、すなわちＳＰ１－５０領域、ＴＡＴＡ－２０領域及びＴＡＴＡ－３５領域にあり得る。特に本発明では、上記領域の１つの範囲内の単一ヌクレオチドの突然変異でさえ、有利にはＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０の発現の大幅な減少を引き起こすことが分かった。
この文脈では、本明細書に示される全てのヌクレオチド位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４３３０３として入手可能なＡＡＶ２完全ゲノム配列を基準とする。全てのアミノ酸位置について同じことが当てはまる。さらに、以下の表１は、ＩＵＰＡＣによる１文字ヌクレオチド命名法の抜粋を示す。
Figure 0007254777000001
好ましい実施の形態では、内部ｐ１９プロモーターを不活性化する本発明による１つ以上の突然変異は、サイレント突然変異、すなわち、コードされたアミノ酸を変化させない突然変異である。
前記１つ以上の突然変異は、突然変異７３１Ｃ＞Ｄ、７３２Ａ＞Ｃ、７３４Ａ＞Ｂ、７３７Ｔ＞Ｃ、７４６Ａ＞Ｇ、７４９Ｃ＞Ｄ、７５２Ｇ＞Ｈ、７５８Ｇ＞Ａ、７６１Ｇ＞Ｈ、７６４Ｇ＞Ｈ、８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８３０Ｔ＞Ｖ、８３３Ｔ＞Ｃ、８４５Ｔ＞Ｃ、８４６Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｂ、又は８４８Ａ＞Ｇ、８４９Ａ＞Ｔ、８５０Ｇ＞Ｃ及び８５１Ｃ＞Ｄからなる群より選択される少なくとも１つの突然変異を含むことが好ましい。
上記１つ以上の突然変異がｐ１９プロモーターのＳＰ１－５０領域内にある場合に、上記突然変異は、突然変異８１８Ｇ＞Ａ及び８２４Ｇ＞Ｈからなる群より選択される少なくとも１つの突然変異を含む。上記１つ以上の突然変異がｐ１９プロモーターのＴＡＴＡ－２０領域内にある場合に、上記突然変異は、突然変異８４５Ｔ＞Ｃ、８４６Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｂ、又は８４８Ａ＞Ｇ、及び８４９Ａ＞Ｔからなる群より選択される少なくとも１つの突然変異を含む。上記１つ以上の突然変異がｐ１９プロモーターのＴＡＴＡ－３５領域内にある場合に、上記突然変異は、突然変異８３０Ｔ＞Ｖ、及び８３３Ｔ＞Ｃからなる群より選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
好ましい実施の形態では、上記１つ以上の突然変異は、上記突然変異の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個全てを含む。したがって、本発明の宿主細胞は、突然変異７３１Ｃ＞Ｄ、７３２Ａ＞Ｃ、７３４Ａ＞Ｂ、７３７Ｔ＞Ｃ、７４６Ａ＞Ｇ、７４９Ｃ＞Ｄ、７５２Ｇ＞Ｈ、７５８Ｇ＞Ａ、７６１Ｇ＞Ｈ、７６４Ｇ＞Ｈ、８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８３０Ｔ＞Ｖ、８３３Ｔ＞Ｃ、８４５Ｔ＞Ｃ、８４６Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｂ又は８４８Ａ＞Ｇ、８４９Ａ＞Ｔ、８５０Ｇ＞Ｃ及び８５１Ｃ＞Ｄのいずれか１個、いずれか２個及び３個、いずれか４個、いずれか５個、いずれか６個、いずれか７個、いずれか８個、いずれか９個、いずれか１０個、いずれか１１個、いずれか１２個、いずれか１３個、いずれか１４個、いずれか１５個、いずれか１６個、いずれか１７個、いずれか１８個、いずれか１９個又は２０個全てを含む核酸を含み得る。
内部ＡＡＶプロモーターｐ１９がサイレント突然変異により不活性化されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８をコードする、本発明で使用される核酸は、好ましくは、配列番号１～配列番号８、配列番号１１～配列番号１４及び配列番号３４～配列番号４２によるヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸である。特に好ましい実施の形態では、上記核酸は、配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号１３、配列番号１４、配列番号３４～配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４２によるヌクレオチド配列を含む。
この文脈では、本明細書で使用される「内部プロモーター」という用語は、ＡＡＶ ｐ１９プロモーターがＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８のコーディング配列内に位置して、上記コーディング配列の一部をなすことを指す。さらに、ＡＡＶ ｐ１９プロモーターに関する「不活性化された」という言い回しは、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター領域中にサイレント突然変異を導入することにより、上記プロモーターが無効となった、又はプロモーター活性が少なくとも大幅に減少した（例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％減少した）ことを示す。
配列番号１～配列番号８、配列番号１１～配列番号１４及び配列番号３４～配列番号４２によるヌクレオチド配列は、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター領域（ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド６５１～ヌクレオチド１０５３）を表し、そこには、以下の表２に示す突然変異パターンが存在する。
好ましい実施の形態では、内部ＡＡＶプロモーターｐ１９がサイレント突然変異により不活性化されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８をコードする、本発明で使用される核酸は、好ましくは、配列番号１５～配列番号２２、配列番号２５～配列番号２８及び配列番号４３～配列番号５１によるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸である。特に好ましい実施の形態では、上記核酸は、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４３～配列番号４８、配列番号５０及び配列番号５１によるヌクレオチド配列を含む。
配列番号１５～配列番号２２、配列番号２５～配列番号２８及び配列番号４３～配列番号５１によるヌクレオチド配列は、Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０のためのＡＡＶコーディング領域（ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド３２１～ヌクレオチド２２５２）であって、ｐ１９プロモーター領域（ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド６５１～ヌクレオチド１０５３）が、以下の表２に示される突然変異を含む突然変異されたｐ１９プロモーター領域によって置き換えられている、ＡＡＶコーディング領域を表す。
Figure 0007254777000002
他の好ましい実施の形態では、内部ｐ１９プロモーターを不活性化する本発明による１つ以上の突然変異は、１つ以上の保存的アミノ酸置換、すなわち、或るアミノ酸を類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性又はサイズに関して）を有する異なるアミノ酸に変えるアミノ酸置換をもたらす突然変異である。前記１つ以上のアミノ酸置換は、脂肪族アミノ酸の部類（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）の範囲内、ヒドロキシル含有アミノ酸若しくは硫黄／セレン含有アミノ酸の部類（Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）の範囲内、塩基性アミノ酸の部類（Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）の範囲内、又は酸性アミノ酸の部類（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）の範囲内で生ずるアミノ酸置換であることが好ましい。
特定の実施の形態では、上記１つ以上のアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｌｅｕ１７６＞Ａｌａ及び／又はＡｌａ１６８＞Ｇｌｙを含む。
この点において、内部ＡＡＶプロモーターｐ１９が保存的アミノ酸置換をもたらす突然変異により不活性化されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８をコードする、本発明で使用される核酸は、好ましくは、配列番号９及び配列番号１０によるヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸である。
