KR20060025134A - 흉선 재활성화 이전에 이식체에 대한 허용성을 유도하는방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자의 성 스테로이드 매개 시그널링을 파괴시켜, 골수 또는 그외 면역 세포의 기능성을 흉선의 재활성화 없이, 재활성화 이전에 또는 재활성화와 동시에 향상시키는 단계를 포함하는, 수용체에서 미스매치되는 기관, 조직 및 /또는 세포 공여체에 대한 허용성을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 예로서, 성 스테로이드 시그널링은 LHRH 작용제, LHRH 길항제, 항-LHRH 리셉터 항체, 항-LHRH 백신, 항-안드로겐, 항-에스트로겐, 선택적 에스트로겐 리셉터 모듈레이터(SERM), 선택적 안드로겐 리셉터 모듈레이터(SARM), 선택적 프로게스테론 반응 모듈레이터(SPRM), ERD, 아로마타제 저해제, 또는 이들의 여러가지 혼합물의 투여에 의해 중지 또는 제거된다.

허용성, 이식, 성 스테로이드 매개 시그널링

Description

흉선 재활성화 이전에 이식체에 대한 허용성을 유도하는 방법{TOLERANCE TO GRAFT PRIOR TO THYMIC REGENERATION}

본 발명은 세포 면역학 및 이식체 이식 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 골수의 조혈 및 기능성 증진, 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)후 BM 생착 증진 및 기존재하는 T 세포와 그외 면역계 세포의 기능성 증가에 관한 것이다. 또한 본 발명은 수용체에 의한 동종이형의 이식체에 대한 허용성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

면역 시스템의 주된 기능은, "자가"(즉 체내에서 유래된) 항원으로부터 "외부"(즉, 체외 임의 기원으로부터 유래된) 항원을 구별하고, 그에따라 반응하여 감염으로부터 신체를 보호하는 것이다. 보다 실제적으로, 면역 반응은 위험한 시그널에 반응하는 것으로 설명된다. 이러한 위험한 시그널은 세포/조직이 더이상 "정상"이 아닌지 의심스러운 면역계 세포를 경계하는 세포 또는 조직 특성상의 모든 변화일 수 있다. 이러한 경계는, 예컨대 바이러스, 세균, 기생충 및 진균 감염과 같은 외부 물질들에 대한 거부를 초래하는데 매우 중요할 수 있으며; 또한 항암 반응을 유도하는데 이용될 수 있다. 그러나, 자가 세포의 부적절한 세포 변화는 면역계에 표적이 되기에(예, 당뇨병에서의 이자의 β-섬 세포), 이러한 위험 시그널 들은 또한 일부 자가 면역 질환들의 개시 이유가 될 수 있다. 또한 면역 세포 스스로의 부적절한 자극으로, 초기 반응을 유도한 외부 세포 또는 미생물 뿐만 아니라 자신의 정상 세포의 파괴를 유발할 수 있다.

정상적인 면역 반응에서, 일련의 사건들에는 외부 항원을 포획하여 표면의 주 조직적합성 복합체(MHC)의 틈(cleft)에 작은 펩티드 절편이 위치하도록 처리하는 항원 표시 세포(APC)가 관여한다. MHC 분자는 모든 유핵 세포상에 발현되는 클래스 I(세포독성 T 세포(Tc 또는 CTL)에 의해 인지됨) 또는 면역계 세포들에 의해 일차적으로 발현되는 클래스 II(헬퍼 T 세포(Th)에 의해 인지됨)중 하나일 수 있다. Th 세포는 APC 상의 MHC II/펩티드 복합체를 인지하고 반응한다. 이런 세포들에 의해 분비된 인자들은 이후 Tc 세포 또는 특정 항원에 특이적인 항체를 생산하는 B 세포중 어느 하나나 또는 둘다의 활성화를 촉매한다. 실제 모든 면역 반응에서 Th 세포의 중요성은, 바이러스에 의한 파괴로 부재하는 경우 심각한 면역 결핍을 초래하고 궁극적으로는 기회 감염으로 인해 죽음에 도달하게 하는 HIV/AIDS에서 가장 잘 설명된다. 부적절한 Th 발생(및 보다 적은 범위의 Tc)은 또한 알레르기, 암 및 자가면역과 같은 기타 다양한 질병을 유발할 수 있다.

이러한 세포의 부절적한 발생은, 구조 조직체가 주로 변이된, 예컨대 많은 자가면역 질환에서 비정상적인 흉선에 의한 것일 수 있으며, 흉선이 성숙하는데 필요한 수질 상피 세포(medullary 상피 cell)는 미성숙한 T 세포가 정상적으로 체류하는 피질에서 이소적으로(etopically) 발현된다. 이는, 발생중인 미성숙 T 세포가 이른 시기에 후기 단계의 성숙 시그널을 받아, 잠재적인 자가반응성 세포를 정 상적으로 제거하는 음성 선별(negative selection) 시그널에 대해 무반응성이 되는 것을 의미할 수 있다. 실제 이러한 흉선의 비정상성은, 루푸스 유사 증상을 발현하는 NZB 마우스(Takeoka et al., (1999) Clin. Immunol. 90: 388), 최근에는 1형 당뇨병의 NOD 마우스(Thomas-Vaslin et al., (1997) P.N.A.S. USA 94: 4598; Atlan-Gepner et al.,(1999) Autoiinniunity 3:249-260)에서 발견되었다. 흉선의 비정상성이 언제 어떻게 발생되는진 알려져 있지 않지만, 자연적인 노화 과정이나 또는 바이러스 감염(AIDS 환자들에서 흉선의 변화가 확인되었다), 스트레스, 화학요법 및 방사선 치료와 같은 해로운 물질들에 의한 것일 수 있다(Mackall et al., (1995) N. Eng. J. Med. 332: 143; Heitger et al., (1997) Blood 99: 4053; Mackall and Gress, (1997) Immunol. Rev. 160: 91). 또한 출생시 결함이 존재할 가능성도 있다.

항원 인지력은 T 및 B 림프구의 원형질 막 리셉터에 있다. 이러한 리셉터들은 여러가지 가능한 유전자의 복잡한 재배열 연속에 의해 무작위적으로 형성된다. 이런 막대한 잠재적인 다양성은, 체내에서 부딪칠 수 있는 임의의 단일 항원에 대하여 다수의 림포구가 다양한 결합 강도(친화성)로 그것을 인지하여 여러 정도의 반응을 유발할 것임을 의미힌다. 항원 수용체 특이성은 기회에 의해 수득되므로, 따라서 왜 신체는 자가 항원에 반응하는 림프구에 의해 자신이 파괴되지 않는지에 대한 의문이 생긴다. 다행히도, T 및 B 세포가 그렇게 행동하도록 방지하는 몇가지 기작이 있다. 이러한 기작들은 총괄적으로 면역 시스템이 자신을 허용하는 상태를 창출한다.

자기 허용의 가장 효과적인 형태는, 잠재적인 반응성 림프구를 발생된 부위에서 물리적으로 제거하거나 또는 사멸시키는 것이다. 이러한 부위로는 T 세포는 흉선이고, B 세포는 BM이다. 이를 중추 허용성(central tolerance)이라고 한다. 중요한 추가적인 허용법은, 직접적으로 또는 사이토카인의 생성을 통해 자가 반응성 세포를 저해하는 조절성 Th 세포를 통한 것이다. 실제 모든 면역반응들에는 T 헬퍼 세포에 의한 개시 및 조절이 필요하므로, 모든 허용 유도책의 주 목적은 T 헬퍼 세포를 겨냥한다. 이와 유사하게, Tc는 매우 중요한 작동세포(effector)이므로, 이의 생산은 예컨대 항암 및 항-바이러스 치료에 주된 표적이다. 또한 CD4+CD25+ 및 NKT 세포와 같은 T 조절성 세포(Treg)는 잠재적인 자가반응성 세포를 억제할 수 있는 수단을 제공한다.

흉선

흉선은 본질적으로 미세환경을 구성하는 다양한 기질 세포(stromal cell)(상피세포 서브세트가 우세적임)내에 산재된 발생중인 흉선세포(흉선내 T 림프구)로 이루어져 있으며, T 세포의 최적 발생에 필수적인 성장 인자(GF) 및 세포의 상호작용을 제공한다.

흉선은 T 림프구 생산 개시 부위이므로 면역 시스템에 매우 중요한 기관이다. 흉선의 역할은 하기와 같이 혈액으로부터 BM으로부터 유래된 적합한 전구 세포를 유인하여 이들을 T 세포 계통으로 유도하는 것이며, 항원에 대한 T 세포 리셉터(TCR)의 생산에 필수적인 유전자 재배열을 포함한다. 각 T 세포는 하나의 TCR 타입을 가지며, 그 특이성은 고유한 것이다. TCR 생산과 관련된 세포의 분열로 그 TCR 타입을 가지는 T 세포의 수가 늘어나고 따라서 각 외부 항원이 인지되어 제거될 가능성이 증가된다. 그러나, B 세포와는 달리, T 세포의 항원을 인식하는 독특한 특성은, TCR 만이 MHC 분자와 물리적으로 조합된 펩티드 절편을 인지하는 것이다. 이는 자가 MHC이고 자가 MHC/펩티드 복합체를 인지하는 능력 또는 TCR은, 흉선에서 선택된다. 이러한 과정을 양성 선별(positive selection)이라고 하며, 피질 상피세포에 한정적인 특징이다. TCR이 자가 MHC/펩티드 복합체에 결합하지 못하게 되면, T 세포는 계속적인 생존 및 성숙시 TCR을 통한 일정 정도의 시그널링을 필요로 하지 때문에 T 세포는 "무시"에 의해 사멸된다.

TCR 유전자 재배열 과정은 무작위로 발생되기 때문에, 경우에 따라 자가 MHC/펩티드 복합체를 고친화성으로 인지할 수 있는 일부 T 세포가 발생될 것이다. 따라서, 이러한 T 세포는 잠재적으로 자가 반응적이며, 다발성 경화증(MS), 류마티스 관절염(RA), 당뇨병, 갑상선염 및 전신홍반루푸스(SLE)와 같은 자가면역 질환에 관여할 수 있다. 다행히도, 자가 MHC/펩티드 복합체에 대한 TCR 친화성이 매우 높고 T 세포가 흉선에서 특이적 복합체와 마주치는 경우, 발생중인 흉선세포에는 자살 활성화 진행이 유발되어 세포자살로 사멸하는데 이러한 과정은 음성 선별이라고 한다. 이러한 과정은 또한 중추 허용성이라고 한다. 이런 "자신에 고친화성" T 세포는 흉선에서 여전히 미성숙상태이므로 반응하지 않고 사멸한다. 흉선에서의 음성 선별에 가장 강력한 유발제는 수지상 세포(DC)라 칭하는 APC이다. DC는 T 세포에 가장 강력한 시그널을 전달하여, 흉선에서의 삭제를 초래한다. 그러나 T 세포가 좀더 성숙한 말초 림프 기관에서는, 동일 TCR에 대한 동일한 MHC/펩티드 복합 체가 존재하는 DC가 TCR을 함유한 T 세포의 활성화를 초래한다.

흉선 퇴화 및 시기

흉선은 매일 혈액으로 T 세포 함량의 약 1%를 방출하는 기능적인 면역 시스템에 근간이지만, 외견상 다른 포유류 및 기타 동물에서 성 호르몬 생산의 결과로서 상기 기관의 심각한 퇴화을 겪게 된다. 이러한 퇴화는 약 5-7년에 걸쳐 점차적으로 발생되어 약 20 세에 이르면 T 세포 방출이 최하에 이르고(Douek et al., Nature (1998) 396: 690-695), 이는 코르티코스테로이드에 대한 스트레스성 반응시 유도되는 가역적 퇴화과는 다르다. 구조적으로 흉선 퇴화시 림프구의 점진적 소실, 피질 상피 네트워크의 붕괴, 세포외 기질 물질 증가 및 지방 세포(adipocyte) 및 지질 침전물을 이용한 선(gland) 침윤이 발생된다(Haynes et al., (1999) J. Clin. Invest. 103: 453). 이러한 과정은 5세정도의 어린이에게서도 개시될 수 있지만(Mackall et al., (1995) N. Eng. J. Med. 32: 143), 성 스테로이드가 최대에 달하는 사춘기에 심하게 발생된다.

흉선 퇴화 효과는 말초에서 반영되어, 흉선의 T 세포 풀(pool)로의 유입이 감소되어 다양한 TCR 레페토리가 감소되는 결과가 나타난다(이는 단지 신생 원시(naive) T 세포에 의해서만 제공되므로). 사이토카인 프로파일 변이(Hobbs et al., (1993) J. Immunol. 150: 3602; Kurashimaet al., (1995) Int. Immunol. 7: 97), CD4+ 및 CD8+ 서브세트 변화, 원시 T 세포에 상반되는 기억 T 세포로의 편향성(Mackall et al., (1995) N. Engl. J. Med. 332: 143), 및 항원 또는 미토겐 자극에 대한 반응성 감소 역시 관찰된다.

흉선은 말초 T 세포 풀의 생산 및 유지에 일차적인 부위이므로, 이러한 퇴화는 중년층에서의 면역계 질환의 발생 증가의 일차적인 원인으로 간주되고 있다. 일반적으로, 일반적인 면역결핍, 기회 감염과 백신에 대한 불충분한 반응성, 및 다발 경화증, 류마티스 관절염 및 루푸스와 같은 자가면역질환의 빈도 증가(Doria et al., (1997) Mech. Age. Dev. 95: 131-142; Weyand et al., (1998) Mech. Age. Dev. 102: 131-147; Castle, (2000) Clin Infect Dis 31 (2): 578-585 ; Murasko et al., (2002) Exp.Gerontol. 37: 427-439)와 같은 증상 발병이 증가하고 노화로 심해진다. 면역 시스템의 결핍은 종종 T 세포 의존적인 면역 기능(예, 세포독성 T 세포 활성 및 미토겐 반응) 저하로 종종 설명된다. 조혈 기작은 건강한 개체의 T 세포 수를 유지시키지만, 예컨대 AIDS와 화학 요법 또는 방사선치료 이후에 T 세포가 다수 소실되면, 이러한 모든 증상이 T 세포 및/또는 기타 혈액 세포(하기 참조)의 소실에 관여하기 때문에 어른 환자는 기회 감염될 가능성이 높다. 또한 림프구의 회복 역시 매우 지체된다. 퇴화성 흉선은 HIV 감염시 없어지는 CD4+ T 세포를 재구성할 수 없으며(Douek et al. Nature (1998) 396: 690-695), 사춘기가 지난 환자는 CD4+ T 세포가 화학요법이후에 정상적인 수준으로 회복되는데 사춘기 이전 환자에 비해 3 내지 4개의 시간이 걸린다(Mackall et al. (1995) N. Engl. J. Med. 332: 143-149). 이런 환자들에는 감염 반응에 필요한 세포가 부족하여 면역이 심각하게 억제된다(Mackall et al., (1995) N. Eng. J. Med. 332: 143; Heitger et al., (2002) Blood 99: 4053). 또한 노년에 암 또는 종양 발생이 증가한다(Hirokawa, 1998)"Immunity and Ageing,"in PRINCIPLES AND PRACTICE OF GERIATRIC MEDICINE, (M. Pathy, ed.) John Wiley and Sons Ltd; Doria et al., (1997) Mech. Age. Dev. 95: 131 ; Castle, (2000) Clin. Infect. Dis. 31: 578).

그러나, Douek 등의 최근 연구((1998) Nature 396: 690)에서, 매우 노인들에서(65세 이상 및 HIV 노인 환자의 항-레트로바이러스 치료후) 매우 약하지만(어린이 수치의 약 5%) 흉선에서의 유출(thymic output)이 발생되고 있음이 확인되었다. 이는, T 세포 리셉터 제거 주기(T 세포Receptor Excision Circles(TRECs); TREC는 항원에 대한 TCR 생성의 일부분으로서 형성되며 새롭게 생산된 T 세포에서만 발견된다.)를 가진 T 세포의 존재로 설명되었다. 또한 Timm과 Thoman((1999) J. Imnunol. 162: 711)은, CD4+ T 세포가 나이든 마우스의 골수 이식 후(BMT)에 재생됨에도 불구하고, 흉선에서의 불충분한 원시 T 세포 생산에 연계된 말초 미세 환경의 노화로 인해 기억 세포으로의 편향성을 보임을 확인하였다. 또한 TREC 수치는 조혈성 줄기 세포 이식 이후에 분석되어지고 있다(Douek et al., (2000) Lancet 355: 1875).

흉선 및 신경내분비축(neuroendocrine axis)

흉선은 신경내분비계와의 양방향성 소통으로 막대한 영향을 받는다(Kendall, (1988) "Anatomical and physiological factors influencing the thymicmicroenvironment,"in Thymus UPDATEI, Vol. 1. (M. D. Kendall, and M. A.

Ritter, eds.) Harwood Academic Publishers, p. 27). 특히 중요한 흉선 기능은, 뇌하수체, 부신 및 생식선 사이에 상호작용하는 것이며, 영양 작용(갑상선 자극 호르몬 또는 TSH, 및 성장 호르몬 또는 GH) 및 퇴화 작용(루테인화 호르몬 또는 LH, 여포 자극 호르몬 또는 FSH, 및 부신피질자극 호르몬 또는 ACTH)을 포함한다 (Kendall, (1988) "Anatomical and physiological factors influencing the thymic microenvironment,"in Thymus UPDATEI, Vol.1. (M.D. Kendall, and M. A. Ritter, eds.) Harwood Academic Publishers, p.27; Homo-Delarche et al.,(1993) Springer Sem. Imfaunopathol. 14: 221). 흉선의 생리학적으로 특징적인 특성중 하나는, 인간의 경우 12-14세에 일반적으로 발생하는 사춘기 무렵의 순환성 성 호르몬 생산 증가에 따른, 구조 및 기능의 점진적 감쇠이다(Hirokawa and Makinodan, (1975) J. Immunol. 114: 1659; Tosi et al., (1982) Clin. Exp. Immunol. 47: 497; and Hirokawa, et al., (1994) Immunol. Lett. 40: 269).

흉선은 본질적으로 미세환경을 구성하는 다양한 기질 세포(stromal cell)(상피세포 서브세트가 우세적임)내에 산재된 발생중인 흉선세포로 이루어져 있으며, T 세포의 최적 발생에 필수적인 성장 인자(GF) 및 세포의 상호작용을 제공한다. 상기 호르몬의 정확한 표적과 흉선 퇴화를 유도하고 면역 반응을 향상시키는 기작은, 아직 확인되지 않았다. 그러나 고환이 자성화된 돌연변이 마우스 실험에서, 흉선의 퇴화시 기능적인 성 스테로이드 리셉터가 흉선의 기질 세포에서 발현되어야 함을 나타내었다. 흉선 세포와 이들의 분화와 성숙을 통제하는 상피 서브세트들 간의 발생적 공생 관계는, 성 스테로이드 저해가 각 세포 유형의 수준에서 발생될 수 있으며 다른 세포 유형의 상태에 영향을 미친다는 것을 의미한다. 골수 줄기 세포는 노인 환자들에서 갯수가 감소하고 정성적인 차이가 있다. HSC는 어린이 경우에 비해 낮은 정도이지만 흉선에서 재증식할 수 있다. 따라서 흉선 퇴화에 영향을 미 치는 주된 인자는, 흉선내인 것으로 보인다. 또한 노화된 동물(18개월이상의 동물)의 흉선은 일정 수준이상으로 분화할 수 있는 능력을 유지하고 있다(George and Ritter, (1996) Immunol. Today 17 : 267 ; Hirokawa et al., (1994) Immunology Letters 40: 269; Mackall et al., (1998) Eur. J. I1nmunol. 28: 1886). 그러나 최근 Aspinall에 의해 흉선 생산이 결핍된 마우스에서 전구체 3개 음성 집단, 즉 CD44+CD25+ (TN2) 단계에 속하는 블럭으로 제조되는 것으로 확인되었다(Aspinallet al., (1997) J. Immunol. 158: 3037).

조혈생성

골수 및 조혈 줄기 세포

면역 시스템의 주된 세포는 B 및 T 림프구(백혈구의 주 클래스)와 항원 표시 세포(APC)이다. 모든 면역 세포들은 조혈 줄기 세포(HS)와 이들의 전구체 CLP(Common Lymphoid Progenitor)와 CMP(Common Myeloid Progenitor)에서 유래된 것으로, BM에서 생성된다. 전구 세포의 일부는 흉선으로 이동하여 T 세포 또는 흉선의 DC로 변환된다. DC는 자가-허용을 유발하는 역할을 수행한다.

소량(어린 동물의 경우 약 0.01%)의 HSC만이 BM에서 분비되고, 혈액 공급을 통해 흉선으로 길을 찾으며, 분열 및 성숙을 거쳐 T 세포를 형성하며, 이후 일반적인 순환으로 회귀한다. 이러한 흉선의 이주성 신생 세포들은 면역 시스템의 주요 부분을 형성하며, 일차적으로 Th 및 Tc이며, 거의 모든 면역 반응 개시를 위한 다양한 TCR 레페토리를 가진 신생 T 세포의 계속적인 공급 유지에 중요하다. 흉선을 떠나기 전에, T 세포는 흉선에서 "선별"되어 떠나는 T 세포는 체내 모든 세포를 자 기 것으로 인식하고 정상적인 환경에서 이들에 대해 반응하지 않기 때문에, Th와 Tc 세포는 전술한 바와 같이 외부 항원을 효과적으로 식별할 수 있다.

또한 B 세포는 궁극적으로 HSC에서 유래된 것이며, 말초 면역 시스템으로 배출되기 전에 BM에서 발생된다. T 세포 및 그외 면역 시스템 세포와의 상호작용 이후에, B 세포는 다량의 항체를 생산 및 분비하는 원형질 세포로 발생되어 감염성 생물 및 비정상적인 세포를 파괴하는 것을 돕는다.

BM에서 생성되는 그외 HSC는, 또한 그외 혈액 세포, 예컨대, NK 세포, 조절 세포, 공통 골수 전구체 유래 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 혈소판 및 적혈구를 생산하는데 활용된다.

조혈 줄기 세포 이식

조혈 줄기 세포 이식(HSCT) - 또한 골수 이식(BMT)이라고도 함 - 은 예컨대 중요한 특정 암 증상에서 면역 시스템 회복을 증진하기 위해 사용되는 치료법이다. "HSCT" 및 "BMT" 및 "이식"은 호환적으로 사용되며, 이하 수용체로의 이식으로 정의되며, 이들은 혈액, 흉선, BM 및/또는 그외 면역 세포를 발생시키는 HSC, BM 세포, 줄기 세포 및/또는 기타 모든 세포를 함유하거나 또는 이들이 풍부하며, 이에 한정되진 않으나 HSC, 상피세포, CLP(common Lymphoid Progenitor), CMLP(common myelolymphoid Progenitor), MLP(multilineage Progenitor), 및/또는 BM의 중배엽 줄기 세포를 포함한다. 일부 예에 있어서, 이식은 말초 혈액 줄기 세포 이식(PBSCT)일 수 있다. HSC는 BM으로부터 가동화(mobilized) 될 수 있으며 이후 혈액에서 회수되거나 또는 공여체로부터는 물리적으로 추출된 BM내에 함유될 수 있다. HSC는 정제된 것이거나, 농후화된 것이거나 또는 수집한 BM 또는 혈액의 단순한 부분일 수 있으며 이후 수용체에게 주입된다. 이식은 동종이형이식, 자가이식, 동계이식 또는 이종이식일 수 있으며, 적은 수의 세포가 사용되는 "소형-이식체"를 포함하여 임의 수의 세포 이식일 수 있다. 일 예에서, HSC는 성 스테로이드 저해 이전에, 동시에 또는 이후에 투여된다.

HSC는 비제한적인 세포 종류의 일예이며, 본 출원에서와 같이 이식되거나 유전학적으로 변형될 수 있다. 그러나, 당업자라면 본원에서 제공된 발명의 실시를 쉽게 이해하므로, HSC를 공연한 실험의 실시없이 여러가지 대체 세포 유형중 임의의 어느 하나로 대체할 수있으며, 대체 세포 유형으로는 이에 한정되진 않으나, BM 세포, 줄기 세포, 및/또는, 혈액, 흉선, BM 및/또는 그외 면역 세포, 즉 이에 한정되진 않으나 HSC, 상피 줄기 세포, CLP, CMLP, MLP 및 BM의 중배엽성 줄기 세포를 포함한 면역 세포를 발생시키는 기타 세포를 포함한다. 일부 예에서, HSC는 태아의 간 및/또는 비장에서 유래된다.

화학요법 및 방사선요법 모두 암 세포를 파괴할 수 있다. 그러나, 특이성 부족으로 인해, 이러한 치료법들은 BM의 HSC 뿐만 아니라 모든 백혈구(WBC)를 포함하여 건강한 세포를 사멸시킨다. WBC와 HSC의 파괴는 환자들에서 HSCT의 요구를 유발한다. HSCT는 예컨대 줄기 세포 및 이의 전구 세포가 예컨대 화학요법이나 방사선치료에 의해 손상되어 환자에게 필요한 혈액 세포를 생산할 수 있는 건강한 줄기 세포로 치환되는 것을 허용한다.

HSCT는 비악성 면역 질환, 예컨대 중증 복합 면역결핍, 판코니 빈혈 (Fanconi's anemia), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 아밀로이드증(amyloidosis), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 다이아몬드 블랙크판 빈혈(Diamond Blackfan anemia), 혈액탐식성 림프조직구 증식증(hemophagocytic lymphohitiocytosis), 코스트만 증후군( Kostmann syndrome), 비스코트 알드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 혈소판 감소(thrombocytopenia) 및 겸상적혈구질환와 지중해빈혈증(thalassemia)과 같은 헤모글로비노파톨로지(hemoglobinopathologies) 뿐만 아니라 백혈병 및 림프종(혈액 및 면역 시스템 세포의 암)과 같은 다수의 조혈성 암에 대한 기본 치료법이다. 암 세포를 몸에서 제거하기 위해 일반적으로 골수 제거(myeloablation) 또는 골수 고갈(myelodepletion)로 치료되는 백혈병과 림프종은, 이후 HSCT에 의해 면역 기능이 회복된다. 본 발명의, 단독으로 또는 사이토카인(예, G-CSF 또는 GM-CSF) 또는 약물(예, 사이클로포스파미드)과 같은 HSC 가동화제와의 병용 투여(동시에 또는 연속적으로)하는 방법은, 보다 빠르고 보다 우수한 생착이 가능하며, 또한 화학요법 및 방사능치료를 보다 증가된 투여량이나 및/또는 보다 자주 실시 가능하도록 할 수 있다.

최신 임상 의학과정에서는 종종 다른 공여체의 혈액으로부터 유래된 HSC 이식(동종이형 HSCT)을 차용하며, 이의 이점은 숙주 암 세포(숙주 편대 백혈병(GVL))에 대해 반응하는 공여체 T 세포를 취할 수 있다는 것이지만, 숙주에 대한 반응하는 다른 T 공여체 T 세포로 보충되어 일반적으로 치명적일 수 있다(이식 편대 숙주(GVH) 질환). HSCT 성공으로 따른 환자 생존은, 주입된 HSC 수 및 생착 속도와 직 접적으로 관련있으므로, 본 발명의 방법을 이용하는 경우, 현 HST프로그램의 성공율이 향상되며 현재 가능한 바에 비해 더 많은 환자들이 HSCT를 받을 수 있음을 의미한다.

BM으로부터 HSC 가동성을 증진하는 기작은, 공여체로부터의 수집에 활용되는 가능한 많은 HSC를 확보하는데 중요하다. GM-CSF와 G-CSF는 이러한 목적으로 사용되며, 그외 물질, 예컨대 화학요법 및 사이토카인 역시 효과적인 것으로 입증되었다. 보다 효과적으로 HSC를 가동화하는 역량은, 조혈 회복 이상의 적용성을 가진다. 최근 연구들에서, HSC는 다능성을 가지며 예컨대 손상된 조직, 심근, 골근, 간, 뼈, 연결조직, 상피조직, 췌장, 혈관구조의 재생에 활용될 수 있는 것으로 보고되었다.

현 HSCT 전략의 한계는 장기간의 면역결핍으로 인한 감염, 특히 바이러스, 진균, 캡슐화된 세균의 감염과 관련있으며, 이식후 사망율 및 어른 사망율에 유의한 원인으로 남아있다. HSCT와 관련된 감염은 일반적으로 현대 항생제를 가지고도 방지하기 매우 어렵다. 어린이들은 일반적으로 HSCT 후 몇 개월 이내에 면역 역량이 회복되지만(Parkman et al., (1997) Immunol. Rev. 157: 73), 반면에 성인 수용자는 림프구 재생이 몇년간 지연될 수 있으며, 새로운 최적조건을 매우 불충분하게 반영할 수 있다. 어른에서의 이러한 지연은 여러가지 인자들에 의존적이며, 노화에 따른 잘 알려진 T 및 B 세포 생산의 감소로 인해 우선적으로 감염되기 쉽다(Parkman et al., (1997) Immunol. Rev. 157: 73).

현 HSCT 전랸의 두번째 한계점은, 이식된 세포가 상기 세포의 수용체에서 " 거부"되는 경우 발생된다. 이는 "이식 편대 숙주 질환"(GVHD)으로 알려져 있다. 자가 이식으로 GVHD를 피할 수 있다. 그러나 자가 이식의 전체적인 항암 성공율은 동종이형이식에 비해 더 낮다. 암환자에서, 자가 이식은, (GVH 효과와 유사한) 이식 편대 암(GVT) 효과를 형성하지 못하고, 암 세포가 이식 환자에게 회귀할 수 있는 위험이 있다는 단점이 있다. 설취류의 동종이형 HSCT 모델 및 거세한 동종이형 이식 HSCT 수용체에서, 성 스테로이드 저해로, 골수 및 림프 계통 모두의 이식 후 세포 재조직화를 향상시키는 것으로 확인되었다. 그 결과는, GVHD 악화 또는 GVT 활성의 손실없이도 T 및 B 세포의 재구성화에 현저한 증가를 보인다(참조, 예 실시예 19).

HSCT 치료법의 또다른 한계점은, 모든 잠재적인 후보자를 치료하기엔 공여체가 부족하다는 것이다. 탯줄 유래 혈액(UCB)이 매우 제한된 범위로 활용되고 있지만, 각 공여체로부터 소수의 세포만이 수득되고 그 결과 HSC를 필요로하는 총 갯수가 적은 어린이들에게 주로 사용된다(필요한 HSC 수는 환자 체중과 연관있다). UCB 이외의 공여체는 공급이 한정적이며, MHC 쌍이 허용가능하여야 하며 또는 GVH 위험성이 높다. 적은 수의 세포를 필요로 하는 경우, 그 결과 생착이 향상되거나, 또는 엄격성이 낮은 매치(match)를 요할 수 있으며, 따라서, 거부반응 또는 GVH의 위험도를 감소시켜, HSCT를 예컨대 자가면역 질환의 치료에 보다 광범위하게 사용할 수 있으며, 제대혈액과 같은 원료를 활용할 수 있다(예, 수용체 생착시 1.5 x 10⁷ cells/kg).

T 세포

T 세포는 면역 시스템의 주 구성성분이며, 흉선에서 생산된다. 가장 중요한 T 세포는 Th 세포인데, 이는 실제 모든 면역 반응들을 개시하는 세포이기 때문이다. 이런 Th 세포의 부재로(HIV 감염, 화학요법, 방사선치료 등으로 인해 초래됨), 면역 억제가 직접 초래되며, 그 결과 감염 및 암에 걸리기 쉽고 빨리 죽는다. Th 세포 서브세트의 중요한 역할은 면역 반응들을 조절하는 것이다. T 세포와 B 세포의 증진와 억제 사이의 균형은 예컨대 백신이 효과적인지, 암 또는 종양이 공격받는지 또는 이식이 허용가능한지 또는 거부되는지 여부에 대해 중요한 작용을 한다.

젊은이에서만 매우 활성적인 흉선은 노화와 함께 크기와 기능이 점차 감퇴된다. 이는 특히 사춘기에 구체적으로 입증된다. 흉선의 배출은 흉선에서의 세포ㅊ충실성(cellularity)와 직접 관련있으므로(Scollay et al., (1980) Eur. J. Immunol. 10: 210; Berzinset al., (1998) J. Exp. Med. 187: 1839), 노화성 흉선 퇴화는 최근 흉선 생착(RTE)에서의 점차적인 감소(Steffens et al.,(2000) Clin. Immunol. 97: 95; Sempowski et al., (2002) Mol.Inzmunol.38 : 841-848 ; Sutherland et al., (submitted)) 및 기억 T 세포에 대한 원시 T 세포의 비율 감소를 초래하여(Ernst et al., (1990) J.Inarnunol. 145: 1295); Kurashima et al., (1995) Int.hrznmunol. 7: 97; Utsuyamaet al., (1992) Mech. Ageing Dev. 63: 57), CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다에서 제한된 TCR 레페토리를 형성한다 (Mosley et al., (1998) Cell. Immunol. 189: 10; LeMaoult et al., (2000) J. Immunol. 165: 2367). 따라서, 비특이적 및 리셉터 매개성(CD3/TCR) 자극에 대한 반응에 있어, T 세포 증식은 나이와 일치한다(Hertogh- Huijbregts et al., (1990) Mech. Ageing Dev. 53: 141-155; Flurkey et al., (1992) J.Gerontol. 47:B115 ; Kirschmann et al., (1992) Cell. Immunol. 139 : 426).

나이가 들면서 인간의 면역 기능은 점차 퇴화하고, 어린이는 매우 잘 반응하고, 젊은 성인은 적당하지만 중,후반이 되면서 반응이 매우 빈약해진다. 이러한 감퇴는, 모든 반응에 실제적으로 관여하는 3종의 주된 세포 1종 이상에서의 결함 또는 변이가 있음을 나타낸다: (i) 항원 표시 세포(항원을 포획하여 위치시키고, 따라서 T 림프구를 활성화시킨다.); (ii) T 림프구 및 (iii) B 림프구. 이러한 3가지 세포종 중 어느 하나의 결함 또는 변이로, 항원 자극에 대한 면역 반응이 차선되지가 설명될 수 있다. 결함 또는 변이는 세포의 수준에서의 결함 또는 변이일 수 있거나 또는 정량적인 또는 기능적인 것을 의미할 수 있다. 일차적으로 성 스테로이드 영향으로 인해 노화시 흉선의 기능이 급격하게 감소되기 때문에, 이들중 가장 결함이 있는 것으로 여겨지는 것은, T 세포 구획내에 있다. 이는 혈액으로 방출되며 새로운 항원에 대한 반응에 필요한, 신생 또는 "원시" T 세포의 소실을 발생시킨다. 또한 잠재적인 반응성 T 세포의 수적 감소 뿐만 아니라, 기존 T 세포도 성 스테로이드에 의해 어느 정도 억제될 수 있다.

암 치료법

전술한 바와 같이, 암 치료에 사용되는 화학요법 및 방사능치료법은 환자의 암세포가 아닌 세포, 특히 혈액 세포에게 유해하다. 이러한 치료법의 빈도 및 투 여량 증가를 제한하는 요인은, 치료에서 생존하고 손상된 면역 시스템의 결과인 기회 감염에 대한 감수성을 피할 수 있는 환자의 능력이다. 따라서, 면역 재생이 보다 빠르고 손상 심각성이 낮다면 환자에게 매우 이롭다.

발명의 개요

본 발명은 성 스테로이드 및 그외 호르몬 시그널링 파괴에 의한, BM의 조혈 및 기능성 증진, HSCT 이후의 BM 생착 증진 및 기존 T 세포와 기타 면역세포의 기능성 증가에 의해, 환자 수용체의 공여체 이식체에 대한 허용성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 면역력은 일신된 흉선 기능에 의해 생산된 원시 T 세포 수치 증가에 의해 증진될 수 있으며, 또한 활성화된 BM 기능을 통해 생산된 B 림프구 및 면역 시스템의 기타 세포의 증가에 의해 증진될 것이다.

성 스테로이드 및/또는 그외 호르몬 시그널링의 간섭이 BM, HSC, T 세포 및 그외 면역 세포의 기능성을 직접적으로 또는 간접적인 작용으로 증진하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견으로 본 발명이 이루어졌으며, 본 발명은 BM 조혈 및/또는 기능성을 증진하는 방법을 제공한다. 일예에서 기존재하는 BM의 조혈 및/또는 기능성이 개선된다. 다른 예에서, 환자는 HSCT를 받으며, HSC 조혈 및/또는 생착이 환자들에서 향상된다.

본 발명은 HSCT 이후의 생착을 증진시키는 방법을 제공한다. 예로서 생착은 BM에서 증진된다. 다른 예에서, 생착 및/또는 재구성은 흉선에서 증진되며, 궁극적으로 흉선의 재생이 유발된다. 다른 예에서, 생착 및/또는 재구성은 비장 및/또는 그외 림프계 기관, 조직 및/또는 혈액에서 증진된다. 일부 예에서, HS는 동종이형이며, 다른 예에서 HSC는 자가조직이다. 일 예에서, T 세포 전구체의 수가 성 스테로이드 시그널을 중지하지 않고 HSCT를 받는 환자들에 비해 증가한다. 다른 예에서, 총 백혈구 수, 공여체 유래 DC, BM 전구체, HSC, CLP, MLP, 림프구, 골수 세포, 대식세포, 호중구, 과립세포, NK, NKT, 혈소판, 원시 T 세포, 기억 T 세포, 헬퍼 T 세포, 작동성 T 세포, 조절성 T 세포, RBC, B 세포, 공여체- 및/또는 숙주-유래 말초 T 세포, APC, 및'/또는 공여체 유래 말초 B 세포들이, 성 스테로이드 시그널을 중지하지 않고 HSCT를 받는 환자들에 비해 증가한다. 다른 예에서, 환자에게 HSCT 이후에 면역 회복 및/또는 생착 증진를 위해, 사이토카인(예, IL-7, SCF, IL-11, G-CSF, 또는 GM-CSF) 또는 호르몬(예, 성장 호르몬 또는 그것의 매개체 인슐린 의존적 성장 호르몬(IGF-1) 또는 섬유아세포 성장 인자 계역의 일원, 예컨대 FGF 7/각질형성세포 성장 인자(KGF))를 처리한다. 다른 예에서, 본 발명은 단독으로 또는 사이토카인(예, G-CSF 또는 GM-CSF)과 같은 조혈제를 병용 투여(동시에 또는 연속적으로)하여, 신속하고 효과적인 생착, 표적 조직으로 이동 및/또는 면역 세포 회복 증진를 가능하게 한다.

또한, 본 발명은 HSCT 다음에 환자에게 면역 세포의 기능성을 증진하는 방법을 제공한다. 일예로, 면역 세포는 T 세포이다. 다른 예로, T 세포 리셉(TCR)터 자극에 대한 T 세포 증식성 반응이 개선된다. 다른 예로, 항원(예, 테타누스 톡소이드(TT) 또는 포케위드 미토겐(PWM)) 자극에 대한 T 세포 반응성이 개선된다. 일 예로, T 세포 반응성이 개선되어 항원을 상기한다(즉 개선된 T 세포 기억 반응). 또다른 예로, 공동-자극성 시그널링 또는 이차 시그널링에 대한 T 세포증식성 반응이 개선된다. 일부 예들에서, T 세포 반응의 동역학이 개선된다. 다른 예로, APC에 의해 표시되는 항원에 대한 T 세포 반응이 개선된다. 본 발명의 일부 예들에서, 면역세포 반응성은 이식후 5달, 4달, 3달 또는 2달 이내에 개선된다. 본 발명의 특정 예에서, 면역세포 반응성은 이식후 약 1달 이내에 개선된다. 본 발명의 다른 예로, 면역세포 반응성은 이식 후 2주내에 개선된다. 본 발명의 다른 예로, 면역세포 반응성은 이식후 약 1주일내에 개선된다. 본 발명의 다른 예로, 면역세포 반응성은 이식 후 3일내에 개선된다. 다른 예에서, 면역 반응은 기존재하는 T 세포 뿐만 아니라 새로운 흉선 유래 T 세포로부터 제공되는 시기인, 이식후 3달 이상 경과한 후에 개선된다.

또한 본 발명은 기존재하는 면역세포의 기능성을 증진하는 방법을 제공하며, 상기 면역세포는 이에 한정되는 것은 아니나 말초 면역세포를 포함한다. 일예로, 세포는 T 세포이다. 다른 예로, 세포는 DC 또는 그외 APC이다. 또다른 예로, 세포는 NK 세포 또는 조절성 세포, 예컨대 CD4+CD25+ T 세포 및 자연 살상 T (NKT) 세포이다. 일예로, TCR 자극에 대한 T 세포 증식성 반응이 환자에서 개선된다. 다른 예로, 항원(예, TT, PWM, 또는 KLH)에 대한 T 세포 반응이 개선된다. 또다른 예로, 공동-자극성 시그널링 또는 이차 시그널링에 대한 T 세포증식성 반응이 개선된다. 다른 예로, APC에 의해 표시되는 항원에 대한 T 세포 반응이 개선된다. 하나의 특정 예에서, LHRH/GnRH 유사체는 기존재하는 면역세포의 반응성에 직접적인 효과 또는 간접적인 효과를 가진다. 일부 예들에서, 성 스테로이드 유사체(그것의 작용제 및 길항제), 예컨대 GnRH/LHRH 유사체는 본 발명의 방법에 사용되어, 성 스테로이드 매개 시그널링, 면역세포 또는 BM를 파괴한다. 다른 예로, 성 스테로이드 유사체는 흉선, BM, 및/또는 기존재하는 면역계 세포, 예컨대 T 세포, B 세포, 및 DC(즉, 이들의 기능성 활성을 직접적으로 증가시켜)를 자극한다.

또한, 본 발명은 환자, 혈액, HSC, 또는 BM 공여체에서 HSC 생착 및 가동화를 증진시키는 방법을 제공한다. 일예로 성 스테로이드 시그널링의 파괴은 HSC, CD34+ 세포, CLP, 또는 CMP와 같은 말초 면역 전구 세포의 수 및/또는 기능성을 증가시킨다. 일예에서는, 단독으로 또는 HSC 가동화제, 예컨대 사이토카인, GM-CSF, G-CSF, CSF, 화학요법, 사이클로포스파미드, flt-3 리간드, KGF/FGF 7 또는 그외 FGF 계의 일원 또는 IL-7를 병용투여하여 성 스테로이드 시그널링을 파괴시키는 단계를 포함하는 HSC 가동화를 증진하는 방법을 제공한다.

일예로, 본 발명은 보다 높은 투여량 및/또는 높은 빈도 및/또는 화학요법 및 방사선치료이후에 면역계의 신속한 회복 또는 적은 손상을 제공하는 화학요법 및 방사선 치료를 허용하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 흉선에서의 성 스테로이드 매개 시그널링을 파괴하여 후속적으로 흉선을 재활성화하는 것을 제공한다. 일예로, 성 스테로이드 매게 시그널링을 파괴하는데 거세를 사용한다. 구체적인 예로, 화학적 거세가 사용된다. 다른 예로, 외과적 거세(예, 고환 또는 난소 제거)가 사용된다. 일부 예들에서, 성 스테로이드 시그널링의 완벽한 저해가 이루어진다. 다른 예로, 성 스테로이드 시그널링의 부분적인 파괴이 이루어진다. 일예로, 거세로 흉선의 상태가 사춘기 이전 상태로 변화되어 흉선이 재활성화된다. 다른 예로, 거세는 그외 분자 수준을 변형시키고, 기존재하는 면역세포에 직접적인 영향을 미침으로써 면역세포 반응성 및/또는 증식 및/또는 활성화 상태가 증진된다.

또한 본 발명은, 흉선에서의 성 스테로이드 매개 시그널링을 파괴하여 후속적으로 흉선을 재활성화하는 것을 제공한다. 일예로, 성 스테로이드 매게 시그널링을 파괴하는데 거세를 사용한다. 구체적인 예로, 화학적 거세가 사용된다. 다른 예로, 외과적 거세(예, 고환 또는 난소 제거)가 사용된다. 일부 예들에서, 성 스테로이드 시그널링의 완벽한 저해가 이루어진다. 다른 예로, 성 스테로이드 시그널링의 부분적인 파괴이 이루어진다. 일예로, 거세로 흉선의 상태가 사춘기 이전 상태로 변화되어 흉선이 재활성화된다. 다른 예로, 거세는 그외 분자 수준을 변형시키고, 기존재하는 면역세포에 직접적인 영향을 미침으로써 면역세포 반응성 및/또는 증식 및/또는 활성화 상태가 증진된다.

일 예로, 성 스테로이드 매개 시그널링은 성 호르몬 생산, 작용, 결합 또는 시그널링의 변형제 투여에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 차단(예, 저해, 불활성화 또는 무용화)되며, 상기 변형제로는 성 호르몬 또는 그것의 리셉터에 결합하는 물질, 성 호르몬에 대한 작용제 또는 길항제가 있으나 이에 한정되지 않으며, GnRH/LHRH, 항-에스트로겐제, 항-안드로겐제, SERM, SARM, 항-에스트로겐 항체, 항-안드로겐 리간드, 항-에스트로겐 리간드, LHRH 리간드, 비활성의(항체) 또는 활성 (항원) 항-LHRH (또는 그외 성 스테로이드) 백신예방, 또는 이들의 혼합 ("차단제")가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 일예로, 하나 이상의 차단제가 사용된다. 일부 예들에서, 하나 이상의 차단제가 지속적인 펩타이드 방출성 제형으로 투여된다. 지속적인 펩타이드 방출성 제형의 예는 WO 98/08533에 개시되어 있으며, 참고문헌으로 본원에 병합된다.

