JP2003159085A - Ｄｎａ発現系 - Google Patents

Ｄｎａ発現系

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 タンパク質及びポリペプチドの製造のため
に、及び組み替えウィルス又はキメラウィルスとして用
いることができ、先行技術より多くの利点を与える、ウ
ィルスベクターに基づいた改良ＤＮＡ発現系の提供。 【解決手段】 動物細胞におけるクローニングされたＤ
ＮＡからの有効なタンパク質製造に適した発現系提供の
ために、本発明ではタンパク質配列をコードするＤＮＡ
分子を、アルファウィルスからの正のストランドＲＮＡ
ウィルスゲノムのｃＤＮＡの工学的処理をした変異体中
に挿入し、それをその後ＲＮＡ転写及び組織培養細胞中
へのトランスフェクションを介して免疫化のためのキメ
ラウィルス粒子又はタンパク質製造のための組み替えウ
ィルスの製造に用いる。トランスフェクションの条件の
最適化及びウィルス複製の性質の故に、本発明は取り扱
い、タンパク質及びＲＮＡ製造の量に関する効率、なら
びに広い宿主域の点で簡略さと安全性の両方を結びつけ
ている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はアルファウィルスに
基づくＤＮＡ発現系に関し、その系はタンパク質及びワ
クチンなどの所望の生成物を高収率で製造するのに用い
るための動物細胞の形質転換に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】バイオテクノロジーの急速な発展は、組
み替えＤＮＡ法の導入に負う所が大きく、それは細胞の
分子機構を明らかにする新しい道を開くことにより、細
胞生物学的及び医学的研究に革命を起こした。ｃＤＮＡ
クローニングの方法を用いて毎年多数の興味深いタンパ
ク質分子が特性化されている。従って今日多くの研究活
動は、これらの分子の構造と機能の関係を明らかにする
ことに向けられている。結局この知識が人及び動物にお
いて健康を維持し病気を防除する我々の可能性を増すで
あろう。実際今日では、すでに薬剤又は診断薬として用
いられている新規“クローニング”タンパク質生成物の
数が増加しつつある。
【０００３】生物学的問題を研究するための組み替えＤ
ＮＡ法において、ＤＮＡ発現系は決定的な要素である。
従って用いるのに簡単で安全で、所望の生成物を高収率
で与え、多様な宿主細胞、特に哺乳類細胞でも用いるこ
とができる有効なＤＮＡ発現系が非常に求められてい
る。
【０００４】これらの要求を満たすＤＮＡ発現系の開発
に、多くの試みが成されてきた。多くの場合ウィルスが
そのような系の供給源として用いられてきた。しかし今
日まで、存在するウィルス発現系のいずれもこれらの要
求のすべてを満足に満たさなかった。例えばｃＤＮＡの
ためのバキュロウィルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発
現系は非常に有効であるが、昆虫細胞でしか用いること
ができない（引用文献のリストの参照文献１を参照；簡
単のために以下においては引用文献を該リスト中の番号
によってのみ示す）。哺乳類起源の細胞の場合は多くの
重要な分子を製造し、プロセシングしてそれらを活性と
しなければならないので、この系はそのような場合に用
いることはできない。さらに、タンパク質の構造と機能
の関係の分析は一般に突然変異株の全系列の分析を含む
ので、バキュロウィルスｃＤＮＡ発現系はその実行が簡
単ではない。表現型分析のための１個のバキュロ組み替
えウィルスを構築するのに、現在約６−８週間を要す
る。この後者の問題は、さらに有効なワクシニア組み替
えウィルス及び他の現代の組み替えウィルスｃＤＮＡ発
現系の場合も真実である（２，３）。安定に形質転換さ
れた細胞系の確立法も非常に苦心のいる方法であり、さ
らにタンパク質発現のレベルが非常に低いことが多い。
これまでウィルスＤＮＡ発現系の開発のほとんどの試
みは、ＤＮＡゲノムを有するウィルス又はレトロウィル
スに基づいており、後者の複製可能中間体は二重鎖ＤＮ
Ａである。
【０００５】しかし近年、ＲＮＡゲノムを含むウィルス
もＤＮＡ発現系の開発に用いられてきた。
【０００６】ＥＰ ０ １９４ ８０９において、
（＋）鎖ＲＮＡウィルスから誘導されたＲＮＡ形質転換
ベクターが開示され、それは該ウィルスＲＮＡゲノムの
複製に非−必須な領域への外因性ＲＮＡの挿入により修
正したキャップ構造のウィルスＲＮＡを含む。これらの
ベクターはそれを用いて形質転換された細胞における該
外因性ＲＮＡの機能の発現のために用いられる。ＲＮＡ
は溶液で、又はキャプシド中にパッケージ（ｐａｃｋａ
ｇｅ）して用いることができる。さらにこのＲＮＡは新
しい機能、すなわちタンパク質発現を有する新規細胞の
生成に用いることができる。該参照文献の発明は宿主細
胞、（＋）鎖ＲＮＡウィルスなどに関して一般にクレイ
ムされている。それにもかかわらず植物細胞のみが形質
転換され、さらに植物ウィルスであるブロモモザイクウ
ィルス（Ｂｒｏｍｏ Ｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）のみが
形質転換ベクターとして用いられたことは、そこに示さ
れている実験的支持から明らかである。
【０００７】該参照文献中で、参照文献に記載されてい
る原理を用い、いずれのＲＮＡウィルス−細胞系の、外
因性ＤＮＡのための有用な発現系への変換も当該技術に
おける熟練者には容易に明らかになると述べられている
が、少なくとも動物細胞ＲＮＡウィルスの場合はそれが
真実であることは証明されていない。この理由はいくつ
かあると思われる。それには： １）試験管内転写されたＲＮＡを用いた動物細胞の形質
転換の無効力；２）見掛け上複製可能な（コンピテン
ト）（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＲＮＡ転写物が通常用いら
れるトランスフェクション法の後でＲＮＡ複製を開始す
ることの無効力； ３）ヘルパーウィルスを含まない組み替えウィルスの高
力価株（ｓｔｏｃｋ）の製造の不可能； ４）外因性ＲＮＡの機能を発現する形質転換細胞の安定
な特性の確立の不可能が含まれる。
【０００８】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，Ｖｏｌ ８４，１９８７，ｐｐ４８１１−４８
１５において、アルファウィルス属の一員、すなわちシ
ンドビスウィルスに基づく遺伝子発現系が開示されてお
り、それがチキン胚繊維芽細胞などのトリの細胞中で細
菌のＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ）を発現するのに用いられている。
【０００９】Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，Ｖｏｌ ２４３，１９８９，１１８８−１１９１も
シンドビスウィルスに基づく遺伝子発現系を開示してい
る。この系は広範囲の動物細胞で有効であると言われて
いる。昆虫、トリ及びヒトを含む哺乳類細胞における細
菌のＣＡＴの発現がそこに開示されている。
【００１０】アルファウィルス属の一員、シンドビスウ
ィルスが挿入に耐え、少なくとも１つの外部遺伝子、細
菌のクロラムフェノコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＶＡＴ）遺伝子の発現に向かうことができることが先
行技術から知られているが、上記の両系共、外因性遺伝
子発現に関して無効力であり、用いるのが非常にやっか
いであることが記載の結果から証明されている。従って
今日、動物細胞におけるＤＮＡ発現の分野で有用な系は
見いだされていない。
【００１１】シンドビスウィルスの欠陥干渉（ＤＩ）ウ
ィルス変異体のｃＤＮＡコピーの最初の例は、ＣＡＴ遺
伝子を運ぶのに用いられた。ＲＮＡは試験管内で転写さ
れ、トリ細胞のトランスフェクションに用いられ、細胞
に野生型シンドビスウィルスを感染させた後、いくらか
のＣＡＴタンパク質の製造が示された。後者のウィルス
はＣＡＴ構築物の発現のためのウィルスレプリカーゼを
備えていた。この系の無効力は、１）初期ＤＩ−ＣＡＴ
ＲＮＡトランスフェクションの低レベル（細胞の０．
０５−０．５％）及び２）不自然で準最適タンパク質翻
訳開始シグナルの故の、タンパク質翻訳へのＤＩ−ＣＡ
Ｔ ＲＮＡの利用の無効力のためである。同系は組み替
えＤＩ−ＣＡＴゲノムのいくらかの、ウィルス粒子内へ
のパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）という結果も
与える。しかしこれは非常な大過剰の野生型シンドビス
ウィルスの製造と同時に起こる。従ってこの混合ウィル
ス株をＣＡＴ発現に用いることは、そのような株に感染
した細胞のほとんどの複製及び翻訳活性が野生型にかか
わり、組み替え遺伝子発現にかかわっていないという事
実により非常に妨げられるであろう。
【００１２】同様の問題の多くは、記載の他のシンドビ
ス発現系に固有である。この場合、ＲＮＡ複製可能シン
ドビスＤＮＡベクターがＣＡＴ遺伝子を運ぶのに用いら
れる。試験管内で製造されたＲＮＡは動物細胞中で複製
されることが示され、ＣＡＴ活性が見られる。しかし非
常に少数の細胞がトランスフェクトされるのみなので、
全体的ＣＡＴ製造はやはり低い。これに対する考えられ
る他の説明は、用いられたシンドビス構築物が複製に最
適でないことである。野生型シンドビスウィルスを用い
て組み替えゲノムを過剰の野生型ゲノムと共に粒子中に
保護することができ、その後この混合株を感染を介して
ＣＡＴタンパク質の発現に用いることができる。しかし
この株は組み替えＤＩ系に関する上記と同様の問題を有
する。後者の文献は、数過程を介してウィルスを増幅す
ると、力価の向上した組み替えウィルス粒子を得ること
ができることも示している。しかし野生型ウィルスの力
価も対応して向上し、野生型ウィルスの主製造という最
初の問題は残ることを記憶していなければならない。混
合ウィルス株の製造に数過程を用いた時に起こり得る問
題もいくつかある。組み替えゲノムに保存に対する選択
的強制がないので、これらは容易に１）転移を起こし、
２）効力の低い複製及び／又はパッケージング性の結果
として野生型ゲノムにより数で圧倒される。
【００１３】ウィルスＤＮＡ発現ベクターの他の重要な
特徴は、非関連病原体の抗原の発現へのその利用であ
り、従ってそれらをそのような病原体に対するワクチン
として用いることができる。
【００１４】ウィルス性の病気に対する安全で有効なワ
クチンの開発は、非常に困難な仕事であることが証明さ
れてきた。多くの現存するワクチンは、多くの感染症の
世界的流行との戦いを助けてきたが、有効なワクチンの
ない感染主がまだ多数ある。ワクチン製造の現在の方法
はいくつかの問題を提供する：（１）十分な大量の抗原
材料の製造が多くの場合困難である；（２）多くの場
合、ワクチン調剤が殺されていない、又は十分に弱毒さ
れていない危険が伴う；（３）免疫学的に活性な形態で
抗原エピトープを与えるのが非常に困難なので、有効な
ワクチンの製造が多くの場合困難である：（４）多くの
ワクチンの場合、抗原成分の遺伝的変異により新しい血
清学的特異性を有する新しい株が発生し、新しいワクチ
ンの開発の必要が再び生まれる。
【００１５】ワクチン製造におけるこれらの問題の多く
の克服のために２種類のウィルスＤＮＡベクターが開発
されてきた。これらは組み替えウィルス又はキメラウィ
ルスのいずれかを与える。組み替えウィルスは組み替え
ゲノムの回りに野生型ウィルスパッケージを含む。これ
らの粒子を用いて細胞を感染させ、それがその後組み替
えゲノムから抗原タンパク質を生産する。キメラウィル
スも組み替えゲノムを含むが、通常これは正常なウィル
ス構造タンパク質の一部として抗原の生産を指定し、そ
れが子孫粒子中に包まれ、例えばウィルススパイク（ｓ
ｐｉｋｅ）タンパク質の表面上に露出される。ワクチン
として用いる目的のこれらの種類のウィルス調剤の主要
な利点は、１）それらを大規模に生産することができ、
２）それらが生物の免疫系に自然な形態で抗原を与える
ことである。組み替えウィルスに感染した細胞は、外因
性抗原生成物を合成し、それをペプチドにプロセシング
し、その後それが正常な方法でＴ細胞にそれを与える。
キメラウィルスの場合、さらにウィルス粒子自身のサブ
ユニットの意味において抗原が露出される。従ってキメ
ラウィルスはエピトープキャリヤーとも呼ばれる。
【００１６】これらの種類のワクチン調剤の場合の主要
な困難は、宿主において安全で限度のある副作用のない
粒子の複製をいかに保証するかということである。これ
まで組み替えウィルス法の例としてワクシニアウィルス
を用いて（６９）、及びキメラ粒子の例としてポリオウ
ィルスを用いて（７０−７２）いくつかの成功を得てき
た。両ウィルス変異体共、通常用いられるワクチン株に
基づいているので、これらはそれぞれ組み替え体及びキ
メラ粒子として有用なワクチン候補であると主張され得
る。しかし両ウィルスワクチン共副作用の危険と組み合
わされ、重度の副作用の危険さえあり、さらにこれらの
ウィルス株はすでに多くの国で人口の大部分にワクチン
として使用されている。
【００１７】前記の議論から明らかな通り、種々の動物
細胞において重要なタンパク質又はポリペプチドを高収
率で容易に製造するために、及び種々の病原体に対する
安全で有効なワクチンとして使用するための組み替えウ
ィルス又はキメラウィルスの製造のために、改良ＤＮＡ
発現系の開発が非常に必要とされている。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、タンパク質及びポリペプチドの製造のために、及び
組み替えウィルス又はキメラウィルスとして用いること
ができ、先行技術より多くの利点を与える、ウィルスベ
クターに基づいた改良ＤＮＡ発現系の提供である。
【００１９】
【課題を解決するための手段】この目的のために、本発
明に従えば、アルファウィルスＲＮＡゲノムから誘導さ
れ、動物の宿主細胞に有効に感染させることができるＲ
ＮＡ分子を提供し、そのＲＮＡ分子は該アルファウィル
スＲＮＡの複製に必須である完全アルファウィルスＲＮ
Ａゲノム領域を含み、さらに該宿主細胞中でその機能を
発現できる外因性ＲＮＡ配列を含み、該外因性ＲＮＡ配
