JP2003265178A - 新規抗ウイルス活性タンパク質及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 植物由来のタンパク質翻訳阻害活性を有する
新規抗ウイルス活性タンパク質、その遺伝子及びこれら
の利用方法の提供。 【解決手段】 以下の（c）又は（d）のDNAからなる遺
伝子、および該遺伝子を用いた形質転換植物、抗ウイル
ス活性タンパク質の提供。（c）特定の塩基配列からな
るDNA（d）特定の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基
配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつ抗ウイルス活性を有するタンパク質を
コードするDNA

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リンドウ由来の新
規抗ウイルス活性タンパク質とその遺伝子及びこれらの
利用方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、遺伝子工学技術を用いて植物に有
用遺伝子を導入し、植物病害に強い病害耐性植物を作出
する試みが進められている。例えば、植物ウイルス等に
対する防御機構の強化を目的として、ウイルスの外被タ
ンパク質遺伝子やサテライト RNA遺伝子、あるいは植物
由来の抗ウイルス活性タンパク質遺伝子、リボソーム不
活化タンパク質遺伝子およびRNase 遺伝子等の植物への
導入が試みられ、ウイルスに対する抵抗性が高まったと
いう事例が報告されている（西澤ら : 化学と生物 37 :
385-392(1999)など）。

【０００３】ところで、リボソーム不活化タンパク質遺
伝子およびRNase 遺伝子は、 in vitro でタンパク質の
翻訳を阻害することによって抗ウイルス活性を示すユニ
ークな機能をもっている。こうしたタンパク質の翻訳を
阻害するタンパク質は、動物細胞でいくつか報告されて
おり、過塩素酸等の酸性溶液中でも変性しないことから
過塩素酸可溶性タンパク質（Percholic acid solble pr
otein：PSP）とも呼ばれる。ヒトやラット等の動物から
単離されたタンパク質翻訳阻害タンパク質は、in vitro
でタンパク質の翻訳を阻害し、その作用機作は通常の
RNase とは異なることが知られている（Morishita et a
l. J. Biol. Chem. 274 : 20688-20692(1999), Oka et
al. J. Biol. Chem. 270 : 300060-300067(1995)）。
また、該タンパク質のホモログは、大腸菌からヒトまで
進化的に保存されていると推定されている。

【０００４】しかし、こうしたタンパク質翻訳阻害タン
パク質が、植物から単離されたという報告や、該タンパ
ク質の抗ウイルス活性を実証した報告はこれまでにな
い。従って、該タンパク質やその遺伝子を利用した形質
転換植物についても全く知られていない。

【０００５】以上の点を考慮すると、植物由来のタンパ
ク質翻訳阻害タンパク質を単離し、その機能（特に、抗
ウイルス活性）を確認することは極めて重要であると考
えられる。つまり、植物よりタンパク質翻訳阻害活性を
有する新規抗ウイルス活性タンパク質またはその遺伝子
が得られれば、該タンパク質や遺伝子を利用することに
より、耐病性が強化された形質転換植物を作出し、作物
の分子育種に役立てることができる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物からタ
ンパク質翻訳阻害活性を有する新規抗ウイルス活性タン
パク質、およびその遺伝子を単離し、該タンパク質や遺
伝子を利用したウイルス病抵抗性形質転換植物、ならび
に抗ウイルス剤を提供することを目的とする。

【０００７】

【発明を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、RT-PCR法を用
いることにより、リンドウ由来のタンパク質翻訳阻害活
性を有する新規抗ウイルス活性タンパク質のクローニン
グに成功した。そして、該遺伝子をリンドウ等の植物に
導入することにより、その植物のウイルス病抵抗性を強
化しうることを見出し、本発明を完成させた。

【０００８】すなわち、本発明は、以下の（１）〜
（８）を提供するものである。 （１） 以下の（a）又は（b）の組換えタンパク質。 （a）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 （b）配列番号2で表されるアミノ酸配列において1又は
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつ抗ウイルス活性を有するタンパク
質

【０００９】（２） 以下の（a）又は（b）の抗ウイル
ス活性タンパク質をコードする遺伝子。 （a）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 （b）配列番号2で表されるアミノ酸配列において1又は
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつ抗ウイルス活性を有するタンパク
質

【００１０】（３） 以下の（c）又は（d）のDNAから
なる遺伝子。 （c）配列番号1で表される塩基配列からなるDNA （d）配列番号1で表される塩基配列からなるDNAと相補
的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、かつ抗ウイルス活性を有するタン
パク質をコードするDNA

【００１１】（４） 請求項２又は３記載の遺伝子を含
有する組換えベクター。 （５）請求項２又は３記載の遺伝子を導入して得られる
形質転換体。 （６）請求項２又は３記載の遺伝子を導入して得られる
形質転換植物。 （７）請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培
養物から抗ウイルス活性タンパク質を採取する、又は、
請求項６記載の形質転換植物を栽培し、得られる植物体
から抗ウイルス活性タンパク質を採取する、抗ウイルス
活性タンパク質の製造方法。 （８）請求項１記載の抗ウイルス活性タンパク質を有効
成分として含む抗ウイルス剤。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。 １．本発明の抗ウイルス活性タンパク質遺伝子 本発明にかかる遺伝子は、タンパク質翻訳阻害活性を有
する抗ウイルス活性タンパク質をコードする遺伝子であ
る。該遺伝子は、リンドウで発現している遺伝子の中か
ら、RT-PCR法を用いることにより、たとえば以下のよう
にしてクローニングすることができる。

【００１３】1）cDNA の合成及び PCR mRNA の供給源としては、たとえばリンドウの葉、茎、
葉柄、花、根などが挙げられる。mRNA の調製は通常行
われる方法により行うことができ、たとえば、上記植物
組織を、グアニジン試薬（Guanidinium Thiocyanate
和光純薬社製）、フェノール試薬（TE-飽和フェノール
和光純薬社製）等で処理して全 RNA を得た後、特に
発現量の低い遺伝子を除き、全 RNA を鋳型に PCR 反応
を行う。必要に応じてオリゴ-dT セルロースやセファロ
ース2Bを担体とするポリＵセファロース等を用いたアフ
ィニティーカラム法、あるいはバッチ法によって、ポリ
（A）⁺RNA（mRNA）を得ても良い。さらに、必要であれ
ば、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（A）⁺RNAをさ
らに精細に分画しても良い。

【００１４】このようにして得られた全 RNA を鋳型に
オリゴ dT に M13プライマーM4（配列番号3） を付加し
たプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNA を合
成する。この一本鎖 cDNAを鋳型に公知の動物細胞由来
のタンパク質翻訳阻害タンパク質のアミノ酸配列をもと
に合成したプライマー（配列番号4、5、6、7）とM13プ
ライマーM4を用いて PCR 反応によって本発明の遺伝子
を得ることができる。ただし、本発明で用いられるプラ
イマーはこれらに限定されるものではない。

【００１５】2）塩基配列の決定 得られたPCR断片をpCR2.1（Invitrogen 社製）、pBlueS
criptSK(+)（Stratagene社製）等の適切なベクターにサ
ブクローニングした後、塩基配列の決定を行う。塩基配
列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM13
ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等、
公知の手法により行うことができるが、自動塩基配列解
析装置（PERKIN-ELMER社製 ：ABI PRISM 377 DNA Seque
nce System 等）を用いる方法が簡便で好ましい。

【００１６】配列番号1に、このようにして特定され
た、本発明の抗ウイルスか遺伝子の塩基配列を示す。し
かしながら、本発明にかかる抗ウイルス活性タンパク質
をコードする遺伝子は、上記配列に限定されず、この遺
伝子（配列番号1）とストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズすることができる他の遺伝子も、該遺伝子が
タンパク質翻訳阻害による抗ウイルス活性を有する限り
をも含むものとする。

【００１７】ここで、ストリンジェントな条件とは、た
とえば、ナトリウム濃度が300-2000mMで温度が40-75
℃、好ましくはナトリウム濃度が600-900mMで温度が65
℃の条件下をいう。なお遺伝子の変異を導入する場合に
は、Kunkel法やGrapped duplex法等の公知の手法又はこ
れに準ずる方法により、たとえば部位特異的突然変異誘
発法を利用した変異導入キット（たとえば Mutant-K (T
akara 社製）や Mutant-G (Takara 社製））、あるいは
LA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキット（Takar
a 社製）を用いることができる。