발명의 상세한 설명

이해를 돕기위한 본원에 언급된 특허 및 과학 문헌들은 당업자라면 이용가능한 것이다. 고찰된 미국 특허, 출원, 공개된 외국 출원 및 GenBank 데이타베이스 서열을 포함한 참고자료들은 각각이 구체적인 동일 범위로 그 전체가 참고문헌으로써 본원에 통합되며, 개별적으로 참고문헌으로 통합되는 것으로 표시된다.

본 발명은 흉선의 재활성화 없이, 재활성화 이전에 또는 재활성화와 동시에 발생되는, 성 스테로이드 제거 및/또는 성 스테로이드 시그널링의 중단으로 인한 골수의 기능성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. "BM의 기능 증가" 및 "BM 기능성 증진"는 전구체, 예컨대 BM에서 HSC(및 그에 따라 혈액에서 증가)를 포함하는 면역 세포의 생산 및/또는 유출 향상으로 정의되며, HSCT 이후의 항상성 개선 및/또는 생착 증진를 포함한다. "유출 향상"은, 말초로 또는 표적 조직, 특히 면역 조직 또는 손상된 조직으로의 HSC를 비제한적으로 포함한, 면역세포 가동화 능력 향상을 포함한다. 일예로, HSC 조혈이 개선된다. 다른 예로, HSC 유출이 향상된다. 특정 예에서, 혈액 및/또는 면역 세포 수가 증가된다. 또다른 예로, HSC 생착이 HSCT이후에 향상된다. 다른 예로, 말초로의 HSC 가동화 또는 표적 조직으로의 귀환이 향상된다. 또다른 예로, 증식성 능력, 및/또는 조혈성 또는 비-조혈성 전구체로의 분화력이 향상된다.

본 발명은 흉선의 재활성화 없이, 재활성화 이전에 또는 재활성화와 동시에 발생되는, 성 스테로이드 제거 및/또는 성 스테로이드 시그널링의 파괴 이후에 T 세포 및 그외 면역 세포의 기능을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 용어 "면역 세포" 및 "면역계 세포"는 호환적으로 사용되며, HSC, T 세포, B 세포, DC, 및/또는 그외 혈액 세포를 의미하며, 이에 한정되진 않으나, HSC 전구체, CLP, MLP, 림프구, 골수 세포, 호중구, 과립세포, 호염기구, 호산구, NK, NKT, 혈소판, 적혈구, 단핵구, 대식세포, 원시 T 세포(naive T cell) 및 전술한 것의 전구체를 포함한다. 세포는 말초일 수 있으며, 아닐 수 있고, 세포는 BM, 혈액, 비장, 림프절, 흉선, 점막, 피부 또는 그외 조직들 중 1종 이상의 부위에서 발견될 수 있다.

면역세포의 "증가된" 또는 "증진된 기능성"은, 면역세포가 성 스테로이드 제거되지 않았을때 정상적으로 예측되는 면역반응에 비해, 필요한 적절한 면역 반응을 더 잘 제공할 수 있는 것을 의미한다. 일예로, 세포는 T 세포이다. 다른 예로, 면역세포는 B 세포, DC, 및/또는 HSC이다. "증가된 기능성"은, 이에 한정되진 않으나, 혈액 및 신체 전역에 있어 표적 T 세포 살상 개선; 림프구의 증식 반응 증가; 시그널링 역량 향상; 귀환력 향상; APC 활성화 향상; 리셉터, 세포 부착분자 또는 공동-자극성 분자의 수치 또는 활성 증가; 세포 자살 감소; 사이토카인, 인터루킨 및 그외 성장 인자 방출 증가; 혈장내 항체(Ab) 수치 증가; 및 선천면역성(예, 자연살상 (NK) 세포, DC, 호중구, 대식세포 등)을 포함한다.

신생 T 림프구를 제조하기 위해. 흉선을 전구 세포를 필요로하며; 이것은 단기간동안 본인의 기관내에서 유래될 수 있지만, 3-4주 이후에 상기한 세포는 고갈되고 신생 조혈 줄기 세포(HSC)가 전형적으로 혈액을 통해 골수로부터 흡수되어야 한다. 그러나, 정상적으로 기능하는 젊은 흉선에서도 이러한 세포의 흡수 매우 느리며, 즉 조혈이 조절된 수치로 T 세포의 생산을 유지하기에 충분히 느려, HSC 또는 T 세포 계통에 따라 이미 우선적인 발생을 가지는 전흉선세포 이상으로 효과적으로 한정된다. 성 스테로이드 저해시, 흉선은 혈액에 순환중인 신생 전구 세포를 매우 잘 수용하게 된다. 혈액 전구 세포의 수치 증가에 의해, 이들로부터 유래된 T 세포는 점진적으로 T 세포 풀(pool)에 포함된다. 이는, 전구체에 도입된 유전자(예, HSC)가 모두 전구 T 세포에 합류하여 결국 다수의 T 세포 풀내에 존재하게 됨을 나타낸다. 상기 세포의 내인성 숙주 HSC 에서 유래된 것 이상의 우세적인 수치는 형질전환된 외인성 HSC의 개수 증가에 의해 증가될 수도 있다.

본 발명은 공여체 동종이식체 이식이 필요한 환자에게서, 공여 세포(예, HSC) 투여 이전에, 또는 동시에 또는 이후에 성 스테로이드 시그널링의 파괴가 공여 동종이식체의 환자 허용성을 용이하게 한다는 발견을 토대로 한다. 일부 예들에서, 상기 환자는 또한 공여체로부터 HSC와 같은 세포의 전이를 받는다. 흉선이 활성화됨으로써, 신생 면역계 또는 변형된 면역계가 형성되어, 더이상 동종이식체상의 항원을 인지하거나 및/또는 반응하지 않는다. 다시 말해, 동종이식체는 "자신"으로 읽혀지며 외부의 것으로 인지되지 않는다.

일예에서, 흉선의 이식은 본 발명에 이용하여 공여 세포의 생착 또는 공여 이식체에 대한 허용성을 향상시킬 수 있다. 일부 예들에서, 흉선의 이식은 환자가 무흉선이거나, 환자의 흉선이 재생에 내성이거나 또는 재생을 앞당기는 경우이다. 특정 예에서, 허용성을 유발하기 위한 흉선의 이종이식이 사용될 수 있다(참조, 예, 미국 특허번호 5,658,564). 다른 예에서, 동종이형의 흉선 이식체가 사용될 수 있다.

이식된 세포는, HSC, 림프계 전구세포, 골수 전구 세포, 상피 줄기세포 또는 이들의 혼합일 수 있다. 본 발명은 또한 흡수 및 T 세포로의 분화를 촉진하는 세포를 전달하기 위해 새로운 방법을 제공한다. 상기 이식된 세포는 유전학적으로 변형 또는 변형되지 않을 수 있다. 상기 세포는 흉선이 본 발명의 방법에 의해 재활성화되는 과정중인 환자에게 세포를 주입한다. 선택적으로 변형된 줄기 세포 및 전구 세포는 흉선에 의해 흡수되어 T 세포, 수지상 세포, NK 세포 및 그외 흉선에서 생성되는 그외 세포로 변환된다. 이식된 세포에 유전학적 변형이 있는 경우, 이들 신생 세포들 각각은 모 줄기/전구 세포의 유전학적 변형을 함유하고 있다.

일부 예들에서, 상기 세포는 흉선이 재활성화되는 시기에 환자에게 투여된다. 다른 예에서, 상기 세포는 흉선의 재생없이, 재새이전에 또는 재생과 동시에 투여된다. 또다른 예에서, 상기 세포는 성 스테로이드 매개 시그널링이 파괴되기 시작하는 시점에 투여된다. 일 예에서, 줄기 세포는 수용체에게 형질전환된다. 상기 줄기 세포는 조혈 줄기 세포, 상피 줄기 세포 또는 이들의 혼합일 수 있다. 다른 예에서, 전구 세포는 수용체에게 형질전환된다. 상기 전구 세포는 림프계 전구 세포, 골수 전구 세포 또는 이들의 혼합일 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 CD34+ 또는 CD34l0 HSC이다. 일부 예들에서, 이식된 세포는 자가조직이다. 다른 예에서, 상기 이식된 세포는 비자가조직이다.

비자가(공여체) 세포가 사용되는 경우, 상기 세포에 대한 허용성은 흉선 재활성화 과정중에 이루어진다. 성 스테로이드 매개 시그널링의 차단 개시 중 또는 후에 해당(유전학적으로 변형된(GM) 또는 유전학적으로 변형되지 않은) 공여 세포는 수용체로 이식된다.

공여 세포는 수용체에 속하게 되고 흉선에 의해 신생 T 세포 및 DC의 생산의 일부가 됨으로써 흉선에 의해 수용된다. 제조되는 T 세포 집단은 수용체와 공여체 모두를 자신으로 인지하고 따라서 공여체 유래 이식체에 대해 허용성을 가지게 된다. 상기 이식체는 공여체의 세포, 조직 또는 기관, 또는 이들의 혼합일 수 있다.

본원에서, 환자에서의 "허용성 형성" 또는 "허용성 유도" 및 그외 유사한 표현은 부분적인 허용성의 유도 뿐만 아니라 완전한 허용성 유도를 의미한다(예, 환자는 본 발명의 방법에 따라 치료되지 않는 환자에 비해, 이색체에 대해 좀더 허용성이 되거나 또는 완전히 허용성이될 수 있다.). 허용성 유도는 예컨대 MLR 반응에 의해 공지의 방법으로 검사될 수 있다.

일예에서, 본 발명의 방법은 유전학적으로 변형된 림프계 전구 세포, 골수 전구 세포, 상피 줄기세포 또는 이들의 혼합(총괄적으로 GM 세포람 함)을 이용하여 특정 항원의 공격에 내성인 면역계를 형성한다.

수용체의 흉선은 결국 하기에서 보다 구체적으로 기재된 바와 같이 성 스테로이드 매개 시그널링의 파괴 방법에 의해 재활서아화된다. 특정 예에서, 상기 수용체는 사춘기가 지난 상태이다. 본 발명에 있어서, 수용체의 호르몬은 사춘기 이전의 수치로 도달하기 위해 상기 수용체의 호르몬 상태는 가역적이다. 수용체에서 스테로이드 호르몬의 수치를 낮춤으로써,흉선에 대한 호르몬의 시그널링이 감소되고 따라서 흉선이 활성화되도록 한다.

전술한 바와 같이, 노화된(사춘기 이후) 흉선은 체내 면역계의 기능을 최고 수치(예컨대 어린, 사춘기 전의 흉선에서 확인된 것)보다 낮게 만든다. "사춘기 이후"는, 흉선이 실질적인 퇴화에 이르는 시기로 정의된다. 인간의 경우, 이는 약 20-25세에 일어나며, 일부는 더 빠르거나 늦을 수 있다. "사춘기"는, 흉선이 퇴화되기 시작하여 완전히 퇴화되기 전 시기를 의미한다. 인간의 경우, 이것은 10-20세에 발생될 수 있으며, 개인에 따라 더 빠르거나 늦을 수 있다. "사천기전"은, 개체의 성 호르몬이 증가되기 이전의 시기를 의미한다. 인간의 경우 이 시기는 0-10세일 수 있으며, 개인에 따라 더 빠르거나 늦을 수 있다.

"수용체", "환자" 및 "숙주"는 호환적으로 사용되며, 성 스테로이드 제거 요법 및/또는 성 스테로이드 매개 시그널링 중단 요법을 받는 대상 및/또는 적절하게는 HSC 이식을 받는 대상을 의미한다. "공여체"는 동계의, 동종이형의 또는 이종의 이식체일 수 있는 이식체의 공급원을 의미한다. 예컨대, 환자는 나중에 환자 이식을 위해, 본인 예컨대 그의 그녀의 자가 세포를 제공할 수 있다. 동종이형의 HSC 이식이 사용될 수 있으며, 이러한 동종이형 이식은 동일한 종의 미스매치 구성원들 사이에 이루어지는 이식이고, 이종 HSC 이식의 공여체 및 수용체는 서로 다른 종이다. 매치되는 동물들 간의 동계 HSC 이식이 사용될 수 있다. HSC 이식 언급에 사용되는 용어 "매치되는", "미스매치되는", "매치되지 않는" 및 "동일하지 않는"은, 공여체와 수용체의 MHC 및/또는 소 조직적합성 마커가 동일하거나(매치) 또는 동일하지 않는(매치되지 않고, 미스매치되는 및 동일하지 않는) 것이다.

환자에서 이식체 또는 그외 외인성 항원에 대한 허용성 "향상", "증진(증진)", 또는 "증가"는 환자의 이식체 또는 그외 외인성 항원에 대한 허용성이 성 스테로이드 시그널링의 파괴가 이루어지지 않은 환자에서 이루어질 수 있는 허용성에 비해 항상되는 것을 의미한다.

흉선 "재생", "재활성화" 및 "재구성" 및 이의 유사 용어는 호환적으로 사용되며, 퇴화된 또는 (예, 화합물, 방사능, 이식 편대 숙주 질환, 감염, 유전학적 소인에 의해) 손상된 흉선의 활성 상태로의 복귀를 의미한다. "활성 상태"는, 성 스테로이드 호르몬 매개 시그널링이 파괴된 환자에서, 흉선이 사춘기 전의 흉선(즉, 사춘기에 이르지 않은 환자의 흉선)의 유출율에 10% 이상, 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상의 T 세포 유출에 도달하는 것을 의미한다.

본 발명은, 성 스테로이드에 의해 성숙되고 면역계가 있는 모든 동물 종(인간을 포함하여), 예컨대 포유류 및 유대류에 사용될 수 있다. 일예로, 본 발명은 거대 포유류, 즉 인간에게 사용된다.

명세서에서, 용어 "포함하다" 또는 "포함하다" 또는 "포함하는" 과 같은 변형체는, 언급된 요소, 완전체 또는 단계, 요소, 완전체들 또는 단계들의 그룹을 포함하는 것을 함축하며, 그외 요소, 완전체, 단계, 또는 요소, 완전체들 또는 단계들의 그룹을 배제하는 것이 아닌 것으로 이해될 것이다.

성 스테로이드 매개 시그널링의 파괴

본 발명은 환자의 성 스테로이드 매개 시그널링의 파괴 방법을 더 제공하며, 상기 환자의 흉선은 이후 재활성화되거나 재활성화되지 않는다. 또한 본 발명은 환자의 면역 세포(예, T 세포)의 기능적인 상태를 향상시키는 방법을 제공한다. T 세포에 있어, 흉선은 초기 전구 세포(CD3^-CD4^- CD8^- 세포)의 증식 속도 증가를 개시하고 이들을 CD4+CD8+로 변환시킨 다음, 새로운 성숙형 CD3^hiCD4⁺CD8^-(T 헬퍼(Th) 림프구) 또는 CD3^hiCD4^-CD8⁺ (세포독성 T 림프구(CTL))가 형성된다. 회복성 흉선은 또한 혈류로부터 HSC, 또는 T 세포로 형성될 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포 흡수를 증가시키고, 이를 새로운 T 세포 및 흉선내부 DC로 변환시킨다. 흉선의 활성 증가는 정상적으로 더 어린 흉선(예, 사춘기전 환자)에서 발견되는 여러가지 방식과 비슷하다. 갱신된 흉선의 유출 결과로, 혈액내 원시 T 세포(아직 항원을 만나지 않은 T 세포)의 수치가 증가한다. 또한 자극에 반응하는 말초 T 세포의 능력은, 예컨대 항 CD-28 항체와의 가교에 의해 또는 예컨대 항-CD3 항체의 TCR 자각 또는 포크위드 미토겐(PWM)과 같은 미토겐을 이용한 자극에 의해 증가되며, 이렇게 증가된 T 세포 반응은 흉선 재생이전에, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14 또는 21일 이내에 이루어질 수 있다.

또한, 비자가조직의 (공여체) 세포는 수용체 환자로 이식되는 경우, 이러한 세포에 대한 허용성은 흉선이 재활성화된는 과정중에 형성된다. 성 스테로이드 매개 시그널링의 차단 개시 중 또는 이후에, 해당(유전학적으로 변형된(GM) 또는 유전학적으로 변형되지 않은) 공여 세포는 수용체로 이식된다. 이러한 세포는 수용체로 속하게 되어 흉선에 의한 신생 T 세포 및 DC의 샌산에 일부가 됨으로써, 흉선에 의해 수용된다. 제조되는 T 세포 집단은 수용체와 공여체는 자신으로 인지하여, 따라서 공여체 유래 이식에 대해 허용성을 형성한다.

본원에서, "성 스테로이드 제거", "성 스테로이드 매개 시그널링 저해", "성 스테로이드 파괴", "성 스테로이드 시그널링 중단" 및 유사 용어는, 직접 또는 간접적인 작용에 의한 성 스테로이드(및/또는 그외 호르몬) 생산 및/또는 성 스테로이드(및/또는 그외 호르몬) 시그널링의 일부분 이상의 파괴를 의미한다. 일예로, 흉선으로의 성 스테로이드 시그널링이 중지된다. 쉽게 이해되는 바와 같이, 성 스테로이드 매개 시그널링은 당업자에게 공지된 범위의 방식으로 파괴될 수 있으며, 일부는 본원에 개시되어 있다. 예컨대, 성 호르몬의 생산 저해 또는 1종 이상의 성 호르몬 리셉터의 차단은, 성 스테로이드 작용제 및/또는 길항제의 투여에서와 같이, 목적한 파괴, 또는 활성(항원) 또는 비활성(항원) 항-성 스테로이드 면역화를 수반할 것이다.

성 스테로이드 매개 시그널링의 파괴를 형성하기 위한 무제한적인 방법은 거세를 통한 것이다. 거세 방법으로는, 화학적 거세 및 외과적 거세가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

"거세"는 성 스테로이드 생산, 작용의 감소 또는 소거, 및/또는 체내에서의 파괴로 정의된다. 거세 바로 직전에 비해 흉선이 보다 충분하게 기능하고 있을 경우, 거세는 환자를 궁극적으로는 사춘기 이전으로 효과적으로 회귀시킨다. 외과적 거세는 환자의 생식선을 제거하는 것이다. 외과적 거세 방법은 숙련된 수의사와 의사들에겐 공지되어 있다. 비제한적인 수컷 동물의 거세 방법이 하기 실시예에 개시되어 있다. 그외 비제한적인 인간 환자를 거세하는 방법에는, 자궁절제술(hysterectomy) 또는 난소절제술 과정(여성 거세) 및 고환(남성 거세)을 제거하는 외과적 거제가 있다. 일부 임상 사례에서는, 물리적인 거세를 통한 영구적인 생식선 제거가 적합할 수 있다.

화학적 거세는 거세의 영구성이 낮은 형태이다. 본원에서 정의된 바와 같이, "화학적 거세"는 일정 시간 화합물을 투여하여 성 스테로이드 생산, 작용의 감소 또는 소거 및/또는 체내에서의 파괴를 발생시키는 것이다. 다양한 화합물들이 이러한 방식으로 작용할 수 있다. 이러한 화합물의 비제한적인 예로는, 성 세트로이드 저해제 및/또는 하기한 유사체들이 있다. 화합물 전달 및 이후 시기 동안, 환자의 호르몬 생산은 중단되거나 감소될 수 있다. 거세는 화합물 전달의 종결 또는 대응 성 호르몬의 전달에 의해 되돌려질 수도 있다.

용어 "성 스테로이드 유사체", "성 스테로이드 제거제", "성 스테로이드 저해제", "성 스테로이드 시그널링 저해제", "성 스테로이드 시그널링 변형제" 및 그외 유사한 용어는, 성 스테로이드(및/또는 그외 호르몬) 매개 시그널링을 감소, 파괴, 방지 또는 폐지시킬 수 있는 1종 이상의 약학적 물질을 나타낸다. GnRH (또한 LHRH 또는 GnRH/LHRH라고도 함) 및 그 유사체는 본 발명에 사용되는 성 스테로이드 시그널링 저해제의 비제한적인 예이다. 그러나, 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 본 발명의 실시시, GnRH/LHRH 또는 그 유사체는 본원에 기재된 다수의 성 스테로이드 저해제 치환체 또는 그 유사체들 중 어느 하나(하나 이상)을 별다른 실험없이 치환시킬 수 있다.

성 스테로이드를 제거하거나 또는 성 스테로이드 매개 시그널링을 중단시키는 모든 의약제 또는 그외 거세 방법은, 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 예컨대, 성 스테로이드 시그널링 저해, 흉선 재활성화 및/또는 BM 및 면역세포의 기능성 증진에 대한 비제한적인 방법중 한 가지는, 뇌하수체상의 GnRH의 정상적인 작용(즉, 고나도트로핀, FSH 및 LH의 분비)을 변형시켜, 그에 따라 생식선으로부터의 정상적인 성 스테로이드의 생산 및 분비를 감소시키는 것이다. 따라서, 일예의 경우, 성 스테로이드 제거는 GnRH 유사체와 같은 1종 이상의 성 호르몬 유사체의 투여에 의해 이루어진다. GnRH는 뇌하수체의 고나도트로핀, LH(leutinizing hormone) 및 FSH(follicle-stimulating hormone)의 분비를 자극하는 시상하부의 데카펩티드이다. 따라서, GnRH 작용제(예, Synarel^® 또는 Lupron^®)는 처음에 과잉의 리셉터 자극을 발생시키고, 피드백 기작으로 LHRH 리셉터의 탈민감화에 의해 FSH 및 LH의 뇌하수체내 생산을 억제할 것이다. 고나도트로핀은 생식선에 정상적으로 작용하여 성 스테로이드, 특히 여성은 에스트로겐을, 남성의 경우 테스토스테론을 분비시키고; 이러한 분비는 FSH 및 LH에 부재로 현저하게 감소된다. 이로 인한 직접적인 결과는, 성 스테로이드의 혈장내 수치가 떨어지는 것이며, 그 결과 흉선에서 저해 시그널이 점진적으로 방출된다. 순환성 성 스테로이드 수치의 매우 갑작스러운 감소는, 예컨대 GnRH 길항제의 사용에 의해 이루어질 수 있다.

일부 예들에서, 성 스테로이드 매개 시그널은, LHRH(leutinizing hormone-releasing hormone) 유사제와 같은 성 스테로이드 유사체의 투여에 의해 파괴된다. 성 스테로이드 유사체 및 이들의 치료 및 화학적 거세에서의 용도는 잘 알려져 있다. 성 스테로이드 유사체는 구입가능한 것으로, 이들의 치료 및 화학적 거세에 있어서의 용도는 공지되어 있다. 이러한 유사체로는, LHRH 리셉터(LHRH-R)의 하기 작용제들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 부세렐린(buserelin)(예, 부세렐린 아세테이트, 상표 Suprefact®(예, 0.5-02 mg s.c./day), Suprefact Depot®, 및 Suprefact® Nasal Spray(예, 2 ug/nostril, 8시간 마다), 미국 특허 4,003,884, 4,118,483 및 4,275,001에 개시된 Hoechst); 시스톨렐린®(Cystorelin)(예, 고나도렐린 디아세테이트 테트라하이드레이트, Hoechst); 데슬로렐린(deslorelin)(예, 데소렐린 아세테이트, Deslorell®, Balance Pharmaceuticals); 고나도렐린(예, 고나도렐린 하이드로클로라이드, 상표 Factrel®(100 ug i.v. 또는 s.c.), Ayerst Laboratories); 고세렐린(고세렐린 아세테이트, 상표 Zoladex®, AstraZeneca, Aukland, NZ, 미국 특허 4,100,274 및 4,128,638; GB 9112859 및 GB 9112825에 개시되어 있음); 히스트렐린(예, 히스테렐린 아세테이트, Supprelin®, (s.c., 10ug/kg. day), Ortho, EP 217659에 개시); 루프롤리드(루프롤리드 아세테이트, 상표: Lupron®; 또는 Lupron Depot®; ; Abbott/TAP, Lake Forest,IL, 미국 특허 4,490,291, 3,972,859, 4,008,209, 4, 992,421, 및 4,005,063; DE 2509783에 개시); 루프로렐린(예, 루프로렐린 아세테이트, 상표: ProstapSR®(예, 3.75 mg 단회 투여 s.c. 또는 i.m./month), 프로스텝3®(예, 단일 11.25mg 복용 s.c. 3개월 마다), Wyeth, USA, Plosker et al., (1994) Drugs 48: 930에 개시); 루트렐린 (Wyeth, USA, 미국 특허 4,089,946에 개시); 메테렐린®(Meterelin)(예, Avorelina (예, 10-15 mg 서방성 제형), EP 23904 및 WO 91/18016에 개시); 나파렐린(예, 상표: Synarel®; (i.n. 200-1800 ug/day), Syntex, 미국 특허 4,234,571; WO 93/15722; 및 EP 52510에 개시); 및 트립토렐린 (예, 트립토렐린 파모에이트; 상표: Trelstar LA®(11.25 mg 3개월간), Trelstar LA Debioclip®(pre-filled, single dose delivery), LA Trelstar Depot®(3.75 mg 1달간), 및 Decapeptyl®, Debiopharm S. A., Switzerland, 미국 특허 4,010,125, 4,018,726, 4,024,121 및 5,258,492; EP 364819에 개시). 또한, LHRH유사체로는 하기 LHRH-R의 길항제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 아바렐릭스(abarelix)(상표: Plenaxis^TM (예, 100 mg i.m. 1, 15 및 29일, 이후에는 4주마다), Praecis Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, MA) 및 세트로렐릭스(cetrorelix)(예, 세트로렐릭스 아세테이트, 상표: Cetrotide^TM(예, 0.25 또는 3 mg s.c.), Zentaris, Frankfurt, Germany). 추가적인 성 스테로이드 유사체로, Eulexin®(예, 플루타미드(예, 캡슐 2개 2x/day, 총 750 mg/day), Schering-Plough Corp., FR 7923545, WO 86/01105 및 PT 100899에 개시), 및 디옥산 유도체(예, EP 413209) 및 EP 181236, 미국 특허 4,608,251, 4, 656,247, 4,642,332, 4,010,149, 3,992,365, 및 4,010,149에 개시된 그외 LHRH유사체를 포함한다. 작용제들의 혼합, 길항제들의 혼합 및 작용제와 길항제의 혼합 역시 포함된다. 본 발명의 비제한적인 유사체중 하나는 데슬로렐린(미국 특허 4,218,439)이다. 보다 확장된 리스트로, Vickery et al. (1984) LHRH AND ITS ANALOG: CONTRACEPTIVE & THERAPEUTIC APPLICATIONS (Vickery et al., eds. ) MTP Press Ltd., Lancaster, PA를 참조한다. 각 유사체 역시 그것의 아세테이트, 시트레이트 또는 공지된 그외 염과 같은 변형 형태로 사용될 수 있다.

성 스테로이드 제거제의 비제한적인 투여 예는, GnRH 작용제의 "서방성" 디포(예, 1, 3 또는 4달 Lupron® 주사)의 피하/경피 주사이거나, 또는 "서방성" GnRH-함유 이식체의 피하/경피 주사(1 또는 3달 Zoladex®, 예, 3.6 mg 또는 10.8 mg 이식)이다. 또한 이는 적절한 제형에 따라 근육내(i.m.), 정맥내(i.v.) 또는 경구로 주어질 수 있다. 다른 예로는, 예컨대 Lupron®(예, Lupron epot®(디포 현탁액의 경우 루프롤리드 아세테이트) TAP Pharmaceuticals Products, Inc., Lake Forest, IL) 약 30 mg을 함유하는 "디포" 또는 "주입성 이식체(impregnated implant)"의 피하 주입하는 것이다. 30 mg의 Lupron® 주입은 성 스테로이드를 4달간 제거하는데 충분하여, 흉선이 회복되고 혈류로 새로운 원시 T 세포를 유출하는 것이 허용된다.

본원의 성 스테로이드 시그널링을 저해하는 많은 기작들은 공지된 것이며, 이러한 약물의 일부, 특히 GnRH 길항제들은 유방암, 전립선암, 자궁내막증(endometriosis), 생식계 질환, 다모증, 이른 사춘기, 성적 이상성을 포함한 일부 호르몬 민감성 암과 같은 생식기관계 질환의 치료 및 수정 조절에 다년간 사용되고 있다.

특정 예에서, 환자의 흉선은 성 스테로이드 제거 및/또는 성 스테로이드 매개성 시그널링의 중단 또는 파괴에 의해 궁극적으로 재활성화된다. 일부 사례에서, 파괴는 환자의 호르몬 상태를 역위시킨다. 본 발명의 방법에 있어서, 수용체의 호르몬 상태는 역위되어, 사춘기 이전의 수치에 도달한다. 성 스테로이드 호르몬을 수용체에서 낮춤으로써, 이러한 호르몬들의 흉선으로의 시그널링이 낮아지고 따라서, 흉선은 재활성화되게 된다. 환자는 사춘기이거나 또는 사춘기 이후일 수 있으며, 또는 환자는 흉선을 어느 정도 이상 퇴화시키는 질환을 가질 수 있다(또는 질환자이다.). 또한 상기 환자는 질환의 치료중이며(또는 치료제 복용중이며)며, 상기 질환의 치료는 환자의 흉선을 일정 부분 이상 퇴화시킨다. 이러한 치료는 항-바이러스, 면역억제, 화학요법 및/또는 방사선 치료일 수 있다. 다른 예에서, 상기 환자는 폐경기이거나 또는 그외 방법, 예컨대 외상, 약물 등에 의해 성 스테로이드(또는 그외 호르몬 수치)가 감소된 상태이다.

성 스테로이드 제거 또는 성 스테로이드 매개 시그널링의 중지는 BM 및/또는 면역계 세포에 한가지 이상의 직접적인 영향을 미치며, 기능성이 향상된다. 상기 효과는 흉선 재활성화 이전제, 또는 동시에 발생될 수 있다.

일부 예에서, 성 스테로이드 제거 또는 성 스테로이드 시그널링 저해는, 안드로겐 차단제(예, 비칼루타미드(bicalutamide), 상표: Cosudex® 또는 Casodex®, 5-500 mg, 예, 50 mg po QID, AstraZeneca, Aukland, NZ)와 같은 항-안드로겐의 단독 투여 또는 LHRH 유사제 또는 그외 거세 방법의 병용 투여에 의해 이루어진다. 성 스테로이드 제거 또는 성 스테로이드 시그널링의 중단은 또는, 프로게스틴으로 작용하는 시프로테론 아세테이트(cyproterone acetate)(상표: Androcor®, Shering AG, Germany; 예, 10-1000 mg, 100 mg bd 또는 tds, 또는 300 mg IM 매주, 17-하이드록시프로게스테론 아세테이트)의 단독 투여나 또는 LHRH 유사제 또는 그외 거세 방법의 병행 투여에 의해 이루어진다. 그외 항-안드로겐(예, 이미다졸 클래스의 항진균 물질, 예컨대 리아로졸(Liazol® 예, 150 mg/day, an 아로마타제 저해제) 및 케토코나졸(ketoconazole), 플루타미드(flutamide)(상표: Euflex® 및 Eulexin®, Shering Plough Corp, N. J.; 50-500 mg 예, 250 또는 750 mg po QID), 메게스트롤 아세테이트(Megace® 예, 480-840 mg/day 또는 닐루타미드(nilutamide)(상표: Anandron® 및 Nilandron®, Roussel, France 예, 경구 150-300 mg/day))가 사용될 수 있다. 항-안드로겐은 GnRH 유사체에 의한 신호(flare)를 지정하는데 일반적으로 활용되므로, 치료법에서 종종 중요하다. 일부 항-안드로겐들은 안드로겐 리셉터 전이(translocation)를 저해하는 것으로 작용하여, 음성 피드백을 중지시켜 테스토스테론 수치를 증가시키고 생명력/효능 소실을 최소한으로 줄인다. 본 발명에 유용한 그외 항-안드로겐 클래스로는, 선택적 안드로겐 리셉터 모듈레이터(SARMS)(예, 퀴놀린 유도체, 비칼루타미드(상표: Cosudex® 또는 Casodex®), 및 플루타미드(flutamide)(상표: Eulexin®, 예, 경구, 250mg/day))가 있다. 그외 공지된 항-안드로겐으로는, 5 알파 리덕타제 이소엔자임 둘다를 저해하여 보다 우수하고 보다 신속한 DHT 억제를 초래하는 5 알파 리덕타제 저해제(예 투타스테리드(dutasteride)(예, po 0.5 mg/day)); 5 알파 리덕타제2를 저해하여 DHT를 생산하며, 테스토스테론 또는 LH 수치에 거의 또는 아무런 영향을 미치지 않는 피나스테리드(finasteride)(상표: Proscar®; 0.5-500 mg, 예, 5 mg po 매일)가 있다.

그외 예들에서, 성 스테로이드 제거 또는 성 스테로이드 시그널링 저해는, 항-안드로겐의 단독 투여 또는 LHRH 유사체 또는 그외 거세 방법과의 병용 투여에 의해 이루어진다. 일부 항-에스트로겐(예, 아나스트로졸(anastrozole)(상표: Arimidex®), 및 풀베스트란트(fulvestrant)(상표: Faslodex®, 10-1000 mg, 예, 250 mg IM 매달)은 에스트라디올과 유사하게 고친화성으로 에스트로겐 리셉터(ER)과 결합하는 방식으로 작용하여, 따라서, 에스트로겐의 결합을 저해한다. Faslodex® 결합은 또한 리셉터에 배위 변화와 에스트로겐 리셉터의 하위 조절을 유발하지만 FSH 또는 LH 수치에는 유의할만한 변화를 유발하지 않는다. 그외 항-에스트로겐에 대한 비제한적인 예로는, 타목시펜(상표: Nolvadex®); 클로미펜(Clomiphene)(상표: Clomid®) 예, 작용제/길항제 특성이 혼합된 고나도트로핀 분비를 자극하는 비스테로이드계 ER 리간드 50-250mg/day; 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol)((DES), 상표: Stilphostrol®) 예, 1-3 mg/day, 에스트론과 유사하지만 더 높은 에스트로겐 활성을 나타내며, 따라서 에스트로겐 작용제로 간주되지만, 안드로겐 및 에스트로겐 둘다에 결합하여 뇌하수체에 의한 FSH 및 LH 생산에 피드백 저해를 유발함, 디에틸스틸베스트롤 디포스페이트 예, 50 to 200 mg/day; 뿐만 아니라 각각이 길항제로 작용하는 다나졸(danazol), 드롤록시펜(droloxifene) 및 요오드옥시펜(iodoxyfene)가 있다. 그외 단독으로 또는 기타 거세 방법과 병용하여 사용될 수 있는 항-에스트로겐 클래스는, 선택적 에스트로겐 리셉터 모듈레이터(SERMS)(예, 토레미펜(toremifene)(상표: Fareston®, 5-1000 mg, 예, 60 mg po QID), 랄록소펜(raloxofene)(상표: Evista®), 및 타목시펜(tamoxifen)(상표: Nolvadex®, 1-1000 mg, 예, 20 mg po bd)로, 이는 뼈 및 심혈관계의 에스트로겐 리셉터에 대해 작용제로서, 유선의 에스트로겐 리셉터에게는 길항제로 작용한다. 에스트로겐 리셉터 하위 조절자(ERDs)(예, 타목시펜(tamoxifen)(상표: Nolvadex®)) 역시 본 발명에 사용될 수 있다.

단독으로 또는 그외 거세 방법과 병용하여 사용될 수 있는 성 스테로이드 시그널링 저해방법의 비제한적인 예는, 아로마타제 저해제 또는 그외 부신 차단제들(예, 아미노글루테티미드, 포르메스탄, 보라졸, 엑세메스탄, 아나스트로졸(상표: Arimidex®, 0.1-100 mg, 예, 1 mg po QTD), 에스트라디올을 낮추고 LH 및 테스토스테론을 증가시킴), 레트로졸(letrozole)(상표: Femarat®), 0.2-500 mg, 예, 2.5 mg po QID) 및 엑시메스탄(exemestane)(상표: 아로마신® 1-2000 mg, 예, 25 mg/day); 알도스테론(aldosterone) 길항제(예, 스피로놀락톤(spironolactone)(상표: Aldactone®) 예, 100 to 400 mg/day), 이는 안드로겐 시토크론 P-450 리셉터를 차단함) 및 에플레레논(eplerenone), 선별적 알도스테론-리셉터 길항제), 항프로게스토겐(예, 메드록시프레게스테론(medroxypregesterone) 아세테이트, 예. 5 mg/day, 테스토스테론 합성 및 LH 합성 저해함); 및 선택적 프로게스테론 반응 모듈레이터(SPRM)(예, 메게스트롤 아세테이트 예, 160 mg/day, 미페프리스톤(mifepristone)(RU486, Mifeprex®, 예, 200 mg/day)와 같은 프로게스틴 및 항-프로게스틴; 및 그외 에스트로겐/항-에스트로겐 활성을 가진 화합물들(예, 피토에스트로겐(phytoestrogen), 플라본(flavone), 이소플라본(isoflavone) 및 코우메스탄 유사체(coumestan derivative), 리간드 및 페놀 고리를 가진 산업 화합물(예,DDT))을 포함한다. 또한, 항-GnRH 백신(예, Hsu et al., (2000) Cancer Res. 60: 3701; Talwar, (1999) Immunol. Rev. 171: 173-92 참조), 또는 전술한 약물에 의해 형성되는 효과를 모방하는 그외 모든 약제들 역시 사용될 수 있다. 또한, 흉선 및/또는 BM에 특이적으로 표적화될 수 있는 스테로이드 리셉터계 모듈레이터(steroid receptor based modulator) 역시 개발 및 사용될 수 있다. 성 스테로이드 시그널링을 저해하는 다수의 기작들이 공지되어 있다. 각 약물은 또한 당업계에 공지된 아세테이트, 시트레이트 및 그외 염 화합물과 같이 변형된 형태로 또한 사용될 수 있다.

호르몬 시스템의 복합적이고 조화로운 피드백 기작으로 인해, 성 스테로이드 투여시 성 스테로이드 시그널링 저해가 발생될 수 있다. 예컨대 에스트라디올은 고나도트로핀 생산을 감소시키고 GnRH 작용에 민감하다. 그러나, 에스트라디올의 고농도는, 고나도트로핀 동요를 초래한다. 이처럼, 프로게스테론은 빈번하게 영향을 미쳐 다량의 LH가 분비된다. 남성의 경우, 테스토스테론은 고나도트로핀 생산을 저해한다. 에스트로겐을 남성에게 투여시, LH 및 테스토스테론이 감소되고, 항-에스트로겐은 LH를 증가시킨다.

다른 예에서, 프로락틴은 환자에게서 저해된다. 성 스테로이드 매개 시그널링을 저해하는 다른 방식은, 프로락틴 수치의 직접적인 또는 간접적인 모듈레이션에 의한 방식일 수 있다. 프로락틴은 전호르몬 형태로 합성되는 단일 체인의 단백질이다. 프로락틴의 정상적인 기준은 남성이고, 비임신 여성은 통상 약 0 내지 20 ng/ml의 범위이지만, 임신시에는 약 10 내지 300 ng/ml이다. 전체적으로 프로락틴의 수백가지의 작용들이 보고되어 있다. 프로락틴은 여성의 유방 발생 및 모유 생성을 촉진한다. 비정상적인 프로락틴은 뇌하수체 종양, 월경 불순, 불임, 발기부전 및 젖분비과다(모유 생산)에 관여되는 것으로 알려져 있다. 상당한 연구들이 정상 및 병원체에 대한 면역 반응에서의 프로락틴의 역할을 설명하고자 진행중에 있다. 프로락틴은 몇가지 면역 기능에서 조절 역할을 하는 것으로 보이지만, 고프로락틴혈증이 면역억제성이라는 추론이 입증되어야 한다(Matera L, Neuroimmunomodulation. 1997 Jul- Aug; 4 (4): 171-80). 약학적 투여량으로의 프로락틴 투여는, 패혈증 마우스에서의 생존율 감소 및 세포성 면역 기능 저해와 관련되어 있다(Oberbeck R, J Surg Res. 2003 Aug ; 113 (2): 248-56). 프로락틴의 도파민성 저해를 줄이고 고프로락틴혈증을 발생시키는 다수의 약물들이 있다. 항-도파민성 약물로는, 할로페리돌(haloperidol), 플루페나진(fluphenazine), 설피리드(sulpiride), 메토클로프라미드(metoclopramide) 및 모의관 상위의 운동 장애를 임상적으로 관리하기 위해 개발된, 모의 운동촉진제(gastrointestinal prokinetics)(예, 브로모프리드(bromopride), 클레보프리드(clebopride), 돔페리돈(domperidone) 및 레보설피리드(levosulpiride))을 포함한다.

인히빈(Inhibin) A 및 B 펩타이드는 생식선에서 고나도트로핀에 대한 반응으로 제조되고, 뇌하수체를 하향 조절하고 FSH를 억제한다. 액티빈(Activin)은 GnRH 리셉터를 정상적으로 상향 조절하고 FSH 합성을 촉진하지만 과잉 생산은 성 스테로이드 생산을 중지시킬 수 있다. 따라서, 이러한 호르몬들은 성 스테로이드 매개 신호의 저해를 표적일 수 있다.

특정 예에서, LHRH-R 길항제는 환자에게 전달되고, LHRH-R 작용제가 따른다. 예컨대, 길항제는 5-8일간 거세를 유발하는 충분한 투여량으로 1회 주사될 수 있다(이는, 예컨대 Abarelix의 경우 정상이다.). 성 스테로이드가 거세 수준에 도달하면, 작용제가 주어진다. 이러한 프로토콜은, 성 스테로이드 생산 감소 적에, 작용제 투여에 이해 형성될 수 있는 성 스테로이드 생산의 임의 상승을 제외하거나 또는 제한한다. 다른 예에서, 성 스테로이드 생산 상승을 거의 또는 전형 창출하지 않는 LHRH-R 길항제는 LHRH-R 길항제 선투여와 함께, 또는 선투여 없이 사용된다.

성 스테로이드 시그널링 저해

성 스테로이드는 다수의 안드로겐, 에스트로겐 및 프로게스틴 호르몬 분자 계열을 포함한다. C21 스테로이드의 프로게스틴계에 속하는 비제한적인 일원으로는, 프로게스테론, 17α-하이드록시 프로게스테론, 20α-하이드록시 프로게스테론, 프레그난디온(pregnanedione), 프레그난디올(pregnanediol) 및 프레그네놀론(pregnenolone)을 포함한다. C19 스테로이드의 안드로겐 계열에 속하는 비제한적인 일원으로는, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스테론(DHT), 안드로스탄디온, 안드로스탄디올, 디하이드로에피안드로스테론 및 17α-하이드록시 안드로스텐디온을 포함한다. C17 스테로이드의 에스트로겐 계열에 속하는 비제한적인 일원으로는, 에스트론, 에스트라디올-17α 및 에스트라디올-17β가 있다.

성 스테로이드에 의한 시그널링은 생합성, 분비, 대사, 구획화(compartmentalization), 및 작용을 포함하는 복잡한 경로 구성의 성과의 최종 결과이다. 이러한 부분들은 충분히 파악되지 않았고; 그럼에도 불구하고 성 스테로이드 시그널링 저해를 이루기 위한, 여러가지 기존의 가능성있는 기작들이 있다. 본 발명에서 성 스테로이드 시그널링 저해는, 생합성 또는 대사, 표적 세포상 또는 세포의 성 스테로이드 리셉터의 결합 및/또는 세포간 성 스테로이드 시그널링을 변형에 의해, 생체이용가능한 성 스테로이드 호르몬을 세포 수준, 즉 '자유' 수준으로 변형함으로써 성취된다.

시그널링 경로에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 미치는 것은 가능하다. 직접적인 방법으로는, 성 스테로이드 생합성 및 대사에 대한 영향을 미치는 방법, 각 리셉터에 결합하는 방법 및 세포내 시그널 변형 방법이 있다. 간접적인 방법으로는, 뇌하수체 및 생식선에 존재하는 펩티드 호르몬 및 성장인자와 같이, 성 스테로이드 호르몬 생산 및 작용에 영향을 미치는 것으로 알려진 방법을 포함한다. 후자에는, 뇌하수체에서 제조되는 FSH(follicle stimulating hormone), LH(luteinizing hormone) 및 액티빈과, 생식선에서 제조되는 인히빈, 액티빈 및 인슐린계 성장 인자-1(IGF-1)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

당업자는, 이를 암호하고 조절하는 핵산 또는 성 스테로이드 작용을 변형할 수 있는 분자를 포함한, 그 분자의 직접적인 작용 또는 분자 전구제의 작용에 의해, 관련 호르몬, 효소, 리셉터, 결합성 분자 및/또는 리간드의 수준으로 전술한 변형을 만듬으로써 성 스테로이드 시그널링이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

직접적인 시그널링 저해방법

생합성

생합성 속도는, 성 호르몬 생산, 그러므로 혈청내 '자유' 호르몬의 생체이용성에서의 주된 속도 결정 단계이다. 초기 경로에서 P450 콜레스테롤 분지 절단(P450 cholesterol side chain cleavage)(P450scc)과 같은 주된 효소의 저해는, 주된 모든 성 스테로이드의 생산을 감소시킬 것이다. 반면에, 후기 경로에서의 안드로겐을 에스트로겐 또는 테스토스텔론을 DHT로 변환시키는 5알파-리덕타제로 전화하는 P450 아로마타제(P450arom)와 같은 효소의 저해는, 에스트로겐 또는 DHT 각각의 생산에만 영향을 미칠 것이다. 성 스테로이드 호르몬 생합성의 중요한 부분은, 불활성형을 생활성의 스테로이드로의 변환을 촉매하는, 예컨대 17-하이드록시스테로이드 디하이드로게나제(17HSD)에 의해 안드로스텐디온을 테스토스테론으로 또는 에스트론을 에스트라디올-17β로 변환시키는, 산화환원 효소 계열이다. 이러한 효소들은 조직 및 세포 특이적이며, 일반적으로 산화 또는 환원 반응을 촉매하며, 예컨대 17β HSD타입 3은 고환의 Leydig 세포에서 주로 발견되고, 반면에 17β HSD 타입 1은 난소에서 발견된다. 따라서, 이는 활성 형의 안드로겐 또는 에스트로겐 생산을 특이적으로 감소시키는 가능성을 제공한다.

