JP2003174891A

JP2003174891A - 植物由来の酵素及びｄｎａ配列並びにそれらの使用

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Publication number: JP2003174891A
Application number: JP2002258423A
Authority: JP
Inventors: Ian George Bridges; ブリツヂス，アイアン，ジヨージ; Simon William Jonathan Bright; ブライト，シモン，ウイリアム，ジヨナサン; Andrew James Greenland; グリーンランド，アンドリユー，ジエームス; David Charles Holt; ホルト，デービツド，チヤールス; Ian Jepson; ジエプソン，アイアン; Wolfgang Walter Schuch; スコツチ，ウオルフガング，ヴアルター
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1991-07-02
Filing date: 2002-09-04
Publication date: 2003-06-24
Also published as: JPH06511385A; EP0603190B1; DE69232620D1; AU6210496A; WO1993001294A1; CA2111983C; US5866792A; AU690855B2; US5589614A; EP0603190A1; ES2178637T3; ATE218163T1; GB9114259D0; JP3377526B2; DK0603190T3; DE69232620T2; AU2195992A; CA2111983A1; AU672362B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】除草剤耐性植物を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するグルタチオ
ン-S-トランスフェラーゼ、イソ型II、27kDサブユニッ
ト、ＧＳＴ−１２９ｋＤサブユニット、ＧＳＴ−３
２６ｋＤ、及びそれをコードするDNAを植物のゲノムに
組み込むこと、ならびにＧＳＴ−１２９ｋＤサブユニ
ットをコードするＤＮＡを第１の植物に導入し、ＧＳＴ
−２２７ｋＤサブユニットをコードするＤＮＡを第２
の植物に導入し、次いで第１の植物と第２の植物とを交
雑させることからなる除草剤耐性トランスジェニック植
物の作成方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、図４に示すアミノ
酸配列を有するグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、
イソ型II、27kDサブユニットに関し、またそれをコード
するDNAを植物のゲノムに組み込むことからなる除草剤
耐性トランスジェニック植物の作成方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GS
T)類は、グルタチオンがスルフィドリル基を介して広範
な疎水性の親電子化合物に複合(conjugation)すること
を触媒する一群の酵素である。この複合の結果、前記化
合物が解毒され得、しかも組織から前記化合物が除去さ
れ得る。

【０００３】GST酵素は、一連の作物植物例えばトウモ
ロコシ、小麦、モロコシ及びエンドウマメにおいて確認
されている。GST類は、白化したトウモロコシ苗中の全
可溶性タンパク質の１〜２％を構成する。

【０００４】GSTの３種類のイソ型(isoform)、すなわち
GST-I、GST-II及びGST-IIIが確認されている（例えば、
特許文献１参照）。トウモロコシの組織中の主要なイソ
型であるGST-Iは、構成的に(constitutively)発現さ
れ、しかもグルタチオンを出芽前除草剤例えばアラクロ
ール(alachlor)と複合させることができる。トウモロコ
シ組織を化学的解毒剤(例えば、N,N-ジアリル-2,2-ジク
ロロアセトアミド)で処理すると、出芽前除草剤の解毒
に関与するGST-Iの活性が高められる。

【０００５】GST-Iタンパク質とGST-IIタンパク質は両
方共に約50kDの固有の分子量を有する。哺乳動物におけ
るように、トウモロコシのGST類は二量体であり；GST-I
は明らかに同じ複数個の29kDのポリペプチドサブユニッ
ト(GST-I-29)を有し、これに対してGST-II はGST-Iに認
められるサブユニット(GST-I-29)と同じ29kDサブユニッ
トと、新規な27kDサブユニット(GST-II-27)とのヘテロ
二量体である。GST-IIは解毒剤の不存在下において極め
て低い基底濃度(basal level)で検出されるが、その発
現は解毒剤処理によって劇的に高められる。GST-Iと同
様に、GST-IIはある種の除草剤に対する抵抗性を付与す
る。GST-IIがクロロアセトアニリド系除草剤やチオカー
バメート系除草剤、例えばアラクロールを解毒すること
は公知である（例えば、非特許文献１参照）。

【０００６】GST-Iの29kDサブユニットに対応するcDNA
と遺伝子とは、既にクローン化され、配列決定されてい
る（例えば、非特許文献２参照）。さらにまた、トウモ
ロコシの苗中のGST活性をもつ第３の少量成分の26kDサ
ブユニット(GST-III-26)に対応するcDNAも、既にクロー
ン化され、配列決定されている（例えば、非特許文献３
参照）。GST-IIIはこの26kDサブユニット同士のホモ二
量体である。GST-IIIは、GST-Iと同様に且つGST-IIとは
異なり、構成的に発現される。GST-IIIが除草剤例えば
アトラジンを解毒することは知られている。

【０００７】

【特許文献１】国際特許出願公開第WO90/08826号明細書

【０００８】

【非特許文献１】Mozer et al., Biochemistry, 1983,
22, 1068-1072

【０００９】

【非特許文献２】Wiegand et al., Plant Mol. Biol.,
1986, 7, 235-243

【００１０】

【非特許文献３】Moore et al., 1986, Nucleic Acid R
esearch, 18, 7227-7235

【００１１】

【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明によれば、グルタチオン-S-トランスフ
ェラーゼ、イソ型II酵素の27kDサブユニット(GST-II-2
7)用の遺伝子プロモーターをコードするゲノムDNA配列
であって、図８に示すヌクレオチド配列を有するゲノム
DNA配列及びその遺伝暗号の宿退によって可能な該配列
の変型が提供される。

【００１２】上記ゲノムDNAは、大腸菌XLI-blue株の中
に含有させたプラスミドpGIE7として、英国、スコット
ランド、AB2 1RY、アバディーン、マーチャー・ドライ
ブ・ストリート23（23 St Machar Drive, Aberdeen, AB
2 1RY, Scotland, UK）所在のザ・ナショナル・コレク
ションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・
バクテリア(the National Collections of Industrial
and Marine Bacteria)(NCIMB)に寄託番号NCIMB 40426と
して1991年６月14日付で寄託してある。

【００１３】また、本発明によれば、図４に示すアミノ
酸配列を有するGST-II-27酵素サブユニットが提供され
る。

【００１４】さらにまた、本発明によれば、このGST-II
-27サブユニットをコードするcDNA配列であって図２に
示すヌクレオチド配列を有するcDNA配列、及びその遺伝
暗号の縮退によって可能にされる該配列の変型が提供さ
れる。

【００１５】上記cDNAは、大腸菌XLI-blue株の中に含有
させたプラスミドpIJ21として、英国、スコットラン
ド、AB2 1RY、アバディーン、マーチャー・ドライブ・
ストリート23所在のザ・ナショナル・コレクションズ・
オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア
(NCIMB)に寄託番号NCIMB 40413として1991年４月19日付
で寄託してある。

【００１６】国際特許出願第公開WO90/08826号明細書に
は、トウモロコシGST-II遺伝子の27kDサブユニット(GST
-II-27)から単離された化学誘導性の遺伝子プロモータ
ー配列が記載されており、その記載は本明細書において
参照される。

【００１７】本出願において、本発明者らは前記の記27
kDサブユニットに対応する完全cDNAのクローニング及び
配列決定について記載する。この配列は誘導性であり、
GST-II-27特異抗血清によって特異的に認識される。該
配列は他のトウモロコシGST類と部分的に相同性であ
る。