【００１８】一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定され
ると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のcDNA
もしくはゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは
該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリ
ダイズさせることによって、さらに本発明の遺伝子を得
ることができる。次に、本発明にかかる形質転換体の作
出方法、及び該形質転換体の植物病原ウイルスに対する
抵抗性について説明する。なお、以下の形質転換植物、
及び植物病原ウイルスは例示であって、本発明はこれら
に限定されるものではない。

【００１９】２．本発明の抗ウイルス活性タンパク質遺
伝子を導入した形質転換植物の作出 公知の遺伝子工学的手法を用いて、本発明の抗ウイルス
活性タンパク質をコードする DNA を植物宿主に導入す
ることにより、植物病原ウイルスに対して抵抗性を有す
る形質転換植物を作出することができる。すなわち、遺
伝子工学的手法による栽培植物への本発明の抗ウイルス
活性タンパク質遺伝子の導入は、植物を植物病原ウイル
スから防護する有効な手段となる。

【００２０】1）ベクターの構築、及び遺伝子導入用ア
グロバクテリウムの形質転換 前記１で得られた DNA はそのまま、又は適当な制限酵
素で消化し、あるいは、適当なリンカーを連結して使用
することができる。DNA を導入するベクターとしては、
pUC18、pUC19、pUC118、pUC119 等の pUC 系ベクタ
ー、pBI101、pBI121、pGA482 等のバイナリーベクター
を挙げることができる。特に、アグロバクテリウムのバ
イナリーベクターを用いる場合は、該バイナリーベクタ
ーの境界配列（LB, RB）間に外来遺伝子を挿入し、この
組換えベクターを大腸菌内で増幅する。次いで、増幅し
た組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス LBA4404、EHA101、EHA105、C58C1Rif^R 等に、凍結
融解法、エレクトロポレーション法等により導入し、こ
れを植物の形質転換体作出に用いる。

【００２１】植物体内で外来遺伝子などを発現させるた
めには、構造遺伝子の前後に、それぞれ植物用のプロモ
ーターとターミネーターを配置させる必要がある。前記
プロモーターとターミネーターは特に限定されず、植物
体中で機能することが知られている任意のものを用いる
ことができる。たとえばプロモーター配列としては、カ
リフラワーモザイクウイルス (CaMV) 由来の 35S 転写
物［The EMBO J. 6:3901-3907 (1987)、トウモロコシ
のユビキチン［Plant Mol. Biol. 18: 675-689 (1992)
］、ノパリン合成酵素（NOS）遺伝子、オクトピン（OC
T）合成遺伝子のプロモーターが挙げられる。またター
ミネーター配列としては、たとえばカリフラワーモザイ
クウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由来のターミ
ネーターが挙げられる。

【００２２】また、必要に応じてプロモーター配列と本
発明の抗ウイルス活性タンパク質遺伝子の間に、遺伝子
の発現を増強させる機能を持つイントロン配列、たとえ
ばトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ (Adh 1)
のイントロン配列［Genes &Development 1: 1183-1200
(1987)］等を導入することができる。

【００２３】さらに効率的に目的の形質転換細胞を選抜
するために、有効な選抜マーカー遺伝子を上記の本発明
の遺伝子と併用することが好ましい。該選抜マーカーと
しては、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植
物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラー
ゼ（htp）遺伝子及びビアラフォスに対する抵抗性を植
物に付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェ
ラーゼ（bar）遺伝子等を挙げることができる。本発明
の抗ウイルス活性タンパク質遺伝子ならびに選抜マーカ
ー遺伝子は、単一のベクターに一緒に組み込んでも良い
し、それぞれを別個のベクターに組み込んだ2種類の組
換えDNAとして用いてもよい。

【００２４】2）宿主植物への本発明の抗ウイルス活性
タンパク質遺伝子の導入 本発明において宿主植物とは、本発明の遺伝子導入が可
能なものであれば、特に限定されない。また、遺伝子導
入に用いられる外植片は、宿主植物の全体、器官（例え
ば葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、組織（例えば表
皮、師部、柔組織、木部、維管束等）または培養細胞の
いずれであってもよい。宿主植物の外植片として、宿主
植物の全体、器官、組織、培養細胞を用いて遺伝子導入
する場合、採取した植物外植片に、本発明のベクターを
アグロバクテリウムのバイナリーベクター法、パーティ
クルガン法、又はポリエチレングリコール法等を用いて
導入することができる。あるいはプロトプラストにエレ
クトロポレーション法で導入することもできる。かくし
て、本発明の遺伝子が導入された形質転換植物が作出さ
れる。

【００２５】なお、パーティクルガン法等による直接遺
伝子導入法では、選抜マーカー遺伝子を含むベクターと
本発明の抗ウイルス活性タンパク質遺伝子を含有するベ
クターとを混合して同時に植物の細胞に撃ち込む、いわ
ゆる co-transformation 法により行うこともできる。
形質転換の結果得られるシュート、毛状根などは細胞培
養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、
また従来知られている植物組織培養法を用いて、適当な
濃度の植物ホルモンの投与などによって、さらに植物体
に再生させることができる。

【００２６】本発明の抗ウイルス活性タンパク質遺伝子
が導入された植物細胞は、選抜マーカーによるスクリー
ニング、又は当該抗ウイルス活性タンパク質遺伝子もし
くはその発現産物の発現解析により、抗ウイルス活性タ
ンパク質遺伝子を保有する形質転換細胞を選抜すること
が可能である。得られた植物体は、土壌又はバーミキュ
ライトを詰めたポットで栽培し、株分けすることによっ
て増殖させることが可能である。このように増殖させた
抗ウイルス活性タンパク質遺伝子導入植物も本発明の形
質転換植物の範囲に含まれる。本発明により抗ウイルス
活性タンパク質遺伝子を導入された植物は、植物病原性
ウイルスに対して抵抗性を有することが期待される。

【００２７】3）本発明の抗ウイルス活性タンパク質遺
伝子の植物組織での発現部位の解析 得られた形質転換植物及びその次世代植物に、目的とす
る抗ウイルス活性タンパク質遺伝子が組み込まれている
ことの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従って
DNAを抽出し、公知の方法、たとえばPCR法又はサザン分
析法等により導入遺伝子を検出することによって行うこ
とができる。

【００２８】また、本発明の抗ウイルス活性タンパク質
遺伝子の組織内での発現部位は、たとえば各組織におけ
るmRNAの発現又はタンパク質の発現を公知の方法により
解析することによって確認することができる。たとえ
ば、RT-PCR 法、ノザンブロット解析法等により本発明
の抗ウイルス活性タンパク質遺伝子の発現を確認するこ
とができる。また本発明の抗ウイルス活性タンパク質の
発現の確認方法としては、該タンパク質に対する抗体を
用いたウエスタンブロット解析法等が挙げられる。次
に、上記遺伝子を用いた新規な抗ウイルス活性タンパク
質の遺伝子工学的生産方法について説明する。

【００２９】３．本発明の抗ウイルス活性タンパク質の
遺伝子工学的生産方法 本発明の抗ウイルス活性タンパク質は、たとえば以下の
ようにして遺伝子工学的に生産することができる。 1）組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、公知のベクターに本発明の
遺伝子を連結（挿入）することによって得ることができ
る。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特
に限定されず、たとえばプラスミドDNA、ファージDNA等
が挙げられる。

【００３０】前記プラスミドDNAとしては、大腸菌由来
のプラスミド（たとえば pBR322, pBR325, pUC18, pUC1
19, pTrcHis, pBlueBacHis 等）、枯草菌由来のプラス
ミド（たとえば pUB110, pTP5 等）、酵母由来のプラス
ミド（たとえば YEp13, YEp24,YCp50, pYE52 等）など
が、ファージ DNAとしてはλファージ等が挙げられる。
さらにレトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動
物ウイルスベクター、バキュロウイルス等の昆虫ウイル
スベクター、ジャガイモエックスウイルス等の植物ウイ
ルスベクターなどを用いてもよい。

