JP2002542174A

JP2002542174A - Ｔ細胞介在性免疫の改善

Info

Publication number: JP2002542174A
Application number: JP2000611797A
Authority: JP
Inventors: リチャード・レノックス・ボイド
Original assignee: モナシュユニバーシティ
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 2000-04-17
Publication date: 2002-12-10
Also published as: CN1364093A; EP1191975A4; HK1046249A1; AU3797700A; BR0009712A; AUPP977899A0; ZA200108451B; AU779067B2; WO2000062657A2; KR20020007371A; CN100376288C; WO2000062657A3; NZ514975A; EP1191975A2; CA2370296A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、抑制されたまたは異常なＴ細胞の群または機能を有する患者における、Ｔ細胞群構成を変更する、またはＴ細胞数を増加させるための方法に関する。これらの方法は、患者の胸腺に対する性ステロイドシグナル伝達を途絶することを特徴とする。また本発明は、患者の抗原に対する免疫応答を増強するための組成物であって、アジュバント、抗原、および黄体化ホルモン放出ホルモンのアナログを含む組成物にも関する。前記患者としては、特に、ガン、ヒト免疫不全ウイルス感染、自己免疫疾患、過敏性疾患または子宮内膜症を患う者が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、抑制されたまたは異常なＴ細胞の群または機能を有する患者におけ
る、Ｔ細胞群構成の変更またはＴ細胞の数の増加のための方法に関する。これら
の方法は、患者の胸腺に対する性ステロイドシグナル伝達を途絶することを含む
。

【０００２】

【従来の技術】

胸腺は、神経内分泌系との両方向の連絡により大きく影響される（Kendall, 1
988）。刺激性（ＴＳＨおよびＧＨ）および萎縮性効果（ＬＨ、ＦＳＨおよびＡ
ＣＴＨ）の両方を含む胸腺機能における、下垂体、副腎および性腺の間の相互作
用は、特に重要である（Kendall, 1988; Homo-Delarche, 1991）。胸腺生理機能
の特徴の一つは、思春期の循環性性ステロイド産生の増加と釣り合った、構造お
よび機能の進行性の減退である（HirokawaとMakinodan, 1975; Tosiら, 1982、
およびHirokawaら, 1994）。胸腺萎縮を誘導するホルモンの正確なターゲットお
よびメカニズムは、未だ解明されていない。胸腺は、末梢Ｔ細胞プールの生成お
よび維持に重要な部位なので、この萎縮は、初老期の免疫をベースとする疾患の
発病率の増加の主要な原因として広く考えられている。特に、細胞溶解性Ｔ細胞
活性およびマイトジェン応答のようなＴ細胞依存性免疫機能の低減により説明さ
れる免疫システムの欠損は、後年の免疫不全、自己免疫および腫瘍荷重(tumour
load)の発症率の増加に反映される（Hirokawa, 1998）。

【０００３】胸腺萎縮の影響は、低い多様Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）レパートリーをもた
らすＴ細胞プールへの胸腺インプットの低減を伴って、末梢において反映される
。変化したサイトカインプロフィール（Hobbsら, 1993; Kurashimaら, 1995）；
ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺サブセットにおける変化、およびナイーブなＴ細胞に対立
するものとしてのメモリーの傾向（Mackallら, 1995）も観察されている。さら
に、胸腺新生の効率が年齢に伴って損なわれ、Ｔ細胞枯渇後の正常なＴ細胞数を
再生する免疫システムの能力がついに失われてしまう（Mackallら, 1995）。し
かしながら、Douekらによる最近の研究(1998)では、高齢のヒトでもおそらくは
胸腺アウトプットが起こることが示された。ＴＣＲ遺伝子リアレンジメントの切
除ＤＮＡ産物が、年をとった患者におけるＨＩＶ感染後に、循環性の、新たに生
成されたナイーブＴ細胞を証明するために用いられた。このアウトプットとその
後の末梢Ｔ細胞プール再生の速度には、さらに注意を向ける必要がある。なぜな
ら、化学療法を受けたことのある患者は、思春期前と比べて思春期後の患者にお
いて、Ｔ細胞プール、特にＣＤ４⁺Ｔ細胞の再生の速度に大きな低減を示すから
である（Mackallら, 1995）。これは、TimmとThoman (1999)による最近の研究に
おいてさらに例証されている。彼らは、ＣＤ４⁺Ｔ細胞はＢＭＴ後の年をとった
マウスにおいて再生されるが、ナイーブＴ細胞の貧弱な胸腺生成に関連した、年
をとった末梢微環境によるメモリー細胞への傾向を示すと考えられることを示し
た。

【０００４】本質的に、胸腺は、微環境を構成し、かつ、Ｔ細胞の最適な発達に必要な細胞
性相互作用および増殖因子を提供する、多様な間質性細胞（優勢的には上皮細胞
サブセット）内に散在した発達性胸腺細胞からなる。分化と成熟を制御する胸腺
細胞と上皮サブセットとの間の共生的発生関係（Boydら, 1993）は、後に他方の
状態に影響する、いずれかの細胞タイプのレベルで性ステロイド阻害が起こりう
ることを意味している。胸腺細胞自体に固有の欠陥が存在するとは考えにくい。
これは、照射キメラを利用した先の研究が、ＢＭ幹細胞が年齢に影響されず（Hi
rokawa, 1998; MackallおよびGress, 1997）、かつ、若いＢＭ細胞と同程度の胸
腺再増殖能を有することを示したからである。さらに、年をとった動物の胸腺細
胞は、少なくともある程度までの分化能を維持している（MackallおよびGress,
1997; GeorgeおよびRitter, 1996; Hirokawaら, 1994）。しかしながら、Aspina
ll (1997)による最近の研究では、ＴＣＲβ鎖遺伝子リアレンジメントの段階で
起こる前駆体ＣＤ３^-ＣＤ４^-ＣＤ８^-トリプルネガティブ（ＴＮ）群に欠陥が示
された。

【０００５】胸腺機能の回復を介して得られる巨大な臨床的利益は、免疫不全、特に成人に
おけるもの、ＨＩＶ患者および化学療法後の処置に重要な戦略を示すであろう。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】

本願発明者らは、胸腺の構造および機能の完全回復を伴う、性ステロイド生成
の阻害により、胸腺萎縮が完全に逆転されうることを示した。また、本願発明者
らは、胸腺への性ステロイドシグナル伝達を途絶することにより胸腺機能を復活
させるための臨床的応用も見出した。

【０００７】従って、第一の態様では、本発明は、抑制されたまたは異常なＴ細胞の群また
は機能を有する患者における、Ｔ細胞群構成の変更またはＴ細胞数の増加のため
の方法を与える。この方法は、患者の胸腺に対する性ステロイドシグナル伝達を
途絶することを含む。

【０００８】好ましくは、前記Ｔ細胞群構成の変更は、機能的に、および／または、特徴的
な分子の発現により定義されたＴ細胞サブセットの性質および／または比率の変
更を特徴とし、前記特徴的な分子は、Ｔ細胞レセプター、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ
３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ６９からなる群から
選択される。

【０００９】患者のＴ細胞数の増加が、別のリンパ系細胞と比較して、Ｔ細胞数に相対的な
増加をもたらすことがさらに好ましい。好ましくは、別のリンパ系細胞とはＢ細
胞である。

【００１０】また、抑制された、または、異常なＴ細胞の群または機能を備えた患者は、ガ
ン、ヒト免疫不全ウイルス感染、自己免疫疾患、過敏性疾患または子宮内膜症か
らなる群から選択された症状を患っていることが好ましい。

【００１１】好ましくは、ガン患者は、化学療法および／または放射線治療および／または
骨髄移植を受けたことがある者である。好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス感染を有する患者はＡＩＤＳを有する。さらに好ましい実施態様では、患者は思春期後である。

【００１２】自己免疫疾患は、ポリジーン特性（polygenic trait）として、病原性自己反
応Ｔ細胞に関係する必須成分を生じると考えられている。かかる患者を、骨髄移
植を伴うかあるいは伴わずに、化学療法または放射線で処置することにより、こ
れらの自己反応性Ｔ細胞を除去することができる。胸腺への性ステロイドシグナ
ル伝達の途絶が、新たな非自己反応性Ｔ細胞の集団を生じる胸腺の再活性化を可
能にすることが考えられる。

【００１３】従って、本発明の第二の態様では、患者における自己免疫疾患の治療方法を提
供する。この方法は、内在性のＴ細胞群を除去し、かつ、患者の胸腺への性ステ
ロイドシグナル伝達を途絶する工程を含む。

【００１４】本発明の第二の態様の工程は、あらゆる順番で行うことができる。好ましい態様では、この方法は、患者に骨髄移植を行うことをさらに含む。さらに好ましい態様では、Ｔ細胞群が、患者を化学療法または放射線に曝すこ
とによって除去される。

【００１５】また、本発明は、患者の抗原に対する免疫応答を強化するためにも利用される
。従って、本発明の第三の態様では、患者の抗原に対する免疫応答を強化するた
めの方法を提供し、この方法は、患者の胸腺への性ステロイドシグナル伝達の途
絶および抗原の投与を含む。

【００１６】抗原は、例えば、感染性因子または腫瘍細胞から誘導される。第三の態様の好ましい実施態様では、患者はガンまたは感染を患っている。第三の態様のさらに好ましい態様では、抗原は投与前にアジュバントと混合さ
れる。

【００１７】第四の態様では、本発明は、臓器移植後の患者における宿主対移植片反応を低
減する方法を与える。この方法は、以下の工程：患者のＴ細胞を除去する工程；患者の胸腺に対する性ステロイドシグナル伝達を途絶する工程；および患者にドナーの臓器を移植する工程を含む。好ましくは、第四の態様の方法は、ドナーから患者に骨髄を移植することも含
む。

【００１８】本発明の各方法に関して、胸腺への性ステロイドシグナル伝達は、性ステロイ
ド産生を阻害することによって、あるいは、胸腺内の性ステロイドレセプターを
ブロックすることによって途絶されることが好ましい。

【００１９】好ましくは、性ステロイド産生の阻害は、去勢または性ステロイドアナログの
投与のいずれかによって達成される。

【００２０】好ましい性ステロイドアナログは、ユーレキシン(eulexin)、ゴセレリン(gose
relin)、ロイプロリド、ジオキサラン(dioxalan)誘導体、例えばトリプトレリン
(triptorelin)、メテレリン(meterelin)、ブセレリン(buserelin)、ヒストレリ
ン(histrelin)、ナファレリン(nafarelin)、ルトレリン(lutrelin)、ロイプロレ
リン(leuprorelin)、および黄体化ホルモン放出ホルモンアナログを含む。

【００２１】現在のところ、性ステロイドアナログは、黄体化ホルモン放出ホルモンのアナ
ログであることが好ましい。さらに好ましくは、黄体化ホルモン放出ホルモンア
ナログは、デスロレリン(deslorelin)である。

【００２２】さらに好ましい実施態様では、性ステロイドアナログは、持続性ペプチド放出
製剤によって投与される。好ましい持続性ペプチド放出製剤は、WO98/08533に記
載されており、その全内容を参考としてここに含める。

【００２３】第五の態様では、本発明は、患者において抗原に対する免疫応答を増強する組
成物を提供するものであり、この組成物は、アジュバント、抗原、および黄体化
ホルモン放出ホルモンのアナログを含む。