列はＲＮＡ分子中のその複製に必須でない領域に挿入さ
れる。
【００２０】アルファウィルスは、正の極性を有する一
重鎖ＲＮＡゲノムがウィルススパイクタンパク質を含む
エンベロープにより囲まれたヌクレオキャプシド中に封
入されたトガウィルスの科に属する属である。
【００２１】アルファウィルス属は中でもシンドビスウ
ィルス、セムリキ森林熱ウィルス（ＳＦＶ）及びロスリ
バーウィルス（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）を
含み、これらはすべて密接に関連している。本発明の好
ましい具体化に従い、セムリキ森林熱ウィルス（ＳＦ
Ｖ）をＤＮＡ発現系の基礎として用いる。
【００２２】外因性ＲＮＡ配列は、ウィルス又は宿主細
胞に与えるべき所望の遺伝的特性をコードし、通常該配
列は該遺伝的特性をコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列
と相補的である。該ＤＮＡ配列は細菌又は哺乳類遺伝子
などの単離された天然の遺伝子を含むことができ、又は
所望の遺伝的特性、すなわち酵素、ホルモンなどの所望
の生成物の発現、又は外因性抗原エピトープあるいは決
定基を指定するペプチド配列の発現をコードする合成Ｄ
ＮＡ配列を構成していることもできる。
【００２３】外因性ＲＮＡ配列がタンパク質又はポリペ
プチドなどの生成物をコードする場合、それをウィルス
ＲＮＡゲノムに挿入し、その欠失した構造タンパク質コ
ード領域に置換されるが、ウィルスエピトープをコード
するＲＮＡ配列は基本的に欠失を含まないか又はわずか
なヌクレオシドしか欠失していないウィルスＲＮＡゲノ
ムの構造タンパク質コード領域に挿入することができ
る。
【００２４】ＲＮＡ分子はそれ自体溶液中で、例えばＤ
ＥＡＥ−デキストラン法又はリン酸カルシウム沈澱法な
どの従来のトランスフェクションにより動物細胞の形質
転換に用いることができる。しかし細胞を感染性ウィル
ス粒子に感染させることにより形質転換すると、細胞の
形質転換の速度、従って発現の速度を実質的に増すこと
がてきると思われる。従って本発明の適した具体化は、
感染性粒子中にパッケージされた発明のＲＮＡ分子を含
むＲＮＡウィルス発現ベクターに関し、感染性粒子はア
ルファウィルススパイクタンパク質を含む膜により囲ま
れた該ＲＮＡをアルファウィルスヌクレオキャプシド中
に含む。
【００２５】本発明のＲＮＡ分子はそのような粒子中に
自由にパッケージすることができ、但しその全体の寸法
は野生型アルファウィルスＲＮＡゲノムに対応するか又
は該感染性粒子中に該ＲＮＡをパッケージするのに適合
する程度で変動する。
【００２６】パッケージされた組み替えゲノムを含み、
純粋で高力価の組み替えウィルス株を製造するこれらの
感染性粒子は、正常なウィルス粒子の感染により外因性
遺伝子又はＤＮＡ配列を発現する手段となり、形質転換
の程度に関してＲＮＡトランスフェクションよりずっと
有効である。
【００２７】本発明の適した具体化に従い動物宿主細胞
を、構造ウィルスタンパク質をコードする領域の一部又
は全部の欠失した本発明のＲＮＡと、ＳＰ６プロモータ
ー領域、ＲＮＡ複製に必要なシス作用シグナル（ｃｉｓ
ａｃｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）をコードするアルファ
ウィルスｃＤＮＡの５’及び３’領域、及びウィルス構
造タンパク質をコードする領域を含むが基本的にヌクレ
オキャプシド粒子内へのＲＮＡのパッケージングのため
のＲＮＡシグナルをコードする配列を含む非構造ウィル
スタンパク質コード領域をすべて欠失したヘルパーＤＮ
Ａベクターから試験管内で転写されたヘルパーＲＮＡ分
子と共にコトランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅ
ｃｔｉｏｎ）し、宿主細胞を培養することによりそのよ
うな感染性粒子を製造する。
【００２８】本発明の他の特徴に従い、エレクトロポレ
ーション（ｅｌｅｃｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により動物
宿主細胞への本発明のＲＮＡの有効な導入を行う。例え
ばベビーハムスター腎臓（Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ
Ｋｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞の場合、本発明のＳＦＶ
ｃＤＮＡから誘導されたＲＮＡ転写物の導入に関してほ
とんど１００％という形質転換の程度が得られた。これ
により、抗体沈降（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｅｃｉｐｉ
ｔａｔｉｏｎ）によりあらかじめ濃縮する必要なくタン
パク質を全細胞ライセート中で追跡できる程の多量の外
因性タンパク質製造を各細胞で達成することが可能にな
る。
【００２９】エレクトロポレーションにより、本発明の
パッケージされたＲＮＡを含む感染性粒子の製造のため
に、上記の方法で高度のコトランスフェクションを行う
ことも可能である。基本的にすべての動物細胞は本発明
のＲＮＡ分子及びヘルパーＲＮＡ分子の両方を含み、非
常に有効なトランス相補性及び感染性粒子の形成に導
く。最高１０9−１０10個の感染粒子を含む純粋な組み
替えウィルス株を、５ｘ１０6個のコトランスフェクシ
ョンされた細胞からわずか２４時間の培養の後に得るこ
とができる。さらにそのようにして得られたウィルス株
は、所望の組み替えゲノムのみを含み、宿主細胞に感染
することはできるが新しい子孫ウィルスを製造できない
ウィルスから成るので、非常に安全に用いることができ
る。
【００３０】コトランスフェクションされた細胞中で組
み替えウィルスを製造する時、野生型ウィルスゲノムの
再生が理論的に起こり得る。しかし条件付致死突然変異
をヘルパーゲノムの構造部分に挿入することにより、そ
のようなウィルスの拡散の可能性は除去することができ
る。そのような突然変異は本出願の実験部分で記載す
る。従ってそのようなヘルパーを用いて製造されたウィ
ルスは試験管内で特殊な条件下で処理しないと非感染性
である。
【００３１】エレクトロポレーションの方法はバイオテ
クノロジーの分野で周知であり、当該技術における熟練
者により最適条件を確立することができる。例えばその
ような方法を行うのにＢｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ ｐｕｌ
ｓｅｒ装置（Ｂｉｏｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，
ＵＳＡ）を用いることができる。
【００３２】本発明のＲＮＡ分子は、最初アルファウィ
ルスＲＮＡから製造され、所望の遺伝的特性をコードす
る外因性ＤＮＡフラグメントを挿入されたｃＤＮＡクロ
ーンの生体内又は試験管内転写によって誘導する。
【００３３】従って本発明は、アルファウィルスＲＮＡ
又はその部分と相補的でＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプ
ロモーターのすぐ下流に位置する全長又は部分的ｃＤＮ
Ａを含み、５’ＡＴＧＧ、５’ＧＡＴＧＧあるいは他の
５’末端及びＴＴＴＣＣＡ69ＡＣＴＡＧＴあるいは他の
３’末端を有するＤＮＡ発現ベクターにも関する。
【００３４】本発明の１つの特徴に従うと、ウィルスｃ
ＤＮＡの一部は欠失しており、欠失はウィルス構造タン
パク質をコードする全又は部分的領域を含み、さらにベ
クターは組み込まれたポリリンカー領域を含み、それは
ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ−ＸｍａＩに対応し、異種ポリペ
プチド又はタンパク質をコードする外因性ＤＮＡフラグ
メントがその後の動物宿主細胞における発現のためにベ
クターｃＤＮＡに挿入できるような位置に挿入されてい
る。
【００３５】本発明の他の特徴に従い、ベクターは全長
ｃＤＮＡを含み、その場合異種エピトープペプチド配列
をコードする外因性ＤＮＡフラグメントはウィルス構造
タンパク質をコードする領域に挿入することができる。
【００３６】その外因性ＤＮＡ挿入物を含むこのｃＤＮ
Ａクローンは、トランスフェクションにより動物細胞に
導入された後、非常に有効に複製されることが認められ
ている。
【００３７】本発明の非常に重要な特徴は、広範囲の動
物起源の宿主細胞に適用できることである。これらの宿
主細胞はトリ、哺乳類、爬虫類、両生類、昆虫及び魚類
細胞から選ばれることができる。哺乳類細胞の例は、ヒ
ト、サル、ハムスター、マウス及びブタ細胞である。適
したトリ細胞はチキン細胞であり、爬虫類細胞としては
ヘビ細胞を用いることができる。かえる及び蚊ならびに
ハエ（ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）からの細
胞はそれぞれ両生類及び昆虫細胞の例である。本発明の
非常に有効なウィルスベクター／宿主細胞系は、ＳＦＶ
／ＢＨＫ細胞に基づき、下記にてさらに詳細に議論す
る。
【００３８】しかし、本発明のＤＮＡ発現ベクターの非
常に重要な利点はそれが多様な動物細胞において有効な
ことであるが、それは他の真核細胞及び原核細胞でも用
いることができる。
【００３９】本発明は又、本発明のＲＮＡ分子を用い
た、あるいはｃＤＮＡを含み、外因性ＤＮＡフラグメン
トを運ぶ本発明の転写ベクターを用いた細胞のトランス
フェクションを含む、形質転換された動物宿主細胞の製
造法に関する。本発明の適した具体化に従い、トランス
フェクションは上記のエレクトロポレーション法により
行われ、非常に高いトランスフェクション率が得られ
る。
【００４０】さらに適した形質転換法は、本発明のＲＮ
Ａ分子を含む上記の感染性ウィルス粒子による動物宿主
細胞の感染に基づく。
【００４１】本発明の形質転換細胞は種々の目的に用い
ることができる。
【００４２】本発明の１つの重要な特徴は、形質転換細
胞を培養して外因性ＲＮＡを発現させ、続いて該発現に
より形成された生成物を単離精製することにより、ポリ
ペプチド又はタンパク質を生産するための本発明の形質
転換細胞の利用に関する。形質転換細胞は、上記のポリ
ペプチド又はタンパク質をコードする外因性ＲＮＡを含
む本発明のウィルス粒子による感染により、又はｃＤＮ
Ａを含み、ポリペプチド又はタンパク質をコードする外
因性ＤＮＡフラグメントを運ぶ本発明のＤＮＡベクター
の試験管内転写により得られるＲＮＡ転写物を用いたト
ランスフェクションにより製造することができる。
【００４３】本発明の他の重要な特徴は、ワクチンにお
ける免疫化成分として用いるための、又は抗血清製造の
ための免疫化成分の生体内製造のための免疫化目的のキ
メラウィルス粒子を含む抗原の生産のための、本発明の
形質転換細胞の利用に関する。
【００４４】従って本発明は、その構造タンパク質内に
挿入された外因性エピトープペプチド配列を有するキメ
ラアルファウィルスを含む抗原にも関する。
【００４５】キメラアルファウィルスはＳＦＶから誘導
するのが好ましい。
【００４６】適した具体化に従い、外因性エピトープペ
プチド配列はヒト免疫不全ウィルス型を含む免疫不全ウ
ィルス種に属するウィルスの構造タンパク質から誘導さ
れたエピトープペプチド配列を含む。
【００４７】本発明の他の特徴は、該抗原を免疫化成分
として含むワクチン調剤に関する。
【００４８】該ワクチンの場合、前記の条件付致死ＳＦ
Ｖ−突然変異、アンバー（停止コドン）又は温度感受性
突然変異などの突然変異をそのゲノム中に含むことによ
りキメラアルファウィルスが適当に弱毒される。
【００４９】例えば前記の条件付致死突然変異（形態形
成の間に宿主細胞においてある種のタンパク質分解的分
裂を行うことが欠失している）をその構造タンパク質中
に含むキメラウィルス粒子をワクチンとして用いる場
合、これは生物に与えられる前に限定タンパク質分解的
処理により最初に活性化され、受容細胞に感染できるよ
うにする。新しいキメラ粒子が活性化ウィルスに感染し
た細胞中で形成されるが、これらは再び致死表現型であ
り、感染がさらに拡散することはできない。
【００５０】本発明はまた、ａ）異種エピトープペプチ
ド配列をコードする外因性ＤＮＡフラグメントを運ぶ本
発明のＤＮＡベクターのｃＤＮＡの試験管内転写、及び
製造されたＲＮＡ転写物を用いた動物宿主細胞のトラン
スフェクション又はｂ）上記段階ａ）の該ｃＤＮＡを用
いた動物宿主細胞のトランスフェクション、トランスフ
ェクションされた細胞の培養及びキメラアルファウィル
ス抗原の回収を含む、本発明の抗原の製造のための方法
に関する。トランスフェクションはエレクトロポレーシ
ョンにより行うのが好ましい。
【００５１】本発明のさらに別の特徴は、ポリペプチド
抗原をコードする外因性ＲＮＡを含む組み替えウィルス
の、予防接種の目的又は抗血清の生産のための利用であ
る。この場合組み替えウィルス又はその条件付致死突然
変異体を用いて生体内で細胞を感染させ、感染細胞中で
抗原の製造を起こし、免疫系への抗原の提示に用いる。
【００５２】本発明の他の具体化に従い、外因性エピト
ープペプチド配列をコードする外因性ＲＮＡを含む本発
明の感染性粒子を生体内感染に用いることにより本発明
の抗原を生物内で製造する。
【００５３】以下において、代表的アルファウィルスで
あるセムリキ森林熱ウィルス（ＳＦＶ）と関連して本発
明をより詳細に説明する。この説明は添付図面と関連さ
せてより十分に理解することができる。図面中：図１は
セムリキ森林熱ウィルスの生活環に含まれる主要集合
（ｍａｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）及び解体（ｄｉｓａｓ
ｓｅｍｂｌｙ）の略図であり、ｐ６２分裂及びｐＨによ
るＳＦＶ侵入機能（ｅｎｔｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の
活性化の調節も示す。
【００５４】図２はＳＦＶの構造タンパク質の合成の間
の転移シグナルの利用を示し；上図は２６Ｓサブゲノム
ＲＮＡの遺伝子地図であり；中図はＰ６２、６Ｋ及びＥ
１タンパク質の膜転移の過程であり；内腔の側上の小さ
い矢印はシグナルペプチダーゼ分裂を示し；下図では３
種類のシグナルペプチドの特性を挙げている。
【００５５】図３は発現ベクターとしてＳＦＶが特に選
