CN113040175A - 一种门多萨假单胞菌的燕麦种衣剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种门多萨假单胞菌的燕麦种衣剂，发现了保藏号为CGMCC1.8049的门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)的新用途，其能够增加土壤中的微生物数量以及提高土壤酶活性，调节根圈微生物的生态平衡，提高有益真菌和放线菌的相对丰度，减少有害菌的相对丰度，为植物提供更有利的生长环境。本发明利用该菌的特性将其制备成种衣剂，所述种衣剂包括门多萨假单胞、腐殖酸、壳寡糖、聚乙烯醇和表面活性剂，该种衣剂除了具有所述门多萨假单胞菌所具备的功能，在种衣助剂的协同下还可提高作物产量以及预防燕麦的全蚀病或黑穗病。

Description

一种门多萨假单胞菌的燕麦种衣剂
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种含有门多萨假单胞菌的燕麦种衣剂。
背景技术
目前市面上的种衣剂内有有毒制剂，一方面，对于使用者是可能的安全风险。当农业操作时候，种衣剂的农药成分可能通过口腔、呼吸道和皮肤接触进入人体。人体的神经系统和肝脏系统，容易受到农药的攻击，产生病变。有证据表明，淋巴癌、白血病和骨髓瘤和长期接触农药有关。种衣剂中的有机磷类，会引起神经功能紊乱、震颤、语言失常等。种衣剂的除虫菊会刺激皮肤损害神经功能。对于农事人员，避免种衣剂农药成分对接触部位的损伤尤为重要。另一方面，对于环境包括空气、土壤、水体也是潜在风险来源。农药种衣剂种子播撒在土壤之中，会杀害土壤中的各类微生物和原生动物和节肢动物，使根圈有益的革兰氏阴性细菌死亡，增大了连作的风险，加大了土传病害的爆发概率，也减低了土壤对于植物分泌的化感物质的降解反应。也会透过雨水渗透和地表径流危害地下水和地表河流。进入水体的农药经过食物链传递，对各级生物链的生物带来毒害。尤其是浮游生物吸收吸附后，被各级鱼虾贝类富集，最后对人体带来潜在威胁。
目前种衣剂内部含有的各种杀菌剂、杀虫剂、除草剂可能会对种子的生活力和幼苗的生长有不利影响。种衣剂含有的化学成分会对种子的萌发造成不利影响，幼苗的生长也受到负面作用。光合产物运输受阻，表现为光合作用下降，气孔失去功能，叶肉细胞的传导率下降，叶片同化物输出受阻。这些药物成分也直接间接干预靶标植物的次生代谢和干扰活性氧代谢。因此，寻求一种无毒无副作用的绿色种衣剂成为本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过大量试验筛选了多种革兰氏阴性有益菌，发现保藏号为：CGMCC1.8049的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)可以作为种衣剂的活性成分，具有提高植物根系活力、种子发芽率和发芽势，还能预防全蚀病和黑穗病。
本发明通过以下技术方案实现本发明的目的：
第一方面：本发明提供了保藏号为：CGMCC1.8049的门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)在下述的中的任一种应用：
(1)所述的门多萨假单胞菌在制备种衣剂中的应用；
(2)所述的门多萨假单胞菌在提高植物根系活力中的应用；
(3)所述的门多萨假单胞菌在增加土壤中的微生物数量中的应用；
(4)所述的门多萨假单胞菌在提高土壤酶活性中的应用；
(5)所述的门多萨假单胞菌在提高种子的发芽率和发芽势中的应用。
经试验验证保藏号为CGMCC1.8049的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)能够增加土壤中的微生物数量以及提高土壤酶活性，调节根圈微生物的生态平衡，提高有益真菌和放线菌的相对丰度，减少有害菌的相对丰度，为植物提供更有利的生长环境。本发明中的保藏号为CGMCC1.8049的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
第二方面：本发明提供了一种含有门多萨假单胞菌的种衣剂，包括门多萨假单胞、腐殖酸、壳寡糖、聚乙烯醇、表面活性剂。将保藏号为CGMCC1.8049的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)作为活性成分与种衣助剂混合制备成种衣剂，可提高作物的产量。