【００２４】また、当業者であれば、本発明が、発達中のある段階において胸腺を有するあ
らゆる生命体に適用可能であることを理解するであろう。好ましくは、生命体は
哺乳動物である。さらに好ましくは、この生命体はヒトである。

【００２５】本明細書を通して、用語“含む(comprise)”、または“含む(comprises)”も
しくは“含んでいる(comprising)”のような変形は、記載した要素(element)、
全体(integer)または工程(step)、あるいは要素、全体または工程の群を包含す
るが、それ以外の要素、全体または工程、あるいは要素、全体または工程の群を
排除するものではないと理解する。

【００２６】

【発明の実施の形態】

表現“Ｔ細胞群構成の変更”は、機能的に、および、特徴的な分子の発現によ
り定義されたＴ細胞サブセットの性質および／または比率の変更を指す。前記特
徴的な分子の例は、Ｔ細胞レセプター、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ２５、Ｃ
Ｄ２８、ＣＤ４４、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ６９を含むが、これらに制限されない
。

【００２７】表現“Ｔ細胞数の増加”は、患者における、胸腺および／または循環系および
／または脾臓および／または骨髄および／または末梢組織、例えばリンパ節、胃
腸、尿性器および呼吸の管のＴ細胞数の絶対的増加を指す。またこの表現は、例
えばＢ細胞と比較した場合のＴ細胞の相対的増加をも指す。

【００２８】 “抑制されたまたは異常なＴ細胞の群または機能を有する患者”は、ガン患者
、特に化学療法または放射線療法を受けたことのある、あるいは、骨髄移植を受
けたことのある患者、あるいは乳ガン患者および前立腺ガン患者、あるいは、細
胞介在性免疫の機能低減またはＴ細胞異常をもたらすあらゆるガンまたは増殖性
疾患の患者を含む。この表現は、ヒト免疫不全ウイルスに感染した患者、特にＡ
ＩＤＳを有する患者も含む。さらに、この表現は、あらゆる思春期後の患者、特
に、思春期後胸腺萎縮の結果として、増加した疾患発病率および低減した免疫応
答を有する年をとった患者を含む。またこの表現は、子宮内膜症、自己免疫疾患
、アレルギー、過敏症またはあらゆる免疫機能不全を患う患者も含む。患者は、
同種異系骨髄移植を受けたことがあってもよく、また、Ｔ細胞に対して非常に毒
性であるフルダラビン(Fludarabine)、クラドラビン(cladrabine)、デキサメタ
ゾンおよび２−シトデオキシアデノシンのような薬剤で処理されたＣＬＬおよび
低級非ホジキン(Non-Hogkins)リンパ腫患者のような化学療法後の白血病患者で
あってもよい。

【００２９】 “アジュバント”は、抗原組成物の免疫原性および効力を増強する一以上の物
質を意味する。適切なアジュバントの非限定的な例は、スクアランおよびスクア
レン（あるいは動物由来の別の油）；ブロックコポリマー；Tween（登録商標）
−８０のような界面活性剤；Quil（登録商標）Ａ、DrakeolまたはMarcolのよう
な鉱油、ピーナツ油のような植物油；コリネバクテリウムパルブムのようなコリ
ネバクテリウム由来のアジュバント；座瘡プロピオンバクテリウムのようなプロ
ピオンバクテリウム由来のアジュバント；ウシ結核菌（バチルスカルメティック
(Bacillus Calmetic)およびゲリン(Guerinn)またはＢＣＧ）；インターロイキン
２およびインターロイキン１２のようなインターロイキン；インターロイキン１
のようなモノカイン；腫瘍壊死因子；ガンマインターフェロンのようなインター
フェロン；サポニン−アルミニウムヒドロキシドまたはQuil-Aアルミニウムヒド
ロキシドのような組合せ；リポソーム；イスコム(iscom)アジュバント；マイコ
バクテリウム細胞壁抽出物；ムラルニル(murarnyl)ジペプチドまたは他の誘導体
のような合成グリコペプチド；アブリジン(Avridine)；リピドＡ；デキストラン
スルファート；ＤＥＡＥデキストランまたはＤＨＡＥデキストランとアルミニウ
ムホスファート；Carbopol' EMAのようなカルボキシポリメチレン；Neocryl A64
0（例えば米国特許第5,047,238）のようなアクリルコポリマーエマルション；ワ
クシニアまたは動物ウイルスタンパク；コレラ毒素のようなサブウイルス粒子ア
ジュバント、もしくはこれらの混合物を含む。

【００３０】臓器移植後の患者における宿主対移植片反応を低減する方法に関して、まず、
宿主リンパ球が枯渇される（例えば、照射または化学療法を介して）。この後に
、胸腺に対する性ステロイドシグナル伝達の途絶と関係したドナーの骨髄／幹細
胞移植を行ってもよく、宿主胸腺において樹状細胞を含むドナー細胞の確立を含
むキメラを確立して、新たに発達した宿主Ｔ細胞のドナーに対する寛容を引き起
こす。中心的寛容の確立後、宿主はドナーから幹細胞の移植を受ける。

【００３１】容易に理解されるように、胸腺への性ステロイドシグナル伝達は、ある範囲の
方法、例えば、胸腺内における性ステロイドレセプターのブロッキングまたは性
ステロイド産生の阻害により途絶されうる。性ステロイド産生の阻害は、例えば
、去勢、性ステロイドアナログの投与、およびその他の周知の技術によって実施
することができる。一部の臨床的なケースでは、身体的去勢を介して生殖腺を永
久的に除くことが適切かもしれない。好ましい実施態様では、胸腺への性ステロ
イドシグナル伝達は、性ステロイドアナログ、好ましくは黄体化ホルモン放出ホ
ルモンアナログの投与により途絶される。現在のところ、このアナログはデスロ
レリン(deslorelin)（米国特許第4218439号記載）であることが好ましい。

【００３２】治療および“化学的去勢”における性ステロイドアナログおよびそれらの使用
は周知である。かかるアナログの例は、ユーレキシン(FR7923545、WO86/01105お
よびPT100899に記載)、ゴセレリン(US4100274、US4128638、GB9112859およびGB9
112825に記載)、ロイプロリド(US4490291、US3972859、US4008209、US4005063、
DE2509783およびUS4992421に記載)、EP413209に記載されているようなジオキサ
ラン誘導体、トリプトレリン(US4010125、US4018726、US4024121、EP364819およ
びUS5258492に記載)、メテレリン(EP23904に記載)、ブセレリン(US4003884、US4
118483、およびUS4275001に記載)、ヒストレリン(EP217659に記載)、ナファレリ
ン(US4234571、WO93/15722およびEP52510に記載)、ルトレリン(US4089946に記載
)、ロイプロレリン(Ploskerらに記載)、および、EP181236、US4608251、US46562
47、US4642332、US4010149、US3992365、およびUS4010149に記載されているよう
なＬＨＲＨアナログを含む。上記各参考文献の開示を、参考としてここに含める
。

【００３３】当業者に理解されるように、胸腺への性ステロイドシグナル伝達を途絶する少
なくとも一部の手段は、適切な化合物が投与される限りにおいてのみ有効である
。結果として、本発明の一部の態様の利点は、本発明の所望の免疫学的効果が達
成されたら、（２−３ヶ月）処置を停止することができ、かつ、患者の生殖系が
正常に戻ることである。

【００３４】理解されるように、用語“臓器”は広い意味で用いられ、皮膚、腎臓、肝臓、
心臓、肺等を含む。

【００３５】

【実施例】

実施例１−年齢誘発性胸腺萎縮の逆転物質と方法動物 CBA/CAH及びC57BJ6/Jオスマウスを、Central Animal Services, Monash Unive
rsityから得て、従来法の条件の下で飼育した。年齢は4-6週齢から26月齢の範囲
であり、適切な範囲を示す。

【００３６】去勢動物を、塩水中に0.3mgのキシラジン(Rompun; Bayer Australia Ltd., Botany
NSW, Australia)及び1.5mgの塩酸ケタミン(Ketalar; Parke-Davis, Caringbah,
NSW, Australia)の0.3mlの腹膜内注射によって麻酔処理した。陰嚢の切開によ
り精巣を表出させ、それを縫合糸で縛って周囲の脂肪組織と共に摘出することに
よって、去勢を実施した。

【００３７】ブロモデオキシウリジン(BrdU)取り込みマウスに、４時間間隔でBrdU(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)(100μlの
PBS中に100mg/体重のkg)の二回の腹膜内注射を与えた。コントロールマウスには
、ビヒクルのみの注射を与えた。第二の注射の一時間後、胸腺を摘出し、FACS分
析のために細胞懸濁液を調製し、または迅速にTissue Tek(O.C.T.化合物、Miles
INC, Indiana)に埋没し、迅速に液体窒素で凍結し、使用まで-70℃で貯蔵した
。

【００３８】フローサイトメトリー分析マウスをCO₂窒息によって殺傷し、胸腺、脾臓及び腸間膜リンパ節を摘出した
。器官を氷冷PBS/1% FCS/0.02% Azideにおいて200μmのふるいを通じて穏やかに
押し込み、遠心分離にかけ(650g, 5分, 4℃)、それぞれPBS/FCS/Azに再懸濁した
。脾臓細胞を、４℃で１０分赤血球細胞溶解バッファー(8.9g/リットル塩酸アン
モニウム)中にインキュベートし、洗浄してPBS/FCS/Azに再懸濁した。細胞濃度
及び生存性を、血球計算板及びエチジウムブロマイド／アクリジンオレンジを使
用して二重に測定し、蛍光顕微鏡(Axioskop; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany
)の下で視覚化した。

【００３９】３色免疫蛍光のため、胸腺を抗αβTCR-FITCまたは抗γσTCR-FITC、抗CD4-PE
及び抗CD8-APC（全てPharmingen, San Diego, CAから入手した）で標準的にラベ
ルし、引き続きフローサイトメトリー分析にかけた。脾臓及びリンパ節懸濁液を
、αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APCで、またはCD4-PEとCD8-APCと共にB220-B(Sigma
)のそれぞれでラベルした。B220-Bは、Caltag Laboratories, Inc., Burlingame
, CAから販売されているストレプタビジン-Tri-発色接合物で視覚化された。

【００４０】 BrdU検出のため、細胞をCD4-PE及びCD8-APCで表面ラベルし、引き続き上述の
ように固定化して浸透化した(Carayon及びBord, 1989)。略記すると、染色細胞
を４℃で1% PFA/0.01% Tween-20において固定化した。洗浄した細胞を、３７℃
で３０分500μlのDNアーゼ(100Kunitzユニット, Boehringer Mannheim, W. Germ
any)中でインキュベートし、DNAを変性させた。細胞に細胞を、抗BrdU-FITC(Bec
ton-Dickinson)と共にインキュベートした。

【００４１】４色免疫蛍光のため、胸腺をCD3、CD4、CD8、B220及びMac-1についてラベルし
、抗ラットIg-Cy5(Amersham, U.K.)によって集合的に検出し、ネガティブ細胞(T
N)を分析のため回収した。それらをさらにCD25-PE(Pharmingen)及びCD44-B(Phar
mingen)について染色し、引き続き上述のように(Godfrey及びZlotnik, 1993)ス
トレプタビジン-Tri-発色(Caltag, CA)によって染色した。次いでBrdU検出を、
上述のように実施した。

