JP2003061651A - 耐熱性トレハラーゼと、その製造法 - Google Patents
耐熱性トレハラーゼと、その製造法Info
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- JP2003061651A JP2003061651A JP2001250756A JP2001250756A JP2003061651A JP 2003061651 A JP2003061651 A JP 2003061651A JP 2001250756 A JP2001250756 A JP 2001250756A JP 2001250756 A JP2001250756 A JP 2001250756A JP 2003061651 A JP2003061651 A JP 2003061651A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 中性域で酵素活性を有する耐熱性トレハラー
ゼを提供する。 【解決手段】 好熱性バチルス属に属する微生物が産生
する酵素であって、以下の性質： (1) トレハロースをグルコース２分子に分解する酵素
活性を有する； (2) pH6-8において80％以上の相対活性を示す； (3) 45-55℃の温度において80％以上の相対活性を示
す；および (4) 分子量が約26kD；を有することを特徴とする耐熱
性トレハラーゼ。
ゼを提供する。 【解決手段】 好熱性バチルス属に属する微生物が産生
する酵素であって、以下の性質： (1) トレハロースをグルコース２分子に分解する酵素
活性を有する； (2) pH6-8において80％以上の相対活性を示す； (3) 45-55℃の温度において80％以上の相対活性を示
す；および (4) 分子量が約26kD；を有することを特徴とする耐熱
性トレハラーゼ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、新規な耐熱性ト
レハラーゼと、その製造法に関するものである。さらに
詳しくは、トレハロース含有量の測定等に有用な新しい
耐熱性酵素トレハラーゼと、このトレハラーゼを産生す
る微生物、およびこの微生物を用いたトレハラーゼの製
造法に関するものである。
レハラーゼと、その製造法に関するものである。さらに
詳しくは、トレハロース含有量の測定等に有用な新しい
耐熱性酵素トレハラーゼと、このトレハラーゼを産生す
る微生物、およびこの微生物を用いたトレハラーゼの製
造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】トレハロースは、２分子のα
−Ｄ−グルコースが結合した非還元性糖であり、酵母を
はじめとする微生物、カビ、昆虫、茸類、藻類、地衣
類、甲殻類等の自然界に広く分布しており、生体の耐寒
性や耐乾燥性等に重要な役割を果たしている。このトレ
ハロースは、従来は、酵母からの抽出法により製造され
ていたが、高価格のために広く利用されるに至らなかっ
た。しかしながら、最近になって発見された酵素を用い
てデンプン等から安価に大量生産できるようになったこ
とから、トレハロースは甘味料等として数多くの食品
や、保湿効果を利用してクリーム、ローション等の化粧
品にも使用されるようになり、さらに医薬品、化成品へ
の利用も期待されている。
−Ｄ−グルコースが結合した非還元性糖であり、酵母を
はじめとする微生物、カビ、昆虫、茸類、藻類、地衣
類、甲殻類等の自然界に広く分布しており、生体の耐寒
性や耐乾燥性等に重要な役割を果たしている。このトレ
ハロースは、従来は、酵母からの抽出法により製造され
ていたが、高価格のために広く利用されるに至らなかっ
た。しかしながら、最近になって発見された酵素を用い
てデンプン等から安価に大量生産できるようになったこ
とから、トレハロースは甘味料等として数多くの食品
や、保湿効果を利用してクリーム、ローション等の化粧
品にも使用されるようになり、さらに医薬品、化成品へ
の利用も期待されている。
【０００３】このように、トレハロースの利用は今後ま
すます拡大すると予想されるが、トレハロースを含む製
品の研究開発や品質管理等において、トレハロース含有
量の測定は不可欠である。従来は、薄層クロマトグラフ
ィや液体クロマトグラフィによってトレハロース含有量
を測定していたが、操作性、迅速性の点で問題があっ
た。
すます拡大すると予想されるが、トレハロースを含む製
品の研究開発や品質管理等において、トレハロース含有
量の測定は不可欠である。従来は、薄層クロマトグラフ
ィや液体クロマトグラフィによってトレハロース含有量
を測定していたが、操作性、迅速性の点で問題があっ
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】トレハロース含有量の
簡便かつ高精度の測定法として、「トレハラーゼ」を利
用した方法が考えられる。トレハラーゼは、トレハロー
スをグルコース２分子に分解する酵素である。そこで、
このトレハラーゼを用いてトレハロースをグルコースに
分解し、より簡便に測定可能なグルコース量を同定する
ことによって、製品中のトレハロースを高精度に測定す
ることが可能となる。
簡便かつ高精度の測定法として、「トレハラーゼ」を利
用した方法が考えられる。トレハラーゼは、トレハロー
スをグルコース２分子に分解する酵素である。そこで、
このトレハラーゼを用いてトレハロースをグルコースに
分解し、より簡便に測定可能なグルコース量を同定する
ことによって、製品中のトレハロースを高精度に測定す
ることが可能となる。
【０００５】なお、トレハラーゼとしては、例えば、ク
ロレラ由来のトレハラーゼ（特開平7-246094号公報：従
来技術１）や、ペニシリウム属、アスペルギルス属、ム
コール属、ピキア属、ハンセニュラ属、カンジダ属、ロ
ドスポリジウム属、サッカロミセス属、エシェリヒア属
またはクレブジエラ属に属する微生物由来のトレハラー
