JP2003284571A - 新規アルカリプロテアーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 可溶性タンパク質のみならず、ケラチンなど
の不溶性タンパク質に対しても強力な活性を有する新規
アルカリプロテアーゼを提供する。 【構成】 下記の理化学的性質を有するアルカリプロテ
アーゼ。 (a) 作用および基質特異性：タンパク質およびペプチ
ドに作用し、そのペプチド結合をエンド型の機作により
切断して、低分子量のオリゴペプチドおよびアミノ酸を
生成する。また、ケラチン等の不溶性タンパク質に対し
ても強力な活性を示す。 (b) 安定pH：30℃、24時間の処理条件において、pH 1.5
〜12.0で安定である。 (c)最適pHは、カゼインを基質とした場合は11.0〜11.5
であり、ケラチンを基質とした場合12.0以上である。 (d)比活性：カゼインを基質とした場合は約1,100（PU/m
gタンハ゜ク質）であり、ケラチンを基質とした場合約3,300
（KU/mgタンハ゜ク質）である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ケラチン分解能の
高い新規なアルカリプロテアーゼおよびその製造法なら
びに該アルカリプロテアーゼ産生能を有する新規な好ア
ルカリ性放線菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルカリプロテアーゼはタンパク質のペ
プチド結合をアルカリ領域において特異的に加水分解す
る酵素であり、食品、繊維、皮革、洗剤等の工業におい
て広く利用されている。このようなアルカリプロテアー
ゼは糸状菌、酵母、細菌等の微生物により広く生産され
ることが知られており、またいわゆる好アルカリ性微生
物と呼ばれる一群の微生物によっても生産される。

【０００３】前述された好アルカリ性微生物から生産さ
れるアルカリプロテアーゼとしては、いわゆる好アルカ
リ性バチルス属菌から得られる酵素（例えば、特公平7-
63366、特公平7-63367、特公平7-63368等）が多数既に
知られており、主に洗剤用として開発が進められてい
る。また、同様な好アルカリ性バチルス属菌から得られ
る耐熱性酵素として、AH-101株の生産するアルカリプロ
テアーゼ（特開平2-255087）およびB18-1株の生産する
アルカリプロテアーゼ（特公平7-63368）等が知られて
いる。しかしながら、同じ好アルカリ性微生物である好
アルカリ性放線菌の産生するプロテアーゼについてはあ
まり知られておらず、わずかにストレプトマイセス属由
来の酵素（Agr. Biol. Chem., 38, (1), 37-44, 197
4）、サーモアクチノマイセス属HS682株の生産するアル
カリプロテアーゼ（Biosci.Biotech. Biochem.,56,
(2), 246-250, 1992）、およびノカルディオプシスダッ
ソンビレイOPC-210の生産するアルカリプロテアーゼ
（J. Appl. Bacteriol., 69, 520-529, 1990）等が報告
されているにすぎない。

【０００４】一方、洗剤用にプロテアーゼを応用する場
合、ケラチン等の不溶性タンパク質に対しても良好に作
用する酵素が望ましいことが指摘されている（皆川基：
繊消誌、26, 322, 1985）。また、浴槽、風呂釜、浴床
排水溝、循環浴槽の配管、便器あるいは洗面化粧台ドレ
インの洗浄剤にプロテアーゼを応用する場合では、30℃
前後の中温で充分な活性を保持し、かつ毛髪、垢あるい
は汚れなどのケラチンを代表とする不溶性タンパク質を
強力に分解する能力が要求される。加えて、現状の洗剤
および洗浄剤は、配合組成の関係からそのpHがアルカリ
領域にあることから、これらに配合する酵素はアルカリ
プロテアーゼが最適である。

【０００５】さらに、ケラチンを主要タンパク質とする
毛髪、羽毛等は化学合成が不可能なアミノ酸であるシス
テインの製造原料として重要である。しかし、現状では
過激な反応条件のため著量のシステインが分解されてし
まい収量が極めて悪いため、プロテアーゼ処理等の温和
な加水分解方法が望まれていた。さらに、発展途上国で
未利用資源として大量に廃棄される牛、水牛の角および
羽毛等は有用なアミノ酸で構成されており、穏和な加水
分解でペプチド液、アミノ酸液が製造できれば、輸液等
の医薬品あるいは栄養補助剤として、これらの国々にと
って極めて有用である。これらの場合においても、ケラ
チンが高アルカリ領域において膨潤し酵素の作用を受け
やすくなるという性質から、加水分解剤としての酵素は
アルカリプロテアーゼが最適である。