ばれる特徴を示す。
【００５６】図４Ａ−ＣはＳＦＶの全長感染性クローン
の構築を示し；図４ＡはＳＦＶゲノムの図解制限地図を
示し；ｃＤＮＡ合成の開始に用いられるプライマーを矢
印で示し、最終クローンの組み立てに用いられるｃＤＮ
Ａ挿入物を棒で示し；図４ＢはプラスミドｐＰＬＨ２１
１、すなわちＳＦＶの全長感染性クローンのためのキャ
リヤーとして用いられるＳＰ６発現ベクター及び得られ
るプラスミドｐＳＰ６−ＳＦＶ４を示し；図４ＣはＳＦ
ＶクローンのＳＰ６プロモーター領域の構造を示し；点
描の棒はＳＰ６プロモーター配列を示し、転写される第
１のヌクレオチドを星印により記し；下線の領域は真性
ＳＦＶ配列を示す。
【００５７】図５はＤＮＡ（Ｕ＝Ｔ）としてのｐＳＰ６
−ＳＦＶ４ ＲＮＡ転写物の完全ヌクレオチド配列、及
びＤＮＡ配列の下に非−構造ポリプロテイン及び構造ポ
リプロテインのアミノ酸配列を示す。
【００５８】図６は試験管内製造ＲＮＡの細胞中へのト
ランスフェクションの後のウィルス製造のためのＳＦＶ
ｃＤＮＡ発現系を示す。
【００５９】図７はＳＦＶ発現ベクターｐＳＦＶ１−３
及びヘルパー１の構築を示す。
【００６０】図８はＳＦＶベクタープラスミドｐＳＦＶ
１−３のポリリンカー領域を示し；サブゲノム２６Ｓ
ＲＮＡのためのプロモーターの位置は四角で囲んであ
り、転写するべき最初のヌクレオチドを星印で記す。
【００６１】図９はヘルパートランス相補性を用いた感
染性粒子中へのｐＳＦＶ１−ｄｈｆｒ ＲＮＡの生体内
パッケージングの略図である（ｄｈｆｒはジヒドロ葉酸
レダクターゼを意味する）；図１０はｐ６２からＥ２及
びＥ３への分裂によるｐ６２−含有非感染性ウィルス粒
子の感染性粒子への変換のためのトリプシンの利用を示
す。
【００６２】図１１はエレクトロポレーションによりＲ
ＮＡトランスフェクションした場合のＢＨＫ細胞におけ
る異種タンパク質の発現を示す。
【００６３】図１２は上図にてＢａｍＨＩ制限エンドヌ
クレアーゼ部位を生ずるＳＦＶの主要抗原部位及び試験
管内製造置換基を含む配列、ＨＩＶ ｇｐ１２０タンパ
ク質の主要中和ドメインに及ぶ配列、及びＳＦＶキャリ
ヤータンパク質Ｅ２にＢａｍＨＩオリゴヌクレオチドと
して挿入されたＨＩＶドメインを示し；下図は野生型又
はキメラ形態におけるドメイン２４６−２５１のブロー
アップ（ｂｌｏｗ−ｕｐｓ）を有するＳＦＶスパイク構
造の略図である。
【００６４】アルファウィルス セムリキ森林熱ウィル
ス（下文でＳＦＶと省略する）は、ウィルス学及び生物
学の両方において膜の生合成、膜の構造及び膜の機能、
ならびにタンパク質−ＲＮＡ相互作用の研究のためのモ
デル系として約２０年間用いられてきた（４，５）。そ
のようなモデルとしてＳＦＶを用いる主な理由はその単
純な構造及び有効な複製にある。
【００６５】図１−３を参照し、以下においてＳＦＶ及
びその複製をより詳細に説明する。基本的部分において
本発明はシンドビスウィルスなどの他のアルファウィル
スについても当て嵌まり、これに関連して引用されてい
る多くの参照文献は実際にシンドビスウィルスに向けら
れている。ＳＦＶはＲＮＡ−含有ヌクレオキャプシド及
び脂質二重層とタンパク質を含む回りの膜を含み、Ｃタ
ンパク質と呼ばれるタンパク質の２０面体殻が規則的に
配置されてキャプシドを形成し、その内側にゲノムＲＮ
Ａが包まれている。キャプシドはＥ１、Ｅ２及びＥ３と
呼ばれる３種類のタンパク質を含む脂質二重層により囲
まれている。これらのいわゆるエンベロープタンパク質
は糖タンパク質であり、そのグリコシル化部分が脂質二
重層の外側にあり、これらのタンパク質の複合体が“ス
パイク”を形成し、それは電子顕微鏡によりウィルスの
表面から外側に突き出ているのが見られる。
【００６６】ＳＦＶゲノムは、１１４２２ヌクレオチド
の一重鎖５’−キャップド及び３’−ポリアデニル化Ｒ
ＮＡ分子である（６，７）。それは正の極性を有し、す
なわちｍＲＮＡとして機能し、むきだしのＲＮＡは細胞
の細胞質中に導入されると感染を開始することができ
る。ウィルスが宿主細胞の形質膜上のタンパク質レセプ
ターに結合すると感染が開始され、それによりウィルス
が形質膜の表面上の“コーテッドピット（ｃｏａｔｅｄ
ｐｉｔｓ）”内に選択的に挿入され、それが陥入して
被覆小胞を細胞中に形成し、その後該小胞を有するエン
ドサイトーシスされたビリオンが急速にエンドソームと
呼ばれるオルガネラと融合する。ウィルスはエンドソー
ムから細胞の細胞質ゾルにむきだしのヌクレオキャプシ
ドとして逃げ、ウィルスのエンベロープがエンドソーム
に残る。その後ヌクレオキャプシドは“脱外被”され、
従ってゲノムＲＮＡが放出される。ここで図１を参照す
ると、ゲノムの５’の３分の２のポリプロテインへの翻
訳と共に感染が進行し、ポリプロテインが自己−分裂に
よるプロセシングにより４個の非構造タンパク質ｎｓＰ
１−４となる（８）。タンパク質ｎｓＰ１はメチルトラ
ンスフェラーゼをコードし、それはウィルス−特異的キ
ャッピング活性ならびに負ストランド合成を担い（９，
１０）；ｎｓＰ２はプロテアーゼであり、これはポリプ
ロテインをその４個の下部成分に切断し（１１，１
２）；ｎｓＰ３はリンタンパク質であり、まだ機能は未
知であり、ｎｓＰ４はＳＦＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性
を含む（１５，１６）。ｎｓＰタンパク質が合成される
とそれらは正ストランドゲノム（４２Ｓ）の全長負スト
ランドへの複製を担う。これらの分子はその後新しい４
２ＳゲノムＲＮＡの製造の鋳型として働く。それらは
又、サブゲノム（２６Ｓ）ＲＮＡの合成の鋳型としても
働く。この４０７３ヌクレオチド長のＲＮＡはゲノムの
最後の３分の１と共直線状であり、その合成は４２Ｓ負
ストランド上の２６Ｓプロモーターにて内部的に開始さ
れる。
【００６７】キャプシド及びエンベロープタンパク質は
異なる区画で合成され、それらは細胞質を通る別々の経
路に従い、すなわちエンベロープタンパク質は粗面小胞
体に結合した膜−結合リボソームにより合成され、キャ
プシドタンパク質は細胞質ゾル中の遊離のリボソームに
より合成される。しかし２６Ｓ ＲＮＡはウィルスのす
べての構造タンパク質をコードし、これらはポリプロテ
イン前駆体としてＣ−Ｅ３−Ｅ２−６Ｋ−Ｅ１の順で合
成される（１９）。キャプシド（Ｃ）タンパク質が合成
されるとそれは折り畳まれ、自己自身を新生鎖に切断す
るプロテアーゼとして働く（２０，２１）。合成された
Ｃタンパク質は前に複製されたゲノムＲＮＡに結合して
細胞の細胞質中で新しいヌクレオキャプシド構造を形成
する。
【００６８】該切断により新生鎖中のＮ−末端シグナル
配列が明らかになり、それはシグナル認識粒子により認
識され、新生鎖−リボソーム複合体を小胞体膜に向け
（２２，２３）、そこでそれは共翻訳的に転移し、シグ
ナルペプチダーゼにより分裂して３個の膜構造タンパク
質ｐ６２（Ｅ３／Ｅ２の前駆体の形態）、６Ｋ及びＥ１
となる（２４，２５）。構造タンパク質の合成の間に用
いられる転移シグナルを図２に示す。膜タンパク質は細
胞の生合成輸送経路内で広範囲の転写後プロセシングを
受ける。ｐ６２タンパク質は小胞体においてそのＥ３ド
メインを介し、Ｅ１とヘテロダイマーを形成する（２
６）。このダイマーは形質に輸送され、そこでスパイク
ヌクレオキャプシド相互作用を通してウィルス出芽が起
こる。輸送の非常に後の段階（ゴルジ体−後）でｐ６２
タンパク質は成熟ビリオンで見られる形態であるＥ３及
びＥ２に分裂する（２７）。この分裂はビリオンの宿主
細胞結合機能及びＥ１の膜融合能を活性化する。後者の
活性は、ウィルスが新しい宿主細胞のエンドソームに入
った後の第２の低−ｐＨ活性化段階に発現し、ウィルス
ヌクレオキャプシドの細胞の細胞質中への放出を担う
（２８−３２）。成熟ウィルス粒子は、キャプシドタン
パク質のＴ＝３対称の１８０個のコピー内に包まれた１
個のＲＮＡゲノムのコピーを含み、Ｔ＝４対称の３個の
群として配置されたＥ１＋Ｅ２＋Ｅ３を含むスパイクト
リマータンパク質の２４０個のコピーを有する脂質二重
層により囲まれている。
【００６９】ＳＦＶ侵入機能はｐ６２分裂及びｐＨによ
り活性化され、調節される。さらに特定するとＥＲで形
成されたｐ６２−Ｅ１ヘテロダイマーは耐酸性である。
これらのヘテロダイマーがゴルジ複合体を介して形質膜
に輸送されると、Ｅ１融合の活性化は複合体の解離を必
要とするので、弱酸性環境にもかかわらずＥ１融合は活
性化できない。図１に示す通り、放出されたウィルス粒
子はＥ２Ｅ１複合体を含む。Ｅ２とＥ１の解離は酸性ｐ
Ｈに敏感なので、エンドサイトーシスを介した宿主細胞
へのウィルスの侵入の間にエンドソームの酸性環境がス
パイク複合体（Ｅ１ Ｅ２ Ｅ３）の解離を始めさせ、
遊離のＥ１を生ずる。後者は上記の通り感染過程におけ
るウィルス及びエンドソーム膜の間の融合過程の触媒に
関して活性化されることができる。
【００７０】本発明の前部分で示した通りアルファウィ
ルス系、特にＳＦＶ系はいくつかの独特の特徴を有し、
それはＤＮＡ発現系において有利である。図３に関連し
て下記にまとめる。
【００７１】１．正の極性のゲノム。ＳＦＶ ＲＮＡゲ
ノムは正の極性であり、すなわちそれは直接ｍＲＮＡと
して機能し、従って感染性ＲＮＡ分子はゲノムの全長ｃ
ＤＮＡコピーからの転写により得ることができる。
【００７２】２．有効な複製。感染性ＲＮＡ分子はそれ
自身のＲＮＡレプリカーゼをコードし、それが今度は有
効なＲＮＡ複製を推進する。実際ＳＦＶは知られている
最も有効な複製ウィルスの１つである。数時間内に正−
ＲＮＡの最高２００．０００ものコピーが１個の細胞中
で形成される。これらの分子が豊富なために、感染細胞
の実際すべてのリボソームはウィルスにコードされたタ
ンパク質の合成に巻き込まれ、宿主タンパク質の合成を
圧倒し、感染細胞のパルス標識法はほとんどウィルスタ
ンパク質のみを標識する結果となる。正常な感染の間に
１０5個の新しいウィルス粒子が１個の細胞から製造さ
れ、これは少なくとも１０8個のタンパク質分子がウィ
ルスゲノムによりコードされた計算になる（５）。
【００７３】３．細胞質複製。ＳＦＶ複製は細胞の細胞
質中で起こり、そこでウィルスレプリカーゼは構造タン
パク質の製造のためのサブゲノムを転写し、キャップす
る（１９）。この特徴をｃＤＮＡ発現系に含むのは明ら
かに非常に有用であり、ｍＲＮＡのスプライシング、転
写因子の限度、キャッピング効率及びｍＲＮＡ輸送に関
する問題などの、従来の“核”ＤＮＡ発現系において遭
遇する多くの問題が除去される。
【００７４】４．細胞変性効果の遅い開始。感染細胞の
細胞変性効果は、感染におけるいくらか遅い時期に現れ
る。従って感染後約４時間から最高感染後２４時間とい
う広い時間枠があり、その間、構造タンパク質の非常に
高い発現レベルと無視し得る程度の形態学的変化が組み
合わされている。
【００７５】５．広い宿主域。この現象はおそらく、自
然界における節足動物ベクターから野生囓歯類（ｒｏｄ
ｅｎｔ）及び鳥に至る伝達を含む正常な生活環の結果で
ある。実験室条件下でＳＦＶは培養された哺乳類、ト
リ、爬虫類及び昆虫の細胞に感染する（３５）（Ｘｉｏ
ｎｇ，ｅｔ ａｌ，ｌｏｃ．ｃｉｔ）。
【００７６】６．自然には、ＳＦＶは人に対して病原性
が非常に低い。さらに組織培養細胞中で製造されたウィ
ルス株は明らかに非病原性である。特異的突然変異を用
い、ウィルス株の大量生産が必要な場合に安全性を支え
るのに非常に有用な特徴であるＳＦＶ条件付致死突然変
異体の創造が可能である。
【００７７】本明細書では、ヌクレオチド及びアミノ酸
配列において以下の略字を用いた：Ａｌａ、アラニン；
Ｉｌｅ、イソロイシン；ｌｅｕ、ロイシン；Ｍｅｔ、メ
チオニン；Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｐｒｏ、プロリ
ン；Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｖａｌ、バリン；Ａｓ
ｎ、アスパラギン；Ｃｙｓ、システイン；Ｇｌｎ、グル
タミン；Ｇｌｙ、グリシン；Ｓｅｒ、セリン；Ｔｈｒ、
トレオニン；Ｔｙｓ、チロシン；Ａｒｇ、アルギニン；
Ｈｉｓ、ヒスチジン；Ｌｙｓ、リシン；Ａｓｐ、アスパ
ラギン酸；Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ａ、アデニン；Ｃ、
シトシン；Ｇ、グアニン；Ｔ、チミン；Ｕ、ウラシル。
【００７８】以下の実施例において用いた材料及び一般
的方法を下記に記載する。
【００７９】１．材料。ほとんどの制限酵素、ＤＮＡポ
リメラーゼＩ、クレノウフラグメント、ウシ腸ホスファ
ターゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ，ＦＲＧ）から得た。ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ及びＫｐｎ
ＩならびにＲＮアーゼインヒビター（ＲＮアシン）及び
ＳＰ６ポリメラーゼはＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ
（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得た。シークエナーゼ
（修正Ｔ７ポリメラーゼ）はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ
ｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏ
ｈｉｏ）から得た。プロテイナーゼＫはＭｅｒｃｋ（Ｄ
ａｒｍｓｔａｄｔ，ＦＲＧ）から得た。リボヌクレオチ
ド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレ
オチド及びキャップ類似体ｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ
（５’）ＧはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｓｗｅｄｅｎ）から
得た。オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓの合成機３８０Ｂを用いて製造し、その後
ＨＰＬＣ及びＮＡＰ−５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）精製を