【００４２】サンプルをFacsCalibur(Becton-Dickinson)で分析した。生存リンパ細胞を、
０°から９０°の光散乱プロフィールに従って回収し、データをCell探索ソフト
ウェアー(Becton-Dickinson)を使用して分析した。

【００４３】免疫組織化学凍結胸腺切片(4μm)を、クリオスタット(Leica)を使用して切断し、100%アセ
トン中で迅速に固定した。

【００４４】２色免疫蛍光のため、この研究室で生産された一群のモノクローナル抗体：MT
S6, 10, 12, 15, 16, 20, 24, 32, 33, 35及び44(Godfrey等, 1990;表１)で二重
ラベルし、上皮細胞決定因子の共発現を、多価ウサギ抗細胞ケラチン抗体(Dako,
Carpinteria, CA)で評価した。結合抗体を、FITC接合ヒツジ抗ラットIg(Silenu
s Laboratories)で視覚化し、抗細胞ケラチンを、TRITC接合ヤギ抗ウサギIg(Sil
enus Laboratories)で視覚化した。

【００４５】ブロモデオキシウリジン検出のため、切片を、抗細胞ケラチン引き続き抗ウサ
ギTRITCで、または抗ラットIg-Cy3(Amersham)で視覚化される特異的mAbのそれぞ
れで染色した。次いでBrdU検出を、上述のように実施した(Penit等, 1996)。略
記すると、切片を70%エタノール中に３０分固定した。半乾燥切片を、4M HCl中
でインキュベートし、ホウ酸バッファー(Sigma)によって中和し、引き続きPBS中
で二回洗浄した。抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson)を使用してBrdUを検出した。

【００４６】３色免疫蛍光のため、切片を、抗細胞ケラチンと共に特異的MTS mAbについて
ラベルした。次いでBrdU検出を、上述のように実施した。

【００４７】 Leica蛍光顕微鏡及びNikon共焦点顕微鏡を使用して、切片を分析した。

【００４８】移動研究動物を、塩水中に0.3mgのキシラジン(Rompun; Bayer Australia Ltd., Botany
NSW, Australia)及び1.5mgの塩酸ケタミン(Ketalar; Parke-Davis, Caringbah,
NSW, Australia)の0.3mlの腹膜内注射によって麻酔処理した。

【００４９】胸腺細胞のFITCラベリングの方法の詳細は、すでに記載されているものと同様
である(Scollay等, 1980; Berzins等, 1998)。略記すると、胸腺葉を露出させ、
各葉を約10μmの350μg/ml FITC(PBS中)で注射した。傷口を外科的繊維で縫合し
、麻酔から十分に回復するためマウスを温めた。注射の約２４時間後、マウスを
CO₂窒息によって殺傷し、リンパ器官を分析のため摘出した。

【００５０】細胞カウントの後、サンプルを抗CD4-PE及び抗CD8-APCで染色し、次いでフロ
ーサイトメトリーによって分析した。移動細胞を、CD4またはCD8のそれぞれを発
現する生存回収FITC⁺細胞として同定した（自己蛍光細胞及び二重体を除くため
）。FITC⁺ CD4及びCD8細胞のパーセンテージを、リンパ節及び脾臓のそれぞれに
ついての全移動パーセンテージを提供するために加えた。毎日の移動速度の計算
を、Berzins等(1998)に記載されているように実施した。

【００５１】データを、不対スチューデント「ｔ」検定を使用して分析し、または少なくと
も三重で実施された試験についてのコントロール結果と試験結果の間の統計学的
有意性を測定するために、非パラメーター性Mann-Whitney検定を使用した。コン
トロール値と有意に異なる実験値を、以下のように示す：^*p≦0.05、^**p≦0.01
及び^***p≦0.001。

【００５２】結果胸腺細胞集団に対する年齢の効果 (i)胸腺重量及び胸腺細胞数年齢の増大と共に、胸腺重量（図１Ａ）と全胸腺細胞数（図１Ｂ）の両者にお
ける非常に有意な(p≦0.0001)減少が存在する。若い成体における相対的胸腺重
量(mg胸腺/g体重)は、3.34の平均値を有し、それは18-24月齢では0.66に減少す
る（脂肪の沈着が正確な計算を制限する）。胸腺重量の減少は、全胸腺細胞数の
減少に寄与し得る：1-2ヶ月の胸腺は、〜6.7×10⁷の胸腺細胞を含み、24ヶ月ま
でに〜4.5×10⁶細胞に減少する。去勢によって胸腺に対する性ステロイドの効果
を除去することによって、再生が生じ、去勢後４週までに胸腺は重量及び細胞数
の両者において若い成体のものと同等になる（図１Ａ及び１Ｂ）。興味深いこと
に、去勢後２週間で胸腺細胞数の有意な(p≦0.001)増大が存在し（〜1.2×10⁵）
、それは去勢後４週までに正常な若いレベルに回復される（図１Ｂ）。

【００５３】胸腺によって生産されるＴ細胞数の減少は、末梢においては影響されないが、
脾臓細胞数は年齢と共に一定数を維持する（図２Ａ）。脾臓及びリンパ節におけ
るＴ細胞に対するＢ細胞の割合は年齢の影響を受けず、Ｔ細胞数の後の減少は末
梢に到達するため（図２Ｂ）、末梢におけるホメオスタシスな機構が明らかであ
った。しかしながら、CD8⁺Ｔ細胞に対するCD4⁺Ｔ細胞の割合は、２月齢での2:1
から２年齢での1:1の割合まで、年齢と共に有意に減少した(p≦0.001)。去勢に
引き続き、Ｔ細胞数の後の増大が末梢に到達するが、末梢Ｔ細胞数の変化は観察
されなかった：脾臓Ｔ細胞数と、脾臓とリンパ節の両者におけるＢ：Ｔ細胞の割
合は、去勢に引き続き変化しなかった（図２Ａ及び２Ｂ）。年齢と共なる末梢に
おけるCD4:CD8の割合の減少は、去勢後２週で未だ明らかであるが、去勢後４週
までに完全に逆転した（図２Ｃ）。

【００５４】 (ii)αβTCR、γσTCR、CD4及びCD8発現年齢と共に観察される胸腺細胞数の減少が、特異的細胞集団の枯渇の結果であ
るかを測定するために、胸腺細胞を所定のマーカーでラベルして、個別のサブ集
団を分析した。さらにこれによって、去勢後の胸腺再集団化の速度の分析が可能
であった。主となる胸腺細胞サブ集団の割合を、正常な若い胸腺のものと比較し
（図３）、年齢と共に均一性を維持することが見出された。さらに、αβTCRと
γσTCRの発現による胸腺細胞のサブ分裂により、年齢と共にこれらの集団の割
合が変化しないことが明らかとなった（データ示さず）。去勢後２週及び４週で
、胸腺細胞サブ集団は同じ割合を維持し、去勢後に胸腺細胞数が１００倍まで増
大するため、このことは、増大の発達上の進行よりむしろ、全ての胸腺細胞のサ
ブセットの同調的な増大を示す。

【００５５】かくして、高齢の動物の胸腺で観察される細胞数の減少は、全ての細胞表現型
のバランスのとれた減少の結果であるようであり、Ｔ細胞集団の有意な変化は検
出されない。胸腺再生は同調的な様式で生じ、連続的と言うよりはむしろ同時的
に、全てのＴ細胞サブ集団を補給する。

【００５６】胸腺細胞の増殖図４．１に示されるように、胸腺細胞の15-20%が、4-6週齢で増殖している。
これらの大部分（〜80%）はDPであり、TNサブセットは〜6%で第二の大集団を形
成する（図４．２Ａ）。従って、ほとんどの分裂は、免疫組織化学によって被膜
下及び皮質において観察される（データ示さず）。いくつかの分裂は髄質領域で
観察され、FACS分析により、分裂しているSP細胞の割合が明らかである（CD4Ｔ
細胞の9%及びCD8Ｔ細胞の25%）（図４．２Ｂ）。

【００５７】細胞数は、高齢の胸腺において有意に減少するが、胸腺細胞の増殖は一定を維
持し、２年で12-15%に減少（図４．１）するが、増殖中の集団の表現型は、２ヶ
月の胸腺と類似している（図４．２Ａ）。免疫組織化学的研究により、１年齢で
の分裂が若い成体で観察されるものを反映することが明らかであるが、２年で増
殖は、外側皮質と血管系の周囲で主に観察される（データ示さず）。去勢の２週
で、胸腺細胞数は有意に増大するが、増殖中の胸腺細胞の割合は変化せず、この
ことは細胞の同調的な増大を再び示す（図４．１）。免疫組織化学的研究により
、胸腺細胞増殖の局在と分裂中の細胞の度合いが、去勢後２週までで２ヶ月齢の
胸腺における状況と類似することが明らかであった（データ示さず）。増殖中の
集団を表す各サブ集団の割合を分析した場合、増殖中の集団内に存在するCD8Ｔ
細胞のパーセンテージの有意な(p<0.001)増大が存在した（２ヶ月齢及び２年齢
で1%、去勢後の２週で〜6%に増大する）（図４．２Ａ）。

【００５８】図４．２Ｂは、若い、高齢の、及び去勢したマウスにおける各サブセット内の
増殖の度合いを説明する。DNサブセット内では増殖の有意な(p≦0.001)減少が存
在する（２年齢では4%に対して２月齢では35%）。CD8⁺Ｔ細胞の増殖もまた有意
に減少し(p≦0.001)、分裂が高齢の胸腺の骨髄においては明らかでないという免
疫組織化学による発見を反映する（データ示さず）。DN増殖における減少は、去
勢後４週まで正常な若いレベルに戻らない。しかしながら、CD8⁺Ｔ細胞サブセッ
ト内の増殖は、去勢後２週で有意に増大し(p≦0.001)、去勢後４週で正常な若い
レベルに戻っている。

【００５９】 DNサブセット内の増殖の減少を、さらにマーカーCD44とCD25を使用して分析し
た。胸腺細胞前駆体に加えてDNサブ集団は、αβTCR⁺CD4^-CD8^-胸腺細胞を含み、
それはSP細胞への転移の時点で両者の共レセプターを下流調節していると解され
る(Godfrey & Zlotnik, 1993)。これらの成熟細胞を回収することによって、真
の構成要素(CD3^-CD4^-CD8^-)を分析することが可能であり、これらは年齢または後
の去勢に関して増殖速度において差異を示さなかった（図４．２Ｃ）。しかしな
がら、CD44及びCD25を発現するサブ集団の分析は、正常の若いものにおける20%
から１８月齢での約6%まで、TN1サブセット(CD44⁺CD25^-)の増殖の有意な減少(p<
0.001)を示し（図４．２Ｄ）、それは去勢後４週までで回復した。TN1サブセッ
トの増殖の減少は、去勢後２週までで正常な若いレベルに戻るTN2サブ集団(CD44 ⁺ CD25⁺)の増殖の有意な増大(p≦0.001)によって埋め合わされた（図４．２Ｄ）
。

【００６０】胸腺微環境に対する年齢の効果年齢と共なる胸腺微環境の変化を、ポリクローナル抗細胞ケラチンAbと二重ラ
ベルした、MTSシリーズ由来のmAbの多数のパネルを使用して、免疫蛍光によって
調べた。