【００３１】前記ベクターへの本発明の遺伝子の挿入
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
ベクターDNAの適当な制限酵素部位又はマルチクローニ
ングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用さ
れる。本発明の遺伝子はその遺伝子の機能を好適に発揮
できるよう、ベクターに組み込む必要がある。そのた
め、ベクターには本発明の遺伝子の他にプロモーター、
必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプラ
イシングシグナル、ポリA付加シグナル、選抜マーカ
ー、リボソーム結合配列（SD配列）等を含有させること
ができる。なお選抜マーカーとしては、たとえばジヒド
ロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオ
マイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。

【００３２】2）形質転換体の作出 本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを目的
遺伝子が発現しうるように宿主中に導入することによっ
て得ることができる。ここで宿主としては、本発明のDN
Aを発現できるのもであれば特に限定されず、たとえ
ば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエ
ッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus sub
tilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pse
udomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム
・メリロテイ（Rhizobium melilotei）等のリゾビウム
属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Sa
ccharomyces cervisiae）、サッカロミセス・ポンベ
（S. pombe）等の酵母、サル細胞（COS細胞）、チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）等の動物細胞、
あるいはSf19、Sf21等の昆虫細胞を挙げることができ
る。

【００３３】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが各細菌中で自律複製可能であると
ともにプロモーター、リボゾーム結合配列、本発明遺伝
子、転写終結配列により構成されていることが望まし
い。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれてい
ても良い。大腸菌としてはエッシェリヒア・コリ（E. c
oli）K12、DH1、TOP10F等が挙げられ、枯草菌としては
バチルス・ズブチリス（B. subtilis）MI114、207-21
等が挙げられる。

【００３４】前記プロモーターとしては、大腸菌等の宿
主で発現できるものであれば特に限定されず、たとえば
trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、
PRプロモーター等の大腸菌由来のプロモータを用いるこ
とができる。tacプロモーター等の人為的に設計された
プロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクター
の導入方法は、細菌にDNAを導入できる方法であれば特
に限定されず、たとえばカルシウムイオンを用いる方法
（Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69
: 2110 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げ
られる。

【００３５】酵母を宿主とする場合は、たとえばサッカ
ロミセス・セルビシエ（S. cervisiae）、サッカロミセ
ス・ポンベ（S. pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia
pastoris）等が用いられる。この場合、プロモーター
としては酵母で発現できるものであれば特に限定され
ず、たとえばgal1プロモーター、gal10プロモーター、
ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモ
ーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロ
モーター、ADHプロモーター、AOXプロモーター等を挙げ
ることができる。

【００３６】酵母への組換えベクターの導入方法は、酵
母にDNAを導入しうる方法であれば特に限定されず、た
とえばエレクトロポレーション法（Becker, D.M. et a
l. :Methods. Enzymol., 194 : 180 (1990)）、スフェ
ロプラスト法（Hinnen, A. etal. : Proc Natl. Acad.
Sci. USA, 75 : 1929 (1978)）、酢酸リチウム法（Ito
h, H. : J. Bacteriol., 153 : 163 (1983)）等を挙げ
ることができる。

【００３７】動物細胞を宿主とする場合にはサル細胞
（COS-7）、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞、
マウスL細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞などが用いら
れる。プロモーターとしては、SRαプロモーター、SV40
プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が
用いられる。また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺
伝子プロモーター等を用いても良い。動物細胞への組換
えベクターの導入方法は、たとえばエレクトロポレーシ
ョン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が
挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合には、Sf9細
胞、Sf21細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベ
クターの導入方法は、たとえばエレクトロポレーション
法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が用い
られる。

【００３８】3）本発明の抗ウイルス活性タンパク質の
生産 本発明の抗ウイルス活性タンパク質は、前記2)記載の形
質転換体を培養し、その培養物から該タンパク質を採取
することによって得ることができる。本発明の形質転換
体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方
法に従って行われる。大腸菌や酵母等の微生物を宿主と
して得られた形質転換体を培養する培地としては、微生
物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、
形質転換体を効率的に培養しうる培地であれば、天然培
地、合成培地のいずれを用いても良い。

【００３９】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、スクロース、デンプン、マルトース、デキストリン
等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノ
ール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒
素源としてはアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の
無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含
窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティ
ープリカー、カザミノ酸、NZアミン等が用いられる。

【００４０】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
銅、炭酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化コバルト等が用い
られる。培養は通常、振とう培養又は通気攪拌培養など
の好気的条件下で、約30℃で24〜96時間行う。培養期間
中、pH は5.0〜8.0に保持する。pH の調製は無機又は有
機の酸、アルカリ溶液による。

【００４１】培養中は必要に応じてアンピシリンやテト
ラサイクリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。プ
ロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてイ
ンデューサーを培地に添加しても良い。たとえば、Lac
プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生
物を培養する場合は、イソプロピル-β-チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現
ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、イン
ドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加しても良い。

【００４２】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般的に使用されているRPMl
1640培地、DMEN培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を
添加した培地が挙げられる。培養は通常、5％CO2存在
下、20〜30℃で1〜7日間行う。培養中は必要に応じてア
ンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添
加しても良い。

【００４３】昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、Grace'sInsect Medium（Grac
e, T.C.C. : Nature, 195:788 (1962)）に牛胎児血清等
を添加した培地が挙げられる。培養は通常25℃で1〜7日
間行う。培養期間中、pHは6.0〜7.0に保持し、必要に応
じて通気や攪拌を加える。

【００４４】培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は
細胞内に生産される場合は、菌体内又は細胞を破砕す
る。一方、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に分
泌される場合は、培養液をそのまま用いるか、遠心分離
等によって菌体又は細胞を除去後上清を得る。タンパク
質の単離・精製には、一般的に、たとえば硫酸アンモニ
ウム沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等を単独であるいは適宜組み合わせて用いることによ
り、上記の培養物（細胞破砕液、培養液、又はそれらの
上清）から本発明の抗ウイルス活性タンパク質又はその
塩を単離・精製することができる。

【００４５】こうして単離された抗ウイルス活性タンパ
ク質は、配列番号２に示すようなアミノ酸配列を有して
いた。しかしながら、本発明の抗ウイルス活性タンパク
質のアミノ酸配列はこれに限定されず、該タンパク質が
タンパク質翻訳阻害による抗ウイルス活性を有する限
り、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が
欠失、置換、付加等の変異が生じたものであっても良
い。かかる欠失、置換、付加等の変異の数は、全アミノ
酸数に対して好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜
5個である。また、この抗ウイルス活性タンパク質をコ
ードする遺伝子も、１．に記載した本発明の遺伝子に含
まれる。

【００４６】４．本発明の抗ウイルス活性タンパク質の
化学合成 本発明の抗ウイルス活性タンパク質の化学合成は通常の
ペプチド合成手段によって行うことができる。たとえ
ば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無
水物法、DCC 法、活性エステル法、カルボイミダゾール
法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び
液相合成法の何れを適用してもよい。すなわち、本発明
の抗ウイルス活性タンパク質を構成しうるアミノ酸と残
余部分を縮合させて、生成物が保護基を有する場合は保
護基を脱離することによって目的のタンパク質が合成さ
れる。縮合法や脱離方法は公知の何れの方法を用いても
良い。

【００４７】反応後は、通常の精製法、たとえば、溶媒
抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマト
グラフィー、再結晶を組み合わせて本発明の抗ウイルス
活性タンパク質を精製できる。本発明の抗ウイルス活性
タンパク質はC末端が通常カルボキシル基（-COOH）、又
はカルボキシレート（-COO-）であるが、C末端がアミド
（-COONH2）、エステル（-COOR）であってもよい。ここ
でエステルにおけるR は炭素数7〜12のアラルキル基、
炭素数3〜10のシクロアラルキル基、炭素数6〜12のアリ
ール基、炭素数1〜12のアルキル基等が挙げられる。さ
らに本発明の抗ウイルス活性タンパク質にはN末端アミ
ノ酸残基が保護されているもの、あるいは糖鎖が結合し
た糖ペプチド等の複合ペプチドも含まれる。

