JP2003344404A - 核酸選別用センサーチップ - Google Patents
核酸選別用センサーチップInfo
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】タンパク質に結合する核酸を、精度よくかつ迅
速、簡便に選別する。 【解決手段】表面プラズモン共鳴センサーチップにＮＴ
Ａ基を介してポリペプチドを結合せしめて、核酸の選別
のために用いる表面プラズモン共鳴センサーチップとす
る。
速、簡便に選別する。 【解決手段】表面プラズモン共鳴センサーチップにＮＴ
Ａ基を介してポリペプチドを結合せしめて、核酸の選別
のために用いる表面プラズモン共鳴センサーチップとす
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ポリペプチドに結
合する核酸を選別するための表面プラズモン共鳴測定用
センサーチップ、およびこれを用いた核酸の選別方法に
関する。
合する核酸を選別するための表面プラズモン共鳴測定用
センサーチップ、およびこれを用いた核酸の選別方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】DNA結合蛋白質など核酸と特異的に結合
する分子は、核酸の配列を認識して、その機能を発現す
る。 DNA結合蛋白質が認識する核酸配列を決定すること
は、その蛋白質の機能を知る上で極めて重要である。従
来より、配列をランダム化した核酸分子集合から、蛋白
質などに結合するものを選別し、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）で増幅し、これをさらに選別して増幅する、
というサイクルを繰り返すことによって、結合する核酸
分子の比率を上げた後、配列決定をすることが行われて
きた。このような配列決定においては、上記蛋白質に結
合する核酸の選別法として、（１）蛋白質を固定化した
カラムやビーズに核酸分子集合の溶液を作用させ、結合
しない核酸を洗い流した後、結合した核酸のみを溶出す
る方法、（２）蛋白質と核酸分子集合の溶液を混合後、
蛋白質に親和性の高いニトロセルロース膜に作用させ
て、結合しない核酸を洗い流した後、結合した核酸のみ
を溶出する方法、（３）ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により蛋白質−核酸複合体に相当するバンドを切り出
す方法等が行われてきた。
する分子は、核酸の配列を認識して、その機能を発現す
る。 DNA結合蛋白質が認識する核酸配列を決定すること
は、その蛋白質の機能を知る上で極めて重要である。従
来より、配列をランダム化した核酸分子集合から、蛋白
質などに結合するものを選別し、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）で増幅し、これをさらに選別して増幅する、
というサイクルを繰り返すことによって、結合する核酸
分子の比率を上げた後、配列決定をすることが行われて
きた。このような配列決定においては、上記蛋白質に結
合する核酸の選別法として、（１）蛋白質を固定化した
カラムやビーズに核酸分子集合の溶液を作用させ、結合
しない核酸を洗い流した後、結合した核酸のみを溶出す
る方法、（２）蛋白質と核酸分子集合の溶液を混合後、
蛋白質に親和性の高いニトロセルロース膜に作用させ
て、結合しない核酸を洗い流した後、結合した核酸のみ
を溶出する方法、（３）ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により蛋白質−核酸複合体に相当するバンドを切り出
す方法等が行われてきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これら従来の
方法では、蛋白質の固定化や核酸の結合状態に関する情
報を実験中にリアルタイムで得ることが不可能であるた
め、蛋白質の固定化量が所定の固定化量か否か、あるい
はタンパク質と核酸とがタンパク質の核酸認識部位を介
して真に結合しているか否かを判別することが容易でな
かった、また、このような判別の困難性により、タンパ
ク質の固定化あるいは核酸の結合を行うための適切な実
験条件の調整も容易でなく、蛋白質が十分固定化されて
いない条件や、核酸が十分結合しない条件で、実験を進
める危険性があった。このため、従来の方法では、例え
ば、タンパク質の核酸認識部位を介して結合するもの以
外にビーズや膜等への非特異的吸着により見かけ上結合
している核酸も選別してしまうことや、選別サイクルの
不足から、結合する核酸分子の比率が十分でない状態で
配列決定することなどにより目的の結果を得られない場
合も生じていた。
方法では、蛋白質の固定化や核酸の結合状態に関する情
報を実験中にリアルタイムで得ることが不可能であるた
め、蛋白質の固定化量が所定の固定化量か否か、あるい
はタンパク質と核酸とがタンパク質の核酸認識部位を介
して真に結合しているか否かを判別することが容易でな
かった、また、このような判別の困難性により、タンパ
ク質の固定化あるいは核酸の結合を行うための適切な実
験条件の調整も容易でなく、蛋白質が十分固定化されて
いない条件や、核酸が十分結合しない条件で、実験を進
める危険性があった。このため、従来の方法では、例え
ば、タンパク質の核酸認識部位を介して結合するもの以
外にビーズや膜等への非特異的吸着により見かけ上結合
している核酸も選別してしまうことや、選別サイクルの
不足から、結合する核酸分子の比率が十分でない状態で
配列決定することなどにより目的の結果を得られない場
合も生じていた。
【０００４】本発明の課題は、これら従来技術の問題点
を解消することにあり、タンパク質の固定化及び核酸の
結合状態をリアルタイムで検出可能とし、 このためポ
リペプチドの固定化および該固定化されたポリペプチド
と核酸との結合が完全で、特にポリペプチドの核酸認識
部位を介してのみタンパク質と核酸とが結合したと実質
的にみなし得る状態において、このように結合した核酸
を選別する手段を提供することにあり、これによりポリ
ペプチドが認識する核酸の塩基配列の決定、タンパク質
あるいは、核酸の機能解析等を迅速かつ正確に行えるよ
うにするものである。
を解消することにあり、タンパク質の固定化及び核酸の
結合状態をリアルタイムで検出可能とし、 このためポ
リペプチドの固定化および該固定化されたポリペプチド
と核酸との結合が完全で、特にポリペプチドの核酸認識
部位を介してのみタンパク質と核酸とが結合したと実質
的にみなし得る状態において、このように結合した核酸
