CN100490652C - 生产含有丝状真菌的颗粒或小球的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产含有丝状真菌的小颗粒或小球的方法，该方法包括以下步骤：挑选和培养在合适的培养基中生长的丝状真菌一段预定时间；在所述预定时间之后，将所述培养基与凝胶剂和至少一种载体混合，得到混合物；通过一滴滴地接触，含有钙盐的溶液将所述混合物凝胶化，获得胶凝状的、含有所述丝状真菌的小球团或颗粒；干燥所述已胶凝的小球团或颗粒到湿度为13-18%。

Description

生产含有丝状真菌的颗粒或小球的方法
技术领域
本发明涉及控制植物病害的试剂的技术领域，特别地是涉及在工业水平上生产含有丝状真菌的、特别是食线虫真菌的小颗粒或小球的方法。
背景技术
使用微生物特别是真菌作为控制植物病害的试剂已日益普及。
以真菌为基础的产品已经市场化，该产品用于对抗昆虫、植物真菌或其它农作物寄生虫类。
例如，美国专利5 811 092描述了用于杀灭线虫的试剂，该试剂能杀灭跟结线虫属(Meloidogyne)、Hetherodera、茎线虫(Ditylenchus)的一类线虫。该试剂由一种丝状真菌Arthrobotrys conoides Dreschsler组成。
上述线虫是造成蔬菜和菌类严重疾病的罪魁祸首，并造成了巨大的经济损失，能导致50-70％的收割损失。
使用食线虫真菌可作为一种传统的在耕作之前施用在土壤中的抗寄生物化学药剂(例如溴化甲烷、三氯硝基甲、二氯丙烯等)或直接作用于农作物的氨基甲酸盐的替代物。这些抗寄生物的化学药剂和氨基甲酸盐会引起一系列问题，例如土壤不育、破坏生态平衡以及潜在的对人和动物的毒性，因此需避免使用。
因而，食线虫真菌特别合适用于有机农业中，但目前，现有技术中为保证在使用前具有满意的保存状态，难于以合适的形式工业化地高产量地生产。
实际上，现有技术中，食线虫真菌是在合适的培养基中生长。然后，食线虫真菌和它们的培养基质一起或是是直接散布到需要处理的土壤中，或是在使用前一直保持在所述培养基中。然而，在这种保存条件下，所述线虫真菌继续以非常快的速度繁殖，并当营养物质耗尽时，在短时间内(1—2个星期)衰落。本发明需要解决的问题就是提供一种在工业水平、高产量、低成本、以合适的形式保证在使用到需要处理的土壤中之前的长时间保存而仍具有稳定性和生存力的生产丝状真菌产品的方法。
发明内容
本发明的目的是解决这样一个技术问题：使丝状真菌结合在一起形成合适的固体形式，从而保证它们的长期的稳定性和生存力。在这点上，含有丝状真菌的颗粒或小球对于本发明的目的提供了合适的形式。
根据上述目的，本发明解决的问题就是提供一种生产含有丝状真菌的颗粒或小球的方法，包括以下步骤：
在合适的培养基中挑选和培养丝状真菌一段预定时间；
在所述预定时间之后，将所述培养基与凝胶剂和至少一种载体混合，得到混合物；
通过一滴滴地接触，含有钙盐的溶液将所述混合物凝胶化，获得凝胶状的、含有丝状真菌的小球团或颗粒；
将所述凝胶状的小球团或颗粒干燥到湿度含量为13-18％。
具体实施方式
本发明将根据实施例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不起限制性作用。
在对实施例描述前，对生产方法中各步骤将用到的材料作详细说明将有助于理解本发明。
根据本发明所述的方法中的所述丝虫属于丛梗孢目族(Moniliales family)，特别优选为Arthrobotrys conoides Dreschsler丝状真菌。
用于培养丝状真菌的培养基包含至少一种碳源，该碳源选自糖蜜、麦精和蔗糖；以及至少一种有机氮源，该有机氮源选自酵母提取物和玉米浆。
优选地，上述的至少一种碳源的重量含量为所述培养基干重的70—85％，上述的至少一种氮源的重量含量为所述培养基干重的15—30％。
根据本发明所述的培养基还可以包括矿物氮源，矿物氮源为硝酸铵或铵盐。上述矿物氮源通常是在真菌生长时期逐渐加入到培养基而总量不高于所述培养基干重的10％，通常重量含量在5—8％之间。
