JP2003235598A - 無細胞系タンパク質合成用抽出液、およびそれを用いた無細胞系タンパク質合成方法、ならびに該抽出液の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 調製が容易であり、糖タンパク質の合成も可
能な無細胞系タンパク質合成を実現し得る新規な無細胞
系タンパク質合成用抽出液、およびその調製方法、なら
びに当該抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成方
法を提供する。 【解決手段】 カイコ組織由来の抽出物と、外来ｍＲＮ
Ａとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用抽
出液、およびそれを用いた無細胞系タンパク質合成方
法、ならびに、カイコ組織から抽出用液を用いて抽出し
たカイコ組織由来の抽出物に、外来ｍＲＮＡを添加する
無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、無細胞系のタンパ
ク質合成に使用できる抽出液、およびその調製方法、な
らびに当該抽出液を使用した無細胞系でのタンパク質合
成方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺
伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲ
ノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク
質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これら
の遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、
利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単
に合成することが必要となってくる。

【０００３】現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子
組換え技術によって酵母や昆虫細胞などの生細胞を用い
る発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く
利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持する
ために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細
胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないな
ど発現が困難なタンパク質も多い。

【０００４】一方、細胞系を使用しないタンパク質の生
産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを
加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り
揃え、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを用い
て、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させるこ
とのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質
合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合
成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受
けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を
行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操
作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質
の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質
合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からな
るタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な
発現方法であると期待されている。このような無細胞系
のタンパク質合成としては、たとえば、小麦胚芽の抽出
液や大腸菌の抽出液を用いる方法が知られている。

【０００５】しかし、小麦胚芽の抽出液を用いた無細胞
系のタンパク質合成では、抽出液の抽出操作が一般に極
めて煩雑であるという欠点がある。小麦胚芽の抽出液の
調製方法の一例として、たとえば、特許文献１には、以
下のような手順が記載されている。小麦種子をミルに添
加し、破砕した後、篩で粗胚芽画分を得、四塩化炭素と
シクロヘキサン混液（四塩化炭素：シクロヘキサン＝
２．５：１）を用いた浮選によって、発芽能を有する胚
芽を浮上する画分から回収し、室温乾燥によって有機溶
媒を除去する。この胚芽画分に混在する種皮などの不純
物を静電気帯電体を用いて吸着除去する。次に、この試
料から小麦胚乳成分を完全に除去するため、非イオン性
界面活性剤であるＮＰ４０の０．５％溶液に懸濁し、超
音波洗浄器を用いて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄
を繰り返す。蒸留水の存在下に再度１回の超音波洗浄を
行い、小麦胚芽を純化する。このように小麦胚芽の抽出
液を用いた無細胞系タンパク質合成では、抽出液の調製
が煩雑であり、多大な時間と労力を要するという不具合
がある。

【０００６】また大腸菌の抽出液を用いた無細胞系タン
パク質合成では、大腸菌が原核生物であるため、タンパ
ク質への糖鎖修飾を行うことができず、糖タンパク質を
合成することができないという欠点がある。上記糖鎖修
飾によりタンパク質に付加される糖鎖は、物質間や細胞
間の認識や接着に関与するシグナルやリガンドとして、
タンパク質自身の機能調節因子として、またはタンパク
質の保護や安定化因子として機能しているものと考えら
れる。そのため、糖鎖修飾を受けるタンパク質について
生体内の機能を解析するためには、糖鎖修飾を受けたタ
ンパク質（糖タンパク質）を取得することが必要であ
り、タンパク質への翻訳の後に糖鎖修飾も行えるような
無細胞系のタンパク質合成が望まれている。

【０００７】

【特許文献１】特開２０００−２３６８９６号公報

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記課題を
解決するためになされたものであって、その目的とする
ところは、調製が容易であり、糖タンパク質の合成も可
能な無細胞系タンパク質合成を実現し得る新規な無細胞
系タンパク質合成用抽出液、およびその調製方法、なら
びに当該抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成方
法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意研究を行った結果、カイコ組織由来
の抽出物と、外来ｍＲＮＡとを少なくとも含有する抽出
液が、調製が容易であるとともに、それを用いた無細胞
系のタンパク質合成において大量のタンパク質合成が可
能であることを見出し、本発明を完成するに至った。す
なわち、本発明は以下のとおりである。 （１）カイコ組織由来の抽出物と、外来ｍＲＮＡとを少
なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液。 （２）さらに、プロテアーゼインヒビターを含有する上
記（１）に記載の抽出液。 （３）カイコ組織由来の抽出物の含有量が、タンパク質
濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬである、上記
（１）または（２）に記載の抽出液。 （４）カイコ組織が、カイコ幼虫の後部絹糸腺を少なく
とも含有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抽
出液。 （５）カイコ組織が、カイコ幼虫の脂肪体を少なくとも
含有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抽出
液。 （６）カイコ組織が、カイコの胚を少なくとも含有する
上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抽出液。 （７）プロテアーゼインヒビターがフェニルメタンスル
ホニルフルオリドである、上記（２）〜（６）のいずれ
かに記載の抽出液。 （８）カイコ組織由来の抽出物と、プロテアーゼインヒ
ビターとを少なくとも含有することを特徴とする無細胞
系タンパク質合成用液状組成物。 （９）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の抽出液を
使用した無細胞系タンパク質合成方法。 （１０）カイコ組織から抽出用液を用いて抽出したカイ
コ組織由来の抽出物に、外来ｍＲＮＡを添加することを
特徴とする、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方
法。 （１１）抽出用液がプロテアーゼインヒビターを少なく
とも含有するものである上記（１０）に記載の調製方
法。 （１２）カイコ組織から抽出用液を用いて抽出したカイ
コ組織由来の抽出物に、液状フィブロインを除去する処
理を施すことを特徴とする上記（１０）または（１１）
に記載の調製方法。

