JP2003321365A - 高脂血症治療剤 - Google Patents

高脂血症治療剤

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JP2003321365A
JP2003321365A JP2002127341A JP2002127341A JP2003321365A JP 2003321365 A JP2003321365 A JP 2003321365A JP 2002127341 A JP2002127341 A JP 2002127341A JP 2002127341 A JP2002127341 A JP 2002127341A JP 2003321365 A JP2003321365 A JP 2003321365A
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JP2002127341A
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Koichi Kino
孝一 木野
Katsuhisa Ioriya
勝久 庵谷
Hajime Okuyama
元 奥山
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Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ転写後のタンパ
ク質発現プロセスを制御することによってＬＤＬ受容体
タンパク質の発現を促進する化合物のスクリーニング方
法、該スクリーニング方法によって得られ得る化合物。 【効果】 転写活性化経路に依存することなくＬＤＬ受
容体のｍＲＮＡ転写後のタンパク質発現プロセスを制御
することによってＬＤＬ受容体の発現を促進することが
可能な化合物は、従来にない新しい作用機序を有する高
脂血症治療剤等として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＬＤＬ受容体発現
上昇をターゲットにした高脂血症治療薬のスクリーニン
グ方法に関する。更に詳しくは転写制御を介さないＬＤ
Ｌ受容体発現上昇作用に基づく高脂血症治療薬のスクリ
ーニング方法ならびに該スクリーニングによって得られ
得る高脂血症治療に有用な物質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ここ数年間で、アテローム性の冠動脈疾
患（ＣＡＤ）による死亡率の減少という点が非常に大き
く進歩したにもかかわらず、ほとんどの先進国におい
て、心臓血管疾患は、依然として主要な死亡原因となっ
ている。ＣＡＤと血清総コレステロール濃度、特に低密
度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール濃度の上昇
との関係は文献で十分に実証されている。冠動脈性心疾
患（ＣＨＤ）の進行において、脂質の変調が重要な因子
であることは十分に確証されている［Schettler,G.著、
“心筋梗塞後の患者の血清コレステロールの低下におけ
る食事と薬物の役割”「Cardiovasc. Drugs Ther.」、
１９８９年、２／６ （７９５〜７９９）を参照］。
【０００３】一方、高脂血症治療薬のターゲットとし
て、肝臓中のＬＤＬ受容体の上昇が考えられることは既
に知られている（参考文献：New. Eng. J. Med 118 (19
81) 557-564等）。ＬＤＬ受容体は、各臓器に発現して
おり、ＬＤＬを血中から取り込む際に必要な受容体であ
り、生体内各臓器へのコレステロール分配に重要である
だけでなく、血中コレステロール量の調節においても主
要な役割を担っている。例えば、ゴールドシュタイン(G
oldstein,J.L.)らは、“家族性高コレステロール血症に
おけるＬＤＬ受容体欠損、病因および治療とのかかわ
り”「Med. Clin.North Am.」、１９８２年、６６／２
(３３５〜３６２)において、『家族性高コレステロー
ル血症は、心筋梗塞の原因となることが認められた最初
の遺伝性疾患であった。高コレステロール血症および冠
動脈アテローム性硬化の両方を引き起こす単一遺伝子突
然変異の未解決の実例が今日まで残っている。』ことを
指摘している。
【０００４】生体内におけるＬＤＬ受容体の発現制御
は、細胞内コレステロール量に依存した遺伝子転写段階
で行われていると考えられている（細胞内コレステロー
ル量によるネガティブフィードバックレギュレーショ
ン）。転写後、ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡはまず、前駆体
（未成熟型）としてタンパク質に翻訳され、糖鎖付加を
受けて成熟型のＬＤＬ受容体として細胞表面に発現する
が、この翻訳後の制御については、現在のところ、その
存在も含めてほとんど判っていない。また、ｍＲＮＡよ
り合成されるＬＤＬ受容体タンパク質の一部が、分解さ
れ細胞表面に発現しない経路の存在が考えられるが、そ
の詳細は不明である。また、転写活性（ｍＲＮＡ合成）
が上昇するのにＬＤＬ受容体タンパク質発現量は上昇し
ないという報告（Eur. J. Biochem. (1993) vol. 216,
527-38等）はあるが、転写後のｍＲＮＡの安定性等が関
与する可能性も考えられており、翻訳後（タンパク合成
後）の作用については不明である。
【０００５】肝細胞中の遊離コレステロール量が減少す
ることにより、肝細胞表面上のＬＤＬ受容体が誘導され
る。ＬＤＬ受容体は血中のＬＤＬと結合し、肝細胞内に
取り込むことによって血中のＬＤＬを減少させる。肝細
胞内に取り込まれたＬＤＬ中のコレステロールは、胆汁
酸等に変換され腸管へ排出される。より細胞表面上のＬ
ＤＬ受容体量を上昇させることにより、血中のＬＤＬ量
をより低減化することができ、従って、高脂血症等のＬ
ＤＬが悪玉として作用する種々の疾患の予防・治療への
用途が期待できる。かくしてＬＤＬ受容体の発現上昇を
ターゲットにした高脂血症治療薬開発は、広く行われて
いる。最もよく知られているのは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元
酵素阻害剤で、コレステロールの生合成を阻害すること
で、間接的にＬＤＬ受容体遺伝子の転写を活性化させＬ
ＤＬ受容体発現を上昇させる（参考文献：Science 232
(1986) 34-47、J. Lipid Res. 25 (1984) 1450-1461
等）。
【０００６】このほか、文献的にＬＤＬ受容体の発現上
昇作用を持つ薬剤の報告は多数あるが、いずれも何らか
の（詳細なメカニズムが不明なものも含めて）転写活性
化を介したものである。Lifibrolのように、明確に転写
活性化を示してはいないが、コレステロール生合成阻害
があり、恐らく転写活性化によると考えられている化合
物もある(Atherosclerosis (2000) vol.153, 69-80)。
現状で、ＬＤＬ受容体の発現上昇作用に関して転写活性
化を経由しないルートが存在するという報告はない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＬＤＬ受容
体の発現を促進する作用、特にＬＤＬ受容体遺伝子の転
写活性化という経路を介さずにＬＤＬ受容体タンパク質
の発現を促進する作用を有する、従来になかった新しい
作用機序を有する高脂血症治療剤ならびに血中脂質低下
剤を提供することを目的とする。さらに本発明の別の目
的は、かかる用途に有用な、ＬＤＬ受容体タンパク質の
発現を促進する化合物のスクリーニング方法ならびに当
該スクリーニング方法により得られ得る、あるいは選択
され得る化合物を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者等は鋭意検討を
進めた結果、転写活性化経路に依存しないＬＤＬ受容体
タンパク質発現上昇作用が存在することを見出し、その
作用による血中脂質低下作用を確認した。さらにかかる
作用を有する化合物を見出し、ＬＤＬ受容体遺伝子の転
写後の過程が、当該化合物のＬＤＬ受容体タンパク質発
現調節に関与しているという明確な知見を得て、そして
そのような化合物のスクリーニング方法を確立して本発
明を完成するに至った。即ち本発明は下記の通りであ
る。 （１）式１
【０００９】
【化６】
【００１０】〔式中、環Ａは置換基を有していてもよい
ピリジン環を表す。Ｘは、式
【００１１】
【化７】
【００１２】（式中、Ｒ1は水素原子、アルキル基、置
換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アル
キニル基、置換アルキニル基、シクロアルキル基、また
は置換シクロアルキル基を表す。）または式
【００１３】
【化８】
【００１４】［式中、Ｗは水素原子または式−ＯＲ
a（Ｒaはアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、
置換アルケニル基、アルキニル基、または置換アルキニ
ル基を表す。）を表す。］で示される基を表す。Ｚは結
合手、−ＮＨ−、炭素原子数１もしくは２のアルキレン
基または−ＣＨ＝ＣＨ−を表す。Ｙはアルキル基、置換
アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル
基、芳香族基または置換芳香族基を表す。Ｂはアルキル
基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル
基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、芳香族
基、または置換芳香族基を表す。〕で表されるナフチリ
ジン誘導体もしくはそのプロドラッグまたはそれらの薬
学上許容される塩を有効成分として含有する、ＬＤＬ受
容体タンパク質の発現促進剤。 （２）式１で表されるナフチリジン誘導体が式２
【００１５】
【化９】
【００１６】〔式中、環Ａは置換基を有していてもよい
ピリジン環を表す。Ｙはアルキル基、置換アルキル基、
シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、芳香族基ま
たは置換芳香族基を表す。Ｒ1は水素原子、アルキル
基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル
基、アルキニル基、置換アルキニル基、シクロアルキル
基、または置換シクロアルキル基を表す。Ｒ2は水素原
子または低級アルキル基を表す。Ｒ3は低級アルキル基
を表す。Ｚaは、 １）−Ｄ1−Ｑ ［式中、Ｄ1は結合手または不飽和結合を含んでいても
よい炭素原子数１〜８の２価の炭化水素基を表し、Ｑは
水酸基、カルボキシル基、ヘテロアリール基、置換ヘテ
ロアリール基、または式：−ＮＲ4Ｒ5（Ｒ4およびＲ5は
互いに独立して、水素原子、低級アルコキシ基、低級ア
ルキル基、置換低級アルキル基、シクロアルキル基また
はアラルキル基を表すか、またはＲ4およびＲ5が互いに
結合してそれらが結合する窒素原子とともに、環中にさ
らに式：−ＮＲ8−（Ｒ8は水素原子、低級アルキル基、
置換低級アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、ベ
ンジル基、置換ベンジル基、または低級アルコキシカル
ボニル基を表す。）で表される基を１個、または酸素原
子１個を含んでもよい、環を構成する炭素原子数が４か
ら８個の飽和環状アミノ基を表す。）を表す。但し、Ｑ
がヘテロアリール基または置換へテロアリール基である
場合は、Ｄ1は結合手とはならない］または、 ２）−Ｄ2−Ｍ−Ｅ−Ｗ ［式中、Ｄ2は結合手または不飽和結合を含んでいても
よい炭素原子数１〜８の２価の炭化水素基を表し、Ｍは
酸素原子、硫黄原子、スルフィニル基もしくはスルホニ
ル基、または式−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ
−もしくは−ＮＲ6−（Ｒ6は水素原子もしくは低級アル
キル基を表す。）で表される基を表し、Ｅは結合手また
は不飽和結合を含んでいてもよい炭素原子数１〜８の２
価の炭化水素基を表し、Ｗは水酸基、カルボキシル基、
ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、または式：
−ＮＲ4Ｒ5（Ｒ4およびＲ5は前記の意味を表す。）で表
される基を表す。但し、Ｗが水酸基、カルボキシル基も
しくは式−ＮＲ4Ｒ5で表される基の時はＥは結合手とは
ならない］を表す。〕で表される化合物である、上記
（１）記載のＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進剤。 （３）ナフチリジン誘導体が下記式Ａ
【００１７】
【化１０】
【００１８】〔式中、ｎ−Ｂｕはｎ−ブチル基を、ｉ−
Ｐｒはイソプロピル基を表す〕で表される化合物であ
る、上記（１）または（２）記載のＬＤＬ受容体タンパ
ク質の発現促進剤。 （４）ＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進が、ＬＤＬ受
容体のｍＲＮＡ転写後のタンパク質発現プロセスを制御
することによって誘導されるものである、上記（１）〜
（３）のいずれかに記載のＬＤＬ受容体タンパク質の発
現促進剤。 （５）さらに、ＬＤＬ受容体の遺伝子発現に影響を与え
ないことを特徴とする上記（４）記載のＬＤＬ受容体タ
ンパク質の発現促進剤。 （６）ＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ転写後のタンパク質発現
プロセスを制御することによってＬＤＬ受容体タンパク
質の発現を促進する化合物のスクリーニング方法であっ
て、以下の工程を含むスクリーニング方法： (1)ＬＤＬ受容体発現細胞を使用し、(2)ＬＤＬ受容体の
転写抑制因子の存在下、被検物質の存在下または非存在
下で当該細胞を培養し、(3)被検物質存在下または非存
在下で培養したＬＤＬ受容体発現細胞のＬＤＬ受容体タ
ンパク質発現量を測定し、(4)ＬＤＬ受容体タンパク質
の発現量を促進する物質を選択する。 （７）ＬＤＬ受容体タンパク質の未成熟型と成熟型の量
を測定し、未成熟型に対する成熟型の比が大きい物質を
選択する工程をさらに含む上記（６）記載のスクリーニ
ング方法。 （８）ＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ転写後のタンパク質発現
プロセスを制御することによってＬＤＬ受容体タンパク
質の発現を促進する化合物のスクリーニング方法であっ
て、以下の工程を含むスクリーニング方法： (1)ＬＤＬ受容体発現細胞を使用し、(2)ＬＤＬ受容体の
転写抑制因子の存在下、被検物質の存在下または非存在
下で当該細胞を培養し、(3)被検物質の存在下または非
存在下で培養したＬＤＬ受容体発現細胞に、放射性同位
元素で標識されたアミノ酸を添加し、(4)経時的に一定
量の細胞を採取し、細胞を可溶化後、細胞タンパク質画
分を調製し、(5)得られた細胞タンパク質画分中に存在
するＬＤＬ受容体タンパク質を免疫沈降させ、(6)免疫
沈降物中のＬＤＬ受容体タンパク質の量を測定し、(7)
ＬＤＬ受容体タンパク質の発現量を促進する物質を選択
する。 （９）免疫沈降物中の未成熟型ＬＤＬ受容体タンパク質
と成熟型ＬＤＬ受容体タンパク質の量を測定し、未成熟
型ＬＤＬ受容体タンパク質量に対する成熟型ＬＤＬ受容
体タンパク質量の比が大きい物質を選択する工程をさら
に含む上記（８）記載のスクリーニング方法。 （１０）ＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ転写後のタンパク質発
現プロセスを制御することによってＬＤＬ受容体タンパ
ク質の発現を促進する化合物のスクリーニング方法であ
って、以下の工程を含むスクリーニング方法： (1)ＬＤＬ受容体発現細胞を使用し、(2)ＬＤＬ受容体の
転写抑制因子の存在下、被検物質の存在下または非存在
下で当該細胞を培養し、(3)被検物質の存在下または非
存在下で培養したＬＤＬ受容体発現細胞に、放射性同位
元素で標識されたアミノ酸を添加後、一定期間培養し、
(4)放射性同位元素を含まない培養液に交換後、経時的
に一定量の細胞を採取し、細胞を可溶化した後、細胞タ
ンパク質画分を調製し、(5)得られた細胞タンパク質画
分中に存在するＬＤＬ受容体タンパク質を免疫沈降さ
せ、(6)免疫沈降物中のＬＤＬ受容体タンパク質の量を
測定し、(7)ＬＤＬ受容体タンパク質の発現量を促進す
る物質を選択する。
【００１９】（１１）免疫沈降物中の未成熟型ＬＤＬ受
容体タンパク質と成熟型ＬＤＬ受容体タンパク質の量を
測定し、未成熟型ＬＤＬ受容体タンパク質量に対する成
熟型ＬＤＬ受容体タンパク質量の比が大きい物質を選択
する工程をさらに含む上記（１０）記載のスクリーニン
グ方法。 （１２）ＬＤＬ受容体の転写抑制因子が２５−ヒドロキ
シコレステロールである、上記（６）、（８）および
（１０）のいずれかに記載のスクリーニング方法。 （１３）陽性対照として、式Ａで表される化合物を用い
ることを特徴とする上記（６）、（８）および（１０）
のいずれかに記載のスクリーニング方法。 （１４）ＬＤＬ受容体タンパク質の発現量を促進する物
質を選択する工程が、式Ａで表される化合物が有するＬ
ＤＬ受容体タンパク質発現促進活性以上の活性を有する
物質を選択する工程である、上記（６）、（８）および
（１０）のいずれかに記載のスクリーニング方法。 （１５）未成熟型ＬＤＬ受容体タンパク質量に対する成
熟型ＬＤＬ受容体タンパク質量の比が大きい物質を選択
する工程が、式Ａで表される化合物を添加した場合に得
られる比以上の値である物質を選択する工程である、上
記（７）、（９）および（１１）のいずれかに記載のス
クリーニング方法。 （１６）上記（６）〜（１５）のいずれかに記載のスク
リーニング方法によって得られる、ＬＤＬ受容体タンパ
ク質の発現を促進する化合物もしくはそのプロドラッグ
またはそれらの薬学上許容される塩を有効成分として含
有する、ＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進剤。 （１７）上記（６）〜（１５）のいずれかに記載のスク
リーニング方法によって得られる、ＬＤＬ受容体タンパ
ク質の発現を促進する化合物が、式１で表されるナフチ
リジン誘導体もしくはそのプロドラッグまたはそれらの
薬学上許容される塩である、上記（１６）記載のＬＤＬ
受容体タンパク質の発現促進剤。 （１８）上記（６）〜（１５）のいずれかに記載のスク
リーニング方法によって得られる、ＬＤＬ受容体タンパ
ク質の発現を促進する化合物もしくはそれらのプロドラ
ッグまたはそれらの薬学上許容される塩を有効成分とし
て含有する、血中脂質低下剤。 （１９）上記（６）〜（１５）のいずれかに記載のスク
リーニング方法によって得られる、ＬＤＬ受容体タンパ
ク質の発現を促進する化合物もしくはそのプロドラッグ
またはそれらの薬学上許容される塩を有効成分として含
有する、高脂血症治療剤。
【００２０】本発明において、「ＬＤＬ受容体のｍＲＮ
Ａ転写後のタンパク質発現プロセス」とは、ＬＤＬ受容
体タンパク質合成経路において、ＬＤＬ受容体のｍＲＮ
Ａ転写後の工程であれば全て包含される。より具体的に
は、翻訳（タンパク質合成）、糖鎖付加（未成熟型から
成熟型への移行）、膜表面への輸送、リソゾームやプロ
テアソームによる分解等が例示される。該「タンパク質
発現プロセス」を制御するとは、上記の種々の工程にお
ける制御を意図し、例えば、翻訳効率の向上、成熟化の
促進、膜表面への輸送の効率化、分解の抑制等が挙げら
れる。本発明のＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進剤
は、ＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ転写後のタンパク質発現プ
ロセスを制御することによってＬＤＬ受容体発現を上昇
させるものであれば特に制限されず、好ましくはＬＤＬ
受容体遺伝子の発現ならびにｍＲＮＡ転写には影響を与
えない。具体的には式１
【００２１】
【化１１】
【００２２】〔式中、環Ａは置換基を有していてもよい
ピリジン環を表す。Ｘは、式
【００２３】
【化１２】
【００２４】（式中、Ｒ1は水素原子、アルキル基、置
換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アル
キニル基、置換アルキニル基、シクロアルキル基、また
は置換シクロアルキル基を表す。）または式
【００２５】
【化１３】
【００２６】［式中、Ｗは水素原子または式−ＯＲ
a（Ｒaはアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、
置換アルケニル基、アルキニル基、または置換アルキニ
ル基を表す。）を表す。］で示される基を表す。Ｚは結
合手、−ＮＨ−、炭素原子数１もしくは２のアルキレン
基または−ＣＨ＝ＣＨ−を表す。Ｙはアルキル基、置換
アルキル基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル
基、芳香族基または置換芳香族基を表す。Ｂはアルキル
基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル
基、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、芳香族
基、または置換芳香族基を表す。〕で表されるナフチリ
ジン誘導体もしくはそのプロドラッグまたはそれらの薬
学上許容される塩を有効成分として含有するものであ
る。
【００２７】〔式１化合物〕本明細書中、式１中の各種
の基を詳細に説明すると次の通りである。なお、特に指
示のない限り、各々の基の説明は他の置換基の一部であ
る場合も含む。
【００２８】環Ａは置換基を有していてもよいピリジン
環を表し、その窒素原子は縮合環の縮合位置を除くいず
れの場所にあってもよい（縮合環の橋頭原子にならな
い）が、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）で表されるものが
好ましい。
【００２９】
【化１４】
【００３０】また、ピリジン環の置換基としては、例え
ば低級アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、トリフル
オロメチル基、ニトロ基、アミノ基、モノ低級アルキル
アミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、水酸基、低級アル
コキシ基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィ
ニル基、低級アルキルスルホニル基等が挙げられる。本
発明でいう低級とは当該基のアルキル部分が低級アルキ
ル基であることを意味し、そのような低級アルキル基と
してはメチル、エチル、プロピル、２−プロピル、ブチ
ル、ペンチル、ヘキシル等の炭素原子数が１〜６個の低
級アルキル基を挙げることができる。ハロゲン原子とし
ては例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
上記ピリジン環の置換基は１個または同一もしくは異な
って複数個あってもよい。好ましくは、環Ａは無置換の
ピリジン環、特に式（ａ）で表される。
【００３１】Ｒ1、Ｒa及びＹにおけるアルキル基、また
は置換アルキル基のアルキル基部分としては、例えば直
鎖または分枝した炭素原子数１〜８個のアルキル基が挙
げられ、具体的には例えばメチル、エチル、プロピル、
２−プロピル、ブチル、２−ブチル、２−メチルプロピ
ル、１，１−ジメチルエチル、３−ペンチル、３−ヘキ
シル、４−ヘプチル、４−オクチル等が挙げられる。Ｒ
1及びＲaにおけるアルケニル基、または置換アルケニル