【００１８】本発明によって、GST-II-27用cDNAは、前
記プロモーター領域を含んでいる対応ゲノム配列を単離
するための遺伝子プローブとして利用されている。

【００１９】さらにまた、本発明によれば化学的にスイ
ッチを入れ得る(switchable)遺伝子組立て体であって、
１個の外来遺伝子又は一連の外来遺伝子類に操作的に連
結されたGST-II-27遺伝子プロモーター配列を含み、そ
れによって前記の1個の外来遺伝子又は前記の一連の外
来遺伝子類の発現を有効な外因性誘導物質を適用するこ
とによって制御し得るようにされてある化学的にスイッ
チを入れ得る遺伝子組立て体が提供される。また本発明
によれば、前記遺伝子組立て体を用いて形質転換された
双子葉植物が提供される。

【００２０】“除草剤解毒剤”として公知であり且つ例
えば噴霧液として生育植物に施用し得るある種の化合物
によって前記GST-II-27遺伝子が誘導されることは既に
明らかにされている(国際特許出願公開第WO90/08826号
明細書)。この誘導は、任意の適当な化学物質例えば公
知の解毒剤並びに他の農薬、化学物質類縁体及び他の可
能性のある誘導物質を施用することによって達成し得
る。かかる化学物質としては、N,N-ジアリル-2,2-ジク
ロロアセトアミド(一般名：dichloramid)；2,2,5-トリ
メチル-3-(ジクロロアセチル)-1,3-オキサゾリジン；2-
クロロ-4-(トリフルオロメチル)-5-トリアゾール-カル
ボン酸ベンジル(一般名：flurazole)；ナフタレン-1,8-
ジカルボン酸無水物；2-ジクロロメチル-2-メチル-1,3-
ジオキソラン；1-(ジクロロアセチル)-ヘキサハイドロ-
3,3,8a-トリメチル-ピロール(1,2-a)-ピリミジン-6(2H)
-オン；1,3-ジオキソラン-2-イル-メトキシイミノ(フェ
ニル)ベンゼンアセトニトリル；4,6-ジクロロ-2-フェニ
ル-ピリミジン；2,2-ジクロロ-[N-アリル-N-(1,3-ジオ
キソラン-2-メチル)]アセトアミド；1-(シアノメトキシ
イミノ)ベンズアセトニトリル；4´-クロロ-2,2,2-トリ
フルオロアセトフェノン-O-1,3-ジオキソラン-2-イル-
メチルオキシム；2,2-ジクロロ-1-(3,4-ジヒドロ-3-メ
チル-2H-1,4-ベンゾオキサジン-4-イル)エタノン；3-ジ
クロロアセル-2,2-ジメチルオキサゾリジン；4-メトキ
シ-3,3-ジメチルベンアゾール-1-イル)ペンタ-1-エン-3
-オール；2,2-ジクロロ-N-(3-メチル-4-チアゾリン-2-
イリデン)アセトアミド；O,O-ジエチル-O-フェニルホス
ホロチオエート；2,2-スピロシクロヘキシル-N-ジクロ
ロアセチルオキサゾリジン；N-ベンジル-N-エチル-ジク
ロロアセトアミド；3-クロロアセチル-4,4-シクロヘキ
サン-スピロ-2,2-ジメチル-1,3-オキサゾリジン；スピ
ロオキサゾリジンアセトアミド；オキサベトリニル；シ
オメトリニル；フェンクロリム；メトキシフェノンが挙
げられる。

【００２１】次いで、前記GST-II-27プロモーターは、
外因性又は外来性の遺伝子に連結され、形質転換によっ
て植物中に導入された場合には、その外来遺伝子の発現
を外部調節するための手段を提供する。上記外来遺伝子
は野生型GST-II-27遺伝子以外の遺伝子であり得る。前
記の国際特許出願公開第WO90/08826号明細書には、かか
る外部調節可能なプロモーターの使用方法の詳細が記載
されており、また国際特許出願公開第WO90/08830号明細
書には、植物中で雄性不稔を惹起する遺伝子カスケード
の一要素としてかかるプロモーターを使用すること及び
かかる植物をハイブリッド作物の作成において使用する
ことが詳細に記載されている。本明細書においては、誘
導性のGST-II-27プロモーターが単子葉植物及び双子葉
植物の両方において機能できることが明らかにされる。
従って、上記GST-II-27プロモーターは、種々の遺伝子
修飾植物、例えば耕作作物例えばカノーラ、ヒマワリ、
タバコ、サトウダイコン、ワタ；穀物例えば小麦、大
麦、稲、トウモロコシ、モロコシ；果実例えばトマト、
マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ及びメ
ロン；並びに野菜例えばニンジン、レタス、キャベツ及
びタマネギにおいて遺伝子の発現を制御するのに使用で
きる。また、前記GST-II-27プロモーターは、種々の組
織例えば根、葉、茎及び再生組織において使用するのに
適している。

【００２２】概略、本発明の酵素、cDNA及びゲノムDNA
を単離するのに使用した方法は下記の通りである。

【００２３】解毒剤で誘導したトウモロコシ組織からGS
T活性のピーク時に全RNAを抽出し、それを使用してGST
転写物を含んでいるcDNAライブラリーを構築した。

【００２４】GST-II-27タンパク質を上記と同種の組織
から抽出し、精製し、それを使用してヒツジ抗血清を高
めた(ウエスタン分析及びドットブロット分析により特
定した）。

【００２５】この抗血清を用いて前記cDNAライブラリー
を免疫スクリーニングすることによって(同位体検出装
置を使用して)、前記の新規GST配列を単離した。プラー
ク精製により、このGSTを含むプラスミドDNAの生体内(i
n vivo)切除及び配列決定が可能にされた。ノーザン分
析により、上記プラスミドDNAが解毒剤誘導性クローン
であることが明らかにされた。

【００２６】上記cDNAから調製し、注意深く設計したプ
ローブを用いてトウモロコシゲノムライブラリーをスク
リーニングすることによって、GST-II-27ゲノムクロー
ンを単離した。これらのクローンをマッピングすること
によって、前記プロモーター領域を含んでいる断片を単
離し、配列決定した。

【００２７】得られたプロモーター配列を使用して植物
遺伝子発現カセットを組み立てた。これらのカセット
を、単子葉植物と双子葉植物の両方に導入し、これらの
カセットにより誘導可能な方法で遺伝子発現が制御され
ることを明らかにした。

【００２８】また、本発明によれば、GSTポリペプチド
類をコード化するDNAを植物中に、グルタチオン-S-トラ
ンスフェラーゼ酵素が発現されるように組み込むことか
らなる、除草剤耐性のトランスジェニック植物(遺伝子
導入植物ともいう)の作成方法が提供される。さらにま
た、本発明によれば、該方法によって作成された除草剤
耐性植物及びその後代(progeny)が提供される。

【００２９】除草剤の作用に耐える作物植物を提供する
目的は、標準状態、すなわち除草剤感受性の状態にある
作物植物を撲滅させる有効濃度の除草剤を全面施用する
ことによって、作物植物の間で生育する雑草を防除する
のに役立てることである。かかる耐性植物はまた、前の
施用から除草剤が短期間残っている場所で使用するのに
有効である。このような状況では、耐性植物は、標準的
植物と比較した場合に、高められた除草剤耐性を示す植
物であると定義される。耐性は、除草剤の影響に対する
耐性が僅かに高いものから、植物が除草剤の存在によっ
ても影響を受けない完全耐性にまで変化させ得る。