【００１０】なお本明細書において「カイコ」は、カイ
コガ科に属する鱗翅目昆虫（絹糸昆虫）と同義であり、
その一生において「卵（胚）」（産卵直後より孵化直前
までの間）、「幼虫」（孵化直後から繭の形成終了直前
（１齢期〜５齢期に分けられる））、「蛹」（繭の形成
終了直前から羽化する直前までの間）、ならびに「成虫
（蛾）」（羽化直後より死亡までの間）の各状態を経る
ものであり、その一生にわたる形態のいずれをも含むも
のとする。カイコは、卵より孵化した後の幼虫の状態で
は、桑を食べて発育する期間（齢）と、食べずに脱皮の
準備をする期間（眠）を交互に繰り返す。カイコの幼虫
において、孵化してから１回目の脱皮までを１齢期、１
回目の脱皮から２回目の脱皮までを２齢期といい、通
常、４回脱皮して５齢期で成熟する（この成熟した状態
のカイコ幼虫は「熟蚕」とも呼ばれる）。カイコの幼虫
は、熟蚕になると体が透明になり絹糸を吐いて繭を形成
し、蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。

【００１１】本明細書における「絹糸腺」は、カイコ幼
虫の両体側において、頭部の下唇先端に位置する吐出口
から盲管にまで連なる一対の管状の外分泌腺であり、前
部絹糸腺、中部絹糸腺および後部絹糸腺に大きく分けら
れる。後部絹糸腺は、絹糸の中心部を為すフィブロイン
を分泌する。また中部絹糸腺は、セリシンを分泌する。
フィブロインは中部絹糸腺に蓄積されるとともに、セリ
シンによってその外周を覆われて、ゲル状の絹物質とな
る。この絹物質は、前部絹糸腺を通って吐出口から排出
され、固体化して絹糸となる。

【００１２】本明細書における「脂肪体」は、カイコ幼
虫において、体内の至るところに分布し、白色の柔らか
い扁平な帯状、ひも状あるいは葉状の組織である。脂肪
体は、ヒトの肝臓に似て栄養、エネルギー源を貯蔵する
役目を果たしているので、細胞内には脂肪球、タンパク
質、グリコーゲンその他の新陳代謝に関係する種々の物
質を含んでいる。

【００１３】本明細書における「胚」は、カイコの卵の
状態の組織を指すものとする。

【００１４】本明細書における「無細胞系タンパク質合
成」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成
する無細胞翻訳系によるタンパク質合成を指すものとす
る。ここで、本発明の合成方法によって無細胞系で合成
される「タンパク質」は、複数のアミノ酸残基から構成
される任意の分子量のペプチド、すなわち低分子量のペ
プチドから高分子量のいずれをも包含するものとする。
また本明細書でいう「タンパク質」は、糖鎖修飾されて
なる糖タンパク質も含む。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抽出液における「カイコ組織由来の抽出物」
は、カイコの一生のうちのどの状態（卵、幼虫（１齢期
〜５齢期）、蛹、成虫）のいずれの組織由来であってよ
い。またカイコ組織は、単一の状態における単一の組織
（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺の
み）由来に限らず、単一の状態における複数の組織（た
とえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺および
脂肪体）由来であってもよく、複数の状態における単一
の組織（たとえば、３齢期、４齢期、５齢期の各カイコ
幼虫における後部絹糸腺）由来であってもよいものとす
る。無論、複数の状態における複数の組織由来であって
もよい。なお上記「カイコ組織由来の抽出物」は、カイ
コの組織の全体（たとえば、後部絹糸腺全体）からの抽
出物である必要はない。

【００１６】本発明の抽出液中におけるカイコ組織由来
の抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度
で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであるのが好まし
く、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであるの
がより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度
で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、本発明の作用に必須な成
分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞
があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク
質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高
い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。

【００１７】なお上記範囲の量のカイコ組織由来の抽出
物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を
利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当
分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ
Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ
社製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを
０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎ
ｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行
う。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を使用する。

【００１８】上記カイコ組織としては、カイコ幼虫の後
部絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なく
ともいずれかであることが望ましい。抽出液中にカイコ
幼虫由来の後部絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選
ばれる少なくともいずれか由来の抽出物が含有されてい
るか否かは、たとえばアルドラーゼについてのアイソザ
イム解析を行うことによって判別することができる（Na
gaokaら(1995)、Insect Biochem Mol Biol. 25, 819-82
5）。

【００１９】カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出物を少
なくとも含有すると、短時間で大量のタンパク質が合成
可能であるというような特に優れた利点を有する無細胞
系タンパク質合成用抽出液を実現できる上で好ましい。

【００２０】カイコ幼虫の脂肪体由来の抽出物は、脂肪
体が柔らかい組織であるために、すり潰す作業が短時間
で済み、結果として容易に抽出液を調製できる、という
ような特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成
用抽出液を実現できる上で好ましい。なお５齢期の脂肪
体については、上記アイソザイム解析以外に、抽出液を
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて脂肪体由来のタンパ
ク質であるＳＰ−１、ＳＰ−２などを検出することによ
っても、抽出液中に含有されているか否かを判別するこ
とができる。

【００２１】カイコの胚由来の抽出物は、胚が１つの個
体であるために、他の組織とは異なり摘出する作業を要
さず、結果として容易に抽出液を調製できる、というよ
うな特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用
抽出液を実現できる上で好ましい。なおカイコの胚につ
いては、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をＳＤＳ
−ＰＡＧＥにかけて胚由来のタンパク質である３０Ｋ、
ＥＳＰ、Ｖｉｔｅｌｌｉｎ（Ｈ）、Ｖｉｔｅｌｌｉｎ
（Ｌ）などを検出することによっても、抽出液中に含有
されているか否かを判別することができる。

【００２２】抽出物がカイコ幼虫の後部絹糸腺または脂
肪体由来である場合、カイコ幼虫の１齢期〜５齢期のも
のであれば、特に制限なく本発明に使用できるが、当該
後部絹糸腺または脂肪体は、５齢期のカイコ幼虫由来で
あるのが好ましい。これは、５齢期のカイコ幼虫におい
ては、後部絹糸腺および脂肪体が１齢期〜５齢期のうち
で最も成熟しており、これを用いることで他の齢期のも
のと比べて短時間で大量のタンパク質合成が可能であ
る、というような利点を有する。中でも特に、絹糸の主
成分である絹フィブロインを活発につくり、高いタンパ
ク質合成能を有しているという観点から、本発明の抽出
液は、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺、中でも５齢期
の３日目〜７日目のカイコ幼虫の後部絹糸腺からの抽出
物を必須成分として含有していることが好ましい。