基のアルケニル基部分としては、例えば直鎖または分枝
した炭素原子数２〜８個のアルケニル基が挙げられ、具
体的には例えばビニル、アリル、２−プロピニル、２−
ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、３−ヘキセニ
ル、３−エチル−２−ペンテニル、４−エチル−３−ヘ
キセニル等が挙げられる。Ｒ1及びＲaにおけるアルキニ
ル基、または置換アルキニル基のアルキニル基部分とし
ては、例えば直鎖または分枝した炭素原子数３〜８個の
アルキニル基が挙げられ、具体的には例えば２−プロピ
ニル、３−ブチニル、４−ペンチニル、３−ヘキシニ
ル、５−メチル−２−ヘキシニル、６−メチル−４−ヘ
プチニル等が挙げられる。
【００３２】Ｂにおけるアルキル基または置換アルキル
基のアルキル基部分としては、例えば直鎖または分枝し
た炭素原子数１〜２０個のアルキル基が挙げられ、具体
的には例えばメチル、エチル、プロピル、２−プロピ
ル、ブチル、２−ブチル、２−メチルプロピル、１，１
−ジメチルエチル、ペンチル、３−ペンチル、ヘキシ
ル、ヘプチル、オクチル、ウンデシル、ドデシル、ヘキ
サデシル、２，２−ジメチルドデシル、２−テトラデシ
ル、ｎ−オクタデシル等が挙げられる。Ｂにおけるアル
ケニル基または置換アルケニル基のアルケニル基部分と
しては、例えば１〜２個の二重結合を有する直鎖または
分枝した炭素原子数３〜２０個のアルケニル基が挙げら
れ、具体的には例えば２−プロペニル、２−ブテニル、
３−メチル−２−ブテニル、３−ペンテニル、２−オク
テニル、５−ノネニル、４−ウンデセニル、５−ヘプタ
デセニル、３−オクタデセニル、９−オクタデセニル、
２，２−ジメチル−９−オクタデセニル、９，１２−オ
クタデカジエニル等が挙げられる。
【００３３】Ｙ及びＢにおけるシクロアルキル基または
置換シクロアルキル基のシクロアルキル基部分として
は、例えば炭素原子数３〜７個のシクロアルキル基が挙
げられ、具体的には例えばシクロプロピル、シクロブチ
ル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル
等が挙げられる。
【００３４】Ｙ及びＢにおける芳香族基または置換芳香
族基の芳香族基部分としてはアリール基、ヘテロアリー
ル基が挙げられる。アリール基としては、例えばフェニ
ル基、ナフチル基等の炭素原子数１０個以下のアリール
基が挙げられる。ヘテロアリール基としては、例えば窒
素原子を１〜２個含む５〜６員単環式の基、窒素原子を
１〜２個と酸素原子を１個もしくは硫黄原子を１個含む
５〜６員単環式の基、酸素原子を１個もしくは硫黄原子
を１個含む５員単環式の基、窒素原子１〜４個を含み、
６員環と５または６員環が縮合した二環式の基等が挙げ
られ、具体的には、例えば、２−ピリジル、３−ピリジ
ル、４−ピリジル、２−チエニル、３−チエニル、３−
オキサジアゾリル、１−イミダゾリル、２−イミダゾリ
ル、２−チアゾリル、３−イソチアゾリル、２−オキサ
ゾリル、３−イソオキサゾリル、２−フリル、３−フリ
ル、３−ピロリル、８−キノリル、２−キナゾリニル、
８−プリニル等が挙げられる。
【００３５】Ｙ及びＢにおける置換芳香族基の置換基と
しては、１個または同一もしくは異なって複数個あって
もよく、例えばハロゲン原子、シアノ基、トリフルオロ
メチル基、ニトロ基、水酸基、メチレンジオキシ基、低
級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルカノイルオ
キシ基、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級
アルキルアミノ基、カルバモイル基、低級アルキルアミ
ノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、
カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級ア
ルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アル
キルスルホニル基、低級アルカノイルアミノ基、低級ア
ルキルスルホンアミド基または式−Ｄ1’−Ｅ’−Ｆ
｛Ｄ1’は、結合手、酸素原子、硫黄原子もしくは式−
ＮＲ3'−（Ｒ3'は水素原子もしくは低級アルキル基を表
す。）を表し、Ｅ’は不飽和結合を含んでいてもよい炭
素原子数１〜６の２価の炭化水素基もしくはフェニレン
基を表し、Ｆは、水酸基、カルボキシル基、低級アルコ
キシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ハロ
ゲン原子、シアノ基、ベンジルオキシ基、低級アルコキ
シ基、低級アルカノイルオキシ基、低級アルキルチオ
基、低級アルキルスルフィニル基、低級アルキルスルホ
ニル基、低級アルカノイルアミノ基、低級アルキルスル
ホンアミド基、フタルイミド基、ヘテロアリール基、式
−ＮＲ4’Ｒ5’（Ｒ4’およびＲ5’は互いに独立して、
水素原子もしくは低級アルキル基を表すか、または
Ｒ4’およびＲ5’が互いに結合して、それらが結合する
窒素原子とともに、環中にさらに−ＮＲ8'−（Ｒ8'は水
素原子、低級アルキル基、フェニル基、またはベンジル
基を表す。）を１個、または酸素原子１個を含んでもよ
い飽和５ないし７員環の環状アミノ基を表す。）、もし
くは式−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ4’Ｒ5’（Ｒ4’、Ｒ5’は前記
の意味を表す。）を表す。｝で示される基が挙げられ
る。不飽和結合を含んでいてもよい炭素原子数１〜６の
２価の炭化水素基としては、例えばメチレン、エチレ
ン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、
またはヘキサメチレン等のアルキレン鎖、プロペニレン
等のアルケニレン鎖、プロピニレン等のアルキニレン鎖
が挙げられる。Ｆにおけるヘテロアリール基としては、
例えば窒素原子を１〜３個含む５〜６員環の基、酸素原
子を１個もしくは硫黄原子を１個含む５員環の基等が挙
げられ、具体的には、例えば２−ピリジル、３−ピリジ
ル、４−ピリジル、１−ピロリル、１−イミダゾリル、
１−（１，２，４−トリアゾリル）、２−チエニル、３
−チエニル、２−フリル、３−フリル等が挙げられる。
これらのヘテロアリール基は低級アルキル基で１個また
は同一もしくは異なって複数個置換されていてもよい。
ＮＲ4’Ｒ5’が形成する環状アミノ基としては、例えば
４−低級アルキル−１−ピペラジニル、４−フェニル−
１−ピペラジニル、４−ベンジル−１−ピペラジニル等
の
【００３６】
【化１５】
【００３７】（Ｒ8'は前記と同じ意味を表す。）で表さ
れる基、または１−ピロリジニル、１−ピペリジニル、
１−ホモピペリジニル、４−モルホリニル等が挙げられ
る。
【００３８】置換アルキル基、置換シクロアルキル基、
置換アルケニル基、置換アルキニル基の置換基は１個ま
たは同一もしくは異なって複数個あってもよく、置換基
としては、例えばハロゲン原子、シアノ基、ベンジルオ
キシ基、トリフルオロメチル基、水酸基、低級アルコキ
シ基、低級アルカノイルオキシ基、アミノ基、モノ低級
アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、カルバモ
イル基、低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アル
キルアミノカルボニル基、低級アルコキシカルボニルア
ミノ基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル
基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル
基、低級アルキルスルホニル基、低級アルカノイルアミ
ノ基、低級アルキルスルホンアミド基、フタルイミド
基、ヘテロアリール基、飽和ヘテロ環基または式−Ｄ2'
−Ｅ’−Ｆ｛Ｄ2'は、酸素原子、硫黄原子もしくは式−
ＮＲ3'−（Ｒ3'は前記の意味を表す。）を表し、Ｅおよ
びＦは前記の意味を表す｝で示される基が挙げられる。
ヘテロアリール基としては前記Ｆと同様のヘテロアリー
ル基が挙げられる。飽和ヘテロ環基としては、例えば１
−ピペリジニル、１−ピロリジニル等の窒素原子１個を
有する５〜８員環の基、窒素原子２個を有する６〜８員
環の基、窒素原子１個および酸素原子１個を有する６〜
８員環の基が挙げられる。また置換アルキル基として
は、シクロアルキル基もしくは置換シクロアルキルに置
換された炭素原子１〜６個のアルキル基、またはアラル
キル基もしくは置換アラルキル基が挙げられる。アラル
キル基および置換アラルキル基としては前記アリール
基、置換アリール基に置換された炭素原子数１〜６個の
アルキル基が挙げられ、例えばベンジル、１−フェニル
エチル、２−フェニルエチル、２−ナフチルメチルが挙
げられる。
【００３９】Ｙにおける好ましい基としては、例えば置
換基を有していてもよいフェニル基もしくはピリジル基
が挙げられる。置換基は１個または同一もしくは異なっ
て複数個あってもよく、好ましい置換基としては、例え
ば、フッ素、塩素等のハロゲン原子、シアノ基、トリフ
ルオロメチル基、ニトロ基、水酸基、メチレンジオキシ
基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルカノ
イルオキシ基、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、
ジ低級アルキルアミノ基、カルバモイル基、低級アルキ
ルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニ
ル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、
低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低
級アルキルスルホニル基、低級アルカノイルアミノ基、
低級アルキルスルホンアミド基または式−Ｄ1’−Ｅ’
−Ｆ（Ｄ1’、Ｅ’およびＦは前記の意味を表す。）で
示される基が挙げられる。Ｄ1’における好ましい基と
しては結合手もしくは酸素原子が挙げられる。特に好ま
しくは酸素原子である。Ｅ’における好ましい基として
は、炭素原子数１〜６のアルキレン鎖、アルケニレン鎖
もしくはアルキニレン鎖が挙げられ、更に好ましくは、
炭素数原子数１〜３個の直鎖のアルキレン鎖、もしくは
アルキニレン鎖が挙げられる。特に好ましくは炭素原子
数１〜３個の直鎖のアルキレン鎖である。Ｆにおける好
ましい基としては、水酸基、ハロゲン原子、シアノ基、
低級アルコキシ基、低級アルカノイルオキシ基、低級ア
ルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アル
キルスルホニル基、低級アルカノイルアミノ基、低級ア
ルキルスルホンアミド基、ヘテロアリール基、式−ＮＲ
4’Ｒ5’（Ｒ4’、Ｒ5’は前記の意味を表す）で示され
る基が挙げられる。具体的には、ヘテロアリール基とし
ては、例えば、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリ
ジル、１−イミダゾリル、１−（１，２，４−トリアゾ
リル）等が挙げられる。式−ＮＲ4’Ｒ5’（Ｒ4’、
Ｒ5’は前記の意味を表す）としては、例えばジメチル
アミノ、ジエチルアミノ、ピペリジニル等が挙げられ
る。特に好ましくはＦは水酸基である。
【００４０】Ｂにおける好ましい基としては、例えば置
換基を有していてもよいフェニル基もしくはヘテロアリ
ール基が挙げられる。更に好ましい基としては、例えば
フッ素、塩素等のハロゲン原子、アミノ基、低級アルキ
ル基、低級アルコキシ基もしくは低級アルキルチオ基が
１〜３個置換したフェニル基もしくはピリジル基が挙げ
られる。具体的には例えば２，６−ジイソプロピルフェ
