BR112020005404A2 - genes rep de aav induzíveis - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a células hospedeiras compreendendo um ácido nucleico que codifica proteínas Rep do vírus adeno-associado (AAV), Rep78 e Rep68, em que o promotor interno p19 do AAV foi inativado por uma ou mais mutações que mantêm a funcionalidade das referidas proteínas Rep78 e Rep68. A presente invenção refere-se ainda aos respectivos ácidos nucleicos e vetores compreendendo os mesmos, bem como aos respectivos métodos para a produção de AAV.

Description

“GENES REP DE AAV INDUZÍVEIS” CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção referese a células hospedeiras compreendendo um ácido nucleico que codifica proteínas Rep do vírus adeno- associado (AAV), Rep78 e Rep68, em que o promotor interno p19 do AAV foi inativado por uma ou mais mutações que mantêm a funcionalidade das referidas proteínas Rep78 e Rep68. A presente invenção refere-se ainda aos respectivos ácidos nucleicos e vetores compreendendo os mesmos, bem como aos respectivos métodos para a produção de AAV.
[002] Recentemente, houve um rápido aumento no número de ensaios de terapia gênica e produtos com base em vetores derivados do vírus adeno- associado (AAV). As vantagens dos vetores de AAV na terapia gênica são um perfil de segurança bom, o fato de que esses vetores não são patogênicos, ou seja, não estão associados a nenhuma doença, à expressão estável de transgenes e à possibilidade de transduzir células divisoras e não divisoras.
[003] A produção de AAV recombinante requer, dentre outras coisas, a expressão de proteínas Rep e Cap de AAV, as quais são comumente codificadas pelo genoma de AAV para produção de vírus recombinante fornecido em trans. Além disso, genes auxiliares que podem ser derivados de diferentes vírus auxiliares devem ser utilizados, sendo que os genes virais auxiliares mais comuns são retirados do Adenovírus (AV), tais como E1A, E1B, E2A, E4orf6 ou RNA do VA. Além disso, é necessário um vetor de transferência contendo o gene de interesse (GOI).
[004] Os sistemas atuais de produção de AAV se baseiam principalmente nas seguintes técnicas que, no entanto, apresentam várias desvantagens. A transfecção transitória de genes rep de AAV, por exemplo, que usa um sistema de três plasmídeos compreendendo um vetor de transferência contendo o gene de interesse, um plasmídeo com funções adenoviral auxiliar e um plasmídeo que fornece as funções de capsídeo e replicase, não possui escalabilidade, robustez, reprodutibilidade e implica altos custos de DNA com qualidade BPFs ou GMP. As linhagens celulares produtoras, que são principalmente à base de células HeLa, ainda precisam de infecção com o vírus auxiliar, exigindo, desse modo, uma extensa purificação e provas custosas da ausência de vírus auxiliar. A expressão induzível de genes rep de AAV por meio da inserção de um cassete de parada no locus rep a jusante do promotor p19 requer a inserção de um íntron artificial que contém um sinal de parada (por exemplo, poli(A) de SV40) flanqueado por dois sítios loxP. Além disso, as células precisam da recombinase Cre, que reconhece os sítios loxP e excisa o cassete de parada. Isso deve ser fornecido de forma induzível ou por um vetor adenoviral modificado, exigindo a prova custosa da ausência de vírus auxiliar. Além disso, a recombinação mediada por Cre mostra frequentemente uma baixa eficiência.
[005] Consequentemente, os atuais sistemas de produção de AAV são limitados em relação à escalabilidade, robustez, reprodutibilidade, facilidade de uso e eficiência em custos. Assim, é altamente desejável um sistema escalável para a produção estável de vetores AAV que não exija transfecção transitória ou vírus auxiliar.
[006] Consequentemente, o problema técnico subjacente à presente invenção é proporcionar células hospedeiras, ácidos nucleicos, vetores e métodos respectivos que constituem esse sistema.
[007] A solução para o problema técnico acima é alcançada pelas formas de realização caracterizadas nas reivindicações.
[008] Em particular, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere- se a uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica as proteínas Rep, Rep78 e Rep68, do vírus adeno-associado (AAV), em que o promotor interno p19 do AAV foi inativado por uma ou mais mutações que mantêm a funcionalidade das referidas proteínas Rep78 e Rep68.
[009] Neste contexto, as linhagens celulares produtoras estáveis para a produção de AAV são difíceis de gerar, pois as proteínas Rep são tóxicas para as células. A expressão das proteínas Rep é regulada por E1A, que também é necessária para a produção de AAV. Em linhagens celulares como células CAP, células HEK293 ou células Per.C6, o E1A já é expresso constitutivamente. No total, existem quatro proteínas Rep: duas longas (Rep78, Rep68), que são expressas a partir do promotor p5, e duas curtas (Rep52, Rep40), que são expressas a partir do promotor interno p19 localizado na região codificante das proteínas Rep longas (vide Figura 1 para uma visão esquemática geral).
[010] O promotor p5 pode ser substituído por um promotor induzível, mas não pelo promotor interno p19, que faz parte da região codificante de Rep78 e Rep68. Assim, a geração de linhagens celulares de empacotamento/produtoras com base em células que expressam constitutivamente E1A é impossível, uma vez que isso resultaria em uma expressão constitutiva de níveis tóxicos de Rep52 e Rep40. Outras linhagens celulares que não expressam constitutivamente EA1 precisam de um suprimento induzido de E1A ou E1A, por exemplo, por infecção com adenovírus, acarretando os inconvenientes indicados acima.
[011] Este problema é resolvido de forma vantajosa pela presente invenção, que se baseia na inativação do promotor interno p19 de AAV por meio de mutações que impedem a expressão constitutiva de Rep52 e Rep40, mantendo, ao mesmo tempo, a funcionalidade das referidas proteínas Rep78 e Rep68.
[012] Os termos "vírus adeno-associado" e "AAV", conforme utilizados neste documento, não se limitam a sorotipos específicos de AAV. Neste contexto,
deve-se notar que as proteínas Rep de AAV são altamente conservadas entre os diferentes sorotipos de AAV. Em determinadas formas de realização, os termos acima se referem ao sorotipo 2 do vírus adeno-associado (AAV2).
[013] O termo "manter a funcionalidade das referidas proteínas Rep78 e Rep68", conforme utilizado neste documento, refere-se ao fato de que as mutações, de acordo com a presente invenção, não reduzem a atividade funcional das referidas proteínas ou reduzem a referida atividade em no máximo 30%, preferencialmente no máximo 25%, no máximo 20%, no máximo 15%, no máximo 12,5%, no máximo 10%, no máximo 7,5%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2% ou no máximo 1%.
[014] Nas formas de realização preferenciais, as uma ou mais mutações de acordo com a presente invenção estão dentro de pelo menos um dos sítios reguladores do promotor p19, preferencialmente a região SP1 -50 (nucleotídeos 817 a 829), a região TATA -20 (nucleotídeos 843 a 849) ou a região TATA -35 (nucleotídeos 830 a 835). Especificamente, as referidas uma ou mais mutações podem estar dentro da região SP1 -50, dentro da região TATA -20, dentro da região TATA -35, dentro da região SP1 -50 e da região TATA -20, dentro da região SP1 -50 e da região TATA -35, dentro da região TATA -20 e da região TATA -35, ou dentro de todas as três regiões, isto é, na região SP1 -50, na região TATA -20, e na região TATA -35. Em particular, foi demonstrado na presente invenção que mesmo a mutação de um único nucleotídeo dentro de uma das referidas regiões leva a uma redução significativa e vantajosa da expressão de Rep52 e Rep40.
[015] Nesse contexto, todas as posições de nucleotídeos, conforme indicadas neste documento, se referem à sequência completa do genoma do AAV?2 disponível sob o número de acesso do GenBank AFO43303. O mesmo se aplica a todas as posições de aminoácidos. Além disso, a Tabela 1 abaixo mostra um trecho da nomenclatura de nucleotídeo de uma letra de acordo com a IUPAC.
TABELA 1: Nomenclatura de nucleotídeo de uma letra de acordo com a IUPAC.