この文脈では、ＡＡＶ ｐ１９プロモーターに関する「不活性化された」という言い回しは、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター領域中に保存的アミノ酸置換をもたらす突然変異を導入することにより、上記プロモーターが破壊された、又はプロモーター活性が少なくとも大幅に減少した（例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％減少した）ことを示す。
配列番号９及び配列番号１０によるヌクレオチド配列は、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター領域（ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド６５１～ヌクレオチド１０５３）を表し、そこには、以下の表３に示す突然変異パターンが存在する。
好ましい実施の形態では、内部ＡＡＶプロモーターｐ１９が保存的アミノ酸置換をもたらす突然変異により不活性化されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８をコードする、本発明で使用される核酸は、配列番号２３及び配列番号２４によるヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸である。
配列番号２３及び配列番号２４によるヌクレオチド配列は、Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０のためのＡＡＶコーディング領域（ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド３２１～ヌクレオチド２２５２）であって、ｐ１９プロモーター領域（ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド６５１～ヌクレオチド１０５３）が、以下の表３に示される突然変異を含む突然変異されたｐ１９プロモーター領域によって置き換えられている、ＡＡＶコーディング領域を表す。
Figure 0007254777000003
本発明の宿主細胞に含まれる核酸は、誘導性プロモーター、ポリ（Ａ）領域、選択マーカー、ＩＲＥＳ配列及び増強エレメントからなる群より選択される少なくとも１つのエレメントを更に含み得る。適切な誘導性プロモーターは特に限定されず、当該技術分野において知られており、例えば第３世代ＴＲＥ３Ｇプロモーター等のＴｅｔ誘導性プロモーターである。適切なポリ（Ａ）領域は特に限定されず、当該技術分野において知られており、例えばＳＶ４０ ポリ（Ａ）領域である。適切な選択マーカーは特に限定されず、当該技術分野において知られており、例えばブラスチシジン耐性カセット又はアンピシリン耐性カセット等の抗生物質耐性カセットである。
本発明はまた、上記定義の核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するが、但し、上記定義の特定の突然変異が存在する核酸を含む宿主細胞に関する。この文脈では、「但し、上記定義の特定の突然変異が存在する」という言い回しは、以下の状況（ｉ）～（ｘｘｉｉｉ）を指す。
（ｉ）配列番号１又は配列番号１５によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異７３１Ｃ＞Ｄ、７３２Ａ＞Ｃ、７３４Ａ＞Ｂ、７３７Ｔ＞Ｃ、７４６Ａ＞Ｇ、７４９Ｃ＞Ｄ、７５２Ｇ＞Ｈ、７５８Ｇ＞Ａ、７６１Ｇ＞Ｈ、７６４Ｇ＞Ｈ、８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８３０Ｔ＞Ｖ、８３３Ｔ＞Ｃ、８４５Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｇ、８４９Ａ＞Ｔ、８５０Ｇ＞Ｃ及び８５１Ｃ＞Ｄが存在すること。
（ｉｉ）配列番号２又は配列番号１６によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８４５Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｇ、８４９Ａ＞Ｔ、８５０Ｇ＞Ｃ及び８５１Ｃ＞Ｄが存在すること。
（ｉｉｉ）配列番号３又は配列番号１７によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８４８Ａ＞Ｇが存在すること。
（ｉｖ）配列番号４又は配列番号１８によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８４９Ａ＞Ｔ及び８５０Ｇ＞Ｃが存在すること。
（ｖ）配列番号５又は配列番号１９によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８４５Ｔ＞Ｃが存在すること。
（ｖｉ）配列番号６又は配列番号２０によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異７３１Ｃ＞Ｄ、７３２Ａ＞Ｃ、７３４Ａ＞Ｂ、７３７Ｔ＞Ｃ、７４６Ａ＞Ｇ、７４９Ｃ＞Ｄ、７５２Ｇ＞Ｈ、７５８Ｇ＞Ａ、７６１Ｇ＞Ｈ、７６４Ｇ＞Ｈ、８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８３０Ｔ＞Ｖ及び８３３Ｔ＞Ｃが存在すること。
（ｖｉｉ）配列番号７又は配列番号２１によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異７３１Ｃ＞Ｄ、７３２Ａ＞Ｃ、７３４Ａ＞Ｂ、７３７Ｔ＞Ｃ、７４６Ａ＞Ｇ、７４９Ｃ＞Ｄ、７５２Ｇ＞Ｈ、７５８Ｇ＞Ａ、７６１Ｇ＞Ｈ及び７６４Ｇ＞Ｈが存在すること。
（ｖｉｉｉ）配列番号８又は配列番号２２によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８３０Ｔ＞Ｖ、８３３Ｔ＞Ｃ、８４５Ｔ＞Ｃ、８４６Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｂ、８４９Ａ＞Ｔ、８５０Ｇ＞Ｃ及び８５１Ｃ＞Ｄが存在すること。
（ｉｘ）配列番号９又は配列番号２３によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８４６Ｔ＞Ｇ、８４７Ｔ＞Ｃ及び８４８Ａ＞Ｂが存在すること。
（ｘ）配列番号１０又は配列番号２４によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８２３Ｃ＞Ｇ及び８２４Ｇ＞Ｈが存在すること。
（ｘｉ）配列番号１１又は配列番号２５によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８４６Ｔ＞Ｃ及び８４８Ａ＞Ｂが存在すること。
（ｘｉｉ）配列番号１２又は配列番号２６によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８４６Ｔ＞Ｃが存在すること。
（ｘｉｉｉ）配列番号１３又は配列番号２７によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８４５Ｔ＞Ｃ、８４６Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｂ、８４９Ａ＞Ｔ及び８５０Ｇ＞Ｃが存在すること。
（ｘｉｖ）配列番号１４又は配列番号２８によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異７３１Ｃ＞Ｄ、７３２Ａ＞Ｃ、７３４Ａ＞Ｂ、７３７Ｔ＞Ｃ、７４６Ａ＞Ｇ、７４９Ｃ＞Ｄ、７５２Ｇ＞Ｈ、７５８Ｇ＞Ａ、７６１Ｇ＞Ｈ、７６４Ｇ＞Ｈ、８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８３０Ｔ＞Ｖ、８３３Ｔ＞Ｃ、８４５Ｔ＞Ｃ、８４６Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｂ、８４９Ａ＞Ｔ、８５０Ｇ＞Ｃ及び８５１Ｃ＞Ｄが存在すること。
（ｘｖ）配列番号３４又は配列番号４３によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８１８Ｇ＞Ａ及び８２４Ｇ＞Ｈが存在すること。
（ｘｖｉ）配列番号３５又は配列番号４４によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８３０Ｔ＞Ｖ及び８３３Ｔ＞Ｃが存在すること。
（ｘｖｉｉ）配列番号３６又は配列番号４５によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８１８Ｇ＞Ａが存在すること。
（ｘｖｉｉｉ）配列番号３７又は配列番号４６によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８２４Ｇ＞Ｈが存在すること。
（ｘｉｘ）配列番号３８又は配列番号４７によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８３０Ｔ＞Ｖが存在すること。
（ｘｘ）配列番号３９又は配列番号４８によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８３３Ｔ＞Ｃが存在すること。
（ｘｘｉ）配列番号４０又は配列番号４９によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８３０Ｔ＞Ｖ及び８３３Ｔ＞Ｃが存在すること。