ニル、４−アミノ−２，６−ジイソプロピルフェニル、
２，４，６−トリメチルフェニル、２，４，６−トリメ
トキシフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，
４，６−トリフルオロフェニル、２，６−ジメチルチオ
−３−ピリジル、２，６−ジメチルチオ−４−メチル−
３−ピリジル等が挙げられる。
【００４１】Ｘの好ましい基としては、例えば以下の基
が挙げられる。
【００４２】
【化１６】
【００４３】〔式中、Ｒ1は前記の意味を表す〕Ｒ1にお
ける好ましい基としては、例えば水素原子、アルキル
基、置換アルキル基が挙げられる。置換アルキル基の置
換基としては、１個または同一もしくは異なって複数個
あってもよく、好ましくは、フッ素、塩素等のハロゲン
原子、シアノ基、ベンジルオキシ基、水酸基、低級アル
コキシ基、低級アルカノイルオキシ基、カルバモイル
基、低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキル
アミノカルボニル基、カルボキシル基、低級アルコキシ
カルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスル
フィニル基、低級アルキルスルホニル基、アリール基、
低級アルカノイルアミノ基、低級アルキルスルホンアミ
ド基、フタルイミド基、ヘテロアリール基、飽和ヘテロ
環基等が挙げられる。更に好ましい置換基としては、例
えば、フッ素原子、塩素原子、シアノ基、水酸基、カル
バモイル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピ
リジル基等が挙げられる。Ｒ1におけるさらに好ましい
基としては無置換のアルキル基もしくはアルケニル基が
挙げられる。
【００４４】式１中、特に好ましくは式２
【００４５】
【化１７】
【００４６】〔式中、環Ａは置換基を有していてもよい
ピリジン環を表す。Ｙはアルキル基、置換アルキル基、
シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、芳香族基ま
たは置換芳香族基を表す。Ｒ1は水素原子、アルキル
基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル
基、アルキニル基、置換アルキニル基、シクロアルキル
基、または置換シクロアルキル基を表す。Ｒ2は水素原
子または低級アルキル基を表す。Ｒ3は低級アルキル基
を表す。Ｚaは、 １）−Ｄ1−Ｑ ［式中、Ｄ1は結合手または不飽和結合を含んでいても
よい炭素原子数１〜８の２価の炭化水素基を表し、Ｑは
水酸基、カルボキシル基、ヘテロアリール基、置換ヘテ
ロアリール基、または式：−ＮＲ4Ｒ5（Ｒ4およびＲ5は
互いに独立して、水素原子、低級アルコキシ基、低級ア
ルキル基、置換低級アルキル基、シクロアルキル基また
はアラルキル基を表すか、またはＲ4およびＲ5が互いに
結合してそれらが結合する窒素原子とともに、環中にさ
らに式：−ＮＲ8−（Ｒ8は水素原子、低級アルキル基、
置換低級アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、ベ
ンジル基、置換ベンジル基、または低級アルコキシカル
ボニル基を表す。）で表される基を１個、または酸素原
子１個を含んでもよい、環を構成する炭素原子数が４か
ら８個の飽和環状アミノ基を表す。）を表す。但し、Ｑ
がヘテロアリール基または置換へテロアリール基である
場合は、Ｄ1は結合手とはならない］または、 ２）−Ｄ2−Ｍ−Ｅ−Ｗ ［式中、Ｄ2は結合手または不飽和結合を含んでいても
よい炭素原子数１〜８の２価の炭化水素基を表し、Ｍは
酸素原子、硫黄原子、スルフィニル基もしくはスルホニ
ル基、または式−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ
−もしくは−ＮＲ6−（Ｒ6は水素原子もしくは低級アル
キル基を表す。）で表される基を表し、Ｅは結合手また
は不飽和結合を含んでいてもよい炭素原子数１〜８の２
価の炭化水素基を表し、Ｗは水酸基、カルボキシル基、
ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、または式：
−ＮＲ4Ｒ5（Ｒ4およびＲ5は前記の意味を表す。）で表
される基を表す。但し、Ｗが水酸基、カルボキシル基も
しくは式−ＮＲ4Ｒ5で表される基の時はＥは結合手とは
ならない］を表す。〕で表される化合物である。
【００４７】〔式２化合物〕本明細書中、式２中の各種
の基を詳細に説明すると次の通りである。なお、特に指
示のない限り、各々の基の説明は他の置換基の一部であ
る場合も含む。
【００４８】ここで、低級とは当該基のアルキル部分が
低級アルキル基であることを意味し、そのような低級ア
ルキル基としてはメチル、エチル、プロピル、２−プロ
ピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル
等の炭素原子数が１〜６個の低級アルキル基を挙げるこ
とができる。
【００４９】ハロゲン原子としては例えばフッ素、塩
素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
【００５０】環Ａ、Ｙ及びＲ1については、それぞれ上
記式１で述べた定義と同様の意味を表す。
【００５１】Ｒ2及びＲ3における低級アルキル基として
は、例えば直鎖または分枝した炭素原子数１〜６個のア
ルキル基が挙げられ、具体的には例えばメチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ブチル、２−ブチル、２
−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ペンチ
ル、３−ペンチル、３−メチルブチル、ヘキシル、３−
ヘキシル等が挙げられる。
【００５２】Ｄ1、Ｄ2及びＥにおける不飽和結合を含ん
でいてもよい炭素原子数１〜８の２価の炭化水素基とし
ては、例えばメチレン、エチレン、トリメチレン、テト
ラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン等のアル
キレン鎖、プロペニレン、ブテニレン等のアルケニレン
鎖、エチニレン、プロピニレン、ブチニレン等のアルキ
ニレン鎖が挙げられる。
【００５３】Ｑ及びＷにおけるヘテロアリール基または
置換ヘテロアリール基のヘテロアリール基部分として
は、例えば窒素原子を１〜３個含む５〜６員環の基、酸
素原子を１個もしくは硫黄原子を１個含む５員環の基、
窒素原子１〜４個を含み６員環と５または６員環が縮合
した二環式の基等が挙げられ、具体的には、例えば１−
ピロリル、１−ピラゾリル、１−イミダゾリル、１，
２，４−トリアゾール−１−イル、２−ピリジル、３−
ピリジル、４−ピリジル、２−チエニル、３−チエニ
ル、２−フリル、３−フリル、２−キノリル等が挙げら
れる。Ｑ及びＷにおける置換ヘテロアリール基の置換基
としては、低級アルキル基、低級アルコキシ基またはハ
ロゲン原子が挙げられ、１個または同一もしくは異なっ
て複数個置換されていてもよい。
【００５４】Ｒ4及びＲ5における置換低級アルキル基の
置換基は、１つまたは複数、同一または異なって置換し
ていてよく、例えば水酸基、ハロゲン原子または低級ア
ルコキシ基が挙げられる。
【００５５】Ｒ8における置換低級アルキル基、置換フ
ェニル基および置換ベンジル基の置換基は、１つまたは
複数、同一または異なって置換していてよく、例えば水
酸基、ハロゲン原子または低級アルコキシ基が挙げられ
る。
【００５６】−ＮＲ4Ｒ5で表される基が形成する環状ア
ミノ基としては、例えば環を構成する原子数が６個、即
ち６員環である基、例えば１−ピペリジニル、４−モル
ホリニル、４−低級アルキル−１−ピペラジニル、４−
フェニル−１−ピペラジニルもしくは４−ベンジル−１
−ピペラジニル等、５員環である基、例えば１−ピロリ
ジニル基等、または７員環である基、例えば１−ホモピ
ペリジニル等が挙げられる。
【００５７】Ｒ2における好ましい基としては水素原
子、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルが挙
げられる。Ｒ3における好ましい基としてはイソプロピ
ルまたはｔｅｒｔ−ブチルである。
【００５８】Ｄ1における好ましい基としては、単結
合、メチレンまたはエチレンが挙げられる。Ｑにおける
好ましい基としては、水酸基、ヘテロアリール基、置換
へテロアリール基、または式：−ＮＲ4Ｒ5（Ｒ4および
Ｒ5は前記の意味を表す。）で表される基が挙げられ
る。さらに好ましい基としては、水酸基、１−ピラゾリ
ル、３，５−ジメチル−１−ピラゾリル、１−イミダゾ
リル、２−メチル−１−イミダゾリル、１，２，４−ト
リアゾール−１−イル、１−ピペリジニル、１−ピロリ
ジニル、４−メチル−１−ピペラジニル、モルホリノ、
ジエチルアミノまたはジプロピルアミノ等が挙げられ
る。Ｑとして、特に好ましくは−ＮＲ4Ｒ5であってその
中でもＲ4及びＲ5が水素原子であるものが好ましい。
【００５９】Ｄ2における好ましい基としては、結合
手、メチレンもしくはエチレンが挙げられる。Ｍにおけ
る好ましい基としては、酸素原子または式：−ＮＨＣ
（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−もしくは−ＮＲ6−で
表される基が挙げられる。Ｅにおける好ましい基として
は、メチレン、エチレンもしくはトリメチレンが挙げら
れる。
【００６０】Ｗにおける好ましい基としては、水酸基、
ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、または式：
−ＮＲ4Ｒ5（Ｒ4およびＲ5は前記の意味を表す。）で表
される基が挙げられる。さらに好ましい基としては、水
酸基、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、１
−ピラゾリル、３，５−ジメチル−１−ピラゾリル、１
−イミダゾリル、２−メチル−１−イミダゾリル、１，
２，４−トリアゾール−１−イル、１−ピペリジニル、
１−ピロリジニル、４−メチル−１−ピペラジニル、モ
ルホリノ、ジエチルアミノまたはジプロピルアミノ等が
挙げられる。
【００６１】「プロドラッグ」としては、生体内で容易
に加水分解され、式１または式２の化合物を再生するも
のが挙げられ、例えばカルボキシル基を有する化合物で
あればそのカルボキシル基がアルコキシカルボニル基と
なった化合物、アルコキシカルボニル基により置換され
アルコキシカルボニルアミノ基となった化合物、アルキ
ルチオカルボニル基となった化合物、またはアルキルア
ミノカルボニル基となった化合物が挙げられる。また、
例えばアミノ基を有する化合物であれば、そのアミノ基
がアルカノイル基で置換されアルカノイルアミノ基とな
った化合物、アシロキシメチルアミノ基となった化合
物、またはヒドロキシルアミンとなった化合物が挙げら
れる。また、例えば水酸基を有する化合物であれば、そ
の水酸基が前記アシル基により置換されてアシロキシ基
となった化合物、リン酸エステルとなった化合物、また
はアシロキシメチルオキシ基となった化合物が挙げられ
る。これらのプロドラッグ化に用いる基のアルキル部分
としては前記アルキル基が挙げられ、そのアルキル基は
置換（例えば炭素数１〜６のアルコキシ基等により）さ
れていてもよい。好ましい例としては、例えばカルボキ
シル基がアルコキシカルボニル基となった化合物を例に
とれば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニルなど
の低級（例えば炭素数１〜６）アルコキシカルボニル、
メトキシメトキシカルボニル、エトキメトキシカルボニ
ル、２−メトキシエトキシカルボニル、２−メトキシエ
トキシメトキシカルボニルまたはピバロイロキシメトキ
