JP4836933B2 - 糸状菌を含有する顆粒又はペレットの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、植物検疫剤（phytosanitary agent）の技術分野に関する。
特に、本発明は、糸状菌（filamentous fungi）、より詳細には線虫捕食菌（nematophagus fungi）を含有する顆粒又はペレットの産業規模における製造方法に関する。

植物検疫剤として微生物、特に真菌を用いることが、次第に慣習となってきている。
真菌ベースの製品が、すでに昆虫、植物検疫菌及び他の作物寄生虫（crop parasite）の対抗用に市販されている。
例えば、米国特許第５８１１０９２号には、線虫捕食菌が、糸状菌であるアルトロボトリス・コノイデス・ドレクスラー（Arthrobotrys conoides Dreschsler）の特定の株からなる、メロイドギネ（Meloidogyne）、ヘテロデラ（Hetherodera）及びディティレンカス（Ditylenchus genera）属の線虫に対する対抗に関して記載されている。

上述した線虫は、５０〜７０％の収穫損失を招くかもしれないように、野菜及び菌類の重篤な病気に関与しており、莫大な経済損失を与えるかもしれない。
耕作に先駆けて土壌に対して適用するために、通常の抗寄生虫化学製品（例えば、臭化メチル、トリクロロニトロメタン、ジクロロプロペン等）又は農作物へ適用されるカルバメート類の使用に代えて、線虫捕食菌を使用することにより、土壌の殺菌、生態系バランスの破壊ならびに人及び動物への潜在的毒性等の深刻な不都合を防止することができる。

従って、線虫捕食菌類は、特に有機農法のために適しているが、高い生産高で産業上それらを生産すること及び使用前の保存に対して満足な状態を確保するのに適する形態とすることは、実質的に困難な状況である。
実際、先行技術では、線虫捕食菌類は適当な培地で生産される。よって、線虫捕食菌類は、それらの培地とともに、処理される土壌に直接分散されるか、使用前に培地に保持される。しかし、これらの保存条件では、線虫捕食菌類は、予想以上に迅速に繁殖し続けるが、栄養源が枯渇するために、短期間後（１〜２週間後）に減衰する。

本発明の課題は、高生産高、低コストで、かつ処理される土壌に使用する前に、長い保存期間にわたる安定性及び生存能力を確保するのに適する形態で、糸状菌を産業規模で製造する方法を提供することである。

そのような技術的課題を解決する概念は、糸状菌を長期間にわたってそれらの安定性及び生存能力を確保し得る適当な固体製剤に取り込むことであった。この関連で、糸状菌類を含む顆粒製剤又はペレットは、本発明の目的に適することを証明している。

上述した概念を考慮して、本発明の基礎をなしている技術的課題は、糸状菌類を含む顆粒製剤又はペレットの製造方法によって解決され、その方法は、
所定時間適当な培地中で糸状菌類を選択及び成長させ、
所定時間の後、前記培地を、ゲル化剤及び少なくとも１つの担体と混合し、混合物を得、
該混合物を、カルシウム塩を含有する溶液とともに、一滴ずつの接触によってゲル化に付し、前記糸状菌類を含有するゲル化ペレット又は顆粒を得、
ゲル化ペレット又は顆粒を１３〜１８％の水分量に乾燥させる工程を含む。

本発明を、例示のため及び限定されない目的のために与えられたいくつかの実施形態を参照してさらに説明する。
実施例の例示を進める前に、本発明の製造方法の種々の工程を実行するために用いられる材料を定義することは有用かもしれない。

本発明に用いられる糸状菌類は、モニリアル（Moniliales）族、好ましくはアルトロボトリス・コノイデス・ドレクスラーの糸状菌類に属する。
糸状菌類用の培地は、糖蜜、麦芽エキス及び蔗糖からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源、ならびにイースト抽出物及び「コーン・スティープ・リカー（corn steep liquor）」から選択される少なくとも１つの有機窒素源を含む。

