JP2003014693A - 電気泳動の支持体に高分子多孔質膜を用いる免疫固定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】検体量の保持力の少ない高分子多孔質膜を免疫
固定法に使うためには高感度に蛋白質を染める方法でな
ければならない。また一般的に５種類の特異抗血清を各
電気泳動の列に重層する必要があるが、それぞれが膜中
や膜表面を流れ交じり合うことを防止する必要がある。
抗血清は高価なので出来るだけ使用量を減らす必要があ
る。 【解決手段】高分子多孔質膜（１）に最低６種類の電気
泳動の列（３〜８）をその網目構造を壊すことにより独
立した仕切り（２）で区切られた列で検体を電気泳動し
た後、特異抗血清を反応させ洗浄後高感度の銀染色液を
用いて検体のモノクローナル蛋白を検出できる方法を発
明した。高感度の染色液を使うため検体を希釈し、それ
に対応する高価な高血清も少なくする事が出来るので結
果的に低価格化につながる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】人や動物の血液や尿及び隋液
などの体液中の蛋白質は、アルブミンと多数のグロブリ
ンから成っており、全部で約１５０種類の蛋白質が含ま
れると言われている。これらの蛋白質の機能は、栄養物
自体であったり栄養物の搬送の役割を果したり，体外か
ら進入した細菌や異種物質を攻撃する免疫に関わる物質
であったりする。これらの蛋白質を分析する分析法は、
物理的や化学的な方法及び免疫学的な方法による測定法
が一般的に使われている。これらの分析法の中で、最も
感度と特異性が高いとされている測定法は、抗原抗体反
応を使用する免疫学的測定法であることは周知のとおり
である。免疫学的測定法の中で、容易に特定の免疫グロ
ブリンを同定したりその免疫グロブリンのサブクラスを
同定したりする方法として、免疫電気泳動法と免疫固定
法がある。本発明はこれらの内、新しい免疫固定法に関
するものである。免疫固定法が必要になる場合は Ｍ蛋白のクラス別及びＬ鎖の型判定 隋液中のオリゴクローナールバンドの検出 蛋白のミクロヘテロジェニテイの検出 尿中ベンズジョーンズ蛋白質の検出 尿中の糸球体及び尿細管性蛋白の検出などである。

【０００２】

【従来の技術】従来の免疫固定法は、電気泳動の支持体
としてアガロースゲルを用いるため、取り扱いが難しく
検査に熟練を要しまた高価なアガロースゲルプレートを
使用するばかりか高価な特異抗血清を多量に使用する必
要があった。すなわち電気泳動の支持体としてアガロー
ゲルを用い、電気泳動後特異抗体をそれぞれの電気泳動
レーンに直接作用させ染み込ませ、この支持体の中で抗
原抗体反応を起こさせる。これによって不溶性の免疫複
合物を生成させ未反応の他の蛋白質を洗浄して除去した
のち蛋白染色していた。また検体をアガロースゲル上に
塗布するには、アガロースゲル上に楔状に作られた溝ま
たは楔状の血清塗布用の穴の開いたフイルムを重ねる。
アガロースゲル上の６個のサンプル孔には、検査しなけ
ればならない患者の検体を一定量塗布し染み込ませた後
電気泳動する。 電気泳動後長方形のテンプレートを重ねそれぞれのレー
ンに対応する抗血清をテンプレートの枠内に均一に塗布
する（表１）。湿潤箱に入れ静かに抗原抗体反応させ
る。固定液にはスルホサリチル酸などが使われている。
次に未反応の蛋白質を１０％のＮａＣＬ液で除去し完全
に乾燥する。蛋白の染色液はポンソー３Ｒ・ニグロシン
・アミドブラックなどの有機染料が用いられている。結
果はそれぞれの対応する位置に染色帯が認められた場
合、例えばＩｇＧの位置及びκの位置に染色帯が認めら
れた時はＩｇＧのκ型と判定され、ＩｇＭの位置及びλ
の位置に染色帯が認められた時は、ＩｇＭのλ型と判定
をおこなっている。多発性硬化症の診断に用いられる隋
液中のオリゴクロナールの検出は、アガロースゲルプレ
ート上で検体を電気泳動したあと、ＩｇＧ・κ・λの特
異抗血清を作用させる。判定は現れた２〜３本のバンド
がκ型と反応していればκ型と、λ型と反応していれば
λ型のオリゴクロナールと判定する。

