ES2338798T3 - Procedimiento para la produccion de granulos o microgranulos que contienen hongos filamentosos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la producción de gránulos o microgránulos que contienen hongos filamentosos que comprende las etapas de: - seleccionar y hacer crecer hongos filamentosos en un medio de cultivo adecuado durante un periodo de tiempo predeterminado, - mezclar dicho medio de cultivo, tras dicho tiempo predeterminado, con un agente gelificante y al menos un vehículo, de modo que se obtiene una mezcla, - someter dicha mezcla a gelificación, a través de contacto gota a gota, con una disolución que contiene una sal de calcio obteniendo así gránulos o microgránulos gelificados que contienen dichos hongos filamentosos, - secar dichos gránulos o microgránulos gelificados hasta un contenido en humedad del 13-18%.
Description
Procedimiento para la producción de gránulos o
microgránulos que contienen hongos filamentosos.
La presente invención se refiere al campo
técnico de los agentes fitosanitarios.
En particular, la invención se refiere a un
procedimiento para la producción a escala industrial de gránulos o
microgránulos que contienen hongos filamentosos, más específicamente
hongos nematófagos.
El uso de microorganismos y en particular hongos
como agentes fitosanitarios constituye una práctica cada vez más
común.
Ya se comercializan productos a base de hongos
para luchar contra insectos, hongos fitopatógenos y otros parásitos
de cultivos.
Por ejemplo, en la patente estadounidense US 5
811 092, se describen agentes nematófagos para combatir nematodos
de los géneros Meloidogyne, Heterodera y
Ditylenchus que consisten en cepas particulares de
Arthrobotrys conoides Dreschsler, un hongo filamentoso.
Los nematodos mencionados anteriormente son
responsables de graves enfermedades de vegetales y hongos y pueden
provocar enormes pérdidas económicas, ya que pueden conducir a que
se ponga en peligro un 50-70% de la cosecha.
El uso de hongos nematófagos, como alternativa a
los productos químicos antiparasitarios habituales (por ejemplo
bromuro de metilo, tricloronitrometano, dicloropropeno, etc.), para
su aplicación sobre el suelo antes del cultivo, o a los carbamatos,
aplicados a los cultivos, permite que se eviten graves
inconvenientes, tales como la esterilización del suelo, la
destrucción del equilibrio ecológico y la posible toxicidad para el
hombre y los animales.
Por tanto, los hongos nematófagos son
particularmente adecuados para su uso en la agricultura ecológica,
pero en la actualidad existe una dificultad sustancial para
producirlos industrialmente con altos rendimientos y en formas
adecuadas para garantizar un estado de conservación satisfactorio
antes de su uso.
De hecho, en la técnica anterior, los hongos
nematófagos se producen en un medio de cultivo adecuado. Entonces,
los hongos nematófagos, junto con su medio de cultivo, o bien se
dispersan directamente sobre el suelo que va a tratarse o bien se
mantienen en el medio de cultivo antes de su uso. Sin embargo, en
estas condiciones de conservación, los hongos nematófagos siguen
reproduciéndose bastante rápidamente y experimentan un declive tras
un corto periodo de tiempo (1-2 semanas) a medida
que se agotan las fuentes de nutrientes.
El problema que subyace a la presente invención
era el de proporcionar un procedimiento para la producción a escala
industrial de hongos filamentosos, con alto rendimiento, bajo coste
y en una forma adecuada para garantizar su estabilidad y viabilidad
durante un largo tiempo de almacenamiento antes de su uso sobre el
suelo que va a tratarse.
La idea para solucionar un problema técnico de
este tipo fue la de incorporar los hongos filamentosos en fórmulas
sólidas adecuadas que garantizarían su estabilidad y viabilidad
durante largos periodos de tiempo. En este sentido, se ha
demostrado que fórmulas granulares o microgránulos que contienen
hongos filamentosos son adecuados para los fines de la presente
invención.