好ましくは、前記の少なくとも１つの炭素源は、培地の乾燥重量の７０〜８５重量％を構成し、前記の少なくとも１つの有機窒素源は、培地の乾燥重量１５〜３０重量％を構成する。

また、培地は、無機の窒素源（硝酸アンモニウムまたは塩類からなる）を含んでいてもよい。前記の無機の窒素源は、通常、培地の乾燥重量の１０重量％未満、通常、５〜８重量％の量で、菌が成長する間に徐々に培地に加えられる。

培地の好ましい組成は、７５〜８５％の麦芽エキス及び１５〜２５％のイースト抽出物（％は培地の乾燥重量の重さによる）からなる。
他の好ましい培地は、６０〜６５％の糖蜜、１０〜１５％の蔗糖、１０〜１５％のコーン・スティープ・リカー及び１０〜１５％のイースト抽出物からなる。有利には、そのような培地は、無機の窒素源、特にリン酸水素二アンモニウムの５〜８％が追加される。

さらに好ましい培地は、２５〜３０％のコーン・スティープ・リカーとともに、２つの炭素源、つまり、２５〜３０％の麦芽エキス及び４０〜４５％の糖蜜を含む。
麦芽エキスは、シリアル穀物（通常、大麦）の発芽によって得られる。発芽の時点で、特定の酵素（アミラーゼ）が生産され、それは澱粉を糖へ転化させることができる。麦芽エキスは、約６０％のマルトース、ビタミン及びいくつかのマイクロ栄養分を含む。

糖蜜は、砂糖産業の副産物を構成し、黒っぽい茶色の粘稠な液体の形態であり、１０％の水、３５％の蔗糖、２０％の他の糖及び１５％の灰を含む。
イースト抽出物は、酵母自己分解によって得られ、微細な淡黄色粉末（容易に水に溶ける）の形態である。Ｂ群の水溶性ビタミンと同様に、イースト抽出物は、ペプチド、遊離アミノ酸、プリン及びピリミジン塩基を含む。イースト抽出物は、総窒素含量１０％及びα−アンミニック（amminic）窒素含量５％を有する。

コーン・スティープ・リカーは、二酸化硫黄を含む水中で２４〜４８時間、５０℃でコーン穀物に浸漬することにより得られる。この剤は、澱粉穀物を囲む蛋白ネットワークの変性を可能にし、浸漬の間、好ましくない微生物の成長を防止する利点を提供する。コーン・スティープ・リカーは、総窒素含量７％及びα−アンミニック窒素含量１．７％を有し、さらに５％の糖、４％のカリウム、３％のリン及び１７％の他のミネラルを含む。

本発明の製造方法において、前記培地中での糸状菌の成長は、好ましくは、２３〜３０℃の一定温度で５〜１０日間行う。
ゲル化剤は、溶液重量に対して、好ましくは１〜２重量％、好ましくは１．３重量％の濃度のアルギン酸ナトリウムを含有する溶液からなる。そのような溶液は、培地：アルギン酸塩溶液、４０：６０〜６０:４０の体積比で糸状菌の培地に添加することが好ましい。

周知のように、アルギン酸ナトリウムは、カルシウム塩を含有する溶液と混合物との接触によって、添加される液体混合物のゲル化を促進することができる。
重要な観点は、担体の培地への添加からなる。本発明では、「担体」という用語について、使用までの保存中にそれらを生存させておくように、顆粒中に分散される菌に安定性及び／又は栄養分を与える製品、及び「フィラー」（つまり、顆粒に望ましい稠度及び容積を与える製品）の双方を意味する。

好ましくは、前記の担体は、ケイソウ土、小麦粉及び糖からなる群から選択される。好ましい担体は、Celaton FPM 0.08である。それはケイソウシェル（珪酸を含む単細胞の藻）に基づく商品であって、約０．０８ミクロンの粒度分布を有する。この製品は、規定量の水を吸収し、従って、望ましい容量の最終顆粒の達成を助ける。