【０００６】これらの用途以外にも、台所洗剤や食器洗
浄器用洗剤および住宅洗剤等の洗剤、毛皮（原皮）の脱
毛、絹や羊毛および皮革等の精錬（風合いの向上）、脱
毛クリームや入浴剤およびコンタクトレンズ洗浄剤等の
医薬部外品、さらに肉質軟化剤等の食品加工や医薬、試
薬等の用途に、不溶性タンパク質の分解力に優れたアル
カリプロテアーゼは極めて有用である。

【０００７】このような用途に対して、特にケラチン等
の不溶性タンパク質の分解力において従来のアルカリプ
ロテアーゼは不充分であり、さらに強力なケラチン分解
力を有する新規なアルカリプロテアーゼの開発が望まれ
ていた。

【０００８】このような観点から、本発明者らは既に新
規なアルカリプロテアーゼを発見し、特許を出願してい
る（特開２０００−０６０５４７号公報）。このアルカ
リプロテアーゼは分子量が小さく、優れたタンパク質分
解活性を有する。しかし、本酵素の生産性が培養ごとで
大きくばらつき、かつ酵素がpH 10.0以上では急激に不
安定となるという問題点があった。したがって、安定的
に酵素の生産が可能であり、かつ高アルカリ領域でも安
定なアルカリプロテアーゼの開発が望まれている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、優れたケラ
チン分解能と高アルカリ領域での安定性を有する新規な
アルカリプロテアーゼを提供することを目的としてい
る。また本発明は、上記アルカリプロテアーゼを生産す
る新規微生物、およびその微生物を利用した上記アルカ
リプロテアーゼの安定した製造法を提供することを目的
としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記のような状況におい
て、発明者らは強力なケラチン分解能を有するアルカリ
プロテアーゼを生産する微生物を主に好アルカリ性放線
菌を中心として検索した結果、好アルカリ性のノカルデ
ィオプシス属に属する放線菌１株が、好気的培養により
目的とする新規アルカリプロテアーゼを効率良く、かつ
安定的に生産することを見い出し、本発明を完成するに
至った。

【００１１】すなわち、本発明は下記の理化学的性質を
有する新規アルカリプロテアーゼを提供する。

【００１２】(a) 作用および基質特異性：タンパク質お
よびペプチドに作用し、そのペプチド結合をエンド型の
機作により切断して、低分子量のオリゴペプチドおよび
アミノ酸を生成する。また、ケラチン等の不溶性タンパ
ク質に対しても強力な活性を示す。 (b) 安定pH：30℃、24時間の処理条件において、pH1.5
〜12.0で安定である。 (c) 分子量：SDS電気泳動法では約20,000、アミノ酸配
列からの平均分子量は19,150である。 (d) 等電点：10.0以上（等電点電気泳動法）である。 (e) 比活性：カゼインを基質とした場合は約1,100（PU/
mgタンハ゜ク質）であり、ケラチンを基質とした場合約3,300
（KU/mgタンハ゜ク質）である。

【００１３】また、本発明による上記新規アルカリプロ
テアーゼの製造法は、好アルカリ性ノカルディオプシス
属に属し、上記アルカリプロテアーゼ産生能を有する微
生物を培養する工程と、該工程で得られる培養物より該
新規アルカリプロテアーゼを分離する工程を含んでなる
もの、である。さらにまた、本発明による上記新規アル
カリプロテアーゼ産生能を有する新規菌株は、ノカルデ
ィオプシス エスピー TOA-1株（FERM P-18676）であ
る。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明で提供するアルカリプロテ
アーゼは、上記(a)〜(e)の性質に加えて、下記の理化学
的性質を有する酵素である。

【００１５】(f) 最適pH：最適pHはカゼインを基質とし
た場合は11.0〜11.5であり、ケラチンを基質とした場合
12.0以上である。 (g) 最適温度：最適作用温度はカゼインを基質とした場
合は70〜75℃であり、ケラチンを基質とした場合65〜70
℃である。 (h) 安定温度：pH7.0、10分間の処理条件において、カ
ルシウムの添加、無添加にかかわらず60℃まで安定であ
る。 (i) 阻害： EDTA（エチレンシ゛アミン四酢酸）で活性は阻害され
ないが、PMSF（フェニルメタンスルフォニルフルオライト゛）、SSI（ストレフ゜トミ
セス ス゛フ゛チリシン インヒヒ゛ター）では阻害される。