シカルボニル等のアルコキシ基により置換された低級
（例えば炭素数１〜６）アルコキシカルボニルが挙げら
れる。
【００６２】式１および式２における各定義ならびに好
ましい基の例示、具体的な化合物の詳細については、特
開平９−４８７８０号公報ならびに国際公開公報ＷＯ０
０／０９５０５の記載に準じることができる。さらに式
１および式２で表される化合物、そのプロドラッグ及び
それらの薬学上許容される塩は、これらの文献に記載の
方法に従って調製することができる。
【００６３】本発明のＬＤＬ受容体タンパク質の発現促
進剤に有効成分として含められる式１化合物としては、
特に下記式Ａ
【００６４】
【化１８】
【００６５】〔式中、ｎ−Ｂｕはｎ−ブチル基を、ｉ−
Ｐｒはイソプロピル基を表す〕で表される化合物が好ま
しい。
【００６６】式１または式２で表される化合物、特に式
Ａで表される化合物、それらのプロドラッグの薬学上許
容される塩としては、例えば酸付加塩が挙げられる。酸
付加塩としては、具体的には、例えば塩酸塩、硝酸塩、
硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、トリ
フルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、マレイン酸塩、クエ
ン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩
が挙げられる。また、該化合物がカルボキシル基等を有
する場合、例えばジエタノールアミン塩、エチレンジア
ミン塩もしくはＮ−メチルグルカミン塩等の有機塩基と
の塩、カルシウム塩もしくはマグネシウム塩等のアルカ
リ土類金属との塩、またはリチウム塩、カリウム塩もし
くはナトリウム塩等のアルカリ金属との塩であってもよ
い。
【００６７】本発明はまた、ＬＤＬ受容体タンパク質の
発現促進剤として、また該剤に有効成分として含めるに
有用な、ＬＤＬ受容体タンパク質の発現を促進する化合
物をスクリーニングする方法を提供する。ここで、スク
リーニングする対象としては、天然あるいは合成の化合
物に加え、組成物や混合物等の任意の態様であってもよ
い。本発明のスクリーニング方法は具体的には以下の工
程を含む。
【００６８】（１）ＬＤＬ受容体発現細胞を使用する工
程（工程１）。 当該工程に使用する細胞はＬＤＬ受容体を発現し得る細
胞であれば特に限定されず、例えば初代培養細胞、株化
細胞、あるいはＬＤＬ受容体遺伝子を導入し人工的にあ
るいは過剰にＬＤＬ受容体を発現している形質転換細胞
等が挙げられる。好ましくは肝臓由来の細胞である。当
該細胞を、次工程（工程２）に付すまで適当な培養条件
にて培養あるいは継代培養する。かかる培養は、ＬＤＬ
受容体を発現する能力を維持し得る条件であれば、当分
野で通常行われている条件下で実施することができる。
【００６９】（２）ＬＤＬ受容体の転写抑制因子の存在
下、被検物質の存在下または非存在下で上記ＬＤＬ受容
体発現細胞を培養する工程（工程２）。 「被検物質」とは、ＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進
作用の有無を調べるために選択あるいは合成された化合
物、あるいは当該化合物を有効成分とする薬剤であり、
当該化合物は新規な化合物以外に、既に別の作用を有す
ることが報告されている既知化合物をも包含する。例え
ば前述の特開平９−４８７８０号公報に開示されている
一連の化合物群（式１で表される）、国際公開公報ＷＯ
００／０９５０５に開示されている一連の化合物（式２
で表される）等が挙げられる。既にＬＤＬ受容体タンパ
ク質の発現促進作用が知られている化合物に対しても、
その効果の程度を知る目的で本発明のスクリーニング方
法の被検物質として使用することができる。後述する
が、被検物質のＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進作用
の有無を確認するための対照（陰性対照）として、被検
物質の非存在下で培養した細胞を用いることが好まし
い。目的とするＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進作用
が、ＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ転写後のタンパク質発現プ
ロセスを制御することによってもたらされるものである
ことを明確にするために、本工程はＬＤＬ受容体の転写
抑制因子の存在下で実施されることが好ましい。「ＬＤ
Ｌ受容体の転写抑制因子」としては、通常当分野で使用
される転写抑制因子が挙げられ、例えば２５−ヒドロキ
シコレステロール、コレステロール、β−ＶＬＤＬ等が
挙げられ、好ましくは２５−ヒドロキシコレステロール
が用いられる。かかる転写抑制因子の存在下で発揮され
るＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進作用は、ＬＤＬ受
容体の遺伝子発現（ｍＲＮＡへの転写）の上昇によるも
のではなく転写後のタンパク質発現プロセスの制御によ
るものである。当該転写抑制因子は、培養細胞の培養液
中に添加することができ、その用量、処理時間等は十分
な転写抑制効果が得られるように適宜設定されるが、通
常、被検物質と一緒に処理に付される。当該工程は培養
細胞の培養液中に、被検物質を添加することによって行
われる。当該被検物質の添加量は、被検物質の種類、細
胞の種類に応じて適宜設定される。好ましくは添加量を
段階的に変化させて調べることが好ましい。温度、処理
時間も被検物質や細胞の種類、培養条件に応じて適宜設
定されるが、通常、０℃〜５０℃で処理し、数十分〜数
時間の範囲内で当該処理を完了する。また、処理時間は
経時的に数種類設定することが好ましい。
【００７０】（３）被検物質存在下または非存在下で培
養したＬＤＬ受容体発現細胞のＬＤＬ受容体タンパク質
発現量を測定する工程（工程３）。 本工程は、上記工程２で調製された、被検物質存在下ま
たは非存在下で培養したＬＤＬ受容体発現細胞のＬＤＬ
受容体タンパク質の発現量が測定できる方法であれば特
に限定されず、当分野で通常実施される任意の技術を用
いることができる。例えばイムノブロッティング法や免
疫沈降法等の抗体を利用した手法が用いられ、必要に応
じて、蛍光色素や放射性同位元素等の標識化合物を用い
ることができる。より具体的には以下の工程により実施
されるが、本発明はこれらの例示になんら限定されるも
のではない。
【００７１】（３−１）上記工程２で調製された、被検
物質存在下または非存在下で培養したＬＤＬ受容体発現
細胞に、放射性同位元素で標識されたアミノ酸を添加す
る工程（工程３−１）。 本工程で使用される「放射性同位元素で標識されたアミ
ノ酸」としては、当分野で通常タンパク質の生合成研究
に使用し得るものであれば特に限定されないが、具体的
には35Ｓ−メチオニンや35Ｓ−システイン、またはそれ
らの混合物（35Ｓ−メチオニン・システイン）が挙げら
れる。当該アミノ酸を添加、あるいは当該アミノ酸を含
有する培養液に交換してから、次の工程（即ち細胞タン
パク質の抽出）に付すまでの培養時間（あるいは処理時
間）は、使用する細胞や被検物質の種類等に応じて適宜
設定される。また、生合成されたタンパク質の挙動を追
跡するためには、上記放射性同位元素でのパルスラベル
が好ましく、この場合、一定期間（当該期間も、使用す
る細胞や被検物質の種類、スクリーニングの対象となる
所望する化合物の特徴等に応じて適宜設定される）、該
放射性同位元素で標識されたアミノ酸存在下で培養（あ
るいは処理）した後、当該アミノ酸を含有しない培養液
に交換する。該「一定期間」は、通常３０分間〜２４時
間、好ましくは３０分間〜２時間、特に好ましくは３０
分程度である。本工程により、放射性同位元素で標識さ
れたアミノ酸添加後、あるいはその存在下で培養してい
た期間に合成されたタンパク質が放射標識される。
【００７２】（３−２）経時的に一定量の細胞を採取
し、細胞を可溶化後、細胞タンパク質画分を調製する工
程（工程３−２）。 本工程では、まず、放射性同位元素で標識されたアミノ
酸存在下で培養した細胞、あるいは放射性同位元素で標
識されたアミノ酸で一定期間処理した細胞を、経時的に
一定量採取する。浮遊系の細胞であれば、フラスコ等の
同一の培養器から経時的に容易に一定量採取することが
できるが、接着細胞等、細胞の採取に剥離操作を伴う場
合には予め測定ポイントの数に応じて複数の培養皿等の
培養器を用いて同一条件で培養、処理した細胞を経時的
に使用する。培養物を遠心分離等の常法に付して細胞を
回収する。当該回収した細胞を適当な緩衝液剤中に懸濁
して、さらに界面活性剤を適当な濃度で加えて細胞を可
溶化し、細胞タンパク質を抽出液として得る。得られる
粗抽出液は、必要ならば界面活性剤の存在下で、一般に
用いられる方法を適宜組み合わせることによって精製す
ることもできる。界面活性剤としては、細胞を可溶化
し、タンパク質を抽出し得るものであれば当分野で通常
使用されるものが使用でき、例えばドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、セチルトリメチルアンモニウムブロマ
イド（ＣＴＡＢ）等が挙げられるが、これらは強力なタ
ンパク質変性作用を有するので、後の工程、例えば免疫
沈降法等の抗体を用いる工程における抗体との反応性を
考慮して、穏やかな界面活性剤、例えばＣＨＡＰＳ等の
両イオン性界面活性剤やＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の非
イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。
【００７３】（３−３）得られた細胞タンパク質画分中
に存在するＬＤＬ受容体タンパク質を免疫沈降させる工
程（工程３−３）。 本工程も通常、当分野で実施される免疫沈降法と同様に
して実施することができる。すなわち、ＬＤＬ受容体タ
ンパク質に特異的に結合する抗体ならびにセファロース
等の担体が結合しているプロテインＡやプロテインＧ等
の抗体に特異的に結合する物質を用い、免疫沈降物を得
る。本発明において使用し得る抗体としてはＬＤＬ受容
体タンパク質を特異的に認識し得る抗体であれば特に限
定されないが、その種類や濃度、処理条件等は実施する
実験条件に応じて適宜設定することが好ましい。
【００７４】（３−４）免疫沈降物中のＬＤＬ受容体タ
ンパク質の量を測定する工程（工程３−４）。 本工程も、免疫沈降物中のＬＤＬ受容体タンパク質の量
を測定することが可能な方法であれば任意の方法が利用
できる。例えば上記の工程３−３で調製した免疫沈降物
を電気泳動に付し、オートラジオグラフィーを行う。デ
ンシトメーターで放射活性の強さを測定し、免疫沈降物
中のＬＤＬ受容体タンパク質を定量する。ＬＤＬ受容体
は、およそ１２０ＫＤａの前駆体（未成熟型）とおよそ
１６０ＫＤａの糖鎖付加を受けた成熟型が存在し、その
分子量の違いに基づいて未成熟型と成熟型を区別し割合
を算出することもできる。
【００７５】（４）ＬＤＬ受容体タンパク質の発現量を
促進する物質を選択する工程（工程４）。 上記工程３で得られた結果をもとに、ＬＤＬ受容体タン
パク質の発現量を促進する物質を選択する。ＬＤＬ受容
体は糖鎖付加され、成熟型として細胞膜表面で発現して
いる。従って、高脂血症への適用や血中脂質低下剤とし
ての用途を想定した場合、ＬＤＬ受容体タンパク質の発
現を促進する化合物、特に成熟型ＬＤＬ受容体タンパク
質の発現を促進する化合物を選択することが好ましい。
すなわち未成熟型ＬＤＬ受容体タンパク質量に対する成
熟型ＬＤＬ受容体タンパク質量の比（以下、成熟型／未
成熟型−比ともいう）が大きい物質を選択する。陰性対
照としては被検物質非存在下で同様に処理した細胞にお
いて測定されるＬＤＬ受容体タンパク質の発現量、ある
いは成熟型／未成熟型−比である。スクリーニングする
にあたり、陽性対照を設けることが好ましく、例えば式