E. :
LILI E 8 >
[016] Nas formas de realização preferenciais, as uma ou mais mutações de acordo com a presente invenção que inativam o promotor interno p19 são mutações silenciosas, isto é, mutações que não alteram o aminoácido codificado.
[017] De preferência, as referidas uma ou mais mutações compreendem pelo menos uma mutação, selecionada do grupo que consiste nas mutações 731C>D, 732A>C, 734A>B, 737T>C, 746A>G, 749C>D, 752G>H, 758G>A, 761G>H, 764G>H, 818G>A, 824G>H, 830T>V, 833T>C, 845T>C, 846T>C, 848A>B ou 848A>G, 849A>T, 850G>C e 851C>D.
[018] Nos casos em que as referidas uma ou mais mutações estão dentro da região SP1 -50 do promotor p19, as referidas mutações compreendem pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste nas mutações 818G>A e 824G>H. Nos casos em que as referidas uma ou mais mutações estão dentro da região TATA -20 do promotor p19, as referidas mutações compreendem pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste nas mutações 845T>C, 846T>C, 848A>B ou 848A>G e 849A>T. Nos casos em que as referidas uma ou mais mutações estão dentro da região TATA -35 do promotor p19, as referidas mutações compreendem pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste nas mutações 830T>V e 833T>C,
[019] Nas formas de realização preferenciais, as referidas uma ou mais mutações compreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou todas as 20 das mutações acima. Por conseguinte, as células hospedeiras da presente invenção podem compreender um ácido nucleico compreendendo qualquer um, qualquer duas, três, qualquer quatro, qualquer cinco, qualquer cinco, qualquer seis, qualquer sete, qualquer oito, qualquer nove, qualquer dez, qualquer onze, qualquer doze, qualquer 13, qualquer 14, qualquer 15, qualquer 16, qualquer 17, qualquer 18 ou qualquer 19 ou todas as 20 da mutações 731C>D, 732A>C, 734A>B, 737T>C, 746A>G, 749C>D, 752G>H, 758G>A, 761G>H, 764G>H, 818G>A, 824G>H, 830T>V, 833T>C, 845T>C, 846T>C, 848A>B or 848A>G, 849A>T, 850G>C e 851C>D.
[020] O ácido nucleico, usado na presente invenção, que codifica as proteínas Rep do vírus adeno-associado (AAV), Rep78 e Rep68, em que o promotor interno p19 do AAV foi inativado por mutações silenciosas, é preferencialmente um ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências nucleotídicas de acordo com a SEQ ID NO: 1a8,11a14e34a42. Nas formas de realização particularmente preferenciais, o referido ácido nucleico compreende a sequência nucleotídica de acordo com a SEQ ID NO: 1, 6, 8, 13, 14, 34 a 39,41 e 42.
[021] Nesse contexto, o termo "promotor interno", conforme usado neste documento, indica o fato de que o promotor p19 do AAV está localizado dentro da sequência codificante de Rep78 e Rep68 e faz parte da referida sequência codificante. Além disso, o termo "inativado" com relação ao promotor p19 do AAV indica o fato de que, ao introduzir mutações silenciosas na região do promotor p19 do AAV, o referido promotor teve a atividade de promotor abolida ou pelo menos fortemente reduzida (por exemplo, redução em pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%).
[022] As sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 1 a8, 11 a 14 e 34 a 42 representam a região do promotor p19 de AAV (nucleotídeos 651 a 1053 do genoma de AAV2), em que os padrões de mutação indicados na Tabela 2 abaixo estão presentes.
[023] Nas formas de realização preferenciais, o ácido nucleico usado na presente invenção que codifica as proteínas do vírus adeno-associado (AAV), Rep78 e Rep68, em que o promotor interno p19 do AAV foi inativado por mutações silenciosas, é preferencialmente um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionado do grupo que consiste nas sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 15 a 22, 25a 28 e 43 a 51. Nas formas de realização particularmente preferenciais, o referido ácido nucleico compreende a sequência nucleotídica de acordo com a SEQ ID NO: 15, 20, 22,27,28,43 a 48, 50 e 51.
[024] As sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 15 a 22,25a28e43a51 representam a região codificante de AAV para as proteínas Rep: Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40 (nucleotídeos 321 a 2252 do genoma de AAV2), em que a região do promotor p19 (nucleotídeos 651 a 1053 do genoma de AAV2) foi substituída pela região mutada do promotor p19 contendo as mutações indicadas na Tabela 2 abaixo.
TABELA 2: Padrões de mutação preferenciais na região do promotor p19.
SEQ = Padrão de =
B 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C; 746A>G; 115 muti9 749C>D; 752G>H; 758G>A; 761G>H; 764G>H; 818G>A; 824G>H; 830T>V; 833T>C; 845T>C; 848A>G; 849A>T; 850G>C; 851C>D 2/16 mut5 845T>C; 848A>G; 849A>T; 850G>C; 851C>D 317 848A>G 4/18 849A>T; 850G>C 5/19 845T>C 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 6/20 mut14 749C>D; 752G>H, 758G>A; 761G>H; 764G>H, 818G>A; 824G>H, 830T>V; 833T>C 7/21 mut10 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H; 758G>A; 761G>H; 764G>H 8/22 mut10-2 818G>A; 824G>H, 830T>V; 833T>C, 845T>C; urso 846T>C; 848A>B; 849A>T; 850G>C; 851C>D 11/25 846T>C; 848A>B 12/26 mut1-3 846T>C 13/27 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, 850G>C 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 14/98 mut20 749C>D; 752G>H, 758G>A; 761G>H; 764G>H, 818G>A; 824G>H, 830T>V; 833T>C, 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, 850G>C, 851C>D L : 34/43 SP1 -50 818G>A; 824G>H M . 35/44 TATA -20 830T>V; 833T>C
N 36/45 SP1-50 1 818G>A Oo 37/46 SP1 -50 2 824G>H
P 38/47 TATA -20 1 830T>V
Q 39/48 TATA -20 2 833T>C
R 40/49 (SP1-50 & 818G>A; 824G>H; 830T>V; 833T>C TATA -35 Ss . . . 41/50 (SP1 -50 & 818G>A; AA Er O 848A>B, TATA -20 ' T . : : 42/51 (TATA -20 & 830T>V; DA EA 848A>B, TATA -35 '
[025] Em outras formas de realização preferenciais, as uma ou mais mutações de acordo com a presente invenção que inativam o promotor interno p19 são mutações que resultam em uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, ou seja, substituições de aminoácidos que alteram um aminoácido por um aminoácido diferente com propriedades bioquímicas semelhantes (por exemplo, em relação à carga, hidrofobicidade ou tamanho). De preferência, as referidas uma ou mais substituições de aminoácidos são substituições de aminoácidos que ocorrem dentro da classe de aminoácidos alifáticos (Gly, Ala, Val, Leu, lle), dentro da classe de aminoácidos contendo hidroxila ou enxofre/selênio (Ser, Cys, Sec, Thr, Met), dentro da classe de aminoácidos básicos (His, Lys, Arg) ou dentro da classe de aminoácidos ácidos (Asp, Glu, Asn, Gln)
[026] Em determinadas formas de realização, as referidas uma ou mais substituições de aminoácidos compreendem as substituições de aminoácidos Leu176>Ala e/ou Ala168>Gly.
[027] Neste aspecto, o ácido nucleico usado na presente invenção, que codifica as proteínas Rep do vírus adeno-associado (AAV), Rep78 e Rep68, em que o promotor interno p19 do AAV foi inativado por mutações que resultam em substituições conservativas de aminoácidos, é preferencialmente um ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 9 e 10.
[028] Nesse contexto, o termo "inativado" em relação ao promotor p19 do AAV indica o fato de que, ao introduzir mutações que resultam em substituições conservativas de aminoácidos na região do promotor p19 do AAV, o referido promotor teve a atividade de promotor abolida ou pelo menos fortemente reduzida (por exemplo, redução em pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%).
[029] As sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 9 e representam a região do promotor p19 de AAV (nucleotídeos 651 a 1053 do genoma de AAV2), em que os padrões de mutação indicados na Tabela 3 abaixo estão presentes.