ゼ（特開平7-51063号公報：従来技術２）等が知られて
いる。
ロレラ由来のトレハラーゼ（特開平7-246094号公報：従
来技術１）や、ペニシリウム属、アスペルギルス属、ム
コール属、ピキア属、ハンセニュラ属、カンジダ属、ロ
ドスポリジウム属、サッカロミセス属、エシェリヒア属
またはクレブジエラ属に属する微生物由来のトレハラー
ゼ（特開平7-51063号公報：従来技術２）等が知られて
いる。
【０００６】しかしながら、これら従来技術のトレハラ
ーゼは、グルコースからトレハロースを合成するために
使用する酵素である。しかも、従来技術１のトレハラー
ゼは至適pHが5〜6であり、従来技術２のトレハラーゼの
至適pHは4〜5である。トレハロース含有量の測定をより
簡便かつ高精度に行うためには、装置システム（バイオ
センサ）の開発が不可欠である。そして、バイオセンサ
に適用可能なトレハラーゼの条件は、40℃以上の温度で
も安定な耐熱性酵素であることと、中性域において高い
活性を有することである。すなわち、酸性域やアルカリ
域で作用する酵素を使用した場合には、pH調整のために
使用する物質によって装置部品が劣化（腐食、溶解）す
ることが避けられないからである。このため、酸性域に
おいて酵素活性を有する従来技術のトレハラーゼは、バ
イオセンサにおける使用には適していない。
ーゼは、グルコースからトレハロースを合成するために
使用する酵素である。しかも、従来技術１のトレハラー
ゼは至適pHが5〜6であり、従来技術２のトレハラーゼの
至適pHは4〜5である。トレハロース含有量の測定をより
簡便かつ高精度に行うためには、装置システム（バイオ
センサ）の開発が不可欠である。そして、バイオセンサ
に適用可能なトレハラーゼの条件は、40℃以上の温度で
も安定な耐熱性酵素であることと、中性域において高い
活性を有することである。すなわち、酸性域やアルカリ
域で作用する酵素を使用した場合には、pH調整のために
使用する物質によって装置部品が劣化（腐食、溶解）す
ることが避けられないからである。このため、酸性域に
おいて酵素活性を有する従来技術のトレハラーゼは、バ
イオセンサにおける使用には適していない。
【０００７】この出願の発明は、以上のとおりの事情に
鑑みてなされたものであって、トレハロース含有量のバ
イオセンサによる測定のために使用可能な、中性域で高
い酵素活性を有する新しい耐熱性トレハラーゼを提供す
ることを課題としている。
鑑みてなされたものであって、トレハロース含有量のバ
イオセンサによる測定のために使用可能な、中性域で高
い酵素活性を有する新しい耐熱性トレハラーゼを提供す
ることを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決する発明として、好熱性バチルス属に属する微生
物が産生する酵素であって、以下の性質： (1) トレハロースをグルコース２分子に分解する酵素
活性を有する； (2) pH6-8において80％以上の相対活性を示す； (3) 至適温度が50℃；および (4) 分子量が26kD；を有することを特徴とする耐熱性
トレハラーゼを提供する。
を解決する発明として、好熱性バチルス属に属する微生
物が産生する酵素であって、以下の性質： (1) トレハロースをグルコース２分子に分解する酵素
活性を有する； (2) pH6-8において80％以上の相対活性を示す； (3) 至適温度が50℃；および (4) 分子量が26kD；を有することを特徴とする耐熱性
トレハラーゼを提供する。
【０００９】この発明の耐熱性トレハラーゼは、好まし
くは、好熱性バチルス属に属する微生物No. 6B株（FERM
P-18412）またはNo. 8株（FERM P-18411）が産生する
耐熱性トレハラーゼである。
くは、好熱性バチルス属に属する微生物No. 6B株（FERM
P-18412）またはNo. 8株（FERM P-18411）が産生する
耐熱性トレハラーゼである。
【００１０】この出願の発明はさらに、新規菌株とし
て、好熱性バチルス属に属する微生物No. 6B株（FERM P
-18412）およびNo. 8株（FERM P-18411）を提供する。
また、この出願の発明は、好熱性バチルス属に属する微
生物を培養し、培養物から請求項１の耐熱性トレハラー
ゼを分離・精製することを特徴とする耐熱性トレハラー
ゼの製造法を提供する。この製造法においては、好熱性
バチルス属に属する微生物が前記No. 6B株（FERM P-184
12）またはNo. 8株（FERM P-18411）であることを好ま
しい態様としてもいる。
て、好熱性バチルス属に属する微生物No. 6B株（FERM P
-18412）およびNo. 8株（FERM P-18411）を提供する。
また、この出願の発明は、好熱性バチルス属に属する微
生物を培養し、培養物から請求項１の耐熱性トレハラー
ゼを分離・精製することを特徴とする耐熱性トレハラー
ゼの製造法を提供する。この製造法においては、好熱性
バチルス属に属する微生物が前記No. 6B株（FERM P-184
12）またはNo. 8株（FERM P-18411）であることを好ま
しい態様としてもいる。
【００１１】以下、この出願の発明について、実施形態
を詳しく説明する。
を詳しく説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】この発明の耐熱性トレハラーゼ
は、基本的には、以下の性質を有する酵素である。 (1) トレハロースをグルコース２分子に分解する酵素
活性を有する。 (2) pH6〜8において80％以上の相対活性を示す。 (3) 45〜55℃の温度において80％以上の相対活性を示
す。 (4) 分子量が約26kDである。
は、基本的には、以下の性質を有する酵素である。 (1) トレハロースをグルコース２分子に分解する酵素
活性を有する。 (2) pH6〜8において80％以上の相対活性を示す。 (3) 45〜55℃の温度において80％以上の相対活性を示
す。 (4) 分子量が約26kDである。