En vista de la idea mencionada anteriormente, el
problema técnico que subyace a la presente invención se soluciona
mediante un procedimiento para la producción de gránulos o
microgránulos que contienen hongos filamentosos que comprende las
etapas de:
- -
- seleccionar y hacer crecer los hongos filamentosos en un medio de cultivo adecuado durante un periodo de tiempo predeterminado,
- -
- mezclar dicho medio de cultivo, tras dicho periodo de tiempo predeterminado, con un agente gelificante y al menos un vehículo, de modo que se obtiene una mezcla,
- -
- someter dicha mezcla a gelificación, mediante contacto gota a gota, con una disolución que contiene una sal de calcio, obteniendo así gránulos o microgránulos gelificados que contienen dichos hongos filamentosos,
- -
- secar dichos gránulos o microgránulos gelificados hasta un contenido en humedad del 13-18%.
La presente invención se describirá
adicionalmente con referencia a varias realizaciones de ejemplo
proporcionadas con fines ilustrativos y no limitativos.
Antes de proceder con la ilustración de los
ejemplos, puede ser útil definir los materiales usados para llevar
a cabo las diversas etapas del procedimiento de producción según la
invención.
Los hongos filamentosos usados en el
procedimiento según la invención pertenecen a la familia Moniliales,
preferiblemente hongos filamentosos de Arthrobotrys conoides
Dreschsler.
El medio de cultivo para hongos filamentosos
comprende al menos una fuente de carbono elegida entre el grupo que
consiste en melaza, extracto de malta y sacarosa y al menos una
fuente de nitrógeno orgánico elegida entre extracto de levadura y
"macerado de maíz".
Preferiblemente, la al menos una fuente de
carbono mencionada anteriormente constituye entre el 70 y el 85% en
peso del peso seco del medio de cultivo y la al menos una fuente de
nitrógeno orgánico mencionada anteriormente constituye entre el 15
y el 30% en peso del peso seco del medio de cultivo.
El medio de cultivo también puede incluir una
fuente de nitrógeno mineral, que consiste en sales o nitratos de
amonio. La fuente de nitrógeno mineral mencionada anteriormente se
añade habitualmente de manera gradual al medio de cultivo durante
el crecimiento de los hongos en una cantidad no superior al 10% en
peso del peso seco del medio de cultivo y habitualmente de entre el
5 y el 8% en peso.
Una composición preferida del medio de cultivo
consiste en un 75-85% de extracto de malta y un
15-25% de extracto de levadura, siendo los
porcentajes en peso del peso seco del medio de cultivo.
Otro medio de cultivo preferido comprende un
60-65% de melaza, un 10-15% de
sacarosa, un 10-15% de macerado de maíz y un
10-15% de extracto de levadura. Ventajosamente, un
medio de cultivo de este tipo contiene, además, entre un 5 y un 8%
de una fuente de nitrógeno mineral, en particular hidrogenofosfato
de diamonio.
Un medio de cultivo preferido adicional contiene
dos fuentes de carbono, es decir, extracto de malta, en una
can-
tidad del 25-30%, y melaza, en una cantidad del 40-45%, así como macerado de maíz, en una cantidad del 25-30%.
tidad del 25-30%, y melaza, en una cantidad del 40-45%, así como macerado de maíz, en una cantidad del 25-30%.
El extracto de malta se obtiene mediante la
germinación de los granos de cereales (habitualmente cebada). En el
momento de la germinación, se producen enzimas específicas
(amilasas), que permiten la conversión del almidón en azúcares. El
extracto de malta contiene aproximadamente un 60% de maltosa,
vitaminas y varios micronutrientes.
La melaza constituye un subproducto de la
industria azucarera y viene en forma de un líquido viscoso marrón
negruzco, que contiene un 10% de agua, un 35% de sacarosa, un 20% de
otros azúcares y 15% de cenizas.
El extracto de levadura se obtiene mediante
autolisis de Saccharomyces cerevisiae y viene en forma de
polvo amarillo pálido fino, fácilmente soluble en agua. El extracto
de levadura contiene péptidos, aminoácidos libres, bases púricas y
pirimidínicas, así como vitaminas solubles en agua del grupo B. El
extracto de levadura tiene un contenido en nitrógeno total del 10%
y un contenido en nitrógeno \alpha-amínico del
5%.
