JP2003284587A

JP2003284587A - 黄色色素の製造方法

Info

Publication number: JP2003284587A
Application number: JP2002097033A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Fukuoka; 聰福岡; Yusuke Ajiki; 雄介安食; Takeshi Ikumori; 健何森; Yasuhiro Kawanami; 康弘川浪
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2002-03-29
Publication date: 2003-10-07
Anticipated expiration: 2022-03-29
Also published as: JP3796540B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒドロキシル基をもつカロチノイド系黄色色
素を、植物以外の供給源を開発することにより労力及び
コストを低減し、安価にかつ多量に生産することを目的
とする。【解決手段】オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）に属する黄色色素生産菌を培養し、培
養物から黄色色素を分離することにより製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、食品添加剤、特に
健康食品用添加剤として有用なヒドロキシル基含有カロ
チノイド系黄色色素の新規な製造方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】近年、長寿の原因としての生体内におけ
る各種物質の機能が明らかにされるとともに、天然の有
用成分を利用したいろいろの健康食品が提案されてい
る。この中の１つとして、カロチノイド系黄色色素類
は、生体に悪影響を与える活性酸素の除去作用や抗ガン
作用を有する物質として注目されているほか、老化防止
剤としての効用も期待されている。

【０００３】他方、カロチノイド系黄色色素の中でヒド
ロキシル基をもつ色素群は、ほうれんそう、パプリカ、
オレンジ、マリーゴールドなどの植物や、卵黄、ヒトの
目の網膜などの動物組織中に存在することが知られてい
るが、ヒトの場合、体内で生産できないため、外部から
の摂取が必要とされる。このため、このものの不足を補
うために、カロチノイド類を添加した食品が市販されて
いる。

【０００４】このヒドロキシル基含有カロチノイド系黄
色色素の１種であるデカプレノキサンチンは、セルロモ
ナス属細菌により生産されること［「ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，）」，第１４１巻，第１２７２〜１２７８ページ
（１９８０）］や、ルテインが緑藻類により生産される
こと（特開平８−８９２７９号公報）は知られている。

【０００５】ところで、健康食品などに添加されるカロ
チノイド系黄色色素類は、一般に野菜、花卉、果実など
の植物原料から有機溶剤により抽出されているが、近
年、環境汚染、衛生面の点で有機溶剤の使用は制限され
る傾向にある上、植物を原料とするには、所要の植物の
栽培、採種、乾燥、抽出、精製など多大の労力とコスト
をかけなければならないため、これに代わるべき供給源
が要望されていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
事情のもとで、ヒドロキシル基をもつカロチノイド系黄
色色素を、植物以外の供給源を開発することにより労力
及びコストを低減し、安価にかつ多量に生産することを
目的としてなされたものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒドロキ
シル基をもつカロチノイド系黄色色素を植物組織以外の
原料を用いて製造する方法について種々研究を重ねた結
果、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）に属する菌が、デカプレノキサンチンを主成分と
する黄色色素を生産することを見出し、この知見に基づ
いて本発明をなすに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、オーレオバクテリウ
ム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する黄色色素
生産菌を培養し、培養物から黄色色素を分離することを
特徴とする黄色色素の製造方法を提供するものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明方法において培養に用いる
微生物は、オーレオバクテリウム属に属し、黄色色素を
生産する能力を有することをもって特徴づけられる菌
株、例えば菌株ＡＡ１であって、これは独立行政法人産
業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ
Ｐ−１８６９８として寄託されている。

【００１０】この菌株ＡＡ１は熊本県天草郡有明町の海
水から分離された文献未載の新菌であるが、本発明方法
においては、この菌株ＡＡ１に限らず、それ以外のオー
レオバクテリウム属に属する黄色色素を生産する能力を
有する菌株や、その変異株、例えば、紫外線や化学薬品
による変異処理によって得られる人工変異株又は自然変
異株なども用いることができる。