【００６１】これらのmAbによって認識される抗原は、３種の群に分割できる：胸腺上皮サ
ブセット、血管会合抗原、及びストロマ細胞と胸腺細胞の量に存在するもの。

【００６２】 (i)上皮細胞抗原２週齢の胸腺の抗ケラチン染色（上皮全体）により、重篤な上皮細胞組織破壊
を伴う一般的胸腺構造の損失と、別個の皮質髄質接合部の不在が明らかであった
。mAb、MTS10（髄質）とMTS44（皮質）を使用するさらなる分析により、髄質上
皮の実質的な減少を伴わない、年齢と相関する皮質サイズの別個の減少が示され
た。上皮細胞を含まない領域、またはケラチン陰性領域(KNA's, van Ewijk等, 1
980; Godfrey等, 1990; Bruijntjes等, 1993)は、抗細胞ケラチンラベリングで
示されるようにより明らかであり、高齢の胸腺におけるサイズが増大していた。
特に髄質領域で顕著であるように、高齢の胸腺では胸腺上皮「嚢様」構造もまた
出現する（データ示さず）。脂肪の沈着、胸腺サイズのひどい減少、及び皮質髄
質接合部の完全性の減少は、抗細胞ケラチン染色で決定的に示される（データ示
さず）。図２．１に示されるように、胸腺は去勢後２週までで再生を開始してい
る。これは、胸腺葉のサイズ(a)、MTS44によって明らかなように皮質上皮の増大
(b)、及び髄質上皮の局在(c)において明らかである。髄質上皮はMTS10によって
検出され、２週で皮質の全体に散乱されたMTS10によって染色される上皮のサブ
ポケットが未だ存在する。去勢後４週までで、別個の髄質及び皮質、並びに認識
可能な皮質−髄質接合部が存在する（データ示さず）。

【００６３】マーカーMTS20及び24は、原始上皮細胞を検出するものと推定され(Godfrey等,
1990)、高齢の胸腺の分解をさらに説明する。これらはE14で豊富に存在し、4-6
週で単離された髄質上皮細胞クラスターを検出するが、高齢の胸腺において再び
強度を増大する（データ示さず）。去勢に引き続き、全てのこれらの抗原は、若
い成体の胸腺のものと同等なレベルで発現されるが（データ示さず）、MTS20及
びMTS24は、皮質−髄質接合部で局在する上皮のサブポケットを減少するように
逆転する。

【００６４】 (ii)血管会合抗原血管−胸腺バリアは、胸腺へのＴ細胞前駆体の内部移動、及び胸腺から末梢へ
の成熟Ｔ細胞の外部移動に関与しているものと解される。

【００６５】 mAb MTS15は、胸腺血管の内皮に特異的であり、顆粒状の拡散した染色パター
ンを示す(Godfrey等, 1990)。高齢の胸腺においては、MTS15発現は非常に増大し
、血管と血管周囲スペースの増大した頻度とサイズを反映する（データ示さず）
。

【００６６】コラーゲン、ラミニン及びフィブリノーゲンのような重要な構造的細胞接着分
子を含む、胸腺細胞外マトリックスは、mAb MTS16によって検出される。正常な
若い胸腺全体に散乱しているMTS16発現の性質は、高齢の胸腺においてはより広
範となり相互連絡するようになる。MTS16の発現は、去勢後２週でさらに増大し
、一方で去勢後４週ではこの発現は、２ヶ月の胸腺における状況を表す（データ
示さず）。

【００６７】 (iii)共有抗原 mAb MTS6によって検出される正常な若い胸腺におけるMHCII発現は、皮質上皮
においては強力にポジティブ（顆粒状）である(Godfrey等, 1990)が、髄質上皮
では弱い染色を示す。高齢の胸腺は、MHCII発現の現象を示すが、去勢後２週で
実質的に発現が増大する。去勢後４週までで、発現は再び減少し、２月齢の胸腺
と同様であるようである（データ示さず）。

【００６８】胸腺細胞の外部移動約１％のＴ細胞が、若いマウスでは毎日胸腺から移動する(Scollay等, 1980)
。１４ヶ月及び２年齢でさえ、正常な若いマウスと同等な比例した速度で移動が
生じているが、数においては有意に減少している(p≦0.0001)ことを我々は見出
した。２ヶ月での-3:2から２６ヶ月の-7:1まで最近の胸腺の外部移動のCD4:CD8
比の増大が存在した。去勢後１週間までで、末梢へ移動する細胞数は実質的に増
大するが、移動の全体の速度は、1-1.5%に一定を維持する。

【００６９】実施例２−化学療法または放射線誘導性胸腺萎縮の逆転去勢したマウス（治療前一週に、または治療と同日にのいずれか）は、放射線
またはシクロホスファミド治療に引き続き胸腺再生速度の実質的な増大を示した
。

【００７０】胸腺においては、放射線処理されたマウスは、迅速に分裂する細胞の枯渇を伴
う胸腺構造の重篤な破壊を示す。高齢の／ヒドロコルチゾン処理胸腺を思い出さ
せる皮質の崩壊は、DN及びDP胸腺細胞の損失を明らかにする。アポトーシス細胞
の証拠である、CD4+及びCD8+SP胸腺細胞に対するαβTCR発現の下流調節が存在
する。比較として、シクロホスファミド処理された動物は、胸腺構造のより重篤
でない破壊を示し、DN及びDP胸腺細胞のより速い再生速度を示す。

【００７１】処理後１週までで、去勢マウスは、この早期の段階でさえ有意な胸腺再生を示
した（図６，７及び８）。比較として、非去勢動物は、DN及びDP胸腺細胞（ジン
属に分裂する細胞）の重篤な損失を示し、その後CD4及びCD8細胞（放射線耐性）
の割合が増大する。これは、治療後１週でさえ胸腺サイズの少なくとも４倍の増
大を示す去勢動物での胸腺細胞数の差異によって最も説明される。２週までで、
非去勢動物は、DN及びDP胸腺細胞の両者の再生に関して、相対的な胸腺細胞の標
準性を示した。しかしながら胸腺細胞の割合は、若い成体のコントロール胸腺と
未だ同等ではない。実際２週で、去勢マウスと非去勢マウスの間の調節速度にお
ける多大な差異は最大である（４週までで胸腺細胞数は、治療群の間で同等であ
った）。

【００７２】興味深いことに、胸腺サイズは、コントロール胸腺のベースラインを「飛び越
している」ようである。胸腺内での迅速な増大を示すが、これらの新たに由来し
た胸腺細胞の移動は、まだ生じていない（胸腺細胞が末梢を通じて及び末梢内か
ら外側へ移動するのに〜3-4週間かかる）。それ故、各サブ集団内の割合は同等
であるが、胸腺細胞数は、末梢内へ放出される前に整えられている。

【００７３】図９は、Ｔ細胞再生の促進における外科的去勢と比較した化学的去勢の使用を
説明する。化学的去勢の速度は、外科的なものよりかなり低い、つまりマウスが
その循環性ステロイドレベルを減少するのに約３週長くかかる。しかしながら化
学的去勢は、図９に説明されるように胸腺の再生においては未だ有効である。

【００７４】実施例３−性ステロイドの阻害に引き続く胸腺再生は、十分な末梢Ｔ細胞機能の
回復を引き起こす。去勢が免疫応答を促進できるかを測定するために、疾患進行とCTL（細胞毒性
）Ｔ細胞の役割の研究を可能にする、単純ヘルペスウイルス(HSV)の免疫化を調
べた。去勢マウスは、ウイルスに対する量的及び質的に改良された応答性を有す
る。マウスを肉丘で免疫化し、膝窩（引き出された）リンパ節を免疫後５日で分
析した。さらに肉丘を摘出し、ホモジェナイズして、実験を通じた特定の時点で
のウイルス力価を測定した。

【００７５】感染後５日で、去勢マウスは、高齢のマウスより有意に高いリンパ節細胞性を
有する（図１０）。さらに、リンパ節内の活性化された細胞数は、高齢のコント
ロールと比較した場合有意に増大する（図１０及び１１）。さらに、活性化され
た細胞数は、若い成体について見出されるものと相関し、CTLが去勢されたマウ
スにおいてより高い度合いで活性化されていることを示すが、若い成体は、Ｂ細
胞活性化のため長いリンパ節を有しているであろう。

【００７６】 HSVに対する応答においてCTLについてのVβ10の使用について、免疫化後40%の
バイアスが存在する。高齢のマウスと去勢されたマウスを、そのVβ１発現につ
いて分析した場合、これは若い成体のマウスと去勢マウスにおいて優勢であるこ
とが見出された。しかしながら上記バイアスは、高齢のマウスでは観察されなか
った（図１２）。これは、最大の免疫応答性を得るために、生涯を通じて胸腺か
らのＴ細胞の増大した生産についての生存のための必要性を説明する。

【００７７】実施例４−性ステロイドの阻害は、宿主及びドナーリンパ細胞（Ｔ、Ｂ及び樹状
細胞）のキメラ混合物を可能にする胸腺内への新生造血前駆体細胞の取り込みを
促進する。以前の実験により、ミクロキメラ形成が、器官移植許容性において重要な役割
を果たすことが示されている。樹状細胞もまた、抗原を接合するために寛容にお
いて重要や役割を果たすことが示されている。それ故、胸腺キメラ形成及び樹状
細胞数に対する去勢の効果が研究された。

【００７８】共同作用的な実験のために、４匹の３月齢のマウスを、治療群当たり使用した
。全てのコントロールは年齢が適合しており、治療されていなかった。遺伝子導
入実験のため、３−４匹の８月齢のマウスを、治療群当たり使用した。全てのコ
ントロロールは年齢が適合しており、治療されていなかった。

【００７９】致死的放射線照射、胎児肝再生、および同系マウスの去勢に引き続く胸腺変化去勢及び非去勢再生マウスの全胸腺細胞数を、治療されていない年齢の適合し
たコントロールと比較し、その結果が図１２に要約されている。治療の１週間後
、去勢及び非去勢マウスの両者の全白血球数はコントロールより低いが、互いに
有意には異ならなかった。３週で、細胞数はコントロールより低い値を維持する
が、去勢マウスの細胞数は、非去勢マウスより３倍高かった(p<0.05)（図１３Ａ
）。

【００８０】致死的放射線照射、同系胎児肝再生と去勢に引き続く脾臓変化脾臓における全細胞数は、去勢及び非去勢マウスの両者において、放射線照射
と再生の後１週及び３週で非常に減少した。去勢及び非去勢治療群の間で、全脾
臓細胞数の実質的に有意な差異は存在しなかった（図１３Ｂ）。

【００８１】致死的放射線照射、同系胎児肝再生と去勢に引き続く腸管膜リンパ節腸管膜リンパ節細胞数は、去勢及び非去勢マウスの両者において、放射線照射
と再生の後１週で非常に減少した。しかしながら、３週の時点で細胞数はコント
ロールレベルに達した。去勢及び非去勢治療群の間でリンパ節細胞数において実
質的に有意な差異は存在しなかった（図１３Ｃ）。

