JP2003063917A - 糸状菌を有効成分とする製剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 固体培養によって得られた糸状菌の分生胞子
の生存率を低下させることなく製剤化することができる
製剤の製造方法を提供する。 【解決手段】 （１）固体培地を用いる糸状菌の固体培
養終了後の培養物に糸状菌の胞子を分散させることがで
きる媒体を加えて混合する工程と、（２）混合する工程
で得られた懸濁液から培養物の残渣と胞子分散液を分離
する工程と、（３）分離する工程で分離した胞子分散液
と賦形剤を混合する工程と、（４）混合する工程で得ら
れた混合物を造粒する工程と、からなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、固体培養した糸状
菌培養物の胞子を有効成分とする製剤の製造方法に関
し、さらに詳細には微生物農薬又は土壌改質剤である製
剤の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】農業分野における有害生物の防除には、
即効性、効果の安定性、コスト対効果の優位性、使用時
の簡便性等の理由により化学合成農薬が主に使用されて
いる。

【０００３】しかしその一方で、薬剤耐性菌の出現によ
る効力の低下、有用生物に対する悪影響、薬剤の環境あ
るいは作物への残留等の問題も顕在化してきた。

【０００４】近年、これらの問題点を補う方法として総
合防除(化学合成農薬依存型農業を改め様々な防除シス
テムを駆使する方法)の考え方が取り入れられてきてい
るが、その中でも特に生物農薬が注目されている。

【０００５】この第一の理由は、生物農薬に使用される
生物あるいはその原体は、本来自然界に存在するものを
使用していることと対象となる有害生物が限定されるこ
とから、化学合成農薬の持つ欠点を補うものとして期待
できるからである。

【０００６】特に、植物の土壌病害(土壌中で生育する
病害糸状菌によって引き起こされる病害)分野は、化学
農薬でも安定した効果が期待できない病害が多いため微
生物農薬に注目が集まっている。

【０００７】土壌病害糸状菌防除のためには通常、病害
菌に拮抗能を有する糸状菌(カビ)が使われ、トリコデル
マ属のトリコデルマ ハルジアナム、トリコデルマ ハ
マタム、トリコデルマ ビリデ、トリコデルマ リグノ
ラムやグリオクラディウム属のグリオクラディウム ビ
レンス、グリオクラディウム カテヌラタムやペニシリ
ウム属のペニシリウム ニグリカンス、ペニシリウム
クリソジーナム、ペニシリウム オキザリカム等が知ら
れている。これらの糸状菌は、宿主細胞膜の破壊、グル
カナーゼ、キチナーゼ等の溶菌酵素による宿主細胞壁の
分解、抗生物質生産等によって病害菌の生育を阻害す
る。

【０００８】通常糸状菌の能力を利用した生物農薬は、
その取扱い易さと環境変化に対する耐久性の点から、菌
糸よりも胞子の形態が好ましいため、分生胞子の状態で
製品化される。

【０００９】したがって、分生胞子の生産量を増やすこ
とを目的に、液状物質あるいは固体培地を水に溶解ある
いは分散させた培地を使用する液体培養や、固体培地を
用いる固体培養の様々な研究がなされている。

【００１０】液体培養では菌糸は容易に増殖し、さらに
培養条件を調整することで厚膜胞子、出芽胞子を生成さ
せることができるが、一般に、培地と気相の界面で形成
される分生胞子は液体培養ではほとんど生成しない。

【００１１】液体培養で生成される厚膜胞子、あるいは
出芽胞子は、固体培養法で容易に生産される分生胞子と
比較して、その胞子濃度は、およそ１／１００以下であ
るため、糸状菌の胞子を目的とする場合は、固体培養法
による分生胞子の生産が採用されるのが一般的である。

【００１２】この固体培養とは、天然物由来の固形成分
に加水し微生物の生育環境を整えた後、一定の含水率を
維持しつつ微生物の成育適温で培養する方法であり、代
表的な例としては、酒、味噌、醤油等の製造に使われる
種麹生産を挙げることができる。

【００１３】糸状菌を培養する固体培地としては、ふす
ま、籾、米糠、木材粉、腐葉土、ピートモス、堆肥、き
のこ廃材、及びこれらの粉砕物等の有機物を含むものを
単独あるいはその他の栄養分を添加して使われる。