【００２３】また本発明の抽出液においては、外来ｍＲ
ＮＡが、上記のカイコ組織由来の抽出物とともに必須成
分として含有される。ここで、「外来ｍＲＮＡ」は、カ
イコ組織に由来しないｍＲＮＡを指し、カイコ組織に由
来しないｍＲＮＡであるならば、コードするタンパク質
（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタ
ンパク質をコードするものであってもよいし、また糖タ
ンパク質をコードするものであってもよい。なお、抽出
液において、含有されるｍＲＮＡが外来ｍＲＮＡである
かカイコ組織に由来するｍＲＮＡであるかは、まず、抽
出液中より、ｍＲＮＡを単離精製後、逆転写酵素により
ｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析
し、既知の外来ｍＲＮＡの塩基配列と比較することで判
別することができる。

【００２４】なお本発明に用いる外来ｍＲＮＡは、その
塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成
し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよ
い。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相
同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠
失、置換、挿入または付加されたものであってよい。

【００２５】当該抽出液中において、外来ｍＲＮＡは、
タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜１０
ｍｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１５μｇ／ｍＬ
〜１７００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。
外来ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０ｍｇ／ｍＬ
を越えると、これを用いたタンパク質合成の際にタンパ
ク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。

【００２６】このようなカイコ組織由来の抽出物と外来
ｍＲＮＡとを含有する抽出液を用いてタンパク質合成反
応を行うことによって、如何なるタンパク質、例えば生
細胞で細胞毒となるタンパク質であっても、短時間にて
合成することが可能となる。また、真核生物であるカイ
コ由来の抽出物を用いているため、糖タンパク質を無細
胞系で合成することも可能であり、特に制限されること
なく多くの種類のタンパク質を合成することができる。
さらに、このような抽出液は、後述するように従来の小
麦胚芽からの抽出液の調製と比較して、無細胞系タンパ
ク質合成に供することのできる抽出液を、格段に容易に
調製することができ、効率的な無細胞系タンパク質合成
を実現できる。

【００２７】また本発明の抽出液は、上記のカイコ組織
由来の抽出物および外来ｍＲＮＡに加えて、プロテアー
ゼインヒビターをさらに含有することが好ましい。プロ
テアーゼインヒビターをさらに含有することによって、
調製が容易であり、タンパク質（糖タンパク質も含む）
の合成を効率的に行うことができ、無細胞系タンパク質
用として非常に有用な抽出液を提供することができる。
これは、プロテアーゼインヒビターによりカイコ組織由
来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害さ
れ、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパク質
の不所望な分解を防止でき、結果としてカイコ組織由来
の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すこ
とができるようになるためであると考えられる。

【００２８】このようなプロテアーゼインヒビターとし
ては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるなら
ば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニ
ルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがあ
る。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペ
プスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシス
クシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エ
チレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用する
ことができるが、カイコ組織由来の抽出液にはセリンプ
ロテアーゼが含まれることから、上記中でも、セリンプ
ロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働
くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。また、１種類のプ
ロテアーゼインヒビターのみならず、数種類のプロテア
ーゼインヒビターの混合物（プロテアーゼインヒビター
カクテル）を用いてもよい。

【００２９】当該抽出液中におけるプロテアーゼインヒ
ビターの含有量に特に制限はないが、本発明の作用に必
須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、
１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１
ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテア
ーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼ
の分解活性を充分抑えることができない傾向にあるため
であり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越
えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるため
である。

【００３０】また本発明の抽出液は、上記の抽出物、外
来ｍＲＮＡおよびプロテアーゼインヒビターに加えて、
カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトールおよ
び緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。これによ
り、本発明の作用に必須な成分を安定に保つことができ
る、というような利点をさらに有する無細胞系タンパク
質合成用の抽出液を実現できる。

【００３１】上記カリウム塩としては、本発明の作用を
阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえ
ば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩
化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カ
リウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化
カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用す
ることができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ま
しい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助
因子として作用する。

【００３２】当該抽出液中におけるカリウム塩の含有量
に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば
酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍ
Ｍ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜
２００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩
が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク
質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためであ
る。

【００３３】上記マグネシウム塩としては、本発明の作
用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、た
とえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシ
ウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マ
グネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で
使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用す
るのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反
応における補助因子として作用する。

【００３４】当該抽出液中におけるマグネシウム塩の含
有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たと
えば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１
ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ
〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム
塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパ
ク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるため
である。

【００３５】上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴ
Ｔ」ということがある。）は、酸化防止の目的で配合さ
れるものであり、当該抽出液中において０．１ｍＭ〜１
０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ
含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未
満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須
な成分が不安定になる傾向にあるためである。

【００３６】上記緩衝剤は、抽出液に緩衝能を付与し、
たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こ
る抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止
する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特
に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン
酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳな
どを使用することができる。緩衝剤は、当該抽出液のｐ
Ｈが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好
ましく、ｐＨが６〜８に保持されるようなものを使用す
るのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨ
が１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性す
る虞があるためである。このような観点より、上記中で
もＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが特
に好ましい。

【００３７】当該抽出液中における緩衝剤の含有量に特
に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５
ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ
〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５
ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加により
ｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向
にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越える
と、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成
分が不安定になる傾向にあるためである。

【００３８】すなわち、本発明の抽出液は、後部絹糸
腺、脂肪体および胚のうちの少なくともいずれかの抽出
物をタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ
含有するとともに、１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの外
来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５００ｍＭの酢酸カリウム、
０．１ｍＭ〜１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ
〜１０ｍＭのＤＴＴ、１μＭ〜５０ｍＭのＰＭＳＦ、５
ｍＭ〜２００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）
を含有するように実現されるのが好ましい。

【００３９】本発明はまた、無細胞系タンパク質合成用
抽出液の新規な調製方法を提供する。本発明の抽出液の
調製方法は、カイコ組織から抽出用液を用いて抽出した
カイコ組織由来の抽出物に、外来ｍＲＮＡを添加して抽
出液とするものである。本発明の抽出液の調製方法にお
いては、カイコ組織からの抽出を行う処理を少なくとも
含有し、好ましくは、カイコ組織からの抽出後、精製を
行う。具体的には、次のような手順にて行う。