（ｘｘｉｉ）配列番号４１又は配列番号５０によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８４５Ｔ＞Ｃ、８４６Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｂ、８４９Ａ＞Ｔ及び８５０Ｇ＞Ｃが存在すること。
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４２又は配列番号５１によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８３０Ｔ＞Ｖ、８３３Ｔ＞Ｃ、８４５Ｔ＞Ｃ、８４６Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｂ、８４９Ａ＞Ｔ及び８５０Ｇ＞Ｃが存在すること。
好ましくは、上記核酸は、上記定義の核酸に対して少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．２％、９８．４％、９８．６％、９８．８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％の配列同一性を有する。特定の実施の形態では、そのような核酸は、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド又は３０ヌクレオチドの欠失、挿入又は置き換え（置換）を有する。
上記定義の核酸に対して定義された配列同一性を有する又は上記定義の核酸に関して特定のヌクレオチドの欠失、挿入若しくは置き換えを有するそれぞれの核酸は、あらゆる種類のフレームシフト突然変異を有するあらゆる核酸だけでなく、非機能的Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ６８タンパク質をコードするあらゆる核酸を除外する。すなわち上記核酸は、機能的Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ６８タンパク質を依然としてコードしている。
好ましい実施の形態では、本発明の宿主細胞に含まれる核酸は、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれている。他の好ましい実施の形態では、本発明の宿主細胞に含まれる核酸はベクターに含まれ、すなわちベクターの一部である。上記ベクターは、好ましくは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター及び人工染色体ベクターからなる群より選択されるベクターである。好ましくは、上記ベクターは、発現ベクターである。
本発明によれば、内部ＡＡＶ ｐ１９プロモーターは、サイレント突然変異又は保存的アミノ酸置換をもたらす突然変異の導入により不活性化される。このようにして、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８をコードする核酸を、誘導性プロモーターの制御下に置くことができ、その際、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０の構成的発現は起こらない。しかしながら、ＡＡＶの産生は４つの全てのＲｅｐタンパク質を必要とするので、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする追加の核酸を、同様のプロモーター、同一のプロモーター又は異なるプロモーターの制御下に置くことができる。したがって、具体的な実施の形態では、本発明の宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下でＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする核酸を更に含む。この核酸は、上記定義のベクターの一部又はＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８をコードする核酸の一部であり得る。
本発明のために適した宿主細胞は特に限定されず、当該技術分野において知られている。好ましくは、上記宿主細胞は、構成的Ｅ１Ａ発現を示す。好ましい実施の形態では、上記宿主細胞は、ＣＡＰ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はＰｅｒ．Ｃ６細胞であり、すなわち、上記細胞株に由来する。
本発明の宿主細胞を作製する方法、すなわち、本発明の核酸を適切な宿主細胞に導入する方法は特に限定されず、当該技術分野において知られている。本発明の核酸及びベクターの作製方法にも同じことが当てはまる。
第２の態様では、本発明は、上記定義の核酸及びベクターに関する。
第３の態様では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の産生方法であって、本発明による宿主細胞においてＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８を組み換え発現する工程を含む、方法に関する。
必要な核酸、ベクター及び／又は宿主細胞を作製するためのそれぞれの方法並びにそれぞれの発現方法は特に限定されず、当該技術分野において知られている。
好ましくは、本発明の方法は、上記宿主細胞においてＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０を組み換え発現する工程を更に含む。
本明細書で使用される場合に、「含む」（"comprising"/"comprises"）という語句は、「本質的に～のみからなる」（"consisting essentially of"/"consists essentially of"）及び「～のみからなる」（"consisting of"/"consists of"）という語句を明確に含み、すなわち上記語句の全ては区別なく使用される。
本発明によれば、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０の構成的発現なしにＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８を発現し得る宿主細胞が提供される。これは、内部ＡＡＶ ｐ１９プロモーター領域が特定の突然変異の導入により不活性化されている核酸を提供することにより達成される。
プロモーターは、特定の転写因子及び基本転写複合体の結合によって活性化される。これらの因子は、ｐ１９プロモーターについて以前に記載されたプロモーター領域内の特定の結合部位を認識する。これらの結合部位の突然変異は、そのプロモーターの活性化を無効にする。長いＲｅｐタンパク質の完全性を維持する必要があるので、ヌクレオチド配列を変化させるが、遺伝コード内で同じアミノ酸をコードするため、同じタンパク質の形成をもたらす突然変異（サイレント突然変異）が選択される、又は保存的アミノ酸置換がもたらされるようにヌクレオチド配列を変化させる突然変異が選択される。
上記突然変異を導入した後に、長いＲｅｐタンパク質のための発現ユニットと短いＲｅｐタンパク質のための発現ユニットとを分離することが可能である。長いＲｅｐタンパク質のための発現カセットは、上記突然変異を含む突然変異されたｐ１９プロモーターを含む。短いＲｅｐタンパク質のための分離された発現ユニットは、ｐ１９プロモーターの下流で開始コドンから始まる。次いで、両方の発現ユニットの発現を、誘導性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ誘導性プロモーター）の調節下に置くことができる。これに基づいて、安定的なパッケージング細胞株／プロデューサー細胞株を作製することができる。
本発明の宿主細胞、核酸、ベクター及び方法は、有利には優れた再現性を特徴とし、一貫した質、拡張性及び費用効率を保証する、ヘルパーウイルスの使用を必要としないＡＡＶの産生のための系を表す。
ｒｅｐ遺伝子座の概略図である。 誘導性Ｒｅｐタンパク質のための発現コンストラクトの概略図である。 分析された突然変異パターンと、対応するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域の配列番号との概要（表２も参照のこと）を示す図である。図３の「ＳＥＱ－ＩＤ」という表示は、それぞれの配列番号を指す。 ｐ１９プロモーター（表２）の調節配列内にサイレント突然変異を含む種々のコンストラクト及び野生型コンストラクト（ｗｔ）でトランスフェクションした際のＣＡＰ細胞における種々のＲｅｐタンパク質の発現を示す図である。タンパク質レベルは、トランスフェクションの７２時間後に一過性トランスフェクションされたＣＡＰ－Ｔ細胞の細胞溶解物中で抗レプリカーゼ抗体（Progen社）を使用して検出した。コントロールとして、トランスフェクションされていない細胞の細胞溶解物を含めた（Ｂｌ）。図４の「ＩＤ」番号の表示は、それぞれの配列番号を指す。 抗Ｒｅｐウェスタンブロットの定量化を示す図である。Ｒｅｐタンパク質バンドを、ＩｍａｇｅＪを使用してデンシトメトリー分析により定量化した。長いＲｅｐタンパク質バンド対短いＲｅｐタンパク質バンドの比率を計算し、ｗｔを１に設定した。全ての他の値をｗｔに対して正規化した。図５の「ＩＤ」番号の表示は、それぞれの配列番号を指す。 １μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで誘導した際の安定的なＣＡＰ由来細胞株におけるＲｅｐタンパク質の誘導性発現を示す図である。Ｒｅｐタンパク質を、抗レプリカーゼ抗体（Progen社）でのイムノブロットにより検出した。