【００１１】次に本発明方法で用いる微生物の菌学的性
状を菌株ＡＡ１を例にして説明する。（１）形態コロニーの形態は、偏平で丸く、不透明で黄色である集
落の周辺細胞の伸長は陰性である。細胞の光学顕微鏡観
察に基づく形態は、多形成桿菌で０．４〜０．７μｍの
幅を有し、培養の経過により初期の桿菌から対数増殖の
終末期には短桿菌〜球菌状に形状が変化し、また、運動
性を有していた。グラム染色は陽性で、胞子形成能は認
められなかった。（２）生理学的性質（ａ）炭素源の発酵性グルコースの酸化分解性は陰性で
ある。（ｂ）細胞壁のジアミノ酸はオルニチンである。（ｃ）主要キノン系はＭＫ−１１，ＭＫ−１０，ＭＫ−
１２である。（ｄ）酵素活性カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）活性は陽性である。オ
キシダーゼ（ｏｘｉｄａｓｅ）活性は陰性である。（ｅ）酸素に対する態度は好気的である。

【００１２】以上の菌学的性質から菌株ＡＡ１は文献を
参考に既知菌種を検索したところ、オーレオバクテリウ
ム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の性状と一
致した。

【００１３】本発明方法により黄色色素を製造するに
は、所定の菌株、例えばＦＥＲＭＰ−１８６９８を栄
養培地に接種し、好気的に培養する。この菌株の培養方
法は、原則的には一般微生物の培養方法に従って行われ
るが、通常は液体培養による振とう培養、通気撹拌培養
などの好気的条件下で行うのが好ましい。

【００１４】この際、培養に用いることのできる培地と
しては、オーレオバクテリウム属に属する微生物が利用
できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成
培地、半合成培地、天然培地などいずれも用いることが
できる。培地組成としては、例えば、炭素源として、グ
ルコース、シュークロース、プシコース、糖みつ、デン
プンなどを単独又は組み合わせて使用することができ、
窒素源としては、大豆粉、コーンスティープリカー、肉
エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウムなど
を単独又は組み合わせて使用することができる。また必
要に応じて、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸
カルシウム、リン酸塩、金属塩などの無機塩を加えるこ
とができる。その他、これらの菌株の生育あるいはグリ
セロ糖脂質の生産を促進する有機物、例えば、ビタミン
類、アミノ酸類を加えることができる。

【００１５】この培養においてグリセロ糖脂質の生産量
を増大するには、炭素源としてプシコースなどの緩慢代
謝性の糖類を用いるのが好ましい。また、この際、栄養
源の他、５質量％以下、好ましくは０．５〜３．５質量
％の塩化ナトリウムを添加し、液体培地で培養する場合
は空気を吹き込むか、空気との接触を保つために振とう
するのが好ましい。

【００１６】培養条件としては、菌株が良好に生育して
本発明の黄色色素を生産しうる範囲内で適宜選択すれば
よい。例えば、培地のｐＨは５〜８程度、通常中性付近
とすることが好ましいが、必ずしも調整する必要はな
い。培養温度は、微生物が良好に生育する温度、通常１
０〜４０℃、好ましくは１５〜３５℃に保つのがよい。
培養時間は、１〜１４日間程度でよく、好ましくは２〜
５日間である。もちろん上述した各種の培養条件は、使
用微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更
でき、またそれに応じて上記範囲から最適条件を選択、
調整できる。その際、培養液中の黄色色素の蓄積量が最
大になったときに培養を停止して得た培養液を後続の工
程に使用する。

【００１７】このようにして得た培養液中に蓄積された
黄色色素は、培養後、濾過、遠心分離などの一般的固液
分離手段によって菌体を分離し、分離した菌体から回収
可能である。

【００１８】黄色色素の分離、精製は、これまで知られ
ている種々の方法を選択、組み合わせて行うことができ
る。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、メチルアルコ
ールなどを用いた溶媒抽出や、シリカゲルやアルミナな
どの担体を用いるクロマトグラフィー法を用いることが
できる。これらの担体から目的物質を溶出させる方法
は、担体の種類、性質によって異なるが、一例として、
シリカゲル薄層クロマトグラフィーの場合には、展開及
び溶出溶媒として、クロロホルムとメチルアルコールの
混合溶媒などを用いることができる。さらに展開溶媒と
してジエチルエーテルを用いたシリカゲル薄層クロマト
グラフィーにより、さらに純度を向上させることができ
る。また、これらの方法を単独又は適宜組み合わせて、
場合によっては反復使用することにより、分離、精製す
ることができる。