【００３０】グルタチオン-S-トランスフェラーゼ遺伝
子を含有する除草剤耐容性植物は、1987年11月26日付け
で公告されたオーストラリア特許出願公告第73146/87号
明細書(チバガイギー社)(1991年12月17日付けで公告さ
れた米国特許第5073677号に関連する)に記載されてい
る。該特許出願公告明細書には、哺乳動物のGST配列、
具体的にはラットのGST配列の使用が記載されている。
ラットのGSTをコードする遺伝子配列が記載され、これ
を使用してタバコ用の植物形質転換ベクターが組み立て
られている。幾つかの形質転換体はアトラジン耐性を示
した。上記特許出願公告明細書には、植物から誘導され
たGST配列は記載されていない。特に、該特許出願明細
書にはGST-II-27配列は記載されていない。

【００３１】GSTポリペプチドサブユニットをコード化
するDNAは、適当なプロモーター（構成性又は誘導性）
の制御下で植物形質転換ベクター中に組み込み得る。GS
T-I 29kD ポリペプチドサブユニットを発現する植物
は、GST-I酵素活性を示すであろう。GST-I 29kDサブユ
ニットと、GST-II 27kDサブユニットとを一緒に発現す
る植物は、GST-II酵素活性と若干のGST-I活性を示すで
あろう。GST-III 26kDサブユニットを発現する植物は、
GST-III酵素活性を示すであろう。GST-I 29kDサブユニ
ットと、GST-III 26kDサブユニットとを一緒に発現する
植物は、GST-I活性とGST-III活性とを示すであろう。GS
T-I 29kDポリペプチドとGST-II 27kDポリペプチドとGST
-III 26kDポリペプチドとを一緒に発現する植物は、GST
-I活性とGST-II活性とGST-III活性とを示すであろう。
かかる植物は全て、グルタチオンをある種の出芽前除草
剤と複合させ得るであろう。従って、かかる植物は上記
除草剤に耐性であろう。GST活性は、一連の化学的除草
剤、例えばクロロアセトアニリド類及びチオカーバメー
ト類に対して有効であることが知られており、しかも除
草性を示す別の化合物に対して活性であり得る。本発明
のトランスジェニック植物が示す除草剤耐性の実際的ス
ペクトラムは、活性なGSTイソ型(GST-I、GST-II又はGST
-III)に左右されるか、あるいは植物中に存在する種々
のGSTイソ型の相対活性に左右されるであろう。例え
ば、GST-IIは、アラクロール及びアセトクロールに対し
て活性であり、GST-IIIはアトラジンに対して活性であ
る。従って、本発明の除草剤耐性トランスジェニック植
物の作成方法は、すでに感受性の植物に耐性を付与する
ことに又は存在する耐性を高めることに使用し得るばか
りではなく、植物が耐性を示す除草剤の範囲を拡大する
のにも使用し得る。従って、トランスジェニック植物内
で種々のGSTイソ型を発現させることによって多数の耐
性を導入することができることは、農業用途には好都合
である。特定の除草剤に対して特異的な耐性は、この除
草剤に対して最も効果的な特異的なGSTイソ型(又は複数
のイソ型の組合わせ)を組み込むことによって達成し得
る。特に、植物中にGST-II活性が存在すると、GST-I酵
素又はGST-III酵素では解毒できないある種の除草剤に
対する耐性が付与され得る。従って、GST-II活性によっ
て（GST-II-27配列を用いて形質転換することによっ
て）除草剤耐性が付与される植物を作成することができ
ることは、好都合であろう。

【００３２】GSTサブユニットをコードする配列を含ん
だ組立て体を用いて種々の公知の方法（アグロバクテリ
ウムTiプラスミド法、電気穿孔法、微量注入法、マイク
ロプロジェクタイルガン法など）に従って、植物を形質
転換し得る。次いで、適当な場合には、新規な核材料が
ゲノム中に安定的に組み込まれている植物全体中に、形
質転換細胞を再生させ得る。形質転換された単子葉植物
及び双子葉植物は両方共にこのようにして得られるが、
通常的には形質転換された双子葉植物の方がより再生し
易い。作成し得る遺伝子修飾植物の例としては、耕作作
物例えばカノーラ、ヒマワリ、タバコ、サトウダイコ
ン、ワタ、及び穀物例えば小麦、大麦、稲、モロコシ及
びトウモロコシが挙げられる。

【００３３】幾つかの植物種は、除草剤を解毒できるGS
T酵素を生来有していない。従って、かかる植物種中
に、GSTポリペプチドをコード化するDNAを組み込むと、
ある種の除草剤に対する新規又は追加の耐性が付与され
るであろう。GST類は別の植物種特にトウモロコシにお
いては生来発現されるが、GST類を高められた濃度で含
有するトランスジェニック植物を作成することにより、
作物の除草剤耐性の水準を増大させ得る。さらにまた、
GSTイソ型の全てはトウモロコシの系統全てに通常は存
在していない。１種又はそれ以上の追加のGSTイソ型を
含有するトランスジェニック植物を作成することによっ
て、広範囲の除草剤に対する耐性が付与されるであろ
う。別の利点は、GST-II-27配列を構成性プロモーター
の制御下に置くことに由来する、従ってこのことはGST-
II酵素がトランスジェニックトウモロコシ植物内で構成
的に発現されることを意味するであろう。これによりト
ウモロコシの種子又は苗に化学的解毒剤を施用する必要
性が回避される。通常は、GST-II酵素活性は誘導性であ
る。解毒剤(例えばジクロルアミド)を種子コーティング
(seed coating)として施用して出芽植物中でGST-II酵素
活性を誘導させ、このようにして除草剤耐性を付与する
のが現在のやり方である。

【００３４】アミノ酸配列決定により、GST-Iの29kDサ
ブユニットがGST-IIの29kDサブユニットと同一であるこ
とが明らかにされている。従って、GST-I-29サブユニッ
トとGST-II-27サブユニットとの組合わせは活性なGST-I
I酵素を与えるであろう。GST-I-29をコードするcDNA〔W
iegandらによって単離された、Plant Mol. Biol., 7,23
5-243(1986)〕と、GST-II-27をコードするcDNA(図２に
示したもの)とを一緒にトランスジェニック植物内で発
現させると、GST-II活性を有する植物を与えるであろ
う。

【００３５】GST-I 29kDサブユニット又はGST-II 27kD
サブユニットをコードするDNAは、適当なプロモーター
例えば35S CaMVプロモーターの制御下でベクター中に組
み込み得る。植物は、GST-I-29発現カセット又はGST-II
-27発現カセットのいずれかを含有するベクターを用い
て形質転換し得る。それぞれのGST-IIサブユニット(29k
D又は27 kD)を発現する形質転換体を交雑させて、GST-I
-29とGST-II-27の両方を発現する後代を産生させ、除草
剤耐性の表現型をもたらし得る。この方法の変法におい
ては、各植物は、GST-I-29発現カセットを含有するベク
ターと、GST-II-27発現カセットを含有するベクターと
を用いて一緒に形質転換し得る。別法として、GST-I 29
kDサブユニットとGST-II 27kDサブユニットとをコード
するDNAを、単一のプロモーターの制御下に単一の植物
形質転換ベクター中に含有させ得る。両方のGST-IIサブ
ユニット(29kD及び27kD)を発現する形質転換体は、除草
剤耐性の表現型を示すであろう。それぞれのGST-IIサブ
ユニット(29kD又は27kD)の一方のみを発現する形質転換
体を交雑させて両方のサブユニット(29kD及び27kD)を発
現する後代を産生させ得る。