【００１３】すなわち、この発明のトレハラーゼ（α,
α-トレハラーゼ）は、α,α-トレハロースのグルコシ
ド結合を特異的に加水分解し、２分子のグルコースを生
成する。なお、pH6〜8および45〜55℃の温度において
「80％以上」の相対活性を示すということは、酵素単位
として50℃で１分間に1μmolのグルコースを生成する酵
素量を1Uとし、グルコースの生成を3,5-Dinitrosalicyl
ic acid（DNS）法によって測定した酵素活性の最大値に
対して80％以上の活性を示すことを意味する。
α-トレハラーゼ）は、α,α-トレハロースのグルコシ
ド結合を特異的に加水分解し、２分子のグルコースを生
成する。なお、pH6〜8および45〜55℃の温度において
「80％以上」の相対活性を示すということは、酵素単位
として50℃で１分間に1μmolのグルコースを生成する酵
素量を1Uとし、グルコースの生成を3,5-Dinitrosalicyl
ic acid（DNS）法によって測定した酵素活性の最大値に
対して80％以上の活性を示すことを意味する。
【００１４】このようなトレハラーゼは、バチルス属に
属する微生物を培養し、その培養物から単離・精製する
ことによって得ることができる。バチルス属に属する微
生物としては、好ましくはこの出願の発明者らが土壌よ
り新たに分離・同定したNo.6B株およびNo. 8株を例示す
ることができる。なお、これらのNo. 6B株およびNo.8株
は2001年7月10日付で独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに、それぞれ受託番号FERM P-184
12およびFERM P-18411として特許寄託されている。な
お、これらNo. 6B株およびNo. 8株が生成するトレハラ
ーゼの至適pHは7.25、至適温度は50℃である。
属する微生物を培養し、その培養物から単離・精製する
ことによって得ることができる。バチルス属に属する微
生物としては、好ましくはこの出願の発明者らが土壌よ
り新たに分離・同定したNo.6B株およびNo. 8株を例示す
ることができる。なお、これらのNo. 6B株およびNo.8株
は2001年7月10日付で独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに、それぞれ受託番号FERM P-184
12およびFERM P-18411として特許寄託されている。な
お、これらNo. 6B株およびNo. 8株が生成するトレハラ
ーゼの至適pHは7.25、至適温度は50℃である。
【００１５】これらのバチルス属細菌の培養に使用する
培地は、この菌株が良好に生育するものであれば、いか
なる組成の培地であっても良く、また、菌体増殖用とト
レハラーゼ生産用にそれぞれ異なる２種類の培地を用い
ても良い。培地は液体培地または固体培地を使用するこ
とができ、培地成分として、炭素源の他に、窒素源およ
び無機イオン等を含有していても良い。
培地は、この菌株が良好に生育するものであれば、いか
なる組成の培地であっても良く、また、菌体増殖用とト
レハラーゼ生産用にそれぞれ異なる２種類の培地を用い
ても良い。培地は液体培地または固体培地を使用するこ
とができ、培地成分として、炭素源の他に、窒素源およ
び無機イオン等を含有していても良い。
【００１６】菌体増殖用の培地における炭素源は特に制
限はなく、公知の炭素源を使用することができるが、酢
酸、リンゴ酸、コハク酸、プロピオン酸、バルミチン酸
等の低級脂肪酸、デンプン、ショ糖等が好ましく使用で
きる。これらの炭素源は、単独または混合して培地に添
加することができる。一方、トレハラーゼ生産用の培地
には、その基質としてトレハロースを含有させることが
できる。
限はなく、公知の炭素源を使用することができるが、酢
酸、リンゴ酸、コハク酸、プロピオン酸、バルミチン酸
等の低級脂肪酸、デンプン、ショ糖等が好ましく使用で
きる。これらの炭素源は、単独または混合して培地に添
加することができる。一方、トレハラーゼ生産用の培地
には、その基質としてトレハロースを含有させることが
できる。
【００１７】また、窒素源としては、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合物、およびペプ
トン、酵母エキス等の有機窒素源が利用できる。さら
に、無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウム
イオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオ
ン、銅イオン、マンガンイオン等が挙げられ、これら無
機イオンを培地に無機塩等の形で含有させても良い。
ム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合物、およびペプ
トン、酵母エキス等の有機窒素源が利用できる。さら
に、無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウム
イオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオ
ン、銅イオン、マンガンイオン等が挙げられ、これら無
機イオンを培地に無機塩等の形で含有させても良い。
【００１８】この発明の微生物の培養方法としては、振
とう培養法等の液体培地による培養法および寒天培地等
の固体培地による培養法等が利用できる。培養温度は例
えば40〜80℃、好ましくは50〜70℃であり、培地のpHは
中性付近である。トレハラーゼ生産時の培養時間は、菌
体量ならびにトレハラーゼの産生等に応じて決めること
ができるが、0.5日〜10日間、より好ましくは１日〜６
日間程度が適当である。
とう培養法等の液体培地による培養法および寒天培地等
の固体培地による培養法等が利用できる。培養温度は例
えば40〜80℃、好ましくは50〜70℃であり、培地のpHは