【００４８】５．本発明の抗ウイルス活性タンパク質の
抗ウイルス剤としての利用 本発明の抗ウイルス活性タンパク質は、植物病原性ウイ
ルスに対して抗ウイルス作用を有し、かつ抗ウイルス活
性のスペクトラムが広いため、特に抗ウイルス剤として
の利用が有用である。また、本抗ウイルス活性タンパク
質は他の農薬と組み合わせた形態、たとえば、殺菌剤
（イネ、野菜、花用殺菌剤）との組み合わせによる殺菌
抗ウイルス剤、殺虫剤（イネ害虫用殺虫剤等）との組み
合わせによる殺虫抗ウイルス剤、植物成長調整剤（水稲
成長調整剤）との組み合わせによる植物成長調整抗ウイ
ルス剤として使用することができる。すなわち、本抗ウ
イルス活性タンパク質は単独で、あるいは適当な液体、
固体又は気体の単体と組み合わせて使用することができ
る。さらに必要に応じて、液化ガス、噴射剤（フレオン
等）、表面活性剤（乳化剤、分散剤、消泡剤等）等を添
加し、乳剤、油剤、水和剤、粉剤、粒剤、液剤等の製剤
として使用することもできる。

【００４９】製剤に使用する液体担体としては、たとえ
ば、キシレン、トルエン、ベンゼン、アルキルナフタレ
ン等の芳香族炭化水素、クロロベンゼン、クロロエチレ
ン、塩化メチレン等の塩素化芳香族炭化水素、シクロヘ
キサン、パラフィン等の脂肪族炭化水素、鉱油成分、エ
タノール、ブタノール、グリコール等のアルコール及び
これらのエーテル類、ならびにエステル類、アセトン、
メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極
性溶剤が挙げられ、これらの1種又は2種以上を混合して
使用することができる。水が溶剤として用いられる場
合、純水又は無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム
等）、糖（グルコース、ショ糖等）もしくは糖アルコー
ル（D- ソルビトール、D- マンニトール等）の水溶液を
用いることができる。

【００５０】また、製剤に使用する固体担体としては、
たとえば、カオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、
アタパルジャイト、モンモリナイト、珪藻土等の天然鉱
物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉
末、高分子性天然物（結晶性セルロース、コーンスター
チ、ゼラチン、アルギン酸等）が挙げられ、これらの1
種又は2種以上を混合して使用することができる。

【００５１】乳化剤、分散剤、消泡剤等として使用され
る表面活性剤としては、ポリオキエチレン-脂肪酸エス
テル、ポリオキエチレン脂肪アルコールエステル、アル
キルアリールポリグリコールエステル、アルキルスルフ
ォネート、アルキルサルフェート、アリールスルフォネ
ート、アルブミン加水分解物、メチルセルロース、アラ
ビアゴム等が挙げられる。

【００５２】有効成分である本発明の抗ウイルス活性タ
ンパク質は、乳剤では0.01〜50重量％、水和剤では0.01
〜50重量％、粉剤では0.01〜10重量％が適当であるが、
使用目的によってはこれらの濃度は適宜変更しても良
い。乳剤、水和剤の場合には、使用に際して水で希釈
し、製品重量の10〜5000倍で使用することができ、好ま
しくは500〜1000倍で使用するとよい。

【００５３】本発明の抗ウイルス剤は、噴霧法、ミスト
法、ダスト法、散布法、注入法等を用いて植物病原ウイ
ルスに侵された植物に直接投与してもよく、あるいは植
物病原ウイルスに汚染された土壌に直接投与してもよ
い。使用法は使用目的に応じて適宜選択されるが、いず
れの場合にも、本発明の抗ウイルス活性タンパク質が可
能な限り均一に分散されることが望ましい。本発明の抗
ウイルス剤の使用量は、その使用方法によって異なる
が、たとえば噴霧法の場合10a当たり、有効成分量で1〜
1000gで噴霧することが好ましい。

【００５４】本発明の抗ウイルス活性タンパク質を抗ウ
イルス剤として使用すべき対象となる植物病原ウイルス
としては、たとえばトマトモザイクウイルス（Tomato M
osaic Virus：ToMV）、キュウリモザイクウイルス（Cuc
umber Mosaic Virus：CMV）、ソラマメウイルトウイル
ス（Broad Bean Wilt Virus：BBWV）、トマト黄化えそ
ウイルス（Tomato Spotted Wilt Virus：TSWV）などが
挙げられる。これらの病原ウイルスは具体的には、ToMV
はイチゴ、トマト、ホウレンソウ、ニンニク、ガーベ
ラ、カトレア、ユリ類、キンモクセイ等の栽培植物を侵
す病原ウイルスであり、CMVはジャガイモ、トウモロコ
シ、ナタネ、カボチャ、キャベツ、キュウリ、スイカ、
ブロッコリー、メロン、アネモネ、インパチェンス、カ
スミソウ、キク、スイセン、スターチス、チューリッ
プ、トルコキキョウ、リンドウ、ウメ、キリ等の栽培植
物を侵す病原ウイルスであり、BBWVはアズキ、インゲン
マメ、ダイズ、ダイコン、ピーマン、ハクサイ、ホウレ
ンソウ、シクラメン、サルビア、スターチス、トルコキ
キョウ、リンドウ、パッションフルーツ等の栽培植物を
侵す病原ウイルスであり、TSWVはキュウリ、スイカ、ピ
ーマン、トマト、ネギ、キク、ダリア、トルコキキョ
ウ、リンドウ等の栽培植物を侵す病原ウイルスである。
従って、これらの病原ウイルスによる病害の防除又は予
防を目的として、前記の植物に本発明の抗ウイルス活性
タンパク質を含む抗ウイルス剤を使用することが好適と
なる。

【００５５】さらに、本発明の抗ウイルス活性タンパク
質は医薬組成物として使用することもできる。本発明の
タンパク質を有効成分として含む医薬組成物は、医薬的
に許容される担体又は添加物を共に含むものであっても
よい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬
的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリ
マー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カ
ルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサン
タンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、
グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコー
ル、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトー
ル、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容
される界面活性剤等が挙げられる。使用される添加物
は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜組み合わせ
て選択される。

【００５６】本発明の抗ウイルス活性タンパク質を抗ウ
イルス活性を有する医薬組成物として使用する場合、そ
の使用対象は特に限定されず、たとえばウイルスを原因
とする疾病の診断、治療又は予防を目的として用いるこ
とができる。これらの疾病は、単独又は併発したもの若
しくは上記以外の他の疾病を併発したもの、あるいはウ
イルス性腫瘍であってもよい。

【００５７】本発明の抗ウイルス活性タンパク質を含む
医薬組成物は、経口的又は非経口的に投与することがで
きる。本発明の抗ウイルス活性タンパク質を経口的に投
与する場合は、それに適用される錠剤、顆粒剤、散剤、
丸剤などの固形製剤、あるいは液剤、シロップ剤などの
液体製剤などとすればよい。とくに顆粒剤及び散剤は、
カプセル剤として単位量投与形態とすることができ、液
体製剤の場合は使用する際に再溶解させる乾燥生成物に
してもよい。これら剤型のうち、経口用固形剤は、通常
それらの組成物中に製剤上一般に使用される結合剤、賦
形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤などの添加剤を含有する。
また、経口用液体製剤は、通常それらの組成物中に製剤
上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、
芳香剤、着色剤などの添加剤を含有する。

【００５８】本発明の抗ウイルス活性タンパク質を非経
口的に投与する場合は、注射剤、坐剤などとすればよ
い。注射の場合は、通常単位投与量アンプル又は多投与
量容器の状態で提供され、使用する際に適当な担体、た
とえば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉体で
あってもよい。これらの剤型は通常それらの組成物中に
製剤上一般に使用される乳化剤、懸濁剤などの添加剤を
含有する。注射手法としては、たとえば点滴静脈内注
射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、
皮内注射が挙げられる。また、その投与量は、投与対象
の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変
えることができる。

【００５９】この場合、投与の剤型及びその投与量につ
いては被検体（ヒト及び動物を包含する）及び疾病の種
類、症状を勘案して、本発明による抗菌効果が認められ
る限り任意の選択が可能である。たとえば、投与量は約
0.001〜10mg/kg 体重であり、好ましくは約0.025〜0.5m
g/kg 体重である。