行った。スペルミジン、フェニルメチルスルホニルフル
オリド（ＰＭＳＦ）、ジエチルピロカーボネート（ＤＥ
ＰＣ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、クレアチンホ
スフェート及びクレアチンホスホキナーゼはＳｉｇｍａ
（Ｓｔ．Ｌｏｕｅｓ，Ｍｏ）から得た。パンソルビンは
ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）かに
得た。アガロースはＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ
（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）から、アクリルアミ
ドはＢｉｏＲａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から購入
した。Ｌ−［35Ｓ］−メチオニン及びα−［35Ｓ］−ｄ
ＡＴＰ−α−ＳはＡｍｅｒｓｈａｍから得た。
【００８０】２．ウィルスの成育及び精製：ＢＨＫ−２
１細胞は、５％のウシ胎児血清、１０％のトリプトース
ホスフェートブロス、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホ
ン酸）及び２ｍＭのグルタミンを補ったＢＨＫ培地（Ｇ
ｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中で成育した。９０％の集密
的細胞単層をＰＢＳで１回洗浄し、０．２％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２ｍＭ
のグルタミンを含むＭＥＭ中のＳＦＶに０．１の多重度
で感染させた。感染後（ｐ．ｉ．）２４時間で培地を集
め、４℃にて８，０００ｘｇの遠心を２０分間行うこと
により細胞破片を除去した。４℃のＳＷ２８ローター
中、２６，０００ｒｐｍで１．５時間遠心することによ
りウィルスを培地からペレット化した。ウィルスは０．
５ｍＭのＥＤＴＡを含むＴＮ中に再懸濁した。
【００８１】３．代謝標識（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｌａ
ｂｅｌｉｎｇ）及び免疫沈降。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、
２ｍＭのグルタミン、０．２％のＢＳＡ、１００ＩＵ／
モルのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマ
イシンを補ったＭＥＭ中で成育したＢＨＫ細胞の集密的
細胞単層に３７℃にて５０の多重度で感染させた。１時
間ｐ．ｉ．後、培地を新しい培地と交換し、３．５時間
成育を続けた。培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄
し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２ｍＭのグルタミンを含
むメチオニン−非含有ＭＥＭを上に載せた。３７℃にて
３０分後、培地を１００μＣｉ／ｍｌの［35Ｓ］メチオ
ニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む同培地と交換し、プレ
ートを３７℃にて１０分間培養した。１０倍過剰のメチ
オニンを含む標識培地で細胞を２回洗浄し、その後同培
地中で種々の時間の間培養した。プレートを氷上に置
き、細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、最後に１０μｇ／
ｍｌのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリ
ド）を含むライシス（ｌｙｓｉｓ）緩衝液（１％ＮＰ−
４０−５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６−１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ−２ｍＭＥＤＴＡ）を加えた。細胞をプレ
ートから砕き、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機にて４℃、
６，０００ｒｐｍで５分間遠心することにより核を除去
した。記載されている通りにタンパク質の免疫沈降を行
った（３１）。簡単に記載すると、ライセートに抗体を
加え、混合物を氷上に３０分間保った。氷上で３０分間
パンソルビンに結合することにより複合体を回収した。
複合体を低塩緩衝液（ｌｏｗ ｓａｌｔ ｂｕｆｆｅ
ｒ）で１回、高塩緩衝液で１回、及び１０ｍＭのトリス
−ＨＣｌで１回洗浄してからゲル負荷緩衝液と共に加熱
した。ｄｈｆｒを沈降させるために、ＳＤＳを０．１％
まで加え、混合物を９５℃に２分間加熱し、その後１０
体積のライシス緩衝液を加えた。抗−Ｅ１［８．１３
９］、抗−Ｅ２［５．１］及び抗Ｃ［１２／２］（３
７）単クローン性抗体は記載されている。腹水液中の単
クローン性抗体ＯＫＴ−９を用いてヒトトランスフェリ
ンレセプターを沈降させた。この調剤は、ＡＴＣＣ（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ）Ｎｏ ＣＲＬ ８０２１から得た対応するハ
イブリドーマ細胞系を用いて我々の実験室においてＴｈ
ｏｍａｓ Ｅｂｅｌにより与えられた。多クローン性う
さぎ抗マウスｄｈｆｒは、Ｅ．Ｈｕｒｔ（Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＦＲＧ）からの
親切な贈り物であり、うさぎ抗−リゾチームは記載され
ている（３８）。
【００８２】４．蛍光抗体法。間接蛍光抗体法を行うた
めに、ガラスのカバーグラス上の感染細胞単層を、リン
酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回濯ぎ、−２０℃のメタ
ノール中で６分間固定した。固定後、メタノールを除去
し、カバーグラスをＰＢＳで３回洗浄した。０．５％の
ゼラチン及び０．２５％のＢＳＡを含むＰＢＳを用いて
室温で培養することにより、非特異的抗体結合を阻止し
た。阻止緩衝液を除去し、一次抗体を含む同緩衝液と交
換した。室温で３０分後、ＰＢＳで３回洗浄することに
より反応を止めた。一次抗体の場合と同様にして二次抗
体（ＦＩＴＣ−複合羊抗−マウス［ＢｉｏＳｙｓ，Ｃｏ
ｍｐｉｅｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ］）の結合を行った。Ｐ
ＢＳで３回洗浄し、水で１回濯いだ後、カバーガラスを
乾燥させてから２．５％のＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザ
ビシクロ−［２．２．２］−オクタン）を含むＭｏｖｉ
ｏｌ ４−８８（Ｈｏｅｃｈｓｔ，Ｆｒａｎｄｆｕｒｔ
ａｍ Ｍａｉｎ，ＦＲＧ）中に固定した。
【００８３】５．ＤＮＡ法。プラスミドをエシェリキア
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｏｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）［ｒｅｃＡ ｅｎｄＡ１ ｇｙｒＡ９６
ｔｈｉｌ ｈｓｄＲ１７ｓｕｐＥ４４ ｒｅｌＡ１
Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ φ８０ｄｌａ
ｃＺΔ（Ｍ１５）］中で成育した。すべての基礎的ＤＮ
Ａ法は、基本的に記載の通りに行った（３９）。収率と
純度を増すために凍結段階の間に３体積のフェノールを
含んだ凍結−解凍法（４０）によりＤＮＡフラグメント
をアガロースゲルから単離した。フラグメントを、ベン
ゾイル−ナフトイル−ＤＥＡＥ（ＢＮＤ）セルロース
（Ｓｅｒｖａ Ｆｅｉｎ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，Ｈｅ
ｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＦＲＧ）クロマトグラフィーにより
精製した（４１）。感染ＲＮＡの製造に用いたプラスミ
ドは、１ＭのＮａＣｌを通した沈降及びその後ＣｓＣｌ
中でバンド形成することにより精製した（３９）。ある
場合には、Ｑｕｉｇｅｎクロマトグラフィー（Ｄｉａｇ
ｅｎ Ｇｍｂｈ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，ＦＲＧ）に
よりプラスミドを精製した。
【００８４】６．特定部位のオリゴヌクレオチド突然変
異誘発。オリゴヌクレオチド突然変異誘発のために、Ｓ
ＦＶ ｃＤＮＡクローンの適したフラグメントをＭ１３
ｍｐ１８又はｍｐ１９中にサブクローニングし（４
２）、ＤＨ５αＦＩＱ［ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１ ｓｕ
ｐＥ４４ ｔｈｉｌ ｒｅｃＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅ
ｌＡ１ φ８０ｄｌａｃΔ（Ｍ１５） Δ（ｌａｃＺＹ
Ａ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９／Ｆ’ｐｒｏＡＢ ｌａｃｌq
ｌａｃＺΔ（Ｍ１５） Ｔｎ ５］（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中
に形質転換した（４３）。これらの構築物からのＲＦ
ＤＮＡをＲＺ１０３２［Ｈｆｒ ＫＬ１６ｄｕｔ１ ｕ
ｎｇ１ ｔｈｉ１ ｒｅｌＡ１ ｓｕｐＥ４４ ｚｂｄ
２７９：Ｔｎ１０．］中に形質転換し（４４）、ウリジ
ンの存在下でウィルスを成育し、ウラシル残基をウィル
スゲノム中に挿入した。一重鎖ＤＮＡをフェノール抽出
によりＰＥＧ沈降ファージから単離した。Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３８０Ｂ合成機上でオリゴヌ
クレオチドを合成し、ＮＡＰ−５カラム（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）上のゲル濾過により精製した。オリゴヌクレオ
チド ５’−ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＴ
ＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＡＡＴＴＡ
ＣＡＴＣＣＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＧ、５’−ＧＣＧＣＡ
ＣＴＡＴＴＡＴＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＣＧＧＧＴＡ
ＡＴＴＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣ
ＣＧＣＣＧＧ及び５’−ＧＣＧＣＡＣＴＡＴＴＡＴＡＧ
ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧ
ＡＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＴＧＧＣＧを用
いて新しいリンカー部位［ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ−Ｘｍ
ａＩ］をＳＦＶ ｃＤＮＡクローンに挿入した。オリゴ
ヌクレオチド５’−ＣＧＧＣＧＧＴＣＣＴＡＧＡＴＴＧ
ＧＴＧＣＧ及び５’−ＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧ
ＣＧＧＣＣＧをシークエンシングプライマー（ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）（ＳＰ１及びＳＰ２）と
してポリリンカー部位の上流及び下流で用いた。リン酸
化オリゴヌクレオチドを前に述べられた通りシークエナ
ーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ
ｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎ
ｄ，Ｏｈｉｏ）と共に突然変異誘発で用いた。試験管内
製造ＲＦ形態をＤＨ５αＦ’ＩＱ中に形質転換し、得ら
れたファージ単離物を、シークエナーゼの利用に関する
ＵＳＢの案に従ってジデオキシシークエンシング（ｄｉ
ｄｅｏｘｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により正しい突然
変異の存在に関して分析した。最後に突然変異フラグメ
ントを全長ＳＦＶ ｃＤＮＡクローン中に再挿入した。
この場合も適した突然変異の存在をプラスミドＤＮＡか
らのシークエンシングにより確認した。６Ｋ領域の欠失
は他に記載されている。
【００８５】７．試験管内転写。ＳｐｅＩ直線化プラス
ミドＤＮＡを試験管内転写の鋳型として用いた。４０ｍ
Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６ｍＭのスペルミ
ジン−ＨＣｌ、５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴ
Ｔ）、１００μｇ／ｍｌのヌクレアーゼ非含有ＢＳＡ、
それぞれ１ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ、５００μ
ＭのＧＴＰ、１単位／μｌのＲＮアシン及び１００−５
００単位／ｍｌのＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを含む１０
−５０μｌの反応において３７℃にて１時間ＲＮＡを合
成した。キャップド転写物（４６）の製造の場合、類似
体ｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ （５’）Ｇ又はｍ7Ｇ（５’）
ｐｐｐ（５’）Ａを１ｍＭにて反応中に含んだ。ＲＮＡ
製造の定量のために微量の［α−32Ｓ］−ＵＴＰ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）を反応中に含み、挿入を三塩化酢酸沈澱