优选地，所述种衣剂包括以下重量份的组分：门多萨假单胞菌菌粉15-30重量份、腐殖酸20-30重量份、壳寡糖20-30重量份、聚乙烯醇15-24重量份和表面活性剂0.05-1重量份。
优选地，所述种衣剂包括以下重量份的组分：门多萨假单胞菌菌粉20重量份、腐殖酸25重量份、壳寡糖25重量份、聚乙烯醇20重量份和表面活性剂0.5重量份。
优选地，所述表面活性剂为十二烷基苯磺酸钙。
第三方面：本发明还提供了所述含有门多萨假单胞菌的种衣剂在下述的中的任一种应用：
(1)所述的种衣剂在制备种衣剂中的应用；
(2)所述的种衣剂在提高植物根系活力中的应用；
(3)所述的种衣剂在增加土壤中的微生物数量中的应用；
(4)所述的种衣剂在提高土壤酶活性中的应用；
(5)所述的种衣剂在提高种子的发芽率和发芽势中的应用；
(6)所述的种衣剂在提高作物产量中的应用；
(7)所述的种衣剂在预防全蚀病或黑穗病中的应用；
(8)所述的种衣剂在预防纹枯病或根腐病中的应用。
优选地，所述植物为燕麦。
第四方面：本发明还提供了上述含有门多萨假单胞菌的种衣剂的制备方法，包括以下步骤：
S1制备门多萨假单胞菌菌粉：取门多萨假单胞菌菌种接种于液体培养基后，置于28～30℃下培养48小时后，获得发酵液，然后采用压力式喷雾干燥塔喷雾干燥，获得菌粉；
S2制备种衣助剂：将腐殖酸、壳寡糖、聚乙烯醇、表面活性剂十二烷基苯磺酸钙按照一定的重量份加入到90-110℃的水中，混匀，制备成种衣助剂溶液；
S3待所述种衣助剂溶液冷却至40-50℃后，加入所述S1的菌粉，制得本发明的种衣剂。
优选地，所述种衣剂中所述门多萨假单胞菌的总菌数为2.5×106～×109个/mL。
优选地，所述表面活性剂为十二烷基苯磺酸钙或烷甲酚甲醛聚氧乙基醚。
本发明的有益效果为：本发明发现了保藏号为CGMCC1.8049的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的新用途，其能够增加土壤中的微生物数量以及提高土壤酶活性，调节根圈微生物的生态平衡，提高有益真菌和放线菌的相对丰度，减少有害菌的相对丰度，为植物提供更有利的生长环境。本发明利用该菌的特性将其制备成种衣剂，该种衣剂除了具有所述门多萨假单胞菌所具备的功能，在种衣助剂的协同下还可提高作物产量以及预防燕麦的全蚀病或黑穗病。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中的保藏号为CGMCC1.8049的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，公众可从CGMCC中购买获得本发明的生物材料。
实施例1
制备保藏号为CGMCC1.8049的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的发酵液：取门多萨假单胞菌菌种接种于液体培养基后，置于2℃下培养48小时后，获得发酵液。培养基的制备：1L培养基中含有牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，将配制好的培养基与121℃灭菌15min。将制备的发酵液稀释10倍后测定效果，其中经检测将发酵液中的活菌数为3.6×109个/mL。具体操作如下：
选取40例燕麦种子，随机分为实验组和对照组，每组20粒种子，实验组中将每粒种子浸泡于上述发酵液中8小时后，进行播种；对照组采用清水作为对照。观察种子发芽率和发芽势、植株根系活力、土壤中的微生物数量以及土壤酶活性情况。
种子发芽率和发芽势采用如下方法：选用三层滤纸的培养皿作为发芽床，用少量清水浸湿，把各组的20粒种子均匀放在滤纸上，培养皿放在恒温培养箱内，每三天换一次滤纸，用胚芽长度等于种子长度的一半作为发芽标准。在发芽第四天记录发芽势，在发芽第十天记录发芽率，计算公式如下：
发芽率GR＝(N0/N)×100％，N0为发芽终期全部发芽的种子数；N为供试种子数；
发芽势GE＝(N4/N)×100％，N4为种子发芽第4天的正常种子发芽数；N为供试种子数。