中性付近である。トレハラーゼ生産時の培養時間は、菌
体量ならびにトレハラーゼの産生等に応じて決めること
ができるが、0.5日〜10日間、より好ましくは１日〜６
日間程度が適当である。
【００１９】このような培養の後、培養上清から公知の
手段によってこの発明のトレハラーゼを単離・精製する
ことができる。例えば、硫安だけによる塩析、透析、遠
心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳
動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相ク
ロマトグラフィーなどが挙げられる。
手段によってこの発明のトレハラーゼを単離・精製する
ことができる。例えば、硫安だけによる塩析、透析、遠
心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳
動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相ク
ロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２０】以下、この発明のNo. 6B株およびNo. 8株
のスクリーニング方法、菌学的性質、ならびにこれら微
生物から単離・精製されたトレハラーゼの特性について
詳しく説明する。なお、これらの菌株の培養には、表１
〜３にそれぞれの組成を示したA〜C培地のいずれかを選
択して用いた。
のスクリーニング方法、菌学的性質、ならびにこれら微
生物から単離・精製されたトレハラーゼの特性について
詳しく説明する。なお、これらの菌株の培養には、表１
〜３にそれぞれの組成を示したA〜C培地のいずれかを選
択して用いた。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
【表３】
【００２４】1 スクリーニング
1.1 スクリーニング方法１
50種類の土壌サンプルを滅菌水に懸濁し、上清液を表１
のA固体培地に塗布し、65℃で３日間培養し、生育のみ
られた菌株をC固体培地（表３）に移し、65℃で３日間
培養した。得られた菌株をB液体培地（表２）に植菌
し、60℃で３日間、振盪培養した。培養液を遠心分離
（8000rpm、10分間、4℃）により培養上清液と菌体とに
分離した。上清液については、そのトレハラーゼ活性を
DNS法により測定した結果、２菌株が高トレハラーゼ産
生能を有することが確認された。また、35菌体はリン酸
バッファーに懸濁し、超音波処理（１秒間に0.2秒発
振、0.8秒停止、100W、10分間）し、その液を遠心分離
し、得られた上清液のトレハラーゼ活性をDNS法により
測定した。その結果、１菌株にトレハラーゼ活性が確認
された。 1.2 スクリーニング方法２ 103種類の土壌サンプルを滅菌水に懸濁し、上清液を表
１のA固体培地に塗布し、65℃で３日間培養した。各培
養液をB液体培地（表２）に植菌し、60℃で３日間、振
盪培養した。培養液を遠心分離（8000rpm、10分間、4
℃）により培養上清液と菌体とに分離し、上清液のトレ
ハラーゼ活性をDNS法により測定した結果、３菌株が高
トレハラーゼ産生能を有することが確認された。 1.3 菌の選択 前記スクリーニング方法１、２でトレハラーゼ活性を認
めた菌株を純粋分離し、得られた20菌株をA液体培地に
植菌し、60℃で３日間振盪培養した。培養液を遠心分離
（8000rpm、10分間、4℃）により培養上清液と菌体とに
分離し、上清液のトレハラーゼ活性をDNS法により測定
した結果、活性の高い５株が得られたが、菌の形態から
No. 6B株およびNo. 8株を選択した。 2 菌学的性質 2.1 生理的試験 No. 6B株およびNo. 8株を表１に示したA培地組成からな
る固体培地および液体培地で60℃、２日間培養し、それ
ぞれの第１次性状（細胞形態、グラム染色、運動性、芽
胞、酸素に対する態度、カタラーゼ、オキシダーゼ、OF
テスト等）を調べた。また、第２次性状として、炭素
源、窒素源の利用、硫化水素の生成、代謝産物、酵素活
性、培養至適温度、pH等を調べた。
のA固体培地に塗布し、65℃で３日間培養し、生育のみ
られた菌株をC固体培地（表３）に移し、65℃で３日間
培養した。得られた菌株をB液体培地（表２）に植菌
し、60℃で３日間、振盪培養した。培養液を遠心分離
（8000rpm、10分間、4℃）により培養上清液と菌体とに
分離した。上清液については、そのトレハラーゼ活性を
DNS法により測定した結果、２菌株が高トレハラーゼ産
生能を有することが確認された。また、35菌体はリン酸
バッファーに懸濁し、超音波処理（１秒間に0.2秒発
振、0.8秒停止、100W、10分間）し、その液を遠心分離
し、得られた上清液のトレハラーゼ活性をDNS法により
測定した。その結果、１菌株にトレハラーゼ活性が確認
された。 1.2 スクリーニング方法２ 103種類の土壌サンプルを滅菌水に懸濁し、上清液を表
１のA固体培地に塗布し、65℃で３日間培養した。各培
養液をB液体培地（表２）に植菌し、60℃で３日間、振
盪培養した。培養液を遠心分離（8000rpm、10分間、4
℃）により培養上清液と菌体とに分離し、上清液のトレ
ハラーゼ活性をDNS法により測定した結果、３菌株が高
トレハラーゼ産生能を有することが確認された。 1.3 菌の選択 前記スクリーニング方法１、２でトレハラーゼ活性を認
めた菌株を純粋分離し、得られた20菌株をA液体培地に
植菌し、60℃で３日間振盪培養した。培養液を遠心分離
（8000rpm、10分間、4℃）により培養上清液と菌体とに
分離し、上清液のトレハラーゼ活性をDNS法により測定
した結果、活性の高い５株が得られたが、菌の形態から
No. 6B株およびNo. 8株を選択した。 2 菌学的性質 2.1 生理的試験 No. 6B株およびNo. 8株を表１に示したA培地組成からな
る固体培地および液体培地で60℃、２日間培養し、それ