Ａで表される化合物（以下単に化合物Ａともいう）存在
下で培養した細胞において測定されるＬＤＬ受容体タン
パク質の発現量、あるいは成熟型／未成熟型−比が用い
られる。特に好ましくはかかる陽性対照以上の結果を得
ることのできる物質を選択する。
【００７６】上記の方法、ならびに上記以外の方法を使
用する場合でも必要な試薬、手法等は公知あるいは商業
的に入手可能である。
【００７７】本発明は、上記スクリーニング方法によっ
て得られ得るＬＤＬ受容体タンパク質の発現を促進する
化合物またはその薬学上許容される塩を有効成分として
含有する、ＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進剤を提供
する。本発明のＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進剤
は、ヒトをはじめウシ、ウマ、イヌ、マウス、ラット等
の哺乳動物に対しＬＤＬ受容体量を上昇させる作用を有
し、血中のＬＤＬ量を低減化することができ、従って、
高脂血症等のＬＤＬが悪玉として作用する種々の疾患の
予防・治療に有用である。従って、本発明は、上記スク
リーニング方法によって得られ得るＬＤＬ受容体タンパ
ク質の発現を促進する化合物もしくはそのプロドラッグ
またはそれらの薬学上許容される塩を有効成分として含
有する、血中脂質低下剤ならびに高脂血症治療剤を提供
する。尚、本発明において、単に治療剤という場合で
も、当該治療には、予防、症状の軽減、症状の減退、進
行停止等、あらゆる管理が含まれるものとする。上記ス
クリーニング方法によって得られ得るＬＤＬ受容体タン
パク質の発現を促進する化合物としては、具体的には陽
性対照として使用し得る化合物Ａをはじめとする上述の
式１化合物が挙げられる。
【００７８】高脂血症治療剤、ならびに血中脂質低下剤
やＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進剤を医薬として使
用する場合は、一般的な医薬製剤として調製され、経口
または非経口的に投与される。経口的に投与する場合、
通常当分野で用いられる投与形態で投与することができ
る。非経口的に投与する場合には、局所投与剤（経皮剤
等）、直腸投与剤、注射剤、経鼻剤等の投与形態で投与
することができる。
【００７９】経口剤または直腸投与剤としては、例えば
カプセル、錠剤、ピル、散剤、ドロップ、カシェ剤、座
剤、液剤等が挙げられる。注射剤としては、例えば、無
菌の溶液又は懸濁液等が挙げられる。局所投与剤として
は、例えば、クリーム、軟膏、ローション、経皮剤（通
常のパッチ剤、マトリクス剤）等が挙げられる。
【００８０】上記の剤形は当分野で通常行われている手
法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤とともに
製剤化され得る。薬学的に許容される賦形剤、添加剤と
しては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色
剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙
げられる。
【００８１】薬学的に許容される担体としては、例え
ば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タ
ルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱
粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリ
ウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カ
カオバター等が挙げられる。
【００８２】さらに、錠剤は必要に応じて通常の剤皮を
施した錠剤、例えば糖衣錠、腸溶性コーティング錠、フ
ィルムコーティング錠あるいは二層錠、多層錠とするこ
とができる。散剤は、薬学的に許容される散剤の基剤と
共に製剤化される。基剤としては、タルク、ラクトー
ス、澱粉等が挙げられる。ドロップは水性又は非水性の
基剤と一種またはそれ以上の薬学的に許容される拡散
剤、懸濁化剤、溶解剤等と共に製剤化できる。カプセル
は、有効成分となる化合物を薬学的に許容される担体と
共に中に充填することにより製造できる。当該化合物は
薬学的に許容される賦形剤と共に混合し、または賦形剤
なしでカプセルの中に充填することができる。カシェ剤
も同様の方法で製造できる。本発明を座剤として調製す
る場合、植物油（ひまし油、オリーブ油、ピーナッツ油
等）や鉱物油（ワセリン、白色ワセリン等）、ロウ類、
部分合成もしくは全合成グリセリン脂肪酸エステル等の
基剤と共に通常用いられる手法によって製剤化される。
【００８３】注射用液剤としては、溶液、懸濁液、乳剤
等が挙げられる。例えば、水溶液、水−プロピレングリ
コール溶液等が挙げられる。液剤は、水を含んでも良
い、ポリエチレングリコールおよび／またはプロピレン
グリコールの溶液の形で製造することもできる。
【００８４】経口投与に適切な液剤は、有効成分となる
化合物を水に加え、着色剤、香料、安定化剤、甘味剤、
溶解剤、増粘剤等を必要に応じて加え製造することがで
きる。また経口投与に適切な液剤は、当該化合物を分散
剤とともに水に加え、粘重にすることによっても製造で
きる。増粘剤としては、例えば、薬学的に許容される天
然または合成ガム、レジン、メチルセルロース、ナトリ
ウムカルボキシメチルセルロースまたは公知の懸濁化剤
等が挙げられる。
【００８５】局所投与剤としては、上記の液剤および、
クリーム、エアロゾル、スプレー、粉剤、ローション、
軟膏等が挙げられる。上記の局所投与剤は、有効成分と
なる化合物と薬学的に許容される希釈剤および担体と混
合することによって製造できる。軟膏およびクリーム
は、例えば、水性または油性の基剤に増粘剤および／ま
たはゲル化剤を加えて製剤化する。該基剤としては、例
えば、水、液体パラフィン、植物油等が挙げられる。増
粘剤としては、例えばソフトパラフィン、ステアリン酸
アルミニウム、セトステアリルアルコール、プロピレン
グリコール、ポリエチレングリコール、ラノリン、水素
添加ラノリン、蜜蝋等が挙げられる。局所投与剤には、
必要に応じて、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ
安息香酸プロピル、クロロクレゾール、ベンザルコニウ
ムクロリド等の防腐剤、細菌増殖防止剤を添加すること
もできる。ローションには、水性又は油性の基剤に、一
種類またはそれ以上の薬学的に許容される安定剤、懸濁
化剤、乳化剤、拡散剤、増粘剤、着色剤、香料等を加え
ることができる。
【００８６】投与量、投与回数は使用する化合物の種
類、患者の症状、年齢、体重、投与形態等によって異な
るが、例えば式１で表される化合物を有効成分として含
める場合であれば、経口投与する場合には、通常は成人
に対し１日あたり約１〜約５００ｍｇの範囲、好ましく
は約１〜約１００ｍｇの範囲を１回または数回に分けて
投与することができる。注射剤として投与する場合には
約０．１〜約１００ｍｇの範囲、好ましくは約０．１〜
約１０ｍｇの範囲を１回または数回に分けて投与するこ
とができる。
【００８７】
【実施例】以下、本発明を実施例にて具体的且つ詳細に
説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものでは
ない。又、本実施例では下記式Ａで表される化合物Ａを
用いて、そのＬＤＬ受容体（以下ＬＤＬＲ、あるいはＬ
ＤＬ−Ｒともいう）タンパク質発現促進作用を確認し
た。
【００８８】
【化１９】
【００８９】実施例１：培養肝細胞株を用いたインビト
ロでの被験物質のＬＤＬ受容体タンパク質量およびｍＲ
ＮＡ量に対する影響 タンパク質量への影響 ［方法］ＨｅｐＧ２細胞を１０％ Lipoprotein defici
ent serum（ＬＰＤＳ）、１．５μｇ／ｍｌ ２５−ヒ
ドロキシコレステロールおよび各種濃度の被験物質（化
合物Ａ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で培養した。
２４時間培養後、細胞を細胞溶解液（１２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），２ｍＭ ＣａＣｌ 2，１
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，プロテアーゼ阻害剤）で溶
解し、１２０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。遠心後
の上清を細胞タンパク質画分とした。タンパク質濃度を
測定し、サンプル間のタンパク質濃度をそろえ、イムノ
ブロッティング法にてＬＤＬ受容体タンパク質量を評価
した。実験条件を図１−１に示す。 ［結果］結果を図１−２に示す。２５−ヒドロキシコレ
ステロールの添加により、ＬＤＬ受容体遺伝子の転写が
抑制された条件下、化合物ＡはＬＤＬ受容体タンパク質
量の発現を０．１μＭの処置濃度より上昇させた。 ｍＲＮＡ量への影響 ［方法］ＨｅｐＧ２細胞を１０％ＬＰＤＳ、１．５μｇ
／ｍｌ ２５−ヒドロキシコレステロールおよび上記
で十分にＬＤＬ受容体タンパク質の発現を引き起こすこ
とが確認された量の被験物質（化合物Ａ；１０μＭ）を
含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で培養を開始した。培養
開始後、経時的にTRIzol reagent（GIBCO社）を用いて
全ＲＮＡを調製した。これを用いて、Taqman PCR法（AB
I PRISM 7700 sequence detector（Applied Biotechnol
ogy社））にてＬＤＬ受容体ｍＲＮＡ量を定量し、β-ア
クチンｍＲＮＡの発現量に対する比として結果を表し
た。実験条件を図１−１に示す。 ［結果］結果を図１−３に示す。２５−ヒドロキシコレ
ステロールの添加により、ＬＤＬ受容体遺伝子の転写が
抑制された条件下、化合物ＡはＬＤＬ受容体ｍＲＮＡを
誘導しなかった。以上の結果より、化合物Ａは、肝細胞
（インビトロ）中のＬＤＬ受容体ｍＲＮＡ発現に変化を
与えることなく、ＬＤＬ受容体タンパク質の発現を上昇
させることを確認した。
【００９０】実施例２：培養肝細胞株を用いたインビト
ロでの被験物質のＬＤＬ受容体タンパク質量およびｍＲ
ＮＡ量に対する影響（スタチン系薬剤との対比） タンパク質量への影響 ［方法］ＨｅｐＧ２細胞を１０％ＬＰＤＳおよび各種濃
度の被験物質（化合物Ａ）あるいはスタチン系薬剤の代
表薬物であるアトロバスタチン（atorvastatin；各種濃
度）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で処置し、２４時間
の培養後、細胞を実施例１と同様にして可溶化し細胞
タンパク質画分を調製し、イムノブロティング法にてＬ
ＤＬ受容体タンパク質量を評価した。実験条件を図２−
１に示す。 ［結果］結果を図２−２に示す。培地中のリポタンパク
質を除いた、スタチン系の薬剤がＬＤＬ受容体の発現を
引き起こすことが良く知られている条件で、化合物Ａ
は、ＬＤＬ受容体タンパク質量を上昇させた。アトロバ
スタチンの効果を調べたところ発現上昇が認められた。 ｍＲＮＡ量への影響 ［方法］ＨｅｐＧ２細胞を１０％ＬＰＤＳおよび実施例
１で十分にＬＤＬ受容体タンパク質の発現を引き起こ
すことが確認された量の被験物質（化合物Ａ；１０μ
Ｍ）あるいはアトロバスタチン（１μＭ）を含む培地中
で培養を開始した。培養開始後、経時的にＲＮＡを調製
した。調製したＲＮＡを用いて、Taqman PCR法にてＬＤ
Ｌ受容体ｍＲＮＡ量を定量し、β−アクチンｍＲＮＡの
発現量に対する比として結果を表した。 ［結果］結果を図２−３に示す。培地中のリポタンパク
質を除き、スタチン系の薬剤がＬＤＬ受容体の発現を引