이미 임상적으로 사용되거나 또는 개발중인 스테로이드 생합성 경로의 효소 저해제가 많이 알려져 있다. 이러한 치료 양상과 이들의 예들이 일부 상기에 나열되어 있다. 이러한 효소 저해제의 작용은 대사 안정성에 필수적인 부신으로부터의 글루코코르티코이드 및 미네랄로코르티코이드와 같은 기타 스테로이드의 생산에 과도한 영향을 미치지 않는다. 이러한 저해제를 이용하는 경우, 환자에게 치환체 글루코코르티코이드 및 때때로 미네랄로코르티코이드를 제공하는 것이 필수적일 수 있다.

성 스테로이드 생합성은 다양한 부위에서 발생되며 다중 경로를 활용하고 난소 및 고환에서 우세적으로 생산되지만, 지방과 같은 그외 조직에서 유도체가 합성될 뿐만 아니라 부신에서 일부 생산된다. 따라서, 성 스테로이드 시그널링을 저해하는 다수 기작들은 충분한 저해를 확보하는데 요구되어 본 발명을 이룰수 있다.

대사 및 구획화

성 스테로이드 호르몬은 특히 간에 의한 신속한 대사와 신장 및 지방세포에 의한 소거로 인해 혈액에서 일반적으로 약 몇분의 짧은 반감기를 가진다. 대사는, 환원뿐만 아니라 글리코실레이션 및 설페이션에 의한 접합을 포함한다. 이러한 대사의 일부는 프로호르몬, 예컨대 에스트론 설페이트로서 또는 환원된 안드로겐과 같은 고유 생활성 형태를 통해 생물학적 활성을 유지하고 있다. 대사 속도에 대한 모든 간섭은, 성 스테로이드 호르몬의 '자유' 수준에 영향을 미칠 수 있지만, 이를 이루기 위한 방법은 생합성에 영향을 미치는 방법처럼 현재 이용가능하지 않다.

'자유' 성 스테로이드 호르몬 수준을 감소시키는 다른 방법은, 성 스테로이드 호르몬을 혈청내 단백질에 결합시켜 구획화하는 것으로, 예컨대 성 호르몬 결합성 글로불린, 코르티코스테로이드-결합성 글로불린, 알부민 및 테스토스테론-에스트라디올 결합성 글로불린가 있다. 성 스테로이드 리간드에 결합시, 운반체 같은 물질들은 성 스테로이드가 리셉터에 결합에 이용되지 못하도록 한다. 결합성 증가는 SHBG와 같은 운반체의 수치 증가 또는 성 스테로이드에 결합하는 그외 리간드, 예컨대 가용성 리셉터의 도입을 발생시킬 수 있다. 또한 운반체 물질의 수치 감소는 성 스테로이드가 분해되기 쉽게 만들 수 있다.

특정 성 스테로이드 호르몬에 대한 활성의 또는 비활성의 면역화는, 구획화의 한가지 형태이다. 에스트로겐 또는 안드로겐에 대한 면역화한 후 동물에서 배란율을 성공적으로 증가시키는 문헌에 예시되어 있다. 성 스테로이드는 세포로부터 분비낭(secretory vesicle)으로 분비된다. 분비 기작의 저해 또는 변형은 성 스테로이드 시그널링을 저해하는 다른 방법이다.

리셉터 및 세포내 시그널링

성 스테로이드는 세포내 또는 최근에 확인된 바와 같인 표적 세포막일 수 있는 특이 리셉터를 통해 세포에 작용한다.

세포내 리셉터는 핵 리셉터 슈퍼패밀리의 일원이다. 세포의 세포질에 위치되어 있으며, 성 스테로이드 호르몬과 결합한 후 특이 유전자의 전사를 변이하는 핵으로 이동한다. 성 스테로이드 호르몬에 대한 리셉터는 여러가지 형태로 존재한다. 공지된 것으로는 두가지 형태의 프로게스테론 리셉터, PRA 및 PRB 및 3가지 형태의 에스트로겐 리셉터, ERα, ERβ1 및 ERβ2가 있다. 성 스테로이드 반응 요소에 성 스테로이드 호르몬 리셉터가 유전자의 프로모터 부위에 결합하며 그 반응으로 유전자의 전사가 여러가지 방식으로 변형될 수 있다. 공통-활성자 및 공통-억제자가 스테로이드-리셉터 복합체의 DNA 결합을 변형하여 전사에 작용할 수 있는 표적 세포의 핵내에 존재한다. 이러한 공통-활성자 및 공통-억제자의 다수 동정물들이 알려져 있으며, 스테로이드 리셉터에 대한 이들의 작용을 변형시키는 방법은 현재 연구 대상이다. 성 스테로이드 호르몬에 관여하는 전사 인자의 예로는, NF-1, SP1, Oct-l 및 TFIID가 있다. 이러한 공통-조절자들은 스테로이드의 충분한 작용에 요구된다. 핵 조절자의 작용의 변형시키는 방법은, 길항제를 이용하거나 또는 조절자를 코딩하는 유전자 발현을 조절함으로써 활성자 및 억제자간의 균형에 관여한다.

최근에 에스트로겐 및 프로게스테론의 특이 리셉터가 세포내 PR과는 그 구조가 상이한 세포의 막에서 확인되었다. 게놈에 작용하는 기존의 스테로이드 리셉터들과는 달리, 이들 리셉터들은 아직 환전히 파악되지 않은 세포내 경로를 통해 신속한 비게놈적인 작용을 전달한다. 막 리셉터와 상호작용하는 에스트로겐이 세포 증식과 관계있는 스핑고신 경로를 활성화시키는 것으로 한 보고서에서 제시되었다.

세포질 리셉터를 통해 스테로이드 작용을 변이시키는데 이용가능하거나 또는 개발중인 방법들이 있다. 이 경우, 특이적인 스테로이드 리셉터와 상호작용하는 항-안드로겐, 항-에스트로겐 및 항-프로게스틴이 문헌에 공지되어 있으며, 전술한 바와 같인 임상적으로 이용되고 있다. 이들의 작용은 리셉터에 대해 경쟁하거나 차단하거나 또는 리셉터 수준, 민감성, 배위, 조립 또는 시그널링을 변형시키는 것일 수 있다. 이러한 약물은 스테로이드 및 비스테로이드, 경쟁적 및 비경쟁적과 같은 여러가지 형태이다. 특히 주목되는 것은, 선택적 리셉터 모듈레이터, SARMS, SERMS 및 SPRM이며, 이들은 특정 조직을 표적으로 하며 상기에서 설명되었다.

리셉터의 하향 조절은 2가지 방식으로 이루어질 수 있다; 첫번째는, 과잉 작용제(스테로이드 리간드)에 의한 것이고, 두번째는 리셉터를 코딩하는 해당 유전자의 전사 저해에 의한 것이다. 첫번째 방법은 타목시펜과 같은 선택적 작용제를 이용하여 실시할 수 있다.

시그널링을 저해하는 간접 방법

생합성

성 스테로이드 시그널링을 저해하는 간접 방법들중 하나는, 이용율 변형에 의한 또는 생식선에서 성 스테로이드 호르몬의 생합성 유도를 초래하는 뇌하수체의 고나도트로핀, FSH 및 LH 작용에 의한 해당 스테로이드 생합성을 하향 조절하는 것이다. FSH 분비의 알려진 저해제 중 하나는 인히빈으로, FSH에 대한 반응으로 생식선에서 생산되는 호르몬이다. 인히빈의 동물 투여는, FSH의 뇌하수체 분비를 감소시켜 형청내 FSH 수치를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 두가지 고나도트로핀의 감소를 수행하는 가장 잘 알려진 방법은 시상하부 호르몬, GnRH/LHRH를 통한 것으로, 이는 뇌하수체의 FSH 및 LH 합성 및 분비를 유도한다. FSH 및 LH 분비를 감소시켜 생식선의 성 스테로이드를 생산하게 하는 GnRH 작용제 및 길항제는, 현재 임상적으로 이용가능하다.

성 스테로이드 호르몬의 생합성을 감소시키는 다른 간접적인 방법은, FSH 및 LH의 작용을 생식선 수준으로 변형시키는 것이다. 이는 FSH 및 LH에 대해 직접적인 항체를 이용하거나, 또는 성 스테로이드 호르몬을 생산하는 생식선 세포상의 각 해당 리셉터에 대해 FSH 및 LH와 경쟁하도록 고안된 분자를 이용함으로써 수행 될 수 있다. 생식선 세포상에서 FSH 및 LH의 작용을 변형시키는 다른 방법은, 고나도트로핀 작용의 공통-조절자에 의한 것이다. 예컨대, 액티빈은 난소의 포막세포 와 고환의 Leydig 세포의 역량을 감소시켜, LH에 대한 반응으로 안드로겐을 생산할 수 있다.

단일 펩티드 GnRH와 같은 단일 펩티드의 절단 저해와 같은 변형은, 호르몬의 전구체 수준에서 이루어질 수 있다.

리셉터 및 세포내 시그널링

성 스테로이드 호르몬의 시그널링 작용을 변형시키는 간접적인 방법으로는, 스테로이드의 게놈 또는 비게놈적인 작용을 이끄는 리셉터 경로의 하향 조절을 포함한다. 이의 예는 표적 조직에서의 프로게스테론의 ER 수치의 하향 조절력이다. 가능한 방법으로는, 세포의 스테로이드의 반응성 감소를 도출하는 세포 핵의 리셉터 공통-조절자에 작용하는 것으로 공지된 물질을 이용한 치료를 포함한다.

추가적인 인자들

BM 기능성, BM 림프구 형성 및 면역세포 기능성에 대한 간접적 또는 직접적으로 작용하는 자극은 성 스테로이드의 작용 저해 및/또는 LHRH 유사체의 직접적인 작용 저해를 본래 토대로 하지만, 흉선, BM,및/또는 면역 세포 작용과 기능성을 증진 또는 증가(부가적, 상승적 또는 상보적)하도록 행동할 수 있는 추가적인 물질을 포함하는 것이 유용할 수 있다. 추가적인 물질이 사용되거나 사용되지 않을 수 있다. 이러한 화합물로는, 인터루킨-2 (IL-2; 100,000 내지 1,000,000 IU, 예, 600,000ILT/Kg 매 8시간 마다 IV 반복 투약), 인터루킨-7(IL-7; lO ng/kg/day 내지 lOO mcg/kg/day 개체에게 치료학적 재량으로), 인터루킨-15(IL-15; 0.1-20 mug/kg IL-15/day), 인터루킨11(IL-ll; 1-1000 ㎍/kg), 상피 및 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 일원, 줄기 세포 인자(SCF; 또한 스틸 인자나 c-kit 리간드라고 함; 0.25-12.5 mg/ml), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF; 1 and 15, ㎍/kg/day IV 또는 SC), 과립구 대식세포 자극 인자(GM-CSF; 50 - 1000 ㎍/sq meter/day SC 또는 IV), 인슐린 의존적 성장 인자(IGF-1), 및 각질형성세포 성장 인자(KGF; 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg/day)(참조, 예, Sempowskiet al., (2000) J. Imniunol. 164: 2180; Andrew and Aspinall, (2001) J. Immunol. 166: 1524-1530; Rossi et al.,(2002) Blood 100: 682); 에리트로포이에틴(EPO; 10-5OO units/kg IV 또는 SC)와 같은 사이토카인 및 성장인자들이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명과 동시에 또는 연속적으로 병용 투여되기에, 적절한 그외 헤마토포이에틴, CSF, 사이토카인, 림포카인, 조혈 성장 인자 및 인터루킨의 비제한적인 예로는, Meg-CSF(Megakaryocyte-Colony Stimulating Factor, 최근에 c-mpl 리간드라 함), MIF(Macrophage Inhibitory Factor), LIF (Leukemia Inhibitory Factor), TNF (Tumor Necrosis Factor), IGF, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), M-CSF, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, LIF, flt3/flk2, 인간 성장 호르몬, B-세포 성장 인자, B-세포 분화 인자 및 호산구 분화 인자, 또는 이들의 혼합을 포함한다.

이러한 1종이상의 추가적인 화합물(들)은, 처음 LHRH 유사체(또는 그외 거세법) 적용시 한번 사용될 수 있다. 각 처리는 작용제, 길항제 또는 그외 모든 성 스테로이드 파괴 형태와의 조합 형태로 주어진다. 성장 인자는 비교적 반감기가 짧아(예, 수시간), 이들은 매일 처리될 필요가 있을 수 있다(예, 7일간 또는 그이상 매일). 성장 인자/사이토카인은 제조사에 의해 지정된 바와 같이, 이들의 생물학적 활성이 보존되는 최적 형태, 예컨대 정제된 단백질 형태로 제공된다. 그러나, 이들 물질중 하나 또는 조합의 추가적인 투약은 BM 및 그외 면역 세포의 기능성을 더 자극하기 위한 임의의 시간에 제공될 수 있다. 특정 경우에, 성 스테로이드 제거 또는 성 스테로이드 시그널링의 중단은, 추가적인 사이토카인, 성장인자 또는 이들 혼합의 조합 투여와 동시에 행해된다. 다른 경우에, 성 스테로이드 제거 또는 성 스테로이드 시그널링 중단은 추가적인 사이토카인, 성장인자 또는 이들 혼합의 조합 투여와 연속적으로 행해된다.

용어 "가동화제"는 BM으로부터 줄기 세포의 가동성을 증진하는, SDF-1(예, AMD3100), 성장 호르몬, GM-CSF, G-CSF 및 화학요법제(예, 사이클로포스파미드)와 같은 물질을 의미한다.

G-CSF 및 GM-CSF는 각각 과립구(일차적으로 호중구) 및 대식세포의 생산을 가동시키는 것으로 알려져 있으며, 또는 그 결과 BM으로부터 항원 기회 감염에 대한 환자의 비특이적 면역 반응 제공을 도와주는 DC의 생산을 증가시킨다(Janeway et al., (2001) Immunobiology 5th Ed. , p. 325). 임상적으로, 예컨대 G-CSF와 GM-CSF는 골수억제성 항암제를 복용하는 비골수종 암 환자의 감염 기회(발열성 호중성백혈구감소증에 의해 나타난바와 같이)를 감소시키기 위해 사용되며, 이는 중증 호중성백혈구감소증 및 열의 현저한 발생률과 일반적으로 관련되어 있다. 또한 이러한 약물들은 HSCT를 복용중인 환자에게서 감염을 예방하기 위해 임상적으로 승인받았다. G-CSF와 GM-CSF는 현재 말초 혈액 전구 세포 수집 또는 치료중인 환자에서 사용된다. BM 줄기 세포의 분화 및/또는 증식을 자극하는 집락 자극 인자(CSFs)는, 표준이하의 조혈 줄기세포 유래 세포 수준 복구에 있어서의 이들의 치료학적 잠재성으로 인해, 많은 관심을 받고 있다. 인간과 설취류 모두에서, CSF는 상동하며, 이들의 활성에 따라 식별된다. 예컨대 과립구-CSP(G-CSF)와 대식세포-CSF(M-CSF)는 호중구 과립구 및 대식세포 집락의 생체외 형성을 촉진시키고, 반면에 GM-CSF와 인터루킨-3(IL-3)는 더 광범위한 활성을 가지며 두가지 대식세포, 호중구성 과립구 집락 및 호산성 과립구 집락의 형성을 촉진한다. 또한 IL-3도 비만세포, 거대핵세포, 순수 및 혼합된 적혈구 집락(에리트로포이에틴 첨가시) 형성을 촉진한다. GM-CSF은 호중구 회복을 가속화하고, 기능적 역량을 유지하지만 여전히 혈소판 회복에 대한 영향은 거의 입증되지 않았다. 반면에, IL-3은 호중구 및 단핵구에서 보다 느린 회복 증가를 촉진시키고, 혈소판 회복을 가속화한다.

따라서, G-CSF 및/또는 GM-CSF는 본 발명의 일부 방법에 사용된다. 성 스테로이드 제거와 G-CSF 및/또는 GM-CSF 치료 병행(연속적으로 또는 동시에)으로, BM에서의 림프구 및 전구 세포의 유출이 증가되며, 순차적으로 감염 환자 또는 감염으로 추측되는 환자에서 단기간 및 장기간의 성과를 현저하게 향상시킨다. 다른 방법으로, CSF는 화학요법 또는 방사선 치료 후 3-4일 경과시 투여된다. CSF 사용과 관련있는 기존 임상적인 성과는 또한 성 스테로이드 시그널링의 중단에 의해 현저하게 증진된다. 특히, 본 발명의 방법과 CSF를 병행 사용함으로써, 예컨대 암 방사선 조사 또는 화학요법을 맏는 환자에서 보다 효과적으로 감염을 통제할 수 있다. 또한, 면역계는 효과적이고도 신속하게 "재가동"되면, 화학요법 약물 또는 방사능 치료를 증가된 투여량 및/또는 빈도로 사용할 수 있다. 이는 동종이계의 또는 자가 HSC의 도입의 병행 또는 병행없이 이루어질 수 있으며, 면역계 기능성의 적시적인 복귀를 더욱 증진한다. 또한 거세는 이식되는 HSC의 수적 감소를 유발하여, 공여체로부터 한정된 수의 HSC를 수득할 수 있거나 또는 탯줄혈액내 줄기세포를 이식체로 사용하는 경우에 유용할 것이다.

예컨대, 2가지 각각의 클래스의 약물(예, GnRH 유사체 Lupron® 및 안드로겐 차단제 Cosudex®)의 동시 사용은, 동일한 면역계 재생을 허용할 수 있지만 G-CSF 또는 GM-CSF의 감소된 투약이 요구될 수 있다. 유사하게, 2가지 각각의 클래스 약물의 동시 사용으로, 면역계 세포의 동일한 회복을 크게 또는 좀더 연기시킬 수 있으나, 동일한 함량의 G-CSF 또는 GM-CSF가 사용된다. 또한 2가지 별개의 클래스에 속하는 약물의 동시 사용으로, 면역계 세포가 동일하게 회복될 수 있으며, 성 스테로이드 시그널링의 제거 또는 중판에 사용된 약물, 약물의 조합은 감소된 함량으로 사용된다(즉, 전립선암, 자궁내막증 또는 유방암의 치료에 사용되는 함량을 "정상적으로" 사용하는 것에 비해 감소된). 또한 이러한 2가지 별개의 클래스에 속하는 약물의 동시 사용은, 면역계 세포의 회복을 증가시키거나 또는 연기시키고, 성 스테로이드 시그널링을 제거 또는 중단하는데 사용되는 약물 또는 약물의 조합을 감소된 함량으로 사용한다.

지시

성 스테로이드 제거 또는 성 스테로이드 시그널링 중단을 초래하는 것으로 알려진 약물의, 전술한 성장 인자 및 사이토카인과의 병용 또는 단독 사용은 하기로 사용될 수 있다: HSC 생착에 보조약으로서(예, 실시예 22 참조); 동종이계 또는 자가 기관이나 세포 이식체의 효과적인 처치에 보조약으로서(예, 실시예 21 및 22과 계류중인 미국 특허 출원번호 10/419,039 및 10/749,119 참조). 이러한 질환에서의 약물 사용으로, 매우 효과적인 치료 성과나 보다 효과적인 전체 치료 프로코톨중 어느 하나가 이루어질 것이다. 또한 실시예 25 및 26에 기술한 바와 같이, 다양한 화학요법 약물의 투여량 또는 투여(또는 방사선 치료법의 조사량)이 변이되어, 부작용을 낮추고 환자의 삶의 질을 보다 좋게 할 수 있다. 또한 다양한 사이토카인과 성장 인자의 병용 투여로, 이식에 필요한 HSC 수를 낮출 수 있다. 예컨대, 본 발명의 방법으로, 생착시 감소된 수의 세포가 요구되어, 성인 HSCT에 인간의 탯줄 혈액의 사용이 가능할 수 있다.

약학적 조성물

본 발명에 사용되는 화합물은, 약학적으로 허용가능한 담체내 형태로 제공될 수 있으며, 또는 담체없이 제공될 수 있다. 약학적 조성물의 제형은 표준적인 방법에 따라 제조될 수 있다(예, Remington, The Science and Practice of Pharmacy. Gennaro A. R., ed., 20^th edition, Williams & Wilkins PA, USA (2000)). 약학적으로 허용가능한 담체에 대한 비제한적인 예로는, 생리학적으로 적합한 코팅제, 용매 및 희석제가 있다. 비경구, 피하, 정맥내 및 근육내 투여를 위해, 상기 조성물은 피막화(encapsulation)와 같이 보호될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 성분(들)을 보호하는 담체와 함께 제공될 수 있으며, 이는 상기 성분들의 느린 방출을 가능하게 한다. 시간에 따라 방출되는 제형이 제조에 있어, 라틱산/글리콜릭산 공중합체의 여러가지 버전과 같은, 다수의 중합체와 공중합체가 알려져 있다. 예컨대, 생분해성 코팅제로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 변형된 중합체를 사용하는 미국 특허 5,410,016를 참조한다.

경구적으로 전달시킬 의도의 제형은, 액제, 캡슐제, 정제 등으로 제조될 수 있다. 이러한 조성물은, 예컨대 부형제, 희석제, 및 또는 활성 성분을 분해로부터 보호하는 커버링제를 포함할 수 있다. 이러한 제형은 공지되어 있다(예, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro A. R., ed., 20^th edition, Williams & Wilkins PA, USA (2000)).

본 발명의 모든 제형에서, LHRH 유사체의 활성에 부정적인 작용을 하지 않는 기타 물질(즉, LHRH 유사체의 성 스테로이드 호르몬 시그널링을 파괴하는 능력을 차단하지 않는 화합물)이 포함될 수 있다. 여러가지 성장 인자와 그외 사이토카인들이 예시된다.

투여량

성 스테로이드 호르몬 시그널링을 파괴하기 위해 본 발명에 따라 사용되는 성 스테로이드 유사체 또는 저해제의 투여량은, 일반적으로 전문의 또는 수의사에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 또는 전문 의학서를 참조하여 결정할 수 있다(예, THE PHYSICIAN'S DESK REFERENCE, 52ND EDITION, Medical Economics Company, 1998).

전술한 질환의 치료 방법에 실시되는 투약 요법은, 약물의 작용을 변형시키는 여러가지 인자, 예컨대 환자의 상태, 체중, 성별 및 식이, 질환의 중증도, 투여 시기 및 그외 임상적인 인자들을 고려하여, 담당 의사에 의해 결정될 것이다. 치료환자의 경과는 혈액학적 프로파일의 정기적인 분석, 예컨대 분화된 세포 측정 등으로 모니터링할 수 있다.

전술한 투약은, 치료학적 조성물에 추가적인 성분을 보완하도록 조절된다. 이는 기타 CSF, 사이토카인, 림포카인, 인터루킨, 조혈 성장 인자와의 병용 투여; 화학요법 약물 및 또는 방사선 치료의 병용 투여; 및 약물의 작용을 변형시키는 여러가지 인자, 예컨대 환자의 상태, 체중, 성별 및 식이, 질환의 중증도, 투여 시기 및 그외 임상적인 인자와 같이 담당 의사에 의해 확인되는 여러가지 환자 관련 문제들을 포함한다.

전술한 투약뿐만 아니라, 예컨대 LHRH 유사체 및 그외 성 스테로이드 유사체는 일정 기간(예 3 내지 6달) 지속되는 1회 투약으로 투여될 수 있다. 특정 경우에, 제형은 1 내지 2달간 효과적인 것이다. 표준 투여량은 사용된 유사체의 종류에 따라 다양하지만, 과도한 실험확인 없이도 당업자에의해 쉽게 결정된다. 일반적으로 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg이거나 또는 약 0.01 mg/kg 내지 약 5 mg/kg이다.

성 스테로이드 저해제 또는 LHRH/GnRH 유사체의 치료 기간은 흉선 위척 및 손상 정도에 따라 다르며, 과도한 실험없이도 당업자에의해 쉽게 결정가능하다. 예컨대, 나이든 환자, 또는 더 든 환자는 치료가 요구되는한 화학요법 또는 방사선치료법과 같이 T 세포 고갈성 반응제, 예컨대 GnRH에 노출된다. 일잔적으로 혈액에서 신생 T 세포가 검출되기에 충분한 기간은 4달이다. 혈액내 신생 T 세포를 검출하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예컨대, T 세포 검출 방법중 한 가지는, T 세포 리셉터 절단 주기(T cell receptor excision circles)(TREC's)) 존재 측정에 의한 것으로, 이는 TCR이 형성되는 중이고 분열 후 세포에서 소실될때 형성된다. 따라서, TREC의 존재는 단시 신생(원시) T 세포에서만 발견된다. TREC 수치는 인간의 흉선 기능의 지표이다. 상기 및 그외 방법들은 WO/00 230,256에 구체적으로 기재되어 있다.

투여량은 사용되는 LHRH 유사체에 따라 변경된다. 특정 예에서, 투여량은 필요한 만큼 오래 지속되로고 제조된다. 예컨대, LHRH 유사체의 제형이 제조되어, 본원에 기술된 바에 따라 2달이상의 기간동안 전달될 수 있으며, 필요시 매 2달 또는 그이상마다 추가적인 투약이 전달될 수 있다.

제형은 면역계를 증진하기 위해 제조될 수 있다. 또한, GM 세포는 LHRH 유사체 제형과 공간적으로 또는 시간적으로 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 비-GM 세포 이용시, 시간에 따른 다중 투약이 필요한 환자에게 수행되어, 특정 외인성 항원에 대한 허용성이 형성될수 있다.

당업자에게 용이한 바와 같이, 성 스테로이드 시그널링을 파괴하는 여러가지 수단은 적합한 화합물이 투여되는 시기만큼 장기간 효과적일 것이다. 그 결과, 본 발명의 특정 예들의 이점은, 본 발명의 목적한 면역학적 작용이 일단 획득되면(2-3달) 치료를 중지할 수 있으며 개체의 생식계는 정상으로 돌아온다는 것이다.

화학적 거세를 위한 물질 전달

성 스테로이드 제거 물질의 투여는, 물질을 체내에 전달하는 모든 방법에 의해 실행될 수 있다. 따라서, 성 스테로이드 제거 물질은 본 발명에 따라, 정맥내로, 진피하, 피하, 근육내, 국소 및 경구 투여 경로의 비제한적인 방식으로 투여될 수 있다.

전술한 방법 이외에도, 본 발명에 이용가능한 화합물의 전달은, 당업자에게 공지된 여러가지 방법을 통해 실시될 수 있을 것이다. 성 스테로이드 매개 시그널링을 저해하기 위한 화학적 저해제의 표준적인 투여 공정은, 3개월간 효과적인 LHRH 작용제의 단회 투여를 이용한다. 여기서, 작용제가 3달이 되기 전에 환자의 체내에서 소실될 수 있으므로, 간단한 1회 정맥내 또는 근육내 주입은 충분하지 않다. 대신, 디포 주입이나 이식을 이용할 수 있으며, 또는 저해제의 느린 방출이 가능한 그외 저해제 전달 방식을 사용할 수 있다. 이와같이 체내 저해제의 반감기를 증가시키면서도 필요한 기능은 유지시키는 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다.

유용한 절단 방법으로는, 피부의 레이저 조사가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이의 예는, 계류중인 미국특허 출원번호 10/418,727와, 미국 특허번호 4,775,361, 5,643,252, 5,839,446, 6,056,738, 6,315,772 및 6,251,099에 상세히 개시되어 있다. 다른 유용한 전달 방법으로는, 피부의 고전압펄스 전이(high pressure impulse transient)(또한 스트레스 웨이브 또는 임펄스 전이라고도 함) 형성이 있다. 이 예는 계류중인 미국특허 출원번호 10/418,727와, 미국 특허 5,614,502 및 5,658,822에 상세히 개시되어 있다. 각 방법은 실시될 수 있으며, 또는 동일 부위에 화합물을 담체와의 조합 또는 조합없이 위치시키는 과정이 뒷따를수 있다. 이러한 위치시키는 방법은, 패치 내부에 위치시켜 치료기간동안 피부에 유지시키는 것이다.

시기

일 경우, 성 스테로이드를 제거하거나 또는 성 스테로이드 시그널링을 중단시키는 물질의 투여(또는 그외 거세 방법)는, 예컨대 순환성 면역세포에 일부 BM 세포의 제거 및/또는 손상을 초래할 것임이 틀림없는 화학요법 또는 방사선요법 실시 이전에 이루어진다.

세포

조혈 전구세포, 예컨대 광범위로 정의된 CD34+ 조혈 세포(이상적인 자가조직의)의 주입은 흉선 재성장 정도 및 동역학을 증진시킬 수 있으며 및/또는 면역세포, BM 기능성과 생착을 흉선의 재생없이, 이전에 또는 동시에 증가시킬 수 있다. 또한 HSC는 Thy-1 low 및 CD38-로 더욱 정의되며; CD34+CD38- ; Thy-1 low 세포는 또한 그외 계포 계통(linve) 마커가 부족하며, 오랜 지속성 또는 보다 긴 재생 기간을 가지는 더 초기의 HSC이다.

본 발명의 방법은 예컨대 CD34+ HSC 및/또는 상피 줄기세포의 첨가에 의해 보충될 수 있다. 예컨대, 이러한 세포는 자가 조직이거나 또는 동계이며, 흉선 재활성화 이전에 환자나 쌍둥이로부터 획득할 수 있다. HSC는 환자의 혈액 및/또는 BM으로부터 CD34+ 또는 CD34^l0 세포를 분류함으로써 수득할 수 있다. HSC의 수는 세포 수집 전에 환자에게 G-CSF(Neupogen, Amgen) 투여, 수집한 세포의 SCGF에서의 배양 및/또는 CD34+ 세포 보충이후의 G-CSF의 환자 투여를 (비제한적으로)포함한 여러가지 방법에 의해 증진시킬 수 있다. 또한 CD34+ 세포 집단이 환자의 G-CSF 전주사에 의해 증진된다면, 혈액이나 BM으로부터 CD34+ 세포를 분류할 필요가 없다.

HSC는 유전학적 변형에 사용될 수 있다. 이들은 BM, 말초혈액 또는 탯줄 또는 그외 HSC 원료로부터 유래될 수 있으며, 자가조직이거나 자가조직이 아닐 수 있다. 또한 림프계 전구 세포, 골수 전구 세포, 골수에서 또한 발견되는 중배엽 줄기 세포 및 상피 중기 세포의 자가 조직 또는 비자가 조직이 유용하다. 줄기 세포는 또는 탯줄 혈액을 포함할 수 있다. 또한 이들은 여러가지 세포 유형으로 형성될 수 있는 가능성을 가진 줄기세포, 예컨대 배아 줄기 세포를 포함할 수 있으며, 성체 줄기 세포, 역시 많은 조직들 예컨대 BM, 이자, 뇌 및 후각계에서 현재 발견되고 있다.

비자가(공여체) 세포가 사용되는 경우, 이 세포에 대한 허용성은 흉선 재활성화 중에 또는 이후에 형성된다. 성 스테로이드 매개 시그널링 차단시 또는 차단 개시 이후에, 해당 (유전학적으로 변형된(GM) 또는 유전학적으로 변형되지 않은)공여 세포는 수용체로 이식된다. 이러한 세포들은, 이상적으로는 줄기 세포 또는 전구 세포는 병합되어 흉선에 수용되며, 이들은 이들에 대해 활성일 수 있는 기회에 의해 새롭게 생산된 T 세포를 소거함으로써 공여체에 대한 허용성을 형성한다. 이후 이들은 "수용체에 속하게" 되며, 흉선에 의한 신생 T 세포와 DC 생산의 일부분이 될 수 있다. 생산되는 T 세포 집단을 공여체와 수용체 모두를 자신으로 인지하여, 공여체로부터의 이식에 허용성을 형성한다(계류중인 미국 특허 출원번호 10/419,039 및 PCT/IBO1/02740).

다른 예에서, (유전학적으로 변형된, 또는 변형되지 않은) 줄기 세포, 전구 세포 또는 공여 세포의 투여는, 한명 이상의 개체로부터 유래된 세포를 포함하여, 수용체는 MHC 타입의 전범위에 대해 허용성을 발생시키며, 이들은 광범위한 공여체에 MHC 매치되기 때문에 수용체는 세포, 조직 또는 기관 이식체로 적합한 후보물질로 보다 쉽고도 신속하게 간주되어질 수 있다.

본 발명은 또한 외부 DC의 환자 흉선으로의 병합 방법을 제공한다. 이는, 공여 세포의 수용체로의 투여에 의해 획득될 수 있으며, 수용체에서 허용성이이 형성된다. 공여 세포는 HSC, 상피 줄기세포, 성체 또는 배아 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포일 수 있다. 공여 세포는, CD34+ HSC, 림프계 전구 세포 또는 골수 전구 세포일 수 있다. 일부에서는, 상기 공여 세포는 CD34+ 또는 CD341o HSC이다. 공여체 HSC는 수용체에서 DC로 발생될 수 있다. 공여 세포는 수용체에게 투여되어 말초 혈액 시스템을 통하여 이동하여 직접적으로 또는 BM을 통하여 흉선을 재활성화시킬 수 있다. 허용 유발을 위한 흉선 병합을 증진하기 위해, 또한 줄기 세포는 성 스테로이드 저해제, 예컨대 LHRH/GnRH 유사체의 사용을 통하여 흉선 재성장을 활성화시키면서 흉선내로 주입될 수 있다. 비-HSC는 흉선 미세환경과 상기 세포에 대한 적합한 성장 인자의 함유 조건에서, DC로 형성되도록 유발될 것이다.

흉선의 조혈 전구 세포의 흡수는 실질적으로 성 스테로이드 저해 또는 부재시 증가된다. 상기 세포는 흉선에 병합되어 수용체 세포에서 실시되는 것과 동일한 양상으로 DC, NK, NKT, 및 T 세포를 생산한다. 이 결과가 T 세포, DC 및 기타 세포의 키메라이다. 수용체 흉선에서 공여 DC의 병합은, 흉선에서 생산되는 T 세포가 공유 세포에 허용되도록 선별된다는 것을 의미한다. 허용성은 공여(또는 공여체와 근접하게 매치되는) 세포, 조직, 및 기관으로부터의 추가적인 이식을 허용하며, 이식된 물질은 수요에의 면역계에 의해 자신으로 인지될 것이므로, 면역억제 약물 요구가 감소된다.

줄기 세포 또는 전구 세포의 선택 유전학적 변형

또한, 본 발명은 유전학적으로 변형된 조혈 줄기 세포, 림프구 저구세포, 골수 전구 세포, 상피 줄기 세포 또는 이들의 조합(GM 세포)를 이용한 유전자 치료방법을 포함한다. 유전자 치료로서 상기 세포 전달은 이전에 시도되었으나 성공하지 못하였고, 그 결과 변형된 세포는 무시가능한 수준으로 형성된다. 본 발명은 세포의 흡수 및 목적한 T 세포로의 분화를 촉진하는 상기 세포의 전달을 위한 신규한 방법을 제공한다. 변형된 세포는 환자에게 주입된다. 변형된 줄기 세포 및 전구 세포는 흉선에 의해 흡수되고 T 세포, 수지상 세포 및 그외 흉선에서 생산되는 세포로 변환된다. 신생 세포 각각은 줄기/전구 세포의 모체의 유전학적 변형을 포함한다.

거세 단계 중이나 또는 이후에, 공여체에서 유래된 조혈 줄기 세포, 전구세포, 또는 상피 줄기세포는수용체 환자에게로 이식될 수 있다. 이러한 세포들은 수용체에 속하므로써 흉선에 의해 수용되며, 흉선에 의해 신생 T 세포 및 DC 생산의 일부분이 된다. 성 스테로이드 매개 시그널링에 대한 차단이 개시된 후 3 내지 3주 이내에(LHRH 처리 개시 후 약 2 내지 3주), 처음으로 신생 T 세포가 혈류내에 존재하게 된다. T 세포 풀로 완전하게 발생하는데는 3 내지 4달이 걸릴 수 있다. 제조된 T 세포 집단은 수용체 및 공여체(비자가조직 이식의 경우) 모두를 자신으로 인지한다. 공여체에서 유래된 이식체에 대한 허용성은 수용체내에서도 이루어질 수 있다.

공여체 이식체에 대한 환자 허용성을 형성 또는 유도할 수 있는 적합한 유전자 또는 폴리뉴클레오티드(즉, 특정 단백질을 한정하는 핵산 서열)는, 줄기 세포 및/또는 전구 세포로 조작된다. 특정 유전자를 HSC로 도입함으로써, 예컨대, APC로의 세포가 분화되고, MHC 클래스 I 또는 II의 부분에 발현되는 펩타이드로서 단백질을 발현한다.

인간에게 흉선의 활성화 및/또는 HSC 흡수 및 생산 증가를 포함한, 이의 골수 기능의 향상을 위해, 성 스테로이드 유사체가 제공될 수 있다. 일예로, 거세중 또는 거세 이후에 환자는 HSCT를 받는다. 사람에서 본인이 HSC를 주입할 수 있으며 또는 3일간 G-CSF를 처리하고(1일 2회 피하 접종) 이후 4 및 5일째에 혈액으로부터 HSC를 수득한, 적합한 공여체의 HSC를 주입할 수 있다. HSC는 유전자(예, 단백질, 펩티드 또는 물질의 항원을 코딩하는 유전자)로 형질 감염 또는 형질 전이되어, 필요한 단백질 또는 항원을 생산할 수 있다. 환자에게 주입한 후, HSC는 혈액으로부터 골 또는 골수로 유입되고 일부는 혈액으로 다시 돌아와, 결국 체내에서 T 세포, DC, APC로 변환된다. 상기 항원은 상기 APC 표면의 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자부위에서 발현된다.

줄기 세포와 전구 세포의 분리 및 형질전이 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 유형의 방법들에 대한 예들은, 예컨대 PCT 공개 번호 WO 95/08105, WO 96/33281, WO96/33282, 미국 특허번호 5,559,703, 5,061,620 5,681,559, 5,199,942에 개시되어 있다.

안티센스 폴리뉴클레오티드

용어 "안티센스"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열이다. 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA이다. 안티센스 분자는 상보적인 가닥의 합성을 허용하는 바이러스 프로모터의 역 방향으로 목적한 유전자를 삽입하는 합성 방법을 포함한, 모든 방법에 의해 생산될 수 있다. 일단 세포에 도입되면 전사된 가닥이 세포에서 생산된 천연 서열과 결합하여 이중가닥을 형성한다. 이러한 이중가작은 추후 전사 또는 번역 중 어느 하나를 차단한다. 이러한 방식으로 돌연변이 표현형이 제조된다.

촉매성 핵산

용어 "촉매성 핵산"은, 분리된 기질을 특이적으로 인지하여 상기 기질의 화학적인 변형을 촉매하는 DNA 분자 또는 DNA 함유 분자(또한 "데옥시리보자임" 또는 "DNAzyme"이라고 함) 또는 RNA 또는 RNA 함유 분자(또한 "리보자임"이라고 함)를 의미한다. 촉매성 핵산에서 핵산 염기는 A, C, G, T 및 U 뿐만 아니라 이들의 유사체일 수 있다. 이들 염기의 유사체는 당업계에 공지되어 있다.

전형적으로, 촉매성 핵산은 표적 핵산의 특이적인 인지를 위한 안티센스 서열 및 핵산 절단성 효소학적 활성을 함유한다. 촉매적인 가닥은 표적 핵산에서 특이적인 부위를 절단한다. 본 발명에 특히 유용한 리보자임의 종류는 헤머헤드 리보자임이다(Haseloff and Gerlach (1988) Nature 334: 585), Perrimanet al., (1992) Gene 113: 157) and the hairpin ribozyme (Shippy et al., (1999) Mol.Biotechnol, 12 :117).

dsRNA

이중 가닥 RNA(dsRNA)는 특히 특정 단백질의 생산을 특지적으로 저해하는데 유용하다. 이론과 무관하지만, 힌 그룹에서 dsRNA가 단백질 생산을 감소시키는데 사용될 수 있는 기작에 대한 모델을 제공하고 있다(Dougherty and Parks, (1995),Curr.Opina. Cell Biol. 7: 399). This model has more recently been modified and expanded (Waterhouse et al., (1998) Proc. Natl.Acad.Sci. USA 95: 13959). 이 기술은 목적한 유전자의 RNA에 본질적으로 상동인 서열을 함유하는 dsRNA, 이 경우 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA의 존재를 토대로 한 것이다. 통상, dsRNA는 재조합 벡터 또는 숙주세포에서 하나의 오픈 리딩 프레임에서 생산되며, 여기서 센스 및 안티센스 서열은 센스 및 안티센스 서열을 루프 구조를 형성하는 무관한 서열과 혼성하여 dsRNA를 형성시킬 수ㅜ 있는 무관한 서열이 측면에 위치한다. 본 발명에 적합한 dsRNA 분자의 설계 및 생산은 당업자에겐 용이한 것이며, 특히 이하를 고려한다: Dougherty and Parks, (1995),Curr.Opin. Cell BioL 7: 399; Waterhouseet al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959; 및 PCT 공개번호 WO 99/32619, WO99/53050, WO99/49029, 및 WO01/34815.

항-HIV 구조체

당업자는 본 발명의 용도에 적합한 항-HIV 구조체를 개발할 수 있다. 다수의 항-HIV 구조체 및 리보자임이 이미 개발되어 있으며, 예컨대 미국 특허번호 5,811,275, 5,741,706 및 5,144,019와 PCT 공개번호 WO 94/26877, 호주 특허 출원번호 56394/94에 개시되어 있다.

유전자

본 발명의 용도에 유용한 유전자 및 유전자 절편(폴리뉴클레오티드)으로, 특정 외인성 항원, 예컨대 공여체 항원 또는 알러겐과 같은 항원에 내성을 코딩하는 것을 포함한다. 상기 공여체가 수용체와 관련 있으나 추가적인 MHC 분자나 Y 염색체에 의해 발현되는 분자를 발현하지 않는 경우의 본 발명의 비제한적인 예로, 상기 분자를 코딩하는 유전자는, 공여체의 HSC를 이용한 수용체의 재구성 이전에 공여체의 HSC에 형질전환되어 발현될 수 있거나, 또는 (예, 성 스테로이드 제거 이전에 또는 동시에 수요에에서 수집된) 수용체 자신의 HSC에 형질전환되어 발현될 수 있다.

이러한 유전자 또는 유전자 절편은 안정하게 발현가능한 형태로 사용될 수 있다. 이러한 유전자 또는 유전자 절편은 안정적으로 발현가능한 형태로 사용될 수 있다. 용어 "안정하게 발현가능한"은 유전자 또는 유전자 절현("기증 절편")의 산물(RNA 및/또는 단백질)이, 세포로 전달된 후 숙주에서 뿐만 아니라 분열 및/또는 분화이후에 세포의 전구체내에서도 반 영구적으로 발현될 수 있는 것을 의미한다. 벡터에 함유되거나 함유되지 않은, 유전자 또는 유전자 절편은 DNA의 RNA로의 전사에 적합한 시그널링 서열을 가진다. 또한 유전자 또는 유전자 절편에 의해 코드되는 단백질이 환자의 상태에 작용하는 활성의 분자인 경우, 상기 DNA는 또한 번역 시그널을 코딩한다.

대부분의 경우에서, 유전자 또는 유전자 절편은 벡터내에 함유되어 있다. 당업자는 목적한 RNA 또는 단백질을 발현하기 위해 사용할 수 있는 발현 벡터를 알고 있다. 발현 벡터는 함유된 DNA 서열의 전사 및 전사된 RNA의 번역을 진행시킬 수 있는 벡터이다. 발현 벡터는 유전학적으로 변형되어 세포에서 복제할 수 있으며, 플라스미드, 박테리오파지, 바이러스 및 미니염색체가 있다. 또한 유전자 또는 유전자 절편은 세포의 염새게 DNA의 삽입되는 부분일 수 있다. 재조합 벡터 및 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 단백질 발현에 유용한 발현 벡터는, 복제 오리긴을 포함할 수 있다. 적합하게 구축된 발현 벡터는 세포에서 자율적인 복제를 위한 복제 오리진을 포함하며, 또는 숙주 세포의 염색체로 삽입될 수 있다. 또한 이러한 벡터는 선별 마커, 제한된 수의 유용한 제한 효소 부위, 고카피 수 및 강력한 프로모터를 함유할 수도 있다. 프로모터는 RNA 중합효소가 DNA에 결합하도록 하고 RNA 합성을 개시하는 DNA 서열이며; 강력한 프로모터는 높은 빈도로 이러한 개시를 야기한다.