【００１６】本発明によるアルカリプロテアーゼは、カ
ゼイン等の可溶性タンパク質だけでなく、従来のプロテ
アーゼでは分解されにくかったケラチン等の不溶性タン
パク質をも強力に加水分解する。したがって、衣料用洗
剤や柔軟剤および各種洗剤に洗浄効果を高める目的で配
合されたり、浴槽、風呂釜、浴室排水溝、循環浴槽の配
管、便器、洗面化粧台ドレインなどの閉塞除去剤に添加
されれば、極めて効果的である。さらに、ケラチンを主
要タンパク質とする毛髪、羽毛、牛角等からのペプチド
およびシステイン等のアミノ酸製造にも応用が可能であ
る。また、毛皮（原皮）の脱毛、絹や羊毛および皮革等
の精錬（風合いの向上）等をより穏和な条件で行うこと
が可能となる。さらに、脱毛クリーム、入浴剤等の化成
品や食肉軟化剤あるいは医薬、試薬等、極めて広範囲の
工業分野で利用され得る。また、本発明による菌株は、
上記アルカリプロテアーゼを効率良く菌体外に分泌する
ので、簡便な工程で高効率にその生産を行うことができ
る点で有利である。

【００１７】

【発明の具体的説明】本発明による新規アルカリプロテ
アーゼは、微生物を用いて生産することができる。特に
好ましくは、本発明によるアルカリプロテアーゼは、好
アルカリ性ノカルディオプシス属、特にノカルディオプ
シス エスピー（Nocardiopsis sp.）TOA-1株により生
産される。この菌株は発明者らにより、神奈川県茅ヶ崎
市の一般家屋より分離されたものである。この菌株は好
アルカリ性放線菌であり、下記に示す菌学的性質を有す
る。なお、本菌株は好アルカリ性微生物であり、通常の
中性培地では生育しないか、あるいは生育が極めて不良
であるため、下記の菌学的性質の検討に際しては1.0％
炭酸ナトリウム添加のアルカリ性培地を用いた。

【００１８】形態学性質 1)胞子形成菌糸の分岐法および形態：単純分枝・直状 2)胞子の形成法 ：気菌糸が分断して
連鎖する 3)胞子の形態および大きさ ：たわら型で平滑、
0.5 μm×1.0 μm程度 4)鞭毛の有無 ：無 5)胞子のうの有無 ：無

【００１９】生理的性質 1)生育温度範囲 / pH ：15〜40 ℃ / pH
7.5〜13 2)ゼラチンの液化 ：する（3日で液化
する） 3)スターチの加水分解 ：加水分解する 4)脱脂牛乳の凝固およびペプトン化：凝固しない：4日
でヘ゜フ゜トン化する 5)メラニン様色素の生成 ：生成しない 6)各炭素源の資化性（＋、資化する；−、資化しない） a)L-アラビノース ：＋ b)D-キシロース ：＋ c)D-グルコース ：＋ d)D-フラクトース ：＋ e)シュクロース ：＋ f)イノシトール ：＋ g)L-ラムノース ：＋ h)ラフィノース ：＋ i)D-マンニット ：＋ 7)各培地における生育状況（生育状況、集落表面の色、
集落裏面の色、拡散色素） a)シュクロース硝酸塩寒天培地 ：良好、白色、無
色、薄肌色〜ピンク色 b)ク゛ルコース・アスハ゜ラキ゛ン寒天培地 ：良好、白色、無
色、無し c)ク゛リセリン・アスハ゜ラキ゛ン寒天培地 ：良好、白色、無
色、無し d)スターチ・無機塩寒天培地 ：良好、白色、無
色、薄茶色 e)チロシン寒天培地 ：良好、白色、無
色、薄茶色、メラニン無し f)栄養寒天培地 ：良好、白色、無
色、無 g)イースト・麦芽寒天培地 ：良好、白色、無
色、無 h)オートミール寒天培地 ：良好、白色、無
色、薄肌色〜ピンク色