を選別する手段を提供することにあり、これによりポリ
ペプチドが認識する核酸の塩基配列の決定、タンパク質
あるいは、核酸の機能解析等を迅速かつ正確に行えるよ
うにするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手投】本発明者は鋭意研究の結
果、表面プラズモン共鳴センサーチップにＮＴＡ基を導
入して修飾センサーチップを作成し、このＮＴＡ基を介
してオリゴHisタグを含むポリペプチドを固定化し、さ
らに、この修飾センサーチップを使用して、表面プラズ
モン共鳴法により固定化されたポリペプチドと核酸との
結合状態を検出、確認して、核酸の選別を行うことによ
り、上記課題を解決しうることを見いだし、本発明を完
成するに至ったものである。すなわち本発明は以下の
（１）〜（６）に係るものである。 （１）ポリペプチドを固定化するためのＮＴＡ基をその
表面上に有することを特徴とする、ポリペプチドに結合
する核酸を選別するために用いる表面プラズモン共鳴測
定用センサーチップ。 （２）ＮＴＡ基を介してＨｉｓタグを含むポリペプチド
が固定化されていることを特徴とする、ポリペプチドに
結合する核酸を選別するために用いる表面プラズモン共
鳴測定用センサーチップ。 （３）表面に存在するカルボキシメチル基の密度が低減
化されている表面プラズモン共鳴センサーチップに対し
て、ＮＴＡ基の導入を行ったものである上記（１）また
は（２）に記載のセンサーチップ。 （４）表面プラズモン共鳴法による測定において、配列
番号１の蛋白質を平衡状態で４００〜６００ＲＵ相当分
固定化し得る量のカルボキシメチル基を有する表面プラ
ズモン共鳴センサーチップに対して、ＮＴＡ基の導入を
行ったものである上記（１）または（２）に記載のセン
サーチップ。 （５）ＮＴＡ基をその表面に有する表面プラズモン共鳴
測定用センサーチップにＨｉｓタグを含むポリペプチド
を固定化したセンサーチップに、核酸含有溶液を流し、
ポリペプチドと結合した核酸を選別する方法であって、
固定されたポリペプチドに対する核酸ポリペプチドの結
合状態を、表面プラズモン共鳴装置により検出しつつ核
酸の選別を行うことを特徴とする核酸の選別方法。
果、表面プラズモン共鳴センサーチップにＮＴＡ基を導
入して修飾センサーチップを作成し、このＮＴＡ基を介
してオリゴHisタグを含むポリペプチドを固定化し、さ
らに、この修飾センサーチップを使用して、表面プラズ
モン共鳴法により固定化されたポリペプチドと核酸との
結合状態を検出、確認して、核酸の選別を行うことによ
り、上記課題を解決しうることを見いだし、本発明を完
成するに至ったものである。すなわち本発明は以下の
（１）〜（６）に係るものである。 （１）ポリペプチドを固定化するためのＮＴＡ基をその
表面上に有することを特徴とする、ポリペプチドに結合
する核酸を選別するために用いる表面プラズモン共鳴測
定用センサーチップ。 （２）ＮＴＡ基を介してＨｉｓタグを含むポリペプチド
が固定化されていることを特徴とする、ポリペプチドに
結合する核酸を選別するために用いる表面プラズモン共
鳴測定用センサーチップ。 （３）表面に存在するカルボキシメチル基の密度が低減
化されている表面プラズモン共鳴センサーチップに対し
て、ＮＴＡ基の導入を行ったものである上記（１）また
は（２）に記載のセンサーチップ。 （４）表面プラズモン共鳴法による測定において、配列
番号１の蛋白質を平衡状態で４００〜６００ＲＵ相当分
固定化し得る量のカルボキシメチル基を有する表面プラ
ズモン共鳴センサーチップに対して、ＮＴＡ基の導入を
行ったものである上記（１）または（２）に記載のセン
サーチップ。 （５）ＮＴＡ基をその表面に有する表面プラズモン共鳴
測定用センサーチップにＨｉｓタグを含むポリペプチド
を固定化したセンサーチップに、核酸含有溶液を流し、
ポリペプチドと結合した核酸を選別する方法であって、
固定されたポリペプチドに対する核酸ポリペプチドの結
合状態を、表面プラズモン共鳴装置により検出しつつ核
酸の選別を行うことを特徴とする核酸の選別方法。
【０００６】以下、本発明をさらに詳細に説明する。表
面プラズモン共鳴法は、金等の金属薄膜で作られたセン
サーチップ上で分子を反応させたときに起こる薄膜の微
少な屈折率の変化を光で検出するというものであり、反
応による分子の付加、脱離に伴う質量の増減をリアルタ
イムで検出可能なものである。本発明においては、セン
サーチップの金属薄膜表面の一部にカルボキシメチルデ
キストランの薄膜層を設けたものを使用する。チップ自
体の大きさは8.9cm×2.5cmであり、カルボキシメチルデ
キストラン薄膜層部分の大きさは0.7cm×0.7cmである。
面プラズモン共鳴法は、金等の金属薄膜で作られたセン
サーチップ上で分子を反応させたときに起こる薄膜の微
少な屈折率の変化を光で検出するというものであり、反
応による分子の付加、脱離に伴う質量の増減をリアルタ
イムで検出可能なものである。本発明においては、セン
サーチップの金属薄膜表面の一部にカルボキシメチルデ
キストランの薄膜層を設けたものを使用する。チップ自
体の大きさは8.9cm×2.5cmであり、カルボキシメチルデ
キストラン薄膜層部分の大きさは0.7cm×0.7cmである。
【０００７】本発明において、センサーチップにポリペ
プチドを固定化するためには、センサーチップにＮＴＡ
基を導入し、ＮＴＡ基を介してポリペプチドを固定化す
るが、ＮＴＡ基は、上記カルボキシメチルデキストラン
のカルボキシメチル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（ＮＨＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）
等で活性化したのち、エタノールアミンとＮ−（５−ア
ミノ−１−カルボキシペンチル）−イミノジ酢酸を反応
させ、エタノールアミンによるブロッキングをするとい
うアミンカップリング反応により、センサーチップ上に
導入する。すなわち、本発明にいうＮＴＡ基とは、Ｎ−
（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）−イミノジ酢
酸のアミンカップリングにより導入される基であり、以
下の部分構造式を有する。
プチドを固定化するためには、センサーチップにＮＴＡ
基を導入し、ＮＴＡ基を介してポリペプチドを固定化す
るが、ＮＴＡ基は、上記カルボキシメチルデキストラン
のカルボキシメチル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（ＮＨＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）