El macerado de maíz se obtiene a través de la
maceración de los granos de maíz a 50ºC durante
24-48 horas en agua que contiene dióxido de azufre.
Este reactivo permite la desnaturalización de la red proteica que
rodea a los granos de almidón y ofrece la ventaja de evitar el
crecimiento de microorganismos no deseados durante la maceración.
El macerado de maíz tiene un contenido en nitrógeno total del 7% y
un contenido en nitrógeno \alpha-amínico del 1,7%
y también contiene un 5% de azúcares, un 4% de potasio, un 3% de
fósforo y un 17% de otros minerales.
En el procedimiento de producción según la
invención, el crecimiento del hongo filamentoso en los medios de
cultivo mencionados anteriormente se lleva a cabo preferiblemente
durante 5-10 días a una temperatura constante de
23-30ºC.
El agente gelificante consiste preferiblemente
en una disolución que contiene alginato de sodio a una concentración
del 1-2%, preferiblemente el 1,3% en peso del peso
de la disolución. Una disolución de este tipo se añade
preferiblemente al medio de cultivo del hongo filamentoso según una
razón en volumen de medio de cultivo:disolución de alginato de
entre 40:60 y 60:40.
Como se sabe, el alginato de sodio puede
promover la gelificación de una mezcla líquida a la que se añade,
mediante el contacto de la mezcla con una disolución que contiene
sales de calcio.
Un aspecto importante consiste en la adición de
vehículos al medio de cultivo. En la presente invención, mediante
el término "vehículo" quiere decirse tanto un producto que
proporciona estabilidad y/o nutrientes a los hongos dispersados en
los gránulos de modo que permanezcan viables durante el
almacenamiento hasta su uso, como una "carga", es decir, un
producto que confiere el volumen y la consistencia deseados a los
gránulos.
Preferiblemente, los vehículos mencionados se
seleccionan del grupo que comprende tierra de diatomeas, harinas y
azúcares.
Un vehículo preferido es Celatom FPM 0.08. Se
trata de un producto comercial a base de cubiertas de diatomeas
(algas unicelulares silíceas) y tiene una granulometría de
aproximadamente 0,08 micrómetros. Este producto puede absorber una
cantidad de agua definida y por tanto ayuda a la consecución de un
volumen deseado de los gránulos finales.
Entre las harinas que pueden usarse como
vehículos en la presente invención, la harina de maíz es la más
preferida. Es un producto natural que puede absorber una cantidad
de agua equivalente a muchas veces su volumen y, en este caso
específico, también ayuda a la consecución de un volumen deseado de
los gránulos finales. Además, la harina de maíz constituye una
importante fuente de nutrientes para los hongos filamentosos
dispersados en los gránulos durante el almacenamiento y cuando se
diseminan los gránulos sobre el suelo que va a tratarse.
En particular, el uso de harina de maíz como
fuente de nutrientes es particularmente ventajoso en el caso de
Arthrobotrys conoides Dreschsler, ya que, sorprendentemente,
en tal caso puede verse que el hongo desarrolla un mayor número de
trampas de nematodos con un consiguiente aumento de la eficacia de
la lucha contra ellos.
Ventajosamente, los azúcares permiten que los
hongos filamentosos permanezcan viables durante el almacenamiento,
estabilizando las membranas celulares. Entre los azúcares que pueden
usarse en el procedimiento según la invención, se prefiere
especialmente la sacarosa.
Preferiblemente, en la presente invención, los
vehículos se añaden al medio de cultivo a través del agente
gelificante. En la práctica, mediante el uso de una disolución de
alginato de sodio como agente gelificante, los vehículos se añaden
preferiblemente a dicha disolución de alginato de sodio en
porcentajes que oscilan entre el 6% y el 22% en peso del peso de la
disolución. En un método particularmente preferido los vehículos se
añaden a la disolución de alginato de sodio en un porcentaje del 15%
en peso del peso de la disolución.
En el procedimiento según la invención, la
gelificación de la mezcla que contiene los hongos filamentosos y el
medio de cultivo relativo así como el promotor de la gelificación y
los vehículos se lleva a cabo preferiblemente añadiendo dicha
mezcla, gota a gota, a una disolución de sal de calcio.