【００４０】まず、常法にしたがって、たとえばハサ
ミ、ピンセット、メスなどの器具を使用して、カイコよ
り所望の組織を摘出する。この摘出によって得る後述の
抽出に使用する組織量としては、特に制限はないが、通
常、１ｇ〜１００ｇの範囲内である。次に、摘出した組
織を、たとえば液体窒素で凍結した後、−８０℃で凍結
させた乳鉢を用いてすり潰し、抽出用液で抽出する。こ
こで使用する抽出用液は、従来公知の抽出に用いる緩衝
液を特に制限なく使用することができるが、好ましく
は、プロテアーゼインヒビター、カリウム塩、マグネシ
ウム塩、ＤＴＴおよび緩衝剤を含有するものを使用す
る。特に好ましくは、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳ
Ｆ、５０ｍＭ〜２００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ
〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤ
ＴＴ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ
６〜８）を含有する抽出用液を使用する。このようにし
て、まず、カイコの組織からの抽出物を含有する液状物
を得る。

【００４１】次に、上記抽出処理で得られた液状物を遠
心分離にかける。該遠心分離は、当分野において通常行
われている条件（１００００×ｇ〜５００００×ｇ、０
℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行う。本発明の調
製方法においては、該遠心分離を１回行った後の上清
（以下、「上清１」と呼ぶ。）をそのまま用い、これに
外来ｍＲＮＡを添加して抽出液とするようにしてもよい
（以下、「調製方法１」と呼ぶ。）し、また、該上清に
上記の条件にて再度の遠心分離を行い、得られた上清
（以下、「上清２」と呼ぶ。）に外来ｍＲＮＡを添加す
るようにしてもよい（以下、「調製方法２」と呼
ぶ。）。あるいは、上記遠心分離で得られた上清をゲル
濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光
度が１０以上の画分を分取する処理を行い、得られた液
状物に外来ｍＲＮＡを添加するようにしてもよい（以
下、「調製方法３」と呼ぶ。）。図１は、上記調製方法
１〜３を簡略化して示すフローチャートである。

【００４２】上記調製方法３を行う場合、具体的には以
下の手順にて行う。まず、遠心分離後の上清についてゲ
ル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム Ｐ
Ｄ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を好適
に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用
緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記
抽出用液にて溶出する、というような条件にて行えばよ
い。上記ゲル濾過用緩衝液は、上記抽出用液にグリセロ
ールを添加したものであることが好ましい。これによ
り、タンパク質合成に必須な成分を安定化できるという
ような利点がある。グリセロールは、通常、５（ｖ／
ｖ）％〜４０（ｖ／ｖ）％（好ましくは、２０（ｖ／
ｖ）％）となるように添加すればよい。

【００４３】ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル
濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画
分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を
効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６
ｍＬを１画分とするのが好ましい。

【００４４】次に、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍに
おける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理
は、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマ
シャムバイオサイエンス社製）などの機器を用いて、各
画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、
この吸光度が１０以上の画分を分取する。このようにし
て得られる画分に外来ｍＲＮＡを添加して、本発明の抽
出液を得る。なお本発明の抽出液は、上記２８０ｎｍに
おける吸光度が１０以上の複数の画分を混合したものに
外来ｍＲＮＡを添加したものであっても当然よい。

【００４５】また、本発明の抽出液は、タンパク質合成
能のより高い抽出液を得る観点からは、液状フィブロイ
ンを除去する工程を含有する以下の調製方法（以下、
「調製方法４」と呼ぶ。）によって、調製されるのが好
ましい。抽出液に液状フィブロインが混入していると、
この液状フィブロイン自体によって該抽出液を用いた後
述するタンパク質合成反応が阻害される虞があり、ま
た、カイコ組織中のタンパク質合成反応に必須な成分
（たとえば、リボソーム、アミノアシルｔＲＮＡシンテ
ターゼ、各種翻訳因子など）が液状フィブロイン中に取
り込まれてしまい、それら成分を抽出することが困難と
なり、結果として抽出液中に含有される必須成分量が減
少するため、タンパク質合成量が低下する虞があるため
である。また液状フィブロインの混入により、抽出液自
体の粘性が高くなってしまい、タンパク質合成反応が進
行しづらく、操作性も悪くなる虞もある。

【００４６】図２は、上記調製方法４を簡略化して示す
フローチャートである。具体的には、まず、ｐＨ４〜１
０の抽出用液を用いて上記の抽出を行った後、上述した
ようにして１回の遠心分離を行って得られた上清（上記
上清１）、再度の遠心分離を行って得られた上清（上記
上清２）、または該再度の遠心分離によって得られた下
層をインキュベーションした後、凍結させる。解凍後、
遠心分離して得られた上清（以下、「上清３」と呼
ぶ。）に、外来ｍＲＮＡを添加して抽出液とする。ある
いは、該上清３をゲル濾過して得られた濾液（２８０ｎ
ｍにおける吸光度が１０以上の画分）に、外来ｍＲＮＡ
を添加して抽出液とする。かかる調製方法４では、ま
ず、ｐＨ４〜１０の抽出用液を用いることで、カイコ組
織からの抽出の際に液状フィブロインを固化させ、その
結果、液状フィブロインが除去された抽出液を調製す
る。さらに、上記上清１、上清２または下層を、インキ
ュベーションした後凍結させる処理を行うことで、液状
フィブロインの固化をより進行させて、液状フィブロイ
ンを効果的に除去することが可能であり、かつ、液状フ
ィブロインに取り込まれていたタンパク質合成反応に必
須な成分を効率的に抽出することが可能である。

【００４７】上記調製方法４にて抽出液を調製する場
合、抽出用液としては、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ
６〜８、より好ましくはｐＨ６〜７のものを用いる。ｐ
Ｈ４未満の抽出用液を用いると、後述するタンパク質合
成反応に必須な成分が変性してしまう虞があるためであ
る。また、ｐＨが１０を越える抽出用液を用いると、上
記と同様にタンパク質合成反応に必須な成分が変性して
しまう虞があり、また液状フィブロインの固化が生じな
い虞もあるためである。