等で活性化したのち、エタノールアミンとＮ−（５−ア
ミノ−１−カルボキシペンチル）−イミノジ酢酸を反応
させ、エタノールアミンによるブロッキングをするとい
うアミンカップリング反応により、センサーチップ上に
導入する。すなわち、本発明にいうＮＴＡ基とは、Ｎ−
（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）−イミノジ酢
酸のアミンカップリングにより導入される基であり、以
下の部分構造式を有する。
【化１】
【０００８】ＮＴＡ基によるポリペプチドの固定化に
は、ＮＴＡ基にＮｉ２＋等の金属イオンを配位結合し、
一方固定化されるタンパク質にはオリゴＨｉｓタグを付
加し、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ基にこの付加したＨｉｓタグを
配位結合させることによりポリペプチドを固定化する。
従来から、表面カルボキシルメチル基の密度の異なる種
々のセンサーチップが知られているが、本発明において
使用するセンサーチップとしては表面カルボキシメチル
基の量が少ない方が好ましく、表面に存在するカルボキ
シメチル基の密度が低減化されたセンサーチップを用い
て、該チップにＮＴＡ基を導入して、ポリペプチドを固
定化することが望ましい。
は、ＮＴＡ基にＮｉ２＋等の金属イオンを配位結合し、
一方固定化されるタンパク質にはオリゴＨｉｓタグを付
加し、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ基にこの付加したＨｉｓタグを
配位結合させることによりポリペプチドを固定化する。
従来から、表面カルボキシルメチル基の密度の異なる種
々のセンサーチップが知られているが、本発明において
使用するセンサーチップとしては表面カルボキシメチル
基の量が少ない方が好ましく、表面に存在するカルボキ
シメチル基の密度が低減化されたセンサーチップを用い
て、該チップにＮＴＡ基を導入して、ポリペプチドを固
定化することが望ましい。
【０００９】この理由は、ＮＴＡ基の導入に際して、カ
ルボキシメチルデキストラン薄膜層上のカルボキシメチ
ル基の全ては反応せず、これによりポリペプチドが固定
されたチップ上に残存する。このカルボキシメチル基は
負電荷を持ち、該基が表面上に多く存在すると、センサ
ーチップ表面の負電荷が多くなり、同じく負電荷を持つ
核酸との反発により結合を阻害するためである。 した
がって、本発明においては、カルボキシメチル基の密度
が低いセンサーチップを使用して、ＮＴＡ基の導入、ポ
リペプチドの固定化を行い、残存するカルボキシメチル
基の量を減らすことが有利な結果を生じる。本発明にお
いて、ポリペプチドに結合する核酸を選別するには、例
えば、別途作成されたポリペプチドが固定化されたセン
サーチップを、表面プラズモン共鳴測定装置にセット
し、該チップに核酸が含有する試料溶液を流して、結合
状態を検出しつつ、結合しなかった核酸を洗い流した
後、ポリペプチドに結合した核酸のみを解離し、回収す
るが、該固定化されたポリペプチドに対する核酸の結合
状態のみを検出するのではなく、ポリペプチドの固定化
の進行状況をも表面プラズモン共鳴測定装置で検出しつ
つ、核酸の選別を行うことがより有利である。これに
は、例えば、表面プラズモン共鳴測定装置にセンサーチ
ップをセットした後に、ポリペプチドの固定化および核
酸の結合を、その進行状況を検出しつつ順次行う。
ルボキシメチルデキストラン薄膜層上のカルボキシメチ
ル基の全ては反応せず、これによりポリペプチドが固定
されたチップ上に残存する。このカルボキシメチル基は
負電荷を持ち、該基が表面上に多く存在すると、センサ
ーチップ表面の負電荷が多くなり、同じく負電荷を持つ
核酸との反発により結合を阻害するためである。 した
がって、本発明においては、カルボキシメチル基の密度
が低いセンサーチップを使用して、ＮＴＡ基の導入、ポ
リペプチドの固定化を行い、残存するカルボキシメチル
基の量を減らすことが有利な結果を生じる。本発明にお
いて、ポリペプチドに結合する核酸を選別するには、例
えば、別途作成されたポリペプチドが固定化されたセン
サーチップを、表面プラズモン共鳴測定装置にセット
し、該チップに核酸が含有する試料溶液を流して、結合
状態を検出しつつ、結合しなかった核酸を洗い流した
後、ポリペプチドに結合した核酸のみを解離し、回収す
るが、該固定化されたポリペプチドに対する核酸の結合
状態のみを検出するのではなく、ポリペプチドの固定化
の進行状況をも表面プラズモン共鳴測定装置で検出しつ
つ、核酸の選別を行うことがより有利である。これに
は、例えば、表面プラズモン共鳴測定装置にセンサーチ
ップをセットした後に、ポリペプチドの固定化および核
酸の結合を、その進行状況を検出しつつ順次行う。
【００１０】本発明によれば、表面プラズモン共鳴測定
装置によりポリペプチドに対する核酸の結合その他の工
程の進行状況をリアルタイムで検出可能であるので、ポ
リペプチドの固定化あるいはポリペプチドに対する核酸
の結合が不十分なまま実験を進める危険性を回避できる
とともに、例えば、これらの反応が十分でない場合に
は、さらに実験条件を調整することも可能である。した
がって、実質的にタンパク質の核酸認識部位を認識して
結合する核酸のみを選別することが可能となる。
装置によりポリペプチドに対する核酸の結合その他の工
程の進行状況をリアルタイムで検出可能であるので、ポ
リペプチドの固定化あるいはポリペプチドに対する核酸
の結合が不十分なまま実験を進める危険性を回避できる
とともに、例えば、これらの反応が十分でない場合に
は、さらに実験条件を調整することも可能である。した
がって、実質的にタンパク質の核酸認識部位を認識して
結合する核酸のみを選別することが可能となる。
【００１１】本発明において固定化されるポリペプチド
は、具体的には転写因子、複製因子、組み替え因子等で
あり、これらに結合して選別の対象となる核酸は、ＤＮ
ＡおよびＲＮＡである。例えば、本発明においては、種
々のＤＮＡを含む核酸分子集合溶液をセンサーチップ上
に流し、ポリペプチドに結合しない核酸を洗い流した
後、結合した核酸をポリペプチドとともに溶出させる。
溶出した核酸はＰＣＲで増幅し、これを再びタンパク質
を固定化したセンサーチップ上に流し、上記と同様にし
て結合した核酸を溶出しＰＣＲで増幅する。このサイク
ルを数回以上繰り返した後、ポリペプチドと結合する核
酸として選別確定して回収精製する。以後その配列等の