コントロールとして、誘導されていない細胞の細胞溶解物をロードした（－Ｄｏｘ）。約８０ｋＤａに、非特異的なバックグラウンドバンドが検出される。 安定的な細胞株に由来する単一細胞クローンにおいて１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加することによるＲｅｐタンパク質の誘導を示す図である。細胞をｒＡＡＶ５産生に必要な成分で一過性トランスフェクションし、トランスフェクションの５時間後に１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで誘導した。トランスフェクションの７２時間後に、細胞溶解物を調製し、Ｒｅｐタンパク質の発現を、抗レプリカーゼ抗体（Progen社）でのイムノブロットにより検出した。クローン５Ｂ６及びクローン２Ｅ３は、非常に低レベルの長いＲｅｐタンパク質を発現する。 誘導的にＲｅｐを発現するクローンによるｒＡＡＶ５産生のウイルス力価を示す図である。ウイルスゲノム／ｍＬは、標準として線状化されたトランスファープラスミドを使用して、ＣＭＶ－プロモーターを検出するプライマー／プローブの組み合わせを用いたｑＰＣＲによって測定した。単一細胞クローン５Ｂ６及び単一細胞クローン２Ｅ３は、長いＲｅｐタンパク質と短いＲｅｐタンパク質との明確な発現を示さず、したがってまたｒＡＡＶ５の非常に低い力価しか生じない。 （Ａ及びＢ）：保存的アミノ酸置換をもたらすｐ１９プロモーター（表３）の調節配列内に突然変異を含む種々のコンストラクト及び野生型コンストラクト（ｗｔ）でトランスフェクションした際のＣＡＰ細胞における種々のＲｅｐタンパク質の発現を示す図である。タンパク質レベルは、トランスフェクションの７２時間後に一過性トランスフェクションされたＣＡＰ－Ｔ細胞の細胞溶解物中で抗レプリカーゼ抗体（Progen社）を使用して検出した。コントロールとして、トランスフェクションされていない細胞の細胞溶解物を含めた（Ｂｌ）。（Ｃ）：以下のコンストラクトの組み合わせ：ｐＳｔｂｌ－Ｒｅｐ－ｐ１９ｍｕｔ－ＩＤ４７、ＩＤ４８若しくはＩＤ３７又はｗｔ、ｐＳｔｂｌ－ＴＲＥ３Ｇ－Ｒｅｐ５０／４２、ｐＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇ、ｐＨｅｌｐｅｒ、ｐＳｔｂｌ－ＣＭＶ－Ｃａｐ５、ｐＡＡＶ－ＧＦＰでのＣＡＰ細胞のトランスフェクションに際してのウイルス産生を示す図である。ウイルスゲノム／ｍＬは、標準として線状化されたトランスファープラスミドを使用して、ＳＶ４０ ポリＡを検出するプライマー／プローブの組み合わせを用いたｑＰＣＲによって測定した。図９の「ＩＤ」番号の表示は、それぞれの配列番号を指す。
本発明を以下の実施例にて更に説明するが、本発明はそれらに限定されない。
実験手順：
発現コンストラクトのクローニング
各末端にＨｐａＩ制限部位を有するとともにｐ１９プロモーター内に調節部位を有するＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子座の合成。ＡＡＶ２のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０４３３０３（ヌクレオチド１６２～ヌクレオチド２３３２）から得られた。合成遺伝子座の配列は、配列番号２９に示されている。
調節配列内に異なる数のサイレント突然変異（表２）を含むｐ１９プロモーター領域（ＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド６５１～ヌクレオチド１０５３）の種々のコンストラクトを設計し、合成により製造した。
それぞれの発現コンストラクトを、標準的なクローニング技術によって製造し、シーケンシングにより検証した。最終的な発現コンストラクトｐＳｔｂｌ－ｂｓｄ－Ｒｅｐ、ｐＳｔｂｌ－ｂｓｄ－Ｒｅｐ－ｐ１９ｍｕｔ－配列番号１～配列番号１４、配列番号３４～配列番号４２の構成要素は、ｐ５プロモーター、突然変異されたｐ１９プロモーター又は野生型ｐ１９プロモーターのいずれかを含むＲｅｐ遺伝子座、ＳＶ４０ ポリ（Ａ）、ヒトＵｂｃプロモーターの制御下のブラスチシジン選択カセット、組み込まれたＯＲＦの安定的な転写のための増強エレメント、Ｅ．コライ（E. coli）での増殖のためのｐＵＣのｏｒｉ及びＥ．コライでの選択のためのアンピシリン耐性カセットであった。
Ｒｅｐタンパク質を第３世代のＴｅｔ誘導性プロモーター（ＴＲＥ３Ｇプロモーター）の制御下に置くコンストラクト（図２）を標準的なクローニング技術によって製造し、シーケンシングによって検証した。このコンストラクトｐＳｔｂｌ－ｂｓｄ－ＴＲＥ３Ｇ－Ｒｅｐ５２／４０－ＩＲＥＳ－Ｒｅｐ７８／６８の、ＴＲＥ３Ｇプロモーターから始まりＳＶ４０ ポリ（Ａ）までの最終的な配列は、配列番号３０に示されている。ｐＳｔｂｌ－ｂｓｄ－ＴＲＥ３Ｇ－Ｒｅｐ５２／４０－ＩＲＥＳ－Ｒｅｐ７８／６８の構成要素は、ＴＲＥ３Ｇプロモーター、短いＲｅｐタンパク質の開始コドンから始まるＲｅｐ遺伝子座、ＥＣＭＶのＩＲＥＳ配列、長いＲｅｐタンパク質の開始コドンから始まる突然変異されたｐ１９プロモーターを含むＲｅｐ遺伝子座、ＳＶ４０ ポリ（Ａ）、ヒトＵｂｃプロモーターの制御下のブラスチシジン選択カセット及び組み込まれたＯＲＦの安定的な転写のための増強エレメントである。
細胞培養
ＣＡＰ細胞を、振盪フラスコ（１２５ｍＬ容；Corning社）内の、４ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Biochrom社、ドイツ）が補填された化学的に定義された無血清ＰＥＭ培地（Thermo Fisher Scientific社）中で振盪インキュベーターにて１８５ｒｐｍ（５ｃｍの軌道）、５％のＣＯ２及び３７℃で通常のように培養した。
通常の培養の間に、細胞を新鮮な培地で１×１０６細胞／ｍｌの生細胞密度になるまで７２時間～９６時間毎に希釈した。生細胞密度及び生存率を、ＣＥＤＥＸ ＸＳ細胞カウンター（Innovatis社、Roche Applied Science社）を使用したトリパンブルー色素排除により測定した。Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇアクチベーターを発現する安定的な細胞株を、２５μｇ／ｍＬのＧ４１８の存在下で培養し、ｐＳｔｂｌ－ｂｓｄ－ＴＲＥ３Ｇ－Ｒｅｐ５０／４２－ＩＲＥＳ－Ｒｅｐ７８／６８によるヌクレオフェクションに際して、５μｇ／ｍＬのブラスチシジンを添加した。
一過性トランスフェクション及びＲｅｐタンパク質発現の試験のためのウェスタンブロット
一過性トランスフェクションを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地（Thermo Fisher Scientific社）中でＰＥＩｍａｘ（PolySciences社）を使用して実施した。トランスフェクションの５時間後に、細胞に完全ＰＥＭ培地（Thermo Fisher Scientific社）を供給した。作製された一過性トランスフェクションプールの概要は、以下の表４に見られる。
ウェスタンブロット分析を、１×１０５個のトランスフェクションされた細胞からの細胞溶解物で、マウス抗レプリカーゼ抗体（Progen社、ドイツ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗マウス抗体（Cell Signaling社）を利用して実施した。タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ ＷＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔを使用して化学発光検出器（INTAS社）を介して検出した。
ヌクレオフェクション及び安定的なプールの作製
安定的なプールを、Lonza社のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して製造業者の使用説明書に従って作製した。第３世代のＴｅｔ－ｏｎ－３Ｇトランスアクチベーターを発現する安定的なＣＡＰ細胞株を、誘導性Ｒｅｐ発現コンストラクトでのヌクレオフェクションのために使用した。各ヌクレオフェクション反応につき、１×１０７個の細胞を遠心分離（１５０×ｇ、５分）により採取した。細胞を１００μＬのｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ（Lonza社）中に再懸濁し、５μｇの線状化された発現ベクターと混合した。ＤＮＡ／細胞懸濁液をキュベットに移し、Ｘ００１プログラムを使用してヌクレオフェクションを実施した。トランスフェクションされた細胞を１２．５ｍＬの成長培地に移し、３７℃、５％のＣＯ２において１８５ｒｐｍで上記のように培養した。
安定的なプールを作製するために、細胞を遠心分離によりペレット化し、トランスフェクションの７２時間～９６時間後に選択培地（表４を参照）中に再懸濁し、引き続き振盪インキュベーター中で上記のように培養した。
Figure 0007254777000004
上記表４の「ＩＤ」番号の表示は、それぞれの配列番号を指す。
ＡＡＶ産生を試験するための誘導及び一過性トランスフェクション
誘導性Ｒｅｐ発現を伴う安定的な単一細胞クローンによるＡＡＶ産生を試験するために、一過性トランスフェクションを上記のように実施した。以下の３つのコンストラクトを使用することで、ｒＡＡＶ５の産生のための追加の構成要素が１：１：０．５（ｐＡＡＶ－ＧＦＰ：ｐＨｅｌｐｅｒ：ｐＳｔｂｌ－ＣＭＶ－Ｃａｐ５）の比率で得られた。トランスフェクションの５時間後に、最終濃度１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Clontech社）を添加して、Ｒｅｐタンパク質の発現を誘導した。