【００２０】本菌株TOA-1株は上記の菌学的性質、特に
形態学的に放線菌の特徴を有する。そこで、「放線菌の
分類と同定」（日本放線菌学会編、2001）に従って属の
検索を行った。まず、本菌株は細胞壁にmeso-ジアミノ
ピメリン酸のみを含有することから、本菌株はストレプ
トマイセスおよびキネオスポリア以外の属に属する菌種
と考えられる。また、本菌株は基生菌糸の分断とジグザ
グ状の菌糸は少ないものの、気菌糸の分断は旺盛であ
り、nocardio-formの放線菌と考えられた。

【００２１】そこで、成書（同上）に従い本菌株の16Sr
DNAを調製して放線菌各属との相同性を検索した。その
結果、本菌株はノカルディオプシス属の各菌種と94.7〜
97.6％の相同性が認められたが、完全に一致する種は認
められなかった。最も相同性の高いものは、ノカルディ
オプシス アルバであった。また、本菌株同様に好アル
カリ性であるノカルディオプシス ダッソンビレイとは
96.7％と、ノカルディオプシス属の中での相同性はそれ
ほど高いものではなかった。

【００２２】すなわち、本菌株TOA-1は好アルカリ性で
あること等を考慮してノカルディオプシス アルバに近
縁の一菌種と判断し、ノカルディオプシス エスピー
TOA-1（Nocardiopsis sp. TOA-1）と命名した。なお、
本菌株は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄
託センターに受託番号FERM P-18676のもと寄託されてい
る。

【００２３】培養条件 上記菌株は好アルカリ性放線菌であるため、その培養は
アルカリ領域で行う必要がある。培地をアルカリ性にす
るための方法としては格別である必要はなく、通常の培
地中に例えば炭酸ナトリウムあるいは炭酸水素ナトリウ
ムを添加するだけで良い。炭素源としてはグルコース、
可溶性デンプン、セルロース等の単糖、多糖などを用い
ることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウ
ム塩などの無機物をはじめ、尿素、ペプトン、乾燥酵
母、酵母エキス、スキムミルク、ダイズ粉、コーンスチ
ープリカー、カゼイン、肉エキス、アミノ酸などが用い
られる。これらの炭素源や窒素源の他に各種無機塩、例
えばマグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン
酸塩などを必要に応じて添加しても良い。培地に加える
アルカリ源としては、0.5〜2.0％程度の炭酸ナトリウ
ム、炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩あるいは水酸化ナト
リウム、アンモニアなどが使用でき、培地のpHは8.0〜1
1.0程度が望ましい。培養は、このような培地中で培養
温度20〜40℃、好ましくは30〜35℃で2日〜7日間好気的
に撹袢または振とうしながら行う。本発明による新規な
アルカリプロテアーゼは、上記のような培養条件のもと
で、主として培養液中に分泌され、蓄積される。

【００２４】酵素の採取 上記培養液から本発明による酵素を採取、精製するため
には、既知の精製法を単独もしくは併用して利用するこ
とができる。本酵素は主として菌体外（培養液中）に分
泌されるため、例えば濾過あるいは遠心分離で菌体を除
去することにより容易に粗酵素液を得ることができる。
この粗酵素は、さらに既知の精製法、例えば硫安などに
よる塩析；メタノール、エタノール、アセトンなどの有
機溶媒による沈殿法；ケラチン等による吸着法；限外濾
過；ゲル濾過クロマトグラフィー；イオン交換クロマト
グラフィー；疎水クロマトグラフィー、その他の各種ク
ロマトグラフィーを、単独もしくは併用して、精製する
ことができる。

【００２５】好ましい精製法を示せば以下の通りであ
る。まず、培養濾液に80%飽和硫安を添加して塩析を行
い、得られた沈殿を緩衝液に溶解する。次いでCM-Toyop
earl 650M（東ソー社製）、DEAE-Toyopearl 650M（同社
製）によるイオン交換クロマトグラフィーを行うことに
より、SDS電気泳動的に均一な精製酵素を得ることがで
きる。