La sal de calcio se elige preferiblemente entre
cloruro de calcio y gluconato de calcio. La concentración de la sal
de calcio en la disolución es de entre 0,2 M y 0,3 M y es
preferiblemente de 0,25 M en el caso del cloruro de calcio.
Habitualmente, la gelificación avanza más rápido con una
concentración creciente de sal de calcio.
Los gránulos o microgránulos en gelificación que
se forman mediante el contacto de las gotas de la mezcla mencionada
anteriormente con la disolución de sal de calcio predeterminada se
dejan reposar en la disolución mencionada anteriormente durante un
periodo de tiempo predeterminado, preferiblemente
2-3 minutos, de modo que se complete la
gelificación. La eliminación de los gránulos o microgránulos
gelificados de la disolución de sal de calcio se lleva a cabo de
manera convencional, por ejemplo mediante filtración.
El secado de los gránulos o microgránulos
gelificados puede llevarse a cabo ventajosamente a través de flujo
de aire estéril a una temperatura de 25-30ºC. En
general, los gránulos o microgránulos gelificados obtenidos a
partir de la gelificación de las gotas de la mezcla añadidas a la
disolución de sal de calcio predeterminada tienen un contenido en
humedad del 80-90%. Un contenido en humedad de este
tipo se reduce por medio de secado hasta un valor del
13-18%. De tal forma, los gránulos alcanzan el
volumen y la consistencia deseados, también con la ayuda de los
vehículos añadidos previamente al medio de cultivo.
Preferiblemente, con el procedimiento según la
invención, se obtienen gránulos o microgránulos que tienen un
diámetro de 1-3 mm, que ofrecen una diseminación
mejorada de los hongos filamentosos sobre el suelo que va a
tratarse.
El procedimiento según la invención puede
llevarse a cabo ventajosamente a escala industrial a través de
aparatos que son económicos y fáciles de diseñar. Un aparato
adecuado, descrito brevemente más adelante en el presente documento
como ejemplo no limitativo, comprende un reactor para el crecimiento
de los hongos filamentosos deseados en el medio de cultivo
adecuado, una mezcladora en la que el agente gelificante y los
vehículos se mezclan con el medio de cultivo de modo que se forma
una mezcla, medios adecuados para alimentar cantidades medidas de
la mezcla a elementos perforados adecuados de modo que se forman
gotas de la mezcla que tienen un volumen predeterminado, un
recipiente que contiene una disolución acuosa de sal de calcio para
recoger las gotas mencionadas anteriormente y permitir su
gelificación, y una secadora para secar los gránulos o microgránulos
gelificados recuperados en el recipiente que contiene la disolución
acuosa de sal de calcio.
Los medios para alimentar cantidades medidas de
la mezcla pueden comprender, por ejemplo, una bomba peristáltica o
dispositivos similares mientras que los elementos perforados pueden
ser tubos que terminan en la parte inferior en un orificio de
diámetro predeterminado, por ejemplo de 1-4 mm.
\newpage
Es importante que el aparato mencionado
anteriormente funcione en condiciones estériles con el fin de evitar
la contaminación por microorganismos, en particular los
antagonistas de los hongos filamentosos deseados. Los productos
usados para llevar a cabo el procedimiento según la invención, en
particular los productos añadidos al medio de cultivo en la mezcla
también deben esterilizarse adecuadamente antes de su uso.
Los gránulos o microgránulos obtenidos según el
procedimiento de la invención están listos para su uso pero
ventajosamente los hongos filamentosos contenidos en los mismos se
mantienen estables y viables durante largos periodos de tiempo. Por
tanto, los gránulos o microgránulos mencionados anteriormente se
prestan a conservarse o almacenarse durante un largo tiempo antes
de su uso, tras el cual los hongos filamentosos mantienen una
viabilidad totalmente satisfactoria para las aplicaciones para las
que están destinados.
La duración del tiempo conservación de los
gránulos o microgránulos según la invención antes de su uso es
ventajosamente superior a 8 semanas y es generalmente de entre 4 y 6
meses.