【００６０】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではな
い。［実施例１］リンドウ由来のタンパク質翻訳阻害タンパ
ク質類似遺伝子（Gt TIP）の単離 １）全 RNA の調製 茎頂培養由来のリンドウをin vitro で継代培養し、増
殖させたリンドウの茎葉よりFast green RNA isolation
Kit (Funakoshi社製) を用いて全RNAを抽出した。即
ち、リンドウの茎葉200mgを破砕用チューブに採取し、
処理バッファー（CRSR-GREEN 溶液 500μL 、PAR 溶液
500μL、CIA 溶液 100μL）を加えて、FastPrep装置で
粉砕処理を行った。処理後チューブを氷上 で 5 分間放
置し、遠心分離（15000rpm、15 min）後、上清画分を新
しい1.5mL容チューブに回収した。CIA溶液 500μLを加
えボルテックスで撹拌し、さらに遠心分離（15000rpm、
2min）した。上清画分を新しいエッペンに取り、DIPS
溶液500μLを加え、チューブの上下反 転撹拌により溶
液を充分混合した後、再び遠心分離（15000rpm、5min）
し、ペレットを SEWS 500μL で洗浄し、DEPC-水 200μ
L に溶かしたものを全RNAとして使用した。

【００６１】２）一本鎖cDNA作製 上記１）によって得られた、全RNA（polyA mRNAを含
む）1μg を用いて RT-PCRキット（Takara社製）により
一本鎖cDNAの合成を行った。この反応に用いたプライマ
ーはオリゴ(dT)20の5'側に既知の配列5' -AGTTTTCCCAGT
CACGAC-3'（配列番号３）を連結したものを用いた。PCR
の反応組成は以下のとおりである。

【００６２】

【表１】 ＰＣＲ反応組成 RNA 1μl（1μg） プライマー 1μl（50pmol） 10×PCR緩衝液 2μl 25 mM MgCl2 4μl RNase inhibitor 0.5μl 10 mM dNTPミックス 2μl AMV 由来逆転写酵素 1μl DEPC処理水 8.5μl 全量 20μl

【００６３】上記混合物を、42℃、50℃、55℃、60℃の
各温度でそれぞれ10分間ずつインキュベートした。次い
で99℃で5分間インキュベートして反応を停止した。

【００６４】３）プライマー作製 目的とするタンパク質翻訳阻害タンパク質類似遺伝子の
増幅には、既知の動物由来のタンパク質翻訳阻害タンパ
ク質遺伝子の配列を基に合成した以下のプライマー（サ
ワディーテクノロジー社；カスタムサービス）を用い
た。 5'プライマー： 5' -AGC CAA AGA AGC CGT CGT ATA AGC AGA ATC-3'（配
列番号４） 5' -ACG GTC GAC GAC GTA GAA GCA TTT AAA CTA-3'（配
列番号５） 3' プライマー： 5' -TCA TAA AGT AAA ACA TGC CAT TAT TTA TGA-3'（配
列番号６） 5' -AAT CCT TGC AAG TCT CGT CTA TAG AAG GGT-3'（配
列番号７）

【００６５】４）RT-PCRによるタンパク質翻訳阻害タン
パク質類似遺伝子の増幅 合成された一本鎖cDNAを鋳型として、上記３）記載の5'
プライマーと 3'プライマーでPCR反応を行った。PCRの
反応組成は以下のとおりである。

【００６６】

【表２】 ＰＣＲ反応組成 cDNA 溶液 1μl（1μg） 20μMセンスプライマー 2μl 20μMアンチセンスプライマー 2μl 10×PCR緩衝液 5μl 25 mM dNTPミックス 4μl ExTaq 1μl DEPC処理水 35.5μl 全量 50μl

【００６７】PCR 反応は、95℃で30秒間の熱変性、55℃
で30秒間のアニーリング、72℃1分間の伸長反応を1サイ
クルとして、30サイクル行った。このPCR反応物を1.6％
アガロースゲル電気泳動に供し、約800bpのDNA断片をゲ
ルから切り出した。このゲル片より Quia Gel Extratio
n Kit（キアゲン社製）を用いてDNA断片を抽出した。

【００６８】次いで、このPCR産物をベクターpCR2.1
（インビトロゲン社製）にTAクローニングを行った。即
ち、pCR2.1ベクターに重量比5〜10倍程度のPCR産物を混
合し、Ligation kit ver. 2（Takara社製）を用いてラ
イゲーションを行った。この組換えプラスミドを用いて
大腸菌（TOP10F' ）を形質転換した。形質転換した大腸
菌の単一コロニーをLB液体培地（3mL）中で培養し、QUI
A Miniprep Kit（キアゲン社製）を用いてプラスミドを
精製した。

【００６９】５）塩基配列の決定 得られたプラスミドを鋳型に M13 RV および T7 プライ
マーを用いて Big DyeSycle sequence Kit（ABI）の方
法に準じてシークエンス反応を行い、ABI PRISM 377 DN
A Sequence System を用いて塩基配列の決定を行った。
得られた塩基配列については、解析ソフト DNASIS およ
び GENETIX を用いて解析し、検索ソフトBLAST によっ
てホモロジー検索を行った。ホモロジー検索の結果、得
られた塩基配列は、動物で報告されている複数のタンパ
ク質翻訳阻害タンパク質と相同性を示した。すなわち、
ヒト（53 %）、マウス（51 % ）等、動物由来のタンパ
ク質翻訳阻害タンパク質 と 50 % 程度の相同性を示
し、タンパク質翻訳阻害タンパク質 に高度に保存され
ているモチーフ（UPF0076）が存在することがわかっ
た。以上の結果より、得られた遺伝子を既知のタンパク
質翻訳阻害タンパク質遺伝子と相同性を有する、リンド
ウ由来のタンパク質翻訳阻害タンパク質類似遺伝子（Gt
TIP）と同定した。

【００７０】［実施例２］リンドウ由来のタンパク質翻
訳阻害タンパク質類似遺伝子（Gt TIP）の大量発現 １）プライマー作製 抗ウイルス活性タンパク質遺伝子の増幅には、実施例１
で決定されたタンパク質翻訳阻害タンパク質類似遺伝子
の配列（配列番号１）を基に、以下のプライマー（サワ
ディーテクノロジー社；カスタムサービス）を合成して
用いた。 5'プライマー： 5' -CGC GGA TCC GAT GGC TTC GAC GGC GGC GGC AGC GG
C ACGA-3'（配列番号８） 3' プライマー： 5' -CGG GGT ACC TTA CAG CAC AGC AAT GCA TTC GAT TT
C AAT-3'（配列番号９） ２）ベクターの調製 Gt TIPを含む pCR2.1 を鋳型として、上記１）記載の5'
プライマーと 3'プライマーを用いてPCR反応を行った。
PCRの反応組成は以下のとおりである。

【００７１】

【表３】 ＰＣＲ反応組成 cDNA 溶液 1μl（1μg） 20μMセンスプライマー 2μl 20μMアンチセンスプライマー 2μl 10×PCR緩衝液 5μl 25 mM dNTPミックス 4μl ExTaq 1μl DEPC処理水 35.5μl 全量 50μl

【００７２】PCR 反応は、95℃で30秒間の熱変性、55℃
で30秒間のアニーリング、72℃1分間の伸長反応を1サイ
クルとして、30サイクル行った。このPCR反応物を1.6％
アガロースゲル電気泳動に供し、約800bpのDNA断片をゲ
ルから切り出した。このゲル片より Quia Gel Extratio
n Kit（キアゲン社製）を用いてDNA断片を抽出した。

【００７３】次いで、このPCR産物を BamHI および Kpn
I で消化し、同酵素で消化した大腸菌ヒスチジンタグ融
合タンパク質発現ベクター pTrcHisB（インビトロゲン
社製）に挿入した。この組み換えプラスミド10μＬを大
腸菌コンピテントセル（DH5α ）100μLと混合し、氷中
で 30 分間、 42 ℃で 45 秒間、さらに氷中に１分間放
置した。こうして得た大腸菌の形質転換体を含む溶液
に、LB 培地 (１％ Bacto trypton、0.5 % Bact yeast
extract、0.5 % NaCl、0.1% グルコース、pH 7.5) 1
00 mL を加えて、37 ℃で１時間培養した後、アンピシ
リン 100 mg/Lを含有するLB 寒天培地にプレーティング
した。翌日、培地上に出現した単一コロニーをアンピシ
リン 100 mg/Lを含む LB 液体培地中で 、37 ℃、約 6
〜12 時間振盪培養した。この培養液から QUIA Minipre
p Kit（キアゲン社製）を用いてプラスミドを精製し
た。精製したプラスミドを用いて Big Dye Sycle sequ
ence Kit（ABI）により、シークエンス反応を行い、ABI
PRISM 377 DNA Sequence System を用いて塩基配列を
確認した。確認したプラスミド10 μLをタンパク質発現
用大腸菌コンピテントセル BL21に上記と同様に形質転
換し、タンパク質発現用大腸菌として用いた。