【００２６】酵素の性質 本発明によるアルカリプロテアーゼの性質は以下に示さ
れる通りである。なお、以下において活性測定法とは次
の方法をいうものとする。

【００２７】プロテアーゼ活性測定法 カゼイン0.6%を含む50mMグリシン/NaCl/NaOH緩衝液（pH
11.0）1.9 mlを0.1mlの酵素液と混合し、30℃で10分間
反応させた後、2mlの0.11Mトリクロロ酢酸溶液を加えて
30℃で30分間静置した後、アドバンテック社製濾紙N0.5
Cで濾過する。次いで、この濾液の0.5mlを2.5mlの0.5M
炭酸ナトリウム溶液に加え、さらに3倍希釈したフェノ
ール試薬を0.5ml添加して撹袢後、さらに室温にて30分
間放置し、660 nmの吸光度を測定する。上記の測定条件
下で1分間に1μｇのチロシンに相当する吸光度を増加さ
せる酵素量を、プロテアーゼ活性1単位（1PU）と定義す
る。

【００２８】ケラチン分解活性測定法 60mｇのケラチンパウダー（東京化成）に2.9mlの50mMグ
リシン/NaCl/NaOH緩衝液（pH12.0）を加え、さらに0.1m
lの酵素液を添加して30℃で1時間振とう（120rpm）させ
て反応させる。次いで、0.11Mトリクロロ酢酸2.5mlを加
えて反応を停止させ、30℃で30分静置の後アドバンテッ
ク社製濾紙NO.5Cで濾過する。このろ液の0.5mlに0.5M炭
酸ナトリウム溶液2.5mlを加え、さらに3倍希釈したフェ
ノール試薬を0.5ml添加撹拌後、さらに室温にて30分間
放置し、660nmの吸光度を測定する。上記の測定条件下
で10分間に1μｇのチロシンに相当する吸光度を増加さ
せる酵素量を、ケラチン分解活性1単位（1KU）と定義す
る。

【００２９】（１）作用および基質特異性 タンパク質およびペプチドに作用し、そのペプチド結合
をエンド型の機作により切断して、低分子量のオリゴペ
プチドおよびアミノ酸を生成する。また、ケラチン等の
不溶性タンパク質に対しても強力な活性を示す。

【００３０】（２）最適pHおよび安定pH 上記の活性測定法にもとづき、本酵素に及ぼすpHの影響
を調べた。なお、緩衝液としてHCl/KCl(pH1.0-1.5)、グ
リシン/NaCl/HCl(pH2.0-3.0)、酢酸(pH4.0-5.0)、リン
酸(pH6.0-7.0)、トリス塩酸(pH7.0-9.0)、グリシン/NaC
l/NaOH(pH9.0-12.0)、KCl/NaOH(pH12.0-13.0)を使用し
た。第１図に活性の最大値を100とした場合の各pHにお
ける相対活性を示した。第１図により、本酵素の最適pH
は30℃においてカゼインを基質とした場合は11.0〜11.5
であり、ケラチンを基質とした場合は12.0以上であるこ
とが分かる。同様に本酵素のpH安定性について第２図に
示した。本酵素を各pHの緩衝液中に30℃で24時間保持し
た後、その残存プロテアーゼ活性を未処理の酵素活性を
100とした相対活性として示した。第２図から、本酵素
は上記処理条件下においてpH1.5〜12.0までの極めて広
範囲のpH域で安定であることが分かる。

【００３１】（３）最適温度および安定温度 上記活性測定法に準じて、本酵素に及ぼす温度の影響を
調べた。第３図に最大活性を100とした場合の各温度に
おける相対活性を示した。第３図から、本酵素の最適温
度はカゼインを基質とした場合は70〜75℃であり、ケラ
チンを基質とした場合は65〜70℃であることが分かる。
また、本酵素を100 mMトリス塩酸緩衝液（pH7.0)に添加
し、40〜80℃の範囲の各条件下で10分間保持した後、そ
の残存プロテアーゼ活性を測定した。その結果を第４図
に示した。第４図により、本酵素は60℃まで安定である
ことがわかる。なお、本酵素の温度安定性に関しては、
カルシウム添加（10mM）の効果は認められなかった。

【００３２】（４）分子量 本酵素の分子量をSDS電気泳動法により測定したとこ
ろ、分子量は約20,000であった。また、後述する配列
表、配列番号2記載のアミノ酸配列から算出した平均分
子量は19,150であった。

【００３３】（５）等電点 本酵素の等電点を等電点電気泳動法により測定したとこ
ろ、等電点は10.0以上であった。

【００３４】（６）比活性 本酵素の比活性を活性測定法に準じて測定した。なお、
タンパク質濃度は酵素を塩酸により加水分解し、生成し
たアミノ酸をニンヒドリン法で定量することにより算出
した。酵素は電気泳動的に均一な精製標品を使用した。
その結果、本酵素の比活性はカゼインを基質とした場合
は約1,100(PU/mgタンハ゜ク質)であり、ケラチンを基質とし
た場合は約3,300(KU/mgタンハ゜ク質)であった。