【００１９】このようにして得られた黄色色素は、公知
の方法に従い、無水酢酸とピリジンを用いてアセチル化
したのち、紫外・可視吸光スペクトル、核磁気共鳴スペ
クトル及び質量スペクトルにより、炭素数５０、ヒドロ
キシル基２個をもつカロチノイド類であることが同定さ
れた。

【００２０】また、このものについて、「ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，）」，第１４１巻，１２７２〜１２７８ページに
記載されている方法に従い、溶媒としてヘキサンを用い
て、紫外・可視吸光スペクトルを測定したところ、図１
に示すように６本の吸収極大が４６７，４３７，４１
４，３２８，３１４及び２６６ｎｍの位置に認められ
た。これは上記の文献に記載されたデカプレノキサンチ
ンの吸収にほぼ一致することから、これはデカプレノキ
サンチンに類似の構造をもつものであると推定される。

【００２１】次に、この黄色色素のアセチル化試料につ
いて同様にスペクトルを測定したところ、吸収極大を示
す波長位置に変化は認められなかった。このことから、
アセチル化反応を受けるヒドロキシル基は、この黄色色
素の色調に変化を生じない位置に結合していることが分
る。

【００２２】また、重水素化クロロホルム溶液に溶解し
た精製黄色色素を核磁気共鳴法により４００ＭＨｚでプ
ロトンのスペクトルを測定したときの結果を図２に示
す。これによると、メチル基のプロトン群、オレフィン
のプロトン群、及びヒドロキシル基を有する炭素原子に
結合したプロトンのピークが認められる。メチル基のプ
ロトンはδ１．９７０，１．９３３，１．６７３，１．
５３０，０．９２９，０．７３８ｐｐｍの６本であり、
上記文献に記載のデカプレノキサンチンのメチル基群の
ケミカルシフト値と一致している。

【００２３】さらに、精製黄色色素及びその色素のアセ
チル化物をメタニトロベンジルアルコールをイオン化の
マトリックスに用いて高速原子衝撃質量スペクトル分析
したときのポジテイブイオン化法による測定結果を図３
に示す。精製黄色色素のスペクトルには質量／荷電比７
０４．５のプリカーサーイオンがアセチル化物には質量
／荷電比７８８．５のプリカーサーイオンピークが認め
られた。また、ヨウ化ナトリウムを添加して同様に測定
したときに、２次精製黄色色素には質量／荷電比７０
４．６の他に７２７．５のプリカーサーイオンピークが
認められたことから、精製黄色色素の分子量は７０４．
５と同定された。アセチル化した黄色色素のプリカーサ
ーイオンは質量／荷電が７８８．５でアセチル化反応に
よりアセチル基２個が導入されていることが分る。

【００２４】以上のようにして得られる黄色色素は以下
に示す物理化学的性質を有する。１．黄色色素の物理化学的性質（１）分子量：７０４．５６（２）分子式：Ｃ₅₀Ｈ₇₂Ｏ₂ （３）図３の高速原子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−Ｍ
Ｓ）よりＭ＋として質量／荷電比はｍ／ｚ７０４．６に
イオンピークを示した。これは分子式により計算される
質量値にほぼ一致した値である。（４）色及び形状：金属光沢を有する暗赤色粉末。（５）溶解性：クロロホルム、エーテル、ヘキサンなど
有機溶媒に溶け、水にはほとんど溶けない。（６）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：シリカゲル薄
層プレート（メルク社製：１．０５６４１）において
０．５１（展開溶媒クロロホルム：メチルアルコール＝
１９：１、容積比）を示した。該色素をアセチル化する
とＲｆ値は０．７０に上昇した。

【００２５】

【実施例】次に実施例により本発明をさらに詳細に説明
する。

【００２６】実施例１寒天［デイフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製、「マリンアガー２
２１６」］５５．１ｇを水１リットルに溶解し、１２１
℃で１５分オートクレーブ滅菌したのち、直径９ｃｍの
シャーレに３０ｍｌを分注し、室温まで放冷することに
より固形培地を調製した。次いで、上記の寒天の表面に
４質量％プシコース溶液２００μｌを塗布した上に、オ
ーレオバクテリウムに属するＦＥＲＭＰ−１８６９８
の菌体を接種し、２０℃の恒温インキュベータ中に静置
し、培養した。７日間培養したのち、菌体を採取し、凍
結乾燥することにより、乾燥菌体１９８ｍｇを得た。