決定に供される。
は、具体的には転写因子、複製因子、組み替え因子等で
あり、これらに結合して選別の対象となる核酸は、ＤＮ
ＡおよびＲＮＡである。例えば、本発明においては、種
々のＤＮＡを含む核酸分子集合溶液をセンサーチップ上
に流し、ポリペプチドに結合しない核酸を洗い流した
後、結合した核酸をポリペプチドとともに溶出させる。
溶出した核酸はＰＣＲで増幅し、これを再びタンパク質
を固定化したセンサーチップ上に流し、上記と同様にし
て結合した核酸を溶出しＰＣＲで増幅する。このサイク
ルを数回以上繰り返した後、ポリペプチドと結合する核
酸として選別確定して回収精製する。以後その配列等の
決定に供される。
【００１２】本発明においてＮＴＡ基の導入に使用する
センサーチップは表面に存在するカルボキシメチル基の
密度が低減化されているものがより有利な結果を生じる
が、市販の表面プラズモン共鳴測定用センサーチップに
は、カルボキシメチル基が低減化されている旨の表示が
あるが、その密度にあるいはその量について詳細な説明
がないため、以下のような検証実験を行った。
センサーチップは表面に存在するカルボキシメチル基の
密度が低減化されているものがより有利な結果を生じる
が、市販の表面プラズモン共鳴測定用センサーチップに
は、カルボキシメチル基が低減化されている旨の表示が
あるが、その密度にあるいはその量について詳細な説明
がないため、以下のような検証実験を行った。
【００１３】〔表面カルボキシルメチル基についての検
証実験〕カルボキシルメチル基が低減されたとされるセ
ンサーチップＢ１（Biacore社；カルボキシメチルデキ
ストラン部分の大きさ0.7cm×0.7cm）と標準チップＣＭ
５（Biacore社；カルボキシメチルデキストラン部分の
大きさ0.7cm×0.7cm）の各々を表面プラズモン共鳴測定
装置BIACORE X（Biacore社）に装着し、チップ上に超純
水を5ul/minの流速で流した状態にした。内部温度を25
度に設定して、アミンカップリングキット（Biacore
社）中のN-hydroxysuccinimide（NHS）とN-ethyl-N'-(3
-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride（E
DC）をそれぞれ100mMおよび400mMの濃度で溶解し、等容
量ずつ混合した。これを７分間チップ上に流したのち、
植物蛋白質NtERF2のDNA結合ドメイン（配列番号１）を1
0μMの濃度で50mMほう酸（pH 8.5）、150mM NaClに溶解
した溶液を７分、さらにアミンカップリングキット（Bi
acore社）中のEthanolamine溶液を７分間流した。これ
により、カルボキシルメチル基を介して蛋白質が固定化
されるため、結果として得られる蛋白質の固定化量は、
カルボキシメチルデキストラン部分のカルボキシルメチ
ル基の量、あるいは単位面積あたりの量である密度を反
映する。図１にその結果を示す。これによれば、標準チ
ップＣＭ５への蛋白質の固定化により3139RUに相当する
質量増加が見られたのに比較して、Ｂ１チップに対して
は平衡状態に達したとみなし得るまで固定化を行って50
2 RU（相対量17%）の増加に留まった。本発明において
は、事実Ｂ１チップを使用したものの方が、ＣＭ５よよ
りより有利に核酸を結合できる。他方、本発明において
ＮＴＡ基の導入はカルボキシメチル基を介して行われる
ため、カルボキシル基はある程度の量以上必要である。
したがって、これらを総合的に検討すれば、、本発明に
おいてＮＴＡ基の導入のために使用するセンサーチップ
における表面カルボキシメチル基の量は、表面プラズモ
ン共鳴法による測定において、配列番号１の蛋白質を平
衡状態で４００〜６００ＲＵ相当分固定化し得る量であ
ればより良好な結果が得られると結論できる。
証実験〕カルボキシルメチル基が低減されたとされるセ
ンサーチップＢ１（Biacore社；カルボキシメチルデキ
ストラン部分の大きさ0.7cm×0.7cm）と標準チップＣＭ
５（Biacore社；カルボキシメチルデキストラン部分の
大きさ0.7cm×0.7cm）の各々を表面プラズモン共鳴測定
装置BIACORE X（Biacore社）に装着し、チップ上に超純
水を5ul/minの流速で流した状態にした。内部温度を25
度に設定して、アミンカップリングキット（Biacore
社）中のN-hydroxysuccinimide（NHS）とN-ethyl-N'-(3
-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride（E
DC）をそれぞれ100mMおよび400mMの濃度で溶解し、等容
量ずつ混合した。これを７分間チップ上に流したのち、
植物蛋白質NtERF2のDNA結合ドメイン（配列番号１）を1
0μMの濃度で50mMほう酸（pH 8.5）、150mM NaClに溶解
した溶液を７分、さらにアミンカップリングキット（Bi
acore社）中のEthanolamine溶液を７分間流した。これ
により、カルボキシルメチル基を介して蛋白質が固定化
されるため、結果として得られる蛋白質の固定化量は、
カルボキシメチルデキストラン部分のカルボキシルメチ
ル基の量、あるいは単位面積あたりの量である密度を反
映する。図１にその結果を示す。これによれば、標準チ
ップＣＭ５への蛋白質の固定化により3139RUに相当する
質量増加が見られたのに比較して、Ｂ１チップに対して
は平衡状態に達したとみなし得るまで固定化を行って50
2 RU（相対量17%）の増加に留まった。本発明において
は、事実Ｂ１チップを使用したものの方が、ＣＭ５よよ
りより有利に核酸を結合できる。他方、本発明において
ＮＴＡ基の導入はカルボキシメチル基を介して行われる
ため、カルボキシル基はある程度の量以上必要である。
したがって、これらを総合的に検討すれば、、本発明に
おいてＮＴＡ基の導入のために使用するセンサーチップ
における表面カルボキシメチル基の量は、表面プラズモ
ン共鳴法による測定において、配列番号１の蛋白質を平
衡状態で４００〜６００ＲＵ相当分固定化し得る量であ
ればより良好な結果が得られると結論できる。
【００１４】
【実施例】〔センサーチップの修飾〕表面プラズモン共
鳴用センサーチップのうち、負電荷の原因となるカルボ
キシルメチル基の密度の低減化されたタイプであるＢ１
チップ（Biacore社）を表面プラズモン共鳴測定装置BIA
CORE X（Biacore社）に装着し、チップ上に超純水を5m
l/minの流速で流した状態にした。内部温度を25度Cに設