から測定した。必要な場合はＤＮアーゼ１又はＲＮアー
ゼＡをそれぞれ１０単位／μｇ鋳型あるいは２０μｇ／
ｍｌで加えることにより、ＤＮＡ又はＲＮＡを３７℃に
て１０分間消化した。
【００８６】８．ＲＮＡトランスフェクション。ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン法によるＢＨＫ単層細胞のトランスフ
ェクションを前に記載の通りに行った（４７）。エレク
トロポレーションによるトランスフェクションの場合、
ＲＮＡは試験管内転写反応から直接、又は５ｍＭのＤＴ
Ｔ及び１単位／μｌのＲＮアシンを含む緩衝液で転写物
を希釈して加えた。細胞をトリプシン処理し、完全ＢＨ
Ｋ−細胞培地で１回、及び氷冷ＰＢＳ（ＭｇＣｌ2及び
ＣａＣｌ2を含まない）で１回洗浄し、最後にＰＢＳに
再懸濁して１０7細胞／ｍｌとした。細胞は直接使用す
るか又は氷上で終夜保存（ＢＨＫ培地中）した。エレク
トロポレーションの場合、０．５ｍｌの細胞を０．２ｃ
ｍのキューベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）（ＢｉｏＲａｄ）
に移し、１０−５０μｌのＲＮＡ溶液を加え、キューベ
ットを逆さにすることにより溶液を混合した。パルス制
御装置を最大抵抗に設定したＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ
Ｐｕｌｓｅｒ装置を用い、１．５ｋＶ／２５μＦの２回
の連続パルスにより、室温でエレクトロポレーションを
行った。１０分間培養した後、細胞を完全ＢＨＫ−細胞
培地中に１：２０で希釈し、組織培養皿に移した。プラ
ーク分析のために、エレクトロポレートした細胞を１ｍ
ｌ当たり約３ｘ１０5個の新しい細胞と共にプレート化
し、３７℃で２時間培養し、その後完全ＢＨＫ−細胞培
地中の１．８％の低融点アガロースを上に載せた。３７
℃で４８時間培養した後、ニュートラルレッドで染色す
ることによりプラークを視覚化した。
【００８７】９．ゲル電気泳動。ナトリウムドデシルサ
ルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）の試料を調製し、前に記載されている通り
に（４８）５％の堆積ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅ
ｌ）を含む１２％の分離ゲル（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ
ｇｅｌ）上で実験した。６Ｋペプチドの分離の場合、ア
クリルアミドの１０％−２０％直線勾配ゲルを用いた。
Ｋｏｄａｋ ＸＡＲ−５フィルムに露光する前に、ゲル
を１０％酢酸−３０％メタノール中で３０分間固定し
た。ゲルをフルオログラフィー（４９）用に調製した場
合、それを固定後に３０％メタノール中で３０分間洗浄
し、その後１Ｍのサリチル酸ナトリウム−３０％のメタ
ノール中に３０分間浸漬してから乾燥した。核酸は、５
０ｍＭのトリス−ボレート−２．５ｍＭのＮａ2ＥＤＴ
Ａを緩衝液として用いたアガロースゲル上で実験した。
染色の場合、実験中に０．２μｇ／ｍｌのエチジウムブ
ロミドを緩衝液及びゲルに含んだ。
【００８８】
【実施例】実施例１ この実施例では全長ＳＦＶ ｃＤＮＡクローンを調製
し、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプ
ラスミド中に置き、全長及び感染性転写物の試験管内転
写をさせる。ｐＳＰ６−ＳＦＶ４と称されるこのプラス
ミドを、１９９１年１１月２８日にＰＨＬＳ Ｃｅｎｔ
ｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅｓ，Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓ
ｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，Ｕ．Ｋ：に供託し、暫
定受け入れ番号９１１１２８２６を与えられた。
【００８９】図４Ａ−Ｃに示す通り、ＳＦＶクローン構
築の戦略は、ＳＦＶ ＲＮＡ分子の既知のヌクレオチド
配列によって指定される適した制限エンドヌクレアーゼ
部位の下流の、鋳型ＲＮＡに沿った数箇所でｃＤＮＡ合
成を開始することである。ウィルスＲＮＡを精製ウィル
ス（中でもＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮｅｗＨ
ａｖｅｎ，ＵＳＡのＡｒｂｏｖｉｒｕｓ ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎから入手可能）からフェノール−クロロホルム
抽出により単離し、前に記載されている通り（５０）ｃ
ＤＮＡ合成の鋳型として用いた。第１のストランド合成
は、５’−ＴＴＴＣＴＣＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＴＣＧＴ
Ｃをプライマー−１として（ＳＦＶは２０４２−２０６
２に相当する）及び５’−ＧＴＴＡＴＣＣＣＡＧＴＧＧ
ＴＴＧＴＴＣＴＣＧＴＡＡＴＡをプライマー−２として
（ＳＦＶは３３２３−３３４９に相当する）ならびにオ
リゴ−ｄＴ12-18をプライマー−３として（ＳＦＶの
３’−末端）用いて３位置で開始した。
【００９０】第２のストランド合成の前に、第１のスト
ランドｃＤＮＡへのオリゴヌクレオチド５’−ＡＴＧＧ
ＣＧＧＡＴＧＴＧＴＧＡＣＡＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＣ
（ＳＦＶのゲノム配列の２８個の最初の塩基と同一）の
ハイブリッド化を行った。第２のストランド合成の完了
後、ｃＤＮＡを裁断し（ｔｒｉｍｍｅｄ）、プライマー
−１の反応の場合を除いたすべての場合に二重鎖アダプ
ター５’−ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡ
ＣＴＡＧＴ／ＧＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＴ
ＣＡ−３’（５’−付着−ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
−ＮｏｔＩ−ＸｍａＩＩＩ−ＳｐｅＩ−ブラント−
３’）を加え、記載されている通りに（５１）ｃＤＮａ
をＥｃｏＲＩ切断ｐＴＺ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，
Ｓｗｅｄｅｎ）中にクローニングした。５’末端領域の
クローニングは、異なる方法で行った。ＳＦＶはＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位を１９４７位に含むので、プライマー−１
を用いて開始したｃＤＮＡはこの領域を含まねばなら
ず、従ってＨｉｎｄＩＩＩはそのｃＤＮＡの３’末端の
指定に用いることができる。ＳＦＶの正に５’末端で制
限部位を得るために、ｃＤＮＡをＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ切断ｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅ
ｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）中にクローニングした。
ＳＦＶゲノムは配列５’−ＡＴＧＧで始まるので、Ｓｍ
ａＩ部位のブラントＣＣＣ−３’末端へのこの連結反応
は、ＮｃｏＩ部位Ｃ’ＣＡＴＧＧを作る。ＳＦＶ配列は
３個のＮｃｏＩ部位を含むが、これらのいずれもＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位の前の領域内になく、従ってこれらの５’
末端クローンはさらにこの目的のために特に設計された
ベクター中にＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと
してクローニングしなければならない(下記参照)。ｐＧ
ＥＭ１中の最初のｃＤＮＡクローンを制限分析によりス
クリーニングし、１５００ｂｐ以上の大きさの挿入物を
含むものすべてを、挿入物の両端にＳＰ６又はＴ７シー
クエンシングプライマーを用いてプラスミドから直接シ
ークエンシングすることによりさらに特性化するために
選んだ。ｐＴＺ１８Ｒ中のＳＦＶ５’−末端クローン
は、ｌａｃシークエンシングプライマーを用いてシーク
エンシングした。ＡＦＶ ＲＮＡの試験管内合成を推進
するためにＳＰ６プロモーターを用いた。あまり多くの
異種ヌクレオチドを加えずにこのプロモーターの前のＳ
ＦＶ５’末端をクローニングするために、ｐＧＥＭ１の
誘導体を構築する必要があった。従ってｐＧＥＭ１をＥ
ｃｏＲＩで開け、Ｂａｌ３１欠失を作り、ＤＮＡをＴ４
ＤＮＡポリメラーゼでブラント化し、Ｎｃｏｌオリゴ
ヌクレオチド（５’−ＧＣＣＡＴＧＧＣ）を加えた。得
られたクローンを、ＳＰ６プロモーターの転写開始部位
（下線のＧ）に直接ＮｃｏＩ配列を有する変異体を拾い
上げる（適した緊縮度で）ために設計されたオリゴヌク
レオチド５’−ＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＣＣＡＴＧ
ＧＣを用いたコロニーハイブリッド化（３９）によりス
クリーニングした。Ｂａｌ３１欠失により最初のプラス
ミドの多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎ
ｇ ｓｉｔｅ）のすべての制限部位が除去されたので、
これらは新しい変異体からのＰｖｕＩ−ＮｃｏＩフラグ
メントを、ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ位で挿入され
たＮｃｏＩ部位を有する別のｐＧＥＭ１の変異体（ｐＤ
Ｈ１０１）にクローニングすることにより復活（ｒｅｓ
ｔｏｒｅｄ）した。これによりプラスミドｐＤＨ２０１
が作られた。最後にＳＦＶ ｃＤＮＡのクローニングに
用いられたアダプターをｐＤＨ２０１中のＥｃｏＲＩ及
びＰｖｕＩＩ部位の間に挿入し、プラスミドｐＰＬＨ２
１１を作った（図４Ｂ）。このプラスミドを、全長クロ
ーンの組み立て物におけるＳＦＶ ｃＤＮＡフラグメン
トの受容体として、これらの部位を用いて独立した重複
サブクローンを結び付けることにより用いた。全長クロ
ーン、ｐＳＰ６−ＳＦＶ４の組み立てに用いたフラグメ
ント及び適した制限部位を図４Ａに示す。５’−末端の
場合、選ばれたフラグメントは適したＳＦＶ配列５’−
ＡＴＧＧを含み、前に追加のＧ−残基を１個有する。こ
のＧ−残基を除去すると、ＳＰ６からの転写効率が低下
するが試験管内製造ＲＮＡの感染性には影響しない。従
ってこの後のすべての研究で用いるクローンは５’末端
にＧ−残基を含む。クローンの３’−末端の場合、６９
個のＡ−残基を含むｃＤＮＡフラグメントが選ばれた。
ｃＤＮＡの３’−末端に独特のＳｐｅＩ部位を含むこと
により、プラスミドは直線化することができ、試験管内
でランオフ転写（ｒｕｎｏｆｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎ）ができ、７０個のＡ−残基を有するＲＮＡを与
える。図４ＣはＳＦＶ ｃＤＮＡクローンの５’及び
３’境界配列を示す。全長ＳＦＶ ＲＮＡの感染性をい
かにして得、示すかの一般的な概略を図６に示す。ｐＳ
Ｐ６−ＳＦＶ４ ＳＰ６転写物の完全ヌクレオチド配列
を非構造及び構造タンパク質のアミノ酸配列と共に図５
に示す。
【００９１】典型的に１００ｎｇの鋳型当たり約５μｇ
のＲＮＡが１０単位のポリメラーゼを用いて得られた
が、より多量の酵素を用いることによって収率の有意な
向上は得られなかった。条件はアルファウィルスの感染
性転写物の製造に関して以前に報告された（５２）（４
７）条件と少し異なる。１ｍＭのｒＮＴＰ濃度でＲＮＡ
の最大の製造が得られた。しかし感染性は５’キャップ
構造の存在にも依存するので、転写反応におけるＧＴＰ
濃度を半分にした時に最適感染性が得られた。この低下
は製造されるＲＮＡの量には限界的影響しか与えない
が、特異的感染性を３倍に上げた（データは示していな
い）。
【００９２】図５に示すｃＤＮＡ配列を以下の実施例で
用いた。しかし図５中の最初の５’−Ｇヌクレオチドを
欠いたＳＦＶ ｃＤＮＡ配列の場合に上記で示した通り
有効性は低いとしても、１個又は数個のヌクレオチドが
図５に示した配列と異なっている配列もベクターとして
有用である。
【００９３】実施例２ この実施例ではＳＦＶ ＤＮＡ発現ベクターの構築を開
示する。
【００９４】実施例１で得たＳＦＶの完全ゲノムをコー
ドするｃＤＮＡクローンを用い、異種挿入物のための道
を作るために２６Ｓ構造遺伝子のコード領域を欠失する
ことによってＳＦＶ ＤＮＡ発現ベクターを構築する。
しかしｎｓＰ１−４レプリカーゼ複合体の製造に必要な
非構造コード領域は保存する。ＲＮＡ複製は短い５’
（ｎｔ １−２４７）配列要素（５３，５４，５５）及
び３’（ｎｔ １１４２３−１１４４１）配列要素（５
６，５７）に依存し、従ってこれらもＣ遺伝子のすぐ上
流の２６Ｓプロモーター（１７，１８）と同様にベクタ
ー構築物中に含まれねばならない。
【００９５】図７に示す通り、最初に実施例１のＳＦＶ
ｃＤＮＡクローンからのＸｂａＩ（６６４０）−Ｎｓ
ｉＩ（８９２７）フラグメントをｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）
（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｗｌ，ＵＳＡ）中にク
ローニングした（段階Ａ）。得られたプラスミド、ｐＧ
ＥＭ７Ｚｆ（＋）−ＳＦＶから、ＥｃｏＲＩフラグメン
ト（ＳＦＶは７３９１及び８８７４６に相当する）をＭ
１３ｍｐ１９中にクローニングし、特定部位の突然変異
誘発を用いて２６Ｓプロモーター部位からすぐ下流にＢ
ａｍＨＩ−ＸｍａＩ−ＳｍａＩポリリンカー配列を挿入
した（段階Ｂ）。Ｍ１３ ｓｓＤＮＡ（一重鎖）からの
シークエンシングにより正しい突然変異体が確認された
ら、ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）−
ＳＦＶ中に再挿入し（段階Ｃ）、ｐＳＰ６−ＳＦＶ４中