【００４８】上清１、上清２または上記下層のインキュ
ベーションの条件に特に制限はなく、従来より当業者が
通常行っている条件によって行えばよいが、インキュベ
ーションの温度は、４０℃以下が好ましく、３０℃以下
がより好ましい。該温度が４０℃を越えると、上記タン
パク質合成反応に必須な成分が変性してしまう傾向にあ
るためである。また、インキュベーション時間は、２４
時間以下であるのが好ましく、６時間以下であるのがよ
り好ましい。インキュベーションの時間が２４時間を越
えると、反応に必須な成分が変性してしまう虞があるた
めである。

【００４９】上記インキュベーション後の凍結も、従来
より当業者が通常行っている条件によって行えばよく特
に制限されるものではないが、−１０℃以下で凍結する
のが好ましく、−２０℃以下で凍結するのがより好まし
い。−１０℃よりも高い温度で凍結すると、上記タンパ
ク質合成反応に必須な成分が変性してしまう傾向にある
ためである。また、凍結時間は、７２時間以下であるの
が好ましく、４８時間以下であるのがより好ましい。７
２時間を越えて凍結しても、液状フィブロインの固化は
既に完了しており、更なる固化は期待できないためであ
る。

【００５０】解凍後の遠心分離の条件にも特に制限はな
く、たとえば、上記と同様の１００００×ｇ〜５０００
０×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間の条件で行
えばよい。該遠心分離で得られた上清（上清３）に、そ
のまま外来ｍＲＮＡを添加するか、あるいは、該上清３
をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおけ
る吸光度が１０以上の画分を分取する処理を行い、得ら
れた液状物に外来ｍＲＮＡを添加すればよい。上記ゲル
濾過および画分の分取処理を行う場合には、上述したの
と同様に行えばよい。

【００５１】所望の量の上記抽出物を含有する抽出液を
得るためには、通常、複数体のカイコより抽出する必要
がある。抽出に供するカイコの数は、使用するカイコの
状態や個体差によっても異なるが、カイコ幼虫について
は、繭の形成期に近づくにつれて組織の成熟に伴って、
同量の抽出物を得るために要する数は少なくて済む。特
に絹糸腺は、５齢期のカイコ幼虫において日を追うごと
に著しく成熟するため、たとえば、５齢期の１日目で３
０匹程度のカイコ幼虫からと同程度の量を５齢期の７日
目では６匹〜７匹程度のカイコ幼虫から得ることができ
る。

【００５２】なお本発明の無細胞系タンパク質合成用抽
出液は、上記の調製方法で得られると、上述したような
利点を有する上で好ましいが、必ずしも上記調製方法で
得られたものでなくともよい。

【００５３】また本発明は、カイコ組織由来の抽出物
と、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する
無細胞系タンパク質合成用の液状組成物も提供する。こ
の液状組成物に含有されるカイコ組織由来の抽出物およ
びプロテアーゼインヒビターは、本発明の抽出液につい
て上述したのと同様である。また、本発明の液状組成物
も、外来ｍＲＮＡを含有しない以外は上述したのと同様
の含有量にて、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオト
レイトールおよび緩衝剤をさらに含有するのが好まし
い。かかる液状組成物を用いて無細胞系タンパク質合成
反応を行う場合には、反応液に外来ｍＲＮＡをさらに添
加する以外は、後述の抽出液からの反応液の調製と同様
にして行えばよい。

【００５４】本発明はまた、上記抽出液を用いた無細胞
系のタンパク質合成方法を提供するものである。当該タ
ンパク質合成に使用する反応液としては、無細胞系のタ
ンパク質合成の分野において従来より一般に使用されて
いるものであれば特に制限はない。

【００５５】なお上記反応液は、本発明の抽出液が１０
（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／
ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製される
のが好ましい。すなわち、上記反応液の全体において、
カイコ組織由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で
０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製
されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬと
なるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の
含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または
１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、タンパク質の合成速度が
低下する傾向にあるためである。また、反応液の全体に
おいて、外来ｍＲＮＡは、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ
／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５
００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｍＲＮ
Ａが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越え
ると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるため
である。

【００５６】通常、上記反応液としては、上記抽出液を
除く成分として、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴ
Ｔ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレア
チンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮ
ａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含
有するものを用いる。これにより、短時間で大量のタン
パク質の合成が可能であるというような利点をさらに有
する無細胞系タンパク質合成用の反応液を実現できる。

【００５７】当該反応液中におけるカリウム塩として
は、抽出液の成分として上述した各種のカリウム塩、好
適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム
塩は、上述した抽出液におけるカリウム塩の場合と同様
の観点から、当該反応液中において、１０ｍＭ〜５００
ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ
含有されることがより好ましい。

【００５８】当該反応液中におけるマグネシウム塩とし
ては、抽出液の成分として上述した各種のマグネシウム
塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用でき
る。マグネシウム塩は、上述した抽出液におけるマグネ
シウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中におい
て、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、
０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。

【００５９】当該反応液中におけるＤＴＴは、上述した
抽出液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１
ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ
〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。

【００６０】当該反応液中におけるアデノシン三リン酸
（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク
質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０
１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍ
Ｍ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが
０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク
質の合成速度が低下する傾向にあるためである。

【００６１】当該反応液中におけるグアノシン三リン酸
（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク
質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０
１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍ
Ｍ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが
０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク
質合成の速度が低下する傾向にあるためである。

【００６２】当該反応液中におけるクレアチンリン酸
は、タンパク質を継続的に合成するための成分であっ
て、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレ
アチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当
該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されること
が好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがよ
り好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、
充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果とし
てタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであ
り、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻
害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾
向にあるためである。

【００６３】当該反応液中におけるクレアチンキナーゼ
は、タンパク質を継続的に合成するための成分であっ
て、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する
目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質
合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／
ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、
１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがよ
り好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満で
あると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、
結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にある
ためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／
ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合
成速度が低下する傾向にあるためである。

