CN116004453B

CN116004453B - 一种阿特拉津降解菌株和发酵液及其应用

Info

Publication number: CN116004453B
Application number: CN202211623943.0A
Authority: CN
Inventors: 孙冬梅; 林志伟; 魏莹
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2022-12-15
Filing date: 2022-12-15
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2042-12-15
Also published as: CN116004453A

Abstract

本发明属于化学农药生物降解技术领域，具体公开了一种阿特拉津降解菌株和发酵液及其应用，该降解菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp.）ate‑1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019925，保藏日期为2019年11月13日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。所述阿特拉津降解菌株用于促进阿特拉津污染土壤中的向日葵的萌发和生长。与现有技术相比，本发明的阿特拉津降解菌株可产生吲哚乙酸，促进向日葵种子萌发，能有效缓解阿特拉津污染土壤中的阿特拉津对向日葵的药害作用，可增强向日葵植株的叶面积、地上及地下重量与叶绿素含量，并提高土壤中磷酸酶及脲酶活性，为阿特拉津污染环境修复栽种向日葵提供了良好的技术支持。

Description

一种阿特拉津降解菌株和发酵液及其应用

技术领域

本发明涉及化学农药生物降解技术领域，特别是一种阿特拉津降解菌株和发酵液及其应用。

背景技术

阿特拉津（Atrazine）也称莠去津，是一种内吸选择性苗前、苗后封闭除草剂，可通过抑制杂草的光合作用发挥除草效果，对部分一年生禾本科杂草和阔叶杂草均具有防除作用。阿特拉津的性质比较稳定，土壤中残留可达一年左右，下茬敏感作物种类较多，也是目前生产上最易产生药害的除草剂品种之一。目前的研究发现细菌、真菌、放线菌和藻类中均有能降解该农药的菌株，已发现或构建的阿特拉津降解细菌至少有19个属，其中研究最为广泛的是节杆菌属（Arthrobacterspp.），而芽孢杆菌属(Bacillus spp.)也是较为常见的降解菌之一。

芽孢杆菌属细菌对外界有害因子抵抗力强，广泛存在于土壤、水体及生物体中，相对功能全面且安全无公害，因而在农业、工业及医药卫生等领域具有重要的应用价值。

芽孢杆菌可通过产生蛋白酶、淀粉酶、有机酸等促进对淀粉、蛋白等大分子有机物质的降解；通过对硝酸盐的还原减轻氮素的淋溶损失；通过分泌产生多黏菌素、抗菌肽等活性物质防治植物病原微生物；通过产生生长素等激素类物质促进植物生长。此外，芽孢杆菌还具有降解农残、减轻重金属毒害等作用，是农业上重要的有益菌之一。

向日葵( Helianthaus annuus L.)为一年生草本植物，属于菊科，向日葵属，是世界上重要的油料作物和经济作物。其对阿特拉津抗药性中等，通常在上茬用莠去津有效成分超过1000 mL/ha时，对其会产生不同程度的不良影响或药害，且用药量越大，药害越重；用药量38%莠去津悬浮剂3500 mL/ha时，施药后40个月才可以种植。

鉴于阿特拉津对后茬作物的危害，亟待获取一种阿特拉津降解菌株。

发明内容

本发明的目的是要提供一种阿特拉津降解菌株和发酵液及其应用，该菌具有一定的促生及降解效能，可缓解阿特拉津污染土壤对向日葵的毒害。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

本发明的第一个目的是要提供一种阿特拉津降解菌株，该降解菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp）ate-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019925，保藏日期为2019年11月13日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

本发明的第二个目的是要提供一种阿特拉津降解菌株的应用，所述阿特拉津降解菌株用于促进阿特拉津污染土壤中的向日葵的萌发和生长。

本发明的第三个目的是要提供一种阿特拉津降解菌发酵液，由在扩增培养基中按接种量5%接入对数期的阿特拉津降解菌株后振荡培养48 h获得，所述扩增培养基由以下组分制成：蒸馏水1000mL，可溶性淀粉5g，葡萄糖10g，蛋白胨3g，硫酸铵1g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，121℃灭菌25 min。