にＸｂａＩ−Ｎｓλフラグメントとして逆クローニング
した（段階Ｄ）。ＳＦＶの構造タンパク質をコードする
ｃＤＮＡ領域の主要部分を欠失するために、これらのプ
ラスミドをＡｓｕＩＩ（７７８３）及びＮｄｅＩ（１１
０３３）を用いて切断し、４種類すべてのヌクレオチド
の存在下でクレノウフラグメントを用いてブラント化
し、連結し、それぞれｐＳＦＶ１、ｐＳＦＶ２及びｐＳ
ＦＶ３と呼ばれる最終的ベクターを作った（段階Ｅ）。
ベクターは２６ＳサブゲノムＲＮＡのプロモーター領域
及びＥ１タンパク質の最後の４９アミノ酸、ならびにＳ
ＦＶゲノムの完全非コード３’末端を保存している。
【００９６】ベクターにおいてサブゲノム（２６Ｓ）部
分をコードする部分をポリリンカー配列で置換し、２６
Ｓプロモーター下で異種ｃＤＮＡ配列を挿入クローニン
グさせた。図８に示す通り、これらの３種類のベクター
は同一の塩基カセットを２６Ｓプロモーターの下流に挿
入して含み、すなわち３つのすべての読み枠においてポ
リリンカー（ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ−ＸｍａＩ）に翻訳
停止−コドンが続く。ベクターはポリリンカーカセット
が挿入されている位置が異なる。ｐＳＦＶ１の場合、カ
セットは２６Ｓ翻訳開始部位の３１塩基下流に位置して
いる。キャプシド遺伝子翻訳の開始作因（ｍｏｔｉｖ
ｅ）は認められた配列（５８）と同一である。従ってこ
の作因はｐＳＦＶ２にも備わっており、その場合それは
キャプシド遺伝子の作因のすぐ後に位置している。最後
にｐＳＦＶ３ではカセットがキャプシド遺伝子の開始コ
ドン（ＡＵＧ）のすぐ後に位置する。挿入の両端を調べ
るのに必要なシークエンシングプライマー（ＳＰ）は、
２６Ｓプロモーター領域（ＳＰ１）又は停止コドンカセ
ットの後の領域（ＳＰ２）のいずれかとハイブリッドす
るように設計されている。
【００９７】２６ＳプロモーターはｎｓＰ４コード領域
の３’−末端と重複することに注意する。ｐＳＦＶ２の
場合、クローニング部位はＳＦＶキャプシド遺伝子の翻
訳開始部位のすぐ後に位置する。ｐＳＦＶ３の場合、ク
ローニング部位はさらに３ヌクレオチド下流に位置し、
すなわちＳＦＶキャプシド遺伝子の開始ＡＵＧコドンに
直接続いている。ポリリンカーに続く３個の翻訳停止コ
ドンを四角で囲む。下流シークエンシングプライマー
（ＳＰ１）は２６Ｓプロモーターと重複し、上流シーク
エンシングプライマー（Ｓｐ２）はＸｍａＩＩＩ部位と
重複する。
【００９８】実施例３ この実施例ではヘルパーウィルスベクター構築物を含む
生体内パッケージング系を調製する。
【００９９】系は、構造タクパク質機能の欠失したＳＦ
Ｖ変異体、又は実施例２で得た発現ベクター構築物から
誘導された組み替えＲＮＡを感染性ウィルス粒子内にパ
ッケージすることを可能にする。従ってこの系は正常な
感染により組み替えＲＮＡを細胞中に導入できるように
する。実施例１で得たｐＳＰ６−ＳＦＶ４の制限エンド
ヌクレアーゼ部位ＡｃｃＩ（３０８）及びＡｃｃＩ（６
３９９）の間の領域を、図７の段階Ｆで示す通りに切断
及び連結することにより欠失させ、ｐＳＦＶ−Ｈｅｌｐ
ｅｒ１と呼ばれるヘルパーベクターを構築する。ベクタ
ーはＲＮＡ複製に必要な５’及び３’シグナルを保存し
ている。Ｈｅｌｐｅｒベクターのほとんど完全なｎｓｐ
領域が欠失しているので、この構築物から製造されるＲ
ＮＡは機能的レプリカーゼ複合体の欠乏のために細胞中
で複製されない。図９に示す通り、ｐＳＦＶ１−組み替
え及びヘルパーｃＤＮＡの試験管内転写の後、ヘルパー
ＲＮＡはｐＳＦＶ１−組み替え誘導体と共にコトランス
フェクションされ、ヘルパー構築物が新しいウィルス粒
子の組み立てに必要な構造タンパク質を与え、組み替え
構築物はＲＮＡ複製に必要な非構造タンパク質を与え、
組み替えゲノムを含むＳＦＶ粒子が製造される。コトラ
ンスフェクションは実施例６で開示した通りエレクトロ
ポレーションにより行うのが好ましく、ＢＨＫ細胞を宿
主細胞として用いるのが好ましい。
【０１００】ＲＮＡのパッケージのために、キャプシド
タンパク質を結合することが示されている（５７，５
９）領域であるｎｓＰ１の末端の領域が必要である。ヘ
ルパーはこの領域を欠いているので、このベクターから
誘導されたＲＮＡはパッケージされず、従って組み替え
及びヘルパーを用いたトランスフェクションは組み替え
−誘導ＲＮＡを有するウィルス粒子のみを製造する。こ
れは、これらのウィルスがさらに継代することはでき
ず、従って１段階ウィルス株を与えることにつながる。
利点は、これらの粒子による感染がウィルスタンパク質
を製造しないことである。
【０１０１】実施例４ この実施例は実施例１からの全長ＳＦＶ ｃＤＮＡクロ
ーンの変異体の構築を説明し、それにより異種エピトー
プをコードする異種ＤＮＡ配列の挿入、及び該異種エピ
トープをＰ６２、Ｅ２又はＥ１スパイクタンパク質の不
可欠の部分として有する組み替え（キメラ）ウィルスの
製造が可能になる。
【０１０２】この目的のために、Ｅ２及びＥ１エンベロ
ープタンパク質の機能、形態学及び抗原構造に関するす
べての知識が欠かせない。アルファウィルスの病原性に
関する以前の研究は、Ｅ２に対する抗体が種類−特異的
であり、優れた中和活性を有するが、Ｅ１に対する抗体
は群−特異的であり、非中和性であることを示した
（５）。しかし、密接に関連したアルファウィルスであ
るＳＦＶ、シンドビス及びロスリバーの抗原部位がマッ
ピングされ、アミノ酸配列のレベル（６０，６１，６
２，６３）と関連づけられたのは最近である。これらの
研究は、問題の主要部位のほとんどがＳＦＶ Ｅ２スパ
イクタンパク質のアミノ酸位置２１６、２３４及び２４
６−２５１にあることを示した。興味深いことに、これ
らの３つの部位は、コンピューター分析により予測され
たものと正確に同一の部位である。この実施例ではドメ
イン２４６−２５１がアルファウィルスの群内で高度に
保存された構造、及びハイドロパシ−プロファイル（ｈ
ｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｐｒｏｆｉｌｅ）を有するのでこ
の領域を用いた。ｐＳＰ６−ＳＦＶ４ Ｐ６２タンパク
質の２４６−２５１領域に異種エピトープをコードする
遺伝子を挿入すると、各ヘテロダイマー、すなわち２４
０コピー上に１個の新しいエピトープを有する粒子を与
える。
【０１０３】ＳＦＶゲノムのＥ２部分内への異種エピト
ープの特異的挿入を可能にする独特の制限エンドヌクレ
アーゼ部位を作るために、オリゴヌクレオチド５’−Ｇ
ＡＴＣＧＧＣＣＴＡＧＧＡＧＣＣＧＡＧＡＧＣＣＣを用
いた特定部位の突然変異誘発によりＢａｍＨＩ部位を挿
入した。
【０１０４】実施例５ この実施例では、ＳＦＶの条件付致死変異体を、実施例
１で得たＳＦＶ ｃＤＮＡから構築し、その変異体はＰ
６２タンパク質に突然変異を有し、該タンパク質の非分
裂形態を生じ、その結果この変異体は外因的に加えられ
たプロテアーゼを用いて最初に切断しないとそのまま新
しい宿主細胞に感染することはできない。
【０１０５】図１０に示す通り、この形態のウィルスは
トランスフェクトされた細胞における野生型の能力を用
いて組み立てられるが新しい宿主細胞に侵入することは
できないので、この構築物は異種エピトープのためのワ
クチンキャリヤーとして有利に用いることができる。阻
止は、不活性ウィルス粒子のトリプシン処理により克服
することができる。これは粒子を、このウィルス変異株
の増幅に用いることができる十分に侵入−可能な形態に
変換する。
【０１０６】活性化されるとＳＦＶ変異体は、通常はエ
ンドサイトーシス経路により細胞に侵入し、感染を開始
する。形質膜でウィルスタンパク質が作られ、出芽が起
こる。しかし製造されたウィルス粒子はすべて不活性な
形態であり、従って複製が一巡した後感染は終わる。感
染の徹底が阻止される理由は、ｐ６２の分裂部位に特定
部位の突然変異誘発により導入された突然変異である。
このアルギニンからロイシンへの置換（ｐ６２タンパク
質のＥ３部分のアミノ酸位置６６における）は、分裂部
位の認められた特徴を変化させ、細胞表面への輸送に間
に通常ｐ６２タンパク質をＥ２及びＥ３ポリペプチドに
切断する宿主細胞のプロテイナーゼによって認識されな
い。代わりに外因的に加えられたトリプシンがこの切断
を行うことができ、この場合最初の分裂部位の直前のア
ルギニン残基６５で起こる。この切断が、侵入スパイク
サブユニットの結合を制御することによりウィルスの侵
入機能力の活性化を調節するので、非分裂ｐ６２のみを
有するウィルス粒子が新しい宿主細胞に侵入することは
完全に不可能である。
【０１０７】分裂欠失変異Ｅ２の創造は以前に記載され
ている（２９）。この領域に及ぶＡｓｕｌｌ−Ｎｓλフ
ラグメントをその後単離し、全長ｃＤＮＡクローンｐＳ
Ｐ６−ＳＦＶ４中にクローニングした。
【０１０８】実施例６ この実施例では、外因性ＤＮＡを含む実施例１からの全
長ｃＤＮＡから試験管内で転写されたＳＦＶ ＲＮＡ分
子又はその変異体、あるいは実施例２からのＳＦＶベク
ターを用いたＢＨＫ細胞のトランスフェクションを開示
する。トランスフェクションは最適条件下で非常に有効
であることが示されているエレクトロポレーションによ
り行う。
【０１０９】ＢＨＫ細胞を上記のＳＦＶ ＲＮＡ分子を
用いたエレクトロポレーションによりトランスフェクト
し、温度、電圧、キャパシタンス及びパルス数などのパ
ラメーターを変化させることにより最適条件を決定し
た。２５μＦにおける１．５ｋＶの２回の連続パルスに
より最適トランスフェクションが得られ、その条件下で
死亡する細胞の数は無視し得るものであった。方法全体
を通じて細胞を０℃より室温に保つのが良いことが見い
だされた。エレクトロポレーションによるトランスフェ
クションを、投入ＲＮＡの関数としても測定した。予想
通り、トランスフェクションの頻度の増加はＲＮＡ濃度
に直線的に依存しておらず、１００％トランスフェクシ
ョンを得るために約２μｇのｃＲＮＡが必要であった。
【０１１０】従来のトランスフェクションと比較する
と、これは大きな進歩である。例えばＤＥＡＥ−デキス
トラントランスフェクションの場合、最適で細胞のわず
か０．２％がトランスフェクトされたのみであった。
【０１１１】実施例７ この実施例は、２１ｋＤの細胞質マウスジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（ｄｈｆｒ）、９０ｋＤの膜タンパク質ヒト
トランスフェリンレセプター（ＴＲ）、及び最後に１４
ｋＤの分泌タンパク質チキンリゾチームをコードする遺
伝子の場合の、ＳＦＶベクターである実施例２からのｐ
ＳＦＶ１により推進される異種遺伝子発現を示す。ｄｈ
ｆｒ遺伝子はｐＧＥＭ２−ｄｈｆｒから（６４）Ｂａｍ
ＨＩ−ＨｉｎＩＩＩフラグメントとして単離し、クレノ
ウフラグメントを用いてブラント化し、ＳｍａＩ−切断
ｐＳＦＶ１に挿入された。トランスフェリンレセプター
遺伝子は、最初にｐＧＥＭ１−ＴＲからＸｂａＩ−Ｅｃ
ｏＲＩフラグメントとしてｐＧＥＭ７ＺＦ（＋）中にク
ローニングされ（６４，６５）、続いてそこからＢａｍ
ＨＩフラグメントとしてｐＳＦＶ１にクローニングされ
た。最後にリゾチーム遺伝子（２１）を有するｐＧＥＭ
２からのＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＦＶ１にクロー
ニングした。
【０１１２】異種遺伝子の発現の研究のために、ｄｈｆ
ｒの試験管内製造ＲＮＡ及びＴＲ構築物をＢＨＫ細胞中
にエレクトロポレートした。野生型ＳＦＶのＲＮＡを標
準として用いた。エレクトロポレーション後（ｐ．
ｅ．）の異なる時点で細胞を１０分間パルス−標識し、
続いて１０分間追跡し、その後ライセートをゲル電気泳
動及びオートラジオグラフィーにより分析した。ＢＨＫ
細胞は、野生型ＳＦＶのＲＮＡ、ｐＳＦＶ１−ｄｈｆｒ
及びｐＳＦＶ１−ＴＲを用いてトランフェクトし、３、
６、９、１２、１５及び２４時間ｐ．ｅ．でパルス−標
識した。等量のライセートにつき１２％ゲル上で実験し
た。９時間の試料はＳＦＶ、ｄｈｆｒ及びトランスフェ
リンレセプタータンパク質の免疫沈降（ＩＰ）にも用い
た。ｐＳＦＶ１−リゾチームを用いてトランスフェクト
した細胞を９時間ｐ．ｅ．でパルス−標識し、その後示
された時間（時間）追跡した。等しい割合のライセート
又は培地を１３．５％ゲル上に負荷した。ＩＰは１時間
追跡ライセート試料からの免疫沈降を示す。Ｕ−列は標
識されたがトランスフェクトされていない細胞のライセ
ートである。侵入ＲＮＡは負のストランド合成から出発
し、これは約４−５時間ｐ．ｅ．までピークに達しない
ので（５）、３時間ｐ．ｅ．で外因性タンパク質はほと
んど製造されなかった。この時点でほとんどすべての標
識タンパク質は宿主起源であった。対照的に６時間ｐ．
ｅ．にて、外因性タンパク質が高い効率で合成され、宿
主タンパク質合成の重度の阻害が明らかであった。これ
は９時間ｐ．ｅ．でさらに衝撃的であり、最大停止（ｍ
ａｘｉｍｕｍ ｓｈｕｔ ｄｏｗｎ）に達した。異種タ
ンパク質の有効な製造は最高２４時間ｐ．ｅ．まで続
き、その後製造は速度が落ち（データは示していな
い）、細胞が定常期に入ったことを示した。
【０１１３】チキンリゾチームは分泌タンパク質なの
で、その発現は細胞ライセートと成育培地の両方から分
析した。細胞を９時間ｐ．ｅ．でパルス−標識し、その
後８時間追跡した。結果を図１１に示す。リゾチームは
ゆっくり分泌されるがほとんどすべての標識物質は追跡
の間に培地に分泌された。
【０１１４】実施例８ この実施例は本発明の生体内パッケージング系を示す。
【０１１５】ｐＳＦＶ１−ＴＲの試験管内製造ＲＮＡを
異なる比率でヘルパーＲＮＡと混合し、これらの混合物
をＢＨＫ細胞中にトランスフェクトした。細胞を２４時
間成育し、その後培地を集め、遠心によりウィルス粒子
をペレット化した。蛍光抗体法により感染性単位（ｉ．
ｕ．）の数を決定した。ヘルパーと組み替え体の１：１
の比率が最も有効に感染性粒子を製造することが見いだ
され、平均５ｘ１０6個の細胞が２．５ｘ１０9ｉ．ｕ．
を与えた。異なる感染の多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でＢＨ
Ｋ細胞に感染させることにより、このウィルス株の感染
性を調べた。ｐＳＦＶ１−ＴＲ組み替えＲＮＡを有する
そのような生体内パッケージ粒子に感染した後のＢＨＫ