ぞれの第１次性状（細胞形態、グラム染色、運動性、芽
胞、酸素に対する態度、カタラーゼ、オキシダーゼ、OF
テスト等）を調べた。また、第２次性状として、炭素
源、窒素源の利用、硫化水素の生成、代謝産物、酵素活
性、培養至適温度、pH等を調べた。
【００２５】結果は表４に示したとおりである。
【００２６】
【表４】
【００２７】また、両菌株の培養温度と増殖との関係は
図１に示したとおりであり、いずれの菌株も約55℃にお
いて最も良好に増殖した。 2.2 16S rDNAの決定 No. 6B株およびNo. 8株を表１に組成を示したA培地で60
℃、４日間培養し、培養液を遠心分離して集菌した。菌
体からDNAを抽出し、PCR法によってDNAを増幅し、DNAシ
ークエンサーによってそれぞれのDNA配列を決定した。
その結果、No.6B株のゲノムDNAの一部配列は配列番号１
に示したとおりであり、No. 8株の配列は配列番号２に
示したとおりである。これらの配列は、Bacillus subti
lisと約94％の相同性を示した。 3.3 菌種の特定 前記の生理学的試験および16S rDNA配列決定の結果か
ら、この発明のNo. 6B株およびNo. 8株はバチルス属に
属する微生物であることが確認された。なお、DNA配列
の相同性は、98％以上が一致する場合に同一種とするこ
とが一般的であるため、このNo. 6B株およびNo. 8株
は、Bacillus subtilisと同一ではないものの、それに
極めて近縁の種であることが確認された。 3 トレハラーゼ特性 3.1 粗トレハラーゼ No. 6B株およびNo. 8株を表1に組成を示したA培地にて6
0℃で４日間、振盪培養し、培養上清液に硫酸アンモニ
ウムを加え、最終濃度を70％にしてトレハラーゼを沈殿
させた。
図１に示したとおりであり、いずれの菌株も約55℃にお
いて最も良好に増殖した。 2.2 16S rDNAの決定 No. 6B株およびNo. 8株を表１に組成を示したA培地で60
℃、４日間培養し、培養液を遠心分離して集菌した。菌
体からDNAを抽出し、PCR法によってDNAを増幅し、DNAシ
ークエンサーによってそれぞれのDNA配列を決定した。
その結果、No.6B株のゲノムDNAの一部配列は配列番号１
に示したとおりであり、No. 8株の配列は配列番号２に
示したとおりである。これらの配列は、Bacillus subti
lisと約94％の相同性を示した。 3.3 菌種の特定 前記の生理学的試験および16S rDNA配列決定の結果か
ら、この発明のNo. 6B株およびNo. 8株はバチルス属に
属する微生物であることが確認された。なお、DNA配列
の相同性は、98％以上が一致する場合に同一種とするこ
とが一般的であるため、このNo. 6B株およびNo. 8株
は、Bacillus subtilisと同一ではないものの、それに
極めて近縁の種であることが確認された。 3 トレハラーゼ特性 3.1 粗トレハラーゼ No. 6B株およびNo. 8株を表1に組成を示したA培地にて6
0℃で４日間、振盪培養し、培養上清液に硫酸アンモニ
ウムを加え、最終濃度を70％にしてトレハラーゼを沈殿
させた。
【００２８】この粗トレハラーゼ溶液を用いて、トレハ
ラーゼ活性に及ぼす温度とpHの影響、耐熱性、ミハエリ
ス定数（Km値）について検討した。なお、トレハラーゼ
活性は、酵素単位として50℃で１分間に1μmolのグルコ
ースを生成する酵素量を1Uとして、グルコースの生成を
DNS法により測定し、最大値に対する相対活性として算
出した。 3.2 温度の影響 様々な温度における粗トレハラーゼ溶液の酵素活性を、
100mMリン酸バッファー（pH7.0）中、50℃で30分間の酵
素反応を行った後、生成したグルコース量をDNS法によ
り測定した。結果は図２に示したとおりである。No. 6B
株およびNo. 8株由来のトレハラーゼは、共に45〜55℃
において80%以上の相対活性を示した。そして、いずれ
のトレハラーゼも至適温度は50℃であった。
ラーゼ活性に及ぼす温度とpHの影響、耐熱性、ミハエリ
ス定数（Km値）について検討した。なお、トレハラーゼ
活性は、酵素単位として50℃で１分間に1μmolのグルコ
ースを生成する酵素量を1Uとして、グルコースの生成を
DNS法により測定し、最大値に対する相対活性として算
出した。 3.2 温度の影響 様々な温度における粗トレハラーゼ溶液の酵素活性を、
100mMリン酸バッファー（pH7.0）中、50℃で30分間の酵
素反応を行った後、生成したグルコース量をDNS法によ
り測定した。結果は図２に示したとおりである。No. 6B
株およびNo. 8株由来のトレハラーゼは、共に45〜55℃
において80%以上の相対活性を示した。そして、いずれ
のトレハラーゼも至適温度は50℃であった。
【００２９】また、粗トレハラーゼ溶液を100mMリン酸
バッファー（pH7.0）中で30分間、様々な温度でインキ
ュベーションし、その後の残存活性を50℃で測定した。
結果は図３に示したとおりであり、いずれのトレハラー
ゼも50℃までは高い安定性を有することが確認された。 3.3 pHの影響 様々なpHにおいて50℃で30分間の酵素反応を行った後、
生成したグルコース量をDNS法により測定することによ
って、粗トレハラーゼ溶液の酵素活性におけるpHの影響
を調べた。pH値の調整は、以下の50mMバッファーを用い
て行った。CH3COOH-CH3COONa(pH4.0-5.5)、Na2HPO4-KH2
PO4(pH6.0-7.0)、Na2CO3-H3BO3-KCl(pH8.0-10.0)。結果
は図４に示したとおりである。No. 6B株およびNo. 8株
由来のトレハラーゼは、共にpH6.0〜8.0において80%以
上の相対活性を示した。そして、いずれのトレハラーゼ
も至適pHは7.25であった。 3.4 Km値 粗トレハラーゼのKm値を、Lineweaver-Burkプロットに
より算出した。結果は図５に示したとおりであり、No.