本発明における担体として用いることができる小麦粉のうち、コーンフラワーが最良である。それは、その容積の何倍もに匹敵する水分量を吸収することができる天然物であって、この特定の場合、最終顆粒の望ましい容積の達成を助ける。さらに、コーンフラワーは、保存の間及び処理される土壌に顆粒を分散する際、顆粒に分散する糸状菌類のために重要な栄養源を構成する。

特に、栄養源としてのコーンフラワーの使用は、驚くべきことに、そのような場合において線虫への対抗において有効な増加を伴う線虫捕食の相当数を展開するようであるため、アルトロボトリス・コノイデス・ドレクスラーの場合に特に有利である。

細胞膜を安定させることによって、糖は有利に糸状菌類を保存の間、生存させることができる。本発明の製造において使用することができる糖のうち、蔗糖は、特に好ましい。好ましくは、本発明において、担体を、ゲル化剤によって培地に添加する。実際には、ゲル化剤としてアルギン酸ナトリウム溶液を用いることによって、担体を、溶液重量の６〜２２重量％の範囲でアルギン酸ナトリウム溶液に加えることが好ましい。特に好ましい方法では、担体を、溶液重量の１５重量％の割合でアルギン酸ナトリウム溶液に加える。

本発明の方法において、糸状菌類及びその関係した培地ならびにゲル化促進剤及び担体を含む混合物のゲル化は、好ましくは、一滴ずつ、カルシウム塩溶液に前記混合物を添加することにより行われる。
カルシウム塩は、塩化カルシウム及びグルコン酸カルシウムから選択されることが好ましい。溶液中のカルシウム塩の濃度は、０．２Ｍ〜０．３Ｍ、好ましくは塩化カルシウムの場合には０．２５Ｍである。通常、ゲル化は、カルシウム塩濃度を増加すると早く進む。

所定のカルシウム塩溶液への前記混合物の滴下による接触によって形成されるゲル化顆粒又はペレットは、ゲル化を完了するために、所定の時間、好ましくは２〜３分間、前記溶液中に放置される。カルシウム塩溶液からのゲル化された顆粒又はペレットの回収は、従来の方法、例えば、濾過によって行われる。

ゲル化された顆粒又はペレットの乾燥は、２５〜３０℃の温度で、無菌の気流によって有利に実行することができる。通常、所定のカルシウム塩溶液に混合物を滴下することによるゲル化から得られたゲル化された顆粒又はペレットは、８０〜９０％の水分量を有する。そのような水分量は、１３〜１８％程度に乾燥によって減少される。このような方法において、顆粒は、予め培地に加えられた担体の助けによって、所望の稠度及び容積に達する。
好ましくは、本発明の方法によって、直径１〜３ｍｍの顆粒又はペレットが得られ、それは、処理される土壌に糸状菌類の改善された分散を与える。

本発明の方法は、安価で容易な設計の装置によって産業規模で有利に実行することができる。適当な装置は、簡単に言えば、後述の限定されない実施例に記載されたものであり、適当な培地中で所望の糸状菌類を成長させるための反応器、混合物を形成するためにゲル化剤及び担体を培地に混合するミキサー、所定の容量の混合物の滴を形成するために、適当な穿孔部材に混合物の一定量を供給するための適当な手段、前述した滴を集め、それらのゲル化を可能にするためのカルシウム塩水溶液を含む容器、及びカルシウム塩水溶液を含む容器中で回収されたゲル化顆粒又はペレットを乾燥するための乾燥機を含む。