根系活力测定采用如下方法：利用氯化三苯基四氮唑(TTC)测定根系活力。植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲瓒，TTC剂量可以表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。燕麦种子生长30天月时，取实验组和对照组相同质量的根尖样品，放入烧杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，充分反应，在37℃下暗保温两小时，加入硫酸以停止反应。TTC标准曲线的制作：取0.4％TTC溶液0.2ml放入量瓶中，加Na2S2O4立即产生三苯甲瓒，显示红色。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。取不同质量的三苯甲瓒的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。把根拿出，吸干表面水分后，加入乙酸乙酯3～4ml，和石英砂一起在研钵内磨碎，析出三苯甲瓒。红色三苯甲瓒提取液移入试管，加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四氮唑还原强度(mg/g(根鲜重)/h)＝四氮唑还原量(mg)/[根重(g)×时间(h)]。
土壤中的微生物数量测定采用如下方法：当燕麦种子生长至60天时，采样植株的根系附近的土壤，测定其的微生物数量，土壤细菌数量采用牛肉膏蛋白胨培养基测定，土壤放线菌数量采用高氏1号培养基测定，土壤真菌数量采用马丁氏培养基测定。
土壤酶活性测定采用如下方法：测定蔗糖酶活性采用3,5—二硝基水杨酸比色法；测定脲酶活性采用苯酚钠比色法；测定蛋白酶活性采用茚三酮比色法；测定多酚氧化酶活性采用焦性没食子酸比色法；测定磷酸酶活性采用磷酸苯二钠法。
结果如表1所示：
表1：
Figure BDA0002938176930000061
由上表1可以看出，与对照组相比，实验组的燕麦种子的发芽率、发芽势和根系活力均有显著提高，同时还提高了土壤中的微生物数量以及土壤酶活性，说明保藏号为CGMCC1.8049的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的发酵液能具有提高发芽率和发芽势、植株根系活力、土壤中的微生物数量以及土壤酶活性的作用。
实施例2
本实施例提供一种种衣剂，其包含以下重量份的组分：门多萨假单胞菌菌粉20重量份、腐殖酸25重量份、壳寡糖25重量份、聚乙烯醇20重量份和表面活性剂十二烷基苯磺酸钙0.5重量份。
上述种衣剂由以下制备方制备：
S1制备门多萨假单胞菌菌粉：取门多萨假单胞菌菌种接种于液体培养基后，置于28～30℃下培养48小时后，获得发酵液，然后采用压力式喷雾干燥塔喷雾干燥，获得菌粉；
S2制备种衣助剂：将腐殖酸、壳寡糖、聚乙烯醇、表面活性剂十二烷基苯磺酸钙按照一定的重量份加入到90℃的水中，混匀，制备成种衣助剂溶液；
S3待所述种衣助剂溶液冷却至40℃后，加入所述S1的菌粉，制得本发明的种衣剂；其中经检测将种衣剂中的活菌数为5.6×108个/mL。
实施例3
本实施例提供一种种衣剂，其包含以下重量份的组分：门多萨假单胞菌菌粉15重量份、腐殖酸20重量份、壳寡糖20重量份、聚乙烯醇15重量份和表面活性剂十二烷基苯磺酸钙0.05重量份。
实施例4
本实施例提供一种种衣剂，其包含以下重量份的组分：门多萨假单胞菌菌粉30重量份、腐殖酸30重量份、壳寡糖30重量份、聚乙烯醇24重量份和表面活性剂十二烷基苯磺酸钙1重量份。
验证本实施例2～4种衣剂的对燕麦种子生长的影响，实验方法与检测方法均采用实施例1的方法，结果如表2所示：
表2
Figure BDA0002938176930000071
Figure BDA0002938176930000081
由上表2可以看出，实施例2～4中的燕麦种子的发芽率、发芽势和根系活力均有显著提高，同时还提高了土壤中的微生物数量以及土壤酶活性，说明实施例2～4制备的种衣剂能具有提高发芽率和发芽势、植株根系活力、土壤中的微生物数量以及土壤酶活性的作用。
效果例1验证本发明种衣剂的防虫防病害的功效
实验方法：选取40粒燕麦种子，随机分为对照组与实验组，每组20粒。对照组使用清水作为对照；实验组分别使用实施例2～4的种衣剂包裹种子，使种子表面均匀包裹的种衣剂，冷凉风干。待植株生长45天左右时，分别接种纹枯病菌、根腐病菌、全蚀病或黑穗病，计算植株的侵茎率、病株率以及全蚀病和黑穗病发病率。结果如表3所示：