【００３５】（７）阻害 一般的な酵素阻害剤であるPMSF(フェニルメタンスルフオニルフルオライト゛)
、EDTA(エチレンシ゛アミン四酢酸) 、およびSSI（ストレフ゜トミセス ス゛
フ゛チリシン インヒヒ゛ター）について、これらが本酵素の活性に及
ぼす影響を調べた。各阻害剤を所定濃度となるように50
mMトリス塩酸緩衝液(pH9.0)に溶解し、本酵素を添加後3
0℃で30分間処理を行った。次いで、処理溶液より一定
量を分取し活性測定法に準じてその残存活性を測定し
た。その結果、本酵素はPMSFおよびSSIにより阻害さ
れ、EDTAによる阻害を受けなかった。このことから、本
アルカリプロテアーゼはセリンプロテアーゼであること
が判明した。

【００３６】（８）アミノ末端配列 本酵素のアミノ末端配列を気相プロテインシークエンサ
ー（島津製作所製、PPSQ-21）を用いて決定した。本酵
素のアミノ末端から25番目までの配列を下記に示した。 Ala-Asp-Ile-Ile-Gly-Gly-Leu-Ala-Tyr-Thr-Met-Gly-Gl
y-Arg-Cys-Ser-Val-Gly-Phe-Ala-Ala-Thr-Asn-Ala-Ser

【００３７】（９）塩基配列およびアミノ酸配列 成書（例えば、J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniat
is: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd. e
d. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989など）
および使用した機器、試薬キット等のプロトコルに従
い、本酵素の遺伝子およびアミノ酸の配列を決定した。
まず、プライマーを設計する目的で本酵素の内部配列を
決定した。精製酵素を尿素処理後リシルエンドペプチダ
ーゼ（和光純薬）で分解し、得られたフラグメントを気
相プロテインシークエンサーでアミノ酸配列を決定し
た。ここで得られた適当な内部配列およびアミノ末端配
列より、2種類のオリゴヌクレオチドプライマーをホス
ホアミダイト法により合成した。このプライマーにより
PCR（Biometra社製、T-Gradient Thermoblock 050-80
1）で遺伝子の増幅を行った。その結果、0.5kbp前後に
特異的な増幅断片を認めた。この断片をプローブとして
本菌株TOA-1のゲノムライブラリーより、本酵素をコー
ドする完全長の遺伝子をスクリーニングした。得られた
クローンの塩基配列をジデオキシ法（F. Sanger et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467,1977）を
原理とするDNAシークエンサー（LICOR社製、LICOR-400
0）により決定した。その塩基配列（564bp）を配列表、
配列番号1に示した。また、塩基配列をもとにアミノ酸
配列（188アミノ酸）を決定し、そのアミノ酸配列を配
列表、配列番号2に示した。

【００３８】

【実施例】次に本発明を以下の実施例により更に詳細に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００３９】実施例１ 粗酵素粉末の調製 ノカルディオプシス エスピー TOA-1株の前培養液50m
l（30℃、3日間振とう培養）を、スキムミルク0.5％、
酵母エキス 0.1％、および別殺菌して添加した炭酸ナト
リウム 1.0％を含有する培地（pH10.5）4000mlを入れた
小型ジャーファーメンターに植菌し、30℃で3日間、通
気量1 v/v/min、回転数200rpmで培養を行った。培養終
了後、培養液を8000 rpmで10分間遠心分離して菌体を除
去した。これにより、30PU/mlの粗酵素液約3,800mlを得
た。