【００１４】培養は、調湿した上記培地を発酵槽あるい
は金属トレー等に一定の層厚になるように仕込み種菌を
接種して行われる。培養が始まると固体培地内は、菌糸
体の増殖に伴い発熱し、さらに培地菌糸によって培地が
固化してくるため培養温度の均一化及び培地利用率向上
のため培地をほぐす操作を必要に応じて行う。

【００１５】菌糸体増殖終了後、胞子着生が進み一般的
には約１週間〜１ヶ月で培養が終了する。このときの培
養終了物の含水率は、培地組成によっても異なるがおよ
そ２０〜８０％（ｗ／ｗ）の範囲にあり、培養が終了し
た固体培養物では、雑菌汚染防止及び保存安定性向上を
目的に凍結乾燥、送風乾燥等の方法によって含水率を４
０％（ｗ／ｗ）以下に調整される。

【００１６】得られた培養物は、製剤としての各種特性
を付与するための物質である賦形剤、例えば、有機栄養
分、微量栄養素、結合剤、硬度調整剤等と均一に混合さ
れ、更に製剤化のための水分が添加されて製剤化され
る。

【００１７】有機栄養分としては、ふすま、籾、米糠、
木材粉、腐葉土、ピートモス、堆肥、きのこ廃材、ある
いはこれらの粉砕物等で、目的とする菌の栄養分となる
ものである。

【００１８】微量栄養素としては鉄、マグネシウム、カ
リウム等を含む無機物、あるいは、カニガラ、油粕、血
粉、肉粉、木酢液等有機物の菌の生育を活性化する物質
である。

【００１９】結合剤とはいわゆる製剤のバインダーであ
り、カルボキシルメチルセルロース、メチルセルロー
ス、ポリビニルアルコール、クレー、有機ポリマーラテ
ックス、澱粉等が使われる。

【００２０】硬度調整剤とは製剤自体の強度、硬度、あ
るいは水中での崩壊度等を調整する助剤であり前述の結
合剤等が同様に使用される。

【００２１】もちろん、これらの賦形剤は、使用する菌
種、目的とする製剤の使用方法等によって適宜選択され
るものである。

【００２２】これらの賦形剤と培養物の混合は、培養終
了物の含水率が通常４０％以上であるため均一混合が困
難となる。

【００２３】また、均一混合を行うために機械的に高い
剪断力をかけて混合分散すると、胞子が熱、機械的剪断
に弱いため、胞子が死滅することになる。

【００２４】そこで一旦培養物を乾燥して混合攪拌する
ことも考えられるが、この場合も乾燥物は乾燥の過程で
ブロック化してしまい、それを解砕する必要があり、上
述した場合と同様に機械的剪断力により胞子の死滅を招
いてしまうことになる。

【００２５】胞子の死滅を防止するには、機械的剪断及
びそれに伴う温度上昇を招く粉砕処理工程を省略すれば
良いが、例えば培地として用いるフスマの粒子径は１０
０μｍから５ｍｍ程度と幅が広く、２００μｍ程度の平
均粒子径を持つ栄養成分としての機能と賦形剤としての
機能を有する増量剤（例えば小麦粉）と均一に混合して
製剤化するためには粉砕処理は必須であった。

【００２６】また、培地を事前に２００μｍ程度にまで
粉砕して固体培養する方式も考えられるが、培地の通気
性が著しく低下するため、糸状菌の固体培養に問題が発
生してしまう。

【００２７】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、固体培養によって得られた糸状菌の分生胞
子の生存率(または回収率)を低下させることなく製剤化
できる製剤の製造方法を提供することにある。

【００２８】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するに
は、固体培養後の培養物が水分に馴染みやすい性質を持
つこと、胞子が水分や油脂分中で分散しやすいこと、さ
らに培養物と胞子の大きさに対して培養物の大きさが格
段に大きいことから容易に分離できることに着目して本
発明を完成するに至った。

【００２９】すなわち本発明は、（１）固体培地を用い
る糸状菌の固体培養終了後の培養物に糸状菌の胞子を分
散させることができる媒体を加えて混合する工程と、
（２）混合する工程で得られた懸濁液から培養物の残渣
と胞子分散液を分離する工程と、（３）分離する工程で
分離した胞子分散液と賦形剤を混合する工程と、（４）
混合する工程で得られる混合物を造粒する工程と、から
なることを特徴とする製剤の製造方法を提供するもので
ある。