定した。アミンカップリングキット（Biacore社）中のN
-hydroxysuccinimideとN-ethyl-N'-(3-dimethylaminopr
opyl)carbodiimide hydorochlorideをそれぞれ100mM及
び400mMの濃度で溶解し、等容量ずつ混合した。これを7
分間チップ上に流したのち、50mMのN-（5-amono-1-carb
oxypentyl)-iminodiacetic acid（同仁化学株式会
社）、50mMほう酸（pH8.5）、150mM NaClの溶液を7分、
さらにアミンカップリングキット（Biacore社）中のEth
anolamine溶液を7分間流した。これにより、NTA基を表
面上にもち、カルボキシルメチル基の密度の低減化され
た修飾センサーチップを作成した。作成されセンサーチ
ップは、装置から離脱させ、冷蔵庫で保存した。
鳴用センサーチップのうち、負電荷の原因となるカルボ
キシルメチル基の密度の低減化されたタイプであるＢ１
チップ（Biacore社）を表面プラズモン共鳴測定装置BIA
CORE X（Biacore社）に装着し、チップ上に超純水を5m
l/minの流速で流した状態にした。内部温度を25度Cに設
定した。アミンカップリングキット（Biacore社）中のN
-hydroxysuccinimideとN-ethyl-N'-(3-dimethylaminopr
opyl)carbodiimide hydorochlorideをそれぞれ100mM及
び400mMの濃度で溶解し、等容量ずつ混合した。これを7
分間チップ上に流したのち、50mMのN-（5-amono-1-carb
oxypentyl)-iminodiacetic acid（同仁化学株式会
社）、50mMほう酸（pH8.5）、150mM NaClの溶液を7分、
さらにアミンカップリングキット（Biacore社）中のEth
anolamine溶液を7分間流した。これにより、NTA基を表
面上にもち、カルボキシルメチル基の密度の低減化され
た修飾センサーチップを作成した。作成されセンサーチ
ップは、装置から離脱させ、冷蔵庫で保存した。
【００１５】〔核酸配列選別システム〕上記センサーチ
ップを表面プラズモン共鳴測定装置BIACORE X（Biacor
e社）に装着し、本発明の核酸配列選別システムを構築
した。
ップを表面プラズモン共鳴測定装置BIACORE X（Biacor
e社）に装着し、本発明の核酸配列選別システムを構築
した。
【００１６】〔蛋白質の固定化〕本装置を内部温度25度
Cに設定し、緩衝液A［25mM（4-(2-hydroxyethyl）-1-pi
perazinyl）ethanesulphonic acid（pH7.0）、40mM KC
l、0.2mM ethylenediamine tetraacetic acid（EDT
A）、0.005％Tween20 ］を10ul/minの速度で流してお
く。NiSO4を500uMの濃度で緩衝液Aに溶解し、1分間チッ
プ上に流して作用させ、ＮＴＡ基にＮｉ２＋イオンを結
合させた。オリゴHisタグを含むポリペプチド（例：植
物蛋白質NtERF2のDNA結合ドメイン＝配列番号1）を50nM
の濃度で緩衝液Aに溶解し、2分間チップ上に流して作用
させ、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ基にポリペプチドのオリゴHis
タグを配位結合させた。 次いで、KClを1Mの濃度で緩衝
液Aに溶解し、1分間チップ上に流して作用させて、配位
結合ではなく静電的に弱く結合しているポリペプチドを
洗い流して、ポリペプチドの固定化を終了させた。この
操作中、表面プラズモン共鳴リアルタイム計測により、
それぞれの分子のチップ上への結合を定量的にモニター
した。この様子を図2aに示す。
Cに設定し、緩衝液A［25mM（4-(2-hydroxyethyl）-1-pi
perazinyl）ethanesulphonic acid（pH7.0）、40mM KC
l、0.2mM ethylenediamine tetraacetic acid（EDT
A）、0.005％Tween20 ］を10ul/minの速度で流してお
く。NiSO4を500uMの濃度で緩衝液Aに溶解し、1分間チッ
プ上に流して作用させ、ＮＴＡ基にＮｉ２＋イオンを結
合させた。オリゴHisタグを含むポリペプチド（例：植
物蛋白質NtERF2のDNA結合ドメイン＝配列番号1）を50nM
の濃度で緩衝液Aに溶解し、2分間チップ上に流して作用
させ、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ基にポリペプチドのオリゴHis
タグを配位結合させた。 次いで、KClを1Mの濃度で緩衝
液Aに溶解し、1分間チップ上に流して作用させて、配位
結合ではなく静電的に弱く結合しているポリペプチドを
洗い流して、ポリペプチドの固定化を終了させた。この
操作中、表面プラズモン共鳴リアルタイム計測により、
それぞれの分子のチップ上への結合を定量的にモニター
した。この様子を図2aに示す。
【００１７】〔配列をランダム化した核酸分子集合の溶
液の作成〕配列の一部を、化学合成時にヌクレオチド混
合物を用いることによってランダム化した1本鎖DNA（配
列番号２；ｎはランダム化部分で、４種の塩基のうちい
ずれかを示す。）と３’プライマー（配列番号３）を混
合し、DNAポリメラーゼI（BoehdngerMannheim社）を用
いた伸長反応により、配列番号２の1本鎖DNAを片鎖とし
て含む2重鎖DNAを調製した。これをQIAquick Nucleoti
de Removal Kit（QIAGEN社）を用いて精製した後、緩
衝液Aに溶解した。
液の作成〕配列の一部を、化学合成時にヌクレオチド混
合物を用いることによってランダム化した1本鎖DNA（配
列番号２；ｎはランダム化部分で、４種の塩基のうちい
ずれかを示す。）と３’プライマー（配列番号３）を混
合し、DNAポリメラーゼI（BoehdngerMannheim社）を用
いた伸長反応により、配列番号２の1本鎖DNAを片鎖とし
て含む2重鎖DNAを調製した。これをQIAquick Nucleoti
de Removal Kit（QIAGEN社）を用いて精製した後、緩
衝液Aに溶解した。
【００１８】〔ポリペプチドを固定化したセンサーチッ
プヘの核酸の結合と解離〕ポリペプチドを固定化した状
態の本装置を内部温度25度Cに設定し、緩衝液Aを10ul/m
inの速度で流しておき、ポリメラーゼ伸長によって作成
されたランダム化配列を含む２重鎖DNA分子集合の溶液