【００３６】上記の方法を適合させて、GST-I酵素(GST-
I-29をコードするDNAを用いて形質転換)、GST-II酵素
〔GST-III-26をコードするDNAを用いて形質転換、Moore
らにより単離されたようなもの、Nucleic Acid Researc
h, 18, 7227-7235(1986)〕又はGST-I／GST-II／GST-III
活性の幾つかの選択を発現する除草剤耐性植物を作成し
得る。

【００３７】前記GSTサブユニット類をコードするDNAは
構成性プロモーター(例えば35S CaMVプロモーター)の制
御下に植物中に導入するのが好ましい。これにより、GS
T発現の外部誘導の必要性が回避され、得られる植物は
永久的に除草剤耐性である。また、前記GSTサブユニッ
ト類をコードするDNAを誘導性プロモーターの制御下
に、植物形質転換ベクター中に含有させて、トランスジ
ェニック植物中に誘導性の除草剤耐性を付与し得る。か
かるプロモーターは、図８に示した化学誘導性のGST-II
-27プロモーターを含有する。耐性は適当な誘導物質(例
えば化学的解毒剤)を適用することによってスイッチを
入れ得る。ある環境のもとでは、必要とする場合にのみ
除草剤耐性を発現させるか又は増大させることができる
ことが好都合であり得る。例えば、作物の輪作中に、第
１の作物種の個体を、第２の作物種を用いて耕作すべき
田畑で翌年、栽培し得る。除草剤を使用してこれらの未
誘導性で且つ未だ感受性の“自生”植物を撲滅し得る。
除草剤耐性を必要とする場合(すなわち、除草剤を施用
する直前)にのみGSTの発現を誘導させることもまた、植
物がGST表現型を必要とする場合にのみGSTポリペプチ
ドを産生しつつあるという理由から、ある場合には代謝
的により効果であり得る。

【００３８】例として本発明を下記の記載により説明す
る。下記の記載は、GST-II-27の単離、発現調査及び配
列決定、誘導性発現カセットの組立て並びにトランスジ
ェニック植物中でのその機能化の例証、並びに除草剤耐
性植物の作成を詳細に示すものである。

【００３９】

【発明の実施の形態】及び

【実施例】トウモロコシ組織の解毒剤処理若いトウモロコシ苗の処理については、種子を湿った濾
紙上で発芽させた。発芽させ、生育させた(１週間まで)
後に、解毒剤N,N-ジアリル-2,2-ジクロロアセトアミド
(以下、R-25788という)を濾紙中の水に加え、トウモロ
コシの苗をさらに一定の期間生育させた後に組織を採取
した。

【００４０】酵素検定 1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン(CDNB)を基質として使
用して340nmで分光光度分析することにより酵素活性を
測定した。反応緩衝液は0.1M EDTAと0.001M CDNBと0.00
25Mグルタチオンとを含有するものであった。

【００４１】抽出物の調製及び酵素精製組織を、乳棒と乳鉢を用いて0.05MトリスHCl(pH7.8)、
0.001M EDTA、0.001M DTT及び7.5％ポリビニルピロリド
ンの中で４℃で均質化し、30,000gで遠心分離して粗抽
出物を得た。得られた粗抽出物からのGSTイソ型の分離
は、下記のようにして行った。粗抽出物をDEAEセファロ
ースカラムにかけ、0.01MトリスHCl(pH7.8)、0.001M ED
TA及び0.001M DTTで洗浄した。結合したGSTを0.3M塩化
カリウムで溶出させた。GST活性を含有する画分を一緒
にし、PD 10ゲル濾過カラムを使用して脱塩した。GST-I
イソ型とGST-IIイソ型との分離は、FPLCによりmono-Qカ
ラム上で塩化カリウム濃度勾配０〜0.4Mで行った。FPLC
から得られたGST-IとGST-IIの脱塩画分を、pH7.3の0.05
M燐酸緩衝液で平衡化したグルタチオン-S-セファロース
・アフィニティーカラムにかけることによって、GST-I
とGST-IIの純粋な試料を得た。緩衝液で洗浄した後に、
結合GSTを0.005Mグルタチオンで溶出させた。GST-I又は
GST-IIのSDS-PAGE（17.5％、アクリルアミド：ビスアク
リルアミド＝30：0.174)は、Amicon Centricon 10 Micr
oconcentrations(登録商標)を使用して純GST試料を濃縮
し、Laemmli緩衝液を含有するメルカプトエタノール中
で試料を変性し、次いで得られたゲルをクーマシー染色
することにより行った。

【００４２】GSTの誘導発現経時実験を行って、解毒剤処理後のGST類の発現を調べ
た。R-25788の30 ppm溶液を３日齢の苗の根に施用し、
解毒剤処理後の種々の時間間隔で、組織を採取した。試
料を、前記の酵素検定法を使用してGST活性について試
験した。この実験の結果を図１にグラフで示した。図１
は、48時間インキュベーション後に全GST活性において
約2.5倍の増加があったことを示している。

【００４３】cDNAライブラリーの作成前記の経時実験により、解毒剤処理後48時間でGST発現
のピークが示された。従って、解毒剤処理後24時間及び
48時間で根組織から抽出した全RNAから２種類のcDNAラ
イブラリーを作成した。誘導操作が首尾よくいっている
ことを確認するために、24時間誘導した組織の試料１g
を採取し、GST-IIについて分析した。この実験により、
cDNAライブラリーを作成するのに使用した組織は全GST
活性の約25％を占めるGST-IIとして実に首尾よく誘導さ
れていることが示された。一本鎖cDNAを前もって精製す
ることなく、第二の鎖の合成にRNアーゼと大腸菌(E.col
i)DNAポリメラーゼIを用いる方法（GublerとHoffman, 1
983年）により、オリゴdT-セルロース精製RNAから二本
鎖cDNAを調製した。λ ZAPIIをクローニングベクターと
して選択した。

【００４４】GST-II-27酵素に対する抗体の産生多数の別々の実験から前記のようにして単離した酵素サ
ブユニットを溜めることによって、ヒツジの免疫化を可
能にするのに十分なタンパク質を得た。次いで、得られ
た27 kD GST-IIポリペプチドを、ポリアクリルアミドゲ
ル切片から電気溶出することによって精製して明確な均
質性にした。抗血清を上記27kDポリペプチド対して調製
した。ヒツジの免疫化は、本質的にはStewartとRoweの
方法〔J.Immunological Methods, 8, 37-45(1975)〕に
従って行った。ウエスタンブロッティング実験により、
抗血清を使用して上記GST-II 27kDサブユニットの特異
認識が得られたことが明らかにされた。また、GST-II 2
9kDサブユニットとの交差反応性は得られなかった。１
次抗血清の親和性と特異性を、免疫ドットブロッティン
グとウエスタンブロッティングとにより試験し、粗抽出
物中の他のポリペプチドとの交差反応性がないことが示
された。種々の対照実験を行って、１次及び２次抗体濃
度を最適化し、種々の酵素基質を試験し、融合タンパク
質誘導条件を確認した。バックグランドノイズに対する
信号の比を最大にする条件を確立し、GST-II 27kDサブ
ユニット１ngの検出を可能にした。