【００３０】固体培養終了後の培養物に対して加える媒
体としては、蒸留水、イオン交換水、水道水等の水分
や、これらにさらに緩衝液や生理食塩水等の無機あるい
は有機塩を含有した溶液であってもよく、または、胞子
の死滅がなければ大豆油、オリーブ油等の天然油脂であ
ってもよい。

【００３１】この加える媒体の量としては、固体培地の
種類と上記媒体の種類にもよるが、懸濁液中の培養物の
分散状態と胞子の分散状態との点から、乾燥培養物１部
に対して５〜５０００倍（重量換算）とすることが好適
である。

【００３２】また、上記媒体にさらに胞子に対して栄養
成分となる溶液を混合した混合液としても構わない。

【００３３】固体培地としては上述したような種々の培
地が挙げられるが、菌糸を培養しやすく多数の胞子が得
られること、品質の均一性に優れること、および上記
（２）の懸濁液から培養物の残渣と胞子分散液を分離す
る工程において分離がしやすいこと等の点から、ふすま
培地が好適である。

【００３４】ふすま培地であれば、トリコデルマ属のト
リコデルマ ハルジアナム、トリコデルマ ハマタム、
トリコデルマ ビリデ、トリコデルマ リグノラムやグ
リオクラディウム属のグリオクラディウム ビレンス、
グリオクラディウム カテヌラタムやペニシリウム属の
ペニシリウム ニグリカンス、ペニシリウム クリソジ
ーナム、ペニシリウム オキザリカム等の種々の糸状菌
に対して好適に使用することができるのである。

【００３５】こうして得られる懸濁液中の残渣の大きさ
は、例えばふすま培地の場合には通常乾燥状態では５０
０〜１０００μｍであるが、膨潤していることにより２
０００〜５０００μｍとなっている。

【００３６】一方、懸濁液中の胞子の大きさは１０μｍ
以下であることから、両者の大きさは２オーダー以上の
違いがあることになる。

【００３７】したがって、懸濁液から胞子分散液を分離
する際には、上記それぞれの粒径の大きさに対して分離
できるものであれば濾紙、濾布、篩、中空紙等の種々の
分離手段を適用することができるが、分離速度や目詰ま
り等の分離効率を考慮すると口径５０〜１０００μｍの
篩を用いることが好適である。

【００３８】この口径は、作製する製剤の種類によって
変えることが好ましい。すなわち顆粒水和剤を作製する
場合は５０〜２００μｍ、粒剤を作製する場合は２００
〜１０００μｍが好ましく、特に３００〜５００μｍが
好ましい。

【００３９】この分離手段は複数段の構成としてもよ
い。例えば顆粒水和剤製造に当たり２段の分離工程とす
る際には、第１段として口径の大きな篩（例えば２００
〜１０００μｍの篩）を使用して粗濾過を行い、第２段
として口径の小さな篩（例えば５０〜２００μｍ）を使
用して密濾過する構成としてもよい。

【００４０】同じように粒剤製造に当たり２段の分離工
程とする際には、第１段として口径の大きな篩（例えば
５００〜１０００μｍの篩）を使用して粗濾過を行い、
第２段として口径の小さな篩（例えば２００〜５００μ
ｍ）を使用して密濾過する構成としてもよい。

【００４１】これらは懸濁液の総量に対して適宜選択す
ればよく、また、混合槽でバッチ処理するような製造ラ
インにおいては循環ライン中に上記篩を複数段配置した
構成としてもよく、混合槽からの連続製造ラインを構成
する場合には、配管に上記篩を複数段配置して濾液回収
槽に濾液のみを回収する構成としてもよい。

【００４２】培養物中の胞子は、例えば水を加え攪拌す
ることで容易に水中に分散するが、濾過残渣の保水能は
通常、非常に大きいので、胞子回収効率は、専ら濾過残
渣中の濾液の回収率に依存することになる。

【００４３】したがって、胞子の回収率を上げるために
は、分離工程として減圧濾過、加圧濾過、あるいは濾過
残渣を絞る等の方法を使用してもよく、またこれらの方
法を複数併用することも効果的である。また、さらに胞
子を死滅させることのないような界面活性剤等を併用し
て濾過効率を高めることも有効である。