本发明的第四个目的是要提供一种阿特拉津降解菌发酵液的应用，所述阿特拉津降解菌株用于促进阿特拉津污染土壤中的向日葵的萌发和生长。

与现有技术相比，本发明的阿特拉津降解菌株可产生吲哚乙酸，能够促进向日葵种子萌发；同时能有效缓解阿特拉津污染土壤中的阿特拉津对向日葵的药害作用，可增强向日葵植株的叶面积、地上及地下重量与叶绿素含量，并一定程度上提高土壤中磷酸酶及脲酶活性，为阿特拉津污染环境修复栽种向日葵提供了良好的技术支持。

附图说明

图1为本发明的阿特拉津降解菌株的16srRNA 进化树。

图2为阿特拉津平板菌株生长情况。

图3为在改良SMS培养基培养下不同时间的阿特拉津降解结果。

图4为向日葵种子萌发率结果。

图5为向日葵种子萌发10 d的结果。

图6不同处理的向日葵的叶片生长状况。

图7为不同处理土壤酶活性变化。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

以下实施例中所用试剂与培养基如下：

阿特拉津原药及乳油均来自于天津市汉邦植物保护剂有限责任公司。

改良SMS培养基：K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.1g，葡萄糖3g，阿特拉津适量，锌铁母液 5mL（100 mL蒸馏水，10 g柠檬酸钠，0.4 g CaCl₂，0.2 g FeSO₄·7H₂O，0.04g ZnSO₄·7H₂O），蒸馏水定容至1 L，121℃灭菌25 min。

细菌扩增培养基：蒸馏水1000mL，可溶性淀粉5g，葡萄糖10g，蛋白胨3g，硫酸铵1g，K₂HPO₄ １g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，121 ℃灭菌25 min。

改良King培养基：蛋白胨 20.0 g， K₂HPO₄ 1.5g， MgSO₄·7H₂O 1.5 g，酵母粉1g， L-色氨酸 200 mg，去离子水 1000 mL，最后在121℃灭菌下 20 min。

牛奶培养基：脱脂奶粉100 g，琼脂粉15 g，加入蒸馏水1L，葡萄糖0.5%，煮沸10min。

实施例1

阿特拉津降解菌的获取

称10 g取自二九一农场玉米田的土样加入含有玻璃珠及90 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，于27℃ 150r/min恒温震荡30 min，然后利用无菌水将土壤悬液进行倍比稀释，选取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的土样悬液，在含有200 µg/mL阿特拉津的改良SMS平板中涂布培养，长出菌落并产生透明圈的进一步检测耐受性。（15 µg/mL浓度以上的阿特拉津在培养基中以稳定悬浊液形态存在，所以目的菌株周边可以观察到明显的水解圈）；筛选一株水解圈较明显的菌株；对该菌株进行16s rDNA测序后初步鉴定为芽孢杆菌属，具体的序列如下：

GCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTG

ATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACC

GGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC

AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACC

TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAAT

CTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCT

CTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCAC

GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAA

GGGCTCGCAGACTTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACT

GGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGG

AACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACA

GGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAG

TGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGA

CGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTAATAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG

ACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTC

GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCA

TTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCA

TGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGCCCCCGCGAGGTTA

AGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGC

TAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAC

GAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGA

TTGGGGTGAAGTCG。

将上述序列与NCBI（美国国立生物技术信息中心）中的序列比对后确定该菌株归属于Bacillus sp.，其进化树如图1所示；将该菌株命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.）ate-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019925，保藏日期为2019年11月13日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

利用改良SMS阿特拉津培养基100mL，阿特拉津母液配置方法为 5 g阿特拉津与1mL吐温80混合后溶于100 mL蒸馏水中，阿特拉津终浓度分别为200 µg/mL、500 µg/mL、800µg/mL与1000 µg/mL，加入1.5 g琼脂粉，制作平板。将芽孢杆菌（Bacillus sp.）ate-1接种至上述平板中，放置在28℃恒温培养箱中进行培养，观察菌株生长情况如图2所示，由图2可以看出，该菌株在1000 µg/L浓度阿特拉津含量培养基的平板中仍可生长，且能产生水解圈，表明该菌株对阿特拉津具有耐受及降解能力。