混合物の一定量を供給するための手段は、例えば、蠕動ポンプ又は類似した装置を含むことができ、一方、穿孔部材は、底部が、所定の直径、例えば１〜４ｍｍの孔でそれぞれ終端したチューブとすることができる。
前記の装置は、微生物（特に、望ましい糸状菌類に敵対的なもの）による汚染を避けるために無菌条件で作動させることが重要である。本発明の方法を行うために用いられる生成物、特に、混合物中に培地が添加された生成物は、使用の前に十分に消毒すべきである。

本発明の方法で得られた顆粒又はペレットは、使用の準備が整っているが、有利にも、それらに含まれる糸状菌類は、長期間、安定して生存したままである。前記の顆粒又はペレットは、使用のために長期間保存又は保管され、その後、糸状菌類が、それらが意図されるアプリケーションのために十分に満足する生存能力を維持する。使用前の本発明の顆粒又はペレットの保存期間は、有利にも、８週を超え、通常、４〜６ヶ月間である。

本発明の方法の操作の以下の例は、モニリアル（Moniliales）族、好ましくはアルトロボトリス・コノイデス・ドレクスラーの糸状菌類で行った。
実施例１
糸状菌の培養を、１．２リットルの培地を含む２リットルの反応器で行った。
反応器は、好ましくは、丸底容器からなり、ブレード攪拌機、加熱冷却手段、気流吹き込み機ならびにｐＨ、酸素及び温度プローブを備える。
媒体は、麦芽エキスの２０ｇ／ｌ及びイースト抽出物の４ｇ／ｌからなり、問題の菌の分生子で接種される前に消毒した。

培地を、約２７℃の温度で、接種から６日間インキュベートした。
インキュベーションの間、サンプルを、乾燥質量（ｇ／ｌ）及び胎芽数（ＣＦＵ／ｌ）を測定するために、培地から採取した。乾燥質量を測定するために、培地の２０ｍｌをろ過し、２４時間１００℃にて、オーブン中で乾燥した。胎芽数を、１ｍｌの培地で測定した。
インキュベーションの終わりに、約８ｇ／ｌの菌類で、１リットル当たり６×１０⁹の胎芽数を得た。

次いで、菌類を含む培地をミキサーに移し、Celaton FPM 0.08の６．６重量％（溶液重量の）溶液が添加された、アルギン酸ナトリウムの１．３重量％の水溶液１８００ｍｌを培地に添加した。
次に、得られた混合物をミキサーでホモジナイズし、穿孔チューブ（直径１．６ｍｍの孔）を通して、一滴ずつ、０．２５Ｍ塩化カルシウム溶液を含む容器に添加した。

前述した混合物のゲル化された顆粒は、３分間、塩化カルシウム溶液に放置して得られる。
放置の終了時、ゲル化された顆粒を、デカンテーションにより分離し、１７％の水分量になるまでコンベアベルト上で乾燥する。乾燥顆粒の平均直径は、２．２ｍｍである。

それらの形成後すぐの測定値として、乾燥顆粒中の平均胎芽数は、糸状菌のインキュベーション終了後測定した数と実質的に同じであり、前述の胎芽が、本発明の顆粒工程で完全に生存したままであることを示す。
前述した乾燥顆粒を、室温で３ヵ月間保存する。貯蔵期間の終わりにおいて、生存した胎芽の平均数は、顆粒形成の後に測定された５０％に匹敵する。

実施例２
実施例２の試験を、Celaton FPM 0.08の６．６重量％溶液及びコーンフラワー３．３重量％（溶液重量の）が添加された、アルギン酸ナトリウムの１．３重量％の水溶液１８００ｍｌを培地に添加した以外、実施例１と同様の実験条件を用いて繰り返した。

乾燥顆粒の平均直径は２．５ｍｍであり、それらの水分量は１．７％である。
乾燥顆粒中の平均胎芽数は、それらの形成後すぐの測定値として、糸状菌のインキュベーション終了後測定した数と実質的に同じであり、前述した胎芽が、本発明の顆粒工程で完全に生存したままであることを示す。