[030] Nas formas de realização preferenciais, o ácido nucleico usado na presente invenção, que codifica as proteínas Rep do vírus adeno-associado (AAV), Rep78 e Rep68, em que o promotor interno p19 do AAV foi inativado por mutações que resultam em substituições conservativas de aminoácidos, é um ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 23 e 24.
[031] As sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 23 e 24 representam a região codificante de AAV para as proteínas Rep: Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40 (nucleotídeos 321 a 2252 do genoma AAV2), em que a região do promotor p19 (nucleotídeos 651 a 1053 do genoma de AAV2) foi substituída pela região mutada do promotor p19 contendo as mutações indicadas na Tabela 3 abaixo.
TABELA 3: Padrões de mutação preferenciais na região do promotor p19.
SEQ Padrão Substituição de ID NO: de Mutações aminoacidos resultante Mutação
[032] O ácido nucleico compreendido na célula hospedeira da presente invenção pode compreender ainda pelo menos um elemento, selecionado do grupo que consiste em promotores induzíveis, regiões poli(A), marcadores de seleção, sequências IRES e elementos intensificadores. Promotores induzíveis adequados não são particularmente limitados e são conhecidos no estado da arte, por exemplo, promotores induzíveis por Tet, como o promotor TRE3G de terceira geração. As regiões poli(A) adequadas não são particularmente limitadas e são conhecidas no estado da arte, por exemplo, a região poli(A) de SV40. Marcadores de seleção adequados não são particularmente limitados e são conhecidos no estado da arte, por exemplo, cassetes de resistência a antibióticos, como cassetes de resistência a blasticidina ou ampicilina.
[033] A presente invenção também se refere a células hospedeiras compreendendo um ácido nucleico tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com um ácido nucleico como definido acima, desde que as mutações específicas definidas acima estejam presentes. Nesse contexto, o termo "desde que as mutações específicas definidas acima estejam presentes" se refere às seguintes situações (i) a (Xxxiii): (i) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com SEQ ID NOs: 1 ou 15, as mutações 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C; 746A>G; 749C>D; 752G>H; 758G>A; 761G>H; 764G>H; 818G>A; 824G>H; 830T>V; 833T>C; 845T>C; 848A>G; 849A>T; 850G>C e 851C>D estão presentes; (ii) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com SEQ ID NOs: 2 ou 16, as mutações 845T>C; 848A>G; 849A>T; 850G>C; e 851C>D estão presentes; (ii)) nas sequências —nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com SEQ ID NOs: 3 ou 17, a mutação 848A>G está presente; (iv) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com SEQ ID NOs: 4 ou 18, as mutações 849A>T; e 850G>C estão presentes;
(v) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 5 ou 19, a mutação 845T>C está presente; (vi) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com SEQ ID NOs: 6 ou 20, as mutações 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H, 758G>A; 761G>H; 764G>H, 818G>A; 824G>H, 830T>V; e 833T>C estão presentes; (vi) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com a SEQ ID NOs: 7 ou 21, as mutações 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H; 758G>A; 761G>H; e 764G>H estão presentes; (viii) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com a SEQ ID NOs: 8 ou 22, as mutações 818G>A; 824G>H, 830T>V; 833T>C, 845T>C; 846T>C; 848A>B; 849A>T; 850G>C; e 851C>D estão presentes; (ix) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com a SEQ ID NOs: 9 ou 23, as mutações 846T>G, 847T>C e 848A>B estão presentes; (x) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 10 ou 24, as mutações 823C>G e 824G>H estão presentes; (xi) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 11 ou 25, as mutações 846T>C; e 848A>B estão presentes;
(xi) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com a SEQ ID NOs: 12 ou 26, a mutação 846T>C está presente; (xiii) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com a SEQ ID NOs: 13 ou 27, as mutações 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849 A>T e 850G>C estão presentes; (xiv) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com SEQ ID NOs: 14 ou 28, as mutações 731C>D; 732A>C; 734A>B; 737T>C, 746A>G; 749C>D; 752G>H, 758G>A; 761G>H; 764G>H, 818G>A; 824G>H, 830T>V; 833T>C, 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T, 850G>C e 851C>D estão presentes; (Xv) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com a SEQ ID NOs: 34 ou 43, as mutações 818G>A e 824G>H estão presentes; (Xvi) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com a SEQ ID NOs: 35 ou 44, as mutações 830T>V e 833T>C estão presentes; (xvii) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com a SEQ ID NOs: 36 ou 45, a mutação 818G>A está presente; (xviii) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 37 ou 46, a mutação 824G>H está presente; (xix) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com SEQ ID NOs: 38 ou 47, a mutação 830T>V está presente;
(xx) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com SEQ ID NOs: 39 ou 48, a mutação 833T>C está presente; (xi) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com SEQ ID NOs: 40 ou 49, as mutações 818G>A; 824G>H; 830T>V; e 833T>C estão presentes; (xxii) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com SEQ ID NOs: 41 ou 50, as mutações 818G>A; 824G>H; 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T e 850G>C estão presentes; e (Xxili) nas sequências nucleotídicas derivadas das sequências nucleotídicas de acordo com a SEQ ID NOs: 42 ou 51, as mutações 830T>V, 833T>C, 845T>C, 846T>C; 848A>B, 849A>T e 850G>C estão presentes.
[034] De preferência, os referidos ácidos nucleicos têm pelo menos 70%, 72%, T4%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% de identidade de sequência com um ácido nucleico como definido acima. Em determinadas formas de realização, esses ácidos nucleicos têm 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 deleções, inserções ou substituições de nucleotídeos (trocas).
[035] Os respectivos ácidos nucleicos com uma identidade de sequência definida com um ácido nucleico como definido acima ou com deleções, inserções ou substituições específicas de nucleotídeos em relação a um ácido nucleico como definido acima excluem quaisquer ácidos nucleicos com qualquer tipo de mutação de mudança de quadro de leitura ou frameshift, bem como quaisquer ácidos nucleicos que codificam as proteínas Rep78 e Rep68 não funcionais, isto é, os referidos ácidos nucleicos ainda codificam as proteínas Rep78 e Rep68 funcionais.
[036] Nas formas de realização preferenciais, o ácido nucleico compreendido nas células hospedeiras da presente invenção é integrado de maneira estável no genoma da célula hospedeira. Em outras formas de realização preferenciais, o ácido nucleico compreendido nas células hospedeiras da presente invenção é constituído por um vetor, isto é, faz parte de um vetor. O referido vetor é preferencialmente um vetor selecionado do grupo que consiste em vetores plasmídicos, vetores virais, vetores cosmídeos e vetores cromossômicos artificiais. De preferência, o referido vetor é um vetor de expressão.
[037] De acordo com a presente invenção, o promotor interno p19 do AAV é inativado pela introdução de mutações silenciosas ou mutações que resultam em substituições conservativas de aminoácidos. Desta maneira, um ácido nucleico que codifica Rep78 e Rep68 pode ser colocado sob o controle de um promotor induzível, em que a expressão constitutiva de Rep52 e Rep40 não ocorre. No entanto, uma vez que a produção de AAV requer todas as quatro proteínas Rep, um ácido nucleico adicional que codifica Rep52 e Rep40 pode ser colocado sob o controle do mesmo promotor, de um promotor idêntico ou de outro promotor. Assim, nas formas de realização específicas, a célula hospedeira da presente invenção compreende ainda um ácido nucleico que codifica as proteínas Rep de AAV, Rep52 e Rep40, sob o controle de um promotor induzível. Este ácido nucleico pode fazer parte do vetor como definido acima, ou do ácido nucleico que codifica Rep78 e Rep68.
[038] As células hospedeiras adequadas para a presente invenção não são particularmente limitadas e são conhecidas no estado da arte.
Preferencialmente, as referidas células hospedeiras apresentam expressão constitutiva de E1A. Nas formas de realização preferenciais, as referidas células hospedeiras são células CAP, células HEK293 ou células Per.C6, isto é, são derivadas das referidas linhagens celulares.