【００４５】cDNAライブラリーの免疫スクリーニングトウモロコシのGST-II-27をコード化するcDNAクローン
を同定するために、cDNAライブラリーからバクテリオフ
ァージを選別した。¹²⁵Ｉタンパク質Ｇ検出装置を使用
する免疫スクリーニングは、変性させたGST-II-27 １ng
の検出を可能にした。解毒剤で誘導した苗のライブラリ
ーから組換え体１×10⁶個を高い平板密度(平板当たり３
×10⁴個)で選別した。30個の陽性プラークを検出し、選
び取り、IPTGを浸した濾紙を用いて１夜インキュベーシ
ョンすることにより再選別した。プラーク精製３回後
に、６個の強い陽性の候補が残った。

【００４６】さらなるプラーク精製免疫スクリーニング法とDNAハイブリダイゼーション法
とを使用して(３回目の選別からPCRによって単離したcD
NAプローブを用いて）第４回目のプラーク精製を行っ
た。両方の検定法を用いてプラーク精製することにより
６個のクローンを得た。また、上記DNAプローブは６個
の陽性クローン全てと同じ強さで交差ハイブリダイズ
し、恐らくはそれら全てが同じ配列を表わすであろうと
いうことを示した。

【００４７】プラスミドDNAの単離生体内(in vivo)切除方法(Stratagene)を実施して、ブ
ルースクリプト・ファージミド(Bluescript phagemids)
を遊離させた。４種類の溶菌液から調製したプラスミド
DNAをそれぞれ、pIJ13、pIJ15、pIJ17及びpIJ21と命名
した。プラスミドpIJ21はアバディーン所在のザ・ナシ
ョナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・ア
ンド・マリン・バクテリア(NCIMB)に寄託番号NCIMB 404
13として寄託してある。

【００４８】ライブラリー陽性クローンの特定 EcoRIで消化すると、全てのクローンは900〜950塩基対
の間の単一の挿入断片が遊離した。該挿入断片は27kDタ
ンパク質をコード化すると予測された大きさの挿入断片
である。得られたゲルをブロットし、pIJ17とハイブリ
ダイズさせると、全ての挿入断片が同じ強さでハイブリ
ダイズした。前記クローンの中の１つから得た950塩基
対の挿入断片を、GST-I-29 及びGST-III-26のPCR生成物
のサザンブロットにハイブリダイズさせた。この実験に
より、GST-III-26にはハイブリダイズせず、GST-I-29に
は極めて弱くハイブリダイズすることが明らかにされた
(標的DNA １μgを１夜暴露)。サザンブロットを取り出
し、GST-I-29特異的プローブと再びハイブリダイズさせ
ると、わずか15分間の暴露を必要としただけであった。
また、上記の950塩基対の挿入断片(推定上のGST-II-27
PCR生成物)とGST-I-29特異的オリゴとを使用して組変え
体１×10⁶個のライブラリーフィルターを探査した。そ
れぞれのプローブについて種々のハイブリダイゼーショ
ンパターンが得られた。これらの調査により、上記ライ
ブラリから得られた陽性クローンは、GST-I-29でもな
く、GST-III-26でもないが、GST-I-29とのある弱い相同
性を共有していることが示される。

【００４９】cDNAの配列分析各クローンの3´末端と5´末端の200-300塩基の間を、S
KプライマーとKSプライマーを使用して配列決定した。
これらのデータから、４種のクローン(pIJ13、pIJ15、p
IJ17及びpIJ21)はポリＡ尾部の位置以外は同じであるこ
とが明らかにされた。GST-I-29については、３か所の可
能なポリＡ付加部位が確認された。最も長いクローンpI
J17KSを完全に配列決定した。得られたcDNA配列(954塩
基対)を図２に示す。pIJ17KSの配列は、中心部領域にお
いてトウモロコシのGST-I-29及びGST-III-26と相同性を
示し、このクローンがトウモロコシGSTに相当するとい
う強い確信を与えた。しかしながら、5´末端におけるG
ST-I-29とGST-III-26との間で高い相同性をもつ領域
は、pIJ17KSの5´領域と類似しておらず、後者が異なる
タンパク質をコード化することを示す。GST-II-27の解
読領域の分析により、それがG-C領域であること及び5´
領域に幾つかの反復を含むことが示される。

【００５０】pIJ17KSが誘導性GSTをコード化することの
証明ノーザン分析によって行った発現調査により、pIJ17KS
がGST-II-27配列に相当することが強く示唆された。pIJ
17KSは一連の処理組織例えば根(R)、房(T)、毛(S)及び
葉(L)から単離された誘導RNA(I)中の0.95kBの転写物に
強くハイブリダイズした。未誘導RNA(U)については、図
３に示すように微弱なハイブリダイゼーション信号であ
り、ある場合には信号を示さなかった。構成性プローブ
との対照ハイブリダイゼーションは、誘導試料及び未誘
導試料についてRNAの等しいローディング(loadings)が
示された。このことにより、pIJ17KSが実際に解毒剤誘
導性クローンに相当することが示される。光学密度分析
により、解毒剤処理後のある組織例えば葉の中の0.95kB
の転写物中において100倍の誘導が示される。未誘導RNA
中の信号の存在は、解毒剤処理がない中でGST-II 27kD
の低い基底発現(basal expression)が検出された先のウ
エスタンデータを支持する。

【００５１】GST-II-27のアミノ酸配列スルホブロモフタレン・グルタチオン-S-アガロース・
アフィニティークロマトグラフィーによりGST-IIの純粋
な試料を得た。27kDサブユニットと29kDサブユニットと
を分離するために、上記GST-IIをＣ8逆相HPLCカラム(SE
G 100mM×2.1mM、細孔300Å)に注入した。上記の２つの
サブユニットを、0.1％トリフルオロ酢酸中のアセトニ
トリル濃度勾配を用いて溶出した。SDS PAGE(17.5％
Ｔ、0.6％Ｃ)は、上記27kDサブユニットと29kDサブユニ
ットとに対応したUV吸収ピークを示した。各サブユニッ
トの全アミノ酸組成を、Applied Biosystems 420AH Der
ivatizer自動アミノ酸分析計を使用して調べた。これに
より、測定した組成と、上記29kDサブユニットと27kDサ
ブユニットの両方の核酸配列から予測される組成との間
に密接な一致があることが明らかにされた。Applied Bi
osystems 477パルス液相自動アミノ酸配列分析計を使用
してエドマン分解法により、各サブユニットについてN-
末端配列分析を行った。これにより、29kDサブユニット
のN-末端配列がGST-Iの29kDサブユニットと同じである
ことが明らかにされた。GST-II 27kDサブユニットのN-
末端はエドマン分解に対してブロックされていた。逆相
HPLCにより分離したGST-II-27をUnivap凍結濃縮装置中
で凍結乾燥した。各サブユニットを６Mグアニジン-HCl
と45mMジチオトレイトールとを使用して50℃で15分間還
元し、次いで８mMヨードアセトアミドで20℃で15分間ア
ルキル化した。得られたタンパク質を希釈して２Mグア
ニジン-HCl溶液を作成し、エンドプロテイナーゼ・リシ
ンＣを加えた(プロテアーゼ：GST=1：20)。プロテアー
ゼ消化を37℃で１夜行った〔Stoneらの著作；“A Pract
ical Guide to Protein andPeptide Purification for
Microsequencing(ミクロ配列決定のためのタンパク質及
びペプチド精製の実際的指針)”第２章、Matsudaira編
集、Academic Press発行〕。得られた消化物をＣ8逆相H
PLCカラム(SEG 2.1★ 100mM)に注入し、0.1％トリフル
オロ酢酸中のアセトニトリル濃度勾配を使用してペプチ
ド断片を溶出した。１個の断片のアミノ酸配列分析によ
り、核酸配列から予測されるようなGST-II-27のアミノ
酸208-222に対応する配列が得られた。この配列は、GST
-I-29又はGST-III-26について公表されている配列との
相同性を有していなかった。上記の還元し、アルキル化
したGST-II-27を、トリプシンで20℃で2.5時間消化する
ことにより別のアミノ酸配列を得た。ペプチド類を逆相
HPLC（Vydac C8 4.6★ 150mM、細孔300Aのカラムを使用
して）とアセトニトリル濃度勾配により分離した。３種
類のペプチドを配列決定した。これらの配列は、核酸配
列から予測されるようなGST-II-27のアミノ酸8-19、20-
38及び52-71に対応した。このことにより、単離されたc
DNAクローンがGST-II-27サブユニットに相当対応するこ
とが示される。図４は、GST-II-27、GST-I-29及びGST-I
II-26のアミノ酸配列を比べたものである。星印(★)は
一列上にある位置が完全に保存されていることを示し；
点(・)は位置がよく保存されていることを示し；合い印
(ι)はラットGST類について保存される位置を示す。GST
-II-27は２つの公知のイソ型、すなわちGST-I-29とGST-
III-26に対する相同性を示す。GST-II-27はGST-I-29と5
7％一致しており、GST-III-26と41％一致している。さ
らにまた、幾つかの残部はラットGST類について保存さ
れる。