【００８２】致死的放射線照射、胎児肝再生及び遺伝子導入マウスの去勢に引き続く胸腺変化非去勢マウスにおいて、４週の時点までで胸腺細胞数の十分な減少が存在する
が、再生の証拠はほとんどまたは全く存在しなかった（図１４Ａ）。しかしなが
ら去勢群においては、２週までですでに過度の胸腺再生が存在し、それは４週で
コントロールレベルに戻り、非去勢マウスよりも１０倍高かった。CD45.2（ドナ
ー由来抗原）に関する胸腺のフローサイトメトリー分析により、ドナー由来の細
胞が４週で非去勢群で検出できないが、著しく去勢マウスにおける全ての胸腺細
胞が実際に、この時点でドナー由来であることを示した（図１４Ｂ）。ドナー由
来の造血細胞前駆体からの胸腺再生のこの過度の促進を考慮すると、Ｔ細胞分化
が正常に進行しているかどうかを測定することが重要であった。CD4、CD8及びTC
Rで定義されたサブセットを、フローサイトメトリーによって分析した。再生の
２週後で胸腺細胞サブセットの割合の割合的差異は存在しなかった（図１５）。
非去勢マウスはドナー由来の細胞で再生しないため、この観察は４週では不可能
であった。しかしながらこの時点で、去勢マウスにおける胸腺細胞の割合は正常
であるようである。

【００８３】胎児肝再生の２週後、非去勢マウスより去勢マウスにおいてドナー由来のミエ
ロイド樹状細胞(CD45.2⁺Mac1⁺CD11C⁺として定義される)の有意な増大が存在し、
その際は４倍であった(p<0.05)。治療の４週後、ドナー由来の樹状細胞数は、去
勢マウスにおいてコントロールより高く維持された（図１６Ａ）。胎児肝再生の
２週後、去勢マウスの胸腺におけるドナー由来の樹状細胞(CD45.2⁺Mac1^-CD11C⁺
として定義される)数は、非去勢マウスで見出されるものの２倍であった。治療
の４週後、ドナー由来のリンパ樹状細胞数は、去勢マウスにおけるコントロール
より高く維持された（図１６Ｂ）。

【００８４】 CD11C、上皮（抗ケラチン）及びCD45.2（ドナー由来マーカー）に対する免疫
蛍光染色は、再生及び去勢の４週後で、皮質髄質接合部及び胸腺の髄質領域に対
して受容細胞で局在した。共局在ソフトウェアーを使用して、これらの細胞のド
ナー由良性が確認された（データ示さず）。これはフローサイトメトリーデータ
によってサポートされ、それは胸腺における約85%の細胞が再生の４週後でドナ
ー由来であることを示唆した。

【００８５】致死的放射線照射、胎児肝再生及び去勢に引き続く骨髄の変化去勢及び非去勢再生マウスの骨髄の細胞数を、非治療の年齢が適合したコント
ロールのものと比較し、その結果が図１７Ａに要約される。骨髄細胞数は、去勢
マウスの再構成の２及び４週後で正常であった。非去勢マウスの細胞数は２週で
正常であったが、４週で劇的に減少した(p<0.05)。しかしながらこの時点で、非
去勢マウスはドナー由来の細胞で構成されなかった。

【００８６】 CD45.2（ドナー由来抗原）での骨髄のフローサイトメトリー分析により、ドナ
ー由来の細胞が再構成の４週後で非去勢マウスの骨髄で検出できないが、去勢マ
ウスの全ての細胞はこの時点でドナー由来であることが確立された（図１７Ｂ）
。

【００８７】再構成の２週後、去勢マウスと非去勢マウスの両者のドナー由来Ｔ細胞数は、
コントロールマウスで観察されるものより顕著に低かった(p<0.05)。４週で、非
去勢マウスの骨髄においてドナー由来Ｔ細胞は存在せず、Ｔ細胞数は去勢マウス
においてコントロールレベル以下であることを維持した（図１８Ａ）。

【００８８】ドナー由来のミエロイド及びリンパ樹状細胞が、再生の２週後で非去勢及び去
勢マウスの骨髄においてコントロールレベルで見出された。治療の４週後、去勢
マウスにおいて数はさらに減少し、ドナー由来の細胞は非去勢群において観察さ
れなかった（図１８Ｂ）。

【００８９】致死的放射線照射、胎児肝再生及び去勢に引き続く脾臓変化去勢及び非去勢再生マウスの脾臓細胞数を、非治療で年齢が適合したコントロ
ールと比較し、その結果が図１９Ａに要約されている。治療の２週後で、去勢及
び非去勢マウスの両者の脾臓細胞数は、コントロールのものの約50%であった。
４週までで、去勢マウスにおける数は、正常レベルに到達したが、非去勢マウス
の数は減少を維持した。CD45.2（ドナー由来）のフローサイトメトリーデータの
分析により、再生の２週後で去勢及び非去勢マウスのドナー由来細胞の数で有意
な差異が存在しないことが示された（図１９Ｂ）。４週で非去勢マウスの脾臓に
おいてドナー由良細胞は検出できないが、去勢マウスの脾臓細胞のほぼ全てがド
ナー由来のものであった。

【００９０】再生の２及び４週後で、去勢及び非去勢マウスの両者のＴ細胞数の顕著な減少
が存在した(p<0.05)（図２０Ａ）。胎児肝再生の２週後で、ドナー由良ミエロイ
ド及びリンパ樹状細胞（それぞれ図２０Ａ及びＢ）が、非去勢及び去勢マウスに
おいてコントロールレベルで見出された。４週でドナー由来樹状細胞は、非去勢
マウスの脾臓において検出されず、数は去勢マウスにおいて減少を維持した。

【００９１】腸管膜リンパ節数に対する致死的放射線照射、胎児肝再生及び去勢の効果去勢及び非去勢再生マウスのリンパ節細胞数を、非治療の年齢の適合したコン
トロールのものと比較し、その結果が図２１Ａに要約される。再生の２週後で、
細胞数は去勢及び非去勢マウスの両者においてコントロールレベルであった。再
生の４週後で、去勢マウスにおける細胞数はコントロールレベルであったが、非
去勢マウスの細胞数は有意に減少した（図２１Ｂ）。CD45.2に関するフローサイ
トメトリー分析により、再生の２週後で、去勢及び非去勢マウスにおけるドナー
由来細胞数の有意な差異は存在しないことが示唆された（図２１Ｂ）。ドナー由
来細胞は、再生の４週後で非去勢マウスにおいては検出されなかった。しかしな
がら、去勢マウスの実質的に全てのリンパ節細胞が、同じ時点でドナー由来であ
った。

【００９２】再生の２及び４週後で、去勢及び非去勢マウスの両者におけるドナー由来Ｔ細
胞数は、コントロールレベルより低かった。４週で上記数は去勢マウスにおいて
は低いままであったが、非去勢マウスのリンパ節においてはドナー由来Ｔ細胞が
存在しなかった（図２２）。胎児肝再生の２週後で、ドナー由来のミエロイド及
びリンパ樹状細胞は、非去勢及び去勢マウスにおいてコントロールレベルで見出
された（それぞれ図２２Ａ及びＢ）。治療の４週後で、ドナー由良ミエロイド樹
状細胞の数はコントロールより低く減少するが、リンパ樹状細胞数は変化しなか
った。

【００９３】実施例の一般的議論我々は、高齢だがひどく萎縮した胸腺が年齢に相関してその機能的能力を維持
し、Ｔ細胞増殖、分化及び移動が若い成体のマウスと同等なレベルで生じている
ことを示した。胸腺機能は、神経−内分泌−免疫軸の間でいくつかの複雑な相互
作用によって調節されているが、性ステロイド生産によって誘発される萎縮症は
、リンパ及び上皮細胞サブセットの両者の去勢後の胸腺再生の度合いによって説
明される、最も顕著で長期的な効果を発揮する。

【００９４】以前に示されたように(Hirokawa及びMakinodan, 1975, Aspinall, 1977)、胸
腺重量は年齢と共に有意に減少し、胸腺細胞数の有意な減少と相関する。コルチ
コステロイドの機能のためさらに胸腺萎縮を生じる、去勢法によって誘発される
ストレスは、性ステロイドの影響の除去によって無視されるが、２週での去勢胸
腺は、去勢前の胸腺の20-30倍まで細胞数を増加する。去勢後３週までで、高齢
の胸腺は、胸腺サイズ及び細胞数の両者において有意な増大を示すが、おそらく
２月齢のマウスにおいてそれ自体すでに発揮している性ステロイドの機能のため
、若い成体胸腺のものを上回る。

【００９５】我々のデータは、胸腺細胞の分化する連続的な能力を強調し、年齢に関して一
定のサブセットの割合を維持する以前の発見を確認する(Aspinall, 1997)。さら
に我々は、胸腺サブセットにおける同調的な増大を示す、去勢後に同時に生じる
胸腺細胞の分化を示した。胸腺細胞数は年齢と共に有意に減少するため、胸腺細
胞の増殖を、これが胸腺萎縮において寄与する因子であるかを測定するために分
析した。

【００９６】胸腺細胞の増殖は、年齢誘発性の胸腺移植によって、または増殖している全て
の胸腺細胞の〜14%で、去勢後の性ステロイドの影響の除去によって影響されな
い。しかしながら、この分裂の局在は、年齢と共に異なる：２月齢のマウスの胸
腺は、被膜下及び皮質領域を通じて多数の分裂を示すが（TN及びDPＴ細胞）、い
くつかの分裂は髄質においても生じる。年齢と共なる胸腺上皮分解のため、増殖
の局在は識別が困難であるが、若いものより均一でないパターンを示すようであ
り、外側皮質に調節された。去勢の２週後までで、分裂胸腺細胞は皮質全体で検
出され、２月齢の胸腺と同様な配置で髄質に明らかであった。

【００９７】 CD4及びCD8分析によって示される増殖集団の表現型は、年齢及び去勢の引き続
き改変されなかった。しかしながら、胸腺細胞サブ集団内の増殖の分析により、
年齢と共にTN及びCD8⁺細胞の両者の増殖の有意な現象が明らかであった。マーカ
ーCD44及びCD25に基づくTNサブセット内のさらなる分析により、TN2(CD44⁺CD25⁺ )集団における増大によって埋め合わされるTN1(CD44⁺CD25^-)集団の増殖の有意な
減少が明らかであった。TN集団内のこれらの富化は、Aspinall(1997)による発見
を反映する。驚くべきことに、TNサブセットは、去勢後２週までで正常なレベル
で増殖しており、性ステロイド作用の阻害に対する上記集団の迅速な応答を示す
。さらに、去勢の２週及び４週で、増殖しているCD8⁺Ｔ細胞の集団は、コントロ
ール胸腺から顕著に増大しており、おそらく末梢Ｔ細胞プールの再確立における
役割を示すであろう。

【００９８】胸腺細胞移動は、年齢と共に胸腺細胞の一定の割合で生じることが示され、そ
れは末梢への胸腺細胞の移動の速度の10倍の減少を示したScollay等(1980)によ
る以前のデータと一致した。これらの結果の差異は、２年齢の胸腺の胸腺内FITC
ラベリングにおける差異、またはFITC取り込みに対する脂肪沈着の効果のためで
あろう。しかしながら、移動するＴ細胞の絶対数は、Scollayによって見出され
たように有意に減少し、末梢Ｔ細胞プールへのRTEの割合の有意な減少を引き起
こす。これは、Ｔ細胞レパートリーに優勢に影響する末梢における変化を引き起
こすであろう(Mackall等, 1995)。以前の論文(Mackall等, 1995)は、年齢と共な
る天然のＴ細胞表現型よりむしろ、記憶に対するＴ細胞レパートリーの歪みを示
している。しかしながら減少したＴ細胞レパートリーは、もし患者が新たな病原
体に遭遇したなら対抗できず、おそらく高齢での免疫欠損の上昇を説明するであ
ろう。明らかに、免疫欠損患者におけるＴ細胞プールを再確立する必要が存在す
る。去勢は、胸腺が天然のＴ細胞の生産を有意に増大することを通じて末梢を再
集団化することを可能にする。