[039] Métodos para gerar as células hospedeiras da presente invenção, isto é, métodos para a introdução dos ácidos nucleicos da presente invenção em células hospedeiras adequadas, não são particularmente limitados e são conhecidos no estado da arte. O mesmo se aplica aos métodos para a geração dos ácidos nucleicos e vetores da presente invenção.
[040] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se aos ácidos nucleicos e vetores como definidos acima.
[041] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a produção de vírus adeno-associado (AAV), que compreende a etapa de expressar de forma recombinante as proteínas Rep de AAV, Rep78 e Rep68, em uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção.
[042] Os respectivos métodos para gerar os ácidos nucleicos, vetores e/ou células hospedeiras necessários, bem como os respectivos métodos de expressão, não são particularmente limitados e são conhecidos no estado da arte.
[043] Preferencialmente, o método da presente invenção compreende ainda a etapa de expressar de forma recombinante as proteínas Rep de AAV, Rep, Rep52 e Rep40, nas referidas células hospedeiras.
[044] Conforme usado neste documento, o termo "compreendendo"/"compreende" inclui expressamente os termos "consistindo essencialmente em"/"consiste essencialmente em" e "consistindo em"/"consiste em", ou seja, todos os referidos termos são intercambiáveis entre si.
[045] De acordo com a presente invenção, são fornecidas células hospedeiras que podem expressar as proteínas Rep de AAV, Rep78 e Rep68, sem expressão constitutiva de Rep52 e Rep40. Isto é conseguido através do provimento de ácidos nucleicos em que a região do promotor interno p19 de AAV é inativada pela introdução de mutações específicas.
[046] Os promotores são ativados pela ligação de fatores de transcrição específicos e do complexo de transcrição basal; esses fatores reconhecem sítios de ligação específicos dentro da região do promotor que foram descritos anteriormente para o promotor p19. A mutação desses sítios de ligação elimina a ativação do promotor. Como a integridade das proteínas Rep longas tem que ser mantida, são escolhidas mutações que alteram a sequência nucleotídica, mas dentro do código genético que codifica o mesmo aminoácido e, portanto, resultam na formação da mesma proteína (mutações silenciosas) ou são escolhidas mutações que alteram a sequência nucleotídica que resultam em substituições conservativas de aminoácidos.
[047] Após a introdução das mutações acima, é possível separar as unidades de expressão para proteínas Rep longas e curtas: o cassete de expressão para as proteínas Rep longas contém o promotor p19 mutado com as referidas mutações. A unidade de expressão isolada para as proteínas Rep curtas começa a jusante do promotor p19 com o códon de início. A expressão de ambas as unidades de expressão pode então ser colocada sob regulação de um promotor induzível (como por exemplo, promotores induzíveis Tet). Com base nisso, uma linhagem celular de empacotamento/produtora estável pode ser gerada.
[048] As células hospedeiras, ácidos nucleicos, vetores e métodos da presente invenção representam um sistema para a produção de AAV que é vantajosamente caracterizado por uma reprodutibilidade superior, garantindo qualidade consistente, escalabilidade e eficiência em custos, e que não precisa do uso de vírus auxiliar.
[049] As figuras ilustram o seguinte:
[050] Figura 1: Vista esquemática geral do locus rep.
[051] Figura 2: Vista esquemática geral da construção de expressão para proteínas Rep induzíveis.
[052] Figura 3: Vista geral dos padrões de mutação analisados com as SEQ ID NOs. da região codificante correspondente das proteínas Rep de AAV2 (vide também Tabela 2). A indicação "SEQ-ID" na Figura 3 refere-se às respectivas SEQ ID NOs.
[053] Figura 4: Expressão de diferentes proteínas Rep em células CAP após transfecção com diferentes construções contendo mutações silenciosas dentro das sequências reguladoras do promotor p19 (Tabela 2) e a construção de tipo selvagem (wt). Os níveis de proteína foram detectados em lisados celulares de células CAP-T transfectadas transitoriamente 72 h após a transfecção usando anticorpo anti-replicase (Progen). Como controle, o lisado celular de células não transfectadas (Bl) foi incluído. A indicação dos números de "ID" na Figura 4 refere-se às respectivas SEQ ID NOs.
[054] Figura 5: Quantificação dos western blots anti-Rep. As bandas de proteína Rep foram quantificadas por análise densitométrica usando ImageJ. À proporção entre as bandas de proteína Rep longa e curta foi calculada e o wt foi ajustado para 1. Todos os outros valores foram normalizados pelo wt. A indicação dos números de "ID" na Figura 5 refere-se às respectivas SEQ ID NOs.
[055] Figura 6: Expressão induzível das proteínas Rep em uma linhagem celular derivada de CAP estável após indução com 1 ug/mL de doxiciclina. As proteínas Rep foram detectadas por imunotransferência com anticorpo anti- replicase (Progen). Como controle, o lisado celular de células não induzidas foi carregado (-Dox) Em -80 kDa, uma banda inespecífica (background) é detectada.
[056] Figura 7: Indução de proteínas Rep por adição de 1 pg/ml de doxiciclina em clones de célula única derivados de linhagem celular estável. As células foram transfectadas transitoriamente com os componentes necessários para a produção de rAAV5 e induzidas com 1 ug/mL de doxiciclina 5 h após a transfecção. 72 h após a transfecção, os lisados celulares foram preparados e a expressão das proteínas Rep foi detectada por imunotransferência com anticorpo anti-replicase (Progen). Os clones 5B6 e 2E3 expressam níveis muito baixos das proteínas Rep longas.
[057] Figura 8: Títulos virais da produção de rAAV5 por clones que expressam Rep induzíveis. Os genomas virais/mL foram medidos por qQPCR com uma combinação de iniciador/sonda que detectou o promotor de CMV usando o plasmídeo de transferência linearizado como padrão. Os clones de célula única 5B6 e 2E3 não mostram expressão clara das proteínas Rep longas e curtas e, portanto, também produzem apenas títulos muito baixos de rAAV5.
[058] Figura 9: (A & B): Expressão de diferentes proteínas Rep em células CAP após transfecção com diferentes construções contendo mutações dentro das sequências reguladoras do promotor p19 (Tabela 3), resultando em substituições conservativas de aminoácidos e a construção de tipo selvagem (wt). Os níveis de proteína foram detectados em lisados celulares de células CAP-T transfectadas transitoriamente 72 h após a transfecção usando anticorpo anti- replicase (Progen). Como controle, o lisado celular de células não transfectadas (BI) foi incluído.
(C): Produção viral após a transfecção de células CAP com a seguinte combinação de contruções: pStbl-Rep-p19mut-ID 47, 48 ou 37 ou wt, pStbl- TRE3SG-Rep50/42, pCMV-Tet3G, pHelper, pStbl-CMV-Cap5, pAAV-GFP. Os genomas virais/ml foram medidos por qPCR com uma combinação de iniciador/sonda que detecta o poli(A) de SV40 usando o plasmídeo de transferência linearizado como padrão.
[059] A indicação dos números de "ID" na Figura 9 refere-se às respectivas SEQ ID NOs.
[060] A presente invenção será ilustrada ainda nos exemplos a seguir, sem se limitar aos mesmos.
EXEMPLOS Procedimentos experimentais: Clonagem de construções de expressão.
[061] Síntese do locus rep de AAV2 com sítios de restrição para Hpal em cada extremidade e sítios reguladores dentro do promotor p19. A sequência genômica do AAV?2 foi derivada do GenBank: AFO43303 (nucleotídeos 162 a 2332). A sequência do locus sintético é mostrada na SEQ ID NO: 29.
[062] Diferentes construções para a região do promotor p19 (nucleotídeos 651 a 1053 do genoma de AAV2) foram projetadas contendo diferentes números de mutações silenciosas dentro das sequências reguladoras (Tabela 2) e produzidas sinteticamente.
[063] As respectivas construções de expressão foram produzidas por técnicas de clonagem padrão e verificadas por sequenciamento. Os componentes das construções de expressão finais pStbl-bsd-Rep, pStbl-bsd- Rep-p19mut-SEQ ID NO: 1-14, 34-42 foram o promotor p5, o locus Rep contendo o promotor p19 mutado ou selvagem, um poli (A) de SV40, um cassete de seleção de blasticidina sob o controle do promotor Ubc humano, um elemento intensificador ou enhancer para a transcrição estável das ORFs integradas, um PUC ori para propagação em E. coli e um cassete de resistência à ampicilina para seleção em E. coli.