き起こすことが良く知られている条件で、化合物Ａは、
処置後８時間で、ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡに対して弱い転
写活性化を示したがアトロバスタチンと比較して弱いも
のであった。２４時間の処置では、この作用は認められ
なかった。
【００９１】実施例３：培養細胞株を用いたインビトロ
での被験物質のＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの安定性に対する
影響 ［方法］ＨｅｐＧ２細胞を１０％ＬＰＤＳ、５μｇ／ｍ
ｌ アクチノマイシンＤ（Actinomycin D）および被験
物質（化合物Ａ；１０μＭ）、あるいは陽性対照として
１６０ｎＭのホルボールミリステートアセテート（ＰＭ
Ａ；ＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ安定化作用を有することが
文献的に公知）を含む培地で処置し、経時的にＲＮＡを
調製した。調製したＲＮＡを用いて、SYBR Green法（AB
I PRISM 7700 sequence detector（Applied Biotechnol
ogy社））にてＬＤＬ受容体ｍＲＮＡ量を定量し、ＧＡ
ＰＤＨ ｍＲＮＡの比として結果をあらわした。実験条
件を図３−１に示す。 ［結果］ＰＭＡは、ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの安定化を示
した（図３−３）が、化合物Ａは影響を及ぼさなかった
（図３−２）。
【００９２】実施例４：ハムスターを用いたインビボで
の被験物質のＬＤＬ受容体タンパク質量およびｍＲＮＡ
量に対する影響 タンパク質量への影響 ［方法］ハムスターを、普通食飼育下で、７日間化合物
Ａを３、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ経口投与した。８日目
に解剖し、肝臓を摘出し、それにホモジナイズバッファ
ー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８），１ｍＭ
ＣａＣｌ2，１５０ｍＭＮａＣｌ）を加え、ホモジナイ
ズした。ホモジネートを８０００ｘｇ、１０分、４℃
で、遠心し、その上清を１００，０００ｘｇ、６０分、
４℃で遠心した沈殿を膜画分とした。これに、ホモジナ
イズバッファーを添加し、１００，０００ｘｇ、２０
分、４℃で遠心し、洗浄の後、懸濁用バッファー（１２
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｍａｌｅａｔｅ（ｐＨ６），１ｍＭ
ＣａＣｌ2，１６０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００）で懸濁し、このタンパク濃度を測定の
後、サンプル間のタンパク量をそろえ、イムノブロッテ
ィング法にてＬＤＬ受容体タンパク質量を評価した。実
験条件を図４−１に示す。 ［結果］化合物ＡはＬＤＬ受容体タンパク質量を上昇さ
せた（図４−２：上段のイムノブロッティング像）。 ｍＲＮＡ量への影響 ［方法］上記実施例４で調製した肝臓より、グアニジ
ンチオシアネート・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰ
Ｃ）法でＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡを用いて、
Taqman PCR法にてＬＤＬ受容体ｍＲＮＡ量を定量し、β
−アクチンｍＲＮＡとの比で結果を示した。実験条件を
図４−１に示す。 ［結果］化合物Ａは、ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡ量に対して
影響を及ぼさなかった（図４−３）。
【００９３】実施例５：培養肝細胞株を用いたインビト
ロでの被験物質のＬＤＬ受容体タンパク質合成に対する
影響 ［方法］ＨｅｐＧ２細胞を１０％ＬＰＤＳ、１．５μｇ
／ｍｌ ２５−ヒドロキシコレステロールおよび被験物
質（化合物Ａ；１０μＭ）を含むメチオニン・システイ
ン不含ＤＭＥＭ培地で処置し、４時間培養後、細胞内で
生合成されるタンパク質の標識を目的として35Ｓ−メチ
オニン・システインを同培地に添加し、処置を続けた。
35Ｓ−メチオニン・システインを添加後、０、１、２、
３時間後に細胞を回収し、洗浄後、１００μｌの溶解液
（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．５），０．１
Ｍ ＮａＣｌ，２％ＣＨＡＰＳ，２ｍＭ ＣａＣｌ2，
２．５ｍＭＭｇＣｌ2）で細胞を溶解させた。４℃、１
５０００ｒｐｍ、３０分の遠心の後、調製した細胞タン
パク質画分に１／９容の１０％ＳＤＳ溶液を添加し、５
分間、９５℃で処置した。これに、９倍容のＨＢＳバッ
ファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．４），
０．１Ｍ ＮａＣｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を
添加し、ＬＤＬ受容体タンパク質を抗ＬＤＬ受容体抗体
（あらかじめ反応性が確認されている市販の抗体）を用
いて免疫沈降させ、電気泳動後オートラジオグラフィー
にて合成されたＬＤＬ受容体タンパク質量を評価した。
分子量１２０ＫＤａ付近のものを未成熟型ＬＤＬ受容
体、分子量１６０ＫＤａ付近のものを成熟型ＬＤＬ受容
体とした。実験条件を図５−１に示す。 ［結果］化合物Ａ処置をすると、対照と比べて、成熟型
のＬＤＬ受容体タンパク質の合成量が経時的に上昇し
た。一方、未成熟型の方は、35Ｓ−メチオニン・システ
インを添加２時間後をピークとした生合成増大が認めら
れた。こちらのほうも、対照と比べて、増大していた
（図５−２）。成熟型と未成熟型の比の経時的変動を示
したものが、図５−３であるが、化合物Ａ処置で、対照
より増大するということが判った。この結果より、化合
物Ａは、成熟型ＬＤＬ受容体の生合成を促進することが
判った。
【００９４】実施例６：培養肝細胞株を用いたインビト
ロでの被験物質のＬＤＬ受容体タンパク質成熟過程に対
する影響 ［方法］ＨｅｐＧ２細胞を１０％ＬＰＤＳ、１．５ｇ／
ｍｌ ２５−ヒドロキシコレステロールおよび被験物質
（化合物Ａ；１０μＭ）を含む培地で処置し、４時間培
養後、35Ｓ−メチオニン・システインを３０分間添加
し、細胞内生合成タンパク質のパルス標識を行った。そ
の後、35Ｓ−メチオニン・システインを含まない培地に
戻し、経時的に細胞を可溶化し細胞タンパク質画分を調
製した。調製した細胞タンパク質画分を用いて、ＬＤＬ
受容体タンパク質を実施例５と同様に免疫沈降させ、電
気泳動後オートラジオグラフィーにて未成熟型・成熟型
ＬＤＬ受容体タンパク質量を評価した。実験条件を図６
−１に示す。 ［結果］本処理条件では、未成熟型のＬＤＬ受容体タン
パク質については、化合物Ａと対照群に差は認められな
かった。一方で、成熟型への変換は、化合物Ａ処置で増
大し、未成熟型と成熟型の比を算出すると、化合物Ａ
は、その比を増大させた。このことから、化合物Ａは、
ＬＤＬ受容体タンパク質の成熟化過程を上昇させること
が明らかとなった（図６−２〜図６−４）。
【００９５】実施例７：培養肝細胞株を用いたインビト
ロでの被験物質のＳＲ−ＢＩ、インスリン受容体βサブ
ユニット発現に対する効果 ［方法］ＨｅｐＧ２細胞を１０％ＬＰＤＳおよび被験物
質（化合物Ａ）を含む培地で処置し、２４時間培養後、
細胞を可溶化し細胞タンパク質画分を調製した。細胞を
可溶化し細胞タンパク質画分を調製した。調製した細胞
タンパク質画分を用いて、イムノブロッティング法にて
ＳＲ−ＢＩタンパク質量およびインスリン受容体βサブ
ユニットタンパク質量を評価した。実験条件を図７−１
に示す。 ［結果］化合物Ａは、ＳＲ−ＢＩタンパク質量およびイ
ンスリン受容体βサブユニットタンパク質量に対して影
響を示さなかった（図７−２、図７−３）。このことか
ら、化合物ＡのＬＤＬ受容体発現に対する作用は、特異
性の高いものであることが明らかとなった。
【００９６】実施例８：ハムスターを用いたインビボで
の被験物質のＳＲ−ＢＩ発現に対する効果 ［方法］ハムスターを普通食飼育下で、７日間化合物Ａ
を３、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ経口投与した後、肝臓よ
り実施例４と同様にして、膜画分を調製した。調製した
膜画分を用いてイムノブロッティング法にてＳＲ−ＢＩ
タンパク質量を評価した。 ［結果］化合物Ａは、ＳＲ−ＢＩタンパク質量に対して
は影響を示さなかった（図８）。
【００９７】実施例９：ハムスターを用いた被験物質の
血清脂質低下作用についての検討 ［方法］ハムスターを普通食飼育下で、７日間化合物Ａ
を３、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ経口投与した後、血清コ
レステロール量を測定した。 ［結果］化合物Ａは、顕著な血清コレステロール低下作
用を示した（図４−２の下段、図８の下段：血清総コレ
ステロール低下率）。
【００９８】実施例１０：スクリーニング方法 インビトロにおいて、ＬＤＬ受容体タンパク量上昇作用
があるかをイムノブロッティング法等にて確認する。必
要に応じて、ｍＲＮＡに対する影響（ＰＣＲ法や、ノザ
ンブロット法等）・他のタンパク質に対する影響（イム
ノブロッティング法等）を確認する。タンパク質合成以
降の過程に影響があるかについては、35Ｓ−メチオニン
・システインなどを用いた方法にて確認する。血清脂質
低下作用は、各種動物（例えばウサギ・ハムスターな
ど）を用いたモデル（普通食下、高脂肪食下など）で評
価する。インビボにおいて、ＬＤＬ受容体タンパク質合
成以降に作用するかの確認は、イムノブロッティング法
などでＬＤＬ受容体タンパク質発現に対する影響を、Ｐ
ＣＲ法などでｍＲＮＡに対する影響を検討する。
【００９９】今までに、ＬＤＬ受容体はｍＲＮＡに転写
され、タンパク質に翻訳された段階では、未成熟で、さ
らに糖鎖付加を受けて成熟型（機能的な）ＬＤＬ受容体
となることが明らかとなっているので、ＬＤＬ受容体の
翻訳後に関与する因子としては、Ｄａｂ１，Ｄａｂ２，
Ｒａｂ１ｂ，Ｒａｂ８，Ｒａｆｔ等が考えられている。
従って、こういった因子に作用することによっても翻訳
効率の上昇／膜表面への輸送の効率化／成熟化の効率化
／分解の抑制などが変化しＬＤＬ受容体タンパク質の発
現増加が生じることが考えられる。
【０１００】
【発明の効果】本発明によれば、転写活性化経路に依存
することなくＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ転写後のタンパク
質発現プロセスを制御することによってＬＤＬ受容体タ
ンパク質の発現を促進することが可能な化合物ならびに
そのような化合物をスクリーニングする方法が提供さ
れ、該化合物は新しい作用機序を有する高脂血症治療剤
等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、培養肝細胞株を用いたインビトロでの
化合物ＡのＬＤＬ受容体タンパク質量およびｍＲＮＡ量
に対する影響を調べた結果を示す図である。 図1-1：実験条件の要約を示す図である。 図1-2：化合物Ａの、ＬＤＬ受容体タンパク質量への影
響を調べた、イムノブロッティングの結果を示す図であ
る。 図1-3：化合物Ａの、ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡ量への影響
を調べたグラフである。
【図２】図２は、培養肝細胞株を用いたインビトロでの
被験物質のＬＤＬ受容体タンパク質量およびｍＲＮＡ量
に対する影響（スタチン系薬剤との対比）を調べた結果
を示す図である。 図2-1：実験条件の要約を示す図である。 図2-2：化合物Ａ及びアトロバスタチンの、ＬＤＬ受容