【００４０】実施例２ 精製酵素の調製 実施例１と同一の培地4000mlを入れた小型ジャーファー
メンターに、ノカルディオプシス エスピー TOA-1株
の前培養液50mlを植菌した。これを実施例１と同様に培
養した後、遠心分離により培養上清3,790mlを得た。こ
の上清液のpH11.0におけるプロテアーゼ活性は29PU/ml
であった。次いで、この上清液に硫安粉末を80％飽和に
なるまで加え、１昼夜5℃で暗所に静置後8000rpmで遠心
分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿を10mMリン酸緩
衝液（pH7.0）に溶解し、セルロースチューブを用いて
同緩衝液に対し透析を行った。透析後、その透析内液を
10mMMOPS緩衝液（pH7.5）で平衡化したCM-Toyopearl 65
0Mカラムに通じて酵素を吸着させ、0〜0.5M のNaCl濃度
勾配で溶出させた。活性画分を透析後、10mMトリス塩酸
緩衝液（pH9.0）で平衡化したDEAE-Toyopearl 650Mカラ
ムに通じて活性画分を通過させ、不純タンパク質を吸着
させた。上記一連の精製により、1940PU/mlの精製アル
カリプロテアーゼ（比活性：1,100PU/mg）が17ml得ら
れ、酵素活性の回収率は30％であった。本画分はSDS電
気泳動的に単一バンドを示し、酵素タンパク質として均
一であることが確認された。

【００４１】実施例３ 酵素の生産性 実施例１と同一の培地を用いて、フラスコを用いた振と
う培養および小型ジャーファメンターによる培養を行
い、培養バッチごとの酵素の生産性を比較した。まず、
500ml容肩付きフラスコに培地100mlを入れ、寒天培地か
らTOA-1株の胞子を1白金耳接種し、30℃、130rpmで４日
間振とう培養を行った。この培養を10連行い、フラスコ
内のそれぞれの培養液につきプロテアーゼ活性を測定し
た。また、別に実施例１と全く同様の小型ジャーファメ
ンターを用いた培養を5連行い、それぞれのバッチごと
のプロテアーゼ活性を測定した。その結果、フラスコ培
養では38〜41PU/ml、小型ジャーファメンター培養では2
8〜33PU/mlとなり、培養バッチによる活性のばらつきは
ほとんどなかった。このことから、本酵素の生産性は安
定していることが判明した。

【００４２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOTO Ltd. <120> Novel Alkaline Protease and Method for Preparing the Same <130> K1020658 <160> 1 <210> 1 <211> 564 <212> DNA <213> Nocardiopsis sp. TOA-1 <400> 1 gcc gac atc atc ggt ggc ctc gcc tac acc atg ggc gga cgc 42 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg 1 5 10 tgc tcg gtc ggc ttc gcg gcc acc aac gcc tcc ggc cag ccc 84 Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro 15 20 25 ggc ttc gtc acc gcc ggc cac tgc ggc agc gtg ggg acc cag 126 Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Ser Val Gly Thr Gln 30 35 40 gtc agc atc ggc aac ggc agg ggc gtc ttc gag cgc tcc gtc 168 Val Ser Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser Val 45 50 55 ttc ccg ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cgg ggc acg tcc aac 210 Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn 60 65 70 ttc acc ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac aac agc ggc ggc 252 Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly 75 80 tac gcc acc gtc tcg ggc tcc agc acg gcg ccc atc ggt tcg 294 Tyr Ala Thr Val Ser Gly Ser Ser Thr Ala Pro Ile Gly Ser 85 90 95 cag gtc tgc cgc tcc ggc tcc acc acc ggc tgg tac tgc ggc 336 Gln Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp Tyr Cys Gly 100 105 110 acc att cag gcc cgc aac cag acg gtg agc tac ccg cag ggc 378 Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Ser Tyr Pro Gln Gly 115 120 125 acc gtc cac agc ctg acc cgg acc tcc gtg tgc gcc gag ccc 420 Thr Val His Ser Leu Thr Arg Thr Ser Val Cys Ala Glu Pro 130 135 140 ggc gac tcc gcg ggc tcg ttc atc tcc gga acc cag gcc cag 462 Gly Asp Ser Ala Gly Ser Phe Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln 145 150 ggc gtg acc tcc ggc ggc tcc ggc aac tgc cgc acc ggt ggc 504 Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly 155 160 165 acg acc ttc tac cag gag gtc aac ccc atg ctc aac tcc tgg 546 Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Asn Ser Trp 170 175 180 aac ctg cgt ctg cgc acc 564 Asn Leu Arg Leu Arg Thr 185 188