【０００３】

【発明が解決しょうとする課題】課題１ 電気泳動の支
持体としてアガロースゲルの代わりに高分子多孔質膜例
えばセルースアセテート膜が免疫固定法に使われなかっ
たのは、アガロースゲルに比較して膜が薄いため検体と
して塗布する検体量が約１／５と少ないので普通の場合
でも染色帯が読み取れず判定が難しかった。特に蛋白濃
度が低い場合は高感度の有機染料を用いても全く染色帯
が認められず今までは使用出来ないものとされていた。
高分子多孔質膜例えばセルースアセテート膜への検体の
塗布量は限られているので、実質目視で確認できる程の
高感度な染色法がなければならないことになる。アガロ
ースゲル用の銀染色液はセルロースアセテート膜に使う
ことが出来ない。課題２ 従来のアガロースゲルではゲ
ル面に抗血清を重層する場合、予め長方形の穴の開いた
テンプレートを重ねて、抗血清を直接塗布しても隣の列
に抗血清が流れ出ないようになっている。セルロースア
セテート膜ではこのようなテンプレートを使用できない
のでそれに代わる方法を見つける必要があった。通常の
セルロースアセテート膜では検体を注入する検体溝や検
体の列を規定する長方形の枠があるテンプレートを使用
することが出来ないのでセルロースアセテート膜では実
質使用できないとされていた。その理由は最低５種類の
抗血清を平面上のセルロースアセテート膜上に単に載せ
るだけでは互いの抗血清が適当に拡散し交じり合ってし
まう致命的な欠点があった。課題３ 抗血清は１名の患
者に５種類以上の高価な特異抗血清を使用しなければな
らない。低価格化を目指すには抗血清の使用量を減らす
ことが重要な課題である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】課題１ 高分子多孔質膜
等のセルロースアセテート膜には検体をアガロースゲル
のように多量に塗布できない。アガロースゲルプレート
には、約３μＬ程の検体を塗布することができるが、セ
ルロースアセテート膜上にはせいぜい０．６μＬしか塗
布する事が出来ない。結果的に検体量として約１／５倍
と少ないので普通の蛋白染色では染色帯が検出されず、
セルロースアセテート膜が免疫固定法に利用されること
は無かった。解決する手段としては微量の蛋白質でも濃
く染色できセルロースアセテート膜に適する染色法を発
明する以外に方法はない。本発明ではこの蛋白質の染色
法としてとして、銀コロイドを用いる高感度の銀染色液
をセルロースアセテート膜の免疫固定用に使える発明を
することで、感度を大幅に増加させ、検体の塗布量を１
／１００以下でも蛋白質を検出することが出来た。課題
２ 抗血清が別の隣の列に流れ込まないようにするには
本来一定の高さのある仕切り又は枠を貼っておく等の手
段を講じる必要がある。アガロースゲルプレートを用い
る免疫固定法は、泳動後テンプレートをゲル面に重ねて
抗血清用の各レーンを確保し直接特異抗体をそれぞれ各
レーンに塗布していた。本発明では、高分子多孔質膜等
のセルロースアセテート膜には、これらの仕切りや枠で
はなく、セルロースアセテート膜の各列を独立の列とす
るために、１枚の膜を複数の列になるよう加熱または溶
剤により網目構造を壊す方法または網目構造の中に固ま
る溶液を吸着させることで網目構造を解消し、完全な仕
切り構造にすし、お互いの列に重層した抗血清や固定用
の試薬が混じらないような発明をした。課題３ 検体の
塗布量を最大１／１００に希釈して用いることが出来る
ので、それに対応する高価な抗血清も通常使用されてい
る濃度の最大約１／１００と大幅に希釈しても本発明の
免疫固定法に使用できた。使用する抗血清の種類は最低
でも５種類必要なので全体の価格低減率は非常に大きい
と判断できる。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明において電気泳動用の高分
子多孔質膜としてセルロースアセテート膜、ろ紙、ニト
ロセルロース膜ポリスルフォン膜などが使用できるがセ
ルロースアセテート膜が最も好適である。このセルロー
スアセテート膜（１）に独立した列を設ける方法は、一
定間隔に一定の幅をもって熱変性するかまたはセルロー
スを溶かす溶剤例えばアセトン・メタノール混合液など
で多孔質膜の網目構造をつぶし固化する仕切り（２）に
よって得られる。例えばこの仕切り（２）は常温硬化性
の水溶性樹脂またはアルコール溶解性樹脂液などを用い
ることが出来る。セルロースアセテート膜上に独立した
列（３〜８）を設けることにより例えばＴＰ（総蛋白
質）（３）の列とＩｇＧ（４），ＩｇＡ（５），ＩｇＭ
（６），κ（７），λ（８）の列の計６種の電気泳動の
列を確保することができた。実際の使用上において、検
体の塗布量を約０．６μＬにし、特異抗体はそれぞれ従
来の使用量の１０倍〜１００倍程度希釈したものが問題
無く使えることが分かった。また、高感度の銀染色液
は、２８０ｍＭクエン酸ソーダからなる銀染色液１、２
５ｍＭ硫酸第一鉄溶液からなる銀染色液２、３５０ｍＭ
硝酸銀溶液からなる銀染色液３、１５％酢酸溶液からな
る銀染色液４およびスルホサリチル酸からなる固定液と
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムからなる固着液などで構成
した。