トランスフェクションの７２時間後に細胞懸濁液を採取した。細胞を０．５％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘの添加により溶解させて、３７℃、１３００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。遠心分離後に、上清をバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０；２ｍＭのＭｇＣｌ２）で１０倍希釈し、１２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（Merck Millipore社）と一緒に３７℃で２時間インキュベートした。２ｍＭのＥＤＴＡの添加、及び７０℃での１０分間のインキュベートを用いて、ベンゾナーゼを失活させた。ウイルスＤＮＡを、Ｐｕｒｅ Ｌｉｎｋ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Thermo Fisher Scientific社）によって製造元の使用説明書に従って精製した。
ｑＰＣＲによるウイルス力価の測定
ＣＭＶプロモーター又はＳＶ４０ ポリＡに対する以下のプライマー／二重標識プローブの組み合わせ（MWG, Eurofins社で注文した；表５）を使用して、ウイルス力価を測定した。
Figure 0007254777000005
標準として、一定のコピー数を有する線状化された導入遺伝子プラスミドを使用した。ｑＰＣＲ反応は、以下の成分：２×Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Agilent社）、ヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ（Thermo Fisher Scientific社）、プライマー／プローブミックス及び試料／標準を含んでいた。ｑＰＣＲは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐで製造元の使用説明書に従って実行した。
実施例１：
ＲＥＰタンパク質の発現に対するサイレント突然変異の効果
序論：
ＣＡＰ細胞はヒト羊膜細胞由来の懸濁細胞であり、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂをコードするコンストラクトでの安定的なトランスフェクションにより不死化されている。
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶゲノムによってコードされている。全部で４つのＲｅｐタンパク質が存在する：Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８（ｐ５プロモーターから発現される）並びにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０（長いＲｅｐタンパク質のコーディング領域内に位置するｐ１９プロモーターから発現される）。これらのタンパク質は、ＡＡＶゲノムの複製及びパッケージングを媒介する。しかしながら、上記タンパク質は、安定的に発現されると細胞にとって毒性である。
サイレント突然変異の導入による内部ｐ１９プロモーターの不活性化のために、ｐ１９プロモーターの調節エレメントを特定し、最終的なタンパク質配列に影響を及ぼさない種々のサイレント突然変異を、これらの調節エレメントのヌクレオチド配列中に挿入した。
結果：
長いＲｅｐタンパク質及び短いＲｅｐタンパク質の発現は、ｐ１９プロモーターの調節配列にサイレント突然変異を導入することにより分離に成功した。突然変異を伴うほとんどのものは、短いＲｅｐタンパク質の発現の大幅な減少を示した。短いＲｅｐタンパク質の発現の減少は、１つの単独の突然変異の導入により既に明白であり、最大２０個の突然変異を導入することでより顕著になった（図４、図５）。５’モチーフと３’モチーフとの分離により、特にプロモーターに隣接する３’モチーフ（ＳＰ１－５０、ＴＡＴＡ－３５、ＴＡＴＡ－２０）が、内部ｐ１９プロモーターの活性化のために重要であることが分かった。ＴＡＴＡ－２０モチーフのみを突然変異させると、短いｒｅｐタンパク質の発現は大幅に減少するが完全には減少しないことから、ＳＰ１－５０及びＴＡＴＡ－３５も発現の活性化に重要であることが示唆され、これは更にＴＡＴＡ－２０を除くどれを突然変異させても、短いｒｅｐタンパク質の発現の明らかな低下が生ずることによって裏付けられる。単一のモチーフを更に詳しく調べると、特にＳＰ１－５０モチーフ、より厳密には突然変異８２４Ｇ＞Ｈは、短いｒｅｐタンパク質の発現を非常に明らかに減少させた。さらに、ＴＡＴＡ－２０の突然変異により、短いｒｅｐタンパク質の発現は明らかに減少した。ＴＡＴＡ－３５の場合に、モチーフ内の種々の突然変異の組み合わせのみが非常に明らかな減少をもたらし、突然変異８４８Ａ＞Ｇが発現に最も大きな影響を及ぼした。
Ｒｅｐタンパク質を誘導的に発現する安定的な細胞株を作製するために、サイレント突然変異を有する長いＲｅｐタンパク質の遺伝子と短いＲｅｐタンパク質のための遺伝子とを分離し、それぞれを誘導性プロモーターの制御下に置いた。更なる実験のために、１９個の突然変異を有するｐ１９ｍｕｔコンストラクトを選択した。
実施例２：
ＡＡＶ２のＲｅｐタンパク質を誘導的に発現する安定的なＣＡＰクローンの作製
序論：
ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質の誘導性発現カセットを作製するために、１９個のサイレント突然変異を有するｐ１９ｍｕｔ変異体を選択した。
第３世代のＴｅｔ誘導性プロモーター（ＴＲＥ３Ｇプロモーター）を使用して、ドキシサイクリンの添加によりＲｅｐタンパク質の発現を調節した（コンストラクトの概要は、図２を参照のこと）。Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇトランスアクチベーターを発現するＣＡＰ細胞は、ヌクレオフェクション及び２５μｇ／ｍＬのＧ４１８での選択によって以前に作製された。ｐＳｔｂｌ－ｂｓｄ－ＴＲＥ３Ｇ－Ｒｅｐ５２／４０－ＩＲＥＳ－Ｒｅｐ７８／６８コンストラクトを、この安定的なプールにおいてヌクレオフェクションし、５μｇ／ｍＬのブラスチシジンで選択した。限界希釈を使用した単一細胞クローニングを実施し、クローンをＲｅｐタンパク質についてウェスタンブロットによりスクリーニングした。
結果：
Ｔｅｔ－ｏｎ－３ＧトランスアクチベーターとｐＳｔｂｌ－ｂｓｄ－ＴＲＥ３Ｇ－Ｒｅｐ５２／４０－ＩＲＥＳ－Ｒｅｐ７８／６８とを有する安定的なＣＡＰ細胞プールを、ドキシサイクリンによる誘導の前後に種々のｒｅｐタンパク質の発現についてウェスタンブロットにより分析した（図６）。ドキシサイクリン誘導がないと、Ｒｅｐタンパク質に特異的なシグナルは検出することができなかったが、ドキシサイクリン誘導によると長いＲｅｐタンパク質と短いＲｅｐタンパク質との両方が発現された。
安定的なプールから単一細胞由来のクローンを限界希釈により作製した。単一細胞由来のクローンを、ドキシサイクリン誘導後にＲｅｐタンパク質の発現について分析した。５個のクローンのうち、３個のクローンが長いＲｅｐタンパク質と短いＲｅｐタンパク質との両方を予想された比率で発現したが、２個のクローンは長いＲｅｐタンパク質レベルの減少を示した（図７）。
ｐ１９プロモーター中にサイレント突然変異を有するｒｅｐコンストラクトを使用すると、長いＲｅｐタンパク質と短いＲｅｐタンパク質との両方の誘導性発現を伴うクローン細胞集団が作製され得ることがデータにより示される。そのようなクローンは、パッケージング細胞株／プロデューサー細胞株の作製のための基礎として役立ち得る。
実施例３：
ＡＡＶ２のＲｅｐタンパク質を誘導的に発現する安定的なＣＡＰクローンにおけるＡＡＶの産生
序論：
誘導性Ｒｅｐ細胞株がＡＡＶベクターを産生可能であることを証明するために、欠如したＡＡＶ産生の構成要素を５つの異なるクローンの細胞に一過的に導入した。
ＣＭＶプロモーターの制御下でｐＳｔｂｌベクター中にクローニングされたＡＡＶ５由来のカプシドタンパク質、追加のヘルパー遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、ＶＡ ＲＮＡ及び対象遺伝子（ＧＯＩ）を有するトランスファーベクター：ｐＡＡＶ－ＧＦＰ。
結果：
安定的なＲｅｐを誘導的に発現する細胞株の単一細胞クローンを使用すると、欠落した必要な構成要素の細胞のへのトランスフェクション及びドキシサイクリン誘導に際してＡＡＶ産生が示され得た（図８）。長いＲｅｐタンパク質がより低レベルの２つのクローンも、予想されるようにより低いＡＡＶ力価を示した。これは、この手法がウイルスベクターの産生をもたらし、高産生ＡＡＶパッケージング細胞株の作製が現在可能になったことを証明している。
実施例４：
保存的アミノ酸置換を伴うＲｅｐタンパク質を使用したＡＡＶ産生