を２分間チップ上に流して作用させた後、蛋白質に結合
しなかった核酸分子をチップ表面から洗い流した。EDTA
を350mMの濃度で緩衝液Aに溶解し、これを1分間チップ
上に流して作用させた。これにより、チップのＮＴＡ基
に結合していたＮｉ２＋イオンが解離することに伴っ
て、配位結合していた蛋白質およびそれに結合していた
核酸分子も溶出される。この操作中、表面プラズモン共
鳴リアルタイム計測により、それぞれの分子のチップ上
への結合を定量的にモニターした。その様子を図2bに示
す。なお、本発明において使用したセンサーチップは2
区画に分かれており、２区画同時に測定可能である。図
中実線はＮＴＡ基が導入された区画の共鳴レスポンスで
あり、点線はＮＴＡ基が導入されていない区画に対する
共鳴レスポンスである。
プヘの核酸の結合と解離〕ポリペプチドを固定化した状
態の本装置を内部温度25度Cに設定し、緩衝液Aを10ul/m
inの速度で流しておき、ポリメラーゼ伸長によって作成
されたランダム化配列を含む２重鎖DNA分子集合の溶液
を２分間チップ上に流して作用させた後、蛋白質に結合
しなかった核酸分子をチップ表面から洗い流した。EDTA
を350mMの濃度で緩衝液Aに溶解し、これを1分間チップ
上に流して作用させた。これにより、チップのＮＴＡ基
に結合していたＮｉ２＋イオンが解離することに伴っ
て、配位結合していた蛋白質およびそれに結合していた
核酸分子も溶出される。この操作中、表面プラズモン共
鳴リアルタイム計測により、それぞれの分子のチップ上
への結合を定量的にモニターした。その様子を図2bに示
す。なお、本発明において使用したセンサーチップは2
区画に分かれており、２区画同時に測定可能である。図
中実線はＮＴＡ基が導入された区画の共鳴レスポンスで
あり、点線はＮＴＡ基が導入されていない区画に対する
共鳴レスポンスである。
【００１９】〔DNAの増幅および選別サイクル〕上記溶
出した核酸分子をpyroBest DNA polymerase（宝酒造
株式会社）を用い、7mMのMgC12を加え、配列番号3およ
び配列番号4のプライマーDNAを加えて、サーマルサイク
ラー（BioRad社 ICycler）上でPCR反応を行った。反応
条件は95度C・1分、55度C 0.5分、72度C・0.5分のサイ
クルが15回であった。増幅された核酸溶液をQIAquick N
ucleotide Removal Kit（QIAGEN社）を用いて精製した
後、緩衝液Aに溶解した。これを再び上述のポリペプチ
ドを固定化したセンサーチップに対して同様に結合と解
離を行った。このサイクルを7回繰り返した。
出した核酸分子をpyroBest DNA polymerase（宝酒造
株式会社）を用い、7mMのMgC12を加え、配列番号3およ
び配列番号4のプライマーDNAを加えて、サーマルサイク
ラー（BioRad社 ICycler）上でPCR反応を行った。反応
条件は95度C・1分、55度C 0.5分、72度C・0.5分のサイ
クルが15回であった。増幅された核酸溶液をQIAquick N
ucleotide Removal Kit（QIAGEN社）を用いて精製した
後、緩衝液Aに溶解した。これを再び上述のポリペプチ
ドを固定化したセンサーチップに対して同様に結合と解
離を行った。このサイクルを7回繰り返した。
【００２０】〔核酸分子の最終精製および配列決定〕選
別と増幅の7サイクル後に回収した核酸溶液を8％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行い、バンドをカッターナ
イフで切り出すことによって最終精製を行った。これを
pUC119プラスミド中に制限酵素Sma I（宝酒造株式会
社）によってクローン化した。大腸菌株DH5α（宝酒造
株式会社）にトランスフオーメーションし、40-50個の
コロニーをピックアップし、LB培地で培養した後、菌内
で生成されたプラスミドDNAを精製キットCentricep(Pri
nceton Separation社）を用いて精製した。これをDNAシ
ークエンサーABI310GeneticAnalyzer（Parkin-Elmer
社）により配列決定をおこなった。その結果を表１に示
す。
別と増幅の7サイクル後に回収した核酸溶液を8％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行い、バンドをカッターナ
イフで切り出すことによって最終精製を行った。これを
pUC119プラスミド中に制限酵素Sma I（宝酒造株式会
社）によってクローン化した。大腸菌株DH5α（宝酒造
株式会社）にトランスフオーメーションし、40-50個の
コロニーをピックアップし、LB培地で培養した後、菌内
で生成されたプラスミドDNAを精製キットCentricep(Pri
nceton Separation社）を用いて精製した。これをDNAシ
ークエンサーABI310GeneticAnalyzer（Parkin-Elmer
社）により配列決定をおこなった。その結果を表１に示
す。
【表１】
これによれば、転写因子NtERF2の認識配列であるGCCGCC
配列が選ばれていることが明らかであり、本システムの
有効性が実証された。
配列が選ばれていることが明らかであり、本システムの
有効性が実証された。
【００２１】
【発明の効果】 以上の説明から明らかなように、本発
明によればポリペプチドの核酸認識部位を認識して結合
する核酸を極めて精度よくかつ迅速、簡便な操作で選別
することが可能であり、該認識部位において認識する核
酸の塩基配列の解明、あるいはポリペプチド、核酸の機
能の解明に大いに資するものである。
明によればポリペプチドの核酸認識部位を認識して結合
する核酸を極めて精度よくかつ迅速、簡便な操作で選別
することが可能であり、該認識部位において認識する核
酸の塩基配列の解明、あるいはポリペプチド、核酸の機
能の解明に大いに資するものである。
【００２２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
<120> The Sensor tip for nucleic acids selection
<130> 220-02049
<140>
<141>
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 100
<212> PRT
<213> Arabidopdis thaliana
<400> 1
Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His