体タンパク質量への影響を調べた、イムノブロッティン
グの結果を示す図である。 図2-3：化合物Ａ及びアトロバスタチンの、ＬＤＬ受容
体ｍＲＮＡ量への影響を調べたグラフである。
【図３】図３は、培養細胞株を用いたインビトロでの被
験物質のＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの安定性に対する影響を
調べた結果を示す図である。 図3-1：実験条件の要約を示す図である。 図3-2：化合物Ａの、ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの安定性に
及ぼす影響を調べた結果を示すグラフである。 図3-3：ＰＭＡの、ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの安定性に及
ぼす影響を調べた結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ハムスターを用いたインビボでの被験
物質のＬＤＬ受容体タンパク質量およびｍＲＮＡ量に対
する影響を調べた結果を示す図である。 図4-1：実験条件の要約を示す図である。 図4-2：（上段）化合物Ａの、ＬＤＬ受容体タンパク質
量への影響を調べたイムノブロッティングの結果を示す
図である。（下段）化合物Ａの、血清総コレステロール
値に及ぼす影響を調べた結果。 図4-3：化合物Ａの、ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡ量への影響
を調べた結果を示すグラフである。
【図５】図５は、培養肝細胞株を用いたインビトロでの
被験物質のＬＤＬ受容体タンパク質合成に対する影響を
調べた結果を示す図である。 図5-1：実験条件の要約を示す図である。 図5-2：未成熟型ＬＤＬ受容体と成熟型ＬＤＬ受容体の
合成量の経時的変化を示したグラフである。 図5-3：未成熟型ＬＤＬ受容体と成熟型ＬＤＬ受容体の
比の経時的変動を示したグラフである。
【図６】図６は、培養肝細胞株を用いたインビトロでの
被験物質のＬＤＬ受容体タンパク質成熟過程に対する影
響を調べた結果を示す図である。 図6-1：実験条件の要約を示す図である。 図6-2：ＬＤＬ受容体の成熟過程を測定したオートラジ
オグラフィーの結果を示す図である。 図6-3：未成熟型ＬＤＬ受容体量と成熟型ＬＤＬ受容体
量の経時的変化を示したグラフである。 図6-4：未成熟型ＬＤＬ受容体と成熟型ＬＤＬ受容体の
比の経時的変動を示したグラフである。
【図７】図７は、培養肝細胞株を用いたインビトロでの
被験物質のＳＲ−ＢＩ、インスリン受容体発現に対する
効果を示した図である。 図7-1：実験条件の要約を示す図である。 図7-2：化合物ＡのＳＲ−ＢＩ発現に及ぼす影響を調べ
たイムノブロッティングの結果を示す図である。 図7-3：化合物Ａのインスリン受容体βサブユニット発
現に及ぼす影響を調べたイムノブロッティングの結果を
示す図である。
【図８】図８は、ハムスターを用いたインビボでの被験
物質のＳＲ−ＢＩ発現に対する効果を調べた結果を示す
図である。 （上段）化合物Ａの、ＳＲ−ＢＩ発現量への影響を調べ
たイムノブロッティングの結果を示す図である。 （下段）化合物Ａの、血清総コレステロール値に及ぼす
影響を調べた結果。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 (72)発明者 奥山 元 東京都練馬区上石神井２−36−６ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 4B063 QA18 QQ02 QQ08 QQ79 QR77 QX02 4C065 AA04 BB09 CC01 DD02 EE02 HH04 HH09 JJ04 JJ06 KK01 PP03 4C086 AA01 AA02 CB09 MA01 MA04 NA14 ZA45 ZB21 ZC33

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式１ 【化１】 〔式中、環Ａは置換基を有していてもよいピリジン環を
    表す。Ｘは、式 【化２】 （式中、Ｒ1は水素原子、アルキル基、置換アルキル
    基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、
    置換アルキニル基、シクロアルキル基、または置換シク
    ロアルキル基を表す。）または式 【化３】 ［式中、Ｗは水素原子または式−ＯＲa（Ｒaはアルキル
    基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル
    基、アルキニル基、または置換アルキニル基を表す。）
    を表す。］で示される基を表す。Ｚは結合手、−ＮＨ
    −、炭素原子数１もしくは２のアルキレン基または−Ｃ
    Ｈ＝ＣＨ−を表す。Ｙはアルキル基、置換アルキル基、
    シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、芳香族基ま
    たは置換芳香族基を表す。Ｂはアルキル基、置換アルキ
    ル基、アルケニル基、置換アルケニル基、シクロアルキ
    ル基、置換シクロアルキル基、芳香族基、または置換芳
    香族基を表す。〕で表されるナフチリジン誘導体もしく
    はそのプロドラッグまたはそれらの薬学上許容される塩
    を有効成分として含有する、ＬＤＬ受容体タンパク質の
    発現促進剤。
  2. 【請求項２】 式１で表されるナフチリジン誘導体が式
    ２ 【化４】 〔式中、環Ａは置換基を有していてもよいピリジン環を
    表す。Ｙはアルキル基、置換アルキル基、シクロアルキ
    ル基、置換シクロアルキル基、芳香族基または置換芳香
    族基を表す。Ｒ1は水素原子、アルキル基、置換アルキ
    ル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル
    基、置換アルキニル基、シクロアルキル基、または置換
    シクロアルキル基を表す。Ｒ2は水素原子または低級ア
    ルキル基を表す。Ｒ3は低級アルキル基を表す。Ｚaは、 １）−Ｄ1−Ｑ ［式中、Ｄ1は結合手または不飽和結合を含んでいても
    よい炭素原子数１〜８の２価の炭化水素基を表し、Ｑは
    水酸基、カルボキシル基、ヘテロアリール基、置換ヘテ
    ロアリール基、または式：−ＮＲ4Ｒ5（Ｒ4およびＲ5は
    互いに独立して、水素原子、低級アルコキシ基、低級ア
    ルキル基、置換低級アルキル基、シクロアルキル基また
    はアラルキル基を表すか、またはＲ4およびＲ5が互いに
    結合してそれらが結合する窒素原子とともに、環中にさ
    らに式：−ＮＲ8−（Ｒ8は水素原子、低級アルキル基、
    置換低級アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、ベ
    ンジル基、置換ベンジル基、または低級アルコキシカル
    ボニル基を表す。）で表される基を１個、または酸素原
    子１個を含んでもよい、環を構成する炭素原子数が４か
    ら８個の飽和環状アミノ基を表す。）を表す。但し、Ｑ
    がヘテロアリール基または置換へテロアリール基である
    場合は、Ｄ1は結合手とはならない］または、 ２）−Ｄ2−Ｍ−Ｅ−Ｗ ［式中、Ｄ2は結合手または不飽和結合を含んでいても
    よい炭素原子数１〜８の２価の炭化水素基を表し、Ｍは
    酸素原子、硫黄原子、スルフィニル基もしくはスルホニ
    ル基、または式−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ
    −もしくは−ＮＲ6−（Ｒ6は水素原子もしくは低級アル
    キル基を表す。）で表される基を表し、Ｅは結合手また
    は不飽和結合を含んでいてもよい炭素原子数１〜８の２
    価の炭化水素基を表し、Ｗは水酸基、カルボキシル基、
    ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、または式：
    −ＮＲ4Ｒ5（Ｒ4およびＲ5は前記の意味を表す。）で表
    される基を表す。但し、Ｗが水酸基、カルボキシル基も
    しくは式−ＮＲ4Ｒ5で表される基の時はＥは結合手とは
    ならない］を表す。〕で表される化合物である、請求項
    １記載のＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進剤。
  3. 【請求項３】 ナフチリジン誘導体が下記式Ａ 【化５】 〔式中、ｎ−Ｂｕはｎ−ブチル基を、ｉ−Ｐｒはイソプ
    ロピル基を表す〕で表される化合物である、請求項１ま
    たは２記載のＬＤＬ受容体タンパク質の発現促進剤。
  4. 【請求項４】 ＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ転写後のタンパ
    ク質発現プロセスを制御することによってＬＤＬ受容体
    タンパク質の発現を促進する化合物のスクリーニング方
    法であって、以下の工程を含むスクリーニング方法： (1)ＬＤＬ受容体発現細胞を使用し、(2)ＬＤＬ受容体の
    転写抑制因子の存在下、被検物質の存在下または非存在
    下で当該細胞を培養し、(3)被検物質存在下または非存
    在下で培養したＬＤＬ受容体発現細胞のＬＤＬ受容体タ
    ンパク質発現量を測定し、(4)ＬＤＬ受容体タンパク質
    の発現量を促進する物質を選択する。
  5. 【請求項５】 ＬＤＬ受容体タンパク質の未成熟型と成
    熟型の量を測定し、未成熟型に対する成熟型の比が大き
    い物質を選択する工程をさらに含む請求項４記載のスク
    リーニング方法。
  6. 【請求項６】 ＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ転写後のタンパ
    ク質発現プロセスを制御することによってＬＤＬ受容体
    タンパク質の発現を促進する化合物のスクリーニング方
    法であって、以下の工程を含むスクリーニング方法： (1)ＬＤＬ受容体発現細胞を使用し、(2)ＬＤＬ受容体の
    転写抑制因子の存在下、被検物質の存在下または非存在
    下で当該細胞を培養し、(3)被検物質の存在下または非
    存在下で培養したＬＤＬ受容体発現細胞に、放射性同位
    元素で標識されたアミノ酸を添加し、(4)経時的に一定
    量の細胞を採取し、細胞を可溶化後、細胞タンパク質画
    分を調製し、(5)得られた細胞タンパク質画分中に存在
    するＬＤＬ受容体タンパク質を免疫沈降させ、(6)免疫
    沈降物中のＬＤＬ受容体タンパク質の量を測定し、(7)
    ＬＤＬ受容体タンパク質の発現量を促進する物質を選択
    する。
  7. 【請求項７】 免疫沈降物中の未成熟型ＬＤＬ受容体タ
    ンパク質と成熟型ＬＤＬ受容体タンパク質の量を測定
    し、未成熟型ＬＤＬ受容体タンパク質量に対する成熟型
    ＬＤＬ受容体タンパク質量の比が大きい物質を選択する
    工程をさらに含む請求項６記載のスクリーニング方法。
  8. 【請求項８】 ＬＤＬ受容体の転写抑制因子が２５−ヒ
    ドロキシコレステロールである、請求項４または６記載
    のスクリーニング方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2005039575A1 (ja) * 2003-10-24 2005-05-06 Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. 高脂血症治療剤

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