【００５２】ゲノムクローンの単離 GST-II-27用cDNAを利用して、プロモーター領域を含ん
でいる対応ゲノム配列を単離するための遺伝子プローブ
を設計した。GST-II-27cDNA配列を調べて、別のトウモ
ロコシGST類又は他の植物／動物／ウイルス／ベクター
配列中に存在しておらず、それ故に特異的遺伝子プロー
ブとして適当である特異領域を同定した。プラスミドpI
J21の3´末端からPCRによって208bp配列を単離し、アク
リルアミドゲル電気泳動により精製した。このPCRプロ
ーブを無作為プライム(prime)標識し、これを使用して
トウモロコシゲノムライブラリー（15kBの平均挿入断片
サイズを有する、部分MboI消化DNA）から５×10^６個の
組換え体を選別した。得られた陽性クローンを、3´PCR
プローブと5´オリゴ(cDNAの5´末端由来の130bp)とを
用いてプラーク精製した。次いで、これらのゲノムクロ
ーンを地図化してcDNAの5´末端からプロモーター領域
の中に延びている(running)断片を同定した。約４kBの
プロモーター領域を含んでいるEcoRI断片を単離した。
この断片を、プラスミドpGIE7と命名されたpBSベクター
中にサブクローン化した。このプラスミドpGIE7はアバ
ディーン所在のザ・ナショナル・コレクションズ・オブ
・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア(NCI
MB)に寄託番号NCIMB 40426として寄託してある。あmるプライマー・エクステンション分析法(Ausubelらによる
Current Protocols inMolecular Biology,1987年に記載
の方法)を使用して図５に示すようにcDNAの末端から16b
pまで転写開始点(TSP)を地図化した。前記プロモーター
サブクローンpGIE7の配列分析により、予測されたTSPか
ら−29bp及び−110bpにそれぞれ推定上のTATAボックス
及びCAATボックスが明らかにされた。このTSP部位、TAT
Aボックス及びイントロン／エキソン境界領域は植物共
通塩基配列に適合し、単離された配列は実際にプロモー
ター領域であることが確認される。

【００５３】GST-II-27プロモーター断片の配列決定図６はGST-II-27遺伝子の5´末端を表すものであり、制
限部位の相対位置及び上記の単離されたEcoRI断片を示
す。ゲノムクローンのPCR及び制限分析により、300bpに
及ぶ上記２つのイントロンがcDNAの5´末端に対応する
領域に存在すること及び上記２つのイントロンのうちの
１つはEcoRI切断部位を含むことが示された。プラスミ
ドpGIE7は、GST-II-27プロモーター領域と幾つかの解読
配列に及ぶEcoRI−EcoRI断片を含む。エキソン１(下線)
の配列はcDNAの5´末端の配列に匹敵する。ゲノムサブ
クローンpGIE7とpGIS15とを使用して、5.4kbのGST-II-2
7遺伝子とプロモーターを配列決定した。両方の鎖につ
いて、図７に示した方法に従って大部分を配列決定し
た。図８に5´EcoRI制限部位から予測された転写開始点
までのプロモーター配列の3.8kBのヌクレオチド配列を
示す。

【００５４】GST-II-27プロモーター組立て体プロモーターサブクローンの詳細なマッピングと配列デ
ータとの組み合わせを使用して、プロモーター組立て体
用に適当な制限部位を選択した。プロトプラスト系用の
種々の過渡的(transient)検定ベクター(pPUG)並びにタ
バコ用の形質転換ベクター(pGSTTAK)及びトウモロコシ
(Zea mays)用の形質転換ベクター(pZM/RMS-3)を組み立
てた。組換えプラスミド全てをハイブリダイゼーション
プローブにより同定し、それらの全体と配向とを制限酵
素地図作成によって調べ、そして完成したベクターの境
界を配列決定によって分析した。種々の過渡的且つ安定
な形質転換GUSベクターを約3.8kbのGST-II-27プロモー
ターを使用して組み立てた。NdeIを使用してGST-II-27
プロモーターをATG及び４kb上流で切断した。この断片
をEcoRIで切断し、平滑末端化し、pTAK（Bin19に基づく
プロモーターのないGUS組立て体）のSmaI制限部位の中
にクローン化した。次いで、pGSTTAKから得られたGST G
USカセットを、過渡的検定ベクターpPUG(3.8GSTプロモ
ーター及びGUS)中にクローン化した。また、同じGST GU
Sカセットを、Bar選択し得るカセットを含んだpUC由来
のベクター中にクローン化しpZM/RMS-3を得た。図９に
上記のベクター組み立て方法の概要を示す。図10にトウ
モロコシの過渡的形質転換ベクターpPUGの最終的構造を
示し；図11にタバコの安定な形質転換ベクターpGSTTAK
を示し；図12にトウモロコシの安定な形質転換ベクター
pZM/RMS-3を示す。

【００５５】プロトプラスト過渡的発現評価系 pPUGを使用して一連のプロトプラスト過渡的評価実験を
行って、3.8kB GST-II-27プロモーター領域が転写的に
活性であること及びこのプロモーターからの発現が除草
剤解毒剤によって誘導し得ることを例証した。トウモロ
コシの細胞の懸濁液系(lines)又は試験管内(in vitro)
で生育させたトウモロコシの葉から、標準的酵素消化操
作、篩操作及び洗浄操作によって、プロトプラストを単
離した。プロトプラスト0.4×10⁵個当りにつきDNA 25μ
gを使用して、部分改変したPEG-媒介取込み法〔Negruti
uらの論文、Plant Mol.Biol., 8, 363-373(1987) に基
づいた方法〕によって形質転換を行った。GST誘導のた
めにプロトプラスト培養液に化学薬剤を３〜300ppm添加
し、次いで暗所で25℃でインキュベーションした。24時
間後に処理したプロトプラストの生存率を評価し、その
後に抽出物を調製した。GUS発現を蛍光定量GUS検定法
〔Jeffersonの論文、Plant Mol. Biol. Rep., 5, 387-4
05(1987)〕により測定した。結果の概略を図13に示す。
図13は、解毒剤を用いて又は用いずに19時間インキュベ
ーションした後のプロトプラスト中のpPUG発現のレベル
(level)を示すものである。結果は、GST-II-27の3.8kB
プロモーターが多数のプロトプラスト系において誘導可
能な方法でGUS濃度(level)を制御できることを例証して
いる。