일예로, DNA 벡터 구조체는 프로모터, 인핸서 및 폴리아델ㄴ닐레이션 신호를 포함한다. 프로모터는 LTR(Long Terminal Repeat), SV40(Simian virus 40), EBV(Epstein Barr virus), CMV(cytomegalovirus), RSV(Rous sarcoma virus), 원숭이 바이러스, MMTV(mouse mammary tumor virus)와 같은 HIV, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 인간 메탈로티오넨(met alothionein)으로 이루어진 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다. 일 예에서, 유도성 프로모터를 사용하여 삽입된 유전자 또는 폴리뉴클레오티의 발현량 및 발현 시간을 조절할 수 있다.

인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 CMV, RSV 및 EBV와 같은 바이러스 인핸스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

폴리아데닐레이션 신호는, 예컨대, LTR 폴리아데닐레이션 신호 및 SV40 폴리아데닐레이션 신호로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 특히 이들중 SV40 (-) 폴리아데닐레이션 신호일 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 본 발명에서 이용될 수 있는 RNA 또는 단백질을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 즉, 벡터는 접촉된 DNA 분자의 복제와 DNA 분자에 의해 코딩되는 RNA 또는 단백질의 발현을 이끌수 있다. 따라서, 발현 벡터는 접촉한 DNA 분자의 상위에 적합한 전사 개시 시그널을 가져야 하며, 조절 서열의 통제하에 DNA 분자의 발현과 DNA 분자에 이해 코딩되는 목적한 단백질의 생산을 가능하게 하는 올바른 리딩 프레임을 유지하여야 한다. 발현 벡터로는, 클로닝 벡터, 변형된 클로닝 벡터, 특이적으로 설계된 플라스미드 또는 바이러스가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유도성 프로모터를 사용하여, 삽입한 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 발현 양과 시기를 조절할 수 있다.

당업자는 세포에서 작용하는 DNA 구조체를 제조할 수 있다. 테스트 발현을 위해, 유전학적 구조체는 유전학적으로 변형되어진 동일한 유형의 조직 세포 배양을 이용하여, 생체외에서 발현 수준을 테스트해볼 수 있다.

유전학적 변형 방법

표준적인 재조합 방법은 사용하여 유전자 치료에 사용되는 세포에 유전학적 변형을 도입할 수 있다. 예컨대, 배양한 HSC의 레트로바이러스 벡터 전달이 당업계에 공지된 성공적인 방법이다(Belmont and Jurecic (1997) "Methods for Efficient Retrovirus-Mediated Gene Transfer to Mouse Hematopoietic Stem Cells,"in Gene Therapy Protocols(P. D. Robbins, ed. ), Humana Press, pp.223-240 ; Bahnson et al.,(1997) "Method for Retrovirus-Mediated Gene Transfer toCD34+-Enriched Cells, "in Gene Therapy Protocols (P. D. Robbins, ed. ), Humana Press, pp. 249-263). 또한 벡터는 아데노바이러스 유래, 렌티바이러스 유래 및 몰로니 유린 백혈병 바이러스 유래 벡터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 하기 방법들은 HSC의 유전학적 변형에 유용하다: 유전자총을 이용하는 것과 같이 입자를 매개로한 유전자 전이(Yang, N. -S. and P. Ziegelhoffer, (1994) "The Particle Bombardment System for Mammalian Gene Transfer,"In PARTICLE BOMBARDMENT TECHNOLOGY GENE TRANSFER (Yang, N. -S. and Christou, P., eds.), Oxford University Press, New York, pp.117-141), 리포좀을 매개로한 유전자 전이(Nabelet al., (1992) Hum.Gelle Ther: 3: 649), 유전학적으로 변형된 벡터와 칼슘 포스페이트와의 공동 침전(Graham and Van Der Eb, (1973) Virol. 52: 456), 전기충격(Potter et al., (1984) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 81 : 7161), 및 미세주입(Capecchi, (1980) Cell 22:479) 뿐만 아니라 벡터내일 수 있는 유전자 또는 올리고뉴클레오티드를 HSC 및 그외 유전학적으로 변형되는 세포에 안정적으로 전이하여 일정 시간에 유전자를 발현시킬 수 있는, 그외 방법들.

유전자 치료법

또한 본 발명은 환자의 흉선의 재활성화를 통한 유전자 치료 방법을 제공한다. 이는, 수용체로의 GM 세포 투여에 의해 및 성 스테로이드 매개 시그널링의 파괴를 통해 이루어질 수 있다. 본 발명의 방법에 의해, 성 스테로이드로 유발된 퇴화된 흉선은 결국 구조적으로 또는 기능적인 면에서 모든 정의가능한 측면에서 최적의 사춘기 이전의 역량으로 대략적으로 회복된다. 이는 모든 T 세포 서브세트의 수, 타입 및 비율을 포함한다. 또한 복합 기질 세포 및 T 세포를 생산하는데 요구되는 흉선의 미세환경을 구성하는 이의 3차 구조물도 포함된다. 새롭게 재생된 T 세포는 흉선에서 생착하여 말초 T 세포 수치 및 기능을 회복시킨다.

흉선의 궁극적인 재활성화는, 흉선이 재생되기 직전에 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC) 및/또는 상피 줄기세포의 첨가에 의해 보충될 수 있다. 이러한 세포는 자가 조직이거나 또는 동계이며, 흉선 재활성화 이전에 환자나 쌍둥이로부터 획득할 수 있다. HSC는 환자의 혈액 및/또는 BM으로부터 CD34⁺ 세포를 분류함으로써 수득할 수 있다. HSC의 수는 세포 수집 전에 환자에게 G-CSF(Neupogen, Amgen) 투여, 수집한 세포의 SCGF(줄기 세포 성장 인자)에서의 배양 및/또는 CD34⁺ 세포 보충이후 G-CSF의 환자 투여를 (비제한적으로)포함한 여러가지 방법에 의해 증진시킬 수 있다. 또한 CD34⁺ 세포 집단이 환자의 G-CSF 전-주사에 의해 증진된다면, 혈액이나 BM으로부터 CD34⁺ 세포를 분류할 필요가 없다.

일예에서, 조혈 세포는 흉선의 재활성화 이전에 또는 동시에 환자에게 공급될 수 있으며, 환자 신체의 면역 역량을 증가시킨다. 조혈 세포는 유전학적으로 변형되었거나, 변형되지 않을 수 있다.

유전학적으로 변형된 세포는 HSC, 상피 줄기 세포, 배아 또는 성체 줄기 세포, 골수 전구 세포 또는 림프계 전구 세포일 수 있다. 일예에서, 유전학적으로 변형된 세포는 CD34+ 또는 CD341o HSC, 림프계 전구 세포 또는 골수 전구 세포이다. 다른 예에서, 유전학적으로 변형된 세포는 CD34+ HSC이다. 유전학적으로 변형된 세포는 환자에게 투여되며, 말초 혈액 시스템을 통해 흉선으로 이동한다. 이러한 조혈 전구 세포의 흉선으로의 흡수는 성 스테로이드의 부재시 실질적으로 증가된다. 상기 세포는 흉선으로 병합되어 변이된 세포로부터 유래된 유전학적으로 변형을 가지는 수지상 세포 및 T 세포를 생산한다. 그 결과는 수용체의 말초 혈액에 순환하는 목적한 유전학적 변화를 가지는 T 세포 집단이며, 환자의 흉선의 재활성화에 의해 초래되는 세포, 조직 및 기관 집단의 증가가 수반된다.

성 스테로이드 시그널링 차단의 개시 3-4주 이내(LHRH 처리 개시후 약 2-3주 후)에, 최초 신생 T 세포가 혈류에 존재한다. T 세포 풀의 완전한 발생에는 그러나 3-4달(또는 그이상) 걸린다.

허용성 유도

개체의 T 세포 집단은 본 발명의 방법을 통해 변이될 수 있다. 특히 변형이 유도되어, 무상동의(즉 동종이형의 또는 이종의) 이식체에 대한 허용성이 혈성될 것이다. 외인성 항원, 특히 임상적인 이식 조건에서 비-자기성 공여체 항원에 대한 허용성 확립은, 공여체 기원의 수지상 세포가 수용체의 흉선으로 병합되는 경우 가장 최상으로 이루질 수 있다. 허용성의 형성은 또한, 저해성 면역 조절 세포(예, CD25+CD4+ T 세포, NKT 세포, δγT 세포)를 이용함여 보다 효과적으로 이룰 수 있다. 후자를 형성하는 기작은 그러나 아직 충분히 파악되지 못하였지만 수지상 세포를 수반할 수 있다.

흉선의 수지상 세포에 의해 음성 선별(클로날 삭제에 의한)로 인한, 자기 항원에 대해 반응하는 T 세포를 방지하는 주된 기작에서, 잠재적인 공여체 기관 또는 조직으로부터 유래된 수지상 세포를 가지는 흉선을 창출하는 능력은 이식 거부반응의 방지에 매우 중요하다. 이는 잠재적으로 이식을 거부할 수 있는 T 세포가 흉선에서 공여체의 수지상 세포와 만아 이들이 혈류로 유입될 기회를 가지기 전에 삭제될 것이기 때문이다. 수지상 세포로 발생되는 혈액 전구 세포는, T 세포로 발생되는 것과 동일하다.

일부 예들에서, 이식된 HSC는 완전한 골수제거(myeloablation) 또는 골수고갈(myelodepletion) 이후 일 수 있으며, 따라서 완전한 HSC 이식이 이루어진다(예, 5x10⁶ cells/kg 무게/이식체). 일부 예들에서, 단지 소수의 골수제거만이 필요하며, 예컨대 2-3 Gy 조사(또는 300 rads)가 3-4 x 10⁵ cells/kg 체중 투여에 후속된다. 일부 예들에서, T 세포 고갈(TCD) 및/또는 그외 면역세포 고갈 방법이 사용된다(예, 실시예 2 참조). 10% 키메라현상처럼 적은 수준으로도 공여체의 이식체에 대한 허용성을 충분히 확립할 수도 있다. 일부 예들에서, 공여체 HSC는 제대혈로부터 유래된다(예, 수용체 생착시 1.5 x 10⁷ cells/kg).

골수에서 처음 집락을 형성하여 혈액세포로 변환되는 HSC의 능력은, 주입된 HSC의 절대적인 수와 특성(질)과, 수용체 골수의 미세환경의 HSC를 안치시키는 기능적 능력과 직접적인 연관성이 있다. 본 발명의, 사이토카인(예, G-CSF, 또는 GM-CSF) 또는 약물(예, 사이클로포스파미드)과 같은HSC 가동화제가 병행(연속적으로 또는 동시에)되거나 그렇지 않는 방법은, 생착이 더욱 빠르고 우수하며, 또한 보다 높은 투여량 및/또는 빈도의 화학요법 및 방사선치료가 가능할 수 있다.

다른 예들에서, 환자는 골수제거 화학요법이전에 최대 45일간 루프룬(Lupron)을 처방받고, 계속적으로 BMT와 동시에 루프론을 복용하는데, 약물에 노출되는 총 기간은 약 9개월이다(각 루프론 주입이 3개월간 약물을 전달함으로써 3회 주사와 동등함). 연구시 다양한 시간 간격으로 혈액 시료를 수집하여 T 세포 수(특히 신생 흉선 생착)와 기능(특히, 생체외 T 세포 자극에 대한 반응)을 분석하였다. 또한 본원의 다른 목적을 위해 상기 예는 HSCT에 일반적으로 적용가능하다.

다른 예에서, 이식된 HSC는 림프구제거 이후일 수 있다. 일부 예들에서, T 세포 또는 B 세포는 선택적으로 절제되어 필요시 세포를 제거할 수 있다(예, 이러한 세포는 자가 면역 또는 알레르기에 작용하는 세포). 상기 선별은 활성화된 세포의 제거 또는 자가면역 또는 알레르기 반응게 작용하는 세포종의 제거이다. 세포는 CD4, CD8, B220, thyl, TCR, CD3, CD5, CD7, CD25, CD26, CD23, CD30, CD38, CD49b, CD69, CD70, CD71, CD95, CD96과 같은 세포 표면 마커, 항체 특이성 또는 Ig 체인 또는 비통제된 사이토카인 리셉터, 예컨대 IL2-R B 체인을 기초로 선별될 수 있다. 매우 잘 알려진 고갈 방법은, 항림프구 글로불린(antilymphocyte globulin)의 사용이다. 그외의 세포 선별 및 분류방법은 공지되어 있으며, 자석 및 형광물질을 이용한 세포 분리, 원심분리 및 보다 구체적으로는 혈액성분채집술(hemapheresis), 백혈구성분채집술(leukopheresis) 및 림프구성분채집술(lymphopheresis)이 있다.

일부 예들에서, HSCT는 골수제거, 골수고갈, 림프구고갈, T 세포 제거 및/또는 그외 면역세포 선택적 제거없이 실시된다.

다른 예들에서, 본 발명의 방법은, 면역억제성 물질(예, 사이클로스포린, 프레드니손, 오조티오프린, FK506, 이뮤란 및/또는 메토트렉세이트)의 투여에 의해 환자를 면역억제시키는 단계를 포함한다(예, 미국 특허 5,876,708). 일 예에서, 면역억제는, HSCT 없이 실시된다. 일예에서, 면역억제는 HSCT와 병용(예, 이전에, 동시에 또는 이후에) 실시된다. 다른 예에서, 면역억제는 골수제거, 림프구제거, T 세포 제거 및/또는 그외 면역세포의 선택적 제거, 삭제 또는 고갈없이 실시된다. 또다른 예에서, 면역억제는 면역억제는 골수제거, 림프구제거, T 세포 제거 및/또는 그외 면역세포의 선택적 제거, 삭제 또는 고갈과 병용(예, 이전에, 동시에 또는 이후에) 실시된다.

전술한 바와 같이, 골수제거, 골수고갈, 림프구제거, 면역억제, T 세포 제거 및/또는 그외 면역세포의 선택적 제거는, 면역 세포 제거의 비제한적인 예이며, 이는 이러한 적용으로 사용된다. 일반적인 용어 "면역 세포 고갈"은, 골수제거, 골수고갈, 림프구제거, T 세포 제거 및/또는 면역세포의 선택적 제거(예, B 세포 또는 NK 세포 고갈) 각각을 포함하는 것이다. 당업자라면 쉽게 이해될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시시, 이러한 "고갈" 방법들은 그외 다른 "고갈" 방법들 중 어느 하나로 치환될 수 있다.

일 예들에서, NK 세포가 고갈된다. NK 집단을 고갈하기에 유용한 NK 항체가 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 항-NK 항원의 한가지 원료는, 항-인간 흉선세포 폴리클로날 항-혈청이다. 미국 특허번호 6,296,846에서는, 비-골수제거적인 치료법과 림프구조혈 키메라 집단의 형성방법 뿐만 아니라 NK 및 T 세포의 고갈 방법이 개시되어 있으며, 이들 모두는 본 발명의 방법으로 사용될 수 있다.

일부 예들에서, 본 발명의 방법은, 예컨대 HSCT 이전에 공여체에서 수득한 기관(예, 간 또는 신장)의 호모퓨징(hemoperfusing)에 의해 수용체의 혈액으로부터 자연적인 항체를 흡착하는 단계를 더 포함한다.

다른 예에서, 본 발명은 이식체에 대한 허용을 직, 간접적으로(예, 이차 사이토카인의 활성 수준의 촉진 또는 저해에 의해) 촉진시키는 사이토카인의 활성 수준을 증가시키거나(예, IL-10, IL-4, TGF-베타) 또는 이식체에 대한 거부반응을 촉진시키는 사이토카인의 활성 수준을 감소시키는(예, IFN베타, IL-1, IL-2, IL-12) 것과 같은, T 세포 보조-감소성 처리(치료)를 더 포함한다. 일부 예들에서, 사이토카인은 투여되어 허용성을 증진시킨다. 사이토카인은 수용체 종으로부터 또는 공여체 종으로부터 유래될 수 있다(예, 미국 특허번호 5,624,823 참조. 상기 용도에 있어서의 돼지 인터루킨-10을 코딩하는 DNA가 개시되어 있음). 보조-감소성 치료의 지속기간은, 수용체의 성숙형 T 세포가 항원에 의해 처음 자극받을 후 항원 거부반응을 개시하는데 필요한 기간과 거의 동일하거나 또는 이보다 짧을 수 있다(인간의 경우 통상 8-12일). 다른 예에서, 상기 지속기간은 수용체의 성숙형 T 세포가 항원에 의해 처음 자극받을 후 항원 거부반응을 개시하는데 필요한 기간과 동일하거나, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 짧다. 짧은 보조-감소성 치료는 수용체에서 성숙형 T 세포에 의한 사이토카인의 분비가 자극될 수 있는 치료 실시 또는 무실시 형태로, 예컨대 프레드니손(Prednisone)(17,21-디하이드록시프레그나-1,4-디엔-3,11,20-트리온)없이 시행될 수 있다. 보조-감소성 치료는 이식체가 도입되기 이전에 또는 도입될때 개시될 수 있다. 짧은 보조-감소성 치료는 전조작되거나 또는 후조작일 수 있다. 일부 경우, 공여체 및 수용체는 클래스 I 매치된다.

또한, 조혈 줄기 세포의 흉선으로의 흡수를 증진시키는 능력은, 천연형의 수지상 세포가 조작될 수 있음을 의미한다. 예컨대, 줄기 세포는 궁극적으로 흉선내( 및 체내 어디서나)에서 수지상 세포로 발현되는 특이 유전자(들)로 형질전환될 수 있다. 공여체가 수용체와 관련있으나 추가적인 MHC 분자나 또는 Y 염색체(예, 수용체가 암컷이고 공여체가 수컷인 경우)에 의해 발현되는 분자를 발현하는, 본 발명의 비제한적인 예에 있어서, 상기 분자를 코딩하는 유전자는 공여체 HSC를 이용하여 수요에가 재구성되기 전에 공여체의 HSC에 형질전환되어 발현되거나 또는 수용체 자신의 HSC(예, 성 스테로이드 제거 이전에 또는 동시에 수용체에서 수집된)에 형질전환되어 발현될 수 있다. 예컨대 삽입체 MHC(HLA 또는 SLA)로 세포를 유전학적으로 변형시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예, 미국 특허번호 5,614,187, 6,030,833, 6,306,651 및 6,558,663 참조). 일부의 HSC는, 공여체 또는 수용체이든 간에 수지상 세포로 발생되어 새롭게 형성된 T 세포를 추가 분자가 자신인 것으로 교육한다. 따라서 교육받은 T 세포는, 공여체 이식 조직에 의해 발현된 세포를 만났을때, 상기 조직을 자신으로 인지하여 거부하지 않을 것이다. 또한 양성 선별에는 다수의 세포 유형들이 관여한다: 피질 상피는 특이적인 분화 분자를 제공하고, 제 3의(third party) 세포는 MHC/펩티드 리간드를 제공한다.

BM 및 HSC에 대한 효과

본 발명은 HSC의 생산 증가 및 조혈증가를 포함한, 환자에서 BM의 기능을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 여러가지 적용에 유용하다. 예컨대, 암 또는 그외 목적으로 실시되는 화학요법 또는 방사선치료의 해로운 부작용들은 환자의 BM에 나쁜 영향을 줄 수 있다. 화학요법의 투여에 의존적으로, BM은 손상 또는 제거될 수 있으며, 혈액 세포의 생산이 지연될 수 있다. 본 발명에 따라, 화학요법 치료후 성 스테로이드 유사체(LHRH 유사체)의 1회 복용은, 화학요법으로 손상된 BM 및 혈액세포의 회복을 보조한다. 또한 화학요법의 실시하기 몇주 전에 LHRH 유사체의 투여는 HSC 및 그외 혈액 세포의 집단을 증가시켜 화학요법의 일부 악영향을 감소시킬 것이다.

BM 기능 향상은 예컨대, 혈액 질환자에게 적용될 수 있다. "혈액 질환"은 환자의 혈액계 세포가 직, 간접적으로 관여된 모든 질환 또는 질병으로 정의되며, 조혈과 관련된 질환, 예컨대 백혈병을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다라서, 본 발명의 방법은 예컨대 동종이형의 HSCT에서 또는 환자 본인의 세포를 이용한 자가 HSCT 이후에, 공여체로부터의 신생 세포로 암이 발생된 혈액계 세포를 치환하는데 유용하다.

BM에 의한 HSC 생산 증가는, 동시에 적혈구 세포의 증가를 초래하여 RBC 생산 관리에 유용하다. 이는 예컨대 적혈구용적율(hematocrit) 증가에 의해 쉽게 측정될 수 있다.

일부 예들에서, 증가된 HSC는 CD34+ HSC이다. 가동화된 HSC (예, G-CSF를 이용하여)는 심장 또는 폐 조직과 같은 조직의 "복구" 또는 회복을 보조할 수 있다. HSC는 비-조혈 조직을 형성할 수 있는 가능성을 가지고 있다. 많은 연구들이 생체외에서 실시되었지만, Mayo Clinic Rochester 연구에서, BMT 이후에 적은 수의 심근세포(cardiomyocyte)가 공여체로 유래된 것으로 확인되었다. 또한 Beuamont Hospital, Michigan에서는 HSC가 근세포 또는 혈관계가 되는지가 불명확함에도 불구하고 HSC를 이용하여 손상된 심장 근육을 복구하였다. 또한 마우스 실험에서 HSC가 인슐린을 생산하는 베타-세포로 되는 가능성을 확인하였다. 그외 연구들에서도 HSC가 골근(근세포), 간(간세포), 뼈, 연결조직, 상피 조직(예, 폐, 소화관 및 피부의 상피 조직), 혈관계, 신경 및 섬 세포로 될 수 있는 것으로 확인되었다.

본원의 방법은 BM에서 손상을 복구하고 및/또는 여러가지 치료요법(예, 화학요법 항암제, 방사선 치료)나 질환들(예, HIV, 만성 신부전증)에 의해 손상되거나 파괴될 수 있는 혈액 세포의 치환을 보조하는데 유용하다.

임의의 혈액암을 치료하기 위해 고투여량의 화학요법과 같은 일부 화학요법 요법에서, BM의 제거는 바람직한 효과이다. 환자의 회복 시기를 줄이기 위해 제거 실시후, 즉각적으로 본 발명의 방법을 수행함으로써 BM이 자극되고 HSC 및 이들의 전구 혈액 세포의 생산이 증가된다. 화학요법을 실시한 후 환자의 신체를 정화하기 위해 통상 1일 이상 지난 후, 본 발명에 따른 LHRH 유사체를 환자에게 투약한다. 이는 CSF(colony stimulating factors) 및 SCF(stem cell factor)와 같은 기타 인자 뿐만 아니라 자가조직의 또는 이형의 BM 또는 조혈 줄기 또는 전구 세포를 병용 투여할 수 있다.

또한, 환자는 차선의(또는 "지친") BM 기능을 가질 수 있으며, 충분한 또는 정상 수치의 HSC 및 그외 혈액 세포를 생산하지 않을 수 있다. 이는 정상적인 노화, 지속된 감염, 화학요법후, 방사선 치료후, 암, 유전학적 이상 및 이식에서 유발된 면역억제를 포함한 만성적인 질환 상태와 같은 여러가지 상태에 의해 야기될 수 있다. 또한 전신 방사선 조사 와 같은 조사는 BM 생산성에 주된 영향을 미칠 수 있다. 이러한 상태는 또한 악영향(예컨대 화학요법 및/또는 방사선 요법에서)을 최소화하기 위해 전처리 되거나 또는 발생 후 영향을 상쇄하기 위해 처리될 수 있다.

T 세포에 대한 효과

남성 및 여성의 성 스테로이드는 성 스테로이드 매개 시그널링의 파괴 발생(예, GnRH 작용제)에 의해 정기적으로 저해될 수 있다. 스테로이드의 감소는 흉선 기능의 재활성화와 원시 T 세포의 생산 증진을 야기한다. 또한 신생 T 세포가 기회를 가지기 위해 흉선을 떠나기도 전에, 기존재하는 T 세포가 자극에 보다 더 민감하여 보다 더 효과적인 면역 반응을 발생시킨다. 이러한 증가된 반응성은 성 스테로이드의 소실된 시기에 발생된다(예, 실시예 23 참조). 이는 성 스테로이드의 저해 효과가 없기 때문일 수도 있다. 이는 흉선의 재활성화 또는 재활성화된 흉선에 의한 "헬퍼" 또는 "보강제" 인자의 생산이 이유일 수 있는데, 이들은 외부 자극과 함께 T 세포를 함께 자극할 수 있다. 또한, 많은 면역계 세포는 GnRH에 대한 표면 리셉터를 가지므로, GnRH 스스로가 T 세포에 대한 부가적인 자극을 제공할 수 있다. 말초 T 세포에 대한 성 스테로이드 소실 효과가 매우 신속하게 이루어지므로, GnRH는 예컨대 백신의 전달과 동시에 단일 치료제로 주어질 수 있다. 1달 제형은 보다 더 긴 성 스테로이드 소실에 따른 부작용 없이 면역 반응을 자극하는 이로운 효과를 가지는데 유용하다. 이후 항원의 "부스터" 주입이 실시될 수 있다.

성 스테로이드 저해제(예, GnRH 유사체)는 암 환자, 특히 이탈한 화학요법(escaped chemotherapy) 또는 수술로 인한 암세포 제거, 또는 기회 감염에 대한 방어에 있어서 면역치료의 모든 형태를 부스트(boost)하는데 사용가능하다. 도한 이러한 유사체는 예방학적인 측면으로 사용되어 예컨대 감염원 또는 암을 예방하기 위해 고안된 백신 예방 프로그램에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 방법은, 성 스테로이드 시그널링 저해를 이용한다. 성 스테로이드는 흉선, 골수 및 또한 신체를 통한 T 및 B 림프구의 기능을 억제하며, 혈액, 림프절, 점막 조직(예, 호흡기, 모의, 생식기)를 비제한적으로 포함하는 체내 주된 림프성 부위에 집중된다. 성 스테로이드 제거 및/또는 성 스테로이드 매개 시그널링의 중단으로 흉선을 재생하고(즉 T 세포의 수 및 '질'), 기존재하는 T 세포와 새롭게 생산된 T 세포( 및 그외 면역계 세포)의 기능성을 흉선의 재생없이, 이전에 또는 병행하여 향상시킬 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하였다.

불충분한 면역 반응은 즉시적이고도 임상적으로 중요한 결과를 낳는다. 이는 일반적인 감염원(예, 인플루엔자)에 대한 증가된 감염가능성, 암 및 종양에 대한 감수성 및/또는 백신예방에 대한 빈약한 반응성을 의미할 수 있다.

총 T 세포 풀에서 원시 T 세포의 수 및/또는 비율 증가는, 암, 면역결핍증(특히 바이러스 감염, 예, AIDS, SARS 또는 인플루엔자), 자가면역성, 이식, 알레르기를 비제한적으로 포함하는 다수의 임상(또는 잠재적인 임상) 증상 및 질환에 대해 긍정적이고도 직접적인 치료 효과를 가질 뿐만 아니라 백신예방 프로그램의 일반적인 효율을 향상시킨다. 이런 각각의 적용은 계류중인 미국 특허 출원번호 10/418,747, 10/419,039, 10/418,953, 10/418,727, 10/419,066, 및 10/419,068에 상세히 기재되어 있다.

성 스테로이드 시그널링 저해(예, LHRH/GNRH 유사체를 이용한)는 여러회 발생될 수 있다. 즉각적인 효과는 기존재하는 림프계 (및 비-림프계) 세포의 기능성 증진에 의한 것이다. 시간에 따라 성 스테로이드의 감소로 T 세포, B 세포 및 APC 세포의 생산 및 기능성이 부가적으로, 상승적으로 또는 상보적으로 증가되어 반응을 증진시킨다. T 세포, B 세포 및 그외 면역 세포 뿐만 아니라 신생 APC의 증가는, 기존재하는 T 세포, B 세포 및 APC의 민감성 증가와 더불어,공여체 이식체에 대한 환자의 허용성을 증진시키는데 사용될 수 있다.

따라서, 성 스테로이드 시그널링의 파괴는 본 발명의 방법에 따라 수행되어, 약물이 유의적인 흉선 재생장을 야기할 수 있기 전에도 면역 세포의 활성 또는 기능성 증가를 개시함으로써 임상적으로 긍정적인 효과를 야기한다.

DC에 대한 효과

또한 본 발명의 DC의 기능 및/또는 수 증가 방법을 제공한다. 성 스테로이드 제거 이후에(예, LHRH 유사체 전달 이후), DC는 흉선과 말초에서 증가하며, 이는 T 세포 자극을 보조할 수 있다.

도 1A-B: 거세는 흉선 세포충실성(cellularity)을 신속하게 재생한다. 도 1A-B는 거세 전 및 후의 흉선 무게 및 흉선세포 수 변화를 나타낸 그래프이다. 흉선당 흉선 무게(도 1A) 또는 세포 수(도 1B)로 측정한 바에 따라, 흉선 퇴화은 노화에 따라 흉선 세포가 현저하게 감소하는 결과를 초래한다. 본 실험에서, 수컷 마우스(즉 2살)를 외과적으로 거세하였다. 체중에 대한 흉선 무게(도 1A) 및 흉선 세포충실성(도 1B)를 연령별(1 및 2년) 및 거세후 2-4주(post-cx)에 분석하였다. 어린 마우스(2달)에 비해, 나이가 든 경우 흉선의 무게 및 세포충실성이 현저하게 감소하였다. 거세후 1주일 경과하였을때 세포수 감소가 여전히 있었으나, 이러한 흉선의 무게 및 세포충실성 감소는 거세에 의해 복구되었다(도 1C). 거세후 2주일 경과시, 세포 수는 어린 마우스에서 관찰되는 수준으로 증가되었다(도 1B). 거세 후 3주 경과시, 세포수는 현저하게 증가하였고, 거세 4주 후 안정화되었다(도 1B). 결과는 그룹당 4-8마우스(도 1A) 또는 그룹당 8-12마리 마우스(도 1B)의 평균 ± 1SD로 나타내었다. **=p ≤ 0.01 ; *** =p ≤ 0.001 어린 성체(2달) 흉선과 거세 마우스의 2-6주된 흉선을 비교.

도 2A-D: 거세로 말초의 CD4:CD8 T 세포 비율이 회복된다. 본 실험에서, 마우스(2살)를 외과적으로 거세하고 말초 림프구 집락을 거세후 2-6주간 분석하였다. 도 2A 및 2B는 비장에서의 총 림프구 수를 나타낸다. 항상성은 비장내 총 세포수를 유지시키므로, 비장 수는 마우스 및 거세 마우스에서 일정하게 유지된다(도 2A 및 2B). 그러나 (18-24 달된) 마우스의 림프절에서는 세포 수가 격감되었다(도 2B). 이러한 림프절에서의 세포충실정 감소는 거세에 의해 회복되었다(도 2B). 도 2C는 T 세포에 대한 B 세포 비율은 비장 및 림프절에서 노화 또는 거세후에 변화되지 않았음을 나타낸다. 그러나 CD4+:CD8+ T 세포 비율에서의 현저한 감소(p ≤ 0.001)가 림프절 및 비장 모두에서 관찰되었다(도2E). 이러한 감소는 거세후 4-6주 경과기 어린 마우스(2달)에서 회복되었다(도 2D).

결과는 그룹당 4-8마우스(도 2A, 2C, 및 2E) 또는 그룹당 8-12마리 마우스(도 2B, 2D, 및 2F)의 평균 ±1SD로 나타내었다. *=p ≤ 0.05; **=p ≤ 0.01 ; *** =p ≤ 0.001 어린 마우스(2달)와 거세 마우스를 비교.

도 3: 흉선 부분집단(subpopulation)은 흉선 퇴화 또는 거세에 의한 재생에도 불구하고 유사한 특성을 유지하고 있다. 본 실험에서, (2살된) 마우스를 거세하고, 마커 CD4 및 CD8을 기초로 흉선세포 서브세트를 분석하였다. CD4-CD8-DN, CD4+CD8+DP, CD4+CD8- 및 CD4-CD8+SP 흉선세포에 대한, CD4(X축) 대 CD8(Y-축)의 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter) 프로파일은 어린 마우스(2달), 노화된 마우스(2살) 및 노화된 거세 동물(2살, 거세후 4주 경과됨)에 대해 나타내고 있다. 각 4분면에 대한 퍼센트가 각 플롯 위에 주어져 있다. 노화 또는 거세 마우스에서 확인한 CD4/CD8 서브세트 비율에는 별다른 차이가 없었다. 따라서, 흉선세포의 부분집단은 노화에 일정하게 유지되고, 거세이후 흉선세포이 동시에 확장된다.

도 4A-B: 거세이후 흉선세포 증식 재생. 마우스에게 BrdU를 펄스로 주입하고 증식성 (BrdU⁺) 흉선세포를 분석하였다. 본 실험에서, 노화 마우스(2년)를 거세하고 증식 수준을 측정하기 위해 브로모데옥시우리딘(BrdU)을 펄스로 주사하였다. 노화된 거세 마우스의 흉선내부의 BrdU+ 비율에 대한 막대그래프를 나타내었다(도 4A). 노화 및 거세 이후 마우스에서 비율이 일정하게 유지된 바와 같이, 흉선내의 총 증식 비율은 변화가 없었다(도 4A 및 도 4B의 좌측 그래프). 그러나, BrdU+ 세포 수의 현저한 감소가 노화된 마우스에서 관찰되었다(도 4B, 우측 그래프). 거세 후 2주 경과시, BrdU+ 세포수가 어린 마우스(2달)와 거의 유사하게 증가하였다(도 4B, 우측 그래프). 결과는 그룹당 4-14 마리 마우스의 평균 ±1SD로 나타내었다. *** =p ≤ 0.001은 어린 마우스(2달)와 거세후 2-6주된 마우스를 비교.

도 5A-H: 거세는 모든 흉선세포 서브세트내 증식을 증진한다. 본 실험에서, 노화된 마우스(2살)를 거세시키고 증식 수준을 측정하기 위해 펄스로 BrdU를 주사하였다. 여러가지 흉선세포 서브세트내 증식 분석은 흉선내 CD4 및 CD8를 토대로 분석하였다. 도 5A에서는 BrdU+ 집단내 각 흉선세포 서브세트의 비율이 노화 또는 거세후에 별다른 변화가 없음을 나타낸다. 그러나, 도 5B에서, 나이에 따라 DN (CD4-CD8-) 흉선세포 증식 비율이 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 도 5C에서, TN 서브세트내 총 BrdU+ 세포(즉, 증식성 세포) 비율이 노화 또는 거세후 변하지 않았다. 그러나, TN1 (CD44+CD25-CD3-CD4-CD8-) 서브세트내 증식의 현저한 감소(도 5E) 및 TN2 (CD44+CD25+CD3-CD4-CD8-) 서브세트내 증식의 현저한 증가(도5F)가 노화시 관찰되었다. 이는 거세후 복귀되었다(도 5D-F). 결과는 그룹당 4-17 마리 마우스의 평균 ±1SD로 나타내었다. *=p ≤ 0.05 ;** =p ≤ 0.01 (유의적);***=p ≤ 0.001(매우 유의적)은 어린 (2달) 마우스와 비교하였다; ^ = 거세후 2-6주된 마우스와는 현저한 차이가 있다((도 5E-H).

도 6A-C: 거세는 노화된 흉선에서의 T 세포 유출을 증가시킨다. 본 실험에서, 노화 마우스(2살)를 거세하고 흉선의 유출율을 측정하기 위해 FITC를 흉선내에 주사하였다. 말초에서 FITC+ 세포 수를 24시간 후 측정하였다. 도 6A에서, 24시간동안 말초에서 검출한 RTE(recent thymic emigrant) 세포 수가 노화된 마우스에서 현저히 감소된 것으로 관찰되었다. 거세를 실시한 다음 거세 후 2주에 상기 수치가 현저하게 증가하였다. 도 6B에서와 같이, 생착율(유출/총 흉선 세포충실성)은 노화에서 일정하게 유지되었으나, 거세후 2주후에 현저하게 감소하였다. 노화된 마우스에서, CD4+ toCD8+ RTE 비율은 현저하게 증가되며, 거세 후 1주일후에 정상화되었다(도 6C).

결과는 그룹당 4-8 마리 마우스의 평균 ±1SD로 나타내었다. *=p ≤ 0.05 ;** =p ≤ 0.01; ***=p ≤ 0.001은 어린 (2달) 마우스(도 6A) 및 그외 모든 그룹(도 6B 및 6C)과 비교하였다; ^ =p ≤ 0.05는 거세하지 않은 노화된 마우스(1살 및 2살)와 거세후 1주된 노화 마우스와 비교.

도 7A-B: 거세는 T 세포 결핍 이후 흉선세포 재생을 증진한다. 3달된 마우스에게 사이클로프로파미드를 처리하거나(2일 간 2회, 체중당 200 mg/kg의 사이클로프로파미드를 복막내 투여)(도 7A) 또는 치사량에 가까운 방사선(625 Rads)을 조사하였다(도 7B). 두가지 T 세포 고갈 실험에서, 모의-거세한(ShCx) 마우스에 비해 거세한(Cx) 마우스에서 흉선 재생율이 현저하게 증가되었다. T 세포 결핍(TCD) 1 및 2주후의 총 흉선세포 수 분석을 통해, 사이클로포스파미드 또는 치사량에 가까운 방사선 조사 중 어느 하나로 처리한 후 거세에 의해 흉선 재생율이 현저하게 증가하는 것을 확인되었다(각 도 7A 및 7B). 결과는 그룹당 4-8 마리 마우스의 평균 ±1SD로 나타내었다. 도 7A에서, ***는 대조군 마우스(노화된 무리된 마우스)와 비교시 p≤0.001 이고; ^는 거세한 2 그룹의 마우스와 비교시 p ≤ 0.001이다. 도 7B에서, ***는 대조군 마우스와 비교시 p ≤ 0.001이고; ^는 거세한 후 방사선 조사한 1주일 경과된 마우스 및 방사선 조사한 2주일 경과된 거세 마우스 2가지 그룹에 대한 것으로 p ≤ O.001이다.

도 8A-B: 사이클로포스파미드 처리후 비장 및 림프절에서의 총 림프구 수. 본 실험에서 (3달된)마우스의 림프구를 사이클로포스파미드(2일 간 2회, 체중당 200 mg/kg의 사이클로프로파미드를 복막내 투여) 및 사이클로포스파미드를 마지막으로 주사한 날에 외과적으로 거세 또는 모의 거세를 하여 고갈시켰다. 흉선, 비장 및 림프절(모은(pooled))을 분리하고 총 세포충실성을 평가하였다. 모의 거세한 마우스에서는 대조군(노화된 무처리군)에 비해 처리 1 및 4주후에 비장의 총 세 포수가 현저히 낮았다(도 8A). 세포 수의 현저한 증가가 처리한 2 그룹의 처리 후 1주 경과시 림프절에서 관찰되었다(도 8B). 처리 2주후, 거세 마우스에서의 림프절 세포 수가 모의 거세 마우스에 비해 월등히 많았다(도 8B). 각 막대기는 그룹당 7-17마리 마우스의 평균 ± lSD이다. *는 p ≤ 0.05; **는 p ≤ 0.01,대조군과 비교함(노화된 무처리군). ^는 거세 마우스와 비교시 p ≤ 0.05이다.

도 9: 동일날자의 사이클로포스파미드, 화학요법제 및 외과적 또는 화학적 거세이후의 흉선(□), 비장(▨) 및 림프절(▧)의 세포 수 변화. 거세 1 및 2 주일후 거세하지 않은 동물(사이클로포스파미드만 처리)에 비해 거세한 동물에서, 흉선의 빠른 확장이 이루어졌다. 또한 거세 그룹에서의 비장 및 림프절 수가 사이클로포스파미드만을 처리한 군에 비해 매우 증가되었다(n = 3-4/처리 그룹 및 처리 시기). 사이클로포스파미드 처리 후 면역계 재생에 있어, 화학적 거세는 외과적 거세와 비슷하였다.

도 10A-C: 외과적 거세 1주일후 방사선 조사(625 Rads)에 따른, 흉선(도 10A), 비장(도 10B) 및 림프절(도 11C)의 세포 수 변화. 본 실험에서, 어린(3달) 마우스에서 림프구를 치사량에 가까운 방사선 조사(625 Rads)로 고갈시켰다. 마우스는 조사 1주일전에 거세 또는 모의-거세한 것이다. 거세시 현저한 흉선 재생 증가(즉 흉선 재생 속도 증가)가 관찰되었다(도 10A). 처리 1 및 2주일 후, 거세하지 않은 그룹과 비교하였을때, 거세 그룹에서의 흉선이 신속하게 확장되었다(n = 3-4/처리 그룹 및 처리 시기). 거세된 마우스에서의 비장(도10B) 또는 림프절(도10C)간의 세포 수에 대한 차이가 없었다. 림프절 세포수는 대조군에 비해 처리 2 주일 경과시 여전히 매우 낮았다(도 10C). 결과는 그룹당 4-8 마리 마우스에 대한 평균 ±1SD로 나타내었다. * = p ≤ 0.05; ** = p ≤ 0.01, 대조군과 비교; *** = p ≤ 0.001 대조군 및 거세 마우스와 비교.

도 11A-C : 동일자 방사선 조사 및 거세후의 흉선 (도 11A), 비장(도 11B) 및 림프절(도 11C)의 세포 수 변화. 본 실험에서, 어린(3달) 마우스에서 림프구를 치사량에 가까운 방사선 조사(625 Rads)로 고갈시켰다. 마우스는 조사한 날 거세 또는 모의-거세하였다. 거세 마우스에서는 모의 거세 마우스에 비해 현저히 빠른 흉선 재생율을 보였다(도 11A). 처리 2주일 후, 거세하지 않은 그룹과 비교하였을때, 거세 그룹에서의 흉선이 신속하게 확장되었다. 거세된 마우스에서의 비장(도11B) 또는 림프절(도11C)간의 세포 수에 대한 차이가 없었다. 림프절 세포수는 대조군에 비해 처리 2주일 경과시 여전히 매우 낮았다(도 11C). 결과는 그룹당 4-8 마리 마우스에 대한 평균 ±1SD로 나타내었다. * = p ≤ 0.05; ** = p ≤ 0.01, 대조군과 비교; *** = p ≤ 0.001 대조군 및 거세 마우스와 비교.

도 12A-B: 방사선 조사 후 비장 및 림프절에서의 총 림프구. 3달된 마우스를 치사량에 가까운 방사선 조사(625Rads) 1주일 전에 거세 또는 모의 거세하였다. 처리 1주일 후 두 그룹의 비장(도 12A) 및 림프절(도 12B)에서 모두 심각한 림프구 감소가 관찰되었다. 비장의 림프구 수는 처리 2주후 대조군 수준으로 회복되었으나(도 12A), 림프절의 세포충실성은 대조군(동일 나이의 무처리군)과 비교하였을때 여전히 감소되었다(도 12B). 처리군 사이에 차이점은 없었다. 각 막대기는 그룹당 6-8 마리 마우스에 대한 평균 ±1SD를 나타낸다. **=p ≤ 0.01; ***=p ≤ 0.001 대조군 마우스와 비교.

도 13A-B: 거세는 HSV-1 면역에 의한 반응성을 회복시킨다. 마우스에 HSV 4 x 10⁵ pfu를 뒷다리 무릎에 주사하였다. 감염 5일 후, 유출되는 림프절(오금)에서 반응성 세포를 분석하였다. 도 13A는 헤르페스 심플렉스 바이러스-1(HSV-1)의 발에 주사한 후 림프절 세포충실성을 나타낸 것이다. 노화된 비거세 그룹에 비해, 거세후 세포충실성이 증가하였다. 도 13B은 FACS(즉 활성화된 세포는 CD8+CD25+ 세포이다)에 의한 CD25 대 CD8 세포으로 표시된 바와 같이 전체 활성화된 세포 수를 나타낸다. 노화된 마우스의 거세로 HSV-1에 대한 면역반응이 어린 마우스와 동일한 CTL 수치로 회복되었다. 결과는 8-12 마리 마우스에 대한 평균 ±1SD를 나타낸다. **=p ≤ 0.01, 어린(2달) 및 거세 마우스 둘다에서 비교.

도 14A-C : HSV-1 접종 이후, 활성화된 LN(림프절)에서 CTL(세포독성 T 림프구) 상의 Vβ10 발현(HSV-특이적). 전체적으로 노화된 마우스(즉 18개월)에서 정상적인 Vβ10 반응에도 불구하고, 몇몇 마우스에서는 완벽한 Vβ10 발현 감소가 관찰되었다. 대표적인 막대그래프를 나타내었다. 노화된 마우스에서의 클로날 반응이 감소되었고, 거세 후 예상 반응이 감소된다.