[064] Uma construção que coloca as proteínas Rep sob o controle de um promotor induzível por Tet da terceira geração (promotor TRE3G) (Figura 2) foi produzida por técnicas padrão de clonagem e verificada por sequenciamento. À sequência final desta construção pStbl-bsd-TRE3G-Rep52/40-IRES-Rep78/68, iniciando do promotor TRE3G até o poli (A) de SV40 é mostrado na SEQ ID NO:
30. Componentes de pStbl-bsd-TRE3SG-Rep52/40-IRES-Rep78/68 são o promotor TRE3G, o locus Rep começando a partir do códon de iniciação das proteínas Rep curtas, uma sequência IRES de ECMV, o locus Rep contendo o promotor p19 mutado a partir do códon de iniciação das proteínas Rep longas, um poli (A) de SV40, um cassete de seleção de blasticidina sob o controle do promotor Ubc humano e um elemento intensificador para a transcrição estável das ORFs integradas.
Cultura de células.
[065] As células CAP foram rotineiramente cultivadas em meio PEM quimicamente definido e sem soro (Thermo Fisher Scientific), suplementado com L-alanil-L-glutamina a 4 MM (Biochrom, Alemanha) em frascos de agitação (125 mL; Corning) em uma incubadora agitada a 185 rpm (órbita de 5 cm), 5% de CO? e 37ºC.
[066] Durante a cultura de rotina, as células foram diluídas com meio fresco a uma densidade de células viáveis de 1 x 106º células/mL a cada 72 a 96 h. A densidade celular viável e a viabilidade foram determinadas por exclusão de azul de tripano utilizando um contador de células CEDEX XS (Innovatis, Roche Applied Science). A linhagem celular estável que expressa o ativador Tet-on-3G foi cultivada na presença de 25 ug/mL de G418; após nucleofecção com o pStbl- bsd-TRE3SG-Rep50/42-IRES-Rep78/68 foram adicionados 5 upoml de blasticidina.
Transfecção transitória e Western blot para testar a expressão da proteína Rep.
[067] A transfecção transitória foi realizada usando PElmax (PolySciences) em meio FreeStyle 293 (Thermo Fisher Scientific). 5 h após a transfecção, as células foram alimentadas com meio PEM completo (Thermo Fisher Scientific). Uma visão geral dos pools de transfecção transitória gerados é encontrada na Tabela 4 abaixo.
[068] A análise por Western Blot foi realizada com lisados de células das 1 x 10º células transfectadas utilizando anticorpo anti-replicase de camundongo (Progen, Alemanha) e anticorpos anti-ccamundongo marcados com peroxidase de rábano (Cell Signaling). As proteínas foram detectadas usando o kit Pierce ECL WB Substrate via detector de quimioluminescência (INTAS).
Nucleofecção e geração de pools estáveis.
[069] Pools estáveis foram gerados usando o Nucleofector da Lonza, de acordo com as instruções do fabricante. Uma linhagem celular CAP estável que expressa o transativador Tet-on-3G da terceira geração foi usada para nucleofecção com a construção de expressão induzível de Rep. Para cada reação de nucleofecção, 1 x 107 células foram coletadas por centrifugação (150 x g, 5 min). As células foram ressuspensas em 100 uL de solução completa de nucleofectores V (Lonza) e misturadas com 5 ug do vetor de expressão linearizado. A suspensão de DNA/célula foi transferida para uma cubeta e a nucleofecção foi realizada usando o programa X001. As células transfectadas foram transferidas para 12,5 mL de meio de crescimento e cultivadas tal como descrito antes, a 37ºC, 5% de CO>2 a 185 rpm.
[070] Para a geração de pools estáveis, as células foram sedimentadas por centrifugação e ressuspensas em meio de seleção (vide Tabela 4) 72 a 96h após a transfecção depois do cultivo em uma incubadora com agitação, como descrito anteriormente. TABELA 4: Expressão transitória de CAP-T gerada e pools estáveis de CAP com meios e vetores de expressão correspondentes. Linhagem celular CAP-T pStbl-bsd-Rep wt CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 15 transitório CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 16 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 17 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 18 transitório CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 19 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut ID 20 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 21 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 22 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 25 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 26 transitório CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 27 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 28 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 43 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 44 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 45 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 46 transitório CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 47 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 48 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 49 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 50 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 51 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 23 CAP-T pStbl-bsd-Rep p19mut-ID 24 transitório PEM + 4 mM GIh Tetono pStbl-bsd-TRE3G-Rep50/42- + 5 ug/mL de CAP-Tet-on-3G IRES-Rep78/68 blasticidina + 25 ug/mlL G418
[071] A indicação dos números de "ID" na Tabela 4 acima refere-se às respectivas SEQ ID NOs. Indução e transfecção transitória para testar a produção de AAV.
[072] Para testar a produção de AAV pelos clones estáveis de célula única com expressão induzível de Rep, foram realizadas transfecções transitórias como descrito anteriormente. As três construções seguintes foram usadas para fornecer os componentes adicionais para a produção de rAAV5 na proporção de 1:1:0,5 (pAAV-GFP:pHelper:pStbl-CMV-Cap5). 5 h após a transfecção, uma concentração final de 1 ug/ml de doxiciclina (Clontech) foi adicionada para induzir a expressão das proteínas Rep.
[073] 72 h após a transfecção, a suspensão celular foi coletada. As células foram lisadas pela adição de Triton-X a 0,5% e incubação durante 30 min a 37ºC com 1300 rpm. Após centrifugação, os sobrenadantes foram diluídos 10 vezes com tampão (Tris/HCI a 50 mM, pH 8,0; MgCl2 a 2 mM) e incubados com benzonase 125 U/mL (Merck Millipore) por 2 h a 37ºC. Utilizou-se a adição de EDTA a 2 mM e a incubação a 70ºC por 10 min para inativar a benzonase. O DNA viral foi purificado através do mini-kit RNA/DNA Viral Pure Link (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante.
qgPCR para determinar o título viral.
[074] A combinação seguinte de iniciadores/sonda duplamente marcada (ordenada na MWG, Eurofins; Tabela 5) dirigida contra o promotor de CMV ou de poli(A) de SV40 foi utilizada para medir o título viral: TABELA 5: Combinação de iniciador/sonda usada para medir o título viral Sonda CMV ROX-5" PA de DA 5-AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA-3' e de NO Sa 5-CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3' (SEQ ID NO: 54) TTT GTC-3-BHQ1
[075] Como padrão, foi utilizado o plasmídeo transgene linearizado com um número de cópias definido. A reação de qPCR continha os seguintes componentes: 2X Brilliant Multiplex qQPCR Master Mix (Agilent), nuclease isenta de H2O (Thermo Fisher Scientific), mistura de iniciador/sondas e amostra/padrão. O qPCR foi executado em um Agilent Mx3005P de acordo com as instruções do fabricante.
Exemplo 1: Efeitos de mutações silenciosas sobre a expressão de proteínas REP.
Introdução:
[076] As células CAP são células em suspensão derivadas de amniócitos humanos que foram imortalizadas por transfecção estável com uma construção que codifica E1A/E1B.
[077] As proteínas Rep de AAV são codificadas pelo genoma de AAV. Existem no total quatro proteínas Rep: Rep78 e Rep68 (expressas a partir do promotor p5); bem como Rep52 e Rep40 (expressas a partir do promotor p19 localizado na região codificante das proteínas Rep longas). Essas proteínas mediam a replicação e o empacotamento do genoma do AAV. No entanto, as referidas proteínas são tóxicas para as células quando expressas de forma estável.
[078] Para a inativação do promotor interno de p19 pela introdução de mutações silenciosas, os elementos reguladores do promotor p19 foram identificados e diferentes mutações silenciosas que não afetam a sequência proteica final foram inseridas na sequência nucleotídica desses elementos reguladores.