【００７４】３）タンパク質の発現と精製 単一コロニーをLB液体培地（50mL）中で一晩培養した大
腸菌を 1 L の LB 培地中に 10 mL添加し、37℃で OD
値 0.6 になるまで培養した後、1 mM IPTG を添加し、
タンパク質の発現を誘導した。３時間の培養後、遠心分
離によって菌体を回収した。

【００７５】回収した菌体を細菌用可溶化剤（B-PER；
ピアス）にて可溶化後、遠心分離により可溶性タンパク
質を得た。可溶性タンパク質をニッケル結合親和性カラ
ム（HisTrap：アマシャム）にかけ、目的とする組換え
タンパク質（recombinant GtTIP）を精製した。精製し
た組換えタンパク質（recombinant GtTIP）に連結して
いるヒスチジンタグをエンテロキナーゼによって切断
後、上記のニッケル結合親和性カラムによって除去した
画分を精製 GtTIPとした。

【００７６】上記の方法で大腸菌培養液 1L から 1 mg
の精製 GtTIP を得た。SDS-PAGEによる電気泳動後、CBB
染色により精製GtTIPを確認した。さらに、精製GtTIPに
対するペプチド抗体（CVSMVGATFSPASSFRSK あるいは C
LAIATDAGIKEAVKTE にKLHをコンジュゲートしたものを抗
原として用いた。）を作成し（サワディーテクノロジー
社；カスタムサービス）、ウエスタンブロット解析を行
ったところ、CBB染色と同一の位置にバンドが検出され
た（図１）。

【００７７】さらに、精製されたGtTIPのアミノ酸配列
をプロテインシーケンサー（モレキュラーバイオアナラ
イザー：ABI180）を用いて調べたところ、配列番号２に
示す配列であった。こうして形質転換体を用いることに
より、本発明のリンドウ由来のGt TIPは大量生産が可能
となった。

【００７８】［実施例３］GtTIPによるタンパク質翻訳
阻害活性の確認 タンパク質翻訳阻害活性の測定は Biotin in vitro tra
nslation kit (ロッシュ) を用いて行った。キット付属
のγ-グロブリン RNA を鋳型にした翻訳系に、精製GtTI
P を 0.2、10、20、100、200 オg/mL 添加し、30℃、１
時間静置培養した。その後、反応溶液を SDS-PAGE、PVD
F 膜へ転写し、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジ
ン（ロシュ）によって翻訳されたγ-グロブリンの検出
を行った。

【００７９】精製GtTIPのタンパク質翻訳阻害活性につ
いて調査したところ、濃度に依存してタンパク質の翻訳
が阻害される翻訳阻害活性が認められた（図２）。以上
の結果、本発明のGt TIPは、動物由来のリボゾーム不活
化タンパク質やRNase等と同様に、in vitro でのタンパ
ク質の翻訳を阻害することが証明された。なお、こうし
たタンパク質翻訳阻害タンパク質の植物からの単離は世
界で初めてである。

【００８０】［実施例４］リンドウゲノム DNA のサザ
ンブロット解析 １）ゲノムDNA調製 継代培養し、増殖させたリンドウ葉茎から CTAB 法（Fo
cus 12 : 13-15(1990)）によってゲノム DNA を調製し
た。すなわち、５ｇのリンドウ茎葉を液体窒素で凍結
後、乳鉢、乳棒にて摩砕し、2×CTAB溶液（2％Cetyl tr
imethyl ammoniumbromide (CTAB)、0.1M Tris-HCl、1.4
M NaCl、1% PVP、pH8.0）10mLを混合した。55℃で10分
間インキュベート後、クロロホルム／イソアミルアルコ
ール（24：1）を5mL添加し、30分間室温にて振とうし
た。3500rpm で遠心分離後、水層部（上清）を回収し、
1／10容量の10％CTAB溶液（10％CTAB、0.7M NaCl）を加
え、転倒混和後、等量の沈殿バッファー（1％CTAB、5 m
M Tris-HCl、10 mM EDTA、pH8.0）を加え、30分間室温
にて転倒混和した。7000rpm で遠心分離後、沈澱部を5m
Lの1M NaCl-TE（1M NaCl、10 mM Tris-HCl、1mM EDTA、
pH8.0）により55℃で溶解し、イソプロパノール5mLを加
えた。再度、転倒混和後、3500rpm で遠心分離し、沈澱
部を5mLの70％エタノールでエタノール沈澱を行い、沈
澱部を乾燥後、500μLのTEに溶解した。その後、RNase
（1μg/mL） 処理を行い、混入した RNAを除去後、フェ
ノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25:24:
1）により抽出し、エタノール沈澱を行い、沈澱部を乾
燥後、500μLのTEに溶解してゲノムDNAを得た。

【００８１】２）ハイブリダゼーション 上記で得られた、ゲノムDNA を制限酵素 BamHI、EcoRI
で消化し、その分解産物を１％アガロースゲル電気泳動
に供した。泳動後、DNA断片をハイボンドN+メンブラン
（アマシャム社製）にトランスファーし、そのメンブラ
ンを高SDSハイブリダイゼーションバッファー（7%SDS、
50%ホルムアミド、5×SSC、2％ブロッキング試薬、50mM
リン酸ナトリウム、0.1％N-ラウリルサルコシン、pH7.
0）中に42℃で１時間以上プレハイブリダイゼーション
した。

【００８２】次いで、プローブとしてリンドウ由来のGt
TIP遺伝子の全長cDNAをDIG（ジゴキシゲニン）発光検
出キット（ロシュ・ダイアグノステックス社製）を用い
てDIG標識した後、上記DNAとハイブリダイゼーションし
た。即ち、ハイブリダイゼーションは標識プローブを含
む高SDSハイブリダイゼーションバッファー中で、42
℃、16時間浸積することにより行った。次いで、2×SS
C、0.1％SDS中で50℃にて2回、0.1×SSC、0.1％SDS中で
68℃にて2回、メンブランを洗浄した。その後、アルカ
リフォスファターゼ標識した抗DIG抗体で処理し、オー
トラジオグラムを取ってプローブとハイブリダイズした
バンドを調べた。その結果、何れの制限酵素でも３本以
上のバンドが認められた（図３）。このことから、Gt T
IP遺伝子は遺伝子ファミリーを形成していることが予測
された。

【００８３】［実施例５］Gt TIP遺伝子産物の抗ウイル
ス活性評価 Gt TIPの抗ウイルス活性は半葉法によって行った。N 遺
伝子を保有するタバコ品種サムスン NN の右半葉にリン
酸バッファーに懸濁した ToMV（1μg/mL）、左半葉に0.
01〜500μg／mLの濃度に調整した精製 GtTIP と ToMV
（1μg/mL）を混合し、カーボンランダムを用いて接種
した。接種３日後に、形成されたえそ斑数を測定した。

【００８４】その結果、精製Gt TIP の濃度に依存して
ウイルス病斑（えそ斑）の形成が抑制され、 1μg／mL
以上の濃度ではウイルス病斑の形成が完全に阻害される
ことが確認された（表４、図４）。以上より、Gt TIPは
タンパク質阻害活性に加えて、抗ウイルス活性をも有す
ることが確認された。

【００８５】

【表４】GtTIPのトマトモザイクウイルス（ ToMV） に
対する抑制効果

【００８６】［実施例６］植物へのGt TIP遺伝子導入用
組換えベクターの構築 １）組換えベクター p35S GtTIP の構築 本発明の抗ウイルス活性タンパク質遺伝子GtTIP を含む
プラスミド10μｇを制限酵素 SalI とBamHI のそれぞれ
10 単位で消化した後、断片をアガロースゲル電気泳動
により分画し、約 800 bP のバンドをアガロースゲルか
ら切り出した。このゲルより Quiaprep. gel extractio
n kit（キアゲン社製）を用いて 800 bpの GtTIP 遺伝
子を含むDNA断片を得た。