도 15A-B: HSV-1 감염 이후, 거세는 활성화를 증진시킨다. 도 15A는 HSV-1의 LN 감염된 마우스에서 활성화된(CD8+CD25+) 세포의 FACS 프로파일을 나타낸다. 노화 또는 거세후 활성화된 CTL 비율에는 변화가 없었다. 거세된 노화 마우스에서, HSV-1에 대한 면역반응이 어린 마우스와 동일한 CTL 수로 회복되었다. 결과는 8-12 마리 마우스의 평균 ±1SD를 나타낸다. ** = p ≤ 0.01 어린(2달) 및 거세된 마우스에서 비교

도 16: HSV-1에 대한 면역반응 특이성. HSV-1(HSV-1 감염 5일 후 제거)로 면역화한 마우스로부터 오금 림프절 세포를 제거하고, 3일간 배양한 다음, HSV 펩타이드가 펄스된 EL4 표적 세포를 용해시킬 수 있는 능력을 실험하였다. CTL 분석은, 세포용해(세포용해) 백그라운드 레벨을 위한 대조군으로 면역화하지 않은 마우스로 실시하였다(⁵¹Cr 방출로 측정). 노화된 마우스에서는 10:1 및 3:1의 E:T 비율로 CTL 활성이 현저하게(p ≤ 0.01, **) 감소되어, 림프절에 존재하는 특이적 CTL의 비율이 감소하는 것으로 나타났다. 거세 마우스에서의 HSV-1에 대한 반응이 어린 마우스(2달)과 비슷한 것으로 나타났으므로, 노화된 마우스의 거세는 어린 마우스에 대한 CTL 반응으로 회복시킨다. 결과는 8마리 마우스의 평균, 3배수 ±1SD로 나타낸다. ** =p ≤ 0.01, 어린 마우스 비교; ^ = 대조군 노화 마우스와 현저한 차이(p ≤ 0.05, E: T 가 3: 1; p ≤ 0.01, E: T가 0.3 : 1).

도 17A-B : HSV-1에 대한 면역 반응에서 Vβ TCR 발현 및 CD4+ T 세포 분석. 오금의 림프절을 HSV-1 감염 5일 후 제거하였고, CD25, CD8, 특이적 TCR Vβ 마커(도 17A) 및 CD4/CD8 T 세포(도 17B)의 발현을 ex-vivo로 분석하였다. Vβ10 또는 Vβ8 중 하나를 발현하는 활성화된 (CD25⁺)CD8⁺ T 세포는 도 17A에서 그룹마다 8마리의 마우스에 대한 평균 ± 1SD로 나타낸다. 연령 또는 거세 후에 별다른 차이점이 관찰되지 않았다. 그러나 휴지기(resting) LN 집단에서 CD4/CD8 비가 연령에 따라 감소하였다(도 17B). 이러한 감소는 거세후에 회복되었다. 결과는 그룹마다 8마리의 마우스에 대한 평균 ± 1SD로 나타낸다. *** = p ≤ 0.001 어린 거세 마우스에서 비교.

도18A-D: Ly5 컨제닉 마우스의 BM 이식(BMT) 후에 수행한 거세는 림프절(도 18C)을 제외하고, 흉선(도 18A), 비장(도 18B), 및 BM(도 18D)의 재생을 향상시킨다. 3 월령의 젊은 성체 C57/BL6 Ly5.1+(CD45.1+) 마우스에 C57/BL6 Ly5.2+(CD45.2+) 성체 BM 세포(10⁶개)를 이식하기 1일 전, 방사선을 조사한 다음(6.25 Gy), 거세 또는 모의 거세하였다. 그로부터 2주일 및 4주일 후에 마우스가 사멸하였고, 흉선(도 18A), 비장(도 18B), 림프절(도 18C), 및 BM(도 18D) 각각의 면역 재구성에 대해 분석하였다. 항-CD45.2(Ly5.2)를 이용하여 공여체/숙주 기원을 분석한 결과, 공여체 기원의 백혈구와만 반응하였다. 거세된 마우스는 모의 거세된 마우스에 비해, BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시, 흉선 내에 존재하는 공여 세포 수가 훨씬 많았다(도 18A). 거세하지 않은 그룹과 비교해 볼 때, 거세한 마우스의 흉선 내에서는 처리 후 모든 시점에서 세포 개수가 신속하게 증가한다는 것에 대해 주목해야 한다. 또한, 거세된 마우스는 모의 거세된 마우스에 비해, BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시, 비장 및 BM 내에 존재하는 세포 수가 훨씬 많았다(도 18B 및 18D). BMT를 수행한 지 2주일 및 4주일 경과 시, 림프절 내의 세포충실성에서는 큰 차이가 없었다(도 18C). 거세한 마우스는 거세하지 않은 마우스에 비해 컨제닉 세포(Ly5.2)수가 크게 증가하였다(Ly5.2). 결과는 그룹당 4-5마리 마우 스에 대한 평균+1SD로 나타내었다. *=p ≤ 0.05; **=p ≤ 0.01.

도19A-C: 컨제닉(congeni) BMT 후에 수행한 거세는 BM 및 비장 세포충실성을 증가시킨다. 도 19A에서와 같이, 거세된 마우스는 BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시, BM 내의 세포수가 크게 증가한다. BM 세포충실성은 모의 거세한 마우스의 BMT 2주일 경과 시, 무처리 대조군 수준이었다(1.5×10⁷±1.5×10⁶). BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시의 거세된 마우스는 컨제닉 BM 세포충실성이 대조군 수준보다 높았다. 도 19B는 BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시의 거세된 마우스의 흉선 내에 대단히 많은 세포가 존재한다는 것을 나타낸다. BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시의 모의 거세된 마우스는 흉선 세포충실성이 무처리 대조군 수준 미만이었다(7.6×10⁷±5.2×10⁶). 컨제닉 BMT 처리4주일 경과 시의 거세된 마우스의 흉선 세포충실성은 대조군 수준보다 높게 증가하였다. 도 19C는 BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시의 비장 세포충실성은 별다른 변화가 없음을 나타낸다. 모의 거세된 마우스 및 거세된 마우스는 BMT 처리 2주일 경과 시의 비장 세포충실성이 대조군 수준이었다(8.5×10⁷±1.1×10⁷). 각각의 그룹은 4 내지 5마리의 마우스를 포함한다. □는 모의 거세 그룹을, ▧는 거세 그룹을 나타낸다.

도 20: BMT 이후의 거세는 HSC의 비율을 증가시킨다. FACS 점 플롯은 c-kit(y축) 대 sca-1(x축) 발현을 나타낸다. HSC는 c-kit^hisca-1^hi이다. BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시의 거세된 마우스에서는 공여체 유래의 HSC 비율이 크게 증 가하였다.

도 21A-B: 컨제닉 BMT 처리 후 거세는 HSC의 비율 및 개수를 증가시킨다. 도 21A에서와 같이, BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시의 거세된 마우스에서는 HSC 비율이 크게 증가하였다(* p＜0.05). 도 21B는 거세된 마우스가 모의 거세된 대조군에 비해, BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시의 HSC의 개수가 크게 증가하였다는 것을 나타낸다 (* p＜0.05, ** p＜0.01). 각각의 그룹은 4 내지 5마리의 마우스를 포함한다. □는 모의 거세 그룹을, ▧는 거세 그룹을 나타낸다.

도 22A-B: BMT 처리한 다음, 거세된 마우스의 BM 내에서는 공여체 유래의 B세포 전구체 및 B 세포수가 크게 증가하였다. 도 22A에서와 같이, 거세된 마우스는 모의 거세된 대조군에 비해, 공여체 유래의 CD45.1⁺B220⁺IgM^-B 세포 전구체수가 더욱 많다(* p＜0.05). 도 22B는 거세된 마우스는 모의 거세된 마우스에 비해, BM 내에 존재하는 공여체 유래의 B220⁺IgM⁺B세포수가 더욱 많다는 것을 나타낸다.(* p ＜0.05). 각각의 그룹은 4 내지 5마리의 마우스를 포함한다. □는 모의 거세 그룹을, ▧는 거세 그룹을 나타낸다.

도 23: 컨제닉 BMT 처리 후의 거세는 공여체 유래의 흉선 세포 비율에 영향을 끼치지 않는다. 거세 또는 모의 거세 2주 후, 모의 거세 그룹과 거세 그룹은 공여체 유래의 이중 음성(CD45.1⁺CD4^-CD8^-)의 초기 흉선세포의 비율이 증가한다. BMT 처리후 초기 시점에서는 공여체-유래의(CD45.1⁺)CD4 및 CD8 단일 양성의 세포가 거의 존재하지 않았다. BMT 처리 4주일 경과 시, 모의 거세 그룹과 거세 그룹은 그 각각의 공여체 유래의 흉선 세포 프로파일이 무처리 대조군의 것과 유사하다.

도 24: 컨제닉 BMT 처리 이후의 거세는 말초 B세포 비율을 증가시키지 않는다. 컨제닉 BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시, 거세된 마우스와 모의 거세된 마우스를 비교한 결과, 비장 B220 발현에 있어서 거의 차이가 없었다.

도 25: 컨제닉 BMT 처리 이후의 거세는 말초 B세포의 개수를 증가시키지 않는다. BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시의 세포수에 있어서 별다른 차이가 없었다. 컨제닉 BMT 처리 2주일 경과 시의 모의 거세된 마우스 및 거세된 마우스의 비장 내 B세포의 개수는 무처리 대조군 수준이다(5.0×10⁷±4.5×10⁶). 각각의 그룹은 4 내지 5마리의 마우스를 포함한다. □는 모의 거세 그룹을, ▧는 거세 그룹을 나타낸다.

도 26: BMT 처리 후에 거세된 마우스에서는 공여체 유래의 3중 음성, 이중 양성, 및 CD4 및 CD8 단일 양성의 흉선 세포 개수가 증가한다. 도 26A는, 거세된 마우스가 모의 거세된 대조군에 비해, BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시의 공여체 유래의 3중 음성의(CD45.1⁺CD3^-CD4^-CD8^-) 흉선 세포수가 크게 증가함을 나타낸다(* p＜0.05, **p＜0.01). 도 26B는 거세된 마우스가 모의 거세된 대조군에 비해, BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시의 2중 양성의(CD45.1⁺CD4⁺CD8⁺) 흉선 세포수가 크게 증가하였음을 나타낸다(* p＜0.05, **p＜0.01). 도 26C에서와 같이, BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시, 거세된 마우스는 모의 거세된 대조군에 비해서, CD4 단일 양 성의(CD45.1⁺CD3⁺CD4⁺CD8^-) 흉선 세포수가 크게 증가하였다(* p＜0.05, **p＜0.01). 도 26D는, 거세된 마우스가 모의 거세된 대조군에 비해, BMT 처리 4주 경과 시의 CD8 단일 양성의(CD45.1⁺CD³⁺CD^4-CD⁸⁺) 흉선 세포수가 크게 증가한다는 것을 나타낸다(* p＜0.05, **p＜0.01). 각각의 그룹은 4 내지 5마리의 마우스를 포함한다. □는 모의 거세 그룹을, ▧는 거세 그룹을 나타낸다.

도 27: 컨제닉 BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시, 공여체 유래의 말초 T세포는 거의 존재하지 않았다. 도 27A에서와 같이, 거세된 마우스는 모의 거세된 마우스에 비해, 컨제닉 BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시, 비장 내의 공여체 유래의 CD4⁺ 및 CD8⁺ T세포수의 비율이 대단히 작다. 도 27B는 BMT 처리 2주일 및 4주일 경과 시, 공여체 유래의 T세포 개수에 있어서는 별다른 차이가 없음을 나타낸다. 컨제닉 BMT 처리 4주 경과 시에는 모의 거세된 마우스와 거세된 마우스 모두, 무처리된 동일 연령의 대조군에 비해서 CD4⁺ 및 CD8⁺ T세포수가 훨씬 적다(CD4⁺-1.1×10⁷±1.4×10⁶, CD8⁺-6.0×10⁶+1.0×10⁵). 각각의 그룹은 4 내지 5마리의 마우스를 포함한다. □는 모의 거세 그룹을, ▧는 거세 그룹을 나타낸다.

도 28: 거세는 컨제닉 BMT 처리 4주일 경과 시의 흉선 내 공여체 유래의 DC 개수를 증가시킨다. 도 28A에서와 같이, 공여체 유래의 DC는 CD45.1⁺CD11c⁺MHCIT⁺이었다. 도 28B는, 컨제닉 BMT 처리 4주일 경과 시의 거세된 마우스가 공여체 유 래의 흉선 DC가 크게 증가하였다는 것을 나타낸다(*p＜0.05). 컨제닉 BMT 처리 2주일 경과 시의 수지상 세포 개수는 무처리 대조군 수준이다(1.4×10⁵±2.8×10⁴). 거세된 마우스 그룹에서는 컨제닉 BMT 처리 4주 경과시의 가지 세포 개수가 대조군보다 높은 수준이다. 각각의 그룹은 4 내지 5마리의 마우스를 포함한다. □는 모의 거세 그룹을, ▧는 거세 그룹을 나타낸다.

도 29A-C: 거세는 동종이형 HSCT 수용체에서의 면역 세포 재구성을 향상시킨다. CBA/J 수용체(3 월령)에 치사량의 방사선(1300 cGy)을 조사한 다음, B10.BR TCD BM(5×10⁶)을 이식하였다. 상기 수용체에 이식하기 1일 전에 각각의 수용체로 거세 또는 모의 거세하였다. 그런 다음, 각각의 마우스를 14일째, 28일째, 42일째에 안락사시킨 다음, BM(도 29A), 흉선(도 29B), 및 비장(도 29C) 조직 세포충실성을 평가하였다. *(p＜0.05). 각각의 그룹은 4 내지 5마리의 마우스를 포함한다.

도 30A-C: 거세는 동종이형 HSCT 수용체에서 공여체 유래의 HSC 및 B세포 개수를 증가시킨다. 도 29에서와 같이, 각각의 거세 또는 모의 거세된 수용체에 위에 설명한 바와 같은 이식을 수행한다. 도 30A에 도시된 바와 같이, 모의 거세된 마우스 및 거세된 마우스의 경우 모두, HSCT 처리 14일 경과 시에 공여체 유래의 HSC(Ly9.1^-Lin^-Sca-1+c-kit⁺)가 대단히 적게 존재하였다. 그러나, HSCT 처리 28일 경과 시에는 공여체 HSC 개수가 거세된 그룹에 비해 4배 높았다. 또한, 도 30B-C에 도시한 바와 같이, 거세된 마우스에서는 BM(도 30B) 및 비장(도 30C) 내 공여체 유래의 B세포수가 크게 증가하였다. BM 세포 또는 비장 세포의 총 세포수, 및 유 세포 분석에 의해, 중추 및 말초 B 세포 집단을 분석하였다. CD45R, IgM 및 CD43 발현을 기준으로 B세포는 발달 단계로 분리되었다. 전체 B 세포(CD45R⁺), 프로-B 세포(CD43⁺CD45R⁺IgM^-), 프리-B 세포(CD43^-CD45R⁺IgM^-), 미숙 B세포(CD43^-CD45R⁺IgM⁺). 공여체/숙주 기원을, 항-Ly9.1로 결정한 결과, 숙주 기원의 백혈구와만 반응하였다. 각각의 그룹은 4 내지 5마리의 마우스를 포함하였다. □는 모의 거세 그룹을, ▧는 거세 그룹을 나타낸다. *(p＜0.05)는 모의 거세된 대조군에 비해 거세된 그룹에서의 세포수 증가가 현저하다는 것을 나타낸다.

도 31A-E: 거세는 동종이형 HSCT 수용체에서의 숙주 및 공여체 유래의 DC의 개수 뿐만 아니라, 흉선 세포 및 말초 T세포의 재구성을 향상시킨다. 거세 또는 모의 거세된 수용체는 도 29에 도시한 바와 같이 이식받았다. 각각의 동물을 14일, 28일, 및 42일째에 안락사시킨 다음, 총 흉선 세포수(도 31A-F) 또는 총 비장 세포수(도 31G), 및 유세포 분석에 의해 흉선세포 및 T세포 집단을 분석하였다. DC는 CD11c^hiIa-k^hi로서 정의된다. 도 31A는 TN(CD3^-CD4^-CD8^-) 흉선 세포수를 나타낸다. 도 31B는 DP(CD4⁺CD8⁺) 흉선 세포수를 나타낸다. 도 31C는 CD4⁺SP(CD3⁺CD4⁺CD8^-) 흉선 세포수를 나타낸다. 도 31D는 CD8⁺SP(CD3⁺CD4^-CD8⁺) 흉선 세포수를 나타낸다. 도 331E에서와 같이, 거세된 수용체는 모의 거세된 대조군 수용체에 비해, 동종이형 HSCT 처리 14일 및 28일 경과 시에 숙주 유래의 DC가 현저하게 증가하였다. 또한, 도 31F에서와 같이, 거세된 수용체는 모의 거세된 대조군에 비해, HSCT 처리 28일 경과 시에 공여체 유래의 DC가 훨씬 더 많이 존재한다. 도 31G는 말초 T세포의 개수를 나타내며, 이는 항-CD3, 항-CD4 및 항-CD8를 이용하여 확인한다. 항-Ly9.1을 이용하여 공여체/숙주 오리진을 평가한 결과, 숙주 기원의 백혈구와만 반응하였다. 공여체 CD4 T세포는 Ly9.1^-CD3⁺CD4⁺CD8^-이고, 공여체 CD8 T세포는 Ly9.1^-CD3⁺CD4^-CD8⁺이었다. 각각의 그룹은 4 내지 5마리의 마우스를 포함하였다. □는 모의 거세 그룹을, ▧는 거세 그룹을 나타낸다. *(p＜0.05) 및 **(p＜0.01)는 모의 거세된 대조군에 비해 거세된 그룹에서의 세포수 증가가 현저하다는 것을 나타낸다.

도 32A-G: 동종이형 HSCT 이후의 거세는 공여체 유래의 T세포의 기능을 변화시키지 않는다. 거세 및 모의 거세된 수용체에 도 29에서와 같이 이식을 수행하였다. 이식 처리 42일 경과 시의 T세포의 기능성을 평가하였다. 도 32A는 동종이형 HSCT 처리 6주 경과 시, 공여체 유래의 T세포(CD3⁺CD4⁺ 및 CD3⁺CD8⁺) 개수를 나타낸다. 도 32B는, 동종이형 HSCT 처리 이후의 거세가 T세포의 증식 가능성에 영향을 끼치지 않는다는 것을 나타낸다. 도 32C는 MLR에서의 동종이형 T세포 증식이 전혀 차이가 없음을 나타낸다. 방사선 조사(20 Gy)된 BALB/c 비장 자극 세포(2×10⁵ 개/웰)를 이용하여, 각각의 그룹(n=5)으로부터 얻은 비장의 T세포 (4×10⁵ 개/웰)를 96-웰 플레이트 내에서 5일간 배양한 다음, 마지막 배양 20시간 동안 [³H]-티미딘을 첨가하였다. 도 32D는 공여체 유래의 T세포가 갖는 세포용해 활성에서 차이가 없음을 나타낸다. 도 32E는 동종이형 T세포의 세포내 IFNγ 발현을 나타낸다. 위에서 설명한 바와 같이, 모의 거세 또는 거세된 수용체로부터 42일째에 비장의 B6 T세포가 수집되었고, 수집된 세포를 방사선 조사(20 Gy)된 (BALB/C-third 파티) 비장의 자극 세포로 24웰 플레이트 내에서 5일간 배양하였다. 그런 다음, 세포를 수집한 후, TCD, 즉, 방사선 조사(20 Gy)된 (BALB/C 또는 B10.BR 내부의 생물학적 대조군) 비장의 자극 세포로 16시간 동안 다시 자극시켰다. 배양한 지 1시간 후에 브레펠딘 A (10 mg/mL)을 첨가하였다. 공여체 유래의 CD3⁺CD8⁺ 세포에서의 세포내 IFNy 발현을 유세포 분석에 의해 측정하였다. 대표적인 플롯은 도 32E에 도시된 바와 같으며, 도 32F에는 IFN-γ을 발현시키는 공여체 유래의 D8⁺ T세포의 백분율을 나타내는 그래프로 도시한다. 도 32G는, 마우스를 동종이형 HSCT 처리 시에 거세한 경우, 거세 처리 48시간 경과 시에 T세포 기능성이 현저하게 향상됨을 나타낸다. 각각의 모의 거세 및 거세된 마우스에 대해 동종이형 HSCT 처리 6주 경과 시에 DTH 분석을 수행한 다음, 우측 발바닥 팽창도에서 왼쪽 발바닥 팽창도를 뺀 값으로부터, 팽창도를 측정하였다. □는 모의 거세 그룹을, ▧는 거세 그룹을 나타낸다.

도 33A-B: 거세는 동종이형 HSCT 수용체에서의 GVHD의 악화, 또는 GVL 활성 감소를 유발하지 않는다. 도 33A에 도시한 각각의 실험에서, 치사량에 가깝게 방사선 조사(1300cGy)된 (B6xC3H)F1 수용체(3개월령)는 B6 TCD BM 세포(5×10⁶)+ 비장 의 T세포(0.5×10⁶)를 이식받았다. 생존률을 Kaplan-Meier 곡선으로 나타낸다. 흰색 원은 TCD-BM 단독(T세포 없음) 대조군(n=4)을 나타낸다. 검은색 원은 모의 거세된 수용체를 나타내며, □는 거세된 수용체를 나타낸다. 각 그룹은 8마리의 동물을 포함한다. 도 33B의 실험에서, 치사량의 방사선 조산, 3개월령의 B6D2F1/J 수용체에게 P815(H-2) 세포(1 x 10³), C57/BL6 TCD BM 세포(5 x10⁶) 및 C57/BL6 T 세포(5 x10⁵)를 제공하였다. 생존율은 Kaplan-Meier 곡선으로 나타내었다. ○는 TCD-BM 만(T 세포 없음)있는 대조군(n=4)이다. ● 는 모의 거세한 수용체이고, □는 거세한 수용체이다. 각각의 테스트 그룹은 8-9마리의 동물을 포함한다.

도 34A-I: 동종이형 HSCT 이후의 거세 및 IL-7 처리는 흉선에 추가적인 효과를 나타낸다. 거세 및 모의 거세된 수용체에 대해 도 1에서와 같이 이식을 수행하였다. 아울러, 처리 0일째부터 13일째까지 복강내 주사로 10 g/day의 IL-7 또는 PBS (대조군)를 이식하였고, 처리 14일째에 수용체가 사멸하였다(도 34A). 처리 21일째부터 28일째까지 10 g/day의 IL-7 또는 PBS (대조군)를 이식하였고, 각각의 수용체는 28일째에 사멸하였다(도 34B). 총 세포수를 계산하여, 흉선의 세포충실성을 평가하였다. *(p＜0.05)는 모의 거세된 대조군에 비해 거세된 그룹의 세포수가 크게 증가함을 나타낸다. 대조군: 모의 거세, PBS 주사된 수용체; CX: 거세, PBS 주사된 수용체; IL-7: 모의 거세, IL-7 주사된 수용체; 및 IL-7 & CX: 거세, IL-7 주사된 수용체. 동종이형 HSCT 및 거세 처리 2주일 경과 시에, 전체 BM에 대해 반정량적인 RT-PCR을 수행하였다. 거세 및 모의 거세된 마우스로부터 얻은 HPRT 평형 템플릿으로 TGFβ₁ 및 KGF의 발현을 비교하였다(도 34C). KGF^-/- 및 IL7^-/- 마우스를 거세한 다음, 2주 후에 흉선, BM, 및 비장의 세포충실성을 분석하였다. 도 34D-F는 각각 KGF^-/- 마우스의 흉선(도 34D), BM(도 34E), 비장(도 34F)의 결과를 나타낸다. 도34G-I는 각각 IL7^-/- 마우스의 흉선(도 34G), BM(도 34H), 및 비장(도 34I)를 나타낸다.

도 35: HSCT 이후의 거세는 BM, 흉선, 및 비장에서의 생착을 향상시킨다. 컨제닉 HSCT 처리 1일 전에 마우스를 거세시켰다. 방사선이 조사된(800 rads) C57/BL6 마우스에 5×10⁶ Ly5.1+BM 세포를 정맥내 주사하였다. 처리 후, 다양한 시점(2-6주)에서 유세포 분석에 의해 BM, 비장, 및 흉선을 분석하였다. 도 35B에서와 같이, 거세 및 HSCT 처리 2주일 경과 시, 모의 거세된 대조군에 비해 거세된 마우스의 BM 내에 더욱 많은 세포가 존재한다. 이와 유사하게, 도 35C에서와 같이, 모의 거세된 대조군에 비해 거세된 마우스는 처리 2주일, 4주일, 및 6주일 경과 시의 흉선 세포수가 현저하게 증가한다. 도 35C에서와 같이, 거세된 수용체는 대조군에 비해, 이식 처리 4주일 및 6주일 경과 시, 말초에서의 비장 세포수 역시 더 많이 존재한다. 회색 막대는 거세된 수용체를 나타낸다. 검은색 막대는 모의 거세된 대조군을 나타낸다.

도 36A-B: 컨제닉 HSCT 이후의 거세는 BM에서의 HSC 생착을 향상시킨다. 컨제닉 HSCT 처리 1일 전에 마우스를 거세시켰다. 방사선이 조사된(800 rads) C57/BL6 마우스에 5×10⁶ Ly5.1+BM 세포를 정맥내 주사하였다. 이식 처리 2주일 경과 시, 유세포 분석에 의해 BM의 lin-c-kit+sca-1+HSC를 분석하였다(도 36A). BMT 이식 및 거세 처리 2주일 경과 시에, 모의 거세된 대조군에 비해 거세된 마우스의 BM에서 공여체 유래의 HSC가 더 많이 존재한다(도 36B).

도 37A-B: 컨제닉 HSCT 이후의 거세는 BM에서의 HSC 생착을 향상시킨다(2.5×10⁶ 개 및 5×10⁶ 개). 컨제닉 HSCT 처리 1일 전에 마우스를 거세시켰다. 방사선이 조사된(800 rads) C57/BL6 마우스에 2.5×10⁶(도 37A-B) 또는 5×10⁶(도 37C-D) Ly5.1+BM 세포를 정맥내 주사하였다. 이식 처리 2주일 경과 시, 유세포 분석에 의해 BM의 lin-c-kit+sca-1+HSC를 분석하였다. 도 37A-D는 BM 내에 통상의 림프계 전구체의 백분율을 나타낸다. BMT 이식 및 거세 처리 2주일 경과 시에, 모의 거세된 대조군에 비해 거세된 마우스의 BM에서 공여체 유래의 HSC가 더 많이 존재한다.

도 38A-B: 컨제닉 HSCT 이후의 거세는 흉선에서의 공여체 유래의 DC의 생착을 향상시킨다(2.5×10⁶ 개 및 5×10⁶ 개). 방사선이 조사된(800 rads) C57/BL6 마우스에 5×10⁶ Ly5.1+BM 세포를 정맥내 주사하였다. 이식 처리 2주일 경과 시, 유세포 분석에 의해 흉선 세포를 분석하였다(도 38A). 공여체 유래의 DC는 CD45.1+CD11c+MHC 클래스 II+CD11b^{+ 또는 -}로 정의된다. 거세된 마우스는 모의 거세된 마우스에 비해, BMT 2주일 경과 시에 흉선에서의 공여체 유래의 CD11b⁺ 및 CD11b^- DC가 더 많이 존재한다(도 38B).

도 39A-D: 컨제닉 HSCT 후의 거세는 비장 내에서의 공여체 유래의 B세포 생착 속도를 증가시킨다. 방사선이 조사된(800 rads) C57/BL6 마우스에 5×10⁶ Ly5.1+BM 세포를 정맥내 주사하였다. 이식 처리 2주일 경과 시, 유세포 분석에 의해 비장 세포를 분석하였다(도 39A-C). BMT 이식 및 거세 처리 2주일 경과 시에, 모의 거세된 대조군에 비해 거세된 마우스의 비장 내에서 B220⁺ B세포가 더 많이 존재한다(도 36D).

도 40: 전립선암에 대한 LHRH 작용제 처리한 인간 환자의 말초 혈액 림프구의 표현형 조성을 분석하였다 (환자 연령＞ 60세). LHRH 작용제 처리 전, 및 처리를 시작한 지 4개월 후에 환자의 샘플을 분석하였다. 혈액(ml) 당 총 림프구 세포수는 모든 환자에 있어서 처리 전에 대조군 수치의 하한 수준이었다. 처리한 후에는 환자 9명 중 6명에게서 총 림프구 수의 실질적인 증가가 나타났다(어떤 경우에는 총 세포수가 2배로 증가하는 것으로 관찰됨). 즉, 이러한 결과가 관찰된 환자 9명 중 6명은 총 T세포수가 증가하였다. CD4⁺ 서브세트 내에서는 환자 9명 중 8명이 CD4⁺ T세포수가 증가하여, 이러한 증가를 보다 분명하게 확인할 수 있었다. CD8⁺ 서브세트에서는, 통상적으로 CD4⁺ T세포보다 작은 수준이기는 하지만, 환자 9명 중 4명에게서 증가된 수준이 나타남으로써, 보다 약한 증가가 나타났다.

도 41: LHRH 작용제 처리 전과 후의 인간 환자의 혈액을 분석한 결과, 처리 후의 T세포, CD4 또는 CD8 T세포의 총 비율에서 실질적인 변화가 나타나지 않으며, 아울러, 처리 후의 CD4: CD8 비값이 변화하지 않음을 알 수 있다. 즉, 상기 결과는, 처리 후의 총 T세포수가 실질적으로 증가하지만, 이러한 처리에 의해 T세포 서브세트의 항상성 유지에 미치는 효과가 최소임을 나타낸다. 모든 수치는 대조군 수치와 비교한 값이다.

도 42: LHRH 작용제 처리된 인간 환자로부터 얻은 말초 혈액 내의 B 세포 및 전구체 세포 (NK, NKT 및 대식세포) 비율을 분석한 결과, 서브세트에서 다양한 수준의 변화가 나타났다. 처리 후의 NK, NKT, 및 대식 세포 비율은 상대적으로 일정하게 유지되는 반면, B 세포 비율은 환자 9명 중 4명에 있어서 감소가 나타났다.

도 43: 처리 후의 인간 환자로부터 얻은 말초 혈액 내의 B 세포 및 전구체 세포의 총 개수를 분석한 결과, 처리 후의 NK (환자 9명 중 5명), NKT (환자 9명 중 4명), 및 대식세포 (환자 9명 중 3명)의 개수가 확실하게 증가하였다. B세포 개수는 환자 9명 중 2명에게서 증가가 나타났고, 4명은 변화가 없었으며, 3명에게서는 감소가 나타남으로써, 확실한 증가 경향이 나타나지 않았다.

도 44A-B: 인간에 대한 화학적 거세는 원시 및 기억 T 세포수를 향상시킨다. 도 44A에 도시한 바와 같이, LHRH-A 처리 이후에 원시(CD62L⁺CD45RA⁺CD45R0^-) CD4⁺ T세포가 현저하게 증가하였다. 도 44B에 도시된 바와 같이, LHRH 작용제 처리 이후에 원시 및 기억(CD62L^-CD45RA^-CD45R0^-) CD8⁺ 세포수가 증가하였따. 각각의 막대는 환자 16명의 평균값±1SD를 나타낸다. 처리 전과 값과 비교된 *= p≤0.05; **= p≤ 0.01.

도 45A-B: 인간에 대한 화학적 거세는 말초 혈액 림프구수를 증가시킨다. 전립선암 치료 일정의 일부로서 LHRH-A를 이용하여 화학적으로 거세시킨 인간 환자의 말초 혈액 림프구의 표현형 조성물을 분석하였다(환자 연령＞ 60세). 처리 전, 및 처리 4개월 경과 시의 환자를 분석하였다. 도 45A에서와 같이, LHRH-A 처리 후에 말초 혈액(㎕) 당 총 림프구 세포수는 현저하게 증가하였다. 이러한 결과는 각각의 T세포, CD4⁺ 및 CD8⁺ T세포 총수의 현저한 증가에서 기인한 것이다.

도 46A-B: LHRH-A 처리는 혈청 테스토스테론을 유효하게 고갈시키며, 흉선의 기능 및 T세포 유출을 유효하게 증가시킨다. 도 46A의 실험에서는 전립선암 환자를 LHRH-A로 4개월간 처리하였다. 처리 전, 및 LHRH-A 처리 4개월 경과 시의 환자 혈액을 FACS에 의해 분석하고, 혈청을 RIA에 의해 분석하였다. 도 83A에서와 같이, LHRH-A 처리 4개월 경과 시의 환자의 혈청 내에 테스토스테론이 검출되지 않았다. 막대는 분석한 환자 13명의 평균값을 나타낸다. 도 46B의 실험에서는 10명의 환자에 대해서 TREC 수준을 분석함으로써, 흉선의 기능 및 T세포 유출의 증가가 직접적으로 입증되었다. CD4⁺ 및 CD8⁺ T세포 집단에서는 LHRH-A 처리 4달째에 환자 10명 중 5명에게서 절대적인 TREC 수준의 증가(초기 프리젠테이션 수치보다 ＞25%)가 나타났다. 이 역시, 비례적으로 증가를 반영한다(세포 1×10⁵ 개 당; 데이터는 도시하지 않음). 즉, 환자 10명 중 6명에게서 TREC 총 수준의 증가가 나타났다. 한 명의 환자에게서만 TREC 총수준의 감소가 나타났다(약 30% 감소).

도 47: 인간에 대한 화학적 거세는 NK 개수를 향상시킨다. LHRH-A 처리 전, 및 LHRH-A 처리 4개월 경과 시의 환자 혈액을 분석하였다. LHRH-A처리한 경우, NK 세포수는 현저하게 증가하였으나, B세포수는 증가하지 않았다. 각각의 결과는 환자 13명에 대한 평균값±1SD이다. 처리 전 수치와 비교한 값은 ** = p≤ 0.01이다.

도 48A-B: 인간에 대한 화학적 거세는 T세포 증식성을 증가시키지 않는다. 도 48A-B는 Ki-67 항원 검출법을 이용하여 수행한 세포 증식 분석 결과를 나타낸다. LHRH-A 처리된 모든 환자에 있어서, 원시, 활성화, 및 기억 세포 서브세트의 CD4⁺ (도 48A) 및 CD8⁺ T세포 (도 48B) 증식 수준은 변화하지 않았다.

도 49A-C: 대조군 환자에게 HSCT 처리를, 처리군 환자에게 LHRH-A 처리를 수행한 다음, 다양한 시점(2-8주)에서의 자연 살상 세포(NK cell)의 회복. 도 49A-B에서와 같이, 대조군의 동종이형 및 자가조직 이식 수용체 모두 유사한 경향이 관찰되었다. 반면, HSCT 처리 3주 전에 LHRH-A된 동종이형 환자의 경우에는 D14-5M 이식 후로부터 얻은 NKT 세포의 개수가 훨씬 많은 것으로 나타났다(도 49C; 결과는 환자 6-20명의 평균값±1 SEM으로서 표시됨; *=p≤0.05).

도 50: 대조군 환자에게 HSCT 처리한 후, 각각의 시점(14일, 21일, 28일, 및 35일)에서의 NKT 세포 재구성의 FACS 분석. 동종이형 환자에게서 초기 회복이 관찰되었고, 이식 후의 CD8⁺ 집단에 있어서는 초기 회복이 지배적으로 나타나며, 이로 써, 재생의 흉선 외부 경로를 알 수 있다. 또한, CD4+NKT 세포는 이식 1개월 경과 시점에서부터 분명하다.

도 51A-B: 대조군 환자에게 HSCT 처리한 후, 각각의 시점(2-12개월)에서 B 세포 재구성. 도 51B에서와 같이, 자가조직 이식 환자는 동종이형 이식 환자의 경우에 비해, B세포 재구성이 비교적 신속하게 일어나는 것으로 나타났다(도 51A). 그러나, 대조군 수치로의 회복(색상을 넣은 것)은 두 그룹 모두 이식 후 적어도 6개월 경과 시점까지는 분명하게 나타나지 않았다.

도 52A-B: 대조군 환자에게 HSCT 처리한 후, 각각의 시점(2-12개월)에서의 CD4⁺ 재구성. 자가조직 수용체(도 52B) 및 동종이형 수용체(도 52A) 모두에서, B 세포수는 이식 후 6개월 경과 시점에서의 대조군 값으로 회복되는 반면(도 48A-B 참조), CD4⁺ T세포수는 이식 후 12개월 경과 시점에 현저하게 감소하였다.

53A-C: 대조군 환자에게 HSCT 처리한 후, 각각의 시점(2-12개월)에서의 CD8⁺ 재구성. 도 53A-B에 도시한 바와 같이, 이식 후, 각각의 자가조직 수용체 및 동종이형 수용체에서 CD8⁺ T 세포수는 신속하게 재생되었다. 그러나, 도 53C에 도시한 바와 같이, TCRγδ8+ T CD8⁺ T 세포, CD8αα T 세포, 및 CD28^-CD8⁺ T 세포수가 증가한 것으로 보아, CD8⁺ T 세포는 주로 외부 흉선의 기원이라는 것을 알 수 있다.

도 54A-B: 대조군 환자에게 각각 HSCT 처리하기 전(도 54A) 및 처리 28일 경 과 시(도 54B)의 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 증식에 대한, 마커 Ki-67를 사용한 FACS 분석. 마커 CD45RO 및 CD27을 이용하여, 각각의 세포에 대해 원시, 기억, 및 활성화 표현형을 분석하였다. CD8⁺ T 세포 서브세트에서는 대부분이 증식하였고, 이로써, 이들 세포가 외부 흉선에서 유래되었으며, 말초 T세포 서브세트 내에서 지배적인 증식이 나타난다는 것을 알 수 있다.

도 55A-D: 대조군 환자 및 LHRH-A 처리된 환자에게 HSCT 처리한 후, 각각의 시점(2-12개월)에서의 원시 CD4⁺ T 세포 재구성. 도 55A는 대조군(LHRH-A 무처리군) 환자의 원시 CD4⁺ T 세포(CD45RA+CD45RO-CD62L+)에 대한 FACS 분석을 도시한 것으로서, 분석 결과, 이들 세포수가 현저하게 감소하였다. 도 55B-C에 도시한 바와 같이, HSCT 처리 12개월 경과 시에, 대조군 내 자가조직 이식 환자의 원시 CD4⁺ T 세포가 재생되기 시작했으나(도 55C), 대조군 내 동종이형 이식 환자의 세포수에 비해서는 여전히 낮은 수치를 나타냈다(도 55B). 이러한 결과로부터, 환자의 연령으로 인해, 이식 후, 대조군 환자의 흉선에서는 적절한 개수의 원시 T세포가 재생될 수 없다는 것을 알 수 있다. 그러나, 동종이형 HSCT 처리 3주 전에 LHRH-A 처리된 환자는 대조군에 비해, 이식 9개월 경과 시, 및 12개월 경과 시에 원시 CD4⁺ T세포수가 크게 증가하는 것으로 나타났다(도55D). 따라서, 성 스테로이드 절제 요법에 의해 흉선 의존성을 갖는 T 세포 경로의 재생성이 향상되었다는 것을 확인할 수 있다. 결과는 환자 6-20명의 평균값±1SEM을 나타낸다. *p≤0.05.

도 56A-D: 대조군 환자 및 LHRH-A 처리된 환자에게 HSCT 처리한 후, 각각의 시점(2-12개월)에서의 TREC 수준. TREC 수준 분석은 RTE(recent thymic emigrant)에서만 수행되었으며, 동종이형 이식 환자(도 52A) 및 자가조직 이식 환자((도 52B) 모두, 흉선이 이식 후의 수준을 회복시킬 수 없다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 흉선의 퇴화으로 인한 흉선 기능의 감소 외에도 환자의 연령 때문에 나타나며, 이로서, 환자의 이환률과 치사율은 서로 밀접하게 연관된다. 반면에, 이식 후 9개월 경과 시에 동종이형 이식 전에 LHRH-A 처리된 경우(p ≤ 0.01), 동종이형 말초 혈액 줄기세포 이식을 수행한 환자는 대조군(LHRH-A 무처리군)에 비해서, CD4⁺TREC⁺ 세포/ml 혈액이 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. LHRH-A 처리된 동종이형 이식 환자는 대조군에 비해, 이식 후 9개월 경과 시점에서 CD4⁺TREC⁺ 세포/ml 혈액의 수가 대단히 높게 나타났다(도 56C). LHRH-A 처리된 자가조직 이식 환자 역시, 이식 후 12개월 경과 시점에서 대단히 높은 수준을 나타내었다(도 56D). 이로써, 따라서, 성 스테로이드 절제 요법에 의해 흉선의 재생성이 향상되었다는 것을 확인할 수 있다. 결과는 환자 5-18명의 평균값±1SEM을 나타낸다. *p≤0.01.

도 57A-C: LHRH-A 투여는 동종이형(도 57A-B) 및 자가조직(도 57C)의 HSCT처리 후의 TCR 특이성 자극에 대한 반응성을 향상시킨다. HSCT 처리 3주 전에, 각각의 환자에게 LHRH-A를 투여하였다. 이 때, 작용제를 투여받지 않은 환자를 대조군 환자로 한다. 이식 후, 각각의 시점(1-12개월)에서 5 ㎍의 항-CD3 및 10 ㎍의 항-CD28를 이용하여 교차 결합시키면서, TCR 특이성 자극 분석을 수행하였다. 도 57A-B에서와 같이, 동종이형 LHRH-A 처리된 환자는 대조군에 비해, 이식 6개월 및 9개월 경과 시점을 제외하고(이 시기에 분석된 환자수가 적기 때문임)는 모든 시점에서 향상된 증식 반응성을 나타내었다(³H-티미딘 통합에 의한 것으로 평가됨). 이식 6개월 및 9개월 경과 시, 대조군 환자는 처리 전과 유사한 수준의 반응을 나타냈다. 그러나, 그 외의 모든 시점에서는 훨씬 더 낮은 수준을 나타냈다. 반면, LHRH-A 처리된 환자는 처리 전 환자의 수준과 비교하여, 이식 6개월 경과 시점을 제외한 모든 시점에서 동등한 반응성을 나타내었다. LHRH-A 처리된 환자는 대조군 환자에 비해, 이식 1개월, 3개월, 및 4개월 경과 시점에서 향상된 증식 반응성을 나타낸다(³H-티미딘 통합에 의한 것으로 평가됨). 이러한 결과로부터, 새로운 CD4+ T 세포가 적어도 이식 1-2개월 경과시까지는 분명하게 나타나지 않기 때문에, 직접적인 말초 T 세포 효과의 기여를 확인할 수 있다 (도 57B; 결과는 환자 5-12명의 평균값±1SEM을 나타낸다. *= p ≤ 0.05; **= p ≤ 0.01). 도 57C에서와 같이, 자가조직 LHRH-A 처리된 환자는 대조군에 비해, 이식 5개월 경과 시점을 제외한 모든 시점에서 향상된 증식 반응성을 나타내었다 (³H-티미딘 통합에 의한 것으로 평가됨). 대조군 환자 및 LHRH-A 처리 환자 모두, 처리 전 수준으로의 회복은 이식 12개월 경과 시점에서 관찰되었다.

도 58A-B: LHRH-A 투여는 동종이형 HSCT 처리 이후의 PWM 및 TT 분열촉진 자 극을 향상시킨다. HSCT 처리 3주 전, 각각의 환자를 LHRH-A 처리하였다. 이 때, 작용제를 투여받지 않은 환자를 대조군 환자로 한다. 이식 후, 각각의 시점(1-12 개월)에서 억새풀 미토젠(PWM) 또는 파상풍 톡소이드(TT)를 이용하여, 분열촉진 반응성에 대한 분석을 수행하였다. HSCT 처리 전에 LHRH-A 처리된 환자는 대조군 환자에 비해, 분석된 모든 시점에서 PWM (도 58A) 및 TT(도 58B) 자극에 대해 향상된 반응성을 나타내었다.

도 59A-B: LHRH-A 투여는 자가조직 HSCT 이후의 PWM 및 TT 분열촉진 자극에 대한 반응성을 향상시킨다. HSCT 처리 3주 전에 각각의 환자를 LHRH-A로 처리하였다. 이 때, 작용제를 투여받지 않은 환자를 대조군 환자로 한다. 이식 후, 각각의 시점(1-12 개월)에서 PWM 또는 TT를 이용하여, 분열촉진 반응성에 대한 분석을 수행하였다. HSCT 처리 전에 LHRH-A 처리된 환자는 대조군 환자에 비해, 분석된 시점 중 대부분의 시점에서 PWM (도 59A) 및 TT(도 59B) 자극에 대해 향상된 반응성을 나타내었다(이식 3개월 경과 시점에서, p≤0.001). 이식 12개월 경과 시점에서, LHRH-A 처리된 환자는 반응성을 회복하였다.

도 60A-D: LHRH-A 처리는 자가조직 HSCT 환자에서의 생착 속도를 향상시킨다. HSCT 처리 3주 전에, 환자를 LHRH-A로 처리하였다(도 60A, 60C, 및 60D). 이 때, 작용제를 투여받지 않은 환자를 대조군 환자로 한다(도 60B). 이식 14일, 28일, 및 35일 경과 시에, 혈액(㎕) 당 백혈구(WBC) 수 및 과립구(G) 수를 측정하였다. 도 60A에 도시한 바와 같이, LHRH-A 처리된 자가조직 이식 환자는 대조군(도 60B)(p≤0.05)에 비해, 이식 14일 경과 시점에서의 WBC 수가 현저하게 증가되었으 며, 이와 동일 시점에서의 대조군의 과립구 생착이 45%(p ≤ 0.05)인데 반해, LHRH-A 처리된 자가조직 이식 환자의 과립구 생착은 87%이었다(≥500 개 세포/ℓ 혈액). 또한, LHRH-A 처리된 자가조직 이식 환자는 대조군에 비해, 이식 10일-12일 경과 시점에서의 호중구 수가 현저하게 증가하였다 (도 60C; 결과는 환자 8-20명의 평균값±1SEM을 나타낸다. *p≤0.05). 아울러, 현저한 수준은 아니지만, LHRH-A 처리된 자가조직 이식 환자는 대조군에 비해서 모든 분석 시점에서 림프구 수가 증가하였다 (도 60D).