【００２７】次に、この乾燥菌体１９８ｍｇをクロロホ
ルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）１５ｍｌ
を用いて３回抽出し、溶媒をロータリーエバポレーター
を用いて濃縮乾固することにより粗黄色色素２８．７ｍ
ｇを得た。次いでこの粗黄色色素をシリカゲル薄層クロ
マトグラフィー（メルク社製：１．０５６４１）に担持
させたのち、クロロホルム／メチルアルコール（体積比
１９／１）で展開した。展開終了後、溶媒を蒸発させ、
Ｒｆ値０．５１の黄色バンド部分を分取し、クロロホル
ム／メチルアルコール混液（体積比４／１）で溶出し、
溶出液をロータリーエバポレーターで乾固することによ
り黄色色素０．３ｍｇを得た。

【００２８】実施例２トリプトン（デイフコ社製）１．０ｇ、酵母エキス（デ
イフコ社製）０．５ｇ、塩化ナトリウム１．０ｇ及び純
水１００ｍｌを混合し、液体栄養培地（ｐＨ６．５）を
調製した次に、この液体栄養培地１００ｍｌを５００ｍ
ｌ体積の三角フラスコに移し、オートクレーブ殺菌した
のち、実施例１と同じ菌体を接取し、ロータリーシェー
カーを用い、２０℃、振とう速度１００ｒｐｍの条件
下、２日間振とう培養し、種母培養液を調製した。別
に、５００ｍｌ体積三角フラスコ５個を用意し、それぞ
れに、前記の組成の液体栄養培地１００ｍｌずつを分注
し、殺菌処理したのち、前記の種母培養液を１ｍｌずつ
接種し、ロータリーシェーカー（１００ｒｐｍ）を用い
て２０℃で４日間、振とう培養した。

【００２９】培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を
集め少量の純水で洗浄後、凍結乾燥することにより、フ
ラスコ１本当り平均１４１ｍｇの乾燥菌体を得た。次い
で、この乾燥菌体１４１ｍｇをクロロホルム／メチルア
ルコール混液（体積比２／１）１０ｍｌを用いて３回抽
出し溶媒をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固さ
せ１１．６ｍｇの粗黄色色素を得た。粗黄色色素をシリ
カゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製：１．０５
６４１）にかけ、クロロホルム／メチルアルコール（１
９／１）で展開した。展開終了後溶媒を乾燥させ、Ｒｆ
値０．５１の黄色バンド部分を分取し、クロロホルム／
メチルアルコール混液（４／１）で溶出後、ロータリー
エバポレーターで乾固し黄色色素０．１ｍｇを得た。

【００３０】実施例３実施例２で用いた組成の液体栄養培地１００ｍｌずつを
三角フラスコ４個に分取し、それぞれにプシコース、グ
ルコース、ガラクトース又はシュークロース０．５ｇず
つ添加したのち殺菌処理した。次いで、これらに実施例
２で調製した種母培養液１ｍｌずつを接種し、ロータリ
ーシェーカーを用いて、２０℃、振とう速度１００ｒｐ
ｍで４日間振とう培養した。

【００３１】培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を
集め少量の純水で洗浄後、凍結乾燥し、乾燥菌体を得
た。この乾燥菌体をクロロホルム／メチルアルコール混
液（体積比２／１）を用いて３回抽出し、この抽出液を
ロータリーエバポレーターにより濃縮乾固させ、粗黄色
色素を得た。次いで、粗黄色色素をシリカゲル薄層クロ
マトグラフィー（メルク社製、１．０５６４１）にか
け、クロロホルム／メチルアルコール（体積比１９／
１）で展開した。展開終了後、乾燥させ、Ｒｆ値０．５
１の黄色バンド部分を分取し、クロロホルム／メチルア
ルコール混液（体積比４／１）で溶出し、ロータリーエ
バポレーターを用いて濃縮乾固することにより精製黄色
色素を得た。各種の糖を添加したときの乾燥菌体量、粗
黄色色素、黄色色素の量を表１に示す。