細胞におけるヒトトランスフェリンレセプターの発現に
関する結果を図１１の右下に示す。ＭＥＭ（０．５％の
ＢＡＳ及び２ｍＭのグルタミンを含む）中に希釈した２
００μｌのウィルスを細胞上に載せ、５−０．００５の
範囲のｍ．ｏ．ｉ．値を与えた。３７℃にて１時間後、
完全ＢＨＫ培地を加え、９時間成育を続け、その時点で
１０分間のパルス（１００μＣｉ35Ｓ−メチオニン／ｍ
ｌ）及び１０分間の追跡を行い、細胞をライシス緩衝液
に溶解した。３００μｌ（３０，０００細胞に相当す
る）のライセートからの１０μｌにつき１０％ゲル上で
実験し、乾燥ゲルを−７０℃にて２時間露光した。発現
レベルが高いので、終夜露光を用いたオートラジオグラ
フィーで明白なバンドを得るためにわずか３，０００細
胞しか必要でなかった。
【０１１６】従って１細胞当たり約１ｉ．ｕ．にて有効
なタンパク質製造及びそれに伴う宿主細胞停止が起こる
ことが見いだされた。１個のＳＦＶ感染細胞が平均１０
8個のキャプシドタンパク質分子を製造するので、１回
のエレクトロポレーションから製造されたウィルス株を
用いて約５０ｍｇのタンパク質に相当する１０17個のタ
ンパク質分子を製造できることになる。
【０１１７】前記の実験結果から本発明は、これまでに
存在した発現系のいくつかの欠点を含まない非常に有用
で有効な発現系に関することが明らかである。本発明の
系の主な利点を簡単にまとめると以下のようになる： （１）１回のトランスフェクション実験により１日で高
力価の組み替えウィルス株を製造することができる。選
択／スクリーニング、プラーク精製及び増幅段階の必要
がない。組み替えウィルスの容易な製造は、多くの系列
の突然変異体の表現型を特性化しなければならない実験
において特に重要である。 （２）組み替えゲノムのみがパッケージングシグナルを
含み、ヘルパーゲノムは含まないので、組み替えウィル
ス株はヘルパーウィルスを含まない。 （３）組み替えウィルスは、昆虫及びより高級な真核細
胞型を含む多様な細胞中に“自然”で漏れのない方法で
組み替えゲノムを感染させるのに用いることができる。
そのような広い宿主域は、特に発現したタンパク質の活
性のために細胞−型−特異的翻訳後修正反応が必要な場
合、発現系にとって非常に有用である。 （４）得られるタンパク質発現のレベルが非常に高く、
そのレベルは感染の間のウィルスタンパク質の量に相当
する。宿主細胞タンパク質の停止も起こり、それにより
抗体媒介による抗原濃縮を必要とせずに細胞ライセート
中の異種タンパク質を明白に追跡することが可能にな
る。これは細胞生物学におけるＤＮＡ発現実験をかなり
容易にするであろう。さらに内在する対になるものによ
る発現タンパク質に対する抵触の問題（すなわちホモ−
オリゴマー化反応）を避けることができる。
【０１１８】実施例９ この実施例はエピトープキャリヤーを示す。
【０１１９】ワクチンの開発が最も重要とされている非
常に重要な例は、ヒト免疫不全ウィルスＨＩＶ−１によ
って起こる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関する
（６６，６７）。これまでＨＩＶ−１に対する有効なワ
クチンを製造する試みはすべて失敗してきたが、破裂Ｓ
ＩＶ−１（猿免疫不全ウィルス）を用いた予防接種があ
る程度ウィルスの感染に対する保護を与えるという極く
最近の報告がある（６８）。しかしＨＩＶ−１に対する
安全で有効なワクチンの開発は、ウィルスの生物学的性
質の故に非常に困難であろう。この実施例ではＨＩＶ−
１の１個のエピトープをＳＦＶのＥ２タンパク質の抗原
性ドメイン中に挿入した。用いられたエピトープはＨＩ
Ｖ−１の糖タンパク質ｇｐ１２０に位置し、アミノ酸３
０９−３２５に及ぶ。これはＨＩＶ−１の可変ループを
形成し、Ｎ−グリコシル化部位の直後に位置する。
【０１２０】ＨＩＶエピトープをコードする既製のオリ
ゴヌクレオチドのカセット挿入を用い、ＨＩＶの３０９
−３２５エピトープがＢａｍＨＩ部位に挿入されたキメ
ラを構築した。ＢａｍＨＩ部位における必要な塩基置換
によりベクター中のアミノ酸変化は起こらなかったが、
２個のアミノ酸（Ａｓｐ及びＧｌｕが位置を変えた。試
験管内製造ベクターＲＮＡは野生型の能力を用いて細胞
感染を起こすので、この変化は悪影響を及ぼさない。図
１２はエピトープキャリヤー中の問題の領域の配列を示
す。予備実験でキメラタンパク質が製造されることが示
された。タンパク質を抗−ＨＩＶ抗体を用いて免疫沈降
させることができる。これらはＨＩＶに対するワクチン
調剤に用いることができるキメラウィルス粒子の製造に
も用いることができると思われる。そのような粒子を図
１２の下部に示す。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
【表４】
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
【表７】
【０１２８】
【表８】
【０１２９】
【表９】
【０１３０】
【表１０】
【０１３１】
【表１１】
【０１３２】
【表１２】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はセムリキ森林熱ウィルスの生活環に含ま
れる主要集合（ｍａｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）及び解体
（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）の略図であり、ｐ６２分裂
及びｐＨによるＳＦＶ侵入機能（ｅｎｔｒｙ ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎ）の活性化の調節も示す。
【図２】図２はＳＦＶの構造タンパク質の合成の間の転
移シグナルの利用を示し；上図は２６ＳサブゲノムＲＮ
Ａの遺伝子地図であり；中図はＰ６２、６Ｋ及びＥ１タ
ンパク質の膜転移の過程であり；内腔の側上の小さい矢
印はシグナルペプチダーゼ分裂を示し；下図では３種類
のシグナルペプチドの特性を挙げている。
【図３】図３は発現ベクターとしてＳＦＶが特に選ばれ
る特徴を示す。
【図４】図４はＳＦＶの全長感染性クローンの構築を示
し；図４ＡはＳＦＶゲノムの図解制限地図を示し；ｃＤ
ＮＡ合成の開始に用いられるプライマーを矢印で示し、
最終クローンの組み立てに用いられるｃＤＮＡ挿入物を
棒で示し；図４ＢはプラスミドｐＰＬＨ２１１、すなわ
ちＳＦＶの全長感染性クローンのためのキャリヤーとし
て用いられるＳＰ６発現ベクター及び得られるプラスミ
ドｐＳＰ６−ＳＦＶ４を示し；図４ＣはＳＦＶクローン
のＳＰ６プロモーター領域の構造を示し；点描の棒はＳ
Ｐ６プロモーター配列を示し、転写される第１のヌクレ
オチドを星印により記し；下線の領域は真性ＳＦＶ配列
を示す。
【図５】図５はＤＮＡ（Ｕ＝Ｔ）としてのｐＳＰ６−Ｓ
ＦＶ４ ＲＮＡ転写物の完全ヌクレオチド配列、及びＤ
ＮＡ配列の下に非−構造ポリプロテイン及び構造ポリプ
ロテインのアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は試験管内製造ＲＮＡの細胞中へのトラン
スフェクションの後のウィルス製造のためのＳＦＶ ｃ
ＤＮＡ発現系を示す。
【図７】図７はＳＦＶ発現ベクターｐＳＦＶ１−３及び
ヘルパー１の構築を示す。
【図８】図８はＳＦＶベクタープラスミドｐＳＦＶ１−
３のポリリンカー領域を示し；サブゲノム２６Ｓ ＲＮ
Ａのためのプロモーターの位置は四角で囲んであり、転
写するべき最初のヌクレオチドを星印で記す。
【図９】図９はヘルパートランス相補性を用いた感染性
粒子中へのｐＳＦＶ１−ｄｈｆｒ ＲＮＡの生体内パッ
ケージングの略図である（ｄｈｆｒはジヒドロ葉酸レダ
クターゼを意味する）。
【図１０】図１０はｐ６２からＥ２及びＥ３への分裂に
よるｐ６２−含有非感染性ウィルス粒子の感染性粒子へ
の変換のためのトリプシンの利用を示す。
【図１１】図１１はエレクトロポレーションによりＲＮ
Ａトランスフェクションした場合のＢＨＫ細胞における
異種タンパク質の発現を示す。
【図１２】図１２は上図にてＢａｍＨＩ制限エンドヌク
レアーゼ部位を生ずるＳＦＶの主要抗原部位及び試験管
内製造置換基を含む配列、ＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク
質の主要中和ドメインに及ぶ配列、及びＳＦＶキャリヤ
ータンパク質Ｅ２にＢａｍＨＩオリゴヌクレオチドとし
て挿入されたＨＩＶドメインを示し；下図は野生型又は
キメラ形態におけるドメイン２４６−２５１のブローア
ップ（ｂｌｏｗ−ｕｐｓ）を有するＳＦＶスパイク構造
の略図である。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA08 BA12 BA35 BA63 CA01 CA04 CA06 CA10 CA11 DA02 EA02 GA11 HA20 4B064 AG01 AG20 AG32 CA10 CA19 CC24 DA01 DA20 4B065 AA90X AA90Y AA91Y AA93Y AA95Y AA97Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA26 CA28 CA31 CA44 CA46 CA60 4C085 AA03 AA12 CC32 EE01 GG01 4C087 AA01 AA02 BB65 BC83 CA12 MA01 NA13

Claims (52)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アルファウィルスＲＮＡゲノムから誘導
    された組換えＲＮＡ分子であって、そのＲＮＡ分子は動
    物宿主細胞に感染が可能であり且つそこで複製すること
    ができ、そしてそのＲＮＡ分子は該アルファウィルスＲ
    ＮＡゲノムの複製に必須である完全なアルファウィルス
    ＲＮＡ領域を含んでなり且つさらに該宿主細胞中でその
    機能を発現することができる外因性ＲＮＡ配列を含んで
    なり、該外因性ＲＮＡ配列が、組換えＲＮＡ分子の複製
    に必須でないアルファウィルスＲＮＡゲノムの領域内に
    且つ該組換えＲＮＡを動物宿主細胞に導入したとき外因
    性ＲＮＡ配列がサブゲノムプロモーターから発現される
    ような位置において操作可能に挿入されており、そして
    該アルファウィルス由来のＲＮＡは、該ＲＮＡがアルフ
    ァウィルス構造タンパク質をコードする領域の一部又は
    完全な領域を欠失するような欠失を含むアルファウィル
    スゲノムを含んでなり、但し、該組換えＲＮＡ分子がシ
    ンドビスウィルスＲＮＡゲノムから誘導される場合に
    は、該外因性ＲＮＡは外因性抗原性エピトープ又は抗原
    決定基を定めるアミノ酸配列をコードするか、或いは該
    組換えＲＮＡ分子は、少なくとも１個のアルファウィル
    ス構造タンパク質をコードするアルファウィルスＲＮＡ
    を含んでなり、そのＲＮＡが宿主細胞内でアルファウィ
    ルスＲＮＡの複製に必要な５′及び３′ヌクレオチドを
    含み且つまたアルファウィルス構造サブゲノムのための
    プロモーターをコードするヌクレオチドを含むがアルフ
    ァウィルスヌクレオキャプシド粒子へのＲＮＡのパッケ
    ージのためのＲＮＡシグナルをコードする配列を欠失し
    ているヘルパーＲＮＡと共に宿主細胞のコトランスフェ
    クションのために使用され、シンドビスウィルスのヌク
    レオキャプシド中にパッケージされ且つシンドビスウィ
    ルス膜によって取り囲まれた該組換えシンドビスウィル
    スＲＮＡを含んでなる感染性粒子を産生せしめることを
    特徴とする組換えＲＮＡ分子。
  2. 【請求項２】 外因性ＲＮＡ配列が外因性抗原性エピト
    ープ又は抗原決定基を定めるタンパク質、ポリペプチド
    又はペプチド配列をコードする請求項１に記載のＲＮ
    Ａ。
  3. 【請求項３】 外因性ＲＮＡ配列がヒト免疫不全ウィル
    ス（ＨＩＶ）型を含む免疫不全ウィルスの構造タンパク
    質のエピトープ配列をコードする請求項２に記載のＲＮ
    Ａ。
  4. 【請求項４】 アルファウィルス由来のＲＮＡ分子領域
    が該ウィルスＲＮＡの５′末端部分、ＲＮＡ複製に必要
    な非構造タンパク質のコード領域、サブゲノムプロモー
    ター領域及び３′末端部分を含んでなる請求項１〜３の
    いずれかに記載のＲＮＡ。
  5. 【請求項５】 外因性ＲＮＡ配列が異種ポリペプチド又
    はタンパク質をコードし、サブゲノム２６Ｓ ＲＮＡ中
    に組み込まれてその欠失部分を置換している請求項１〜
    ４のいずれかに記載のＲＮＡ。
  6. 【請求項６】 該外因性ＲＮＡ配列が酵素又はホルモン
    のような生産物をコードする請求項１に記載のＲＮＡ。
  7. 【請求項７】 該アルファウィルスがセムリキ森林熱ウ
    ィルス（ＳＦＶ）である請求項１〜６のいずれかに記載
    のＲＮＡ。
  8. 【請求項８】 ＲＮＡをアルファウィルスヌクレオキャ
    プシド内に含んでなり、そしてアルファウィルススパイ
    クタンパク質を有する膜により取り囲まれた感染性粒子
    中にパッケージされた、請求項１〜７のいずれかに記載
    のＲＮＡを含んでなるＲＮＡ発現ベクター。
  9. 【請求項９】 ＲＮＡが該感染性粒子中へのＲＮＡのパ
    ッケージに適合する長さを有する請求項８に記載のＲＮ
    Ａベクター。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載の組換えＲＮＡと相補
    的な１本のストランドを有するｃＤＮＡを含んでなるＤ
    ＮＡベクター。
  11. 【請求項１１】 請求項２〜９項のいずれかに記載のＲ
    ＮＡに相補的な１本のストランドを有するｃＤＮＡを含
    んでなる請求項１０に記載のＤＮＡベクター。
  12. 【請求項１２】 該ｃＤＮＡの転写産物が請求項１に記
    載の組換えＲＮＡ分子である請求項１０に記載のＤＮＡ
    ベクター。
  13. 【請求項１３】 該ベクターがＡＴＧＧ又はＧＡＴＧＧ
    の５′末端配列及びＴＴＴＣＣＡ69ＡＣＴＡＧＴの３′