本发明所述培养基的优选的成份为由75-85％的麦精和15-25％的酵母提取物组成，上述百分比是培养基的干重的重量含量。
根据本发明的另一种优选的培养基含有60-65％糖蜜，10-15％蔗糖，10-15％的玉米浆，10-15％的酵母提取物。优选地，该培养基还含有5-8％的矿物氮源，特别是磷酸氢二铵。
根据本发明，另一种优选的培养基为含有有两种碳源，即重量含量为25-30％的麦精和重量含量为的40-45％的糖蜜，以及重量含量为的25-30％的玉米浆。
麦精和/或糖蜜和/或蔗糖被用作为碳源。
麦精是通过谷类作物(通常是大麦)芽得到的。在萌芽时，产生特殊的酶(淀粉酶)，其能将淀粉转化为糖类。所述麦精含有大约60％的麦芽糖，维生素以及多种微量元素。
糖蜜是工业糖的副产物，为黑褐色的黏性液体，含有10％的水，35％的蔗糖，20％的其它糖和15％灰渣物质。
酵母提取物是通过啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的自我分解得到的，为淡黄色的精细粉末，易溶于水。该酵母提取物含有多肽、游离氨基酸、嘌呤和嘧啶基，以及可溶于水的维生素B族。所述酵母提取物具有10％的总氮含量以及5％α-amminic氮含量。
所述玉米浆是通过在50℃将玉米浸泡在含有二氧化硫的水中24-48小时而得到的。在浸泡时该反应物允许围绕在淀粉周围的蛋白质网状物变性并对抑制不合需要的微生物的增长提供有利条件。所述玉米浆的总氮含量为7％，α-amminic氮含量为1.7％，并还含有5％的糖、4％的钾、3％的磷以及17％的其他矿物质。
根据本发明所述的生产方法，丝状真菌在上述培养基中、在恒温23—30℃下生长的天数优选为5—10天。
胶凝剂优选为由含有藻酸钠的溶液组成，藻酸钠的浓度为1-2％，优选为1.3％(溶液的重量百分含量)。加入到所述丝状真菌的培养基中的所述藻酸钠溶液的量优选为：培养基与藻酸钠溶液体积比为40:60—60:40。
众所周知，当一接触到含有钙盐溶液的混合物，藻酸钠能促进混合物的凝胶化。
一个重要的方面是添加载体到所述培养基中。在本发明中，所述“载体”术语意味着一种产品能提供稳定性和/或对分散在颗粒中的真菌有营养的作用，因此在使用前的保存期真菌仍保持存活；以及还意味着“装填者”，即一种产品能满足所需的颗粒密度和体积。
优选地，上述载体选自硅藻土(diatom earth)、面粉类和糖。优选的载体为Celaton FPM0.08，它是一种基于硅藻壳(含硅质的单细胞藻类)的商业产品，并具有大约0.08微米的粒度。这些产品能吸附一定量的水，因而帮助获得所需的最终颗粒的体积。
本发明中，在用作为所述载体的面粉类中，玉米粉是首选。它是一种自然产物，能吸附大量的、相当于其体积多倍的水，在这种特殊情况下，还可以帮助达到最终颗粒需要的体积。另外，玉米粉对于保存期间的分布在颗粒中的丝状真菌以及被撒布到土壤中的颗粒中的丝状真菌而言都是一种重要的营养来源。
特别地，使用玉米粉作为营养来源是非常有利于Arthrobotrys conoides Dreschsler丝状真菌的生长，特别让人惊讶的是，在这样的情况下，可以发现所述真菌生长更多的线虫捕捉物，从而提高杀灭线虫的功效。
通过稳定胞膜，糖有利于丝状真菌在储存期间保持活性。在本发明所述的生产方法中用到的糖类中，蔗糖是特别的首选。
优选地，在本发明中，载体是通过胶凝剂加到所述培养基中。特别地，通过使用藻酸钠溶液作为胶凝剂，优选地，加入到所述藻酸钠溶液的所述载体的量是藻酸钠溶液的重量的6％—22％，特别优选的方法是所述加入到藻酸钠溶液的载体的量为藻酸钠溶液的15％。
根据本发明所述的方法，优选地，含有丝状真菌、相关的培养基以及胶凝剂和载体的的混合物的凝胶化为是通过所述混合物一滴一滴地加入到钙盐溶液中。
优选地，所述钙盐选自氯化钙和葡萄糖酸钙。溶液中钙盐的浓度为0.2M—0.3M，优选为0.25M氯化钙。通常，凝胶过程随着钙盐的浓度提高而加快。
凝胶化的颗粒或小球通过滴入的上述混合物到所述的钙盐溶液而形成。凝胶化的颗粒或小球在所述溶液中保持一个预定时间，优选为2—3分钟，以致完成凝胶化。从所述钙盐溶液中取出已胶凝的颗粒或小球可用常规的方法，例如过滤。