保存的アミノ酸置換をもたらすプロモーター領域における突然変異の導入による内部ｐ１９プロモーターの不活性化のために、ｐ１９プロモーターの調節エレメントを特定した。３つの異なる突然変異８４６Ｔ＞Ｇ、８４７Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞ＢをＴＡＴＡ－２０領域のヌクレオチド配列中に挿入することで、保存的Ｌｅｕ１７６＞Ａｌａ置換（ＩＤ２３）が得られた。２つの異なる突然変異８２３Ｃ＞Ｇ、８２４Ｇ＞ＨをＳＰ１－５０領域のヌクレオチド配列中に挿入することで、保存的Ａｌａ１６８＞Ｇｌｙ置換（ＩＤ２４）が得られた。種々のコンストラクトをＣＡＰ－Ｔ細胞中に一過的に導入し、長いＲｅｐタンパク質及び短いＲｅｐタンパク質の発現レベルを分析し、ｗｔ及びｍｕｔ－２０（ＩＤ２８）と比較した（図９Ａ、Ｂ）。
ＴＡＴＡ－２０領域又はＳＰ１－５０領域における保存的アミノ酸置換を伴う長いｒｅｐタンパク質の機能性を証明するために、以下のコンストラクトの組み合わせ：長いＲｅｐタンパク質をコードするコンストラクトｐＳｔｂｌ－Ｒｅｐ－ｐ１９ｍｕｔ－ＩＤ２３又はＩＤ２４又はｍｕｔ２０又はｗｔのいずれかと一緒に、短いＲｅｐタンパク質をコードするコンストラクト（ｐＳｔｂｌ－ＴＲＥ３Ｇ－Ｒｅｐ５０／４２）、ｐＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇ及び追加のヘルパー遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、ＶＡ ＲＮＡ、並びに対象遺伝子（ＧＯＩ）を有するトランスファーベクターｐＡＡＶ－ＧＦＰをＣＡＰ－Ｔ細胞中に一過的に導入することにより、ＡＡＶを産生させた（図９Ｃ）。
結果：
ウェスタンブロット分析により、ｐ１９プロモーターの調節配列中に異なる突然変異を導入してＳＰ１－５０領域又はＴＡＴＡ－２０領域のいずれかに保存的アミノ酸置換をもたらすことによって、長いＲｅｐタンパク質及び短いＲｅｐタンパク質の発現の分離に成功することが明らかとなった。
上記のように、ＳＰ１－５０領域中の突然変異は、ＴＡＴＡ－２０ボックス中の導入された突然変異よりも顕著な効果を有したことから、ＳＰ１－５０の重要な役割が確認される（図９Ａ、Ｂ）。
重要なことには、Ｌｅｕ１７６＞Ａｌａ（ＩＤ２３）又はＡｌａ１６８＞Ｇｌｙ（ＩＤ２４）の置換を有する長いＲｅｐタンパク質の機能性を一過的産生によるＡＡＶ粒子の産生によって証明することができた。保存的アミノ酸置換を有するＲｅｐタンパク質を伴って産生されたＡＡＶ粒子の力価は、ｗｔ又はｍｕｔ－２０コントロールと同じ範囲内であり、ＩＤ２４試料においてはＡＡＶ力価がいくらか減少している（図９Ｃ）。
本発明は、以下のヌクレオチド配列に関する。
配列番号１
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１９
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTACTTGTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号２
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ５
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTACTTGTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号３
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTGAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号４
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ２
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTATCCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号５
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１－２
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTACTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号６
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１４
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号７
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１０
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号８
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１０－２
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号９
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ３
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATGCBAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号１０
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ２－２
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGGHTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号１１
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ２－３
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATCTBAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号１２
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１－３
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATCTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号１３
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ５－２
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTACCTBTCCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号１４
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ２０
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号１５
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１９を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTACTTGTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号１６
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ５を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTACTTGTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号１７
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTGAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号１８
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ２を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTATCCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号１９
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１－２を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTACTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号２０
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１４を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号２１
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１０を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号２２