    末端配列を有する請求項１０又は１２に記載のＤＮＡベ
    クター。
  14. 【請求項１４】 請求項１に記載のＲＮＡに相補的なｃ
    ＤＮＡを含んでなり、そしてＤＮＡベクターで形質転換
    された動物宿主細胞中で外因性ポリペプチド又はタンパ
    ク質をコードするＤＮＡの発現を可能にするような位置
    に挿入された、一体化ポリリンカー領域をさらに含んで
    なる請求項１３に記載のＤＮＡベクター。
  15. 【請求項１５】 ポリリンカーがＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ
    −ＸｍａＩポリリンカーである請求項１４に記載のＤＮ
    Ａベクター。
  16. 【請求項１６】 該ｃＤＮＡが、アルファウィルスｐ６
    ２タンパク質をコードする領域において、温度感受性突
    然変異又は切断欠陥突然変異のような条件付致死突然変
    異を含み、その結果、ｐ６２タンパク質は宿主細胞プロ
    テアーゼによって認識されず、宿主細胞内でウィルス細
    胞−侵入機能を活性化するアルファウィルス構造タンパ
    ク質Ｅ３及びＥ２へのタンパク質分解的切断を受けるこ
    とができない欠失ｐ６２タンパク質を発現する請求項１
    ０〜１５のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
  17. 【請求項１７】 切断欠陥突然変異が該ｐ６２切断部位
    に位置し、ｐ６２タンパク質のＥ３部分のアミノ酸位置
    ６６におけるアルギニンのロイシンへの置換のようなア
    ミノ酸の変更を包含し、それは、外因的に添加されたプ
    ロテアーゼのための切断部位をもとの切断部位の前方の
    アミノ酸位置において保存しつつ該部位においてｐ６２
    切断をブロックし、アルファウィルスのｐ６２タンパク
    質の細胞内で切断できないが細胞外で切断できる突然変
    異形を発現し、かくして試験管内でのタンパク質分解処
    理による細胞−侵入機能の活性化を可能にする請求項１
    ６に記載のＤＮＡベクター。
  18. 【請求項１８】 ウィルス粒子の表面上にタンパク質を
    発現する該突然変異ｐ６２タンパク質の細胞−侵入機能
    がトリプシンによる試験管内処理によって活性化され得
    る請求項１７に記載のＤＮＡベクター。
  19. 【請求項１９】 ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモー
    ターのすぐ下流に操作可能にリンクされ且つ位置する該
    ｃＤＮＡを含んでなる請求項１０〜１８のいずれかに記
    載のＤＮＡベクター。
  20. 【請求項２０】 アルファウィルスがＳＦＶである請求
    項１０〜１９のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
  21. 【請求項２１】 ＳＦＶ−由来ｃＤＮＡを含んでなり、
    ベクターが図８に示す構造を有するｐＳＦＶ１、ｐＳＦ
    Ｖ２又はｐＳＦＶ３である請求項１２に記載のベクタ
    ー。
  22. 【請求項２２】 請求項１０〜２１のいずれかに記載の
    ＤＮＡ−ベクターの転写により誘導されたＲＮＡ転写産
    物。
  23. 【請求項２３】 少なくとも１個のアルファウィルス構
    造タンパク質をコードするアルファウィルスＲＮＡを含
    んでなり、そのＲＮＡが宿主細胞内でアルファウィルス
    ＲＮＡの複製に必要な５′及び３′ヌクレオチドを含み
    且つまたアルファウィルス構造サブゲノムのためのプロ
    モーターをコードするヌクレオチドを含むがアルファウ
    ィルスヌクレオキャプシド粒子へのＲＮＡのパッケージ
    のためのＲＮＡシグナルをコードする配列を欠失してい
    るヘルパーＲＮＡ。
  24. 【請求項２４】 ヘルパーＲＮＡが請求項２２に記載の
    ＲＮＡ転写産物と共に動物宿主細胞にコトランスフェク
    ションするために意図されたものであり、該ヘルパーＲ
    ＮＡはトランス相補性を可能にする該ＲＮＡ転写産物に
    よってコードされないウィルス粒子のアセンブリー及び
    感染性ウィルス粒子のアセンブリーに必要なアルファウ
    ィルス構造タンパク質をコードする請求項２３に記載の
    ヘルパーＲＮＡ。
  25. 【請求項２５】 請求項２３又は２４に記載のＲＮＡに
    相補的なＤＮＡ配列を含んでなり、試験管内で転写され
    該ＲＮＡを産生することができるヘルパーＤＮＡベクタ
    ー。
  26. 【請求項２６】 アルファウィルス構造タンパク質を発
    現するアルファウィルスＲＮＡをコードするｃＤＮＡを
    含んでなり、該アルファウィルスＲＮＡはアルファウィ
    ルスヌクレオキャプシド粒子へのＲＮＡのパッケージの
    ためのＲＮＡシグナルをコードする配列を欠失している
    が、宿主細胞内でのアルファウィルスＲＮＡの複製に必
    要な５′及び３′ヌクレオチドを含み且つまた該宿主細
    胞内で該アルファウィルス構造タンパク質をコードする
    該ＲＮＡの転写のためのアルファウィルス構造サブゲノ
    ムのためのプロモーターをコードするヌクレオチドを含
    むヘルパーＤＮＡベクター。
  27. 【請求項２７】 該ｃＤＮＡがＲＮＡ分子をコードし、
    ここで非構造ウィルスタンパク質をコードする領域が殆
    んど完全に欠失している請求項２６に記載のヘルパーＤ
    ＮＡベクター。
  28. 【請求項２８】 該ｃＤＮＡがすべてのアルファウィル
    ス構造タンパク質をコードし、該タンパク質がヌクレオ
    キャプシド、ｐ６２、６Ｋ及びＥ１タンパク質を含んで
    なる請求項２６に記載のヘルパーＤＮＡベクター。
  29. 【請求項２９】 ベクターにおいて複製に必要なヌクレ
    オチドがアルファウィルスからの複製配列を含んでな
    り、ベクターがアルファウィルスからのサブゲノムプロ
    モーター配列を含み、そしてさらに、ベクターにおいて
    構造タンパク質配列がアルファウィルス２６Ｓサブゲノ
    ムＲＮＡの直接転写によりコードされる請求項２６〜２
    ８のいずれかに記載のヘルパーＤＮＡベクター。
  30. 【請求項３０】 該構造タンパク質がｐ６２タンパク質
    である請求項２６又は２７に記載のヘルパーＤＮＡベク
    ター。
  31. 【請求項３１】 構造タンパク質をコードするＤＮＡが
    請求項１６、１７又は１８に記載の突然変異を含む請求
    項２６〜３０のいずれかに記載のヘルパーＤＮＡベクタ
    ー。
  32. 【請求項３２】 ｃＤＮＡがＳＦＶ ＲＮＡをコードす
    る請求項２６〜３１のいずれかに記載のヘルパーＤＮ
    Ａ。
  33. 【請求項３３】 該ｃＤＮＡが、該ｃＤＮＡのＡｃｃＩ
    （３０８）からＡｃｃＩ（６３９９）までの制限エンド
    ヌクレアーゼ部位に及ぶ欠失を含む図５に示す全長ＳＦ
    Ｖ ｃＤＮＡである請求項３２に記載のヘルパーＤＮＡ
    ベクター。
  34. 【請求項３４】 動物宿主細胞を、アルファウィルスＲ
    ＮＡがウィルス構造タンパク質をコードする領域の一部
    又は全部を欠失している請求項２２に記載のＲＮＡ転写
    産物と、ヘルパーＤＮＡベクターから試験管内転写によ
    り産生されるヘルパーＲＮＡでトランスフェクション
    し、ここで、該ヘルパーＲＮＡは該ＲＮＡ転写産物がコ
    ードしていない野生型アルファウィルス構造タンパク質
    をコードするゲノムアルファウィルスＲＮＡを含有し；
    該ベクターから発現されたアルファウィルス由来ＲＮＡ
    及び該ヘルパーＲＮＡを含有するトランスフェクション
    された宿主細胞を培養して感染性ウィルス粒子をアセン
    ブリーし且つ回収する、ベクターが感染性アルファウィ
    ルス由来粒子を含んでなり、アルファウィルス由来ＲＮ
    Ａがウィルス構造タンパク質をコードする領域の一部又
    は全部を欠失している請求項８又は９に記載のＲＮＡ発
    現ベクターの製造法。
  35. 【請求項３５】 トランスフェクションを宿主細胞のエ
    レクトロポレーションにより行なう請求項３４に記載の
    方法。
  36. 【請求項３６】 該宿主細胞が形質転換されて該ヘルパ
    ーＲＮＡを産生する動物細胞であり、該形質転換された
    細胞が請求項２２に記載のＲＮＡ転写産物でトランスフ
    ェクションされる請求項３４又は３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 該形質転換された細胞が請求項２６〜
    ３３のいずれかに記載のヘルパーＤＮＡベクター又はそ
    のＲＮＡ転写産物で形質転換された動物細胞である請求
    項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 請求項１〜７のいずれかに記載のＲＮ
    Ａ、請求項１０〜２１のいずれかに記載のＤＮＡベクタ
    ー、又は請求項２６〜３３のいずれかに記載のヘルパー
    ＤＮＡベクターもしくは該ヘルパーＤＮＡベクターのＲ
    ＮＡ転写産物で形質転換された動物起源の宿主細胞。
  39. 【請求項３９】 細胞が鳥類、哺乳類、爬虫類、両生
    類、昆虫類又は魚類細胞である請求項３８に記載の宿主
    細胞。
  40. 【請求項４０】 ハムスターＢＨＫ細胞である請求項３
    ９に記載の宿主細胞。
  41. 【請求項４１】 細胞を、請求項１〜７のいずれかに記
    載のＲＮＡ、請求項１０〜２１のいずれかに記載のＤＮ
    Ａベクター、請求項２６〜３３のいずれかに記載のヘル
    パーＤＮＡベクター又は該ヘルパーベクターのＲＮＡ転
    写産物でトランスフェクションするか、或いは細胞を、
    感染性ウィルス粒子を含んでなる請求項８又は９に記載
    のＲＮＡ発現ベクターで感染させることを含んでなる請
    求項３８、３９又は４０に記載の形質転換された宿主細
    胞の製造法。
  42. 【請求項４２】 トランスフェクションを宿主細胞のエ
    レクトロポレーションにより行なう請求項４１に記載の
    方法。
  43. 【請求項４３】 動物宿主細胞を、ポリペプチド又はタ
    ンパク質をコードする外因性ＲＮＡを含有し且つ請求項
    ３４又は３５に記載の方法に従って得られる感染性粒子
    を含んでなる請求項８又は９に記載のＲＮＡ発現ベクタ
    ーで感染させ；該感染により形質転換された細胞を培養
    して外因性ＲＮＡを発現させ；そして該発現により形成
    されたポリペプチド又はタンパク質を回収することを含
    んでなるポリペプチド又はタンパク質の製造法。
  44. 【請求項４４】 ポリペプチド又はタンパク質をコード
    する外因性ＤＮＡフラグメントを有する請求項１０〜２
    １のいずれかに記載のＤＮＡベクターのアルファウィル
    ス由来ｃＤＮＡを試験管内転写してＲＮＡ転写産物を製
    造し；該ＲＮＡ転写産物で動物宿主細胞をトランスフェ
    クションし、ＲＮＡ転写産物が停泊する形質転換動物宿
    主細胞を得；該形質転換細胞を培養して外因性ＲＮＡを
    発現させ、そして該発現により形成されたポリペプチド
    又はタンパク質を回収することを含んでなるポリペプチ
    ド又はタンパク質の製造法。
  45. 【請求項４５】 請求項１６、１７又は１８に記載のＤ
    ＮＡベクターを試験管内で転写して該ＲＮＡ転写産物を
    製造する請求項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 ポリペプチド又はタンパク質をコード
    する外因性ＤＮＡフラグメントを有する請求項１０〜２
    １のいずれかに記載のＤＮＡベクターで動物宿主細胞を
    トランスフェクションして形質転換動物宿主細胞を製造
    し；該形質転換細胞を培養して外因性ＤＮＡを発現さ
    せ、そして該発現により形成されたポリペプチド又はタ
    ンパク質を回収することからなるポリペプチド又はタン
    パク質の製造法。
  47. 【請求項４７】 請求項８又は９に記載の感染性組換え
    アルファウィルス由来粒子を含んでなり、外因性ＲＮＡ
    が外因性抗原エピトープ又は抗原決定基をコードするワ
    クチン調製物。
  48. 【請求項４８】 組換えアルファウィルスが請求項１
    ６、１７又は１８に記載の条件付致死突然変異、アンバ
    ー（終結コドン）突然変異又は他の突然変異をゲノム中
    に含んでなることにより弱毒化されている請求項４７に
    記載のワクチン調製物。
  49. 【請求項４９】 トランスフェクションを宿主細胞のエ
    レクトロポレーションにより行なう請求項４４、４５又
    は４６に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 感染性粒子を含んでなり且つ外因性エ
    ピトープペプチド配列又は抗原決定基をコードする外因
    性ＲＮＡを含有する請求項８又は９に記載のＲＮＡ発現
    ベクターで動物宿主を生体内感染させることにより該宿
    主内で抗原を産生させ、該抗原に対する免疫学的応答と
    して該宿主内で産生した抗血清を回収することを含んで
    なる抗血清の製造法。
  51. 【請求項５１】 動物に請求項１に記載の組換えＲＮＡ
    分子を含んでなる組成物を投与することからなり、該組
    換えＲＮＡ分子が免疫原性の外因性アミノ酸配列を含ん
    でなり、それにより該動物の細胞中に組換えＲＮＡ分子
    を導入し且つ該動物内で免疫応答を誘引する、動物にお
    ける免疫応答の誘発方法。
  52. 【請求項５２】 該組換えＲＮＡ分子がアルファウィル
    スヌクレオキャプシド及び取り囲む膜を含んでなる組換
    えアルファウィルス粒子中に含有され、該膜がアルファ
    ウィルススパイクタンパク質を含む請求項５１に記載の
    方法。
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