【００９９】末梢においてはＴ細胞数は、おそらく末梢ホメオスタシスのため、脾臓及びリ
ンパ節のB:T細胞割合に示されるように一定レベルを維持した(Mackall等, 1995;
Berzins等, 1998)。しかしながら、末梢における細胞組成の分布は高齢の胸腺
で明らかであり、若い成体での2:1から２年齢のマウスでの1:1までCD4：CD8割合
の有意な減少を示し、それはおそらく年齢に対するCD4⁺Ｔ細胞の高い感受性、ま
たは胸腺外のソースからのCD8⁺Ｔ細胞の生産の増大を示す。去勢後２週までで、
この割合は中和され、外科的去勢に対する免疫系の迅速な応答を再び反映する。

【０１００】上述の発見は、思春期前の胸腺と同等な性質で機能可能であることを示してい
る。この点で、Ｔ細胞数は有意に減少するが、分化する胸腺細胞の能力は破壊さ
れない。増殖し末梢へ最終的に移動する胸腺細胞の全体の能力は、胸腺の年齢相
関的な萎縮によって影響されない。しかしながら二つの重要な発見が記載された
。第一に、増殖する能力においてTN細胞に対する逆の影響が存在するようであり
、それはAspinall(1997)による発見と一致する。この欠点は、胸腺細胞自体にお
ける固有の欠点に寄与する。しかし我々のデータ及び以前の研究により、胸腺細
胞の分化は減少するが未だ生じており、BMからの幹細胞の流入は年齢に影響され
ないことが示されている(Hirokawa, 1998; Mackall及びGress, 1997)。これは、
性ステロイド作用に対する標的としての胸腺間質を示唆し、Ｔ細胞のこの前駆体
サブセットの後の異常な調節を意味する。第二にCD8＋Ｔ細胞は、年齢と共にそ
の増殖能力を有意に減少し、去勢に引き続いて２月齢と比較して増殖したCD8⁺Ｔ
細胞の割合を有意に増大した。成熟Ｔ細胞の増殖は、移動前の最終的な段階であ
ると解され(Suda及びZlotnik, 1992)、そのためCD8⁺増殖の有意な減少は、その
移動能力における減少を示すであろう。この仮説は、RTEにおけるCD4：CD8Ｔ細
胞の割合が年齢と共に増大するという我々の発見によってサポートされ、それは
移動しているCD8Ｔ細胞の減少を示す。代わりに、もし胸腺上皮が、CD8Ｔ細胞維
持のための鍵となる因子を提供しているのであれば、リンパ間質分子またはサイ
トカインの影響のいずれかで、この因子が増大する性ステロイドの生産を破壊す
るであろう。性ステロイドの影響を除去することによって、CD8Ｔ細胞集団は、
再び最適に増殖する。かくして去勢前後の胸腺上皮細胞の状態を詳細に測定する
ことが必要であった。

【０１０１】皮質は、上皮のネットワークを増大するのに利用可能な胸腺細胞の欠失のため
、年齢と共に崩壊するようである。去勢後の胸腺上皮の最も劇的な変化は、MTS4
4によって検出される皮質上皮の増大するネットワークであり、これは胸腺細胞
数の有意な増大を説明する。去勢後２週で、KNAは豊富であり、増殖中の胸腺細
胞を蓄積するようであり、これは胸腺の発達が、上皮が対抗できるより高い速度
で生じていることを示す。皮質上皮の増大は、上皮の増大が免疫蛍光によるBrdU
染色で明らかにされないため、このサブタイプの増殖よりむしろ胸腺構造の伸長
のためであるようである。

【０１０２】髄質上皮は、おそらくこの領域において蓄積するＴ細胞のより少ない数のため
、年齢の影響にあまり感受性ではない（胸腺細胞の>95%が、選択減少のためDP段
階で欠落する）。しかしながら高齢の胸腺は、皮質髄質接合部の配置の欠落によ
って識別されるひどい上皮細胞破壊を示し、髄質上皮は皮質上皮内に取り込まれ
る。去勢の２週までで、MTS10染色によって検出される髄質上皮は、ある程度ま
で再構成されるが、サブポケットは皮質上皮内に依然として存在する。去勢後４
週までで、皮質及び髄質上皮は、若い成体胸腺と同様に別個の皮質髄質接合部で
完全に再構成される。

【０１０３】去勢に引き続きわずかな変化も観察され、最も明らかなものは去勢前の胸腺と
比較した場合、MHCクラスII及び血液胸腺バリア抗原の減少した発現である。MHC
II(MTS6によって検出される)は、高齢の胸腺において発現が増大し、それはおそ
らくその減少した数のため胸腺細胞の発達によるコントロールにおける減少と関
連する。代わりにそれは、単に胸腺細胞によるマスキングの欠失のためであるか
もしれず、それはDP胸腺細胞の枯渇した放射線照射後の胸腺においても説明され
る(Randle及びBoyd, 1992)。一度胸腺細胞数が去勢に引き続き増大すると、抗原
結合部位は胸腺細胞の蓄積によって再びブロックされ、かくして免疫蛍光による
検出を減少する。血液−胸腺バリアを検出する抗原(MTS12、15及び16)は、高齢
の胸腺において再び増大し、また去勢後の若い成体胸腺における発現に逆転する
。胸腺細胞によるマスキングの欠失及び胸腺萎縮による抗原の緊密な近接性は、
この発現の増大を説明するであろう。代わりに、発達中の胸腺細胞は、これらの
抗原の発現に対して必要なコントロール機構を提供するかもしれず、かくしてこ
れらが枯渇した場合、発現はコントロールされない。MTS20及びMTS24によって検
出される原始上皮抗原は、高齢の胸腺において発現を増大するが、去勢後皮質髄
質接合部で上皮のサブポケットに逆転する。これは、高齢のマウスにおいてこの
上皮前駆体サブタイプが分化するためのシグナルの欠失を示す。性ステロイドに
よって置換されるブロックの除去で、これらの抗原は皮質上皮抗原を発現するよ
うに分化できる。

【０１０４】上述の発見は、発達のために必要な刺激を発達中の胸腺細胞に提供することが
できないようにする胸腺上皮における弱点を示す。しかしながら、胸腺上皮及び
胸腺細胞の共生性は、性ステロイドの影響による破壊の正確な経路を確認するこ
とを困難にする。髄質上皮は、その正確な発達及び維持のため皮質Ｔ細胞を必要
とする。かくして、もしこの集団が減少するなら、髄質胸腺細胞は発達のための
十分なシグナルを受け取れないであろう。これは特にCD8⁺集団に影響するようで
ある。TRF⁺マウスは、CD8⁺Ｔ細胞の減少した数を示す。それ故、これらの細胞の
増殖能力を測定することは興味深いであろう。

【０１０５】観察されたTN1サブセットの増殖の弱点は、皮質上皮の損失が、TCR遺伝子再生
列の必須の段階で胸腺細胞発達に影響することを示し、それによって皮質上皮が
、胸腺生成のために必要なIL-7及びSCFのような因子を提供することを示す(Godf
rey及びZlontik, 1990; Aspinall, 1997)。実際、IL-7⁺及びIL-7R⁺マウスは、高
齢のマウスで観察されるものに類似した胸腺形態を示す(Wiles等, 1992; Zlonti
k及びMoore, 1995; von Freeden-Jeffy, 1995)。さらなる実験が、年齢と共なる
IL-7及びIL-7Rの変化を測定するために必要である。

【０１０６】結論を言うと、高齢の胸腺は、未だその機能的能力を維持するが、高齢のマウ
スで発達する胸腺細胞は、胸腺微環境の構造的完全性の欠如のため、正常な若い
マウスで観察されるような胸腺上皮細胞による厳しいコントロールの下には存し
ない。かくしてこれらの細胞の増殖、分化及び移動は、最適な調節の下にはなく
、末梢における自己反応性／免疫機能不全Ｔ細胞の増大した放出を引き起こすで
あろう。TN及び特にCD8⁺集団の両者の弱点は、年齢と共に末梢Ｔ細胞プール内で
観察される変化を引き起こすであろう。さらに我々は、胸腺上皮細胞発達及び再
構成に対する去勢の効果を詳細に記載した。ステロイドレセプター結合アッセイ
を使用する胸腺萎縮を支える機構、及び去勢後の胸腺再生における胸腺上皮サブ
セットの役割は、現在研究中である。去勢による胸腺機能の回復は、末梢Ｔ細胞
プールを再生するための必須の手段を提供し、かくして免疫抑制患者における免
疫の再確立を引き起こす。

【０１０７】胸腺構造及びＴ細胞集団に対する去勢の影響を、免疫欠損の動物モデルにおい
て調べた。特に実施例２は、サブ致死的な放射線照射とシクロホスファミド治療
の後の免疫系の回復に対する去勢の効果を調べた。免疫欠損のこれらの形態は、
DNA合成を阻害するように機能し、それ故迅速に分裂細胞を標的化する。胸腺に
おいてこれらの細胞は、主に非成熟の皮質胸腺細胞であるが、全てのサブセット
が影響される(Fredrickson及びBasch, 1994)。正常な健康な高齢のマウスにおい
ては、末梢Ｔ細胞における質的量的な偏りは、ほとんど病理学的状態を導かない
。しかしながら、Ｔ細胞再生に対する胸腺の減少した能力のため、Ｔ細胞のひど
い枯渇に引き続き主要な問題が生じる。上記障害はHIV/AIDSで生じ、特にガンの
治療における化学療法及び放射線療法に引き続いて生じる(Mackall等, 1995)

【０１０８】サブ致死的な放射線照射及びシクロホスファミドで治療されたマウスにおいて
、去勢は胸腺再生を顕著に促進する。去勢は免疫欠損と同日または数日前に実施
され、胸腺再生に対する、外科的去勢に応答する主にコルチコステロイド誘導性
のストレスの効果を評価した。胸腺細胞性及び構造の増大が、免疫欠損の一週間
程度の早期で観察されるが、去勢後２週間で主要な差異が観察された。これは、
免疫欠損の同日及び１週間前に去勢を実施したいずれでの場合でもあてはまった
。

【０１０９】免疫組織学的的な方法により、全ての場合で去勢の２週間後で胸腺構造が表現
型的に正常であるようであることが示された一方、非去勢マウスの構造は破壊さ
れていた。Pan上皮マーカーは、免疫欠損が皮質上皮の崩壊を引き起こし、非去
勢マウスの胸腺における去勢構造の一般的破壊を引き越すことを示した。髄質マ
ーカーは、この発見をサポートした。興味深いことに、去勢誘発性の胸腺再生の
第一の特徴の一つは、MTS16によって同定される細胞外マトリックスの顕著な上
流調節であった。