Los siguientes ejemplos de actuación del
procedimiento según la invención se llevaron a cabo con hongos
filamentosos de la familia Moniliales, y preferiblemente hongos
filamentosos Arthrobotrys conoides Dreschsler.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo del hongo filamentoso se llevó a cabo
en un reactor de 2 litros que contenía 1,2 litros del medio de
cultivo.
El reactor consiste preferiblemente en un
depósito que tiene un fondo redondeado, dotado de un agitador de
paletas, medios de calentamiento y enfriamiento, medios de soplado
de aire, así como sondas de pH, O_{2} y temperatura.
El medio consistía en 20 g/l de extracto de
malta y 4 g/l de extracto de levadura y se esterilizó antes de
sembrarse con conidios del hongo en cuestión.
Se incubó el cultivo durante 6 días desde la
siembra a una temperatura de aproximadamente 27ºC.
Durante la incubación, se tomaron muestras del
medio de cultivo para determinar la masa seca (g/l) y el número de
propágulos (UFC/l). Para determinar la masa seca, se filtraron 20 ml
del medio de cultivo y entonces se secaron en un horno a 100ºC
durante 24 horas. Se determinó el número de propágulos en 1 ml de
medio de cultivo.
Al final del tiempo de incubación, se obtienen
por tanto casi 8 g/l de hongo con un número de propágulos de 6 x
10^{9} por litro.
Se transfiere entonces el medio de cultivo que
contiene el hongo al interior de una mezcladora y se añaden al
medio de cultivo 1800 ml de una disolución acuosa al 1,3% en peso de
alginato de sodio, disolución a la que se le ha añadido un 6,6% de
Celatom FPM 0.08 (en peso del peso de la disolución).
Se homogeneiza entonces la mezcla resultante en
la mezcladora y se añade, gota a gota, a través de un tubo
perforado (diámetro del orificio de 1,6 mm) al interior de un
recipiente que contiene una disolución de cloruro de calcio 0,25
M.
Se obtienen así gránulos gelificados de la
mezcla mencionada anteriormente que se dejan reposar en la
disolución de cloruro de calcio durante 3 minutos.
Al final del tiempo de reposo, se separan los
gránulos gelificados mediante decantación y se secan en una cinta
transportadora hasta un contenido en humedad del 17%. El diámetro
promedio de los gránulos secos es de 2,2 mm.
El número promedio de propágulos en los gránulos
secos, tal como se determina inmediatamente tras su formación, es
sustancialmente el mismo que el determinado al final de la
incubación del hongo filamentoso, lo que demuestra que los
propágulos mencionados anteriormente han sobrevivido completamente
al procedimiento de granulación de la presente invención.
Los gránulos secos mencionados anteriormente se
mantienen durante 3 meses a temperatura ambiente. Al final del
periodo de almacenamiento, el número promedio de propágulos
supervivientes es igual al 50% del determinado tras la formación de
los gránulos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repitió la prueba del ejemplo 2 usando las
mismas condiciones experimentales que el ejemplo 1 con la excepción
de que se añadieron al medio de cultivo 1800 ml de una disolución
acuosa al 1,3% en peso de alginato de sodio, disolución a la que se
le habían añadido un 6,6% de Celatom FPM 0.08 y un 3,3% de harina de
maíz (en peso del peso de la disolución).
El diámetro promedio de los gránulos secos es de
2,5 mm y su contenido en humedad era del 17%.
El número promedio de propágulos en los gránulos
secos, tal como se determina inmediatamente tras su formación, es
sustancialmente el mismo que el determinado al final de la
incubación del hongo filamentoso, lo que demuestra que los
propágulos mencionados anteriormente han sobrevivido completamente
al procedimiento de granulación de la presente invención.
Los gránulos secos mencionados anteriormente se
mantienen durante 3 meses a temperatura ambiente. Al final del
periodo de almacenamiento, el número promedio de propágulos
supervivientes es igual al 90% del determinado tras la formación de
los gránulos, lo que permite que los gránulos secos puedan usarse
eficazmente sobre el suelo como agentes fitosanitarios.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repitió la prueba del ejemplo 3 usando las
mismas condiciones experimentales que el ejemplo 1 con la excepción
de que se añadieron al medio de cultivo 1800 ml de una disolución
acuosa al 1,3% en peso de alginato de sodio, disolución a la que se
le habían añadido un 6,6% de Celatom FPM 0.08, un 3,3% de harina de
maíz y un 5% de sacarosa (en peso del peso de la disolución).