도 61A-D: LHRH-A 처리는 동종이형 HSCT 환자의 생착 속도를 향상시킨다. HSCT 처리 3주 전, 각각의 환자를 LHRH-A로 처리하였다(도 61A, 61C, 및 61D). 이 때, 작용제를 투여받지 않은 환자를 대조군 환자로 한다(도 61B). 이식 14일, 28일, 및 35일 경과 시에, 혈액(㎕) 당 백혈구(WBC) 수 및 과립구(G) 수를 측정하였다. 도 61A에 도시한 바와 같이, LHRH-A 처리된 동종이형 이식 환자는 대조군(도 61B)(p≤0.05)에 비해, 이식 14일 경과 시점에서의 WBC 수가 현저하게 증가되었으며, 이와 동일 시점에서의 대조군의 과립구 생착이 44%(p ≤ 0.05)인데 반해, LHRH-A 처리된 동종이형 이식 환자의 과립구 생착은 64%이었다(≥500 개 세포/ℓ 혈액). 또한, LHRH-A 처리된 동종이형 이식 환자는 대조군에 비해, 이식 9일, 12일, 및 19일 경과 시점에서의 호중구 수가 현저하게 증가하였다 (도 61C; 결과는 환자 8-20명의 평균값±1SEM을 나타낸다. *p≤0.05). 아울러, 말초 혈액 줄기세포 이식된 환자를 분석한 결과, 동종이형 이식 처리 전에 LHRH-A 처리한 경우에 림프구 수가 현저하게 증가하는 것으로 나타났다 (이식 10일, 12일, 13일, 및 17-21 일 경과 시에 p≤0.05) (도 61D).

도 62A-F: TCR 특이성 말초 T세포 증식 반응성은 거세 1주일 내에 향상된다. 8주령 마우스를 거세한 다음, 거세 3일 경과시(도 62A, 62C, 및 62E), 7일 경과시(도 62B, 62D, 및 62F)에 항-CD3/항-CD28 자극된 T세포 증식 반응성을 분석하였다. 말초(자궁경부, 겨드랑, 위팔, 및 사타구니) 림프절(도 62A 및 62B), 장간막림프절(도 62C 및 62D), 및 비장 세포(도 62E 및 62F)을 다양한 농도의 항-CD3로 자극하고, 아울러, 10 ㎍/ml의 일정 농도의 항-CD28로 함께 48시간 동안 자극하였다. 그런 다음, 각각의 세포를 ³H-티미딘으로 18시간 동안 펄스화한 후, ³H-T 통합도로서 증식도를 측정하였다. 마름모는 거세된 마우스를 나타낸다. 사각형은 모의 거세된 마우스를 나타낸다. n=4, *p≤0.05 (비모수적(non-parametric), 독립된 표본(unpaired), Mann-Whitney 통계 테스트).

도 63: 만성 암 환자에게 LHRH-A를 투여함으로써, TCR 특이성 자극에 대한 반응성이 향상된다. 만성 암 환자들을 LHRH-A로 처리하였다. 그런 다음, LHRH-A 투여 후, 각각의 시점(7일-12개월)에서 항-CD3 및 항-CD28를 이용하여 교차 결합시키면서, TCR 특이성 자극 분석을 수행하였다. LHRH-A 처리된 환자는 사이클 식으로, 처리 전 수준에 비해서 향상된 증식 반응성을 나타내었다(³H-티미딘 통합에 의한 것으로 평가됨). 이러한 결과는 1개월마다 디포 주사(depot injection)로 작용제를 투여함으로써 얻어진다. 이로써, 말초 T 세포에 대한 직접적인 영향을 확인할 수 있다. 그러나, 모든 환자에 대한 작용제의 투여를 4개월부터 중단하였기 때 문에, 처리 12개월 경과 시에 관찰되는 반응성의 향상은 흉선 유래의 T세포에서의 변화에 의한 것이기도 하다.

도 64A-E는 흉선 제거(thymectomy)가 BM 내 통상의 림프계 전구 세포 수(도 64A), 총 BM B세포수(도 64B), BM 내 미성숙 B세포수(도 64C), 비장 내 총 세포수(도 64D) 또는 비장 내 총 B세포수(도 64C)에 대해 성 스테로이드 억제/BMT 효과를 미치지 않는다는 것을 나타내는 그래프이다.

실시예

아래 실시예는 본 발명의 방법에 대한 구체적인 예를 제공하며, 본 발명이 하기 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1

노화로 유발된 흉선의 퇴화 복구

재료 및 방법

동물. 모나쉬 대학의 중앙 동물 서비스(Monash University의 Central Animal Services)에서 CBA/CAH 및 C57B16/J 수컷 마우스를 공급받아, 일반적인 조건하에 사육하였다. 모나쉬 대학의 중앙 동물 서비스(Monash University의 Central Animal Services), 발트 및 엘리자 홀 의학연구회(Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research(Parkvile, Victoria)) 및 A.R.C(Perth, Western Australia)에서 C57B16/J Ly5.1⁺을 분양받아, 일반적인 조건을로 상육하였다. 4-6 주령 내지 26 월령을 적당한 곳에 표시해두었다.

외과적 거세. 크실라진(Rompun®; Bayer Australia Ltd., Botany NSW, Australia) 0.3mg과 케타민 염화수소(Ketalar®; Parke-Davis, Caringbah NSW, Australia) 1.5mg을 포함하는 염수 0.3ml로 복강내 주사법을 사용하여 동물을 마취시켰다. 외과적 거세는 음낭 절개법에 의하여 수행되었으며, 고환을 꺼내어, 봉합사로 묶은 다음 주위의 지방 조직과 함께 제거하였다. 상처는 외과용 스테플러를 사용하여 봉합하였다. 상기 과정의 고환을 제거하지 않는 과정을 제외한 방법으로 모의-거세를 실시하고 모든 연구의 대조군으로 사용하였다.

브로모데옥시유리딘(BrdU) 도입. 100㎕의 PBS내 100mg/kg(체중)의 투여량으로 BrdU(Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO)를 4시간 간격으로(즉, 4시간 간격) 마우스에 2번 복강내 주사하였다. 대조군 마우스에게는 비히클만을 주사하였다. 2차 주사한 후 1시간이 경과한 다음, 흉선을 절개하여 FACS 분석용 세포 현탁액으로 제조하거나, 조직 테크(O.C.T 화합물, Miles Inc., Indiana)에 즉시 넣고, 액체 질소로 급속 냉각시켜, 사용할 때까지 -70℃의 온도로 저장하였다.

유세포 분석. 마우스를 CO₂로 질식사시키고, 흉선, 비장 및 장간막 림프절을 꺼내었다. 장기는차가운 PBS/1% FCS/0.02% 아지드 내에서 200㎛의 체를 통해 조심스럽게 통과시키고, 원심분리(650g, 5분, 4℃)하고, PBS/FCS/Az 중의 하나에 재현탁시켰다. 비장 세포를 4℃의 온도에서 10분 동안 적혈구 세포용해 완충액(8.9g/리터 염화암모늄)에서 배양한 후, 세척한 다음 PBS/FCS/Az에 재현탁시켰다. 세포의 농도 및 생존력을 혈구 측정기와 브롬화에티듐/아크리딘 오렌지를 사용하여 2배수로 각각 측정하고, 형광 현미경(Axioskop; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.

3색 면역형광 검사법을 위하여, 세포를 항-αβTCR-FITC, 항-CD4-PE 및 항-CD8-APC(모두 Pharmingen, San Diego, CA에서 얻음)로 표지하고, 유세포 측정을 행하였다. 비장 및 림프절 현탁물을 항-αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC 또는 B220-B(Sigma) 중 어느 하나로 CD4-PE 및 CD8-APC와 함께 표지하였다. B220-B는 Calta Laboratories, Inc., Burlingame, CA사의 스트렙타비딘-Tri-색상 접합체(에 구입)를 이용하여 확인하였다.

세포의 BrdU 검사를 위하여, 세포를 CD4-PE 및 CD8-APC을 사용하여 표면 표지하고, 상기에서 기재한 바와 같이(Carayon and Bord, (1989) J. Imm. Meth. 147:225) 고정 및 투과 처리를 하였다. 간단히, 염색된 세포를 4℃에서 1%의 파라포름알데히드(PEA)/0.01% 트윈-20에서 하루 밤 동안 고정시켰다. DNA를 변성시키기 위하여, 세척된 세포를 37℃에서 30분 동안 500㎕의 DNase(100 Kunitz unit, Roche, USA)에 두었다. 최종적으로, 세포를 실온에서 30분 동안 항-BrdU-FITC와 함께 방치하고, FACS 분석을 위하여 세척 및 재현탁시켰다.

TN 서브세트의 BrdU 분석을 위하여, 세포를 APC에서 Lin-세포에 집합적으로 게이트하고, BrdU 검사를 하기 전에 CD44-비오틴 및 CD25-PE 검사를 행하였다. Pharmingen(San Diego, CA)에서 모든 항체를 얻었다.

4색 면역 형광 검사법을 위하여, 흉선 세포를 CD3, CD4, CD8, B220 및 Mac-1 으로 표지하고, 항-쥐 Ig-Cy5(Amersham, U.K.)을 모두 검사하였고, 음성 세포(TN)를 분석에 사용하였다. 이들을 CD25-PE(Pharmingen, San Diego, CA) 및 CD44-B(Pharmingen, San Diego, CA)에 대해 더 염색하고, 앞서 기술한(Godfrey and Zlotnik, (1993) Immunol. Today 14:547) 스트렙타비딘-Tri-색(Caltag, CA)으로 확인하였다. 이후 BrdU 검사를 상기한 바와 같이 수행하였다.

시료를 FACSCalibur^TM(Becton-Dickinson)으로 분석하였다. 살아 있는 림프구를 0˚ 내지 90˚의 광 산란 프로파일에 따라 표시하고, 데이터를 CellQuest^TM(Becton-Dickinson) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

면역 조직학. 냉동 흉선 섹션(4㎛)을 사이로스테트(cyrostat)을 사용하여 자르고, 100% 아세톤으로 즉시 고정시켰다.

2색 면역 형광 검사법을 위하여, 섹션을 단일 클론 항체(MTS6, 10, 12, 15, 16, 20, 24, 32, 33, 35, 및 44(Godfrey et al., (1990) Immunol. 70:66; Table1); 이 연구소에서 제조됨)로 이중 표지하고, 다중 토끼 항-시토케라틴 Ab(Dako, Carpinteria, CA)을 사용하여 상피 세포 결정 인자의 공동-발현을 분석하였다. 결합된 mAb는 FITC-접합된 양 항-쥐 Ig(Silenus Labratories, Victoria, Australia)를 사용하여 확인하였고, 항-시토케라틴은 TRITC-접합된 염소 항-토끼 Ig(Silenus Labratories, Victoria, Australia)으로 확인하였다.

섹션에 대한 BrdU 검사를 위하여, 섹션을 항-시토케라틴으로 염색한 후, 항-토끼-TRITC 또는 특이적 mAb를 반응시키고, 항-쥐 Ig-Cγ3(Amersham, Uppsala, Sweden)으로 확인하였다. 이후 BrdU 검사를 상기한 바와 같이 실행하였다(Penit et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86:5547). 간단하게, 섹션을 70% 에탄올에 30분 동안 고정시켰다. 반-건조된 섹션을 4M HCl에 두고, 붕산염 완충액(Sigma)으로 세척하여 중화시키고, PBS로 2번 세척하였다. BrdU는 항-BrdU-FITC(Becton-Dickinson)으로 확인하였다.

3색 면역 형광 검사법을 위하여, 섹션을 항-시토케라틴과 함께 특이적 MTS mAb으로 표지하였다. 이후 BrdU 검사를 상기한 바와 같이 수행하였다.

섹션은 Leica 형광물질 및 니콘사의 공초점 현미경을 사용하여 분석하였다.

이동 검사(즉, 흉선의 새로운 생착(RTE) 분석). 실라진(Rompun®; Bayer Australia Ltd., Botany NSW, Australia) 0.3mg과 케타민 염화수소(Ketalar®; Parke-Davis, Caringbah NSW, Australia) 1.5mg을 포함하는 염수 0.3ml을 복강내 주사법을 사용하여 동물을 마취시켰다.

흉선 세포를 FITC 표지하는 자세한 방법은 다른 문헌(Scollary et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86:5547; Berzins et al., (1998) J. Exp. Med. 187:1839)의 방법과 유사하다. 간단하게, 흉선 엽을 노출시키고, 각 엽에 약 10㎛의 350㎍/ml FITC(PBS 내에서)를 주사하였다. 상처를 외과용 스테플러로 봉합하고, 마우스가 마취에서 완전히 회복될 때까지 따뜻하게 하였다. 주입 후 약 24시간 후에 CO₂를 사용하여 마우스를 질식사키고, 림프계 기관을 적출하여 분석하였다.

세포의 개수를 파악한 후, 시료를 항-CD4-PE 및 항-CD8-APC를 사용하여 염색한 후 유세포 측정법으로 분석하였다. 이동성 세포를 CD4 또는 CD8(자기 발광 세포 및 더블렛(doublet)을 제외하기 위하여)을 발현하는 살아있는- FITC⁺ 세포로 동정하였다. FITC⁺ CD4 및 CD8 세포의 비율을 합하여 림프구 및 비장 각각에 대한 총 이동성 세포 비율을 구하였다. Berzins et al.,((1998) J. Exp. Med. 187:1839)에 따라, 일일 유출율을 계산하였다.

매치되지 않는 Student "t" 테스트 또는 비매개 Mann-Whitney U-테스트를 사용하여 데이터를 분석하고, 3번 이상의 실험과 대조군의 테스트 결과간의 통계적 유의성을 확인하였다. 실험치는 대조군과 상당히 차이가 있었으며, 그 결과는 아래와 같다: *p≤0.05, **p≤0.01 및 ***p≤0.001.

결과

I. 흉선 세포 집단에 대한 연령의 영향

(i) 흉선의 중량 및 흉선 세포의 수

마우스의 연령이 증가함에 따라서, 흉선의 중량 및 전체 흉선 세포의 개수(도 1B)에 있어서 유의적인(p≤0.0001) 감소가 있었다. 연령이 적은 성체에 있어서의 상대적인 흉선의 중량(mg 흉선/g 신체)은 평균 3.34로서, 이는 18-24월령(지방 축적물은 정확한 계산을 어렵게 함)에서 0.66으로 감소한 것이다. 흉선 중량의 감소는 전체 흉선 세포 개수의 감소 때문이다: 1-2개월(즉, 연령이 적은 성체) 흉선은 약 6.7×10⁷개의 흉선 세포를 포함하고 있으며, 24개월까지 약 4.4×10⁶개로 감 소한다. 거세하여 흉선에서의 성 스테로이드의 영향을 제거시키면, 흉선 세포의 개수가 재생되어 거세한 후 4주가 경과하면, 흉선은 연령이 적은 성체의 중량(도 1A)과 세포충식성(도 1B)과 동등하게 된다. 흥미롭게도, 거세한 후 2주가 경과하면 흉선 세포의 개수가 상당히(p≤0.001) 증가하며(1.2×10⁸), 거세한 후 4주가 경과하면 정상적인 어린 마우스의 수준까지 회복된다.

흉선에서 생산되는 T 세포의 감소는 말초에서 나타나지 않았고, 비장 세포 수는 연령에 무관하였다(도 2A 및 2B). 비장과 림프절에서의 B 세포와 T 세포의 비가 연령에 영향을 받지 않고, 후속적인 말초에 도달하는 T 세포 수 감소로, 말초에서의 지혈 기작인 입증되었다(도 2C). 그러나, 연령에 따라서 CD4⁺ 내지 CD8⁺ T 세포의 비는 2월령일 때 2:1에서, 연령이 2년일 때 1:1로 상당히 감소(p≤0.001)한다(도 2D). 거세 및 말초에 도달하는 T 세포 수 증가 이후에, 말초에서의 T 세포 수의 변화는 관찰되지 않았다. 비장 T 세포 개수 및 비장과 림프절에서의 B:T 세포의 비는 거세 이후에 변경되지 않았다(도 2A-C). 연령에 따른 말초에서의 CD4:CD8 비의 감소는 거세 2주 후에 나타났으나, 거세 4주 후에는 완전히 역전되었다(도 2D).

(ii) 연령 및 거세 후에 따른 흉선 세포 부분 집단

연령에 따른 흉선 세포 개수의 감소가 특정 세포 집단의 고갈의 결과인지를 알아보기 위하여, 분리된 부분 집단을 분석분석하기 위해, 식별 마커로 흉선 세포를 표지하였다. 또한, 거세 후의 흉선 재 집단(repopulation)의 속도를 분석할 수 있다. 주요 흉선 세포 부분 집단의 비율을 연령이 어린(2-4 개월) 성체의 흉선과 비교하여(도 3), 연령에 따른 변화가 없음을 발견하였다. 또한, αβTCR의 발현에 의한 흉선 세포의 추가적인 분류으로, 연령에 따른 이들 집단의 비율에 변화가 없음을 확인하였다. 거세한 후 2주 및 4주에서, 흉선 세포 부분 집단은 동일한 비율을 유지하였으며, 흉선 세포 개수가 거세 후에 최대 100배 증가하여, 이는 증식이 점차적으로 진행된 것이 아니라 모든 흉선 세포 부분에서 동시적으로 증식했음을 뜻한다.

검사한 T 세포 집단에서의 유의적인 변화 없이, 2년 연령 동물의 흉선에서의 세포 개수의 감소는, 모든 세포 표현형에서의 균형적인 감소에 기인한 것으로 보인다. 모든 T 세포 집단을 순차적이 아닌 동시에 보충함으로써, 흉선의 재생은 동시적으로 발생한다.

II. 흉선 세포의 증식

도 4A-4B에 나타낸 바와 같이, 15-20%의 흉선 세포를 2-4개월 증식시켰다. 이들의 대부분(약 80%)은 약 6%로 두 번째로 큰 집단을 형성하는 3중 음성(TN)(즉, CD3^-, CD4^-, CD8^-)을 가지는 2중 양성(DP)(즉, CD4⁺, CD8⁺) 서브세트이다(도 5A). 이들 TN 세포는 흉선에서 대부분 미숙한 세포이며, 흉선내 전구체 세포를 포함한다. 따라서, 대부분의 분열은 면역 조직학적으로 서브캡슐 및 피질에서 나타난다. 일부 분열은 FACS 분석에 의하여 수질 영역에서 이루어지는 것으로 확인되었고, FACS 분석으로 분열된, 어린(2개월) 흉선에서 하나의 양성(즉, CD4+CD8- 또는 CD4- CD8+) 세포(CD4+ 세포 9% 및 CD8+ 세포 25%)의 비율이 확인되었다.

성숙된 마우스 흉선(2년)에서 세포 수가 현저히 감소하지만총 증식성 흉선세포의 비율은 일정하였으며(도 4B 및 5C), CD4-CD8-의 분열된 세포의 비율은 감소하였고, CD4_-CD8+ T 세포의 증식 또한 상당히(p≤0.001) 감소하였다(데이터를 나타내지는 않음). 면역 조직학은, 연령이 어린 성체(2-4개월)에서 보여지는 것을 반영하는, 연령 1년에서의 분열 세포의 분포를 밝히지만; 2년에서는 증식이 주로 외부 피질과 수질(medulla)에서 아주 작은 부분의 둘러싼 맥관 구조에서 관찰된다.

거세 후 1주일 후에, 증식된 CD4-CD8- 세포 및 CD4-CD8+ 세포의 비율에 있어서 현저한 증가가 있었다(데이터는 나타내지 않음). 거세하며, 이러한 세포가 노화에 따라 증식되지 않는 것을 극복할 수 있음이 분명하다. 거세 후에 증식된 CD4+CD8- 세포가 동일하게 비례하여 감소되었다.(데이터는 나타내지 않음). 거세한지 2주 후, 흉선 세포의 개수는 많이 증가했지만, 증식 및 세포의 동시적인 증식을 나타내는 흉선 세포의 전체 비율은 변하지 않았다(도 4A, 4B 및 4C). 면역 조직학으로 흉선 세포 증식 위치와 분열 세포의 범위를 확인하였으며, 이는, 거세 후 2주된 2개월령 흉선에서의 상황과 유사하다.

흉선 세포 전구체뿐만 아니라, DN 부분 집단도 .□□TCR.+CD4_-CD8_- 흉선 세포를 함유하며, 이는 SP 세포로의 전이에서 하향 조절된(down-regulated) 공통 수용체를 가지는 것으로 생각된다(Godfrey and Zlotnik, (1993) Immunol. Today 14:547). 이들 성숙한 세포를 게이트함으로써, 진성(true) TN 부분(CD3^-, CD4^-, CD8^-)과, CD44 및 CD45를 발현하는 이들의 부분 집단을 분석할 수 있었다. 도 5E-H는 어린 마우스, 노화한 마우스 및 거세된 마우스에서의 TN 세포의 각 서브세트에서의 증식 정도를 도시한 것이다. 이는 약 10 %의 어린 정상 마우스에서부터 거세 후 1주 회복시킨 18월령 마우스 약 2%에서, TN1(CD44⁺CD25^-CD3^-, CD4^-, CD8^-)의 현저한 증식 감소를 나타내고 있다.

III. 흉선 세포 생착

어린 마우스에게 약 1%의 T 세포가 매일 흉선으로부터 이동한다(Scollay et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86:547). 거세된 마우스에서의 이동은, 유의적인 수적 감소에도 불구하고(p≤0.0001), 14월령의 어린 정상 마우스와 2년된 마우스에서도 동일한 비율로 발생되는 것으로 확인되었다(도 6A 및 6B). 새로운 흉선 생착물의 CD4:CD8 비는 2개월일 때 약 3:1에서 26개월일 때 약 7:1로 증가하였다(도 6C). 거세 후 1주까지, 상기 비는 정상화되었다(도 6C). 거세 후 2주까지, 말초로 이동하는 세포의 수는, 실질적으로 증가하였고 총 이동 비율은 0.4%로 감소하여 흉선의 증식을 나타낸다(도 6B).

고찰

노화된 흉선은, 비록 많이 퇴화되었지만, 어린 성체 마우스와 동일한 수준의 T 세포 증식, 분화 및 이동 기능을 유지함을 보여준다. 비록 흉선 기능이 신경-내분비-면역 축 간의 복수의 복잡한 상호작용으로 조절되지만, 성 스테로이드 생산으로 유발된 퇴화은, 거세 후의 흉선 재생에서 어느 정도 알려진 바와 같이, 가장 강 력하고 장시간의 영향을 미친다.

개시된 바와 같이 노화에 따라 흉선의 중량은 상당히 줄어들며(Hirokawa 및 Makinodan, (1975) J. Immunol. 114:1659, Aspinall, (1997) J. Immunol. 158:3037), 흉선 세포 개수에 있어서의 큰 폭의 감소와 관련이 있다. 2주된 거세한 흉선을 거세되기 전의 흉선으로부터 세포질에서 20-30배 증가시킴으로써, 성 스테로이드의 영향을 제거하여, 코르티코스테로이드의 작용에 따라 흉선을 추가적으로 퇴화시킬 수도 있는 거세 방법에 따른 스트레스를 약화시킬 수 있다. 거세 후 3주까지, 노화된 흉선은 흉선의 크기 및 세포 수에서 상당한 증가를 보여주며, 이는 2월령 마우스에서 이미 나타나는 성 스테로이드의 작용 때문인 것으로 짐작되는 어린 성체 흉선의 것을 능가하는 것이다.

이와 같은 데이터는 노화에 따른 일정한 서브세트 비율을 분화 및 유지하는, 계속적인 흉선 세포의 능력을 강조한 종래의 발견을 확인시켜주는 것이다(Aspinall (1997) J. Immunol. 158:3037). 게다가, 흉선 세포의 분화는 흉선 세포의 서브세트에서의 동시적인 증식을 나타내는 거세와 동시에 일어나는 것으로 보인다. 노화에 따라 흉선 세포의 개수가 상당히 감소하므로, 흉선 퇴화에 기여하는 요소인지를 판단하기 위하여 흉선의 증식을 분석한다.

노화에 의해 촉발된 흉선 퇴화시키거나, 전체 흉선 세포의 약 14%로 거세 후의 성 스테로이드의 영향을 제거해도 흉선 세포의 증식은 영향을 받지 않는다. 그러나, 국부적인 이러한 분열은 연령에 따라 다르다: 2월령 마우스 흉선은 전체 피막하 및 피층 영역에서 풍부한 분열을 나타내며, 일부 분열은 수질에서도 발생한 다. 노화에 따른 흉선 상피 해체 때문에, 국부적인 증식이 나타나기 어렵지만 어린 성체보다 패턴이 균일하지 않으며, 외부 피질로 내려 않는다. 거세 후 2주까지, 분열 흉선 세포는 전체 피질을 통하여 검사되었으며, 2월령 흉선과 유사한 분포로 수질에 존재하는 것이 확실하였다.

CD4 및 CD8 분석으로 결정되는 증식 집단의 표현형은 노화나 거세로 변경되지 않는다. 그렇지만, 흉선 세포 부분 집단에서의 증식의 분석은, 노화에 따른 TN 및 CD8⁺ 세포 모두에서의 증식에서의 상당한 감소를 드러내었다. 마커 CD44 및 CD25를 기준으로 한 TN 서브세트 내에서의 추가적인 분석은, TN2(CD44^-CD25⁺) 집단에서의 감소로 보상받는 TN1(CD44⁺CD25^-) 집단 증식에서의 상당한 감소를 드러내었다. TN 집단에서의 이와 같은 비정상성은 Aspinall((1997) J. Immunol. 158:3037)이 발견한 것을 반영한다. 놀랍게도, TN 서브세트은 성 스테로이드 활성의 방해에 대한 집단의 즉각적인 반응의 표시로서 거세 후 2주까지 정상적인 수준에서 증식하고 있었다. 또한, 거세 후 2주 및 4주 경과 후, 증식하고 있는 CD8⁺ T 세포의 비율은, 말초 T 세포 풀의 재구성 역할을 할 수도 있을 만큼 대조군 흉선으로부터 현저하게 증가하였다.

흉선 세포의 이동은 노화에 따라 일정한 비율의 흉선 세포 발생하는 것으로 보여지는데, 이는 말초에 대한 흉선 세포 이동 속도의 10배 감소를 보여주었던 Scollay et al.,((1980) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86:5547)의 이전 데이터와 일치하지 않는다. 이와 같이 결과가 다른 것은 2년 된 흉선의 흉선간 FITC 표지에 있어서의 어려움 때문이거나 FITC 흡수에 따른 지방 침전물의 영향 때문일 수 있다. 그러나, 이동되는 T 세포의 절대적인 개수는, T 세포 풀에 대한 RTEs의 비에 있어서의 상당한 감소를 초래했던 Scollay의 발견과 같이 상당히 감소하였다. 이것은 T 세포 레퍼토리에 우세한 영향을 미쳤던 말초에서의 변화를 초래할 것이다(Mackall et al., (1995) N. Eng. J. Med. 332:143). 이전의 문헌(즉, Mackall et al., (1995) N. Eng. J. Med. 332:143)은 노화에 따른 투약하지 않은 T 세포 표현형보다 기억 T 세포 레퍼토리의 비대칭을 보여준다. 그러나, 감소된 T 세포 레퍼토리는 만약 개체가 새로운 병원균을 만나게 되면, 노화된 개체에 있어서 면역 결핍을 일으키면서, 저항하지 못할 수도 있다. 분명히, 면역에서 문제가 있는 개체의 T 세포 풀을 재구성할 필요가 있다. 거세는 투약하지 않은 T 세포의 제조를 매우 상승시킴으로써, 흉선이 말초를 다시 살아가게 한다.

말초에서, T 세포의 개수는 비장 및 림프절의 B:T 세포의 비에서 밝혀졌듯이, 아마도 말초 항상성 때문에 일정한 수준으로 남아 있는다(Mackall et al., (1995) N. Eng. J. Med. 332:143; Berzins et al., (1998) J. Exp. Med. 187:1839). 그러나, 말초에서의 세포 조성의 붕괴는 노화된 흉선에서 명확한 것이며, CD4:CD8의 비가 어린 성체일 때의 2:1에서 2년 된 마우스일 때의 1:1로 상당한 감소를 보이며, CD4⁺ 세포가 연령에 보다 민감함을 보여주는 것일 수도 있으며, 또는 흉선 외부의 소스로부터 CD8⁺ 세포 생산의 증가를 보여주는 것일 수도 있다. 거 세 후 2주까지, 이 비율이 정상화되며, 외과적 거세에 대한 면역 체계의 즉각적인 반응을 다시 반영한다.

상기한 발견은 우선, 노화된 흉선이 자연 상태에서 사춘기 이전의 흉선과 동일한 기능을 할 수 있음을 보여준다. 이러한 관점에서, T 세포의 개수는 상당히 감소하지만, 흉선 세포의 분화 능력은 방해받지 없어지지 않는다. 이들의 전반적인 증식 및 최종적으로 말초로 이동하는 능력은, 흉선의 노화로 인한 퇴화에 의해 다시 영향받지 않는다. 그러나, 2가지의 중요한 발견이 주목된다. 우선, Aspinall((1997) J. Immunol. 158:3037)의 발견과 공통으로 연관이 있는데, 증식 능력에 있어서의 TN 세포에 있어서의 불리한 영향이 있는 것으로 나타났다. 이러한 결함은 흉선 세포 자체의 타고난 결함 때문일 수 있다. 아직까지, 여기에서 제시한 데이터 및 이전의 연구에서 흉선 세포의 분화는, 감소하지만 여전히 발생되며, BM으로부터의 줄기 세포 유입 역시 노화에 따라 영향을 받지 않는다는 것이 확인되었다(Hirokawa, (1998), "Immunity and Ageing", in PRINCIPLES AND PRACTICE OF GERIATRIC MEDICINE, (M. Pathy, ed.) John Wiley and Sons Ltd; Mackall and Gress, (1997) Immunol. Rev. 160:91). 두 번째로, CD8⁺ 세포는 노화에 따라서 증식 능력이 상당히 감소하며, 거세하면, 2월령 마우스와 비교한 증식된 CD8⁺ T 세포의 증가 비율이 상당히 증가한다. 성숙한 T 세포의 증식은 이동 전의 최종 단계일 것으로 생각되며(Suda and Zlotnik, (1991) J. Immunol. 146:3068), CD8⁺에서의 상당한 감소는 이들의 이동 잠재성에서의 감소를 가리킬 수도 있다. 이러한 가설 은, CD8 T 세포의 이동의 감소를 의미하는, 즉 RTEs에서의 CD4:CD8 T 세포의 비가 노화에 따라서 증가한다는 발견으로 뒷받침되고 있다. 만약, 흉선 상피가 CD8 T 세포의 유지에 주요한 인자를 제공한다면, 림포기질 분자 또는 사이토카인의 영향이든 간에, 이와 같은 인자는 성 스테로이드 제조의 증가로 인해 방해받을 수 있다. 성 스테로이드의 영향을 제거함으로써, CD8 T 세포 집단은 다시 최적의 상태로 증식할 수 있다.

피질 상피는 흉선 형성에 필수적인 IL-7 및 SCF와 같은 인자를 제공하므로, TN1 서브세트의 증식 결함은, 피질 상피의 감소가 TCR 유전자 재배열의 결정적인 단계에서 흉선 세포 발생에 영향을 미치는 것을 의미한다(Godfrey and Zlotnik, (1993) Immunol. Today 14:547; Aspinall, (1997) J. Immunol. 158:3037). 실제로, IL-7^-/- 및 IL-7R^-/- 마우스는 노화된 마우스에서 나타나는 흉선 형태를 보인다(Wiles et al., (1992) Eur. J. Immunol. 22:1037; Zlotnik and Moore, (1995) Curr. Opin. Immunol. 7:206; von Freeden-Jeffry, (1995) J. Exp. Med. 181:1519).

결론적으로, 노화된 흉선은 기능적인 역량을 여전히 유지하고 있지만, 흉선 미세환경의 구조적 완전성의 결함 때문에 어린 정상 마우스에서 나타나는 것처럼, 노화된 마우스에서 발생하는 흉선 세포는 흉선 상피 세포의 엄격한 통제하에 있지 않다. 따라서, 이러한 세포의 증식, 분획 및 이동은 최적의 조절 상태에 있지 않을 것이며, 말초에서 자가반응성/면역기능장애 T 세포의 방출을 증가시킬 수도 있 다. TN 및 특히, CD8⁺ 모두에서의 결함은, 노화에 따른 말단 T 세포 풀에서의 변화를 초래할 수도 있다. 거세하여 흉선의 기능을 회복시키는 것은 말단 T 세포 풀의 재생을 위한 본질적인 수단을 제공할 수 있으며, 따라서 면역억제, 면역결핍 또는 면역장애 개체의 면역을 재활성화시킬 수 있다.

실시예 2

화학 요법이나 방사능을 사용한 흉선 퇴화의 역전

재료 및 방법

재료 및 방법을 실시예 1에 나타내었다. 추가적으로, 아래의 방법을 사용하였다.

BM 재구성. 수용체 마우스(3-4월령 C57BL6/7)를 3시간 간격으로 5.5Gy 방사선에 2번 노출시켰다. 2번째 방사선 사용 후 1시간 후, 상기 마우스에게 5×10⁶ 공여체 BM 세포를 정맥 주사하였다. BM 세포는 공여체(2월령의 유전자가 같은 C57BL6/J Ly5.1⁺) 마우스의 경골 및 대퇴골를 통해 RPMI-1640 배지에서 통과시켜 수득하였고, 상기 배지에서 수집한 세포를 회수하였다.

방사선 조사. 3-4월령 마우스를 625Rads로 전신 γ-방사선 조사하였다.

사이클로포스파미드를 이용한 T 세포의 고갈 노화 마우스(예를 들면, 2년령)에게 사이클로포스파미드(2일 동안 200mg/kg(체중))를 주사하고 거세하였다.

결과

거세는 심각한 T 세포 고갈(TCD) 이후에 재생을 증진하였다. T 세포 고갈을 연구한 두 모델(사이클로포스파미드를 사용한 화학 요법 또는 625Rads를 사용한 치사량에 가까운 방사선 조사)에 의하면, 거세된(Cx) 마우스는 이들의 모의-거세된(ShCx) 군에 비하여 흉선 재생 속도가 상당히 증가함을 보여주었다(도 7A 및 7B). 거세된 후 1주일이 경과한 마우스는 심지어 초기 단계에서도 흉선이 상당히 재생되었다(도 7 및 9-11). 이와는 대조적으로, 거세하지 않은 동물은, 심각한 DN 및 DP 흉선 세포(빠른 속도로 분열하는 세포)의 감소를 보여주었으며, CD4 및 CD8 세포(방사선-저항)의 비율이 증가하였다. 이는 거세된 동물의 흉선 세포 개수의 차이에 의해 가장 잘 나타내어지는데, 거세 후 1주일만 경과해도 흉선의 크기가 최소한 4배 증가함을 보여준다. 2주 경과 후, 거세되지 않은 동물은 DN 및 DP 흉선 세포가 모두 재생되면서 상대적으로 흉선 세포가 정상적이 되었다. 그러나, 흉선 세포의 비율은 어린 성체 대조군 흉선과 여전히 등등하지 않다. 실제로, 거세한 마우스와 거세하지 않은 마우스의 조절 속도에서의 최대 차이는 2주가 경과한 시점이었다(4주 후의 흉선 세포의 개수는 처리 그룹 사이에서 동일하였다).

대조군(무처리, 연령 동일; p≤0.001) Cx 마우스(p≤0.05)와 비교하여, 사이클로포스파미드 처리한 후 1주 경과한 ShCx 마우스에게서 흉선 세포질이 상당히 감소하였다(도 7A). 이 시점에서, 1주 전에 거세된 마우스와 동일한 날에 화학 처리한 마우스 사이에서는, 이들 두 집단은 ShCx 마우스와 비교하여 세포의 수에서는 최소한 2배인데, 흉선의 재생 속도에서 차이가 발견되지 않았다(도 7A 및 8A). 이와 유사하게, 사이클로포스파미드 처리한 후 2주 경과 후, Cx 마우스 양 집단은 ShCx 마우스보다 흉선 세포 개수(p≤0.001)가 현저히 증가(5-6배)하였다(도 7A). 대조군 마우스에 있어서, 4주가 경과하면서 흉선 세포 개수가 점진적으로 증가하였지만, 이는 심지어 1주 이내에, 거세에 의해서 현저하게 증가된 것이다(데이터는 나타내지 않음). 이와 유사하게, 1주 경과 후 거세한 마우스의 비장 및 림프절의 개수가 증가하였다(데이터는 나타내지 않음).

방사선 조사하기 1주 이전에 거세하거나(도 10) 또는 방사선 조사와 동일한 날 거세(도 10)함으로써 흉선 회복에 있어서의 거세 시기의 영향을 조사하였다. 1주 전에 수행한 경우, 거세는 흉선 회복에 보다 신속한 영향을 주었다(도 11A와 비교한 도 10A). 동일한 날 거세한 경우는 1주 전에 거세한 마우스의 흉선 회복을 "따라 잡는데" 2주가 걸렸다. 두 경우에 있어서, 각 비장 또는 림프절에 대한 주요한 영향은 없었다(도 10B 및 10C, 및 도 11B 및 11C).

방사선 조사 처리 이후에, ShCx 및, 처리(SDCx)된 동일한 날 거세된 마우스는 둘다 대조군 마우스(p≤0.001)(도 7B 및 11A) 및 처리(p≤0.01)되기 1주 전에 거세된 마우스와 비교하여 흉선 세포질이 상당히 감소했음을 보여준다(도 7B). 처리 후 2주 경과된 시점에서, 거세된 마우스 양 집단에 있어서, ShCx 마우스(p≤0.001)와 비교하여 방사선 조사(PIrr) 후의 흉선 세포질의 증진를 나타내면서, 거세 처방이 흉선 세포 개수의 회복에 있어서 효과가 없었다(도 7B, 10A, 11A). 그러므로, 거세는 심각한 T 세포 고갈 이후에 흉선 재생을 유의적으로 증진시키며, 거세는 면역계 손상되기 최소 1주 전에 실시될 수 있다.

흥미롭게도, 흉선의 크기는 대조군 흉선의 기본을 "초과하는(overshoot)" 것으로 나타났다. 흉선의 신속한 증식을 나타내는 이러한 새롭게 유도된 흉선 세포 의 이동은 여전히 이루어지지 않는다(흉선 세포가 말초를 통해서 이동되는 데는 약 3-4주가 소요된다). 따라서, 각 부분 집단에서의 비율이 동일하더라도, 흉선 세포의 개수는 말초로 방출되기 전까지 증가한다.

어린 마우스(약 2-3월령)에게 사이클로포스파미드 처리를 한 후, Cx 마우스의 비장에 있는 전체 림프구 세포의 개수는, 비록 감소했지만, 분석한 모든 경우에 있어서 대조군 마우스와 현저하게 달랐다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, ShCx 마우스는 처리(p≤0.05) 후 1주 및 4주에서 전체 비장 세포의 개수가 현저하게 감소함을 나타내었다(도 8A). 림프절에 있어서, 1주일 경과 후의 모의-거세 및 거세 마우스(p≤0.01) 모두에게서 세포질의 상당한 감소가 나타났으며(도 8B), 이는 스트레스 스테로이드의 영향을 반영하는 것일 수 있다. 처리 후 2주 이후에, 거세된 마우스의 림프절 세포질은 대조군 마우스의 동일했지만, 모의-거세된 마우스는, 처리 후 2주 후의 대조군 및 Cx 마우스와 비교할 때 세포질이 상당히(p≤0.05) 감소하면서, 처리 후 4주가 경과할 때까지 림프절 세포 개수가 회복되지 않았다(도 8B). 이러한 결과는 거세가 사이클로포스파미드 처리 후의 전체 림프구 세포 개수의 회복 속도를 앞당기는 것을 의미할 수 있다.

처리 후 1주일 경과한 시점에서, 심각한 림프구 감소증을 유발하는 치사량에 가까운 방사선을 조사(625 Rads)한 양 처리 집단(Cx 및 ShCx)은, 대조군 마우스와 비교할 때 비장 및 림프절(p≤0.001)의 세포질이 현저하게 감소함을 보여주었다(도 12A 및 12B). 처리 후 2주까지, 림프절 세포 개수는 여전히 대조군의 값보다 현저하게 낮지만(모의-거세 마우스의 경우 p≤0.001; 거세한 마우스의 경우 p≤0.01)( 도 12A), 비장 세포 개수는 거세 마우스 및 모의-거세 마우스 모두의 대조군 값과 유사하였다(도 12B). Cx 및 ShCx 마우스 사이에서는 현저한 차이를 찾아볼 수 없었다.

도 9는 외과적 거세와 비교하여 화학적 거세를 사용했을 경우의 T 세포 재생의 향상을 나타낸다. 이 예에서 사용한 화합물인 Deslorelin(LHRH-A)을 4주 동안 주사하고, 외과적 거세와 비교하여 사이클로포스파미드 처리 후의 재생 속도와 비교해서 나타내었다. 흉선의 증식과 비장과 림프절의 회복에 있어서 효과의 향상은 동일하였다. 화학적 거세의 속도는 외과적 거세보다 느리며, 즉 마우스가 순환 성 스테로이드 수준을 감소시키는데 약 3주가 더 소요된다. 그러나, 화학적 거세는 여전히 외과적 거세만큼이나 효과적이며, 동일한 효과를 가지는 것으로 고려할 수 있다.

고찰

흉선의 구조와 T 세포 생성에 대한 거세의 효과를 면역 고갈된 동물 모델로 조사하였다. 보다 구체적으로, 실시예 2는 치사량에 가까운 방사선 조사 및 사이클로포스파미드 처리 이후의 면역 시스템의 회복에 대한 거세의 영향을 조사하였다. 이러한 형태의 면역 고갈은 DNA 합성을 방해하며, 따라서 신속한 세포 분열을 목표로 한다. 흉선에 있어서, 이러한 세포는 우세한 미성숙 피층 흉선 세포이지만, 모든 서브세트이 영향을 받는다(Fredrickson and Basch, (1994) Dev. Comp. Immunol. 18:251). 보통의 건강한 노화된 동물에 있어서, 말초 T 세포에서의 양적 및 질적 편차는 거의 병적인 상태를 초래하지 않는다. 그러나, T 세포를 재생 하기 위하여 흉선의 능력이 감소되기 때문에, T 세포가 고갈되면 심각한 문제가 발생한다. 이러한 손상은 특히 항암 치료에서 화학 요법 및 방사선 요법을 사용한 경우 HIV/AIDS에서 발생한다(Mackall et al., (1995) N. Eng. J. Med. 332:143).

치사 수준으로 방사선 조사 및 사이클로포스파미드 처리된 마우스에 있어서, 거세는 흉선의 재생을 현저하게 증진시킨다. 우세한 유도 코르티코스테로이드, 흉선 재생에 대한 외과적 거세의 스트레스 반응을 평가하기 위하여, 면역 고갈과 동이한 날 및 7일 전에 거세를 행하였다. 비록 흉선 세포질 및 구조에 있어서의 증가가 면역 고갈 후 1주일 먼저 나타났지만, 거세 후 2주 후에 주요한 차이가 관찰되었다. 이는 거세를 면역 고갈과 동일한 날에 수행하거나 또는 1주일 전에 수행한 경우였다.

면역 조직학은, 거세되지 않은 흉선 구조가 조직적이지 않는 반면에, 거세한 후 2주가 경과한 흉선 구조는 표현형적으로 정상적으로 나타남을 증명하였다. 판(pan) 상피 마커는 면역 고갈이 피층 상피의 붕괴 및 거세되지 않은 마우스의 흉선에서의 흉선 구조의 대체적인 파괴를 초래함을 증명하였다. 수질 마커는 이러한 발견을 뒷받침하였다. 흥미롭게도, 거세로 촉발된 흉선 재생의 주요한 특징 중의 하나는 MTS 16으로 확인된 세포 밖의 매트릭스에서의 현저한 조절 상승(upregulation)이었다.

유세포 측정 데이터는 거세된 마우스에서 모든 흉선 세포 서브세트에서의 세포 개수가 상당히 증가했음을 보여주었다. 각 시점에서, 면역 고갈 및 거세 이후 에 모든 CD4, CD8 및 αβ-TCR 한정 서브세트이 동시에 증가하였다. T 세포의 발생이 점진적인 프로세스이므로 이는 특이하지만 일관성이 있은 결과이며, 전구체 세포(CD4^-CD8^- 게이트 내에 함유)에서의 초기 증가가 있을 것으로 예측하고 있었으며, 이는 첫 번째 시점 전에 일어날 수 있다. 게다가, 전구체는 전체 흉선 세포의 아주 작은 비율을 나타내므로, 숫자에 있어서의 변화는 감지할 수 없을 수도 있다. 대식세포 및 과립성 백혈구를 포함한 다른 세포에 있어서의 거세의 영향도 분석하였다. 대체로, 흉선에서의 대식 세포 및 과립성 백혈구의 개수는 거의 변함없었다.

면역 고갈된 방사선 조사 및 사이클로포스파미드 모델에 있어서, 흉선 세포 개수 매 2주마다 최고를 나타내었으며, 처리 후 4주 이후에 감소하였다. 방사선 조사 또는 화학 요법을 실시한 거의 직후에, 흉선의 중량과 세포질은 극적으로 감소했으며, 약 5일이 경과한 후 흉선 재생의 첫 번째 상(phase)이 시작되었다. 재구성의 제1 웨이브(5-14일)는, 흉선 세포 서브세트의 상승시키는 방사선 저항 흉선 세포(우세한 이중 네거티브)의 증식에 의해서 발생한다(Penit and Ezine, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86:5547). 제2 감소는 16 내지 22일 사이에서 관찰되었는데, BM에 의한 흉선 전구체의 생산 저하(방사선 조사도 영향을 미침)와 함께 방사선 저항 세포의 증식 능력의 제한 때문이었다. 두 번째 재생 상은 흉선의 BM 유도 전구체로의 보충에 기인한 것이었다(Huiskamp et al., (1983) Radiat. Res. 95:370).