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１０－２を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号２３
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ３を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATGCBAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号２４
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ２－２を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGGHTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号２５
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ２－３を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATCTBAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号２６
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ１－３を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATCTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号２７
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ５－２を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTACCTBTCCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号２８
突然変異されたｐ１９プロモーター領域ｍｕｔ２０を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGGGGGDGGHAACAAAGTHGTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号２９
合成ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子座
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ＨｐａＩ制限部位
GTTAACTGACGTGAATTACGTCATAGGGTTAGGGAGGTCCTGTATTAGAGGTCACGTGAGTGTTTTGCGACATTTTGCGACACCATGTGGTCACGCTGGGTATTTAAGCCCGAGTGAGCACGCAGGGTCTCCATTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCGCAGCCGCCATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTTAAC
配列番号３０
ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質のための誘導性発現コンストラクト
GTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAAGTCGACACCGGGGCCCAGATCTATCGATCGGCCGGATAACGCCACCATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAGATAACTGAGGGATAGAATTCCGCCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATAGTTATCGCCGCCATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACACGGAACGGCGCCGGGGGAGGCAACAAAGTCGTCGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCTTGGACCAACATGGAACAGTACTTGTCGGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAGTTATCATTTAAATGGCGCGCCCACGTGGGTACCGCGGCCGCGGGGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCA
配列番号３１
ＣＭＶフォワードプライマー
AAATGGCCCGCCTGGCATTATG
配列番号３２
ＣＭＶリバースプライマー
AAACCGCTATCCACGCCCATTG
配列番号３３
ＣＭＶプローブ
ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATC
配列番号３４
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｌ（ＳＰ１－５０）
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号３５
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｍ（ＴＡＴＡ－２０）
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号３６
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｎ（ＳＰ１－５０ １）
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号３７
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｏ（ＳＰ１－５０ ２）
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCHTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号３８
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｐ（ＴＡＴＡ－２０ １）
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACVAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号３９
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｑ（ＴＡＴＡ－２０ ２）
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号４０
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｒ（ＳＰ１－５０及びＴＡＴＡ－３５）
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号４１
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｓ（ＳＰ１－５０及びＴＡＴＡ－２０）
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACTAATATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号４２
ＡＡＶ２の突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｔ（ＴＡＴＡ－２０及びＴＡＴＡ－３５）
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG
配列番号４３
突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｌ（ＳＰ－１）を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号４４
突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｍ（ＴＡＴＡ－２０）を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号４５
突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｎ（ＳＰ１－５０ １）を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号４６
突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｏ（ＳＰ１－５０ ２）を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCHTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号４７