Resultados:
[079] A expressão de proteínas Rep longas e curtas foi separada com sucesso através da introdução de mutações silenciosas nas sequências reguladoras do promotor p19. A maioria das versões com mutações mostrou expressão significativamente reduzida das proteínas Rep curtas. A redução na expressão das proteínas Rep curtas já era visível após a introdução de uma única mutação, tornando-se mais pronunciada com a introdução de até 20 mutações (Figura 4, Figura 5). A separação dos motivos 5' e 3' mostrou que especialmente os motivos 3' próximos ao promotor (SP1 -50; TATA -35, TATA - 20) são importantes para a ativação do promotor interno p19. A mutação apenas do motivo TATA -20 levou a uma redução significativa, mas não total, da expressão das proteínas rep de curta duração, sugerindo que SP1 -50 e TATA - também são importantes para a ativação da expressão, fundamentada ainda pelo fato de que mutando tudo, exceto o TATA -20 também resultou em uma clara diminuição da expressão das proteínas rep de curta duração. Olhando mais de perto os motivos únicos, especialmente o motivo SP1 -50, a mutação 824G>H, mais exatamente, resultou em uma redução muito clara da expressão das proteínas Rep de curta duração. Além disso, a mutação de TATA -20 reduziu claramente a expressão de proteínas Rep de curta duração. Para TATA -35, apenas a combinação das diferentes mutações no motivo resultou em uma diminuição muito clara com a mutação 848A>G tendo o maior efeito sobre a expressão.
[080] Para gerar uma linhagem celular estável que expressasse de forma induzível as proteínas Rep, os genes para as proteínas Rep longas que carreiam as mutações silenciosas e os genes para as proteínas Rep curtas foram separados e cada um colocado sob controle de um promotor induzível. Para os experimentos posteriores, a construção p19mut com as 19 mutações foi escolhida.
Exemplo 2: Geração de clones CAP estáveis que expressam de forma induzível as proteínas Rep de AAV2.
Introdução:
[081] Para a geração de um cassete de expressão induzível para proteínas Rep AAV2, foi selecionado a variante p19mut com 19 mutações silenciosas.
[082] Promotores induzíveis por Tet da terceira geração (promotor TRE3G) foram usados para regular a expressão das proteínas Rep por adição de doxiciclina (visão geral da construção, vide Figura 2). As células CAP que expressam o transativador Tet-on-3G foram previamente geradas por nucleofecção e seleção com 25 ug/mL de G418. A construção pStbl-bsd-TRE3G- Rep52/40-IRES-Rep78/68 foi nucleofectada neste pool estável e selecionada com 5 ug/mL de blasticidina. Foi realizada clonagem de célula única usando diluições limitantes e os clones foram rastreados por Western Blot para proteínas Rep.
Resultados:
[083] Um pool de células CAP estáveis, carreando o transativador Tet- on-3G e o pStbl-bsd-TRE3G-Rep52/40-IRES-Rep78/68 foi analisado por Western blot para expressão das diferentes proteínas rep antes e após a indução com doxiciclina (Figura 6). Sem a indução de doxiciclina, não foram detectados sinais específicos para as proteínas Rep, enquanto as proteínas Rep, longas e curtas, foram expressas após indução com doxiciclina.
[084] A partir dos clones derivados de células únicas de pool estável, foram gerados por diluição limitante. Os clones derivados de células únicas foram analisados quanto à expressão das proteínas Rep após a indução com doxiciclina. Dos 5 clones, 3 clones expressaram as proteínas Rep longa e curta na proporção esperada, enquanto 2 dos clones exibiram níveis reduzidos das proteínas Rep longas (Figura 7).
[085] Os dados mostram que usando construções rep com mutações silenciosas no promotor p19, populações de células clonais com expressão induzível de proteínas Rep longas e curtas podem ser geradas. Esses clones podem servir de base para a geração de linhagens celulares de empacotamento/produtoras.
Exemplo 3: Produção de AAV em clones CAP estáveis que expressam de forma induzível as proteínas Rep de AAV2.
Introdução:
[086] Para provar que as linhagens celulares Rep induzíveis são capazes de produzir vetores AAV, os componentes ausentes para a produção de AAV foram introduzidos transitoriamente nas células dos 5 clones diferentes:
[087] As proteínas da cápside do AAV5, clonadas sob o controle do promotor de CMV no vetor pStbl, os genes auxiliares adicionais E2A, E4orf6, RNA do VA, bem como o vetor de transferência com o gene de interesse (GOI): pAAV-GFP.
Resultados:
[088] Utilizando clones de célula única da linhagem celular que expressa de forma induzível Rep estável, a produção de AAV pode ser mostrada após transfecção das células com os componentes necessários ausentes e indução de doxiciclina (Figura 8). Os dois clones com níveis mais baixos de proteínas Rep longas também mostraram títulos mais baixos de AAV conforme o esperado. Isso prova que essa abordagem resulta na produção de vetores virais e que agora é possível a geração de uma linhagem celular de empacotamento de AAV de alta produção.
Exemplo 4: Produção de AAV usando proteínas Rep com substituição conservativa de aminoácidos
[089] Para a inativação do promotor interno p19 pela introdução de mutações nas regiões do promotor que resultam em substituições conservativas de aminoácidos, foram identificados elementos reguladores do promotor p19. Três mutações distintas, 846T>G, 847T>C, 848A>B, foram inseridas na sequência nucleotídica da região TATA -20, resultando em uma substituição conservativa de Leu176>Ala (ID23). Duas mutações distintas, 823C>G, 824G>H, foram inseridas na sequência nucleotídica da região SP1 -50, resultando em uma substituição conservativa de Ala168>Gly (ID24). As diferentes construções foram introduzidas transitoriamente nas células CAP-T e o nível de expressão das proteínas Rep longa e curta foi analisado e comparado com o wt e mut-20 (I1D28) (Fig. 9A,B).
[090] Para a provar a funcionalidade das proteínas rep longas com substituição conservativa de aminoácidos na região TATA -20 ou SP1 -50, AAV foi produzido através da introdução da seguinte combinação de construções de forma transitória nas células CAP-T: uma construção que codifica as proteínas Rep longas, quer pStbl-Rep-p19mut-ID23, ou -ID24, ou -mut20, ou -wt, em conjunto com a uma construção que codifica as proteínas Rep curtas (pStbl- TRE3SG-Rep50/42), pCMV-Tet3G, e os genes auxiliares adicionais E2A, E4orf6, RNA do VA, bem como o vetor de transferência com gene de interesse (GOI): pAAV-GFP (Fig. 9C).
Resultados:
[091] A análise por Western blot revelou que a expressão de proteínas Rep longas e curtas foi separada com sucesso através da introdução de mutações distintas nas sequências reguladoras do promotor p19, resultando em substituições conservativas de aminoácidos na região SP1 -50 ou na região TATA -20.
[092] Como antes, a mutação na região SP1 -50 teve um efeito mais pronunciado que as mutações introduzidas no TATA box -20, confirmando o importante papel da SP1 -50 (Fig. 9A,B).
[093] É importante ressaltar que a funcionalidade das proteínas Rep longas que abrigam as substituições Leu176>Ala (ID23) ou Ala168>Gly (ID24) pode ser comprovada pela produção de partículas de AAV via produção transitória. O título da partícula AAV produzida com as proteínas Rep que abrigam a substituição conservativa de aminoácidos está na mesma faixa do wt ou controle mut-20, com alguma redução do título de AAV na amostra ID24 (Fig. 29C).
[094] A presente invenção refere-se às seguintes sequências nucleotídicas.