【００３２】

【表１】

【００３３】実施例４プシコース０．５質量％、酵母エキス（デイフコ社製）
０．５質量％、トリプトン（デイフコ社製）１．０質量
％を海水に添加して調製した栄養培地（ｐＨ６．３）５
リットルを１０リットル体積のジャーファーメンターに
入れ殺菌した。これに実施例２で調製したオーレオバク
テリウムＦＥＲＭＰ−１８６９８の種母培養液を接種
し、２０℃で撹拌速度３００ｒｐｍ、通気量毎分２リッ
トルで３日間培養した。培養終了後に培養液３．４８リ
ットルを遠心分離して菌体を集め凍結乾燥し、乾燥菌体
６．１ｇを得た。

【００３４】乾燥菌体６．１ｇをクロロホルム／メチル
アルコール混液（体積比２／１）１２０ｍｌを用いて３
回抽出し、溶媒をロータリーエバポレーターにより濃縮
乾固させ２５９ｍｇの粗黄色色素を得た。粗黄色色素を
シリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製：Ａｒ
ｔ．１３７９２，２０×２０ｃｍ、１ｍｍ厚）にかけ、
クロロホルム／メチルアルコール（体積比１９／１）で
展開した。展開終了後、乾燥させ、Ｒｆ値０．５１〜
０．５４の黄色バンド部分を分取し、クロロホルム／メ
チルアルコール混液（体積比４／１）で溶出し、溶出液
をロータリーエバポレーターで乾固することにより黄色
色素３．８ｍｇを得た。

【００３５】黄色色素３．８ｍｇをジエチルエーテルに
分散し、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社
製：１．０５６４１）にかけ、ジエチルエーテルで展開
した。展開終了後、乾燥させ、Ｒｆ値０．５４の黄色バ
ンドを分取し、ジエチルエーテルで溶出した。ロータリ
ーエバポレーターで乾固し、精製黄色色素２．５ｍｇを
得た。

【００３６】

【発明の効果】黄色色素の製造においては従来、植物体
などより抽出して得ていたために、計画的に大量生産し
ようとしても設備なども多く要する上、生産される黄色
色素製剤の量も植物の生育状況に影響されるという欠点
があった。また、植物体における黄色色素の存在は限ら
れた部位であり、含有率が低いために抽出分離に多量の
有機溶剤を必要とし、装置も大規模なものが必要であっ
た。

【００３７】これに対し、本発明方法は、細菌を原料と
して用いるため、任意かつ計画的な黄色色素の生産を可
能にするものである。また、細菌はスケールを変えて培
養することが可能であり、培養の条件は任意に制御する
ことが可能であるという利点がある。また、培養槽を大
きくすることにより大量製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】精製黄色色素の紫−可視領域の光吸収スペク
トル。

【図２】精製黄色色素の４００ＭＨｚプロトンＮＭＲ
スペクトル。

【図３】ポジテイブイオン化法による高速原子衝撃質
量スペクトル。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者何森健香川県木田郡三木町池戸2393番香川大学農学部内 (72)発明者川浪康弘香川県木田郡三木町池戸2393番香川大学農学部内Ｆターム(参考） 4B018 MA01 MC01 MD85 ME06 ME08 ME10 MF01 MF13 4B064 AH01 BA08 BG02 BH04 BH08 CA02 CC03 CD09 DA10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）に属する黄色色素生産菌を培養し、培
養物から黄色色素を分離することを特徴とする黄色色素
の製造方法。
【請求項２】プシコースを添加した固体培地又は液体
培地を用いて培養する請求項１記載の黄色色素の製造方
法。
【請求項３】黄色色素がデカプレノキサンチンを主要
成分とするヒドロキシル基含有カロチノイド系黄色色素
である請求項１又は２記載の黄色色素の製造方法。
【請求項４】オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）に属する黄色色素生産菌が菌株ＦＥＲ
ＭＰ−１８６９８である請求項１、２又は３記載の黄
色色素の製造方法。