前述した乾燥顆粒を、室温で３ヵ月間保存する。貯蔵期間の終わりにおいて、生存した胎芽の平均数は、顆粒形成の後に測定された９０％に匹敵し、乾燥顆粒は、植物検疫剤として土壌に効果的に用いることができる。

実施例３
実施例３の試験を、Celaton FPM 0.08の６．６重量％溶液、コーンフラワー３．３重量％及び蔗糖５％（溶液重量の）が添加された、アルギン酸ナトリウムの１．３重量％の水溶液１８００ｍｌを培地に添加した以外、実施例１と同様の実験条件を用いて繰り返した。

乾燥顆粒の平均直径は２．９ｍｍであり、それらの水分量は１．７％である。
乾燥顆粒中の平均胎芽数は、それらの形成後すぐの測定値として、糸状菌のインキュベーション終了後測定した数と実質的に同じであり、前述した胎芽が、本発明の顆粒工程で完全に生存したままであることを示す。

前述した乾燥顆粒を、室温で３ヵ月間保存する。貯蔵期間の終わりにおいて、生存した胎芽の平均数は、顆粒形成の後に測定されたものの１００％に匹敵し、乾燥顆粒は、植物検疫剤として土壌に効果的に用いることができる。
さらに、前記の顆粒の使用において、菌が線虫に対する大量のトラップをもたらすという事実のために、線虫に対抗するという点において、菌のより大きな有効性が得られる。

Claims (11)

1. 所定時間、糖蜜、麦芽エキス及び蔗糖からなる群から選択される少なくとも１つの炭素源ならびにイースト抽出物及びコーン・スティープ・リカーから選択される少なくとも１つの有機窒素源を含む培地中で前記モニリアル（Moniliales）族の線虫捕食糸状菌（nematophagus filamentous fungi）を選択及び成長させ、
   所定時間の後、前記培地を、アルギン酸ナトリウムからなるゲル化剤と、コーンスラワー及びショ糖からなる担体とに混合して、混合物を得、
   該混合物を、カルシウム塩を含有する溶液とともに、一滴ずつの接触によってゲル化に付し、前記糸状菌を含有するゲル化ペレット又は顆粒を得、
   ゲル化ペレット又は顆粒を１３〜１８％の水分量に乾燥する工程を含むモニリアル族の線虫捕食糸状菌を含有する顆粒又はペレットの製造方法。
2. ゲル化工程は、カルシウム塩を含有する溶液に、一滴ずつ、混合物を添加することにより行う請求項１の方法。
3. 前記の少なくとも１つの炭素源は、培地の乾燥重量の７０〜８５重量％を構成し、前記の少なくとも１つの有機窒素源は、培地の乾燥重量１５〜３０重量％を構成する請求項１又は２の方法。
4. 培地は、さらに無機の窒素源を含む請求項１〜３のいずれか１つの方法。
5. 無機の窒素源は、培地の乾燥重量の１０重量％未満の量で含まれる請求項４の方法。
6. ゲル化剤は、アルギン酸ナトリウム１〜２重量％を含む溶液からなる請求項１〜５のいずれか１つの方法。
7. アルギン酸ナトリウム溶液は、培地／アルギン酸塩溶液、４０：６０〜６０:４０の体積比で、糸状菌の培地に添加される請求項１〜６のいずれか１つの方法。
8. 糸状菌は、アルトロボトリス・コノイデス・ドレクスラーである請求項１〜７のいずれか１つの方法。
9. 担体は、溶液重量の６〜２２重量％の範囲でアルギン酸ナトリウム溶液に添加される請求項１〜８のいずれか１つの方法。
10. カルシウム塩を含む溶液は、０．２Ｍ〜０．３Ｍの濃度の塩化カルシウム及びグルコン酸カルシウムの水溶液である請求項１〜９のいずれか１つの方法。
11. 乾燥顆粒又はペレットは、平均直径が１〜３ｍｍである請求項１〜１０のいずれか１つの方法。