干燥所述胶凝状的颗粒或小球可以在25—30℃通过灭菌的气流而方便地实现。通常，通过混合物滴入到预先准备的钙盐溶液中所得到的胶凝状的颗粒或小球含有80-90％的湿度。这样的湿度含量通过干燥降低到13—18％。通过这样的方法，并在先前加入到所述培养基中的所述载体的帮助下，颗粒达到需要的密度和体积。
优选地，根据本发明的目的，可获得具有1-3mm直径的颗粒或小球，这样，有助于提高丝状真菌在需处理的土壤中的传播。
根据本发明所述的方法，能通过便宜的、易设计的设备在工业水平上方便地实现。在此，非限制性地、简要地描述一套相配的设备，该设备包括一个反应器，该反应器用于所要得到丝状真菌在合适的培养基中的生长；一个搅拌器，在该搅拌器中胶凝剂和所述载体与所述培养基混合以致形成混合物；装置，该装置适合输送一定量的混合物到合适的有孔的元件，以致形成预先确定大小的滴状混合物；一个含有钙盐水溶液的容器，用于收集上述滴状混合物，并使之凝胶化；以及一个干燥器，用于干燥从含有钙盐溶液的容器中回收所述已胶凝的颗粒或小球。
用于输送一定量的混合物的装置可以是，例如，包括一个可蠕动的泵或类似的装置，而有孔的元件可以是管子，在每个末端有预先确定直径的小孔，例如为1-4mm。
重要的是，上述设备应在无菌的条件下操作，目的是为了避免微生物—特别是这些要得到的丝状真菌的敌对微生物的污染。这些用于实现本发明所述方法的物质，特别是加入到所述培养基的混合物中的物质也应该在使用前灭菌。
通过本发明所述方法得到的、准备使用的颗粒或小球有利于其中的丝状真菌在很长的一段时间内保持稳定和活性。因而，上述的颗粒或小球本身在使用前可被保存或存储很长一段时间，且丝状真菌对于已有目的的应用而言能维持完全满意的活性。
根据本发明得到的颗粒或小球在使用前保存的持续时间可大于8个星期，通常在4—6个月。
以下实施例中，根据本发明所述的生产方法将通过Moniliales(丛梗孢目)族中的丝状真菌而实现，优选地，使用Arthrobotrys conoides Dreschsler丝状真菌。
实施例1
在含有1.2升培养基、容量为2升的反应器中培养所述丝状真菌。
优选地，所述袖珍型反应器具有圆形底部、刀片式搅拌器、加热和冷却装置、鼓风装置以及pH、O2测量计和温度计。
培养基中含有20g/l的麦精和4g/l的酵母提取物，该培养基在接种真菌孢子之前已被灭菌。
接种后在27℃培养6天。在培养期间，从培养基中取样去检测干重(g/l)和繁殖体的数量(CFU/1)。为了检测干重，20ml的培养基被过滤并被在干燥箱中100℃干燥24小时。在1ml的培养基中测定繁殖体的数量。
在培养末期，获得具有6 x 109/升繁殖体的大约8g/l的真菌。
所述含有真菌的培养基然后被转移到搅拌器中的1800ml溶液中，溶液中已加入重量百分比为1.3％藻酸钠的，重量百分比为6.6％的Celaton FPM 0.08，再加入所述培养基。
结果，混合物然后在搅拌器中成为均匀分布的微粒，并通过有孔的管子(孔的直径为1.6mm)一滴滴地加入到含有0.25M的氯化钙溶液的容器中。
然后，停留在所述氯化钙溶液中3分钟，可获得所述上述混合物的胶凝化的颗粒。
在停留时间的末期，已胶凝的颗粒通过移入其他容器而分离出来，并在传送带上干燥到湿度为17％。干燥颗粒的平均直径为2.2mm。
干燥颗粒成形后立即测定其中的繁殖体数量，测量方法与在培养的末期测量所述丝状真菌的方法完全一样，从而校对根据本发明的成粒方法的上述全部繁殖体的存活率。
上述干燥的颗粒在室温保存3个月。在储存的末期，存活的繁殖体的平均数量相当于颗粒成形时测定的50％。
实施例2
实施例2的试验条件与实施例1相同，不同的是：1800ml溶液中已加入与溶液的重量百分含量为1.3％的藻酸钠，6.6％的Celaton FPM 0.08以及3.3％的玉米粉，再加入所述培养基。
干燥的颗粒的平均直径为2.5mm，湿度为17％。
干燥的颗粒成形后立即测定其中的繁殖体数量，测量方法与在培养的末期测量所述丝状真菌的方法完全一样，从而校对根据本发明的成粒方法上述全部繁殖体的存活率。