6B株由来のトレハラーゼのKm値は7.7、Vmax値は0.17、N
0. 8株由来のトレハラーゼのKm値は6.8、Vmax値は0.27
であった。 4 精製トレハラーゼ 4.1 トレハラーゼの精製 粗トレハラーゼ溶液を1.5φ×40cm DEAE-セルロースカ
ラムにのせ、50-500mMNaCl濃度勾配によりトレハラーゼ
を溶出した。得られた分画のトレハラーゼ活性をDNS法
で測定し、活性の高かった画分No. 14, 15, 16溶液（図
６）を、2.5φ×75cmセファロース-4Bカラムにのせ、リ
ン酸バッファーを用いて溶出した。得られた画分のトレ
ハラーゼ活性をDNS法により測定し、活性の高かった画
分N0. 28（図７）を、前記と同様のDEAE-セルロースカ
ラムを用いたクロマトグラフィーにより精製した。
バッファー（pH7.0）中で30分間、様々な温度でインキ
ュベーションし、その後の残存活性を50℃で測定した。
結果は図３に示したとおりであり、いずれのトレハラー
ゼも50℃までは高い安定性を有することが確認された。 3.3 pHの影響 様々なpHにおいて50℃で30分間の酵素反応を行った後、
生成したグルコース量をDNS法により測定することによ
って、粗トレハラーゼ溶液の酵素活性におけるpHの影響
を調べた。pH値の調整は、以下の50mMバッファーを用い
て行った。CH3COOH-CH3COONa(pH4.0-5.5)、Na2HPO4-KH2
PO4(pH6.0-7.0)、Na2CO3-H3BO3-KCl(pH8.0-10.0)。結果
は図４に示したとおりである。No. 6B株およびNo. 8株
由来のトレハラーゼは、共にpH6.0〜8.0において80%以
上の相対活性を示した。そして、いずれのトレハラーゼ
も至適pHは7.25であった。 3.4 Km値 粗トレハラーゼのKm値を、Lineweaver-Burkプロットに
より算出した。結果は図５に示したとおりであり、No.
6B株由来のトレハラーゼのKm値は7.7、Vmax値は0.17、N
0. 8株由来のトレハラーゼのKm値は6.8、Vmax値は0.27
であった。 4 精製トレハラーゼ 4.1 トレハラーゼの精製 粗トレハラーゼ溶液を1.5φ×40cm DEAE-セルロースカ
ラムにのせ、50-500mMNaCl濃度勾配によりトレハラーゼ
を溶出した。得られた分画のトレハラーゼ活性をDNS法
で測定し、活性の高かった画分No. 14, 15, 16溶液（図
６）を、2.5φ×75cmセファロース-4Bカラムにのせ、リ
ン酸バッファーを用いて溶出した。得られた画分のトレ
ハラーゼ活性をDNS法により測定し、活性の高かった画
分N0. 28（図７）を、前記と同様のDEAE-セルロースカ
ラムを用いたクロマトグラフィーにより精製した。
【００３０】以上の精製工程による結果は表５に示した
とおりである。粗トレハラーゼから最終公知のクロマト
グラフィーによって126倍に濃縮され、114U/mgもの高い
酵素活性を有するトレハラーゼが得られた。なお、この
酵素活性は、50℃で１分間に1μmolのグルコースを生成
する酵素量を1Uとした。
とおりである。粗トレハラーゼから最終公知のクロマト
グラフィーによって126倍に濃縮され、114U/mgもの高い
酵素活性を有するトレハラーゼが得られた。なお、この
酵素活性は、50℃で１分間に1μmolのグルコースを生成
する酵素量を1Uとした。
【００３１】
【表５】
【００３２】4.2 精製トレハラーゼの分子量測定
粗トレハラーゼおよび各工程で得られた精製トレハラー
ゼの分子量をSDS-PAGEによって決定した。結果は図８に
示したとおりであり、この発明のトレハラーゼの分子量
は26kDaであることが確認された。 4.3 金属イオンの影響 精製トレハラーゼを10mM Tris-HClバッファー（pH7.0）
に溶解し、表６に示した各金属イオン1mMを添加して50
℃、30分間インキュベートし、その後の残存活性を、無
添加（コントロール）を100％として算出した。結果は
表６に示したとおりである。トレハラーゼ活性は、Mn+
+、Co++の添加によりそれぞれ205％、130％に酵素活性
が増加し、Cu++、EDTAの添加によりそれぞれ0％、57％
に酵素活性が低下した。
ゼの分子量をSDS-PAGEによって決定した。結果は図８に
示したとおりであり、この発明のトレハラーゼの分子量
は26kDaであることが確認された。 4.3 金属イオンの影響 精製トレハラーゼを10mM Tris-HClバッファー（pH7.0）
に溶解し、表６に示した各金属イオン1mMを添加して50
℃、30分間インキュベートし、その後の残存活性を、無
添加（コントロール）を100％として算出した。結果は
表６に示したとおりである。トレハラーゼ活性は、Mn+
+、Co++の添加によりそれぞれ205％、130％に酵素活性
が増加し、Cu++、EDTAの添加によりそれぞれ0％、57％
に酵素活性が低下した。
【００３３】
【表６】
【００３４】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、中性域で高い酵素活性を有する耐熱性の
トレハラーゼが提供される。このトレハラーゼによっ
て、トレハロースを含有する製品の研究開発や品質管理
に不可欠なトレハロース含有量測定のためのバイオセン
サが実用化可能となる。
発明によって、中性域で高い酵素活性を有する耐熱性の
トレハラーゼが提供される。このトレハラーゼによっ
て、トレハロースを含有する製品の研究開発や品質管理
に不可欠なトレハロース含有量測定のためのバイオセン
サが実用化可能となる。
【００３５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Toyo University
<120> Thermostable trehalase and method for producing the trehalase.
<130> NP01173-YS
<140>
<141>
<160> 2
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1348
<212> DNA
<213> No. 6B (FERM P-18412)
<400> 1
ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgga ctaaaagggg 60
cttgctcctt ttagttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggcaacct gcccgtaaga 120
tcgggataac ttcgggaaac cggagctaat accggataac accgaagacc gcatggtctt 180
tggttgaaag gcggcttcgg ctgtcactta cggatgggcc cgcggcgcat tagctagttg 240
gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac 300
actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa 360
tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagcgaaga aggtcttcgg attgtaaagc 420
tctgtgtagt aggaagaaca astaccgttc gaatagggcg gtatcgtgac ggtacctaac 480
gacaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg 540
tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggttcct taagtctgat gtgaaagccc 600
acggctcaac cgtggagggt cattggaaac tgggggactt gagtgcagaa gaggagagcg 660
gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtaa gatgtggaga acaccagtgg cgaaggcggc 720
tctctggtct gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gagggtatcc accctttagt 840
gctgtagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg ctcgcaagag tgaaactcaa 900
aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 960
agaaccttac caggtcttga catcccctga caacccgaga gatcgggcgt tccccttcgg 1020
gggacagggt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080
agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgacctt agttgccagc attgagttgg gcactctaag 1140
gtgactgccg aatgacaaat cggaggaagg tggggaatga cgtcaaatca tcaatgcccc 1200
ttatgacctg gggctacaca cgtgcctaca atgggcggta caaagggctg cgaacccgcg 1260
agggggaagc gaaatcccaa aaaagccgcc tctcagttcg ggattgcagg gctgcaaact 1320
cgccctgcaa tgaaagccgg gaatcgcc 1348
<210> 2
<211> 1198
<212> DNA
<213> No. 8 (FERM P-18411)
<400> 2
gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgga 60
ctaaaagggg cttgctcctt ttagttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggcaacct 120
gcccgtaaga tcgggataac ttcgggaaac cggagctaat accggataac accgaagacc 180
gcatggtctt tggttgaaag gcggctttgg ctgtcactta cggatgggcc cgcggcgcat 240
tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt 300
gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa 360
tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagcgaaga aggtcttcgg 420
attgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtacgttcg aatagggcgg taccgtgacg 480
gtacctaacg agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg 540
caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gcgcgcgcag gcggttcctt aagtctgatg 600
tgaaagccca cggctcaacc gtggagggtc attggaaact gggggacttg agtgcagaag 660
aggagagcgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg 720
gcgaaggcgg ctctctggtc tgtaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca 780
ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtatc 840
caccctttag tgctgtagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gctcgcaaga 900
gtgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 960
aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcccctg acaacccgag agatcgggcg 1020
ttccccttcg ggggacaggg tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgacct tagttgccag cattgagttg 1140
ggcactctaa ggtgactgcc gatgacaaat cggaggaagg tggggatgac gtcaaatc 1198
【図１】この発明のNo. 6B株およびNo. 8株の、培養温
度と増殖の程度の関係を示すグラフである。
度と増殖の程度の関係を示すグラフである。
【図２】この発明のNo. 6B株およびNo. 8株のそれぞれ
に由来する粗トレハラーゼの温度と相対活性の関係を示
すグラフである。
に由来する粗トレハラーゼの温度と相対活性の関係を示
すグラフである。
【図３】この発明のNo. 6B株およびNo. 8株のそれぞれ
に由来する粗トレハラーゼの温度安定性を示すグラフで
ある。
に由来する粗トレハラーゼの温度安定性を示すグラフで
ある。
【図４】この発明のNo. 6B株およびNo. 8株のそれぞれ
に由来する粗トレハラーゼのpHと相対活性の関係を示す
グラフである。
に由来する粗トレハラーゼのpHと相対活性の関係を示す
グラフである。