表3：
Figure BDA0002938176930000082
Figure BDA0002938176930000091
由表3可以看出，与对照组相比，实验组中的侵茎率、病株率以及全蚀病和黑穗病发病率均低于对照组，说明本发明的种衣剂能够预防纹枯病菌、根腐病菌、全蚀病或黑穗病。
效果例2门多萨假单胞菌包衣剂可减少氮肥的施用量，提高产量
选取没有包裹门多萨假单胞菌的白燕8号和均匀包裹门多萨假单胞菌的白燕8号进行种植，分别作为对照组和处理组，田间管理的除草、灌水、病虫害防治采用日常规定操作，但是处理组相对于对照组减少施用30％的氮肥。在收获期采用机械收获，及时入仓入库。结果如表4：
表4：
Figure BDA0002938176930000092
由表4可以看出，相比对照组，处理组显然提高了产量，穗粒数、籽粒饱满度、穗数以及千粒重均有所提高，表明经本发明种衣剂处理的种子在种植过程中可以减少30％氮肥的施用，可替代部分氮肥，同时还能提高产量。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.保藏号为CGMCC1.8049的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)在下述的中的任一种应用：
(1)所述的门多萨假单胞菌在制备种衣剂中的应用；
(2)所述的门多萨假单胞菌在提高植物根系活力中的应用；
(3)所述的门多萨假单胞菌在增加土壤中的微生物数量中的应用；
(4)所述的门多萨假单胞菌在提高土壤酶活性中的应用；
(5)所述的门多萨假单胞菌在提高种子的发芽率和发芽势中的应用。
2.一种含有门多萨假单胞菌的种衣剂，其特征在于，所述种衣剂包括门多萨假单胞、腐殖酸、壳寡糖、聚乙烯醇和表面活性剂，所述门多萨假单胞为保藏号为CGMCC1.8049的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)。
3.如权利要求2所述的种衣剂，其特征在于，包括以下重量份的组分：门多萨假单胞菌菌粉15-30重量份、腐殖酸20-30重量份、壳寡糖20-30重量份、聚乙烯醇15-24重量份和表面活性剂0.05-1重量份。
4.如权利要求2所述的种衣剂，其特征在于，所述种衣剂包括以下重量份的组分：门多萨假单胞菌菌粉20重量份、腐殖酸25重量份、壳寡糖25重量份、聚乙烯醇20重量份、表面活性剂0.5重量份。
5.如权利要求2～4任一项所述的种衣剂，其特征在于，所述表明活性剂为十二烷基苯磺酸钙。
6.如权利要求2～5任一项所述的种衣剂在下述的中的任一种应用：
(1)所述的种衣剂在制备种衣剂中的应用；
(2)所述的种衣剂在提高植物根系活力中的应用；
(3)所述的种衣剂在增加土壤中的微生物数量中的应用；
(4)所述的种衣剂在提高土壤酶活性中的应用；
(5)所述的种衣剂在提高种子的发芽率和发芽势中的应用；
(6)所述的种衣剂在提高作物产量中的应用；
(7)所述的种衣剂在预防全蚀病或黑穗病中的应用；
(8)所述的种衣剂在预防纹枯病或根腐病中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为燕麦。
8.一种权利要求2～5任一项所述的种衣剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1制备门多萨假单胞菌菌粉：取门多萨假单胞菌菌种接种于液体培养基后，置于28～30℃下培养48小时后，获得发酵液，然后采用压力式喷雾干燥塔喷雾干燥，获得菌粉；
S2制备种衣助剂：将腐殖酸、壳寡糖、聚乙烯醇、表面活性剂十二烷基苯磺酸钙按照一定的重量份加入到90-110℃的水中，混匀，制备成种衣助剂溶液；
S3待所述种衣助剂溶液冷却至40-50℃后，加入所述S1的菌粉，制得本发明的种衣剂。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述种衣剂中所述门多萨假单胞菌的总菌数为2.5×106～×109个/mL。
10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为十二烷基苯磺酸钙或烷甲酚甲醛聚氧乙基醚。
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