【００６４】当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２
０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グ
ルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、
グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、
アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アス
パラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチ
ン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含
有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識さ
れたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾
アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、
通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、
当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１
０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２０
０μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が
１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質
の合成速度が低下する傾向にあるためである。

【００６５】当該反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビ
ターは、抽出液に混在するカイコ由来のＲＮａｓｅによ
って、本発明の無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡ
やｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を
妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応
液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有され
ることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有され
ることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．
１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分
抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮ
ａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タン
パク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。

【００６６】当該反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２
０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量
ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成
の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ
〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０
μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好
ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μ
ｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する
傾向にあるためである。

【００６７】反応液に含有される緩衝剤としては、上述
した本発明の抽出液と同様のものが好適に使用でき、同
様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使
用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出液
における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２０
０ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ
含有されることがより好ましい。

【００６８】また上記反応液は、グリセロールを含有す
るのがより好ましい。グリセロールを添加すると、タン
パク質合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を
安定化できるというような利点があるためである。グリ
セロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０
（ｖ／ｖ）％となるように添加する。

【００６９】さらに、上記反応液は、エチレングリコー
ルビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、
「ＥＧＴＡ」ということがある。）を含有するのが好ま
しい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金
属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアー
ゼ、プロテアーゼなどを不活化させることにより、本発
明のタンパク質合成に必須な成分の分解を阻害すること
ができるためである。該ＥＧＴＡは、上記反応液中にお
いて、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．
０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１
ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡ
が０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充
分に抑えることができない傾向にあるためであり、ま
た、１０ｍＭを越えるとタンパク質合成反応を阻害する
傾向にあるためである。

【００７０】すなわち、本発明の無細胞系タンパク質合
成方法に用いる反応液は、上記抽出液を３０（ｖ／ｖ）
％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１
５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マ
グネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５（ｖ／
ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロール、０．１ｍＭ
〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０
ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ
〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜
２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ
のＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μ
ｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍ
ＬのｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯ
Ｈ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ま
しい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜５ｍＭの
ＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好まし
い。

【００７１】本発明の無細胞系タンパク質合成方法は、
上記のような本発明の抽出液を含有する反応液を用い
て、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。

【００７２】また反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、
好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が
１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する
傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な
成分が変性する傾向にあるためである。反応の時間は、
通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間
である。

【００７３】本発明の無細胞系タンパク質合成方法にて
合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。

【００７４】本発明の無細胞系のタンパク質合成方法に
て合成できるタンパク質に特に制限はない。

【００７５】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説
明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲
を何ら限定するものではない。実施例１ ：カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出液の調製 ５齢期に達したカイコ幼虫を１日目から７日目まで１日
ごとにサンプリングした。サンプリングしたカイコか
ら、ハサミ、ピンセット、メスを使用して、後部絹糸腺
を摘出し、以下の手順に従って各日の後部絹糸腺につい
て抽出を行った。サンプリングしたカイコ幼虫の数と摘
出した後部絹糸腺の量を表１に示す。

【００７６】

【表１】

【００７７】抽出は、まず、５齢期のカイコ幼虫より摘
出した後部絹糸腺を、それぞれ液体窒素で凍結し、−８
０℃で凍結させた乳鉢ですり潰し、下記組成の抽出用液
を用いて、抽出を行った。 〔抽出用液の組成〕 ・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４） ・１００ｍＭ 酢酸カリウム ・２ｍＭ 酢酸マグネシウム ・２ｍＭ ＤＴＴ ・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ 抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ
２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３００００×ｇ、３
０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離
後、上清のみを単離し、再び３００００×ｇ、１０分
間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上
清のみを単離した。脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャ
ム バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを
含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給
し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行
った。ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔ
ｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイ
エンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１
０以上の画分を分取して、これに４０μｇ／ｍＬの外来
ｍＲＮＡを添加し、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由
来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。外来ｍＲ
ＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ
（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）
を用いた。得られた抽出液について、ＢＣＡ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用
い、タンパク質濃度を測定した。まず反応試薬２ｍＬに
対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反
応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒ
ｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、５
６２ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとし
て、ＢＳＡを用い、検量線を作成した。得られた各抽出
液のタンパク質濃度は、次のとおりであった。

【００７８】

【表２】

【００７９】熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出
液を調製するのにかかった平均時間は、約２時間であっ
た。

【００８０】実施例２ ：カイコ幼虫の脂肪体由来の抽出液の調製 １日目から７日目まで１日ごとにサンプリングしてなる
５齢期に達したカイコ幼虫より、脂肪体を摘出して、各
日の脂肪体を含有する抽出液をそれぞれ調製した以外
は、実施例１と同様に行った。サンプリングしたカイコ
幼虫の数と摘出した脂肪体の量を表３に、得られた各抽
出液のタンパク質濃度を表４に示す。

【００８１】

【表３】

【００８２】

【表４】

【００８３】熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出
液を調製するのにかかった平均時間は、約２時間であっ
た。

【００８４】実験例１ ：実施例１，２の抽出液を用いた無細胞系でのタンパク
質合成 上記実施例１、２で得られた各抽出液を用いて、下記の
組成の反応液を調製した。 〔反応液の組成〕 ・５０（ｖ／ｖ）％ 抽出液（反応液中における外来ｍＲＮＡ：２０μｇ／ｍ Ｌ） ・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４） ・１００ｍＭ 酢酸カリウム ・１ｍＭ 酢酸マグネシウム ・３ｍＭ ＤＴＴ ・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール ・０．５ｍＭ ＡＴＰ ・０．１ｍＭ ＧＴＰ ・２５ｍＭ クレアチンリン酸 ・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ ・４０μＭ アミノ酸（２０種） ・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター ・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ
酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター
（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティ
ックス社製）をそれぞれ用いた。各々調製した反応液を
用いて、反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ
−１０００（東京理化器械社製）を用い、無細胞系のタ
ンパク質（ルシフェラーゼ）の合成反応を行った。反応
液量は２５μＬとした。反応温度は２０℃とし、反応時
間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラー
ゼ量を測定した。合成されたルシフェラーゼは、ルシフ
ェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社
製）を用いて各々定量した。ルシフェラーゼアッセイ試
薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメータ
ー（Ｔｕｒｎｅｒ ＤｅｓｉｇｎｓＴＤ−２０／２０、
プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を
測定した。