【０１１０】フローサイトメトリー分析は、免疫蛍光に対応する、去勢マウスにおける全て
の胸腺細胞サブセットの細胞数の有意な増大を示した。各時点で、免疫欠損及び
去勢に引き続き、CD4、CD8及びαβTCRで定義されるサブセットの全ての同調的
な増大が存在した。これは異常だが一貫した結果である；Ｔ細胞発達は進行的な
プロセスであるため、前駆体細胞(CD4^-CD8^-型内に含まれる)の初期の増大が存在
し、これは最初の時点のまで存在しているであろう。さらに、前駆体は全胸胞細
胞の非常に小さな割合を表すため、その数のシフトは検出可能ではないであろう
。マクロファージ及び顆粒球を含む他の細胞に対する去勢の効果もまた分析した
。一般的に、胸腺内のマクロファージ及び顆粒球数はほとんど変化しなかった。

【０１１１】免疫欠損の放射線照射及びシクロホスファミドモデルにおいて、胸腺細胞数は
、治療後２週ごとにピークを生じ、治療後４週で減少した。放射線照射または化
学療法のほぼ直後、胸腺重量及び細胞性は劇的に減少し、約５日後、胸腺再生の
第一期が始まった。再生の第一の波(5-14日目)は、放射線耐性胸腺細胞（主に二
重ネガティブ）の増殖によって生じ、それは全ての胸腺細胞サブセットで上昇し
た(Penit及びEzine 1989)。16から22日目の間で観察される第二の減少は、骨髄
による胸腺前駆体の減少した生産と結びつけられる放射線耐性細胞の制限された
増殖能力のためであった（それはまた放射線照射によって影響される）。第二の
再生期は、骨髄由来前駆体での胸腺の補充のためであった(Huiskamp等, 1983)。

【０１１２】成体のマウスにおいて、HSCから成熟Ｔ細胞への発達は約２８日かかることに
注意することは重要である(Shortman等, 1990)。それ故、治療後４週までで末梢
Ｔ細胞の変化が観察されなかったことは驚くべきことではない。末梢は、いくつ
かの胸腺流出によってサポートされているであろうが、治療の４週後までで末梢
で見出されるＴ細胞の大多数は、枯渇した細胞の不在を拡大する増殖中のシクロ
ホスファミドまたは放射線照射耐性クローンであると予測されるであろう。末梢
におけるいくつかの長期的変化が去勢後に予測され、その中には、最も重要なこ
とに胸腺流出の増大によるTCRレパートリーの多様化が含まれる。去勢は、Ｂ細
胞、マクロファージ及び顆粒球を含む他のリンパ球の末梢での回復には影響しな
かった。

【０１１３】実施例４は、同系の遺伝子導入的な骨髄移植に対する去勢の影響を示す。Star
zl等(1992)は、リンパ組織及び非リンパ組織において明らかな微環境が、異系移
植に対する適切な診断的指標であることを報告した。つまり、それらは移植片に
対する寛容の誘導に対して必要であることが仮定される(Starzl等, 1992)。ドナ
ー由来の樹状細胞が、これらのキメラにおいて存在し、移植片の拒絶の回避にお
いて重要な役割を果たしていると解される(Thomson及びLu 1999)。樹状細胞は、
胸腺のネガティブな選択プロセスにおいて鍵となる因子であることが周知であり
、もしドナー由来樹状細胞が受容者胸腺において存在するのであれば、Ｔ細胞に
反応性の移植片は排除されるであろう。

【０１１４】去勢が増大するキメラの形成を可能にするかどうかを測定するために、同系胎
児肝移植を使用する研究を実施した。この結果は、去勢マウスの胸腺の増大した
再生を示した。これらの傾向は、実験を遺伝子導入(Ly5)マウスを使用して繰り
返した場合に再び観察された。遺伝子導入マーカーの存在のため、マウスのキメ
ラ状態を評価することが可能であった。胎児肝再生の２週間程度の早期で、共生
において検出可能なドナー由来樹状細胞が存在し、去勢マウスにおける数は、非
去勢マウスのものより４倍高かった。再生の４週後、非去勢マウスはドナー由来
細胞で再構成されていないようであり、去勢がキメラ形成の可能性を実際に増大
することを示唆した。去勢が致死的放射線照射と胎児肝再生の後に胸腺再生を増
大するだけでなく、胸腺におけるドナー由来樹状細胞の数をも増大することを考
慮して、幹細胞移植と合わせてこのアプローチは移植片の許容性の可能性を増大
する。

【０１１５】数多くの変形及び／または修正が、広く記載された本発明の精神または範囲か
ら離れることなく、特異的な実施態様に示された本発明になすことができること
は、当業者に明らかであろう。それ故本実施態様は、全て説明の観点において考
慮されるべきであり、制限的なものとして考慮されるべきではない。

【０１１６】「参考文献」

【図面の簡単な説明】

【図１】去勢前後の胸腺細胞数の変化。胸腺萎縮は、年齢に伴った胸腺細
胞数の顕著な低減をもたらす。去勢後２週間までに、細胞数は若い成体(young a
dult)のレベルにまで増加した。去勢後３週間までに、若い成体から顕著に増大
し、去勢から４週間後までに安定化した。^*** ＝若い成体（２ｍｔｈ）の胸腺とは顕著に異なる、ｐ＜０．００１

【図２】（Ａ）脾臓数は、年齢によらず、および、去勢後も一定のままで
ある。末梢におけるＢ：Ｔ細胞比も一定のままであるが（Ｂ）、ＣＤ４：ＣＤ８
比は、年齢に伴って顕著に（ｐ＜０．００１）低減し、ｅｘ後(post-ex)４週ま
でに正常な若いレベルにまで復帰する。

【図３】年齢にともなった、および、去勢後のＣＤ４対ＣＤ８胸腺細胞群
のＦＡＣＳプロフィール。各象限のパーセントが、各プロットの上に記載されて
いる。胸腺細胞の部分母集団は年齢によらず一定のままであり、去勢後の胸腺細
胞の同期増加があった。

【図４．１】ＢｒｄＵのパルスの取り込みにより検出される胸腺細胞の増
殖。増殖性胸腺細胞の比率は、年齢によらず、また、去勢後も一定のままであっ
た。

【図４．２】胸腺細胞サブセットの増殖に対する年齢および去勢の影響。
（Ａ）全増殖集団を構成する各サブセットの比率。増殖集団内のＣＤ８＋Ｔ細胞
の比率が顕著に増加した。（Ｂ）増殖性の各部分母集団のパーセント。ＴＮおよ
びＣＤ８サブセットは、２ヶ月よりも２年で顕著に低い増殖を示した。去勢から
２週間後に、ＴＮ群は正常な若いレベルの増殖に回復したが、ＣＤ８群は、増殖
に顕著な増大を示した。このレベルは、去勢後４週間まで、正常な若いレベルと
同じであった。（Ｃ）全ＴＮ増殖は、年齢によらず、かつ、去勢後でも一定のま
まであったが、年齢に伴うＴＮ１部分母集団の増殖における顕著な低減は、去勢
後４週間まで正常レベルに回復しなかった（Ｄ）。^***＝高度に顕著、ｐ＜０．
００１、^**＝顕著、ｐ＜０．０１

【図５】ＩＴＦＩＴＣラベリングにより調べられた１年および２年マウ
スからの移動速度。若い成体移動速度は、一日に１％であった。使用したコント
ロールは、非注射の動物であった。移動速度は、年齢によらず一定のままであっ
た。

【図６】シクロホスファミド、化学療法剤で処置した後の胸腺、脾臓およ
びリンパ節細胞数の変化。処置から１および２週間後において、非去勢（シクロ
のみ）群と比較して、去勢した動物の胸腺の急速な膨張がある。さらに、去勢群
の脾臓およびリンパ節数は、シクロホスファミドのみの群と比較して増大した。
４週までに、細胞数が正常化された（ｎ＝処置群および時点当たり３−４）。

【図７】照射（６２５Rads）後の胸腺、脾臓およびリンパ節細胞数の変化
。処置から１および２週間後において、非去勢（照射のみ）群と比較して、去勢
した動物の胸腺の急速な膨張がある。４週までに、細胞数が正常化された（ｎ＝
処置群および時点当たり３−４）。

【図８】照射後の胸腺、脾臓およびリンパ節細胞数の変化。処置から１お
よび２週間後において、非去勢群と比較して、去勢した動物の胸腺の急速な膨張
がある。しかしながら、観察された差異は、マウスが処置の１週間前に去勢され
た場合ほど明瞭ではなかった（図８）。４週までに、細胞数が正常化された（ｎ
＝処置群および時点当たり３−４）。

【図９】シクロホスファミド、化学療法剤で処置した後の胸腺、脾臓およ
びリンパ節細胞数の変化。処置から１および２週間後において、非去勢（シクロ
ホスファミドのみ）群と比較して、去勢した動物の胸腺の急速な膨張がある。さ
らに、去勢群の脾臓およびリンパ節数は、シクロホスファミドのみの群と比較し
て増大していた。４週までに、細胞数が正常化された（ｎ＝処置群および時点当
たり３−４）。化学去勢は、シクロホスファミド処置後の免疫システムの再生に
おいて外科的去勢に匹敵するものであった。

【図１０】ＨＳＶ−１で肉趾を免疫化した後のリンパ節細胞性(cellulari
ty)。非去勢群と比較して、去勢後の年をとったものにおいて増大した細胞性が
認められる。下のグラフは、ＦＡＣＳによってＣＤ２５対ＣＤ８細胞にゲート化
(gated)された全活性化細胞数を図示する。

【図１１】ＨＳＶ−１免疫化後のリンパ節における活性化細胞集団を示す
フローサイトメトリードットプロットの例。活性化細胞は、ＣＤ２５／ＣＤ８二
重陽性である。

【図１２】ＨＳＶ−１接種後の活性化ＬＮにおけるＣＴＬのＶβ１０発現
。年をとったマウスにおけるクローナル応答のジムニション(dimunition)および
去勢後の予想される応答のレインステーション(reinstation)が認められる。

【図１３】Ｌｙ５コンジェニックマウスの骨髄移植後の胸腺、脾臓、リン
パ節および骨髄細胞数の変化。処置後いずれの時点においても、非去勢群と比較
して、去勢した動物の胸腺の急速な膨張がある。さらに、去勢群の脾臓およびリ
ンパ節数は、シクロホスファミドのみの群と比較して増大していた。（ｎ＝処置
群および時点当たり３−４）。去勢されたマウスは、非去勢のマウスと比較して
、コンジェニック（Ｌｙ５．２）細胞を顕著に増加した（データ示さず）。

【図１４】胎児肝臓再形成後の去勢および非去勢マウスにおける胸腺細胞
数の変化。ｎ＝各試験群につき３−４．（Ａ）２週目に、去勢したマウスの胸腺
細胞数は、正常なレベルであり、非去勢マウスと比べて顕著に高かった（＊ｐ≦
０．０５）。４週後の去勢されたマウスの胸腺に肥大が観察された。非去勢細胞
数は、コントロールレベル以下のままであった。（Ｂ）ＣＤ４５．２⁺細胞−Ｃ
Ｄ４５．２⁺は、ドナー由来を示すマーカーである。再形成から２週後、ドナー
由来細胞は、去勢マウスと非去勢マウスの両方に存在した。処置から４週後に、
去勢された胸腺の約８５％の細胞がドナー由来であった。非去勢胸腺にはドナー
由来細胞はなかった。