1 5 10 15
Ile Glu Gly Arg His Met Thr Ala Gln Ala Val Val Pro Lys Gly Arg
20 25 30
His Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Phe Ala Ala Gly
35 40 45
Ile Arg Asp Pro Ala Lys Asn Gly Ala Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr
50 55 60
Glu Thr Ala Glu Glu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Asp Lys Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Arg Met Arg Gly Ser Lys Ala Leu Leu Asn Phe Pro His Arg Ile Gly
85 90 95
Leu Asn Glu Pro
100
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<400> 2
ctgtcagtga tgcatatgaa cgaatnnnnn nnnnnaatca acgacattag gatccttagc 60
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<400> 3
gctaaggatc ctaatgtcgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<400> 4
ctgtcagtga tgcatatgaa 20
【図１】表面プラズモン共鳴リアルタイム計測による、
配列番号１で示されるポリペプチドのB1チップ（実線）
およびCM5チップ（点線）への固定化状態を示す図であ
る。
配列番号１で示されるポリペプチドのB1チップ（実線）
およびCM5チップ（点線）への固定化状態を示す図であ
る。
【図２】センサーチップに対する蛋白質の固定化（ａ）
及び核酸の結合（ｂ）状態を、表面プラズモン共鳴リア
ルタイム計測により測定した図である。
及び核酸の結合（ｂ）状態を、表面プラズモン共鳴リア
ルタイム計測により測定した図である。
Claims (5)
- 【請求項１】ポリペプチドを固定化するためのＮＴＡ基
をその表面上に有することを特徴とする、ポリペプチド
に結合する核酸を選別するために用いる表面プラズモン
共鳴測定用センサーチップ。 - 【請求項２】ＮＴＡ基を介してＨｉｓタグを含むポリペ
プチドが固定化されていることを特徴とする、ポリペプ
チドに結合する核酸を選別するために用いる表面プラズ
モン共鳴測定用センサーチップ。 - 【請求項３】表面に存在するカルボキシメチル基の密度
が低減化されている表面プラズモン共鳴センサーチップ
に対して、ＮＴＡ基の導入を行ったものである請求項１
または２に記載のセンサーチップ。 - 【請求項４】表面プラズモン共鳴法による測定におい
て、配列番号１の蛋白質を平衡状態で４００〜６００Ｒ
Ｕ相当分固定化し得る量のカルボキシメチル基を有する
表面プラズモン共鳴センサーチップに対して、ＮＴＡ基
の導入を行ったものである請求項１または２に記載のセ
ンサーチップ。 - 【請求項５】ＮＴＡ基をその表面に有する表面プラズモ
ン共鳴測定用センサーチップにＨｉｓタグを含むポリペ
プチドを固定化したセンサーチップに、核酸含有溶液を
流し、ポリペプチドと結合した核酸を選別する方法にお
いて、固定されたポリペプチドに対する核酸ポリペプチ
ドの結合状態を、表面プラズモン共鳴装置で検出しつつ
核酸の選別を行うことを特徴とする核酸の選別方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002149330A JP4092394B2 (ja) | 2002-05-23 | 2002-05-23 | 核酸選別用センサーチップ |
| US10/301,875 US20040091874A1 (en) | 2002-05-23 | 2002-11-22 | Sensor chip for nucleic acid selection |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002149330A JP4092394B2 (ja) | 2002-05-23 | 2002-05-23 | 核酸選別用センサーチップ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003344404A true JP2003344404A (ja) | 2003-12-03 |
| JP4092394B2 JP4092394B2 (ja) | 2008-05-28 |
Family
ID=29767538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002149330A Expired - Lifetime JP4092394B2 (ja) | 2002-05-23 | 2002-05-23 | 核酸選別用センサーチップ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040091874A1 (ja) |
| JP (1) | JP4092394B2 (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008516189A (ja) * | 2004-07-02 | 2008-05-15 | バイオ‐レイヤー ピーティーワイ リミティッド | 金属錯体の使用方法 |
| JP2009042210A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Fujifilm Corp | 表面プラズモン共鳴測定用チップ |
| JP2009042209A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Fujifilm Corp | 担体およびその製造方法並びにバイオリアクター |
| US8030546B2 (en) | 1998-09-22 | 2011-10-04 | Mendel Biotechnology, Inc. | Biotic and abiotic stress tolerance in plants |