성체 마우스에 있어서, HSC로부터의 성숙한 T 세포의 발생은 약 28일이 소요된다(Shortman et al., (1990) Sem. Immunol. 2:3). 따라서, 처리 이후에 최대 4주까지 말초 T 세포에서 변화가 거의 없는 것은 놀라운 것이 아니다. 말초는 일부 흉선 유출에 의해 지지될 수 있지만, 처리 후 최대 4주 경과 후에 말초에서 발견되는 대부분의 T 세포는, 고갈된 세포의 부재시에 사이클로포스포아미드 또는 방사선 저항 클론을 증식할 것으로 기대된다. 가장 중요한 것으로, 흉선 유출의 증가에 따른 TCR 레퍼토리의 변화를 포함하여, 거세 이후에 말초에서의 일부 장시간이 소요되는 변화가 있을 것으로 예상된다.

실시예 3

성 스테로이드 저해 이후의 흉선 재생은 불완전한 말초 T 세포 기능을 복귀시킨다.

재료 및 방법

재료 및 방법은 실시예 1 및 2에 기재되어 있다. 또한 아래 방법을 사용하였다.

HSV-1 면역화. 나이든 마우스(≥ 18 개월)을 외과적으로 거세하였다. 거세후 6주(흉선 재활성화 후). 마취한 다음, 마우스 뒷다리(무릎)에 20게이지 바늘을 이용해 멸균 PBS내의 HSV(KOS 균주) 4 x 10⁵ pfu(plaque forming units)으로 HSV-1를 주사하였다. 감염시킨 마우스는 분리된 케이지에 두었고 면역화후 5일째에 안락사시켜 오금에서 (유출되는) 림프절을 분석을 위해 취하였다.

바이러스는 Assoc. Prof. Frank Carbone (Melbourne University)에서 구하 였다. 바이러스 원액은 5% FCS (Gibco-BRL, Australia)가 보충된 MEM상에서 VERO 세포 단층상에서 생육 및 계수하였다.

유출되는 (오금) 림프절의 분석은 감염 5일째에 실시하였다. HSV-1 분석으로, 오금의 림프절 세포는 항-CD25-PE, 항-CD8-APC 및 항-Vβ10-비오틴으로 염색하였다. DC 검출시 FcR 블롯을 CD45.1-FITC, I-A^b-PE 및 CDllc-비오틴 염색전에 사용하였다. 모든 비오틸화된 항체를 스트렙타비딘-PerCP로 검출하였다. HS 검출시, BM 세포는 항-CD3, CD4, CD8, Gr-l, B220 및 Mac-1(모든 FITC 접합됨)으로 총체적으로 염색함으로써, Lin^- 세포상에 게이트되었다. HSC는 CD117-APC 및 Sca-l-PE로 염색하여 검출하였다. TN 흉선세포 분석시, 세포는 Lin^- 집단상에 게이트되었고 CD44-비오틴, CD25-PE 및 c-kit-APC 염색으로 검출되었다.

림프절 세포의 세포독성 분석. 립프절 세포는 37℃에서 6.5% 이산화탄소하에서 3일간 배양하였다. 특이도는 gB_498-505 펩티드(gBp) 와 대조군으로서 EL4 세포 단독을 펄스한 비-형질감염성 세포주(EL4)를 이용하여 측정하였다. 시작 작동세포;표적 비율은 30:1로 하였다. 플레이트는 4시간동안 37℃에서 6.5% 이산화탄소하에서 배양하였고 5분간 650_gmaX로 원심분리하였다. 상등액(100㎕)를 각 웰에서 수거하고 이를 Packard Cobra 자공-감마 계수기에 의한 측정을 위해 유리 발효 튜브로 이동시켰다.

결과

흉선 재생의 기능적인 결과를 확인하기 위해(예, 거세가 면역 반응을 증진시킬 수 있는지 여부), 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 면역화를 질병 진행 및 CTL 역할 연구가 가능하도록 시험하였다. 거세 마우스에서 바이러스에 대해 질적 및 양적인 반응성 향상이 확인되었다.

마우스 발바닥에서 면역화하고 오금(유출성) 림프절을 면역화 5일 후에 분석하였다. 또한, 발다락을 제거하고 실험동안 특정 시간에 바이러스의 역가를 측정하기 위해 이를 균질화하였다. HSV-1 감염(도 13-17)에 대한 국부(오금) 림프절 반응을 형가하였다.

림프절 세포충실성의 현저한 감소가 연령에 따라 관찰되었다(도 13A, 13B, 및 14). 면역화 5일째에, 거세 마우스는 노화된 마우에 비해 현저하게 증가된 림프절 세포충실성을 가졌다(데이타 미첨부). 연령에 따른 또는 거세 후 활성화된 세포(CD8+CD25+) 비율상의 차이가 관찰되지 않았지만(도 15), 림프절내 활성화된 세포의 수가 노화된 대조군에 비해 거세로인재 현저하게 증가하였다(데이타 미첨부). 또한 활성화된 세포 수는 어린 성체에서 발견된 것과 관련있었고(데이타 미첨부), 이는 CTL 은 거세 마우스에서 보다 크게 활성화되지만 어린 성체는 B 세포 활성화로 인해 확대된 림프절을 가질 수 있음을 나타낸다. 이는 연령에 따라 및 거세 후 발생되는 특이적 세포용해(lysis)의 비율을 검출한 CTL 분석에서 확인되었다(도 16). 노화된 마우스에서는 어린 성체 마우스(2달)에 비해 작동세포:표적 비율 10:1 및 3:1로 현저하게 감소된 표적 세포 세포용해를 보였다(도 16). 거세는 HSV 감염후 특이적인 CTL 반응을 형성하는 바우스의 증력을 복구하였다(도 16).

또한, 활성화된 세포에 의한 전반적인 Vβ10 발현이 연령과 일정하게 유지되지만(데이타 미첨부), 노화된 마우스(18달)의 서브그룹에서는 이러한 클로날 반응의 감소되었다(도 14A-C). 거세후 6주까지, 침윤성 림프절 세포의 총 수와 활성화된 CD25+CD8+ 세포 수가 어린 성체 수준으로 증가되었다(데이타 미첨부). 더 중요한 점은, 거세가 호와된 마우스에서 현저하게 감소되는, HSV-감염 표적 세포의 CTL 반응성을 현저하게 증진시켰으며(도 16), 림프절에서의 CD4: CD8 비율을 복구시켰다는 것이다(도 17B). 또한, 유출성 림프절에서 CD4+ T 세포 감소는 어린 성체 및 거세 마우스 둘다에 비해 노화에서 확인되었으며(도 17B), 따라서 최대 면역 반응성을 수득하기 위해 생애동안 흉선으로부터 T 세포의 생산 증가가 필수적으로 필요함을 예시한다.

실시예 4

성 스테로이드의 저해는 흉선으로의 신생 조혈 전구 세포의 흡수를 증가시키고, 숙주 및 공여체 림프구 세포(T, B 및 DC)의 키메라성 혼합이 가능하게 하다

재료 및 방법은 실시예 1-3에 개시되어 있아. 또한 하기 방법을 사용하였다.

기존 실험들에서, 마이크로키메라(microchimera ) 형성이 기관 이식 수용에 중요하다는 것이 확인되었다. 또한 DC는 이식 항원 허용성에 필수적인 역할을 하는 것으로 확인되었다. 따라서, 흉선의 키메라 형성 및 수지상 세포 수에 대한 거세 효과를 실험하였다.

흉선 재싱에 흡수되는 줄기 세포의 기능을 분석하기 위해, BM 재구종을 실시 예 2에서와 같이 실시하였다.

거세한 및 미거세한 재구성된 마우스의 총 흉선 세포 수를, 무처리한 동일 연령의 대조군과 비교하였고, 이를 도 18A에 요약하였다. 재구성 1일 전에 거세한 마우스에서, 모의 거세(ShCx)한 대조군 마우스에 비해 흉선 재생 비율의 현저한 증가(p ≤ 0.01)가 있었다. 모의 거세한 마우스에서의 흉선 세포충실성은 컨제닉의(congenic) BMT 이후 2 및 4주에 무처리군 수준(7.6 x 10⁷ + 5.2 x 10⁶) 이하였으며, 거세 마우스의 흉선 충실성은 BMT후 4주된 대조군 수준보다 증가하였다(도 18A). 6주에, 세포 수는 대조군 수치 이하를 유지하였다. 그러나, 거세 마우스에서는 비거세 마우스보다 3배 높았다(도 18A)(p ≤ 0.05).

또한, BMT후 4주에 거세 마우스의 BM에서 현저하게(p ≤ 0.05) 세포가 증가되었다(도 18D). 모의 거세 마우스에서 BM 세포충실성은 2주까지 무처리 대조군 수준(1.5 x 10⁷ + 1.5 x 10⁶)에 도달하였고, 반면에 거세 마우스에서 BM 세포충실성은 컨제닉의 BMT 이후 2 및 4일 모두에 대조군 수준 이상으로 증가하였다(도 18D). 거세 마우스 및 비거세 마우스 모두에서 장간막림프절 세포 수가 방사선조사 및 재구성후 2주일에 감소하였으며; 4주일까지 대조군 수준으로 세포 수가 도달하였다. 거세 마우스 및 비거세 처리군간의 림프절 세포 사에 대한 통계학적 유의적인 차이는 없었다(도 18C). 거세 마우스 및 모의-거세 마우스에서 비장 세포 충실성은 2주까지 무처리 대조군 수준(1.5 x 10⁷ + 1.5 x 10⁶)에 이르렀고 모의 군에서는 4-6주동안 감소하였으나, 반면에 거세 마우스에서는 여전히 높은 수준의 비장 세포를 유지하였다(도 18B). 또한, 거세 마우스 및 비거세 처리군 사이에 총 비장 세포수가 2주째에는 없는 것으로 보였으나, 이 시기에(즉 재구성후 4-6주) 거세 마우스에서는 비거세 마우스에 비해(p ≤ 0.05) 림프구 수가 증가되었다를 보었다(도 18B).

따라서, 재구정 하루 전에 거세한 마우스의 경우, 모의 거세한(ShCx) 대조군 마우스에 비해 흉선 재생 율이 현저하게 증가하였다(p ≤ 0.01)(도 18A). 모이 거세한 마우스에서의 흉선 세포충실성은 컨제닉 BMT 이후 2 및 4주에 무처리군 수준(7.6 x 10⁷ + 5.2 x 10⁶) 이하였으나 거세 마우스의 흉선 세포충실성은 BMT후 4주일에 대조군 수준의 이상으로 증가하였다(도 18A). 거세 마우스는 비거세 동물에 비해 현저하게 증가된 컨제닉 (Ly5.2) 세포를 가였다.

비거세 마우스에서는, 재생 입증이 거의 또는 전혀 없는 상태에서 4주간에 걸쳐 흉선세포의 수가 매우 감소하였다(결과 미첨부). 그러나 거세 군의 경우, 2주까지 확대된 흉선세포생성(thymopoiesis)이 있었고 4주까지 대조군 수준으로 회복되었으며 이는 비거세 마우스보다 10배 높았다. CD45.2(공여체-유래 항원)에 대해 흉선의 유세포 분석을 실시하여, 공여체 유래 세포가 비거세 군에서 검출되지 않았으나, 거세 마우스에서는 거의 모든 흉선세포에서 동일한 시기에 공여체 유래 세포가 검출되었다(결과 미첨부). 이러한 공여체 유래한 조혈 전구체로부터의 확장된 흉선세포생성 증진에서, T 세포 분화가 정상적으로 진행되었는지를 판단하는 것이 중요하다. CD4, CD8 및 TCR 구정된 서브세트를 유세포기로 측정하였다. 재구성이후 2주에 흉선세포 서브세트 비에서 비계적인 차이는 없었다(결과 미첨부). 비거세 마우스가 공여체 유래 세포로 재구성되지 않아 4주째에는 관찰이 불가능하였다. 그러나 거세 마우스에서 흉선세포의 비율은 이 시기에 정상적으로 나타난다.

실시예 3과 같은 세트로, 3달된 어린 성체 C57/BL6 마우스를 BMT 하루 전에 거세 또는 모의 거세하였다. 컨제닉 BMT에서, 마우스는 800RADS TBI에 두었고5 x 106 Ly5.1⁺ BM 세포로 IV 주사하였다. 2주 및 4주 후에 마우스를 죽이고, 골수, 흉선 및 비장으로 면역 재구성을 분석하였다. 공여체/숙주 기원(origin)은 항-CD45.1 항체로 측정하였으나, 단지 공여체 기원의 백혈구만 반응하였다.

동일 실험 결과는 도 19-28에 나타내었다. 도 20 및 21은 거세 동물의 골수에서 공여체 유래 HSC의 수 및 비율 증가를 보이고 있다. 이는 생착 증가를 의미하며, BMT로부터 빠른 회복을 시사한다.

도 22는 거세 마우스의 BM에서 공여체 유래 B 세포 전구체 및 B 세포의 증가를 나타낸 것이다. 그러나 도 24 및 25는 거세가 거세 후 2 및 4주에 말초내 B 세포의 수 또는 비율을 변화시키지 않는다는 것을 나타낸 것이다.

도 26은 거세가 흉선에서의 공여체 유래 TN, DP, CD4 및 CD8 세포 수를 증가시키는 것을 보이고 있다. 그러나, 도 23은 거세가 CD4 및 CD8의 공여체 흉선세포 비율을 변화시키지 않음을 보이고 있다. 말초에서 매우 소량의 CD4 또는 CD8 세포가 있었고, 그 시기에는 거세에 의해 이들 세포가 증가되지 않았다.

도 28은 거세후 4주에 흉선에서 공여체 DC의 수 증가를 나타낸다.

고찰

실시예 4는 동계 및 컨제닉 BM 이식에 대한 거세 영향을 나타낸다. Starzl et al., (1992) Lancet 339: 1579은, 림프형 및 비림프형 조직에서 마이크로키메라 증가가 동종이식에 좋은 예후 지표라고 보고하였다. 즉, 이들이 이식에 대한 허용성 유발에 필수적임을 주장하였다(Starzl et al., (1992) Lancet 339: 1579). 공여체 유래 DC는 이러한 키메라에서 존재하였고 이식 거부반응을 방지하는데 필수적인 역할을 하는 것으로 추측되었다(Thomson and Lu,(1999) Immunol. Today 20: 20). DC는 흉선의 음성 선별 과정에 주된 작동세포인 것으로 알려져 있으며, 수용체 흉선내에 공여체 유래 DC가 존재된다면 이식체에 반응성이 있는 T 세포가 제거될 수 있다.

거세가 키메라 형성을 증가시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 동종 태아 간 이식을 이용하여 실험을 수행하였다. 그 결과, 거세한 마우스의 흉선 재생이 증진되었다. 이러한 경향은 컨제닉(Ly5) 마우스를 이용한 반복실험에서도 동일하였다. 컨제닉 마커의 표시로 인해, 마우스의 키메라 상태를 분석하는 것이 가능하였다. 태아 간 재구성 이후 2주에, 흉선에서 공여체-유래 수지상 세포가 검출되었으며 거세 마우스에서의 수는 비거세 마우스에 비해 4배 높았다. 재구성 후 4주에, 비거세 마우스는 공여체 유래 세포로 재구성된 것으로 보이지 않았는데, 이는 거세가 실제로 키메라 형성 가능성을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 거세는 취사량의 방사선 조사 및 태아 간 재구성 이후에 흉선 재생을 증가시킬 뿐만 아니라 흉선에서 공여체 유래 수지상 세포의 수도 증가시키며 또한 줄기 세포 이식에 따라 이식 수용 가능성을 증가시킨다.

실시예 5

면역 세포 고갈

잠재적인 이식 수용체 환자에서 기존재하는 T 세포에 의한 이식 방해를 방지하기 위해, 환자에게서 T 세포를 고갈(제거)하였다. 상기 단계를 위한 과장은 다음과 같다. 인간 환자에게 매일 15 mg/kg의 Atgam(xeno anti-T 세포globulin, Pharmacia Upjohn)의 형태로 T 세포 활성화 저배제인 사이클로스포린A 3 mg/kg와 병용하여 3일간 항-T 세포 항체를 주사하였고, 필요에 따라 매일 9 mg/kg으로 정제를 3-4일간 연속 주입하였다. 상기 치료는 환자의 흉선에서의 초기 T 세포 발생에 영향을 미치지 않는데, 이는 이러한 영향을 가지기 위한 항체의 필요 함량이 인간의 흉선의 크기와 구조 때문에 전달될 수 없기 때문이다. 치료는 약 4-6일간 지속하여, 성 스테로이드가 감소되고 흉선의 재구성이 허용되었다.

또한 T 세포 재활성 방지는, 인터루킨, 보조 분자(예, 하에 차단제, 예, CD28), 신호 전이 분자 또는 세포 부착 분자와 같은 이차 시그널의 저해제가 저합되어, T 세포 제거 또는 그외 면역 세포 고갈을 증진시킬 수 이다. 흉선 재구성 단계는, 공여체 HSC의 주입(동시에 혈액으로부터 기관 또는 조직으로 수득한), G-CSF를 이용하여 혈액으로부터 전-가동화된 형태(2회 지진피하 주입/일, 3일간) 또는 공여체의 BM으로부터 직접 수집과 연계된다. 순환성 HSC의 수치 증진은, (성 스테로이드 부재 및/또는 증가된 GnRH 수치에 이해 활성화된)흉선에 의한 흡수를 촉진시킨다. 이러한 공여체 HSC는 흉선내 DC로 발생되고 공여체-반응성이게 되는 기회에 의해 새롭게 형성된 임의의 T 세포의 제거를 야기한다. 이는 공여 세포 및 조직에 대한 중추적인 허용성을 확립하여, 숙주에 의하 모든 거부 반응을 예방하거나 또는 크게 최소화한다. T 세포의 새로운 레페토리의 발생은 또한 T 세포 고갈 요법에 의해 초래된 면역결핍증을 해결한다.

말초 T 세포의 고갈은, 외부 공여체에 대하여 잠재적으로 반응성인 것을 포함한 모든 비특이적인 T 세포를 고갈시킴으로써, 이식 거부반응 위험성을 최소화한다. 동시에, 상기 과정은 T 세포의 결핍으로 인해, 환자가 감염, 특히 바이러스 감염에 매우 감수적임을 의미하는 일반화된 면역결핍증 상태를 유발한다.

실시예 6

성 스테로이드 제거 요법

환자에게 LHREH 작용제 전달 형태로 성 스테로이드 제거 요법이 실시된다. 이것은 3달 동안 효과적인 1회 투약으로서, 루크린(디포 주입; 22.5 mg) 또는 졸라덱스^®(이식; 10.8 mg)형태로 제공된다. 이는 흉선을 재활성화시키기에 충분한 수준으로 성 스테로이드를 감소시키는 효과가 있다. 일부 경우에서, 또한 부식의 성 스테로이드 생산 억제제의 전달이 필수적이다. 코수덱스^®(5 mg/day 또는 50 mg/day)가 성 스테로이드 제거 요법동안 1일 1정으로 제공될 수 있다. 또한 환자에게 GnRH 길항제, 예, 세트로렐릭스(Cetrorelix) 또는 아바렐릭스(Abarelix)를 피하 주사한다.

혈액내 성 스테로이드의 최소 수치로의 감소하는데 외과적 거세후 약 1-3주 일, 화학적 거세이후에는 약 3-4주일 걸린다. 일부 경우에서는, 치료가 두번째 3달 주입/이식으로 확대되는 것이 필수적이다. 흉선 확장은 동종이형의 공여체(외부 조직의 이식시) 또는 자가조직의 HSC(HSC를 골수에서 흉선으로 가동시키기 위해 G-CSF와 함께 숙주에 주입에 의해)중 어느 하나인 혈액 HSC의 동시적인 증진에 의해 증가될 수 있다.

실시예 7

대안적인 전달법

3달 디포 또는 LHRH 작용제의 이식 투여에서, 대안적인 방법이 사용될 수 있다. 한 예에서, 각질층(stratum corneum)의 지연 효과를 감소시키기 위해 환자의 피부에 Er.YAG 레이저와 같은 레이저를 조사하여 피부를 제거 또는 변이시킬 수 있다. 로 조사하여 .

레이저 제거 또는 변이법은 미국 특허번호 6,251,100, 6,419,642 및 4,775,361에 개시되어 있다.

다른 예로, 전달은 압력파가 형성되는 레이저에 의한 것이다. LHRH 작용에의 투약은 플라스틱의 탄력적인 식기(약 1인치 직경 및 약 1/16인치 두께)와 같은 적절한 용기내에서 피부상 압력파가 형성되는 부위에 위치된다. 상기 부위는 이후 약 1 mm 두께의 흑색 폴리스티렌 시트와 같은 표적 물질로 덮어진다. Q-스위치의 고형상 루비 레이저(20 ns 펄스 지속, 펄스당 최대 2 J)를 사용하여 1회 일시적인 임펄스를 형성하여 표적 물질을 명중시켰다. 흑색 폴리스티렌 표적은 완전하게 레이저를 흡수하여 피부는 레이저 방사가 아닌 단지 일시적인 임펄스만을 흡수한다. 상기 방법은 매일 반복하거나 또는 필요시에 반복하여 순환성 혈액내 작용제 농도를 유지시킬 수 있다.

실시예 8

공여 세포 투여

실제 공여체 혈액내 조혈 줄기세포(HSC)의 수치는, 세포 ㅐ집 2-5일전에 G-CSF를 10 ㎍/kg으로 주사함으로써 증가시킨다(예, 2-5일간 매일 10 ㎍/kg를 1 또는 2회 주사). 공여체에 역시 LHRH 및/또는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인을 수집전에(예 7-14일전) 주사하여, 혈액내 줄기세포의 질 및 양을 증가시킨다. CD34⁺ 공여 세포를 예컨대 유세포측정기 또는 면역자석 비드를 이용하여 공여체 혈액이나 BM으로부터 정제하였다. 인간 CD34에 특이적으로 결합하는 항체는 상업적으로 이용가능한 것이다(예, Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ; Miltenyi-Biotec, Germany). 공여체 유래 HSC는 CD34⁺인 것으로 유세포측정기로 판별하였다. CD34⁺ HSC는 또한 공급자 세포(예, 섬유아세포), 특정 세포 형으로의 분화를 방지하기 위해 줄기세포인자(SCF) 및 LIF와 같은 성장인자를 이용하여 생체외 배양함으로써 증가시켰다. LHRH 작용제 전달 약 3-4주후에(즉, 흉선이 재생되기 시작하기 바로 전 또는 그때), 환자에세 공여체 HSC를 약 2-4 x 10⁶ 세포/kg으로 ㅚ적적으로 주입하였다. 또한 G-CSF는 공여체 HSC의 증식을 보조하기 위해 수용체에 주입될 수 있다. 이 시기는 임상적인 증상의 주된 특징이기 때문에 계획하는 것이 불가능하 다면, HS는 GnRH와 동일 시기에 투여될 수 있다. 약 2-3주 후의 HSC 두번째 투여는 흉선의 재생장과 공여체 DC(특히 흉선에서)의 발생을 보조하는데 필수적이다. 일단 HSC가 생착되어(즉, 병합되어) BM 및 흉선으로 이동되면, HSC가 자기자신을 일신하므로써 그 효과는 영구적이다.

재활성화성 또는 재활성화된 흉선은 수용체의 HSC를 수용체 타인의 T 세포 및 DC로 변환시키면서 공여체 HSC를 흡수하여 이를 공여체 타입의 T 세포 및 DC로 변환시킨다. 세포 사별에 의한 제거를 유도함으로써 또는 면역조절성 세포를 통해 허용성을 유도함으로써, 공여체 및 숙주 DNA는 공여체 또는 수용체 세포와 반응성이 있을 수 있는 모든 신생 T 또는 NK 세포를 허용화한다.

실시예 9

이식체의 이식

본 발명의 일 구현에로, 수용체는 여전히 계속적인 T 세포 고갈 및/또는 그외 면역세포 고갈 및/또는 면역억제 요법의 진행하에 있으면서, 기관, 조직 또는 일정부분 이상 공여체 T 세포가 고갈된 세포 군이 공여체에서 수용체 환자에게로 이식된다. 수용체 흉선은 GnRH 처리에 의해 활성화되고 외인적 HSC에 의해 침투된다.

LHRH 요법 약 3-4주이내에, 최초 신생 T 세포는 수용체의 혈류에 위치한다. 그러나 숙주와 공여체 조혈 세포의 안정적인 키메라 생성이 가능하도록 하기 위해, 면역억제 요법이 약 3-4달동안 유지될 수 있다. 재활성화성 흉선내에 공여체와 숙주 DC가 모두 존재하기 때문에, 신생 T 세포에서 잠재적으로 공여체에 반응성인 세 포와 숙주에 반응성인 세포는 제거된다. 숙주 흉선 상피에 의해 양성으로 선별되어진 T 세포는, 수용체의 말초에서 숙주 APC에 의해 표시된 펩티드를 인지함으로써 정상적인 감염에 반응할 수 있는 능력을 유지하고 있다. 수용체의 림프 기관으로의 공여체 DC의 병합은 공여 세포, 조직 및 기관의 허용이기보다는 숙주 단독의 허용과 실제적으로 동일하게 면역계 상황을 확립한다. 따라서, 정상적인 면역조절성 기작이 존재하고 있다. 또한 이들은 IL4, 5,10, TGF-베타, TNF-알파와 같은 사이토카인을 이용하여 면역 반응을 실행 또는 중단시키는 조절성 T 세포의 발생을 또한 포함할 수 있다.

실시예 11

대안적 프로토콜

공여 세포, 조직 또는 기관의 이식에 유용한 시간이 단축되는 경우, 실시예 1-10에서 사용한 시간을 변형한다. T 세포 제거 또는 기타 면역 세포 고갈 및 성 스테로이드 제거를 동시에 시작한다. T 세포 제거 또는 기타 면역 세포 고갈을 약 10일간 유지하며, 성 스테로이드 제거를 약 3개월 유지한다. 한 구현예에서, HSC 이식을 조합 치료 개시 후 약 10-12일에 흉선이 재활성화되기 시작할 때 수행한다.

시간이 더욱 단축된 경우, 두가지 유형의 제거 및 HSC 이식을 동시에 시작한다. 이 경우, T 세포 제거 또는 기타 면역 세포 고갈을 3-12개월, 예컨대, 3-4개월 유지한다.

실시예 12

면역 억제 종결

흉선 키메라가 확립되고 성숙 T 세포의 새로운 코호트가 흉선을 떠나기 시작하면, 환자의 혈액을 채취하여 T 세포를 표준 혼합 림프구 반응에서 공여 세포에 대한 반응성 결여에 대하여 실험관 내 검사한다 (Current Protocols InImmunology. John E. Coligan et al., (eds), Wiley and Sons, New York, NY (1994), and yearly updates including 2002). 반응이 없을 경우, 면역억제 요법을 점진적으로 감소시켜 감염에 대하여 방어하도록 한다. 혈액내 활성화된 T 세포의 존재에 의한 부분에서 나타나는 바와 같은 거부의 신호가 없을 경우, 면역억제 요법을 완전히 중단한다. HSC는 강한 자기-소생 능력을 가지므로, 형성된 조혈 키메라는 이론적으로 정상적이고 비-내성화되고 비-이식된 환자의 일생 동안 안정할 것이다.

실시예 13

인간 내 흉선 재활성화에의 LHRH 작용제의 용도

재료 및 방법:

인간 흉선이 본 발명의 방법에 의해 재활성화될 수 있음을 보이기 위해, 전립선암에 대한 화학요법을 받은 경험이 있는 환자에 대하여 본 방법을 사용하였다. 환자. 스테이지 I-III 전립선암 (전립선 특이성 항원(PSA) 스코어에 따라 평가함)을 가진 16 환자를 분석을 위해 선별하였다. 모든 개체는 필요한 전립선암에 대한 국부 조사 요법 이전에 4-6 개월 동안 매월 GnRH 작용제 3.6 mg 고세렐린 아세테이트(Zoladex) 또는 7.5 mg 루프로라이드(Lupron)의 주입에 근거한 표준 조합 안드로겐 봉쇄(CAB)를 경험한 60-77세의 남성이었다.

FACS 분석. 적절한 항체 칵테일(20□l)을 200 □1 전체 혈액에 첨가하고 실 온에서 30분간 어두운곳에서 인큐베이션하였다. RBC를 용해하고 잔류 세포를 세척하고 FACS 분석을 위해 1% PFA 내에 재현탁하였다. 샘플을 CD19-FITC, CD4-FITC, CD8-APC, CD27-FITC,CD45RA-PE, CD45RO- CyChrome, CD62L-FITC 및 CD56-PE (모두 Pharmingen, San Diego, CA로부터 구입)에 대한 항체로 염색하였다.

통계학적 분석. 치료 전후 결과를 비교함으로써 각각의 환자를 내부 대조군으로 사용하고, paired student t-테스트 또는 Wilcoxon signed rank 테스트를 사용하여 분석하였다.

결과:

성 스테로이드 제거 전후 4개월에 전립선암 환자를 평가하였다. 결과를 도 19-23에 요약한다. 집약적으로, 데이터는 많은 환자에서의 T 세포 상태의 정량적 및 정성적 개선을 입증한다.

I. 전체 림프구 및 그 T 세포 서브세트의 수에 대한 LHRH 요법의 효과:

말초혈액 림프구의 표현형 조성을 전립선암에 대한 LHRH 작용제 치료를 받고 있는 환자(모두 > 60 세)에서 분석하였다(도 40). 치료전 및 LHRH 작용제 치료 시작 후 4개월에 환자 샘플을 분석하였다. 혈액 ml 당 전체 림프구 수는 모든 환자에서 치료전에 대조 값의 하한이었다.

치료후, 9명의 환자 중 6명이 전체 림프구 수의 상당한 증가를 보였다(일부 경우, 전체 세포의 배가가 관찰됨). 이는 9명의 환자 중 6명에서 전체 T 세포 수 증가와 관련이 있다. CD4+ 서브세트 내에서, 9명의 환자 중 8명의 환자로 이러한 증가는 더욱 명백하였으며, 이들은 CD4+ T 세포의 증가된 레벨을 보였다. 9명의 환자 중 4명에서 CD8+ 서브세트 내에서 덜 분명한 경향이 보여졌으며, 이들은 비록 CD4+ T 세포 보다 적은 정도이나 증가된 레벨을 보였다.

II. T 세포 서브세트의 비율에 대한 LHRH 치료법의 영향:

LHRH 작용제 치료 전후의 환자 혈액 분석은 전체 T 세포, CD4+ 또는 CD8+ T 세포 비율에 있어 현저한 변화를 보이지 않았으며, 치료후 CD4+ : CD8+ 비율에 있어 가변적 변화를 보였다(도 41). 이는 치료후 전체 T 세포의 상당한 증가에도 불구하고 T 세포 서브세트의 항상성 유지에는 거의 영향이 없음을 나타낸다. 모든 값은 대조값에 대한 상대값이었다.

III. B 세포 및 골수 세포의 비율에 대한 LHRH 치료법의 영향:

LHRH 작용제 치료를 받고 있는 환자의 말초 혈액 내 B 세포 및 골수 세포(NK, NKT 및 대식세포) 분석은 서브세트 내에 가변적인 변화를 보였다(도 42). NK, NKT 및 대식세포 비율이 치료후 상대적으로 일정하게 유지된 반면, B 세포의 비율은 9명 중 4명에서 감소하였다.

IV. 전체 B세포 및 골수세포 수에 대한 LHRH 작용제 치료법의 영향:

치료후 말초 혈액 내 전체 B 세포 및 골수 세포 수의 분석은 명백히 증가된 레벨의 NK(9명 중 5명), NKT(9명 중 4명) 및 대식세포(9명 중 3명)를 보였다(도 43). B 세포 수는 증가된 레벨을 보이는 9명 중 2명의 환자에서 분명한 경향을 보이지 않았으며, 9명 중 4명은 변화를 보이지 않았고, 9명중 3명은 감소된 레벨을 보였다.

V. 기억 세포에 대한 원시(naive) 세포 레벨에 대한 LHRH 요법의 영향:

LHRH 작용제 치료 후 주요 변화가 말초혈액의 T 세포 집단 내에서 보여졌다. 특히, 원시 (CD45RA+)CD4+ 세포 비율의 선택적 증가가 있었으며, CD4+ T 세포 서브세트 내 원시 (CD45RA+) 대 기억 (CD45RO+)의 비율이 환자 9명 중 6명에서 증가하였다(도시되지 않음).

VI. 결론

따라서, 퇴화된 흉선을 가지는 인간과 같은 동물의 LHRH 작용제 치료는 흉선 재생을 유도할 수 있는 것으로 결론지을 수 있다. 성 스테로이드 제거 요법을 받은 전립선암 환자 내 혈액 T 림프구의 상태에서 일반적인 개선이 보여져 왔다. 다른 메인스트림(TCRαβ+CD8 αβ 체인) T 세포의 급원이 기재되지 않았으므로 그러한 세포는 흉선으로부터 유도된 것이다. 모의관 T 세포는 주로 TCRγδ 또는 CD8 αα체인이다.

실시예 14

인간에서 허용성 유도

피부 또는 기관 이식이 필요한 남성 환자에게 실시예 10에서와 같이 0-6달 동안, GnRH 작용제(Lurcin, 3.6 mg)을 기초로한 표준 조합 안드로겐 차단(CAB) 치료제를 투여하였다. 안드로겐 차단 치료제를 투여하면서, 환자에게 동종이형의 공여체의 말초 혈액에서 채집한 CD34++ 세포를 정맥내 주사하였다. CD34++ 세포를 채집하기 위해, 공여체(즉, 수용체에게 그의/그녀의 기관 또는 피부를 공여할 사람)의 말초 혈액을 채혈하고, 표준 방법에 따라 말초 혈액으로부터 CD34++ 세포를 분리하였다. 비제한적인 방법은, 인간 CD34에 특이적으로 결합하는 항체(예, 뮤라 인 단일클로날 항-인간 CD34+ 항체, Abcam Ltd., Cambidge, UK)와 말초 혈액을 함께 배양하고, 검출가능한 표지된 항-뮤라인 항체(예, FITC-표지된 염소 항-마우스 항체)를 이용하여 세포를 이차 염색하고, 및 형관 활성화된 세포 분류(FACS)를 통해 FITC-표지된 CD34++ 세포를 분리하는 방법이다. 순화성 말초 혈액에서는 소량의 CD34+가 발견되기 때문에, 더려번의 채혈과 세포 분류가 요구될 수 있다. CD34+는 수용체 환자를 재구성하는데 사용하기 전까지 동결보존할 수 있다. 일예로, 5 x 10⁵ HSC/kg 체중 이상으로 수용체 환자에게 투여된다.

수용체 환자를 관찰하여 공여체 혈액과 수지상 세포가 그/그녀의 말초 혈액에 존재하는지를 검출한다. 이러한 공여체 세포가 검출되는 경우, 공여체 조직(즉, 피부 및/또는 기관)의 이식이 행해진 것이다. 공여체 조직은 수용체에게 본인의 흉선이 재활성화되지 않았으며 공여체 CD34+ 세포로 재구성되지 않는 수용체에 비해 더욱 높은 수준으로(즉, 수용체에서 더 오래 생존) 허용된다.

실시예 15

유전학적으로 변형된 HSC 세포에 의해 촉진된 이식체 수용성

MHC가 일치하는 수컷 및 암컷 마우스를 이용하여, HSC의 유전학적 변형이 이식체 수용성을 촉진시킬 수 있는지를 평가하였다.

이를 이해, 노화된(즉 2년) 암컷의 Balb/cJ(H-2d) 마우스를 외과적으로(예, 표준적인 방법에 따라 난소를 제거함) 또는 화학적으로 거세하였다. 화학적 거세로, 마우스에게 1달간의 서방형 제형의 10 mg/kg의 루프론(GNRH 작용제)을 주입하 였다. 또한 마우스에게 GnRM 길항제(예, 세트로렐릭스 또는 아바렐릭스)를 주입하였다. 성 스테로이드의 확인은, 제조사의 안내서에 따라 형장 시료의 표준적인 방사면역분석으로 실시하였고, 과정중에 모니터닝 할 수 있다. 거세는(<0.5ng 에스트로겐/ml)은 주입후 3-4주까지 정상적으로 형성되어야 한다.

암컷 Balb/cJ의 골수 세포에, Balb/cJ 수컷 세포에서는 발현되지만 암컷 Balb/cJ에서는 발현되지 않는 H-Y 단백질을 코딩하는 유전자를 이의 발현 조건하에서 형질전환시켰다. 즉, H-Y 단백질 코딩 유전자(또는 CDNA)를 발현 벡터(예, 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터)에 삽입하고, 이를 Balb/cJ 암컷 마우스 골수 세포로 형질전환시켰다(예, Bonyhadi et al., (1997) J. Virol. 71:4707). 형질전환된 세포상의 H-Y 항원 발현은 표준 방법으로 측정하였다(예, 웨스턴 블럿, 노던 블럿, 세포 표면 염색).

형질전환된 골수 세포를 골수 제거된, 또는 면역억제된 거세(화학적으로 또는 외과적으로)한 암컷 마우스에게 투여하여 전술한 바와 같이 흉선을 재구성하였다. 동시에 또는 재구성한 후 1주일 내지 1달 후에, Balb/cJ 수컷 마우스의 피부를 재구성한 거세시킨 암컷 마우스에게 이식하였다.

그 결과, Balb/cJ 수컷 마우스 유래 피부 이식체는, H-Y 단백질-코딩 유전자로 형질전이된 Balb/cJ 암컷 마우스의 골수 세포를 이용하여 재구성되지 않은 거세된 암컷 마우스에 비하여, H-Y 단백질-코딩 유전자로 형질전이된 Balb/cJ 암컷 마우스의 골수 세포를 이용하여 재구성된 거세된 암컷 마우스에서 보다 잘 "받아들여졌다".

암컷이 화학적으로 거세되으나 화합물 투여를 중지시킬 수 있다면, 수용체 암컷 Balb/cJ 마우스는 수컷 Balb/cJ 마우스에서 유래된 이식체를 일단 완전하게 허용하고, 상기 암컷의 흉선 퇴화과 생식력 복원이 가능해진다.

실시예 18

인간에서 조혈 줄기 세포 이식 후 말초 면역 세포 풀의 재생

I. 동종이형 및 자가 HSCT

본 실시예는 HSCT 환자에 대한 임상학적 시도이다. 인간에서 흉선 및 골수 기능을 회복하는 임상학적 잠재성을 평가하기 위하여, LHRH-작용제 치료에 근거한 성 스테로이드 제거(화학적 거세)를 정기적으로 받는 요법을 전립선암 환자(>60세)를 분석하였다. 환자를 제시 시에 및 모든 환자에서 혈청 테스토스테론 농도가 거세 레벨인 치료 4개월 후에 검사하였다.

재료 및 방법:

환자. 82명 환자 모두 악성 질환 또는 골수 이상에 대하여 PBSCT 고투여량 치료법(HDT)을 받고 있었다(동종이형의 대조 환자에 대한 n = 22, allo LHRH-A 치료 환자에 대한 n = 20, 자가 대조군에 대한 n = 20, 및 자가 LHRH-A- 치료 환자에 대한 n =20). 테스트 환자에게 자가 또는 종동 줄기 세포 이식 3주 전에 3.6 mg (4주 동안 효율적임) Zoladex (LHRH-A)를 주입한 다음, 4개월 동안 매월 주입하였다. 모든 환자를 처리전, 이식후 매주 5주 동안 및 12개월까지 매월 분석하였다. The Alfred Committee for Ethical Research on Humans (Trial Number01/006)으로부터 윤리적 승인을 얻었다.

전체 말초 혈액의 FACS 분석. 적절한 항체 칵테일(20 □1)을 200□1 전체 혈액에 첨가하고 실온에서 30분간 어두운곳에서 인큐베이션하였다. RBC를 용해하고 잔류 세포를 세척하고 FACS 분석을 위해 1% PFA 내 재현탁하였다. 샘플을 CD19-FITC, CD4-FITC, CD8-APC, CD27- FITC, CD45RA-PE, CD45RO-CyChrome, CD62L-FITC 및 CD56-PE (모두 Pharmingen, San Diego, CA로부터 구입)에 대한 항체로 염색하였다.

Ki67 분석. 증식 세포의 검출을 위해, 샘플 표면을 CD27-FITC, CD45RO-CyChrome, 및 CD4- 또는 CD8-APC (Pharmingen, San Diego, CA)로 염색하였다. 적혈 세포 용해 후, 샘플을 실온에서 20분 어두운 곳에서 500㎕의 1X FACS 투과성화 용액(Becton-Dickinson, USA; 1X 용액을 10X 원액으로부터 R. O. H2O 내에서 제조함) 내에서 인큐베이션하였다. 세척한 샘플(2 ml FACS buffer, 5 min., 600gmax, RT) 을 항-Ki67-PE 또는 항-Ki67-FITC (또는 적절한 이소타입 대조군)으로 30분간 실온에서 어두운 곳에서 인큐베이션하였다. 샘플을 세척하고 분석을 위해 1% PFA내 재혀탁하였다.

PBMC의 제조. ficoll-hypaque 분리에 의하여 T-세포 자극 분석 및 TREC ㅂ분석을 위한 정제된 림프구를 제조하고, 원심분리후 혈장 층을 제거하고 성 스테로이드 레벨 분석 전에 -20℃ 저장하였다. T 림프구 자극 분석에 사용되지 않은 세포를 동결 매질 내 재현탁하고 TREC 분석 전에 액체 질소 내 저장하였다.

T 림프구 자극 분석. 미토겐 자극을 위해, 정제된 림프구를 96-웰 둥근 바 닥 플레이트에 100㎕의 RPMI-FCS 내에 1 x 10⁵ 세포/웰의 농도로 배치하였다. 세포를 37℃, 5% COS에서 PHA로 1-10㎍/ml의 투여량으로 인큐베이션하였다. TCR-특이적 자극을 위해, 세포를 정제된 항-CD3 (1-10 ㎍/ml) 및 항-CD28 (10 ㎍/ml)로 미리 코팅된 플레이트 상에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 플라크 형성 후(48-72시간), 1μCi의 ³H-티미딘을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 추가 16-24시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 필터 매트 상으로 수확하고 p-카운터 상(Packard-Coulter, USA)에서 액체 섬광을 이용하여 ³H-티미딘의 혼입을 결정하였다.

TREC 분석:

세포 분류. 동결된 샘플을 신속히 해동하고 항-CD4-FITC 및 항-CD8-APC으로 30분간 얼음 상에서 염색하고, 세척하고(2 ml FACS buffer), PBS 내 3% 포르말린으로 고정하였다 (교반하면서). 샘플을 추가 30분 인큐베이션하고, 세척하고, 분류를 위해 500㎕ FACS 완충액 내에 재현탁하였다. CD4+ 및 CD8+ 세포 집단을 MoFlo# 세포 분류기(Cytomation Inc.)상에서 분류하였다.

DNA 단리. 세포를 분류하고 프로티나아제 K (PK) 소화 완충액 (0.8mg/mL 용액의 2 x 10⁵ 세포/20 ㎕) 내에 재현탁하였다. 샘플을 1시간 동안 56℃ 인큐베이션한 후, 95℃ 10분 인큐베이션하여 프로티나아제를 불활성화시켰다.

분자 비콘(Beacon)을 사용하는 실시간 PCR. 분류된 세포내 TREC 함량 분석을 위한 실시간 PCR을 종래 기재된 바에 따라 수행하였다(Zhang etal., (1999) J. Exp. Med. 190: 725). 프라이머는 센스, 5'-GGATGGAAAACACAGTGTGACATGG-3' (SEQ ID N0 : 4) 및 안티센스, 5'-CTGTCAACAAAGGTGATGCCACATCC-3' (SEQ ID NO :5)였다. 1 변성 사이클(95℃ 10분간)을 수행한 다음, 45 증식 사이클(94℃ 30초, 60℃ 30초, 및 72 ℃ 30초). 인풋 DNA 내 세포 등가물을 표준화하기 위하여, 별도의 실시간 PCR 분석을 사용하여 위 유전자(pseudogene)를 함유하지 않는 CCR5 코딩 서열을 정량하였다.

통계적 분석. Instat II 소프트웨어를 사용하여 통계학적 분석을 하였다. 전립선암 HSCT 연구를 위하여, Mann-Whitney U-test를 수행하였다. 인간 연구를 위해, 치료 전후 결과를 대조함으로써 각각의 환자를 내부 표준으로 사용하고, paired student t-test 또는 wilcoxon signed rank test를 사용하여 분석하였다.

결과:

도 49는 대조 환자에서 HSCT 후 다양한 시간에서(2-8주) 천연 킬러(NK) 세포 회복의 분석을 도시한다. 도 49 A-B에 도시되는 바와 같이, 대조 동종 및 자가 이식 수령자에서 유사한 경향이 관찰되었다. 대조적으로, LHRH-A 치료를 HSCT 3주전에 받은 동종 환자는 D14-5M 이식후로부터 현저히 더 높은 NKT (V024+VD11+) 세포 수를 보였다(도 49C: 데이터는 6-20 환자의 평균 1 SEM으로 표현;*=p < 0.05). NKT 세포를 V 024+V 11+ 표현형에 근거하여 분석하였다.