【００８５】図３は、実施例１の抽出液（カイコ幼虫の
後部絹糸腺を含有）を用いた各反応液についての、反応
開始より２時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフ
である。図３において、縦軸はルシフェラーゼ合成量
（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は５齢期カイコ幼虫の生育
日数を示す。また図４は、実施例２の抽出液（カイコ幼
虫の脂肪体を含有）を用いた各反応液についての反応開
始より２時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフで
ある。図４において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎ
ｇ／ｍＬ）を示し、横軸は５齢期カイコ幼虫の生育日数
を示す。

【００８６】また図５は、実施例１の抽出液を用いた各
反応液（１日目〜７日目の各日のサンプル）について
の、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグ
ラフである。図５において、縦軸はルシフェラーゼ合成
量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示
す。図５に示すように、５齢期４日目のカイコ幼虫の後
部絹糸腺由来の抽出物を含有する抽出液を用いて調製し
た無細胞系タンパク質合成用の反応液は、６時間後まで
反応が継続し、３９７．４ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼ
が合成されていることがわかった。さらに、この反応液
を用いた反応では、２３時間後には６５７．４ｎｇ／ｍ
Ｌのルシフェラーゼが合成されていた。

【００８７】実験例２ 実施例１の抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成反
応における各成分添加量の影響を調べたところ、最適な
反応液組成は、以下のとおりであった。 〔反応液の組成〕 ・５０（ｖ／ｖ）％ 抽出液（カイコ幼虫５齢期４日目の後部絹糸腺を含有） （反応液中における外来ｍＲＮＡ：４０μｇ／ｍＬ） ・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４） ・７５ｍＭ 酢酸カリウム ・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム ・０．５ｍＭ ＤＴＴ ・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール ・０．５ｍＭ ＡＴＰ ・０．５ｍＭ ＧＴＰ ・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ ・２５ｍＭ クレアチンリン酸 ・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ ・４０μＭ アミノ酸（２０種） ・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター ・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ 上記最適化した組成の反応液を用い、反応温度を２５℃
とした以外は上記実験例１で行ったのと同様にしてルシ
フェラーゼの合成を行った。図６は、上記最適化した組
成の反応液についての、反応時間に対するルシフェラー
ゼの合成量を示すグラフである。図６において、縦軸は
ルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反
応時間（分）を示す。図６に示すように、組成を最適化
した反応液では、４時間まで反応が継続し、４．６μｇ
／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていることがわかっ
た。

【００８８】実施例３ ：カイコの胚由来の抽出液の調製 産下後２５℃に保温した０日目、２日目、５日目および
７日目のカイコの卵をそれぞれ２ｇ採取し、実施例１と
同様の方法で抽出液を調製した。得られた各抽出液のタ
ンパク質濃度は、次のとおりであった。

【００８９】

【表５】

【００９０】熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出
液を調製するのにかかった平均時間は、約１．５時間で
あった。

【００９１】実験例３ ：実施例３の抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合
成 上記実施例３で得られた各抽出液を用いた以外は、上記
の実験例１と同様の組成で反応液を作成し、無細胞系の
タンパク質（ルシフェラーゼ）合成を行った。その結
果、２日目の胚由来の抽出液を用いた場合、１６ｎｇ／
ｍＬのルシフェラーゼが合成されていた。

【００９２】実施例４ ：カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出液の調製 ５齢期の５日目に達したカイコ幼虫をサンプリングし
た。サンプリングしたカイコから、ハサミ、ピンセッ
ト、メスを使用して、後部絹糸腺を摘出し、以下の手順
に従って後部絹糸腺について抽出を行った。抽出は、ま
ず、５齢期の５日目に達したカイコ幼虫より摘出した後
部絹糸腺を液体窒素で凍結し、−８０℃で凍結させた乳
棒ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行
った。 〔抽出用液の組成〕 ・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０） ・１００ｍＭ 酢酸カリウム ・２ｍＭ 酢酸マグネシウム ・１ｍＭ ＤＴＴ ・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ 抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ
２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３００００×ｇ、１
０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離
後、上清のみを単離し、再び３００００×ｇ、３０分
間、４℃の条件にて遠心分離を行い、下層を単離した。
この下層を室温（２５℃）、６時間インキュベーション
を行った後、−８０℃、一昼夜凍結させた。凍結させた
下層を室温にて解凍後、２２０００×ｇ、６０分間、４
℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみ
を単離した。得られた上清に、３２０μｇ／ｍＬの外来
ｍＲＮＡを添加し、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由
来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。外来ｍＲ
ＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ
（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）
を用いた。この抽出液について分光光度計（Ｕｌｔｒｏ
ｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエン
ス社製）を用いた２８０ｎｍにおける吸光度は６２．４
であった。熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出液
を調製するのにかかった平均時間は、２４時間であっ
た。

【００９３】実験例４ ：実施例４の抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合
成 上記実施例４で得られた抽出液を用いて、下記の組成の
反応液を調製し、実験例１で行ったのと同様にしてルシ
フェラーゼの合成を行った。 〔反応液組成〕 ・５０（ｖ／ｖ）％ 抽出液（反応液中における外来ｍＲＮＡ：１６０μｇ／ ｍＬ） ・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４） ・１００ｍＭ 酢酸カリウム ・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム ・０．５ｍＭ ＤＴＴ ・１０％（ｖ／ｖ）％ グリセロール ・０．５ｍＭ ＡＴＰ ・０．５ｍＭ ＧＴＰ ・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ ・２５ｍＭ クレアチンリン酸 ・２００μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ ・４０μＭ アミノ酸（２０種） ・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター ・２００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ 図７は、実施例４の抽出液（カイコ幼虫の後部絹糸腺を
含有）を用いた反応液についての、反応時間に対するル
シフェラーゼの合成量を示すグラフである。図７におい
て、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示
し、横軸は反応時間（分）を示す。図７に示すように、
５齢期５日目カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出物を含
有する抽出液を用いて調製した無細胞系タンパク質合成
用の反応液は、７時間後まで反応が継続し、２８μｇ／
ｍＬのルシフェラーゼが合成されていた。