进一步，对上述芽孢杆菌（Bacillus sp.）ate-1的降解阿特拉津的能力进行测定：参考工业废水中阿特拉津的测定方法，以正己烷作为萃取剂，测定218nm处吸光值。将菌株进行液体培养，待培养液出现明显浑浊后按1%的接菌量接入改良SMS液体培养基中，在接菌后24 h，48 h、72 h、96 h、120 h后分别用正己烷按1：1的比例进行萃取，测定吸光度，并带入标准曲线，判断目的菌株是否可以降解阿特拉津，及粗略检验目的菌株的降解能力，其结果如图3所示。由图3可知，利用改良SMS培养基，测定不同时间的阿特拉津降解效率发现，该菌株在培养24 h后即可对阿特拉津进行降解，当培养时间达到72 h以上，降解率可高于95%。

本实施进一步对上述芽孢杆菌（Bacillus sp.）ate-1的特性进行检测

（1）产蛋白酶能力检测

将芽孢杆菌（Bacillus sp.）ate-1点接在牛奶培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养36 h 后检测有无水解圈产生。经初步检测，在牛奶培养基中该菌株不产生水解圈，证明该菌株不具备产生蛋白酶的能力。

（2）IAA 产生能力测定

吸取在King培养基中分别培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h的芽孢杆菌（Bacillus sp.）ate-1的发酵液2 mL于离心管中，12000 r/min离心3 min，取1 mL上清液于试管中，加入2 mL Sakowski试剂在黑暗处室温下反应30 min，反应后在530 nm测吸光值，以未接菌的King液体培养基做空白对照，测定结果如表1所示。

表1

由表1可知，该芽孢杆菌（Bacillus sp.）ate-1可以产生吲哚乙酸，在48 h和72 h时产生能力较强，随时间进一步延长至96 h与120 h时，菌株产生能力下降。表明菌株在King培养基中可产生IAA，但培养时间不易过长。

实施例2

上述实施例的芽孢杆菌（Bacillus sp.）ate-1可用于促进阿特拉津污染土壤中的向日葵的萌发和生长，以下分别进行描述：

（1）菌株发酵液对向日葵种子萌发的影响

配制扩增培养基，按接种量5%接入对数期的菌种后振荡培养48 h。然后将发酵液和培养基分别用无菌水稀释成浓度梯度分别为20倍、40倍、60倍、80倍、100倍的待测液，以无菌水为对照。向日葵种子筛选后用70%乙醇表面消毒1 min，并用无菌水冲洗两遍后，将处理好的向日葵种子使用对应浓度梯度的待测液对其进行浸泡，浸泡时间为4 h。在无菌室中将种子转移到提前灭菌的垫有滤纸的培养皿中，每一个平板中接入20粒种子，并且每组中各加入对应梯度的稀释液5 mL，之后每两天添加一次无菌水，以保证种子发芽中水分的充足。培养10 d之后进行根长度、根数量及芽长的测量。每一个处理都需做五组重复。其结果如图4、图5及表2所示。

表2

图4、图5中可以看出，菌液对向日葵种子萌发率无影响，菌液40倍处理时，对芽长作用不理想，但可明显增加向日葵萌发中的根数。从表2中数据可知，菌液稀释不同倍数对根长和芽长影响不大，但无论是菌液还是原培养基稀释20倍时的根数、根长及芽长数据都比较低，表明低稀释倍数对发芽生长有一定的抑制，但稀释40倍以上，对芽长的影响效果不如根数和根长明显，表明该菌菌液的主要作用体现在对根长和根数的促进上。

（2）菌株在阿特拉津污染土壤中的应用及栽种向日葵试验

阿特拉津降解菌在扩增培养基中培养48 h 后即可使用，使用量为每公斤土3 mL菌液。

阿特拉津土壤处理：土壤过筛混匀后分成不同处理，分别为阿特拉津加量20 mg/kg、15 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg、0 mg/kg（使用38%的阿特拉津乳油，添加量按阿特拉津原液含量计算）。每份土壤分别设置为加菌和不加菌处理，同时设置一个只加菌的处理。加水量按每公斤土共200 mL 水即可。如以阿特拉津含量为20 mg/kg 土处理为例：分加菌、不加菌；加菌的取3 mL 菌液加入197 mL 水中（含20 mg阿特拉津），拌入1 kg 土中；不加菌的取3 mL扩增培养基加入197 mL 水（含20 mg阿特拉津）拌入1 kg 土即可。土壤处理好后分装花盆，浇足水分，孵育1 d后播种，并利用相同处理的土壤覆土。待向日葵出苗后测定株高、叶面积、地上重、地下重、茎粗、叶片重及叶绿素含量，其结果如图6、表3所示。