突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｐ（ＴＡＴＡ－２０ １）を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACVAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号４８
突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｑ（ＴＡＴＡ－２０ ２）を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号４９
突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｒ（ＳＰ１－５０及びＴＡＴＡ－３５）を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号５０
突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｓ（ＳＰ１－５０及びＴＡＴＡ－２０）を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACTAATATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号５１
突然変異されたｐ１９プロモーター領域Ｔ（ＴＡＴＡ－２０及びＴＡＴＡ－３５）を有するＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質コーディング領域
太字：ｐ１９プロモーター内の調節部位
下線部：ｐ１９プロモーター領域中の突然変異
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA
配列番号５２
ＳＶ４０ ポリＡフォワードプライマー
AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA
配列番号５３
ＳＶ４０ ポリＡリバースプライマー
CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT
配列番号５４
ＳＶ４０ ポリＡプローブ
AGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC

Claims (7)

  1. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８をコードする核酸を含む宿主細胞であって、内部ＡＡＶプロモーターｐ１９が、前記Ｒｅｐ７８タンパク質及び前記Ｒｅｐ６８タンパク質の機能性を維持する１つ以上の突然変異により不活性化されており、
    前記１つ以上の突然変異は、ｐ１９プロモーターのＳＰ１－５０領域、ＴＡＴＡ－２０領域及びＴＡＴＡ－３５領域の少なくとも１つの範囲内にあり、
    （ｉ）前記１つ以上の突然変異がｐ１９プロモーターのＳＰ１－５０領域内にあり、及び／又は
    （ｉｉ）前記１つ以上の突然変異がそれぞれ、ｐ１９プロモーターのＳＰ１－５０領域とｐ１９プロモーターのＴＡＴＡ－２０領域との両方の範囲内に、ｐ１９プロモーターのＳＰ１－５０領域とｐ１９プロモーターのＴＡＴＡ－３５領域との両方の範囲内に、及び／又はｐ１９プロモーターのＴＡＴＡ－２０領域とｐ１９プロモーターのＴＡＴＡ－３５領域との両方の範囲内にあり、
    前記核酸は、配列番号１、６、８、１０、１４、１５、２０、２２、２４、２８、３４、３６、３７、４０～４３、４５、４６、及び４９～５１によるヌクレオチド配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
  2. 請求項１に規定される核酸に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するが、但し、請求項１に規定される特定の突然変異が存在する核酸を含み、かつ
    特定の突然変異が存在する、とは、以下の状況（１）～（１１）を指す：
    （１）配列番号１又は配列番号１５によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異７３１Ｃ＞Ｄ、７３２Ａ＞Ｃ、７３４Ａ＞Ｂ、７３７Ｔ＞Ｃ、７４６Ａ＞Ｇ、７４９Ｃ＞Ｄ、７５２Ｇ＞Ｈ、７５８Ｇ＞Ａ、７６１Ｇ＞Ｈ、７６４Ｇ＞Ｈ、８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８３０Ｔ＞Ｖ、８３３Ｔ＞Ｃ、８４５Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｇ、８４９Ａ＞Ｔ、８５０Ｇ＞Ｃ及び８５１Ｃ＞Ｄが存在すること；
    （２）配列番号６又は配列番号２０によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異７３１Ｃ＞Ｄ、７３２Ａ＞Ｃ、７３４Ａ＞Ｂ、７３７Ｔ＞Ｃ、７４６Ａ＞Ｇ、７４９Ｃ＞Ｄ、７５２Ｇ＞Ｈ、７５８Ｇ＞Ａ、７６１Ｇ＞Ｈ、７６４Ｇ＞Ｈ、８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８３０Ｔ＞Ｖ及び８３３Ｔ＞Ｃが存在すること；
    （３）配列番号８又は配列番号２２によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８３０Ｔ＞Ｖ、８３３Ｔ＞Ｃ、８４５Ｔ＞Ｃ、８４６Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｂ、８４９Ａ＞Ｔ、８５０Ｇ＞Ｃ及び８５１Ｃ＞Ｄが存在すること；
    （４）配列番号１０又は配列番号２４によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８２３Ｃ＞Ｇ及び８２４Ｇ＞Ｈが存在すること；
    （５）配列番号１４又は配列番号２８によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異７３１Ｃ＞Ｄ、７３２Ａ＞Ｃ、７３４Ａ＞Ｂ、７３７Ｔ＞Ｃ、７４６Ａ＞Ｇ、７４９Ｃ＞Ｄ、７５２Ｇ＞Ｈ、７５８Ｇ＞Ａ、７６１Ｇ＞Ｈ、７６４Ｇ＞Ｈ、８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８３０Ｔ＞Ｖ、８３３Ｔ＞Ｃ、８４５Ｔ＞Ｃ、８４６Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｂ、８４９Ａ＞Ｔ、８５０Ｇ＞Ｃ及び８５１Ｃ＞Ｄが存在すること；
    （６）配列番号３４又は配列番号４３によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８１８Ｇ＞Ａ及び８２４Ｇ＞Ｈが存在すること；
    （７）配列番号３６又は配列番号４５によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８１８Ｇ＞Ａが存在すること；
    （８）配列番号３７又は配列番号４６によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８２４Ｇ＞Ｈが存在すること；
    （９）配列番号４０又は配列番号４９によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８３０Ｔ＞Ｖ及び８３３Ｔ＞Ｃが存在すること；
    （１０）配列番号４１又は配列番号５０によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８１８Ｇ＞Ａ、８２４Ｇ＞Ｈ、８４５Ｔ＞Ｃ、８４６Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｂ、８４９Ａ＞Ｔ及び８５０Ｇ＞Ｃが存在すること；及び
    （１１）配列番号４２又は配列番号５１によるヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列において、突然変異８３０Ｔ＞Ｖ、８３３Ｔ＞Ｃ、８４５Ｔ＞Ｃ、８４６Ｔ＞Ｃ、８４８Ａ＞Ｂ、８４９Ａ＞Ｔ及び８５０Ｇ＞Ｃが存在すること、
    宿主細胞。
  3. 前記核酸が、宿主細胞ゲノム中に安定的に組み込まれている、又はベクター中に含まれている、請求項１又は２に記載の宿主細胞。
  4. ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする核酸を誘導性プロモーターの制御下で更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  5. ＣＡＰ細胞、ＨＥＫ２９３細胞及びＰｅｒ．Ｃ６細胞からなる群より選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  6. 請求項１又は２に規定される核酸又は請求項３に規定されるベクター。
  7. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の産生方法であって、請求項１～５のいずれか一項に記載の宿主細胞においてＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８を組み換え発現する工程を含む、方法。
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