【００８７】一方、CaMV35S（カリフラワーモザイクウ
イルス）プロモーターとNOS（ノパリン合成酵素）ター
ミネーターを含むプラスミドベクターDNA 10μg を TE
バッファー中で 10 単位 ずつの制限酵素 BamHI と Sal
I で消化した後、断片をアガロースゲル電気泳動によ
り分画し、約 4.5 kb のバンドをアガロースゲルから切
り出した。このゲルより Quiaprep. gel extraction ki
t（キアゲン社製）を用いて 消化されたプラスミドを回
収した。

【００８８】上記のようにして得られたGtTIP 遺伝子を
含む DNA 断片とベクター DNA 断片を各 5μL ずつを混
合し、本 DNA 混合液と等量のライゲーション溶液（DNA
ligation kit (Takara 社製) ）を加えることにより連
結させた。この連結反応液のうちの 2μL を市販の大腸
菌コンピテントセル DH5α（TOYOBO 社製） 100 μLと
混合し、氷中で 30 分間、 42 ℃で 45 秒間、さらに氷
中に１分間放置した。得られた大腸菌の形質転換体を含
む溶液に、LB 培地 (１％ Bacto trypton、0.5% Bact
yeast extract、0.5 % NaCl、0.1% グルコース、pH
7.5) 100 mL を加えて、37 ℃で１時間培養した後、ス
ペクチノマイシン 50 mg/Lを有するLB 寒天培地にプレ
ーティングした。翌日、培地上に出現したコロニーのう
ち白色のコロニーの中から１つを選抜し、スペクチノマ
イシン 50 mg/Lを含む LB 液体培地で 37 ℃、約 6〜12
時間振盪培養した。この培養液から Quiaprep. minipr
ep.kit（キアゲン社製） を用いてプラスミドを調製
し、各種の制限酵素を用いて消化した後、アガロースゲ
ル電気泳動で解析を行うことにより、CaMV35Sプロモー
ターの下流にGtTIP 遺伝子が正常に連結されているプラ
スミドを選択し、これを植物への遺伝子導入用組換えベ
クター p35SGtTIP（図５）とした。

【００８９】2）バイナリーベクターpEbisTIPKBの構築 バイナリープラスミドベクター pEBisKB の 10 μg
およびプラスミドベクターp35SGtTIP 10 μｇの DNA を
TE バッファー中で 10 単位 ずつの制限酵素SSeI で消
化した後、飽和フェノール抽出を２回行うことにより制
限酵素を除いた。この抽出液に 100 分の１容の3 M 酢
酸ナトリウム、2 倍容のエタノールを加え、- 20 ℃に
6 時間放置した。この溶液を 1,500 rpm、4℃で10分間
遠心分離し、得られた沈殿を減圧下で乾燥させ、10 μL
の TE に溶解し、DNA ligation kit (Takara 社製) に
より連結させた。この連結反応液のうち、10 μL を市
販の大腸菌コンピテントセル DH5α（TOYOBO 社製） 10
0 μL と混合し、氷中で30 分間、 42 ℃で 45 秒間、
さらに氷中に１分間放置した。こうして得た大腸菌の形
質転換体を含む溶液に、LB 培地 (前述) 100 mL を加え
て、37 ℃で１時間培養した後、スペクチノマイシン 10
0 mg/L、カナマイシン50mg/Lを含有するLB 寒天培地に
プレーティングした。翌日、培地上に出現したコロニー
のうち白色のコロニーの中から１つを選抜し、スペクチ
ノマイシンとカナマイシンを含む LB 液体培地中で 、3
7 ℃、約 6〜12 時間振盪培養した。この培養液から Q
uiaprep. miniprep. kit（キアゲン社製）を用いてプラ
スミドを調製し、各種の制限酵素を用いて消化してアガ
ロースゲル電気泳動により解析を行うことにより、GtTI
P 遺伝子が正常に連結されているプラスミドを選択し
た。これを植物への遺伝子導入用組換えベクター pEbis
TIPKB（図６）とし、公知の方法にしたがい、アグロバ
クテリウム（A.tumefaciens） にトランスフォームし
た。

【００９０】［実施例７］タバコへのGtTIP遺伝子 の導
入 １）タバコへのpEbisTIPKBの導入 （１）タバコ植物体の育成 タバコ（Nicotiana tabacum SR1）の完熟種子を１％次
亜塩素酸で消毒後、ＭＳ培地（MS培地、3%ショ糖、0.9%
寒天）に置床して発芽・伸長を誘発した。１〜２ヶ月
間培養後、アグロバクテリウムに感染可能な十分に展開
した葉を得た。

【００９１】（２）バイナリーベクター pEbisTIPKBの
タバコへの導入 十分展開したタバコの葉を外植片として約１ｃｍ四方に
切断し、抗生物質スペクチノマイシン200mg/L、カナマ
イシン30mg/Lを含むYEB培地で、28℃、１夜培養したpEB
isTIPKBを有するアグロバクテリウム菌液にその外植片
を約１分間浸漬し、付着した余分な菌液を濾紙で軽く拭
い取りMS培地上に移し、25℃、弱光下で２日間共存培養
した。

【００９２】（３）形質転換細胞の選抜および植物体再
生 共存培養後の葉外植片を再分化培地（MS培地、３％ショ
糖、１mg/mL BAP、0.1mg/L NAA、500mg/Lカルベニシリ
ン、５ mg/L ビアラフォス、0.9 % 寒天）に移し、１ヶ
月後、カルス上に生じた不定芽を切り出し、発根培地
（MS培地、500mg/Lカルベニシリン、５ mg/L ビアラフ
ォス、0.9 % 寒天）に置床し、発根を誘導した。こうし
て抗生物質ビアラフォスに抵抗性のタバコ幼植物体９系
統を得た。

【００９３】（４）形質転換体の馴化育成、採種 上記で得られたビアラフォス耐性タバコをバーミキュラ
イトを充填した鉢に移植し、湿潤条件下（湿度約100%）
で１〜２週間栽培した。徐々に湿度を低下させて外気環
境に馴化させた。馴化したタバコ植物は、栽培土（サカ
タソイルミックス）を充填した鉢に移植し、閉鎖型温室
で栽培を続け開花させた。自家受粉を行い、Ｔ１世代の
種子を採種した。

【００９４】（５）形質転換体のホモ化系統の作出 上記で得られたＴ１世代の種子をビアラフォス5mg／Lを
含有する発芽培地に播種し、ビアラフォス耐性の実生個
体を選抜した。上記（４）と同様にして、馴化育成し、
自家受粉を行い、Ｔ２世代の種子を採種した。同様にＴ
２世代の栽培を行い、自家受粉によりＴ３世代のホモ化
された種子を得た。

【００９５】［実施例８］ GtTIP遺伝子を導入した形質
転換タバコにおけるウイルス病抵抗性評価 １）GtTIP遺伝子を導入した形質転換タバコにおけるノ
ザンブロット解析 GtTIP遺伝子を導入した形質転換タバコ９系統および非
形質転換タバコSR1の葉より前述の方法により全RNAを抽
出し、ノザンブロット解析を行った。プローブには、サ
ザンブロット解析で用いたものと同様にGtTIP遺伝子全
長を用いた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄も同条
件で行った。その結果、９系統全ての形質転換体でGtTI
P遺伝子の発現を示すバンドが確認された（図７）。

【００９６】２）GtTIP遺伝子を導入した形質転換タバ
コの抗ウイルス活性評価 上記で得られたGtTIP遺伝子を発現している形質転換体
の系統番号１と系統番号４の各20個体について、トマト
モザイクウイルス（ToMV）に対する抵抗性を調査した。
形質転換タバコは温室で展開葉４〜５枚となる時期まで
育成した。各個体の下位の展開葉２枚にToMV（１μg／m
L）をカーボンランダムを用いて綿棒で接種し、ウイル
ス病徴（モザイク症状）の上位葉における発生個体数を
経時的に調査し、ToMVの上位葉への移行個体率を求め
た。その結果、図８に示すとおり、形質転換タバコで
は、野生株SR1と比較してToMVの上位葉への移行の遅延
が観察された。