SEQ ID NO: 1 Região mutada do promotor p19 de AAV2 (com padrão de mutação) mut19 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGEGEGDEGHAACAAAGTHGTHGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACAT GGAACAGTACTTGTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGGTEGCTCGTGGACAAGEGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 2 Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut5 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGECGGGAACAAGGTGGTGGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCEGTGGACTAATAT GGAACAGTACTTGTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGECTCGTGGACAAGGGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 3 Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut1 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECEGEAACAAGGTGGTEGGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATAT GGAACAGTATTTGAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGETEGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGGTEGCTCGTGGACAAGEGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ1D NO: 4 Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut2 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTT GCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCEGGAACAAGETEG TGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGG GCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTATCCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACG GTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATC AGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAG
CTGGTCGEGTEGCTCETGGACAAGEGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQID NO: 5 Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut1-2 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECGEGAACAAGGTGGTGGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATAT GGAACAGTACTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGEGCTCGTGGACAAGGGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 6 Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut14 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTT GCCAARACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCEGEGEDGGHAACAAAGTHG THGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGG GCHTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACG GTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATC AGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAG
CTGGTCGEGTEGCTCETGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 7 Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut10 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTT GCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCEGEGEDGGHAACAAAGTHG THGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGG GCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACG GTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATC AGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAG
CTGGTCGEGTEGCTCETGEACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 8 Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut10-2 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECEGEAACAAGGTGGTEGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGEGCHTGGACVAACAT GGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGGTEGCTCGTGGACAAGEGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 9 Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut3 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTT GCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGETGEG TGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGG GCGTGGACTAATATGGAACAGTATGCBAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACG GTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATC AGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAG
CTGGTCGEGTEGCTCETGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 10 Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut2-2 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECGGGAACAAGGTGGTEGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGEHTGGACTAATAT GGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGETEEGCTCGTGGACAAGEGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 11
Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut2-3 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTT GCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGETGG TGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGG GCGTGGACTAATATGGAACAGTATCTBAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACG GTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATC AGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAG
CTGGTCGEGTEGCTCETGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 12 Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut1-3 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECEGEAACAAGGTGGTEGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATAT GGAACAGTATCTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGETEGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGGTEECTCGTGGACAAGEGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 13 Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut5-2 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTT GCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGETGEG TGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGG GCGTGGACTAATATGGAACAGTACCTBTCCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACG GTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATC AGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAG
CTGGTCGEGTEGCTCETEGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 14 Região mutada do promotor p19 de AAV2 mut20 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGEGEGDEGHAACAAAGTHGTHGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACAT GGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGETEGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGETEEGCTCEGTGGACAAGEGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 15 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 mut19 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGECCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGEGEGDEGHAACAAAGTH GTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAMAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGECHT GGACVAACATGGAACAGTACTTGTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGG ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGG GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 16 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com região mutada do promotor p19 mut5 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEGAGECGGGAACAAGETGE GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTEGECET GGACTAATATGGAACAGTACTTGTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAMAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTEGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAMACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCEGTEGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAMAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAMATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 17
Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com região mutada do promotor p19 mut1 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutação na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGETGEGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGEAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGECEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAMAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGEGCGET GGACTAATATGGAACAGTATTTGAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAMACGGTTEGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTEGCTCETEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAMAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGG ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGCAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGEACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACEGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAMAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 18 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com região mutada do promotor p19 mut2 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutação na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGEGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGEAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGEGCEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGEGCET GGACTAATATGGAACAGTATTTATCCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAMAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 19 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com região mutada do promotor p19 mut1-2 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutação na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGETGECCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCEGTGTGAGTAAGGCCCCGEGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEGAGECEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAMAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGEGCET GGACTAATATGGAACAGTACTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTEGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTEGCTCETEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGG GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACEGETGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 20 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 mut14 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutação na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGEGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGEAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGEGEGDEGHAACAAAGTH GTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGECHT GGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTEGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTEGCTCETEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAMATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGG ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCEGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACEGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 21 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 mut10 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutação na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGEGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGETCACAAAGACDCGBAACGGCGCCEGEGEDEGHAACAAAGTH GTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTEGECET GGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGETEGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAMACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCEGTEGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAMAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 22
Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 mut10-2 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutação na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGETGEGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGEAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGECEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGECHT GGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAMACGGTTEGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTEGCTCETEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAMAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGG ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTEGCAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGEACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACEGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAMAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 23 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 mut3 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutação na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGEGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGEAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGEGCEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGEGCET GGACTAATATGGAACAGTATGCBAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAMAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 24 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 mut2-2 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutação na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGETGECCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCEGTGTGAGTAAGGCCCCGEGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEGAGECEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAMAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGGHT GGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGETEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTEGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGG GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACEGETGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 25 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 mut2-3 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutação na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGEGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGEAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGECEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAMAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGEGCGET GGACTAATATGGAACAGTATCTBAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTEGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTEGCTCETEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAMATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGG ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCEGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACEGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 26 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 mut1-3 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutação na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGEGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECGGGAACAAGETGE GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTEGECET GGACTAATATGGAACAGTATCTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGETEGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAMACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAMAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 27
Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 mut5-2 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutação na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGETGEGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGEAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGECEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAMAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGEGCGET GGACTAATATGGAACAGTACCTBTCCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAMACGGTTEGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTEGCTCETEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAMAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGG ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGCAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGEACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACEGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAMAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 28 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 mut20 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutação na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGECCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGECCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACDCGBAACGGCGCCGEGEGDEGHAACAAAGTH GTHGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGEGCHT GGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGECCTGCAACTACCGEGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCEGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 29 Locus rep de AAV2 sintético negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: sítios de restrição para Hpal
GTTAACTGACGTGAATTACGTCATAGGGTTAGGGAGGTCCTGTATTAGAGGTCACGT GAGTGTTTTGCGACATTTTGCGACACCATGTGGTCACGCTGGGTATTTAAGCCCGAGTGAGCAC GCAGGGTCTCCATTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCGCAGCCGCCATGCCEGEGTTTTACGAGA TTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAA CTGGGTEGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAG CAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGA GTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCA CGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGC GAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCEGTCA CAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECEEGGAACAAGGTGGTEGATGAGTGCTACATCCCCAATTA CTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGEGCETGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGC GCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCECAGA CGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAAC TTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGETGECTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAG TGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAA TCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCT GGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAAC GGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGA GGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGECCATAGC CCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGT GTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGEGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCEGCCA AAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGA CCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACG ACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGG ATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCA CGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGEGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCECC AGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGÇ ACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCAT GAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTC ACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCG TCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTG CACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAA ATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATA AGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCECAGAGCGGCATAAGGACG
ACAGCAGGGGTTAAC SEQ ID NO: 30 Construção de expressão induzível para proteínas Rep de AAV2
GTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATA GAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTAT CAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTA CTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAA GCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCC TGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAA GTCGACACCGGGGCCCAGATCTATCGATCGGCCGGATAACGCCACCATGGAGCTGGTCGEGTEG CTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCT CCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGETCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGAT TATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCC AGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCT TTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTECAAC TACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAAC TGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGE GGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGET GGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACC AACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACC GGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGA AGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTC AAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGEGG TGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAG GTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGC GAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCT TTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACAT TCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTG GATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCA GATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAGATAACTGAGGGATAGAATTCCGCCCCCCCCCCCTAAC GTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCA TATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCC TAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTT CCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCECC CACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGECCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGECGEGC ACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGC GTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGEGC CTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCA CGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATAGTTATCGCCGCCATGCCGGGETTTT ACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTT TGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTG ATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTEGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGECC GTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCA CATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAG ATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCG CGGTCACAAAGACACGGAACGGCGCCGGGGGAGGCAACAAAGTCGTCGATGAGTGCTACATCCC CAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCTTGGACCAACATGGAACAGTAC TTGTCGGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGT CGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATC AAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGEGTEGCTCGTEGACAAGGGGATTACCTCGGAGÇ AAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGT CCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGA CTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAA CTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCG GCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGEC CATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAAC GACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGEGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTEGAGT CGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGECCCA GATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAAC TCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCC GTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAA GGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCC GCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGA CGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGT GGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATC TGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTT CTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGA CGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATG ATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAG TTATCATTTAAATGGCGCGCCCACGTGGGTACCGCGGCCGCEGEGATCCAGACATGATAAGATA CATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATT TGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATT GCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTCGGATCCTCTAGAGTC
GACCTGCAGGCA SEQ ID NO: 31 Iniciador de CMV direto
AAATGGCCCGCCTGGCATTATG SEQ ID NO: 32 Iniciador de CMV reverso
AAACCGCTATCCACGCCCATTG SEQ ID NO: 33 Sonda CMV
ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATC SEQ ID NO: 34 Região mutada do promotor p19 de AAV2 (com padrão de mutação) L (SP1 -50) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGECGGEAACAAGETGGTGGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACTAATAT GGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGECTCGTGGACAAGGGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 35 Região mutada do promotor p19 de AAV2 M (TATA -20) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTT GCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGETGEG TGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGG GCGTGGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACG GTTGGTGECECAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATC AGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAG
CTGGTCGEGTEGCTCETEGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 36 Região mutada do promotor p19 de AAV2 N (SP1 -50 1 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTT GCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGETGG TGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGG GCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACG GTTGGTGGCEGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATC AGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAG
CTGGTCGEGTEGCTCETEGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 37 Região mutada do promotor p19 de AAV2 O (SP1 -50 2) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECEGEAACAAGETGGTEGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGEGCHTGGACTAATAT GGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTEECTCETGGACAAGEGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 38 Região mutada do promotor p19 de AAV2 P (TATA -20 1) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECEGEAACAAGGTGGTEGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGEGCGTGGACVAATAT GGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTEGCTCEGTGGACAAGEGGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 39 Região mutada do promotor p19 de AAV2 Q (TATA -20 2)
negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECEGEAACAAGGTGGTEGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGEGCEGTGGACTAACAT GGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGGTEGCTCETGGACAAGEGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 40 Região mutada do promotor p19 de AAV2 R (SP1 -50 & TATA -35) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECGGGAACAAGGTGGTGGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACVAACAT GGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGECTCGTGGACAAGEGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 41 Região mutada do promotor p19 de AAV2 S (SP1 -50 & TATA -20) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGECGGGAACAAGGTGGTGGATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHTGGACTAATAT GGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGG TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGECTCGTGGACAAGGGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 42 Região mutada do promotor p19 de AAV2 T (TATA -20 e TATA -35 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
CAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCA AACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECGGGAACAAGETGGTGCATGAGT GCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGEGCETECACVAACAT GGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTG ACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGE TGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTGGCTCGTGGACAAGGGGAT
TACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGG SEQ ID NO: 43 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 L (SP-1) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGEGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECEGEAACAAGETGE GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAMAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHT GGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAMAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTEGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGEGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAMACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCEGTEGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAMAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAMATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 44
Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 M (TATA -20) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGETGEGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGEAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGECEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAMAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGEGCGET GGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAMACGGTTEGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTEGCTCETEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAMAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGG ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGCAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGEACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACEGGTECGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAMAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 45 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 N (SP1 -50 1) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGECCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGEGCEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCET GGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGETCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGEGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 46 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 O (SP1 -50 2 negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGETGECCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCEGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEGAGECEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAMAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCHT GGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGETEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTEGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGG GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACEGETGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 47 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 P (TATA -20 1) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGEGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGEAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGECEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAMAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGEGCGET GGACVAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTEGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTEGCTCETEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGG ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCEGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACEGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 48 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 Q (TATA -20 2) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGEGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEAGECGGGAACAAGETGE GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTEGECET GGACTAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGETEGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGC CTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAMACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCEGTEGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAMAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 49
Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 R (SP1 -50 & TATA -35) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGETGEGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGEAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGECEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGECHT GGACVAACATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAMACGGTTEGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTEGCTCETEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAMAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGG ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTEGCAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGEACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACEGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAMAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 50 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 S (SP1 -50 & TATA -20) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGEGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGECCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGECEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAATGGGCHT GGACTAATATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAMAGATTATGAGC CTGACTAAMAACCGCCCCCGACTACCTGGTGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGE ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGEGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 51 Região codificante das proteínas Rep de AAV2 com a região mutada do promotor p19 T (TATA -20 e TATA -35) negrito: sítios reguladores dentro do promotor p19 sublinhado: mutações na região do promotor p19
ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTG CCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGETGECCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATT CTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGA CTTTCTGACGGAATGGCGCCEGTGTGAGTAAGGCCCCGEGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAG AAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTT TGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCC GACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGEGAGECEGEAACAAGETG GTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAMAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGEGCET GGACVAACATGGAACAGTACCTBTCDGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTEGTEGC GCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCT GATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGEGTEGCTCGTEG ACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAA TGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAMATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAMAGATTATGAGC CTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGETGEGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATC GGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGG ATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGE AAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCA ATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTEGCAGGAGGGGAAGAT GACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCEGTGEACCAG AAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGT GCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTT CAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAA GACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGE GTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGA GTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA AACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAA TGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGT GTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCAT ATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACT GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGC
TCGAGGACACTCTCTCTGA SEQ ID NO: 52 Iniciador de poli(A) de SV40 direto
AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA SEQ ID NO: 53 Iniciador de poli(A) de SV40 reverso
CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT SEQ ID NO: 54 Sonda PoliA de SV40 AGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGIC.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula hospedeira CARACTERIZADA por compreender um ácido nucleico que codifica as proteínas Rep do vírus adeno-associado (AAV), Rep78 e Rep68, em que o promotor interno p19 do AAV foi inativado por uma ou mais mutações que mantêm a funcionalidade das referidas proteínas Rep78 e Rep68.
2. Célula — hospedeira, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que as referidas uma ou mais mutações estão dentro de pelo menos uma da região SP1 -50, região TATA -20 e região TATA - do promotor p19.
3. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que as referidas uma ou mais mutações são mutações silenciosas.
4. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida uma ou mais mutações compreendem pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste nas mutações 731C>D, 732A>C, 734A>B, 737T>C, 746A>G, 749C>D, 752G>H, 758G>A, 761G>H, 764G>H, 818G>A, 824G>H, 830T>V, 833T>C, 845T>C, 846T>C, 8484A>B, 848A>G, 849A>T, 850G>C e 851C>D.
5. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido ácido nucleico compreende pelo menos uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 1a8, 11al14e34a 42
6. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido ácido nucleico compreende pelo menos uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas sequências nucleotídicas de acordo com as SEQ ID NOs: 15 a 22, 25a 28 e 43 a 51.
7. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que as referidas uma ou mais mutações são mutações que resultam em uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos.
8. Célula — hospedeira, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que as referidas uma ou mais substituições de aminoácidos são substituições de aminoácidos dentro da classe de aminoácidos alifáticos (Gly, Ala, Val, Leu, Ile), dentro da classe de aminoácidos contendo hidroxila ou enxofre/selênio (Ser, Cys, Sec, Thr, Met), dentro da classe de aminoácidos básicos (His, Lys, Arg) ou dentro da classe de aminoácidos ácidos (Asp, Glu, Asn, Gln).
9. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido ácido nucleico compreende pelo menos uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas sequências nucleotídicas de acordo com a SEQ ID NOs: 9 e 10.
10. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido ácido nucleico compreende pelo menos uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas sequências nucleotídicas de acordo com a SEQ ID NOs: 23 e 24.
11. Célula hospedeira CARACTERIZADA por compreender um ácido nucleico com pelo menos 70% de identidade de sequência com um ácido nucleico definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, desde que as mutações específicas definidas nas referidas reivindicações estejam presentes.
12. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 11, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido ácido nucleico é integrado de maneira estável no genoma da célula hospedeira ou está compreendido em um vetor.
13. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADA por compreender ainda um ácido nucleico que codifica as proteínas Rep de AAV, Rep52 e Rep40, sob o controle de um promotor induzível.
14. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a13, CARACTERIZADA por ser selecionada do grupo que consiste em células CAP, células HEK293 e células Per.C6.
15. Ácido nucleico CARACTERIZADO por ser definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou um vetor definido na reivindicação 12.
16. Método para a produção de vírus adeno-associado (AAV), CARACTERIZADO por compreender a etapa de expressar de forma recombinante as proteínas Rep78 e Rep68 da AAV em uma célula hospedeira definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
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