【００４３】 <210> 2 <211> 188 <212> PRT <213> Nocardiopsis sp. TOA-1 <400> 2 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg 1 5 10 Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro 15 20 25 Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Ser Val Gly Thr Gln 30 35 40 Val Ser Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser Val 45 50 55 Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn 60 65 70 Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly 75 80 Tyr Ala Thr Val Ser Gly Ser Ser Thr Ala Pro Ile Gly Ser 85 90 95 Gln Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp Tyr Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Ser Tyr Pro Gln Gly 115 120 125 Thr Val His Ser Leu Thr Arg Thr Ser Val Cys Ala Glu Pro 130 135 140 Gly Asp Ser Ala Gly Ser Phe Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln 145 150 Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly 155 160 165 Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Asn Ser Trp 170 175 180 Asn Leu Arg Leu Arg Thr 185 188

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明によるアルカリプロテアーゼの
最適pHを示すグラフである。

【図２】図２は、本発明によるアルカリプロテアーゼの
安定pHを示すグラフである。

【図３】図３は、本発明によるアルカリプロテアーゼの
最適温度を示すグラフである。

【図４】図４は、本発明によるアルカリプロテアーゼの
安定温度を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 清水 保広 大阪府大阪市天王寺区上本町５丁目７番12 号 大和化成株式会社内 (72)発明者 満生 慎二 福岡県福岡市東区松香台２丁目３番１号 九州産業大学内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA14 CA02 GA19 HA03 4B050 CC01 DD02 LL02 LL04 4B065 AA01X AA01Y AC14 BA22 BC02 BD14 CA33 CA41 CA57

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するアルカリ
   プロテアーゼ。 (a) 作用および基質特異性：タンパク質およびペプチド
   に作用し、そのペプチド結合をエンド型の機作により切
   断して、低分子量のオリゴペプチドおよびアミノ酸を生
   成する。また、ケラチン等の不溶性タンパク質に対して
   も強力な活性を示す。 (b) 安定pH：30℃、24時間の処理条件において、pH 1.5
   〜12.0で安定である。 (c) 分子量：SDS電気泳動法では約20,000、アミノ酸配
   列からの平均分子量は19,150である。 (d) 等電点：10.0以上（等電点電気泳動法）である。 (e) 比活性：カゼインを基質とした場合は約1,100（PU/
   mgタンハ゜ク質）であり、ケラチンを基質とした場合約3,300
   （KU/mgタンハ゜ク質）である。
2. 【請求項２】 さらに、下記の理化学的性質を有する
   請求項１記載のアルカリプロテアーゼ。 (f) 最適pH：最適pHはカゼインを基質とした場合は11.0
   〜11.5であり、ケラチンを基質とした場合12.0以上であ
   る。 (g) 最適温度：最適作用温度はカゼインを基質とした場
   合は70〜75℃であり、ケラチンを基質とした場合65〜70
   ℃である。 (h) 安定温度：pH7.0、10分間の処理条件において、カ
   ルシウムの添加、無添加にかかわらず60℃まで安定であ
   る。 (i) 阻害： EDTA（エチレンシ゛アミン四酢酸）で活性は阻害され
   ないが、PMSF（フェニルメタンスルフォニルフルオライト゛）、SSI（ストレフ゜トミ
   セス ス゛フ゛チリシン インヒヒ゛ター）では阻害される。
3. 【請求項３】 請求項１記載のアルカリプロテアーゼ
   をコードする配列表、配列番号１に示す遺伝子。
4. 【請求項４】 配列表、配列番号2に示すアミノ酸配
   列を有する請求項１記載のアルカリプロテアーゼ。
5. 【請求項５】 好アルカリ性放線菌ノカルディオプシ
   ス（ Nocardiopsis ）属菌から得られる、請求項１記載
   のアルカリプロテアーゼ。
6. 【請求項６】 ノカルディオプシス エスピー（ Noc
   ardiopsis sp. ）TOA-1株から得られる、請求項１記載
   のアルカリプロテアーゼ。
7. 【請求項７】 好アルカリ性ノカルディオプシス属に
   属し、請求項１記載のアルカリプロテアーゼ産生能を有
   する微生物を培養する工程と、該工程で得られた培養物
   より該アルカリプロテアーゼを分離する工程とを含んで
   なるアルカリプロテアーゼの製造法。
8. 【請求項８】 前期微生物の培養が培養温度15〜35℃
   でpH8.0〜11.0のアルカリ性で行われる、請求項７記載
   のアルカリプロテアーゼ製造法。
9. 【請求項９】 前記微生物がノカルディオプシス エ
   スピー TOA-1株である請求項７記載のアルカリプロテ
   アーゼ製造法。
10. 【請求項１０】 ノカルディオプシス エスピー TO
    A-1株（FERM P-18676）。