【００９７】

【発明の効果】本発明の抗ウイルス活性タンパク質遺伝
子（Gt TIP遺伝子）を用いれば、植物のウイルス性病害
を軽減若しくは防除することができる。さらに、該遺伝
子を導入した形質転換体を用いることにより、本発明の
抗ウイルス活性タンパク質の大量生産が可能であり、該
タンパク質は抗ウイルス剤の開発に利用し得る。

【００９８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Iwate Prefecture <120> New antivirus proteins from Gentiana triflora and genes thereof <130> P02-0181 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 784 <212> DNA <213> Gentiana triflora <400> 1 agccaaagaa gccgtcgtat aagcagaatc gttacggtcg acgacgtaga agcatttaaa 60 ctagactact gagtagtgag aaagctagta agggaacgtg acaatggctt cgacggcggc 120 ggcagcggca gcaaactttt tatcgacggc aatggacgtc ggtgcactgc ggtctctagc 180 tcctcaagca cctggcttca actgcgtttc aatggtcggc gctactttca gcccagcttc 240 gtcattccgt tcaaagccct tcccttgctt ggccattgct actgacgccg gcatcaagga 300 ggctgttaag acggaaaagg ctcctgctgc gttggggccg tattctcaag ctatcaaatc 360 aaacaatctg gtttttgtat ctggtgtgct tggtcttatc ccagagactg gaaagttcgt 420 ttcagatagc gtggaggaac agactgagca ggttatgaag aatatgggtg agatactgaa 480 ggcaagtgga gctagctact cttccgtggt taagaccaca atcatgttgg ctgacttgaa 540 cgactttaaa aaagtcaacg atatttatgc taaatatttc agttcgccag caccggcacg 600 ttcaacttac caggtggctg cactaccgtt gaatgctagg attgaaatcg aatgcattgc 660 tgtgctgtaa atcccatttg caaactaggt ttttttgtgc tgtagtactg tatcattttg 720 gaacccttct atagacgaga cttgcaagga ttagttcata aataatggca tgttttactt 780 tatg 784 <210> 2 <211> 188 <212> PRT <213> Gentiana triflora <400> 2 Met Ala Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asn Phe Leu Ser Thr Ala 1 5 10 15 Met Asp Val Gly Ala Leu Arg Ser Leu Ala Pro Gln Ala Pro Gly Phe 20 25 30 Asn Cys Val Ser Met Val Gly Ala Thr Phe Ser Pro Ala Ser Ser Phe 35 40 45 Arg Ser Lys Pro Phe Pro Cys Leu Ala Ile Ala Thr Asp Ala Gly Ile 50 55 60 Lys Glu Ala Val Lys Thr Glu Lys Ala Pro Ala Ala Leu Gly Pro Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Ala Ile Lys Ser Asn Asn Leu Val Phe Val Ser Gly Val Leu 85 90 95 Gly Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys Phe Val Ser Asp Ser Val Glu Glu 100 105 110 Gln Thr Glu Gln Val Met Lys Asn Met Gly Glu Ile Leu Lys Ala Ser 115 120 125 Gly Ala Ser Tyr Ser Ser Val Val Lys Thr Thr Ile Met Leu Ala Asp 130 135 140 Leu Asn Asp Phe Lys Lys Val Asn Asp Ile Tyr Ala Lys Tyr Phe Ser 145 150 155 160 Ser Pro Ala Pro Ala Arg Ser Thr Tyr Gln Val Ala Ala Leu Pro Leu 165 170 175 Asn Ala Arg Ile Glu Ile Glu Cys Ile Ala Val Leu 180 185 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 agttttccca gtcacgac 18 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 agccaaagaa gccgtcgtat aagcagaatc 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 acggtcgacg acgtagaagc atttaaacta 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 tcataaagta aaacatgcca ttatttatga 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 aatccttgca agtctcgtct atagaagggt 30 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 cgcggatccg atggcttcga cggcggcggc agcggcagca 40 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 cggggtacct tacagcacag caatgcattc gatttcaat 39

【００９９】

【配列表フリーテキスト】配列番号3−人工配列の説
明：プライマー 配列番号4−人工配列の説明：プライマー 配列番号5−人工配列の説明：プライマー 配列番号6−人工配列の説明：プライマー 配列番号7−人工配列の説明：プライマー 配列番号8−人工配列の説明：プライマー 配列番号9−人工配列の説明：プライマー

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、大腸菌で大量発現させたGtTIPの電気
泳動およびウエスタンブロット解析結果を示す（図中、
左レーン：CBB染色、右レーン：GtTIP抗体によるウエス
タンブロット、矢印：精製したGtTIP）。

【図２】図２は、GtTIPによるタンパク質の翻訳阻害活
性を示す。

【図３】図３は、GtTIPのサザンブロット解析の結果を
示す（図中、Ｂ：制限酵素BamHI、Ｅ：制限酵素ＥcoR
1）。

【図４】図４は、GtTIP遺伝子のトマトモザイクウイル
ス（ToMV）に対する抑制効果を示す（図中、左半葉：精
製GtTIPとToMV（１μg／mL）の混液接種区、右半葉：リ
ン酸バッファーとToMV（１μg／mL）の混液接種区（対
照））。

【図５】図５は、プラスミドp35SGtTIPの構造の模式図
を示す。

【図６】図６は、プラスミドpEbisTIPKBの構造の模式図
を示す。

【図７】図７は、GtTIP遺伝子を導入した形質転換タバ
コ（Ｔ３世代）のノザンブロット解析結果を示す。

【図８】図８は、GtTIP遺伝子を導入した形質転換タバ
コ（Ｔ３世代）へのトマトモザイクウイルス（ToMV）接
種試験における、防除効果を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (72)発明者 中塚 貴司 岩手県北上市若宮町二丁目３番地14号 ピ ースフルハウスＩＩＩ Ｅ号 (72)発明者 塚谷 延枝 岩手県北上市上野町一丁目26番地127号 イーグルＫ202号 (72)発明者 鈴木 一実 岩手県北上市中野町二丁目24番地７号 コ ーポすがわら102号 (72)発明者 山村 三郎 岩手県北上市新穀町一丁目６番地27号 メ ルベイユ北上１−404号 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD13 CD14 CD21 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 DA05 DA06 DA11 EA04 GA11 HA08 4B064 AG01 CA02 CA05 CA11 CA19 CC24 DA11 4B065 AA01X AA26X AA57X AA87X AA89Y AB01 BA02 BB19 BB37 CA24 CA47 CA53 4H045 AA10 AA20 AA30 BA09 CA30 EA05 EA06 FA74

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（a）又は（b）の組換えタンパク
   質。 （a）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 （b）配列番号2で表されるアミノ酸配列において1又は
   数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
   酸配列からなり、かつ抗ウイルス活性を有するタンパク
   質
2. 【請求項２】以下の（a）又は（b）の抗ウイルス活性タ
   ンパク質をコードする遺伝子。 （a）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 （b）配列番号2で表されるアミノ酸配列において1又は
   数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
   酸配列からなり、かつ抗ウイルス活性を有するタンパク
   質
3. 【請求項３】以下の（c）又は（d）のDNAからなる遺伝
   子。 （c）配列番号1で表される塩基配列からなるDNA （d）配列番号1で表される塩基配列からなるDNAと相補
   的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下
   でハイブリダイズし、かつ抗ウイルス活性を有するタン
   パク質をコードするDNA
4. 【請求項４】請求項２又は３記載の遺伝子を含有する組
   換えベクター。
5. 【請求項５】請求項２又は３記載の遺伝子を導入して得
   られる形質転換体。
6. 【請求項６】請求項２又は３記載の遺伝子を導入して得
   られる形質転換植物。
7. 【請求項７】請求項５記載の形質転換体を培養し、得ら
   れる培養物から抗ウイルス活性タンパク質を採取する、
   又は、請求項６記載の形質転換植物を栽培し、得られる
   植物体から抗ウイルス活性タンパク質を採取する、抗ウ
   イルス活性タンパク質の製造方法。
8. 【請求項８】請求項１記載の抗ウイルス活性タンパク質
   を有効成分として含む抗ウイルス剤。