El diámetro promedio de los gránulos secos es de
2,9 mm y su contenido en humedad es del 17%.
El número promedio de propágulos en los gránulos
secos, tal como se determina inmediatamente tras su formación, es
sustancialmente el mismo que el determinado al final de la
incubación del hongo filamentoso, lo que demuestra que los
propágulos mencionados anteriormente han sobrevivido completamente
al procedimiento de granulación de la presente invención.
Los gránulos secos mencionados anteriormente se
mantienen durante 3 meses a temperatura ambiente. Al final del
periodo de almacenamiento, el número promedio de propágulos
supervivientes es igual al 100% del determinado tras la formación
de los gránulos, lo que permite que los gránulos secos pueden usarse
eficazmente sobre el suelo como agentes fitosanitarios.
Además, en el uso de los gránulos mencionados
anteriormente, hay una mayor eficacia del hongo en el combate
contra los nematodos debido al hecho de que el hongo desarrolla un
mayor número de trampas contra ellos.
Claims (13)
1. Procedimiento para la producción de gránulos
o microgránulos que contienen hongos filamentosos que comprende las
etapas de:
- -
- seleccionar y hacer crecer hongos filamentosos en un medio de cultivo adecuado durante un periodo de tiempo predeterminado,
- -
- mezclar dicho medio de cultivo, tras dicho tiempo predeterminado, con un agente gelificante y al menos un vehículo, de modo que se obtiene una mezcla,
- -
- someter dicha mezcla a gelificación, a través de contacto gota a gota, con una disolución que contiene una sal de calcio obteniendo así gránulos o microgránulos gelificados que contienen dichos hongos filamentosos,
- -
- secar dichos gránulos o microgránulos gelificados hasta un contenido en humedad del 13-18%.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha etapa de gelificación se lleva a cabo añadiendo dicha
mezcla, gota a gota, a dicha disolución que contiene una sal de
calcio.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicho medio de cultivo para hongos filamentosos comprende
al menos una fuente de carbono elegida entre el grupo que consiste
en melaza, extracto de malta y sacarosa y al menos una fuente de
nitrógeno orgánico elegida entre extracto de levadura y "macerado
de maíz".
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que dicha al menos una fuente de carbono constituye entre el 70
y el 85% en peso del peso seco del medio de cultivo y dicha al menos
una fuente de nitrógeno orgánico constituye entre el 15 y el 30% en
peso del peso seco del medio de cultivo.
5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4,
en el que dicho medio de cultivo comprende además una fuente de
nitrógeno mineral.
6. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que dicha fuente de nitrógeno mineral está contenida en una
cantidad no superior al 10% en peso del peso seco del medio de
cultivo y preferiblemente de entre el 5 y el 8% en peso.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el agente gelificante
consiste en una disolución que contiene entre el 1 y el 2% en peso
de alginato de sodio.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que dicha disolución de alginato de sodio se añade al medio de
cultivo del hongo filamentoso preferiblemente según una razón en
volumen de medio de cultivo/disolución de alginato de entre 40:60 y
60:40.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dichos vehículos se eligen
del grupo que comprende tierra de diatomeas, preferiblemente Celatom
FPM 0.08, harinas, preferiblemente harina de maíz, y azúcares.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que dichos hongos filamentosos son de Arthrobotrys
conoides Dreschsler y dichos vehículos comprenden al menos
harina de maíz.
11. Procedimiento según la reivindicación 9 ó
10, en el que los vehículos se añaden a la disolución de alginato
de sodio en porcentajes que oscilan entre el 6% y el 22% en peso del
peso de la disolución.
12. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la disolución que contiene
una sal de calcio es preferiblemente una disolución acuosa de
cloruro de calcio o gluconato de calcio que tiene una concentración
de 0,2-0,3 M.
13. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que los gránulos o microgránulos
secados tienen un diámetro promedio de entre 1 y 3 mm.
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