上述干燥的颗粒在室温保存3个月。在储存的末期，存活的繁殖体的平均数量相当于颗粒成形时测定的90％，这样，允许所述干燥的颗粒可以有效地作为控制植物病害的试剂用于土壤中。
实施例3
实施例3的试验条件与实施例1相同，不同的是：1800ml溶液中已加入与溶液的重量百分比为1.3％的藻酸钠，6.6％的Celaton FPM 0.08以及3.3％的玉米粉和5％的蔗糖，再加入所述培养基。
干燥的颗粒的平均直径为2.9mm，湿度为17％。
干燥的颗粒成形后立即测定其中的繁殖体数量，测量方法与在培养的末期测量所述丝状真菌的方法完全一样，从而校对根据本发明的成粒方法上述繁殖体的全部存活率。
上述干燥的颗粒在室温保存3个月。在储存的末期，存活的繁殖体的平均数量相当于颗粒成形时测定的100％，这样，允许所述干燥的颗粒可以有效地作为控制植物病害的试剂用于土壤中。
而且，在使用上述颗粒时，由于所述真菌发展更多数量的对付线虫的捕捉物，杀灭线虫更有效。

Claims (14)

1.一种生产含有丝状真菌的颗粒或小球的方法，其特征是，包括以下步骤：
—在合适的培养基中挑选和培养丝状真菌一段预定时间；
—在所述预定时间之后，将所述培养基与凝胶剂和至少一种载体混合，得到混合物；
—通过一滴滴地接触，含有钙盐的溶液将所述混合物凝胶化，获得凝胶状的、含有所述丝状真菌的小球团或颗粒；
—将所述胶凝状的小球团或颗粒干燥到湿度为13-18％。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是，所述凝胶化步骤是通过将所述混合物一滴滴地加入到所述含有钙盐的溶液中。
3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征是，所述用于丝状真菌的培养基含有至少一种碳源，该碳源选自糖蜜、麦精和蔗糖；以及至少一种有机氮源，该有机氮源选自酵母提取物和玉米浆。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征是，所述的至少一种碳源的重量含量为所述培养基干重的70—85％，所述的至少一种氮源的重量含量为所述培养基干重的15—30％。
5.根据权利要求3或4所述的生产方法，其特征是，所述的培养基还含有矿物氮源。
6.根据权利要求4所述的生产方法，其特征是，所述矿物氮源的重量含量不高于所述培养基干重的10％.
7.根据权利要求6所述的生产方法，其特征是，所述矿物氮源的重量是所述培养基干重的5—8％。
8.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是，所述胶凝剂为含有重量百分含量为1—2％的藻酸钠的溶液。
9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征是，所述含有培养丝状真菌的培养基与加入到培养基中的所述藻酸钠溶液的体积比为40∶60至60∶40之间。
10.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是，所述载体选自硅藻土、面粉类以及糖。
11.根据权利要求10所述的生产方法，其特征是，所述丝状真菌是Arthrobotrys conoidesDreschsler，所述载体至少包括面粉类中的玉米粉。
12.根据权利要求10所述的生产方法，其特征是，加入到藻酸钠溶液的所述载体的量是所述藻酸钠溶液重量的6—22％。
13.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是，所述含有钙盐的溶液为浓度为0.2-0.3M的氯化钙溶液或葡萄糖酸钙溶液。
14.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是，所述干燥的颗粒或小球的平均直径为1-3mm。
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