| US8273403B2 (en) | 2002-05-10 | 2012-09-25 | Bio-Layer Pty Ltd. | Generation of surface coating diversity |
| US8557194B2 (en) | 2007-07-13 | 2013-10-15 | Fujifilm Corporation | Carrier, process for producing same, bioreactor, and chip for surface plasmon resonance analysis |
| US8912394B2 (en) | 2001-04-18 | 2014-12-16 | Mendel Biotechnology Inc. | Transcriptional regulation of plant disease tolerance |
| JP2018516358A (ja) * | 2015-04-02 | 2018-06-21 | バイオデシー， インコーポレイテッド | 表面選択的非線形光学技法を使用してタンパク質構造を決定するための方法 |
| US11486881B2 (en) | 2016-05-09 | 2022-11-01 | Quanta Therapeutics, Inc. | Methods and devices for detection of peripheral membrane protein interactions using nonlinear optical techniques |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7888558B2 (en) * | 1999-11-17 | 2011-02-15 | Mendel Biotechnology, Inc. | Conferring biotic and abiotic stress tolerance in plants |
| US7663025B2 (en) * | 1999-03-23 | 2010-02-16 | Mendel Biotechnology, Inc. | Plant Transcriptional Regulators |
| US20080229448A1 (en) * | 2004-12-20 | 2008-09-18 | Mendel Biotechnology, Inc. | Plant Stress Tolerance from Modified Ap2 Transcription Factors |
| US20080301836A1 (en) * | 2007-05-17 | 2008-12-04 | Mendel Biotechnology, Inc. | Selection of transcription factor variants |
-
2002
- 2002-05-23 JP JP2002149330A patent/JP4092394B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-22 US US10/301,875 patent/US20040091874A1/en not_active Abandoned
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| US8030546B2 (en) | 1998-09-22 | 2011-10-04 | Mendel Biotechnology, Inc. | Biotic and abiotic stress tolerance in plants |
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| US8273403B2 (en) | 2002-05-10 | 2012-09-25 | Bio-Layer Pty Ltd. | Generation of surface coating diversity |
| JP2008516189A (ja) * | 2004-07-02 | 2008-05-15 | バイオ‐レイヤー ピーティーワイ リミティッド | 金属錯体の使用方法 |
| JP4897676B2 (ja) * | 2004-07-02 | 2012-03-14 | バイオ‐レイヤー ピーティーワイ リミティッド | 金属錯体の使用方法 |
| US8168445B2 (en) | 2004-07-02 | 2012-05-01 | Bio-Layer Pty Limited | Use of metal complexes |
| JP2009042210A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Fujifilm Corp | 表面プラズモン共鳴測定用チップ |
| JP2009042209A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Fujifilm Corp | 担体およびその製造方法並びにバイオリアクター |
| US8557194B2 (en) | 2007-07-13 | 2013-10-15 | Fujifilm Corporation | Carrier, process for producing same, bioreactor, and chip for surface plasmon resonance analysis |
| JP2018516358A (ja) * | 2015-04-02 | 2018-06-21 | バイオデシー， インコーポレイテッド | 表面選択的非線形光学技法を使用してタンパク質構造を決定するための方法 |
| US11486881B2 (en) | 2016-05-09 | 2022-11-01 | Quanta Therapeutics, Inc. | Methods and devices for detection of peripheral membrane protein interactions using nonlinear optical techniques |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040091874A1 (en) | 2004-05-13 |
| JP4092394B2 (ja) | 2008-05-28 |
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