【００４４】こうして得られた胞子分散液は、製剤化す
るための造粒工程にそのまま使用することができるので
ある。

【００４５】上述した各種賦形剤を均一に混合した原料
に、上記胞子分散液を噴霧等の方法により加液し、これ
を混練したものを押出し造粒により造粒して製剤とす
る。

【００４６】もちろん、原料の混練と胞子分散液の噴霧
とを同時に行い、さらに造粒する工程とを同時に行うこ
とにより、製剤工程の効率化を図ることも好ましく、そ
の際には転動造粒機や混合造粒機を使用することが好適
である。

【００４７】転動造粒機には、例えば回転容器型、振動
型、パン型、ドラム型、混合機械型などがあり、また混
合造粒機には、ブレード式造粒機やピン造粒機など種々
の造粒機があるが、いずれの方式を採用しても構わな
い。

【００４８】

【実施例】以下、実施例と比較例を用い本発明を更に具
体的に説明する。 （実施例１）ポテトデキストロース寒天培地(ディフコ
社製)で培養温度２８℃、１週間培養したトリコデルマ
ハルジアナムＡＴＣＣ７４０５８の分生胞子を１２１
℃、６０分殺菌済みのふすま培地(千葉製粉（株）社製)
に接種し、含水率６８％、培養温度２８℃で１週間培養
した。

【００４９】次に、図１に示す工程に従い、この固体培
養終了後の培養物１に対し重量比で９倍量の水道水２を
加えて撹拌混合し、懸濁液を作製した。次にこの懸濁液
を目開き１０００μｍの篩３と、続いて３００μｍの篩
４に通し、培地として使用したフスマのみを取り除い
た。

【００５０】胞子を含む濾液１ｋｇに対し２ｋｇ(重量
換算２倍量)の小麦粉(日清製粉（株）社製)を予め混合
造粒装置５レーディゲミキサーＭ−２０型(総発売元
（株）マツボー)に仕込んでおき、主軸回転数毎分２３
０回転で撹拌しながら濾液を毎分１Ｌで噴霧し、２０分
間造粒処理を行い、その後５０℃で４時間乾燥して造粒
品６とした。

【００５１】以上の製造方法で得られた造粒品７は、分
生胞子生存率が固体培養後の培養物に比し、８０％とい
う極めて高い数値を示した。

【００５２】（実施例２）ポテトデキストロース寒天培
地(ディフコ社製)上で培養温度２５℃、１週間培養した
グリオクラディウム ビレンスＩＦＯ６３５５の分生胞
子を１２１℃、６０分殺菌済みのふすま培地(千葉製粉
（株）社製)に接種し、含水率６８％、培養温度２５℃
で１週間培養した。

【００５３】この固体培養終了後の培養物に対し重量比
で９倍量の水道水を加えて撹拌混合し、懸濁液を作製し
た。次にこの懸濁液を目開き１０００μｍ、続いて３０
０μｍの篩に通し、培地として使用したフスマのみを取
り除いた。

【００５４】胞子を含む濾液１００ｇに対し２００ｇ
(重量換算２倍量)の小麦粉(日清製粉（株）社製)を予め
転動造粒装置ラボラトリーマトリックス(ＬＭＡ５)(奈
良機械（株）社製)に仕込んでおき、主軸回転数毎分６
００回転で撹拌しながら濾液を毎分１０ｇの速度で滴下
し小麦粉と濾液を良くなじませた後、主軸回転数を毎分
１００回転に変え１０分間造粒処理を行った。造粒終了
物は、３０℃で２４時間送風乾燥し造粒品とした。

【００５５】以上の製造方法で得られた造粒品は、分生
胞子生存率が固体培養後の培養物に比し、７２％という
極めて高い数値を示した。

【００５６】（比較例１）ポテトデキストロース寒天培
地(ディフコ社製)で培養温度２８℃、１週間培養したト
リコデルマ ハルジアナムＡＴＣＣ７４０５８の分生胞
子を１２１℃、６０分殺菌済みのふすま培地(千葉製粉
（株）社製)に接種し、含水率６８％、培養温度２８℃
で１週間培養した。

【００５７】次に、図２に示す工程に従い、この固体培
養終了後の培養物を除湿乾燥機７Ｔ−５Ｆ型(（株）田
中化学機械製造所社製)を使用し３０℃、２４時間乾燥
した。