【００５６】タバコにおける安定な形質転換実験 GUSレポーター(reporter)遺伝子に対して5´方向の3.8k
BのGST-II-27プロモーターと、nosターミネーターとを
含有するBin19ベクターpGSTTAKを使用して、Bevanによ
って報告されたアグロバクテリウムTiプラスミド法〔Nu
cleic AcidsResearch, 12, 8711-8721(1984)〕を使用し
てトランスジェニックタバコを作成した。この方法によ
って作成した形質転換体を、葉への塗布実験において使
用した。この実験においては、製剤化した解毒剤10mg
を、葉の10cm³の領域に施用した。第２の施用を48時間
後に同じ領域に対して行い、さらにその24時間後に組織
を採集した。解毒剤処理及び未処理の葉の組織を、Jeff
ersonの方法〔PlantMol. Biol. Rep., 5, 387-405(198
7)〕を使用してGUS活性を検定した。この方法を使用し
て一連の形質転換体を調べた。図14に示すように、解毒
剤施用により幾つかの場合においてGUS発現が100倍まで
高められた。このことにより、単子葉植物のGST-II-27
プロモーターが、双子葉植物種において誘導可能な方法
で遺伝子発現を調節できることが明らかに例証される。

【００５７】トウモロコシにおける安定な形質転換実験 GST GUSベクターRMS 3を使用して、パーチクル・ガン(p
article bombardment)法〔Gordon-Kammらの論文、Plant
Cell, 2, 603-618(1990)〕を使用してトランスジェニ
ックトウモロコシ植物を作成した。葉の組織を前記のよ
うにして除草剤解毒剤で塗布した場合に、誘導性GUS活
性が（図15に示すように）認められた。

【００５８】種々の組織におけるGST-II-27誘導発育中のトウモロコシの幾つかの組織におけるGST-II-2
7誘導を調査して、プロモーターがその自然環境におい
てどの様に働くかを調べた。製剤化したR-29148〔2,2,5
-トリメチル-3-(ジクロロアセチル)-1,3-オキサゾリジ
ン〕又は製剤のみを、トウモロコシ植物に根の浸液とし
て施用し(R-29148400mg／植物）、一定時間後に成熟及
び未成熟の葉、根、茎及び房の試料から粗タンパク質抽
出液を調製した。これらの抽出液と抗GST-II-27血清又
は抗GST-I-29血清を使用してウエスタンブロット分析を
行った。得られた結果により、29kDサブユニット(GST-I
-29)が供試組織全てにおいて構成的に発現しており、し
かも解毒剤施用するによって全ての組織中で誘導可能で
あったことが示される。GST-IIに特異的な27kDサブユニ
ットは、根組織において唯一構成的に発現しただけであ
った。R-29148の根浸液を施用した後に、供試試料全部
においてGST-IIの発現を検出した。この誘導は、R-2914
8を含まない製剤で処理した植物においては検出されな
かった。第16図は、解毒剤未処理（対照）及び解毒剤処
理のトウモロコシの成熟葉(２)、未成熟葉(３)、茎
(４)、根(５)及び房(６)においてGST-II27kDサブユニッ
トの組織局在を可能にするウエスタンブロットを示すも
のである。また、このブロットは標識(レーン１)及び純
粋なGST-II(レーン７)も含む。これらの実験の結果によ
り、本発明のプロモーターを使用して種々のトランスジ
ェニック組織中で遺伝子の発現を制御し得ることが示唆
される。

【００５９】解毒剤施用による房組織中のGST-II-27誘
導を示す圃場試験圃場試験を行って、化学的解毒剤の外部施用後の発育中
のトウモロコシ組織におけGSTイソ型の発現を調べた。
この圃場試験は野外条件下で統計的に顕著なGST-IIの誘
導を例証した。２種の解毒剤、R-25788(N,N-ジアリル-
2,2-ジクロロアセトアミド)及びR-29148〔2,2,5-トリメ
チル-3-(ジクロロアセチル)-1,3-オキサゾリジン〕を圃
場試験において使用した。これらをシクロヘキサノン、
Synperonic NPE1800及びTween 85からなる製剤又はSolv
esso 100、Synperonic NB13及びフェニルスルホネート
からなる製剤で施用した。解毒剤を、下記の４段階の施用量（施用量当たり３回反
復）： X 2.58 Kg/Ha 2X 5.16 Kg/Ha 4X 10.32 Kg/Ha 8X 20.64 Kg/Ha で頭上噴霧法(植物の上30cm)を使用して噴霧施用により
施用した。対照処理は、製剤ブランク2F(解毒剤なしの
処理2X)及び8F(解毒剤なしの処理8X)の噴霧を伴うもの
である。一定の期間後に、房を採取し、３種類の大き
さ：減数分裂前の小筒花(pre-meitonic floret)組織、
減数分裂小筒花組織及び減数分裂後の(post-meitonic)
小筒花組織に分けた。小筒花組織から粗タンパク質抽出
物を調製し、−70℃で保存した。これらの粗抽出物と、
GST-I-29サブユニット又はGST-II-27サブユニットに対
してヒツジで高めた抗血清とを使用してウエスタンブロ
ット分析を行った。セイヨウワサビペルオキシダーゼに
結合した抗ヒツジ血清を２次抗血清として使用し、増強
した化学蛍光(Enhanced Chemical Luminescence)(Amers
hamInternational PLC社製）を使用して検出を行った。
上記粗抽出物中に存在するGST-II-27の濃度を、粗抽出
物試料に隣り合ったSDS-PAGEゲルのレーンにおける精製
GST-II-27の標準を操作し、ブロット上の光学密度分析
を行うことにより定量した。また、FPLCイオン交換クロ
マトグラフィーでGSTイソ型を分離し、基質としてCDNB
を使用してGSTの存在を検定することにより、GST-IIの
誘導の濃度(level)も測定した。圃場試験の幾つかの結
果を図17及び図18に示す。図17はR-25788及びR-29148を
用いた処理についての全平均値を示すものである。誘導
性化学薬剤を存在させる(処理X、2X、4X、8X)と、対照
植物(処理2F及び8F)と比較した場合に圃場試験条件下で
GST-II酵素の量の増加を生じることが明らかである。図
18はウエスタンブロット分析により評価した2F圃場試験
の房試料から得られたGST-IIの量を示すものである。2X
処理試料と比較すると、誘導性化学薬剤を存在させると
基底濃度(basal level)にわたってGST-IIの量の増加を
生じることが明らかである。これらの結果により、解毒
剤R-25788及びR-29148を使用して圃場試験条件下でGST-
IIの発現を誘導できることが示される。GST-II-27遺伝
子プロモーターを含んだトランスジェニック植物を用い
た調査から得られた結果を用いたこれらのデータによ
り、前記のプロモーターが圃場試験条件下にトランスジ
ェニック植物中で遺伝子発現を制御する有効で効果的な
機構を提供するであろうことが示唆される。