【図１５】致死照射および胎児肝臓再形成後のＣＤ４対ＣＤ８ドナー由来
胸腺細胞集団のＦＡＣＳプロフィール。各象限のパーセントは、各プロットの右
に与えられている。年齢にあったコントロールプロフィールは、８ヶ月齢のＬｙ
５．１コンジェニックマウス胸腺のものである。去勢および非去勢マウスのもの
は、ＣＤ４５．２⁺細胞にゲートされており、ドナー由来細胞のみを示す。再形
成から２週間後、胸腺細胞の部分母集団は、去勢マウスと非去勢マウスとの間で
異ならなかった。

【図１６】致死照射、胎児肝臓再形成および去勢後の脊髄およびリンパ樹
状細胞（ＤＣ）数。ｎ＝各試験群あたり３−４匹のマウス。以下のグラフのコン
トロール（白色）バーは、未処理の年齢が適合したマウスに見出される樹状細胞
の正常な数に基づいている。（Ａ）ドナー由来骨髄樹状細胞 − 再形成から２
週間後、ＤＣは、非去勢マウスに正常レベルで存在した。同時点では、去勢マウ
スにより多くのＤＣが認められた（^*ｐ≦０．０５）。４週後には、去勢マウス
においてＤＣ数はコントロールレベル以上のままであった。（Ｂ）ドナー由来リ
ンパ樹状細胞 − 再形成から二週後に、去勢マウスにおけるＤＣ数は、非去勢
マウスの二倍であった。処置から４週後、ＤＣ数は、コントロールレベル以上の
ままであった。

【図１７】胎児肝臓再形成後の去勢および非去勢マウスにおける全体およ
びＣＤ４５．２⁺骨髄細胞数の変化。ｎ＝各試験群あたり３−４匹のマウス。（
Ａ）全細胞数 − 再形成から二週後、骨髄細胞数は正常化し、去勢および非去
勢マウス間の細胞数には顕著な差が認められなかった。再形成から二週後、去勢
および非去勢マウス間の細胞数には顕著な差が認められた（^*ｐ≦０．０５）。
（Ｂ）ＣＤ４５．２⁺細胞数 − 再形成から二週後には、骨髄におけるＣＤ４
５．２⁺細胞数に関して去勢および非去勢マウス間に顕著な差異は認められなか
った。ＣＤ４５．２⁺細胞数は、４週目の去勢マウスにおいて高いままであった
。同時点において非去勢マウスにドナー由来細胞は認められなかった。

【図１８】胎児肝臓再形成後の骨髄における骨髄およびリンパ由来樹状細
胞（ＤＣ）およびＴ細胞の変化。ｎ＝各試験群あたり３−４匹のマウス。以下の
グラフのコントロール（白色）バーは、未処理の年齢が適合したマウスに見出さ
れる樹状細胞およびＴ細胞の正常な数に基づいている。（Ａ）Ｔ細胞数 − 去
勢および非去勢マウスの両方において、再形成後２および４週で数が減少した。
（Ｂ）ドナー由来骨髄樹状細胞 − 再形成から二週間後に、去勢および非去勢
マウスの両方においてＤＣ細胞数は正常であった。この時点で、去勢および非去
勢マウスの数において顕著な差異はなかった。（Ｃ）ドナー由来リンパ樹状細胞
− 数は、再形成から２および４週後に正常なレベルであった。二週目で、去
勢および非去勢マウスにおいて、数に顕著な差は認められなかった。

【図１９】胎児肝臓再形成後の去勢および非去勢マウスにおける全体およ
びＣＤ４５．２⁺脾臓細胞数の変化。ｎ＝各試験群あたり３−４匹のマウス。（
Ａ）全細胞数 − 再形成から二週後、細胞数は低減し、去勢および非去勢マウ
ス間の細胞数には顕著な差が認められなかった。再形成から４週後、去勢マウス
において細胞数は正常レベルに達しつつあった。（Ｂ）ＣＤ４５．２⁺細胞数
− 再形成から二週後には、脾臓におけるＣＤ４５．２⁺細胞数に関して去勢お
よび非去勢マウス間に顕著な差異は認められなかった。ＣＤ４５．２⁺細胞数は
、４週目の去勢マウスにおいて高いままであった。同時点において非去勢マウス
にドナー由来細胞は認められなかった。

【図２０】胎児肝臓再形成後のＴ細胞および骨髄およびリンパ由来樹状細
胞（ＤＣ）における脾臓の変化。ｎ＝各試験群あたり３−４匹のマウス。以下の
グラフのコントロール（白色）バーは、未処理の年齢が適合したマウスに見出さ
れる樹状細胞およびＴ細胞の正常な数に基づいている。（Ａ）Ｔ細胞数 − 去
勢および非去勢マウスの両方において、再形成後２および４週で数が減少した。
（Ｂ）ドナー由来骨髄樹状細胞 − 再形成から２および４週間後に、去勢およ
び非去勢マウスの両方においてＤＣ数は正常であった。２週後、去勢および非去
勢マウスの数において顕著な差異はなかった。（Ｃ）ドナー由来リンパ樹状細胞
− 数は、再形成から２および４週後に正常なレベルであった。二週目で、去
勢および非去勢マウスの数において、顕著な差は認められなかった。

【図２１】胎児肝臓再形成後の去勢および非去勢マウスにおける全体およ
びＣＤ４５．２⁺リンパ節細胞数の変化。ｎ＝各試験群あたり３−４匹のマウス
。（Ａ）全細胞数 − 再形成から二週後、細胞数は正常レベルであり、去勢お
よび非去勢マウス間の細胞数には顕著な差が認められなかった。再形成から４週
後、去勢マウスにおいて細胞数は正常レベルであった。（Ｂ）ＣＤ４５．２⁺細
胞数 − 再形成から二週後には、リンパ節におけるＣＤ４５．２⁺細胞数に関
して去勢および非去勢マウス間に顕著な差異は認められなかった。ＣＤ４５．２ ⁺ 細胞数は、４週目の去勢マウスにおいて高いままであった。同時点において非
去勢マウスにドナー由来細胞は認められなかった。

【図２２】胎児肝臓再形成後の腸間膜リンパ節における骨髄およびリンパ
由来樹状細胞（ＤＣ）およびＴ細胞の変化。ｎ＝各試験群あたり３−４匹のマウ
ス。以下のグラフのコントロール（白色）バーは、未処理の年齢が適合したマウ
スに見出される樹状細胞およびＴ細胞の正常な数に基づいている。（Ａ）Ｔ細胞
数 − 去勢および非去勢マウスの両方において、再形成後２および４週で数が
減少した。（Ｂ）ドナー由来骨髄樹状細胞 − 再形成から二週間後に、去勢お
よび非去勢マウスの両方においてＤＣ細胞数は正常であった。４週目でこれらは
低減した。２週目で、去勢および非去勢マウスの数において顕著な差異はなかっ
た。（Ｃ）ドナー由来リンパ樹状細胞 − 数は、再形成から２および４週後に
正常なレベルであった。二週目で、去勢および非去勢マウスにおいて、数に顕著
な差は認められなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 15/00 Ａ６１Ｐ 35/00 31/18 37/04 35/00 37/06 37/04 Ａ６１Ｋ 37/02 37/06 37/43 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C084 AA02 AA03 BA01 BA17 BA44 DB09 NA14 ZA812 ZB082 ZB092 ZB262 ZC032 ZC552 4C085 AA02 CC03 FF21 4C206 AA01 AA02 GA31 MA01 MA04 NA14 ZA81 ZB09 ZB26 ZC02 ZC55

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抑制されたまたは異常なＴ細胞の群または機能を有する患者
において、Ｔ細胞群構成を変更またはＴ細胞数を増加させる方法であって、患者
の胸腺に対する性ステロイドシグナル伝達を途絶することを含む方法。
【請求項２】Ｔ細胞群構成の変更が、機能的に、および／または、特徴的
な分子の発現により定義されたＴ細胞サブセットの性質および／または比率の変
更を特徴とし、前記特徴的な分子は、Ｔ細胞レセプター、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ
３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ６９からなる群から
選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】患者における前記Ｔ細胞数の増加が、他のリンパ細胞と比較
してＴ細胞数の相対的増加をもたらすものである、請求項１または２記載の方法
。
【請求項４】他のリンパ細胞がＢ細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項５】抑制されたまたは異常なＴ細胞の群または機能を有する患者
が、ガン、ヒト免疫不全ウイルス感染、自己免疫疾患、過敏性疾患または子宮内
膜症からなる群から選択された症状を患っている、請求項１ないし４のいずれか
一項に記載の方法。
【請求項６】ガン患者が、化学療法および／または放射線治療および／ま
たは骨髄移植を受けたことがある、請求項５記載の方法。
【請求項７】ヒト免疫不全ウイルス感染を有する患者がＡＩＤＳを有する
、請求項５記載の方法。
【請求項８】患者が思春期後である、請求項１ないし７のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項９】患者の内在性のＴ細胞群を除去し、かつ、胸腺への性ステロ
イドシグナル伝達を途絶することを含む、自己免疫疾患患者の治療方法。
【請求項１０】患者に骨髄移植を行うことをさらに含む、請求項９記載の
方法。
【請求項１１】Ｔ細胞群が、患者を化学療法または放射線照射に曝すこと
によって除去される、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】患者の胸腺への性ステロイドシグナル伝達の途絶、および
、抗原の投与を含む、患者における抗原に対する免疫応答を強化するための方法
。
【請求項１３】抗原が、感染性因子または腫瘍細胞に由来する、請求項１
２記載の方法。
【請求項１４】患者がガンを患っている、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】患者が感染症を患っている、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】抗原が、投与前にアジュバントと混合される、請求項１２
ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】臓器移植後の患者における宿主対移植片反応を低減する方
法であって、以下の工程：患者のＴ細胞を除去する工程；患者の胸腺に対する性ステロイドシグナル伝達を途絶する工程；および患者にドナーの臓器を移植する工程を含む方法。
【請求項１８】ドナーから患者に骨髄を移植する工程をさらに含む、請求
項１７記載の方法。
【請求項１９】胸腺への性ステロイドシグナル伝達が、性ステロイド産生
を阻害することによって、あるいは、胸腺内の性ステロイドレセプターをブロッ
クすることによって途絶される請求項１ないし１８のいずれか一項に記載の方法
。
【請求項２０】性ステロイド産生の阻害が、去勢または性ステロイドアナ
ログの投与のいずれかによって行われる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】性ステロイドアナログが、ユーレキシン、ゴセレリン、ロ
イプロリド、ジオキサラン誘導体、例えばトリプトレリン、メテレリン、ブセレ
リン、ヒストレリン、ナファレリン、ルトレリン、ロイプロレリン、および黄体
化ホルモン放出ホルモンアナログからなる群から選択される、請求項２０記載の
方法。
【請求項２２】性ステロイドアナログが、黄体化ホルモン放出ホルモンの
アナログである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】黄体化ホルモン放出ホルモンアナログが、デスロレリンで
ある、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】性ステロイドアナログが、持続性ペプチド放出製剤によっ
て投与される、請求項１ないし２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】患者の抗原に対する免疫応答を増強する組成物であって、
アジュバント、抗原、および黄体化ホルモン放出ホルモンのアナログを含む組成
物。
【請求項２６】患者が哺乳動物である、請求項１ないし２４のいずれか一
項に記載の方法。
【請求項２７】哺乳動物がヒトである、請求項２６記載の方法。