【図５】この発明のNo. 6B株およびNo. 8株のそれぞれ
に由来する粗トレハラーゼのKm値の測定結果を示すグラ
フである。
に由来する粗トレハラーゼのKm値の測定結果を示すグラ
フである。
【図６】DEAE-セファロースカラムを用いたクロマトグ
ラフィーの結果である。
ラフィーの結果である。
【図７】セファロース-4Bカラムを用いたゲルフィルト
レーションの結果である。
レーションの結果である。
【図８】各精製段階のトレハラーゼのSDS-PAGEによる泳
動像である。MKはマーカー、レーン１はDEAE-セファロ
ースカラムを用いた２回目のクロマトグラフィーによる
最終精製トレハラーゼ、レーン２は粗トレハラーゼ、レ
ーン３はDEAE-セファロースカラムを用いた１回目のク
ロマトグラフィーによる精製トレハラーゼ、レーン４は
セファロース-4Bカラムを用いたゲルフィルトレーショ
ンによる精製トレハラーゼである。
動像である。MKはマーカー、レーン１はDEAE-セファロ
ースカラムを用いた２回目のクロマトグラフィーによる
最終精製トレハラーゼ、レーン２は粗トレハラーゼ、レ
ーン３はDEAE-セファロースカラムを用いた１回目のク
ロマトグラフィーによる精製トレハラーゼ、レーン４は
セファロース-4Bカラムを用いたゲルフィルトレーショ
ンによる精製トレハラーゼである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
(Ｃ１２Ｎ 9/24
Ｃ１２Ｒ 1:07）
(72)発明者 掘越 弘毅
群馬県邑楽郡板倉町泉野１−１−１ 東洋
大学 生命科学部内
Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA12 CA01 GA19
4B050 CC01 DD02 HH01 LL02
4B065 AA19 AC02 BC03 CA31 CA41
CA50
Claims (6)
- 【請求項１】 好熱性バチルス属に属する微生物が産生
する酵素であって、以下の性質： (1) トレハロースをグルコース２分子に分解する酵素
活性を有する； (2) pH6-8において80％以上の相対活性を示す； (3) 45-55℃の温度において80％以上の相対活性を示
す；および (4) 分子量が約26kD；を有することを特徴とする耐熱
性トレハラーゼ。 - 【請求項２】 好熱性バチルス属に属する微生物No. 6B
株（FERM P-18412）またはNo. 8株（FERM P-18411）が
産生する請求項１の耐熱性トレハラーゼ。 - 【請求項３】 好熱性バチルス属に属する微生物No. 6B
株（FERM P-18412）。 - 【請求項４】 好熱性バチルス属に属する微生物No. 8
株（FERM P-18411）。 - 【請求項５】 好熱性バチルス属に属する微生物を培養
し、培養物から請求項１の耐熱性トレハラーゼを分離・
精製することを特徴とする耐熱性トレハラーゼの製造
法。 - 【請求項６】 好熱性バチルス属に属する微生物が、請
求項３または４の微生物である請求項５の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001250756A JP3959439B2 (ja) | 2001-08-21 | 2001-08-21 | 耐熱性トレハラーゼと、その製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001250756A JP3959439B2 (ja) | 2001-08-21 | 2001-08-21 | 耐熱性トレハラーゼと、その製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003061651A true JP2003061651A (ja) | 2003-03-04 |
| JP3959439B2 JP3959439B2 (ja) | 2007-08-15 |
Family
ID=19079513
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001250756A Expired - Fee Related JP3959439B2 (ja) | 2001-08-21 | 2001-08-21 | 耐熱性トレハラーゼと、その製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3959439B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2717926A2 (en) * | 2011-06-13 | 2014-04-16 | Ivanova, Svetlana A. | Compositions and methods to prevent and treat biofilms |
| US10420822B2 (en) | 2011-06-13 | 2019-09-24 | Ziolase, Llc | Compositions and methods to prevent and treat biofilms |
-
2001
- 2001-08-21 JP JP2001250756A patent/JP3959439B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2717926A2 (en) * | 2011-06-13 | 2014-04-16 | Ivanova, Svetlana A. | Compositions and methods to prevent and treat biofilms |
| EP2717926A4 (en) * | 2011-06-13 | 2014-12-31 | Ivanova Svetlana A | COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREVENTING AND TREATING BIOFILMS |
| JP2015502179A (ja) * | 2011-06-13 | 2015-01-22 | エー． イヴァノーヴァ、スヴェトラーナ | バイオフィルムを予防および処理するための組成物および方法 |
| US10420822B2 (en) | 2011-06-13 | 2019-09-24 | Ziolase, Llc | Compositions and methods to prevent and treat biofilms |
| US10758596B2 (en) | 2011-06-13 | 2020-09-01 | Ziolase, Llc | Compositions and methods to prevent and treat biofilms |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3959439B2 (ja) | 2007-08-15 |
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