【００５８】次にこの乾燥物をエックサンプルミル８Ｋ
ＩＩ−１型(不二パウダル社製：現（株）ダルトン)にて
平均粒子径３００μｍまで粉砕し粒剤の原料とした。

【００５９】この乾燥培養物粉砕品１ｋｇと２ｋｇ(重
量換算２倍量)の小麦粉(日清製粉（株）社製)を予め混
合造粒装置５レーディゲミキサーＭ−２０型(総発売元
（株）マツボー)に仕込んでおき、主軸回転数毎分２３
０回転で撹拌しながら水道水１．５Ｌを毎分１Ｌで噴霧
し、２０分間造粒処理を行い、その後５０℃で４時間乾
燥し造粒品９とした。

【００６０】以上の製造方法で得られた造粒品９は、分
生胞子生存率が固体培養後の培養物に比し、１２％であ
り大幅に低下していた。

【００６１】（比較例２）ポテトデキストロース寒天培
地(ディフコ社製)上で培養温度２８℃、１週間培養した
グリオクラディウム ビレンスＩＦＯ６３５５の分生胞
子を１２１℃、６０分殺菌済みのふすま培地(千葉製粉
（株）社製)に接種し、含水率６８％、培養温度２５℃
で１週間培養した。

【００６２】この固体培養終了後の培養物を除湿乾燥機
Ｔ−５Ｆ型(（株）田中化学機械製造所社製)を使用し３
０℃、２４時間乾燥した。

【００６３】次にこの乾燥物をエックサンプルミルＫＩ
Ｉ−１型(不二パウダル社製：現（株）ダルトン)にて平
均粒子径３００μｍまで粉砕し粒剤の原料とした。

【００６４】この乾燥培養物粉砕品１００ｇに対し２０
０ｇ(重量換算２倍量)の小麦粉(日清製粉（株）社製)を
予め転動造粒装置ラボラトリーマトリックス(ＬＭＡ５)
(奈良機械（株）社製)に仕込んでおき、主軸回転数毎分
６００回転で撹拌しながら水道水１５０ｇを毎分１０ｇ
の速度で滴下し小麦粉と濾液を良くなじませた後、主軸
回転数を毎分１００回転に変え１０分間造粒処理を行っ
た。造粒終了物は、３０℃で２４時間送風乾燥し造粒品
とした。

【００６５】以上の製造方法で得られた造粒品は、分生
胞子生存率が固体培養後の培養物に比し、８％であり大
幅に低下していた。

【００６６】

【発明の効果】以上、詳細に説明したように、固体培養
終了後の培養物に糸状菌の胞子を分散させることができ
る媒体を加えて混合した懸濁液から、培養物の残渣と胞
子分散液を分離し、この分離した胞子分散液と賦形剤を
混合・造粒することにより、糸状菌の分生胞子の生存率
を低下させることなく製剤化することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による製剤の製造方法の一例を示す工程
図。

【図２】従来方法による製剤の製造方法の一例を示す工
程図。

【符号の説明】

１ 培養物 ２ 水道水 ３ 篩 ４ 篩 ５ 混合・造粒・乾燥機 ６ 造粒品 ７ 乾燥機 ８ 粉砕機 ９ 造粒品

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０９Ｋ 17/32 Ｃ０９Ｋ 17/32 Ｈ (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:885 Ｃ１２Ｒ 1:885） Ｃ０９Ｋ 101:00 Ｃ０９Ｋ 101:00 (72)発明者 篠崎 玄美 千葉県千葉市緑区あすみが丘１−６−２ Ｆターム(参考） 4B065 AA58X AA70X BB26 BC31 BD05 BD14 BD43 CA47 CA54 4D071 AA02 AB15 AB22 AB52 DA20 4H011 AA01 AA03 BA01 BB21 BC22 DA02 DC06 DD04 DG06 DH10 DH29 4H026 AA08 AB04

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）固体培地を用いる糸状菌の固体培
   養終了後の培養物に該糸状菌の胞子を分散させることが
   できる媒体を加えて混合する工程と、（２）該混合する
   工程で得られた懸濁液から該培養物の残渣と胞子分散液
   を分離する工程と、（３）該分離する工程で分離した該
   胞子分散液と賦形剤を混合する工程と、（４）該混合す
   る工程で得られた混合物を造粒する工程と、からなるこ
   とを特徴とする製剤の製造方法。
2. 【請求項２】 該固体培地がふすま培地である請求項１
   に記載の製剤の製造方法。
3. 【請求項３】 （３）該分離する工程が、口径５０〜１
   ０００μｍの篩を用いて分離する工程である請求項１又
   は２に記載の製剤の製造方法。