表3

由图6可以看出，不添加降解菌时，随着阿特拉津浓度增加，叶片的颜色逐渐变浅且叶面积也逐渐变小，至20 mg/kg土含量时，叶片已经开始萎蔫；而添加降解菌后向日葵叶片的颜色及大小均有缓解，表明降解菌在实际应用中可缓解阿特拉津的毒害作用。

由表3可知：随着土壤中阿特拉津含量的提高，在种植20 d时，向日葵植株最大叶的叶面积、茎粗、地上及地下重与叶绿素含量均下降，但降解菌的加入却可以有效地提高叶面积及地上地下重与叶绿素含量，尤其是阿特拉津含量为20 mg/Kg土时，不添加降解菌的植株已出现濒临死亡的趋势；更加进一步表明了该菌株在所使用的阿特拉津含量下对阿特拉津毒害的有效缓解作用，经初步计算在实验室条件下该含量可折合使用阿特拉津用量5000 mL/ha以上。

（3）菌株应用后土壤中相关酶活性变化

土壤脲酶的测定：取2.5 g 风干土，置于50 mL 三角瓶中，加1 mL 甲苯。15 min后加10 mL 10%尿素液和20 mL pH6.7 柠檬酸缓冲液。摇匀后在37℃恒温箱中培养24 h。过滤后取1.5 mL 滤液注入50 mL 锥形瓶中，然后加蒸馏水20 mL，再加4 mL 苯酚钠溶液和3mL 次氯酸钠溶液，边加边摇匀。20 min 后显色，定容至50 mL，1 h 内在分光光度计上于波长578 nm 处比色。

结果计算：脲酶活性（M）以24 h后1 g土壤中NH₃－N的毫克数表示；每产生1 mgNH₃－N即为一个酶活单位（U）。

磷酸酶活性：取2.5 g风干土，置于50 mL三角瓶中，加5滴甲苯。20 mL 0.5%磷酸苯二钠，充分振荡后在37℃恒温箱中培养2 h。取培养后滤液5 mL，分置50 mL的锥形瓶中，加20 mL蒸馏水，再加0.25 mL缓冲液，0.5 mL 4－氨基安替比林液，0.5 mL铁氰化钾液，每次充分摇动。最后定容至50 mL，15 min内在分光光度计上于波长510 nm处比色。

结果计算：磷酸酶的活性（M），以2 h后1 g土壤中P₂O₅的毫克数表示，每产生1 mgP₂O₅即为一个酶活单位（U）。

菌株应用后土壤中相关酶活性变化结果如图7所示，由图7可知，随着阿特拉津添加量的增多，土壤脲酶活性与磷酸酶活性均下降，但加入降解菌后却可以一定程度上提高酶活性，即加菌处理的土壤酶活性均高于不加菌的处理。也进一步证实了降解菌的添加也可改善土壤环境，对植株生长产生促进作用。

综述，本发明的阿特拉津降解菌株可产生吲哚乙酸，能够促进向日葵种子萌发；同时能有效缓解阿特拉津污染土壤中的阿特拉津对向日葵的药害作用，可增强向日葵植株的叶面积、地上及地下重量与叶绿素含量，并一定程度上提高土壤中磷酸酶及脲酶活性，为阿特拉津污染环境修复栽种向日葵提供了良好的技术支持。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种阿特拉津降解菌株，其特征在于，该降解菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp.）ate-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019925；保藏日期为2019年11月13日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学；所述阿特拉津降解菌株用于促进阿特拉津污染土壤中的向日葵的萌发和生长。

2.一种如权利要求1所述的阿特拉津降解菌株的发酵液，其特征在于，由在扩增培养基中按接种量5%接入对数期的阿特拉津降解菌株后振荡培养48 h获得，所述扩增培养基由以下组分制成：蒸馏水1000 mL，可溶性淀粉5 g，葡萄糖10 g，蛋白胨3 g，硫酸铵1 g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，121℃灭菌25 min。

3.一种如权利要求2所述的阿特拉津降解菌株的发酵液的应用，其特征在于，所述阿特拉津降解菌株的发酵液用于促进阿特拉津污染土壤中的向日葵的萌发和生长。