【００６０】GST-II酵素を発現する除草剤耐性トランス
ジェニック植物の作成 GST-I-29をコード化するcDNAのヌクレオチド配列は、Pl
ant Mol. Biol., 7, 235-243にWiegandらによって公表
されている。この配列を使用して、特異的オリゴヌクレ
オチドプローブを設計し、それを使用して解毒剤誘導し
た苗の根のcDNAライブラリーから、GST-I-29をコード化
するcDNA(プラスミドpIJ4)の全長を単離した。GST-II-2
7をコード化するcDNA（図２に示されるもの）の単離に
ついては既に記載してある。上記のcDNA類の全長を、35
S CaMVプロモーターの制御下にBin19に基づくベクター
類の中に組み込み得る。図19にこれらの組立て体をどの
様にして調製し得るかを示す。GST-I-29解読領域の全長
とGST-II-27配列の全長とを、それぞれpIJ4及びpIJ21か
らEcoRIで消化することにより単離した。これらの断片
をクレノウ／Ｔ4ポリメラーゼを使用して平滑末端化し
た。次いで、平滑末端化した断片をSmaIクローニング部
位でpJRIiの35S CaMVプロモーターに3´連結した。正し
い配向のcDNA挿入断片を含有する組換え体を、制限酵素
地図化分析を使用して選択する。タバコ植物を、CaMV35
S-GST-I-29カセット又はCaMV35S-GST-II-27カセットの
いずれかを含有するベクターを用いて、既に記載してあ
る方法を使用して形質転換し得る。それぞれのGST-IIサ
ブユニット(29kD又は27kD)を発現する形質転換体は、サ
ブユニット特異的抗血清(前記のもの)を用いてウエスタ
ンブロット分析により調べた。かかる形質転換体は交差
してGST-I-29又はGST-II-27の両方を発現する後代を産
生し、除草剤耐性表現型をもたらし得る。

【００６１】

【００６２】

【図面の簡単な説明】

【図１】誘導(induced)トウモロコシ又は未誘導トウモ
ロコシの根の組織中のGST活性の時間経過を表すグラフ
である。

【図２ａ】GST-II-27をコード化するcDNAのヌクレオチ
ド配列の1/3を示す。

【図２ｂ】GST-II-27をコード化するcDNAのヌクレオチ
ド配列の2/3を示す。

【図２ｃ】GST-II-27をコード化するcDNAのヌクレオチ
ド配列の3/3を示す。

【図３】誘導(induced)RNA試料又は未誘導RNA試料のノ
ーザン分析結果を示す。

【図４】GST-I-29及びGST-III-26のアミノ酸配列と比較
したGST-II-27のアミノ酸配列を示す。

【図５ａ】ゲノムクローンのプライマーエクステンショ
ン・マッピングを示す。

【図５ｂ】ゲノムクローンのプライマーエクステンショ
ン・マッピングを示す。

【図６】GST-II-27遺伝子の5´末端を示す。

【図７】5.4kDのGST-II-27遺伝子とプロモーターとを配
列決定するのに使用した方法を示す。

【図８ａ】GST-II-27プロモーターのヌクレオチド配列
の1/3を示す。

【図８ｂ】GST-II-27プロモーターのヌクレオチド配列
の2/3を示す。

【図８ｃ】GST-II-27プロモーターのヌクレオチド配列
の3/3を示す。

【図９】GST GUSベクター組み立ての概要を示す。

【図１０】トウモロコシの過渡的(transient)形質転換
ベクターpPUGを示す。

【図１１】タバコの安定な形質転換ベクターpGSTTAKを
示す。

【図１２】トウモロコシの安定な形質転換ベクターpZM/
RMS-3を示す。

【図１３】プロトプラストの過渡的発現検定の結果を示
す。

【図１４】タバコの安定な形質転換実験の結果を示す。

【図１５】トウモロコシの安定な形質転換実験の結果を
示す。

【図１６】未処理トウモロコシ及び解毒剤処理トウモロ
コシ中のGST-II 27kDサブユニットの組織分布を示す。

【図１７】圃場試験におけるトウモロコシの解毒剤処理
後のGST-II濃度を示す。

【図１８】誘導組織と比較した種々の大きさの未誘導ト
ウモロコシの房の中のGST-II濃度を示す。

【図１９】CaMV35S-GST-I-29カセット又はCaMV35S-GST-
II-27カセットを含有するベクターの調製を説明する図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ブライト，シモン，ウイリアム，ジヨナサンイギリス国．バツキンガムシヤー・エスエル７・２エイワイ．マーロー．パウンド・レーン．24 (72)発明者グリーンランド，アンドリユー，ジエームスイギリス国．バークシヤー・エスエル６・８エスエツクス．メイデンヘツド．レイミル・ロード・イースト．ザ・キヤビン（番地なし) (72)発明者ホルト，デービツド，チヤールスイギリス国．バークシヤー・アールジイ 11・２イージイ．ウオキンガム．イーストハンプステツド・ロード．22 (72)発明者ジエプソン，アイアンイギリス国．バークシヤー・エスエル１・３キユジイ．スロウ．グレイス・ロード. 41 (72)発明者スコツチ，ウオルフガング，ヴアルターイギリス国．バークシヤー・アールジイ 11・６テイゼツト．クロウトーン．ヘルスレーク・パーク．グリーンフインチ・クロス．14 Ｆターム(参考） 2B030 AB03 AD04 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA10 CA04 DA01 EA04 GA06 GA11 GA21 HA01 4B050 CC03 DD13 FF11E FF12E FF14E 4B065 AA88X AA88Y AB01 AB03 BA02 BA08 BA10 CA27 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】図４に示すアミノ酸配列を有するグルタ
チオン-S-トランスフェラーゼ、イソ型II、27kDサブユ
ニット。
【請求項２】請求項１に記載のサブユニットをコード
するcDNA配列であって図２に示すヌクレオチド配列を有
するcDNA配列及びその遺伝暗号の縮退によって可能にさ
れる該配列の変型。
【請求項３】グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、
イソ型II、27kDサブユニットをコードし且つ前記プロモ
ーター領域を含んでいる対応ゲノム配列を単離するため
の遺伝子プローブとして請求項２に記載の配列を利用す
る方法。
【請求項４】グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、
イソ型II、27kDサブユニットをコードするDNAを植物の
ゲノムに組み込むことからなる、除草剤耐性のトランス
ジェニック植物の作成方法。
【請求項５】 GST-I 29kDサブユニットをコードするDN
Aをさらに植物中に組み込む請求項４に記載の方法。
【請求項６】 GST-III 26kDサブユニットをコードする
DNAをさらに植物中に組み込む請求項４又は５に記載の
方法。
【請求項７】 GST-I 29kDサブユニットをコードするDN
Aを第１の植物中に導入し、GST-II 27kDサブユニットを
コードするDNAを第２の植物中に導入し、次いで第１の
植物と第２の植物とを交雑させて除草剤耐性のトランス
ジェニック植物の作成方法。
【請求項８】前記GSTポリペプチドをコードするDNAが
構成性プロモーターの制御下にある請求項４〜７のいず
れか１項に記載の方法。
【請求項９】前記GSTポリペプチドをコードするDNAが
誘導性プロモーターの制御下にある請求項４〜７のいず
れかに１項に記載の方法。
【請求項１０】前記誘導性プロモーターがGST-II-27
プロモーターである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】請求項４〜10のいずれかに１項に記載
の方法によって産生される除草剤耐性のトランスジェニ
ック植物。
【請求項１２】トウモロコシである請求項11に記載の
植物。
【請求項１３】請求項11又は12に記載の植物の後代及
び種子。