【０００６】

【実施例】以下に実際、本発明による免疫固定法の操作
を述べる。先ず血清を１０〜１００倍に希釈（尿蛋白質
の検出の場合は希釈不要）して、検体塗布器で一定量例
えば０．８μＬをセルロースアセテート膜などの多孔質
膜に塗布する。一定時間（例えば２０分間）電気泳動し
たのち、総蛋白（ＴＰ）の列（３，９，１５）には上記
固定液をその他のＩｇＧ（４，１０，１６），ＩｇＡ
（５，１１，１７），ＩｇＭ（６，１２，１８），κ
（７，１３，１９），λ（８，１４，２０）の列にはそ
れぞれの特異抗体を重層する。その後洗浄液で余分な蛋
白を洗い流し銀染色液１から４の混合液に洗浄後のセル
ロースアセテート膜を浸し１５分間染色する。染色後蒸
留水で水洗し固着液でしっかりと銀をセルロースアセテ
ート膜に固定する。本発明による免疫固定法は、尿蛋白
質の免疫固定法において、検体の尿を濃縮することなく
そのまま電気泳動し免疫固定法に使用できることも確認
した。図１は高分子多孔質膜に６種類の列（３〜８）を
その仕切り（２）を設けることで作りそれぞれの列を独
立させたものを示した。図２は本発明の実施例であり、
ＴＰ（９）の列は全蛋白質が染め出されており、ＩｇＧ
の列（１０）とκ（１３）の列にのみ濃い横線が見え
る。この判定はＩｇＧκ型と判定する。また図３はＴＰ
（１５）の列は全蛋白質が染め出されており、ＩｇＡの
列（１７）とλ（２０）の列にのみ濃い横線が見える。
この判定はＩｇＡλ型と判定する。

【０００７】

【発明の効果】本発明の最大の効果は、高価で扱いの難
しいアガロースゲルプレートを使用することなく既に一
般的に使用されているセルロースアセテート膜を使用す
ることで、特に操作面において検体塗布溝や特異抗体の
テンプレートを使用したり、アガロースゲルの乾燥操作
も不要になる事で操作性が非常に改善できるとともに、
安価にセルロースアセテート膜が使え、かつ操作が簡便
なため、既に実用化されている血清蛋白分画の全自動装
置と同様全自動型の免疫固定法の装置が簡単に開発でき
るようになる。現在手作業に頼っている免疫固定法の検
査は本発明の実施により、癌の診断のスクリーニング検
査化が図れるようになり、その早期発見に道を開くこと
になる。その上、高価な特異抗血清５種類（一般的な免
疫固定法の場合）を約１０〜１００倍も希釈して使用で
きるのでコストを大幅に下げることができる。また、検
体として血清のみならず尿・髄液・唾液など蛋白濃度の
低い検体も従来のような濃縮操作なしで直接セルロース
アセテート膜に塗布しても充分免疫固定が出来ることに
なった。結果的に、免疫固定法の技術革新につながる。

【図面の簡単な説明】

【図１】平面図

【図２】Ａ−Ａ断面図

【図３】実施例１

【図４】実施例２

【符号の説明】

１ 高分子多孔質膜 １１ ＩｇＡの列 ２ 仕切り １２ ＩｇＭの列 ３ 総蛋白質（ＴＰ）の列 １３ κの列 ４ ＩｇＧの列 １４ λの列 ５ ＩｇＡの列 １５ 総蛋白質（Ｔ
Ｐ）の列 ６ ＩｇＭの列 １６ ＩｇＧの列 ７ κの列 １７ ＩｇＡの列 ８ λの列 １８ ＩｇＭの列 ９ 総蛋白質（ＴＰ）の列 １９ κの列 １０ ＩｇＧの列 ２０ λの列

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１１Ａ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】電気泳動の支持体である高分子多孔質膜上
   に電気泳動で展開した蛋白質を抗原抗体反応を用いてそ
   の種類を同定する免疫固定法において、高分子多孔質膜
   の網目構造を電気泳動の列に合わせ試薬や溶液の流れを
   遮断し電気泳動のそれぞれの列を独立化したことを特長
   とした高分子多孔質膜を用いる免疫固定法。
2. 【請求項２】請求項１を用いて、電気泳動後、抗原抗体
   反応および酸による蛋白固定をしたあと、脱蛋白を行
   い、銀イオンを還元剤とあらかじめ反応させコロイド状
   にした高感度銀染色液中で「銀−蛋白質結合体」を形成
   させることを特長とする、高分子多孔質膜を用いる免疫
   固定法。