【００９４】実施例５ ：カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出液の調製 ５齢期の４日目に達したカイコ幼虫をサンプリングし
た。サンプリングしたカイコから、ハサミ、ピンセッ
ト、メスを使用して、後部絹糸腺を摘出し、以下の手順
に従って後部絹糸腺について抽出を行った。抽出は、ま
ず、５齢期の４日目に達したカイコ幼虫より摘出した後
部絹糸腺を液体窒素で凍結し、−８０℃で凍結させた乳
棒ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行
った。 〔抽出用液の組成〕 ・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４） ・１００ｍＭ 酢酸カリウム ・２ｍＭ 酢酸マグネシウム ・１ｍＭ ＤＴＴ 抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ
２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３００００×ｇ、１
０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離
後、上清のみを単離し、再び３００００×ｇ、３０分
間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上
清のみを単離した。脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャ
ム バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを
含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給
し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行
った。ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔ
ｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイ
エンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１
０以上の画分を分取して、これに８０μｇ／ｍＬの外来
ｍＲＮＡを添加し、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由
来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。外来ｍＲ
ＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ
（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）
を用いた。熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出液
を調製するのにかかった平均時間は、約２時間であっ
た。

【００９５】実験例５ ：実施例５の抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合
成 上記実施例５で得られた抽出液を用いて、下記の組成の
反応液を調製し、実験例１で行ったのと同様にしてルシ
フェラーゼの合成を行った。 〔反応液組成〕 ・５０（ｖ／ｖ）％ 抽出液（反応液中における外来ｍＲＮＡ：４０μｇ／ｍ Ｌ） ・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４） ・１００ｍＭ 酢酸カリウム ・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム ・０．５ｍＭ ＤＴＴ ・１０％（ｖ／ｖ）％ グリセロール ・０．５ｍＭ ＡＴＰ ・０．５ｍＭ ＧＴＰ ・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ ・２５ｍＭ クレアチンリン酸 ・２００μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ ・４０μＭ アミノ酸（２０種） ・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター ・２００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ 結果、抽出液にＰＭＳＦを未添加の場合のタンパク質
（ルシフェラーゼ）合成量は、ＰＭＳＦを添加した場合
の５０．２％にまで減少していた。

【００９６】

【発明の効果】以上の説明で明らかなように、本発明に
よれば、調製が容易であり、真核生物由来であるため、
糖タンパク質の合成も可能な無細胞系タンパク質合成を
実現し得る新規な無細胞系タンパク質合成用抽出液、お
よびその調製方法、ならびに当該抽出液を用いた無細胞
系でのタンパク質合成方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の抽出液の調製方法１〜３を簡略化して
示すフローチャートである。

【図２】本発明の抽出液の調製方法４を簡略化して示す
フローチャートである。

【図３】実施例１の抽出液（カイコ幼虫の後部絹糸腺を
含有）を用いた各反応液についての、反応開始より２時
間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフであり、縦軸
はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は
５齢期カイコ幼虫の生育日数を示す。

【図４】実施例２の抽出液（カイコ幼虫の脂肪体を含
有）を用いた各反応液についての、反応開始より２時間
後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフであり、縦軸は
ルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は５
齢期カイコ幼虫の生育日数を示す。

【図５】実施例１の抽出液を用いた各反応液（１日目〜
７日目の各日のサンプル）についての、反応時間に対す
るルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸は
ルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反
応時間（分）を示す。

【図６】最適化した組成の反応液についての、反応時間
に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、
縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横
軸は反応時間（分）を示す。

【図７】実施例４の抽出液（カイコ幼虫の後部絹糸腺を
含有）を用いた反応液についての、反応時間に対するル
シフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシ
フェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時
間（分）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 白木 聡子 大阪府大阪市福島区大開４−１−186 レ ンゴー株式会社中央研究所内 (72)発明者 伊東 昌章 大阪府大阪市福島区大開４−１−186 レ ンゴー株式会社中央研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA20 BA08 BA80 CA12 DA20 GA11 HA20 4B064 AG01 CA19 CA50 CC01 CC24 CD16 CD21 CD30 DA01 DA16

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カイコ組織由来の抽出物と、外来ｍＲＮ
   Ａとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用抽
   出液。
2. 【請求項２】 さらに、プロテアーゼインヒビターを含
   有する請求項１に記載の抽出液。
3. 【請求項３】 カイコ組織由来の抽出物の含有量が、タ
   ンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであ
   る、請求項１または２に記載の抽出液。
4. 【請求項４】 カイコ組織が、カイコ幼虫の後部絹糸腺
   を少なくとも含有する請求項１〜３のいずれかに記載の
   抽出液。
5. 【請求項５】 カイコ組織が、カイコ幼虫の脂肪体を少
   なくとも含有する請求項１〜３のいずれかに記載の抽出
   液。
6. 【請求項６】 カイコ組織が、カイコの胚を少なくとも
   含有する請求項１〜３のいずれかに記載の抽出液。
7. 【請求項７】 プロテアーゼインヒビターがフェニルメ
   タンスルホニルフルオリドである、請求項２〜６のいず
   れかに記載の抽出液。
8. 【請求項８】 カイコ組織由来の抽出物と、プロテアー
   ゼインヒビターとを少なくとも含有することを特徴とす
   る無細胞系タンパク質合成用液状組成物。
9. 【請求項９】 請求項１〜７のいずれかに記載の抽出液
   を使用した無細胞系タンパク質合成方法。
10. 【請求項１０】 カイコ組織から抽出用液を用いて抽出
    したカイコ組織由来の抽出物に、外来ｍＲＮＡを添加す
    ることを特徴とする、無細胞系タンパク質合成用抽出液
    の調製方法。
11. 【請求項１１】 抽出用液がプロテアーゼインヒビター
    を少なくとも含有するものである請求項１０に記載の調
    製方法。
12. 【請求項１２】 カイコ組織から抽出用液を用いて抽出
    したカイコ組織由来の抽出物に、液状フィブロインを除
    去する処理を施すことを特徴とする請求項１０または１
    １に記載の調製方法。