도 50은 대조 환자에서 HSCT 후 다양한 시간 지점에서(14, 21, 28, 35일) NKT 세포 재구성의 FACS 분석을 도시한다. 초기 회복이 동종 환자에서 관찰되었으며, 주로 이식후 초기에 CD8+ 집단 내에서 보여졌으며, 이는 재생의 흉선외 루트를 나타낸다. 또한, CD4+NKT 세포는 이식후 1개월로부터 명백하였다.

도 51은 대조 환자에서 HSCT 후 다양한 시간 지점에서(2-12 개월) B 세포 재구성을 도시한다. 도 51B에 도시하는 바와 같이, B 세포 재생은 동종 환자와 비교하여 자가 이식 환자내에서 비교적 빨리 일어난다(도 51A). 그러나, 대조 값(shaded)으로의 복귀는 두 그룹 모두에서 적어도 이식 6개월 후까지 명백하지 않다.

도 52는 대조 환자에서 HSCT 후 다양한 시간 지점에서 (2-12개월) CD4+ 재구성을 도시한다. B 세포수는 이식 6개월후까지 대조값으로 돌아가는 반면(도 48A-B), CD4+ T 세포 수는 이식 12개월에서도 자가(도 52B) 및 동종(도 52A) 그룹 모두에서 심각하게 감소되었다.

도 53은 대조 환자 내에서 HSCT 후 다양한 시간 지점(2-12개월)에서 CD8+ 재생을 도시한다. 도 53A-B에 도시되는 바와 같이, CD8+ T 세포가 동종 및 자가 수령자 모두에서 이식후 상당히 신속히 재생되었다. 그러나, 도 53C에 도시되는 바와 RX이, CD8+ 세포는 주로 흉선외 기원이며, 이는 TCR6+ T CD8+ T 세포, CD8aa T 세포, 및 CD28-CD8+ T 세포의 증가에 의해 나타내어 진다.

도 54는 대조 환자 내에서 HSCT 전(도 54A) 및 28일 후(도 54B)에 다양한 집단의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 마커 Ki-67을 사용하여 분석한 결과를 도시한다. 세포를 원시, 기억 및 활성화된 표현형을 근거로 마커 CD45RO 및 CD27을 사용하여 분석하였다. CD8+ T 세포 서브세트 내에 증식이 일어나며, 이는 이들 세포가 흉선외 유도되었으며 증식은 주로 말초 T 세포 서브세트 내에서 일어났음을 나타낸 다.

도 55는 대조 환자 및 LHRH-A 처리된 환자에서 HSCT 후 다양한 시간 지점에서(2-12개월) 원시 CD4+ T 세포 재생을 도시한다. 도 55A는 원시 CD4+ T 세포(CD45RA+CD45RO-CD62L+)의 FACS 분석을 도시하며, 연구를 통하여 이들 세포의 심각한 손실을 보인다. 도 55B-C에 도시된 바와 같이, 원시 CD4+ T 세포는 HSCT 후 12 개월에 자가 이식 환자에서 재생하기 시작하나(도 55C), 동종 환자(도 55B)에서의 대조 값 보다 여전히 상당히 낮다. 이러한 결과는 환자의 연령으로 인하여 흉선이 적절한 수의 원시 T 세포를 이식후 회복할 수 없었음을 나타낸다. 대조적으로, 동종 HSCT 3주 전에 LHTH-A를 투여받은 환자에서 대조군에 비하여 이식후 9 및 12 개월에서 상당히 높은 수의 원시 CD4+ T 세포를 보였다(p < 0.05 대조군과 비교하여이식 후 9 및 12개월 모두(LHRH-A 비-처리됨) (도 55D). 이는 성 스테로이드 제거 요법으로 흉선 의존성 T 세포 경로의 재생 증진을 나타낸다.

도 56은 대조 환자 내에서 HSCT 후 다양한 시간 지점에서(1-12개월) TREC 레벨을 도시한다. 최근의 흉선 이주(RTE)에서만 보여지는 TREC 레벨의 분석은 이식 후 동종(도 52A) 및 자가(도 52B) 환자 모두에서 흉선이 레벨을 회복하지 못함을 강조한다. 다시, 이는 환자의 연령 및 흉선 퇴화로 인한 흉선 기능 결여로 인한 것이며, 환자의 병적상태 및 사망과 상당한 관계가 있다. 대조적으로, 동종 말초 혈액 줄기 세포 이식을 받은 환자는 동종 이식 전 LHRH-A 처리되었을때 CD4+TREC+ 세포/ml 혈액의 상당한 증가를 보였다(p < 0.01, 대조군(LHRH-A-비처리됨)과 비교하여 이식 후 9 개월에서). LHRH-A 처리 받은 동종 환자는 대조군과 비교하여 이 식 후 9개월에서 상당힌 높은 수의 CD4+TREC+ 세포/ml 혈액을 보였다(도 56C). 자가 LHRH-A 처리된 환자 또한 이식 후 12개월에서 상당히 높은 레벨을 보였다(도 56D). 이는 성 스테로이드 제거 요법으로 증진된 흉선 재생을 나타낸다. 데이터는 5-18 환자의 평균 1 SEM으로 나타내어진다.*=p < 0.01.

LHRH-A 투여는 말초혈액 내에 NK를 상당히 증가시키나 B 세포 수를 증가시키지 않는다. 전체적으로, LHRH-A 처리로 B 세포수에 있어서 현저한 변화가 관찰되지 않았다9도 47). 그러나, NK 세포 수의 상당한 증가가 처리로 관찰되었다(p < 0.01). 따라서, 성 스테로이드의 제거로 인하여 T 세포 및 NK 세포 수가 상당히 증가된다.

전체 림프구, T 세포(주로 CD4+) 및 NK 세포의 상당한 증가가 관찰되었으며(도 45 및 47), 이는 LHRH-작용제 처리된 환자의 이전의 연구와 일치한다(Garzetti etal., (1996) Obstet.GynecoL 88: 234-40; Oliver etal., (1995)Urol. Int, 54: 226-229; Umesaki etal., (1999)Gynecol. Obstet. Invest. 48 : 66-8). T 세포 본획의 보다 상세한 분석은 LHRH-A 처리 후 원시 CD4+ T 세포 및 원시 및 기억 CD8+ T 세포 수의 상당한 증가를 나타낸다(도 44).

원시 T 세포 증가가 말초 팽창을 통한 것인지 (IL-7 투여로 보여지는 것과 같이(Soares etal., J. Immunol. (1998) 161: 5909-5917) 또는 흉선 재활성화의 직접적인 결과인지 판단하기 위하여, 세포 증식(Ki-67 항원+) 분석을 TREC 레벨 분석과 함께 행하였다(Hazenberg etal., (2001) J. Mol. Med. 79: 631-40). CD4+ (도 48A) 및 CD8+ T 세포(도 48B) 모두의 원시하고 활성화되거나 기억 집단에서 작 용제 처리로 증식 레벨에 변화는 나타나지 않았다(낮은 2-4% 유지). 이는 상기 처리가 T 세포 증식을 직접적으로 유도하지 않으며, TRECs 레벨이 말초혈액 내 과도 증식에 의해 영향받지 않음을 나타낸다. 이는 초기 시간 지점에서 말초 팽창의 가능성을 배제하지는 않는다. 그러나, 이는 증가된 활성화된/기억 세포 레벨을 설명한다. 흉선 기능 및 T 세포 이출 증가에 대한 직접적인 증거는 10 환자 내에 TREC 레벨 분석후 발견된다 (도 46B). CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 모두에서, 10 환자 중 5 명이 LHRH-A 처리 4개월에서 절대 TREC 레벨(혈액 ml 당)의 증가(초기 제시 값 위 >25%)를 보였다. 이는 또한 비율 증가에 반영된다 (1 x 10⁵ 세포 당). 이는 환자 10명 중 6명이 전체 TREC 레벨 증가를 보인 것과 연관된다. 단지 1명의 환자만이 전체 TRECs 감소를 보였다(약 30% 감소). TRECs는 흉선내 정상 T 세포 전개의 일부로서 또는 이출 후 일어나는 (Hazenberg etal., (2001)J. Mol. Med. 79: 631-40) 유사분열로 희석되므로(Zhang etal., (1999) J. Exp.Med. 190: 725-732), 절대적인 TREC 레벨은 적게 어림잡은 T 세포 방출을 나타낸다. 작용제 처리 후 말초 혈액 내 전체 TREC+ 세포의 현저한 증가는 따라서 흉선 의존성 T 세포 경로의 재생과 전적으로 일치한다(Douek et al., (1998) Nature 396: 690-695(1998) ; Douek etal., (2001) J.I7nmu7zol. 167: 6663-8; Hochberg etal., (2001) Blood 98: 1116-21). 또한, 이들 데이터는 성인 인간에서 흉선 아웃풋을 개선하는 성 스테로이드 억제의 능력을 입증하며, 많은 임상학적 상황에서 심각한 T-세포 고갈 후 원시 T 세포 수 회복의 근거를 제공한다.

실시예 17

마우스 내에서 성 스테로이드 제거는 조혈 줄기 세포 이식 후 면역 재구성을 증진한다.

본 실험은 동종 HSCT 수령자에서 성 스테로이드 억제가 이식후 면역 재구성을 증진한다는 가설을 테스트하기 위하여 수행되었다. 따라서, 본 실험은 성 스테로이드 제거가 동종 HSCT 후 조혈 회보에 영향을 미치는지 여부를 확립하는 것을 목적으로 한다. HSCT 후 14일에, BM 및 흉선 세포 수가 모의 대조군에 비하여 거세된 마우스에서 상당히 증가되었다. 이들은 비장 세포질이 또한 거세된 동물에서 증가하는 28일에 증가된 채 유지되었다. 흉선 내에서, T 세포 전구체 및 DC는 HSCT 및 거세 후 상당히 증가하였다. BM 전구체 및 전개 B 세포 또한 HSCT 및 거세후 상당히 증가하였다. 이러한 증가는 동종 HSCT 후 공여체-유도된 말초 T 및 B 세포의 상당한 증가로 해석된다. 모든 면역 증진 전략은 이식 대 숙주 질환(GVHD)의 발발을 악화시킬 위험을 수반한다. 마우스를 동종 세팅에서 GVHD 유도와 동일한 시간에 거세하였다. 거세된 마우스와 모의 거세된 마우스를 비교하였을 때 GVHD 발발 또는 심각성에 있어서 상당한 차이는 없었다. 더욱이, GVT 활성은 성 스테로이드 부재시에 감소되지 않았다. 종래에 임파 회복이 allo-HSCT 수령자 내에서 IL-7 처리 후에 증진되는 것으로 보여져 왔다. IL-7 처리와 거세의 조합은 HSCT 후 흉선 내에 부가적인 효과를 가지는 것으로 보였다. 이러한 결과는 거세 및 이에 따른 성 스테로이드 제거가 GVHD를 증가시키지 않고 GVT를 유지하면서 동종 HSCT 후 조혈 회복을 증진시킴을 나타낸다.

재료 및 방법:

시약. 항-쥐 CD16/CD32 FcR 블록 (2.4G2) 및 쥐 항원에 대한 모든 플루오로크롬-표지된 항체를 Pharmingen으로부터 얻었다(San Diego, CA): Ly-9.1(30C7), CD3(145-2C11), CD4 (RM4-5),CD8 . 2 (53-5.8), T-cellreceptor-P (TCR-J3 ; H57-597), CD45R/B220 (RA3-6B2), CD43 (S7),IgM-FITC (R6-60.2) CDllb(M1/70), Ly-6G(Gr-l) (RB6-8C5),c-kit (2B8),Sca-1 (D7), CDllc(HL3)I-Ak(11- 5.2), 이소타입 대조군: 래트 IgG2a-k (R35-95), ratIgG2a-1 (B39-4), ratIgG2b- (A95-1), 래트 IgGl-k (R3-34), 햄스터 IgG-군 l-k(Al9-3), 햄스터 IgG-군 2-1 (Ha4/8), 및 2. 4G2 및 Per (FcR 블로킹). 스트렙트아비딘-FITC, PercP-phycoerythrin (PE) 또한Pharmingen (San Diego, CA)으로부터 얻었다. 재조합 인간 IL-7 은 Dr MichelMon-e(Cytheris, Vanves, France)에 의해 제공되었다.

인간 재조합 IL-7이 쥐 세포를 자극할 수 있음을 확인하기 위하여, IL-7-의존성 쥐 pre-B 세포주 2EB로 티미딘 혼입 증식 분석을 수행하였고, 인간 IL-7이 쥐 IL-7과 동등한 쥐 세포 상에서 증식성 효과를 가짐을 발견하였다. 조직 배양 배지는 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100mg/mL 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민 (또한 50 mM 2-머캅토에탄올, 32Dp210 세포 및 증식 분석을 위해)로 보충된 RPMI 1640으로 이루어졌다.

마우스 및 HSCT. 웅성 C57BL/6J (B6, H-2b),C3FeB6Fl/J( [B6 3 C3H]F1 ; H-2b/k),B 10. BR (H-2k),B6D2F1/J (H-2b/d), CBA/J (H-2k), Balb/c (H2-d),IL7-/-및 KGF-/-마우스를 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)로 부터 얻었으며, 8-12주 가 되었을때 실험에 사용하였다. KGF-/-및 IL7-/- 를 4-7 개월 연령에서 사용하였다. HSCT 프로토콜은 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 승인되었다. BM 세포를 대퇴부 및 경골로부터 무균 제거하였다. 공여체 BM을 항-Thy-1.2로 30분간 4℃ 인큐베이션 후 Low-TOX-M 래빗 보충물(Cedarlane Laboratories, Hornby, ON, Canada)로 1시간 37℃ 인큐베이션하여 T 세포 고갈시켰다. 비장 T 세포(GCHD 분석을 위해)를 나일론 울 컬럼 상에서 정제 후 암모늄 클로라이드 적혈 세포 용해 완충액로 적혈세포를 제거하여 얻었다. 세포(5x10⁶ BM 세포, 비장 T 세포 및 백혈병 세포와 함께 또는 단독)를 Dulbecco 변형 필수 배지(Life Technologies, Grand Island, NY) 내에 재현탁하고, 0일에 꼬리 정맥 주입(0.25mL 전체 부피)에 의해 치사적으로 조사된 수령자 내로 이식하였다. 이식 전에, 0일에, 수령자는 1300 cGy 전체 신체 조사(137Cs source)를 분할 투여로 3시간 간격으로 받았다(모의관 독성 감소시킴). 마우스를 살균된 마이크로단리기 케이지 내에 넣고 정상적인 식사 및 하이퍼클로리네이티드 음료수(pH 3.0)를 공급하였다.

수술에 의한 거세. 마우스를 마취시키고 산증 절개하여 고환을 드러냈다. 이를 봉합하고 주위 지방 조직을 따라 제거하였다. 상처를 외과용 스테이플로 덮었다. 모의 거세는 고환 제거를 제외하고 동일 외과 절차를 요한다. 거세를 BM이식 전 1일에 면역 재구성 및 GVHD 연구를 위해 수행하였다.

IL-7 투여. IL-7을 0 내지 13 또는 21 내지 27일에 복막내 10 ㎍/day 면역 재구성 연구를 위해 투여하였다. PBS를 동일 시간 지점에서 대조 마우스에 주입하였다.

유세포 측정 분석. BM 세포, 비장 세포 또는 흉선 세포를 FACS 완충액 (phosphate buffered saline (PBS) /2% 소 혈청 알부민(BSA)/0. 1% azide) 내에서 세척하고, 1-3 x 106 세포를 CD16/CD32 FcR 블록으로 30분간 4℃ 인큐베이션하였다. 다음, 세포를 1차 항체로 30분간 4℃ 인큐베이션하고, FACS 완충액로 2회 세척하였다. 필요하면, 세포를 접합 스트렙트아비딘으로 추가 30분간 4℃에서 인큐베이션하였다. 염색된 세포를 FACS 완충액내 재현탁하고 FACS 칼리버 유세포 측정기 (Becton Dickinson, San Jose, CA)상에서CellQuestTM 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

증식 분석. 비장세포를(4 x 10⁵ 세포/웰) 5일간 조사된 (2000 cGy) BALB/C 비장세포를 시뮬레이터로서(2 x 10⁵ 세포/웰) 96-웰 플레이트 내에서 인큐베이션하고, 비장세포를(4 x 10⁵ 세포/웰) αCD3(145-2cl 11) 및 αCD28 (37.51) (2.5 mg/mL 최종 농도)으로 4일간 자극하였다. 배양액을 1 mCi/웰 [3H]-티미딘으로 최종 18 시간 펄싱하고, DNA를 Harvester 96 (Packard) 상에서 수확하였다. 자극 인덱스(SI)를 비자극된 세포(cpm)에 대한 자극된 세포(cpm)의 비율로서 계산하였다.

51Cr 방출 분석. 표적 세포를 100 mCi51Cr로 2x10⁶ 세포/mL로 2시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 표지하였다. 3회 세척후, 표지된 표적 세포를 U-바닥 플레이트 (Costar, Cambridge, MA)에 2.5xlO³ 세포/웰로 플레이팅하였다. 조사된 BALB/C 비장세포(1:2 비율)로 5일간 배양된 비장세포를 다양한 작동제-대-표적 비율로 최종 부피 200mL로 4-6웰에 첨가하고, 4-6 시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 이어서, 35 mL 상청액을 각각의 웰로부터 제거하고 감마 카운터(Packard, Meriden, CT)에서 카운트하여 실험적 방출을 결정하였다. 자발적 방출을 표적 세포 및 배지만을 받은 웰로부터 얻었고, 전체 방출을 5% Triton X-100를 받은 웰로부터 얻었다. 세포독성 퍼센트를 이하 식으로 계산하였다: 세포독성 % = 100 X [ (실험적 방출 - 자발적 방출)/(전체 방출 - 자발적 방출)].

세포내 IFN-y 염색으로 동종 반응성 T 세포 클론의 검출. 간략히, 세포를 12-15 시간 동안(T 세포-고갈[TCD]되고 조사된 자극 세포로 2차 동종이형 자극을 위함) Brefeldin A (10 mg/mL)로 인큐베이션하고, 수확하고, 세척하고, 1차 (표면) 플루오로크롬(FITC, PerCP, andAPC)-접합 항체로 염색하고, 고정하고, Cytofix/Cytoperm 키트 (Pharmingen)로 투과성화하고, 이어서 xIFNy-PE으로 염색하였다. 지정된 집단에 대하여 게이팅함으로써 FACS 분석을 행하였따. 유세포 측정기 및 소프트웨어를 다음과 같이 사용하였다.

지연형 과민증 분석. 모의 거세된 및 거세된 마우스를 PBS 내 200pi의 0.01% 양 적혈세포(Colorado Serum, Denver, CO)를 꼬리 정맥 주입하여 allo-BMT 후 42일에 감작하였다. 감작된 동물에 46일에 오른쪽 후방 풋패드에 50 pi의 20% 양 RBC 현탁액으로 공격하고, 왼쪽 후방 풋패드에 동일 용량의 50 겔의 PBS 용액을 대조군으로서 투여하였다. 24 및 48시간 후, 풋패드 팽창을 다이얼-두께 게이지(Mitutoyo, Kanagawa, Japan)로 측정하였다. 오른쪽 실험의 측정치로부터 PBS-주입된 왼쪽 풋패드의 측정치를 감하여 반응의 정도를 결정하였다.

GVHD의 평가. GVHD의 심각성을 임상학적 GVHD 스코어링 시스템으로 Cooke et al.( (1996) Blood 88: 3230-9)에 기재된 바와 같이 평가하였다. 간략히, 암호화된 케이지 내 귀-태그된 동물을 개별적으로 5 임상학적 패러미터에 대하여(체중 손실, 자세, 활동성, 털 및 피부) 0 내지 2 스케일로 매주 스코어링하였다. 5 기준 스코어(0-10)을 합하여 임상학적 GVHD 인덱스를 생성하였다. 생존을 매일 모니터링하였다. 5 이상의 스코어를 가진 동물을 죽어가는 것으로 고려하였으며 인위적으로 죽였다.

GVT-P813(H-2d) 세포종(mastocytoma) 유도의 평가 및 세포종 사망 대 GVHD로 인한 사망의 평가. B6D2F1/J 수령자에게 1x103 P815 (H-2d) 세포를 정맥내 동종 HSCT (5 x10⁶ T 세포 고갈된 (TCD) BM 세포 및 C57/BL6 기원의 5 x10⁵ T 세포) 0일에 투여하였다. 생존을 매일 모니터링하고, HSCT 후 사망 원인을 부검에 의하여 결정하였다. 간략히, 백혈병으로 인한 사망은 현미경 검사에서 hepatosplenomegaly 및 간과 비장 내 세포종 세포의 존재를 특징으로 하는 반면, GVHD로 인한 사망은 hepatosplenomegaly 의 부재 및 비장과 간 내 백혈병 세포의 부재, 및 사망시 임상학적 GVHD 스코어링 시스템에 의해 평가되는 GVHD의 임상학적 징후의 존재로 정의된다.

반-정량적 RT-PCR. 전체 BM을부터의 전체 세포 RNA를 Superscript II 역전사효소(Life Technologies, Rockville, USA)를 사용하여 역-전사하였다. cDNA를 35 사이클 동안(94 ℃ 30초 ; 56℃ 30초; 72 ℃ 60 초) PCR Master Mix (Promega, Madison, USA. HPRT: 5'CACAggACTAgAACACCT gC3'and gCTggTgAAAAggACCTCT3'TGF (31 : 5'CTACTgCTTCAgCTC CACAg 3'and 5' TgCACTTgCAggAgCgCAC3'and KGF :5'gCCTTgTCACgACCTgTTTC 3'and 5'AgTTCACACTCgTAgCCgTTTg 3' 를 사용하여 PCR-증폭시켰다.

IL7-/-Thymii의 효소적 소화. IL7-/-마우스는 큰 비율의 CD45-흉선 간질(thymic stromal) 세포를 함유하며, 각각의 흉선을 0. 125% (w/v) 콜라게나아제/디스파아제 (Roche Applied Sciences,Indianapolis, USA) 내에서 0.1% (w/v) DNase를 이용하여 효소적 소화하여, 흉선으로부터 대부분의 간질 및 조혈 세포를 방출시켜 흉선 세포질에 대하여 정확히 계산하돌고 하였다. 항-CD45를 사용하여 CD45-간질 세포를 확인하였다.

통계. 모든 값을 평균+SEM으로 나타내었다. 생존 데이터를 위해 Mantel-Cox log-rank test를 사용하였고, 기타 통계적 분석을 비-파라미터의 짝지어지지 않은 Mann-Whitney U test로 수행하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계학적으로 유의한 것으로 고려되었다.

결과

I. 거세는 동종 HSCT 후 BM, 흉선 및 비장 세포질을 증가시킨다.

웅성 CBA 마우스를 동종 HSCT 하루 전에 거세하였다. 마우스에 1300cGy 전 체 신체 조사한 후 5 x 10⁶ B 10. BR TCD BM 세포를 가하였다. HSCT 후 14일에 모의 거세된 대조군과 비교하여(9.5 x10⁶+ 3. 0 x10⁵ and 25 x10⁶+ 2. 6x10⁶, 각각), 거세된 마우스의 BM 내 (16 x10⁶ + 1.4 x 10⁶) 및 흉선 내 (55.4 x10⁶+ 1.8 x10⁶) 상당히 많은 세포가 있었다(도 29A-B). 이러한 숫자는 HSCT 후 28일에 거세된 마우스에서 상당히 높게 유지되었다(BM: 22 x 10⁶ ± 4.0 x 10⁶ vs. 14x10⁶±2.2 x10⁶ ; 흉선: 72x 10⁶ ± 5. 9 x 10⁶ vs.45x10⁶ ± 2.9x10⁶). 28일에 거세된 마우스내 비장 세포질 또한 모의 거세된 비장 세포수 보다 상당히 상승되었다(253 x10⁶ ± 28.4 x 10⁶ vs. 126 x 10⁶ ± 13.9x10⁶) (도 29C). 거세된 마우스는 28일에 이식전 세포질에 접근하기 시작하였다. HSCT 후 42일에, 거세된 마우스와 모의 거세된 마우스 간에 흉선 및 비장 세포질에 있어서 유의한 차이가 더 이상 나타나지 않았다. 모의 수령자는 어린 마우스이므로, 이들은 이식후 활발하게 임파구가 생성되나 1차 및 2차 임파 조직 내 정상적인 세포질을 생성하는데 요구되는 시간이 거세된 수령자에 비하여 현저히 지연되었다.

II. HSCT 후 28일에 거세된 마우스의 BM 내에 현저히 많은 공여체-유도된 HSCs가 있었다.

몇몇 연구는 성 스테로이드가 초기 조혈 전구체의 증식 및/또는 분화를 억제함을 보여왔다(Thurmond et al., (2000) Endocrmol. 141: 2309-2318; Medina et al., (2001)Nat. Immunol. 2: 718; Kouro et al., (2001) Blood 97: 2708). 따라서, 동종 이식 세팅에서 HSC 수에 대한 거세의 영향의 조사되어 왔다. 공여체-유도된 HSC의 수는 모의 거세된 마우스 및 거세된 마우스 모두에서 동종 HSCT 후 14일에 매우 낮았다(2.98x10²±1.25x10² 및 2.66x10²±8.8x10^l, 각각) (도 30A). 그러나, +28일에, 모의 거세된 대조군과 비교하여(1.1x10³±4.1x10²), 거세된 마우스내에(4.8x10³±1.lx10³) 현저하게 많은 Ly9.1⁺Lin^-Sca^-1⁺c-kit⁺ 공여체-유도된 HSCs가 있었다 (도 30A).

III. 동종 HSCT 전의 거세는 공여체-유도된 B 세포 회복을 증진시킨다.

B 세포 회복 분석에서, B 세포 전개의 3 스테이지를 구별하였다: Pro-B 세포 (CD45R⁺CD43⁺IgM^-), pre-B 세포(CD45R⁺CD43^-IgM^-) 및 미숙 B 세포 (CD45R⁺CD43^-IgM⁺). 동종 HSCT 후 14일에, 모의 거세된 대조군 (5x10⁶±1.7x10⁶)과 비교하여, 거세된 마우스(5.5x10⁶±1.7x10⁶)의 BM 내에 현저히 많은 pre-B 세포가 있었다(도 30B). 28일에, 거세된 마우스의 BM 내에 현저히 많은 pre-B 세포(sham-cx : 3.1x10⁶±3.7x10⁵ c.f. cx : 6.6x10⁶±6.6x10⁵) 및 미숙 B 세포(sham-cx:1.3x10⁶±2.6x10⁵ c.f. cx: 3.Ox10⁶±3.4x10⁵)가 있었다(도 30B). HSCT 후 28일에 BM B 세포 및 그 전구체 증가는 거세된 마우스의 비장 내 미숙 B 세포의 상당한 증가로 해석된다 (sham-cx: 64.9x10⁶±6.4x10⁶ c.f.cx : 112.0x10⁶±10.0x10⁶) (도30C). 이러한 결과는 거세가 B 세포 생산 및 BM으로부터의 방출을 증진시킨다는 이전의 연구와 일치한다.

IV. 동종 HSCT 후 T 세포 재구성이 거세에 의해 증진된다.

흉선세포 및 말초세포를 CD3, CD4 및 CD8의 발현에 근거하여 전개 스테이지로 구분하였다: Triple Negatives (TN)(CD3^-CD4^-CD8^-), double positive (DP)(CD4⁺CD8⁺), single positive CD4(SP CD4) CD3⁺CD4+CD8^- 및 single positive CD8(SP CD8) CD3⁺CD4^-CD8⁺ (도 31A-D). 동종 HSCT 후 14일에, 모의 거세된 대조군에 비하여 거세된 마우스 내에서 현저히 많은 TN, DP, SP CD4 및 SP CD8 흉선 세포가 있었다. 28일에, DP 및 CD4 SP 세포수가 거세군에서 상승된 채 유지되었다. 42일에, 모든 흉선 세포 서브세트가 모의 거세 및 거세된 마우스에서 동등하다. 숙주 및 공여체-유도된 DC는 이식 거부를 방지함에 있어 중심 역할을 하는 것으로 생각된다(Morelli et al., (2001)Semin. Immunol. 13: 323-335). 동종 HSCT 후 14일에, 거세된 마우스의 흉선에 현저히 많은 숙주-유도된 CD11c^hi DC가 있었다. 동종 HSCT 후 28일에 거세된 마우스에서 흉선 내 숙주 및 공여체-유도된 DC 모두 현저히 증가하였다(도 31E-F). 거세 마우스에서 흉선 세포 수 증가는 모의 거세 마우스와 비교하여 거세 마우스의 비장에서 공여체-유도된 성숙 CD4+ 및 CD8+ T 세포 수의 현저한 증가로 해석된다(도 31G).

V. 세포 당 근거로,모의 거세 및 거세 마우스로부터의 T 세포 간에 유의한 차이가 없다.

allo-HSCT 후 거세 마우스 내 말초 T 세포의 기능적 잠재성을 결정하기 위해, 일련의 실험관 분석을 행하였다. allo-HSCT 후 6주에 거세 및 모의 거세 대조군에서 공여체-유도된 T 세포 수를 도 32A에 제시한다. 비장 T 세포의 증식능을 2 방법:αCD3/αCD28 cross-linking(도 32B) 및 3rd party MLR (조사된 BALB/C ㅂ비빚비장 세포를 자극원으로 사용)(Fig. 32C)으로 테스트하였다. 모의 거세 및 거세 마우스를 비교하면, 말초 T 세포의 증식능에 있어 유의한 차이는 없었다. allo-HSCT 후 6주에, 비장세포를 조사된 BALB/C 비장세포(3rd party)로 5일간 인큐베이션하였다. 동종 자극 5일 후, 배양액 내 대부분의 세포는 CD8+ T 세포였다. 이들 세포는 반을 CTL(SICr 방출) 분석에 사용하여 모의 거세 및 거세 마우스로부터의 비장세포의 세포독성을 결정하였다. 비장세포를 51Cr loaded A20 (BALB/C B 세포 임파종 세포주) 세포를 사멸하는 능력에 대하여 상이한 작동자: 표적 비율로 테스트하였다(도 32D). 세포독성에 있어 모의 거세 및 거세 마우스 간에 유의한 차이는 없었다. 5일 배양된 세포의 다른 절반을 3rd party(BALB/C) 또는 공통 유전자 (B10. BR) 조사된 비장세포 및 Brefeldin A로 밤새 재자극하여 IFN-y 생산을 결정하였다. 도 32E는 BALB/C 1차 자극 및 BALB/C 또는 B10. BR(대조군) 2차 자극 후 공여체-유도된 CD8+ 비장 T 세포에 의한 IFNy 생산을 보인다. 이는 도 32F에 도식적으로 나타내어 진다. 모의거세 및 거세 마우스를 비교시 IFN-y 생산 공여체-유도된 CD8+의 유의한 차이는 없다.

면역 기능 평가를 위해, 생체내 DTH 분석을 사용하여, 거세 및 allo-BMT 후 42일에, 마우스를 sRBCs로 감장하였다. 46일에, 이들을 공격하고 24 및 48시간 후에, 풋패드 팽창을 결정하였다. DTH 반응은 모의 거세 대조군에 비하여 allo-HSCT 시에 마우스가 거세되었을 때 공격 후 48시간에 상당히 증진되었다(도 32G).

이러한 기능적 분석은 거세 수령자 내에 T 세포가 세포당 기초하여 모의 거세 수령자로부터의 T 세포에 필적하며, 증식, 세포독성 및 사이토카인 생산이 손상되지 않으면서 새로운 항원에 반응할 수 있음을 보인다. 그러나, 거세 수령자 내 현저히 보다 신속한 T 세포 재구성은 이식 후 6주에서 증진된 DTM 반응으로 해석된다.

VI. 동종-HSCT 전의 거세는 GVHD를 악화시키지 않으며 GVT 활성을 유지시킨다.

GVHD 및 GVT 모두 allo이식으로 전달된 동종 반응성 공여체-유도된 T 세포에 의해 일차적으로 중재된다. 면역 재구성 증진을 위해 사용되는 임의 처리는 GVHD를 악화시킬 잠재성 또는 GVT 활성을 악화시킬 잠재성을 가진다. 거세가 공여체 기원의 동종 반응성 T 세포에 자극 효과를 가지지 않음을 확립하기 위하여, 공통유전자 공여체 T 세포를 동종이식에 첨가하여 GVHD를 유도하였다. 거세 및 모의 거세 마우스를 비교시 GVHD로 인한 사망률에 있어서 유의한 차이는 없었다(도 33A). GVT 활성에 대한 거세의 영향을 평가하기 위하여, 세포종(mastocytoma) 세포주 P815 (H-2d) 를 B6D2F1/J 수령자에게 이식 시에 주입하였다. 실험 중에 사망한 동물을 부검하고, 사망 원인(종양 vs. GVHD)을 결정하였다. 세포종으로 인한 사망 은 모의 거세 대조군(8 마우스 중 5)과 비교시 거세후 변화되지 않고 유지되었다(9 마우스 중 6). 이는 거세가 HSCT 후 GVT 반응을 감소시키지 않음을 시사한다(도 33B).

VII. IL-7 및 거세는 동종 HSCT 후 부가적 효과를 가진다.

IL-7 치료는 그렇지 않으면 미처리된 동물에서 T 및 B 세포 수를 증가시키고 또한 시클로포스파미드 처리, 조사, 공통유전자 및 동종이형 HSCT 후 림프구 회복을 증진시킬 수 있는 것으로 보여져 왔다(Alpdogan et al., (2001) Blood 98: 2256; Bolotin et al., (1996) Blood 88: 1887; Faltynek etal.,(1992) J. immunol. 149: 1276; Morrissey et al., (1991) J. Immunol. 146: 1547). IL-7는 증가된 흉선 활성 및 말초 팽챵을 통하여 T 세포수를 증가시키는 것으로 알려져 있다.

따라서, 동종이형 HSCT 수령자 내에 IL-7 투여를 거세와 조합하는 것으로 결정되었다. 처리 후 14일에, 거세 마우스 및 조합 처리(거세 및 IL-7 투여) 받은 마우스의 흉선 내에 현저히 많은 세포가 있다. 초기 시간 지점에서, PBS 처리된 모의 거세 대조군과 IL-7 처리된 모의 거세 마우스 간에 유의한 차이가 없다. 또한, 거세 군과 조합 처리 받은 군 사이에 유의한 차이가 없으며, 이는 allo-HSCT, IL-7 처리 및 거세 후 14일에 작용하는 것은 단지 거세일 뿐임을 시사한다 (도 34A). 그 후의 시간 지점에서, allo-HSCT 후 28일에, 거세 처리 군과 IL-7 단독 처리군 모두의 흉선의 세포질이 대조군 보다 상당히 높다. IL-7 처리와 거세의 조합은 동종이형 HSCT 후 28일에 분석하면 흉선 세포질에 대하여 부가적으로 영향을 미친다 (도 34B).

VIII. IL-7, TGF-β1, 및 KGF에 대한 반-정량적 RT-PCR은 allo-HSCT 및 거세 후 KGF 증가 및 TGF 감소를 보인다.

전체 골수 세포의 RT-PCR 분석은 allo-HSCT 후 6주에 모의 거세 및 거세 마우스 모두에서 탐지불가능한 레벨의 IL-7 트랜스크립트를 드러낸다. 대조군으로부터의 주형, 비-이식된 마우스를 사용하여 IL-7을 검출하였다 (데이터 도시하지 않음). TGF l 및 KGF는 조혈 작용의 주요 중재자인 것으로 알려져 있다. HPRT 평형화된 주형을 사용하면, 거세 및 allo-BMT 후 2주에 TGFP의 감소 및 KGF 2의 증가가 있는 것으로 보인다(도 34C).

IX. 거세 후 일어나는 변화가 KGF ^-/- 마우스 내에 보여지나 IL7 ^-/- 마우스 내에서는 보여지지 않았다.

거세 후 증진된 면역 재구성 뒤의 가능한 메커니즘의 추가적 연구를 위해, KGF^-/- 및 IL7^-/- 마우스 (4-6 개월 연령) 거세시키고, 2주 후에, 흉선, 비장 및 BM을 분석하였다(TGFβ₁ ^-/- 마우스는 성숙기전에 사망하였다. Shull et aL (1992) Nature 359: 693). 모의 거세 및 거세된 KHF^-/- 마우스를 비교시 흉선 세포질이 상당히 증가되었다. 초기 시간 지점에서 BM 및 비장 전체 세포질의 유의한 차이는 보이지 않았으나, 야생형 마우스에서 종래 보여진 것과 같이, BM의 B 세포 분획에서 변화가 보여졌다(Ellis etal. (2001)Iizt.nmunol. 13: 553; data not shown). IL7^-/- 마우스의 흉선 내 세포의 큰 비율이 CD45-간질 세포라는 사실로 인하여, 효소적 소화를 사용하여 단일 세포 현탁액을 얻었다. 이렇게 함으로써, 보다 많은 세포를 현탁액 내로 방출시키며, 이는 종래 문헌과 비교하여 본 실험에서 보여지는 약간 더 많은 흉선 세포질을 설명한다(von Freeden-Jeffry etal.(1995) J. Exp. Med. 181: 1519). 거세 마우스 및 모의 거세 대조군을 비교시 IL7^-/- 마우스의 흉선(도 34G), 비장(도 34H) 또는 BM(도 34I)에 있어 유의한 차이는 없었다. 이러한 발견은 거세 및 allo-HSCT 후 증진된 면역 재구성에 대한 IL-7의 중요한 역할을 시사한다.

고찰:

동종이형 HSCT 수령자는 생명을 위협하는 감염과 관련된 연장된 면역 결핍 기간을 경험한다. 수령자 나이 증가에 따라, 완전한 면역 재구성을 위한 시간과 함께 감염 위험이 증가한다. HSCT 후 면역결핍 기간은 1년 이상일 수 있으며, 최근의 장기 연구는 공여체와 비교하여 고령의 HSCT 환자 내 TREC+CD4+ T 세포의 감소를 입증하였다(Storek et al., (2001) Blood98 : 3505); Lewin etal., (2002) Blood 100: 2235). 이는 흉선 손상 및 이에 따른 T 세포 생산 감소가 종래 생각된 것 ㅂ보다 연장될 수 있음을 시사한다. 대다수의 HSCT 후 감염은 CD4+ 말초 T 세포와 관련있다(Storek etal., (1997)Am. J. Hematol. 54:131). 따라서, 거세 후 일어나는 말초 T 세포 수의 증가가 감염 발생률을 감소시켜 이식 환자의 전체적인 생존을 증진시킬 수 있다.

HSCT 후 조혈 재구성에 많은 초점이 맞추어져 왔으며, 가장 유망한 결과는 조혈 성장 인자 및 사이토카인의 사용으로 얻어졌다. 예컨대, G-CSF를 사용하여 공여체 줄기 세포를 동원한다(Dreger etal., (1993) Blood 81: 1404). Noach et al은 SCF 및 IL-11 또는 SCF 및 Flt-3 리간드로의 전처리가 증진된 공여 세포 이식을 초래함을 보였다((2002) Blood 100: 312). KGF는 공통유전자 및 동종이형 세팅 모두에서 이식 및 재구성을 증진시키며 GVHD를 경감시키는 것으로 보인다(Panoskaltsis-Mortari etal., (2000) Blood 96: 4350; Krijanovski, etal., (1999) Blood 94:825). IL-7은 공통유전자 HSCT 후 면역 재구성을 증진시키며(Bolotin etal., (1996) Blood 88: 1887), 동종이형 HSCT 후 GVHD의 악화없이 면역 재구성을 증진하고 GVT 활성을 유지할 수 있다(Alpdogan etal., (2001) Blood 98: 2256).

몇몇 연구는 웅성 마우스의 수술 또는 화학적 거세에 의한 성 스테로이드 제거가 BM 및 비장 B 세포 수를 증가시킴을 보였다(Ellise et al., (2001) Int.Immunol. 13: 553; Erben et al., (2001) Horm. Metab. Res. (2001) 33: 491; Wilson et al., (1995) Blood 85: 1535; Masuzawa et al., (1994)J. Clin. Invest. 94: 1090). 말초 B 세포 수 증가는 주로 B220^lo CD24^hi 최근 BM 방출로 인한 것이다

(Ellis et al., (2001) Int. Immunol. 13: 553). Olsen et al은 안드로겐이 BM 내 간질 세포에 의해 TGF-β 생산을 증진시키며, 이는 결국 B 세포 발달을 억제함 을 입증하였다(J. Clin. Invest. (2001) 108: 697). 또한, TGF-β의 실험관내 중화는 디하이드로테스토스테론에 의한 B 세포 억제를 전환시킨다. TGF-β는 또한 간질 IL-7 생산을 하향 조절하며 따라서 B 세포 원종의 증식을 억제하는 것으로 보여졌다(Tanget al., (1997)J. Immunol. 159: 117). 따라서, 예컨대 동종이형 HSCT 후 거세/안드로겐 제거의 영향에 대한 간 가지 가능한 설명은, TGF-β의 생산을 억제하고, 따라서 B 세포 발달을 증진시키며, 이는 모의 거세 대조군과 비교시 거세 마우스의 BM 및 비장 내 증가된 B 세포 수를 설명한다.

조혈 줄기 세포의 증식 또한 TGF-β에 의해 조절된다. Batard et al은 생리학적 농도의 TGF-β가 실험관내 HSCs의 증식 및 분화를 억제함을 입증하였다((2000) J. Cell. Sci. 113: 383-90). 또한, HSCs 내 TGF-β 시그널링의 파괴(돌연변이 타입 II 수용체의 일시적 발현을 통한)는 이들 세포의 생존 및 증식을 증진시킨다(Fan et al., (2002) J. Immunol. 168 : 755-62). 따라서, 동종이형 HSCT 및 거세 후 28일에 보여지는 HSCs 수의 증가는 BM 간질 세포에 의한 TGF-β 생산 감소로 인한 것일 수 있다.

에스트로겐 및 안드로겐 모두 HSCs의 증식 및 분화에 영향을 미칠 수 있다(Thurmond et al., Endocrinol., (2000) 141: 2309-18; Medina et al., (2001)Nat.Immunol.2:718-24 ; Kouro et al., (2001) Blood 97: 2708-15). 에스트로겐은 일부 림프계 전구체 서브세트 뿐 아니라 HSC의 증식 및 분화를 직접 억제한다(Medina etal.,(2001) Nat. Immunol. 2:718 ; Kouro et al. (2001) Blood 97: 2708). HSCs는 기능적 에스트로겐 수용체(ERs)를 발현하며, 에스트로겐 투여는 Lin^-c^-kit⁺Sca^-l⁺ HSCs 수를 감소시킨다 (Thurmond et al., (2000)Endocrinol. 141: 2309; Kouro et al., Blood (2001) 97: 2708). Thurmond et al의 연구는 c^-kit⁺Sca^-l+ 전구체 및 보다 성숙한 서브세트 간의 변이를 시사한다(ERα가 BM의 조혈 세포 내 존재할 때 c^-kit⁺Sca^-l^- 및 c^-kit^-Sca^-l^- 블록킹됨 (Endocrinol. (2000) 141: 2309). ERα는 또한 BM 간질 세포 상에 존재하며(Girasole et al., (1992) J. Clin. Invest. 89 :883 ; Smithson et al., (1995) J. Immunol. 155: 3409), 이는 에스트로겐이 간질에 의한 성장 인자 생산에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 HSC 증식 및/또는 분화에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 대부분의 증거는 BM 간질을 통한 HSCs에 대한 안드로겐의 간접적 영향을 시사하나, BM의 림프 성분 상의 기능적 안드로겐 수용체의 존재는 직접적인 영향을 배제하지 않는다.

Olsen et al은 연령과 관련된 흉선 퇴화 및 이에 따른 성 스테로이드 제거를 통한 재생에 필수적인 것은 흉선 상피 상의 기능적 안드로겐 수용체의 존재이며 흉선 세포가 아님을 보였다((2001) Endocrinol. 142: 1278).

흉선 퇴화 및/또는 재생에 대한 분자 메커니즘은 알려지지 않았으나, 몇몇 잠재적 후보가 있다. IL-7 레벨은 연령과 함께 감소한다 (Aspinall, et al., (2000) Vaccine 18: 1629 ; Andrew et al., (2002) Exp.Gerontol. 37: 455; Ortman et al., (2002) Int. Immunol. 14: 813). 이러한 것이 IL-7을 생산하는 세포 수의 감소로 인한 것인지 존재하는 세포의 사이토카인 생산 능력 감소로 인한 것인지는 여전히 불명확하다. 그러나, 나이든 마우스의 IL-7 처리는 흉선 세포사의 연령-관련 증가를 반전시킬 수 있으며 흉선세포 생성을 증진시킬 수 있다(Andrew et al., (2001)J. Immunol. 166: 1524). 줄기 세포 인자(SCF) 및 M-CSF mRNA 발현 또한 마우스에서 연령과 함께 감소한다(Andrew et al., (2002) Exp.Gerontol. 37: 455). 세포내 시그널링 레벨에서, 흉선 상피 세포의 증식 및 분화에 관여하고 존재하는 전사 인자인 Foxnl (whn)와 같이 DN 흉선세포의 발달을 위한 전사 인자인 E2A가 감소한다(Ortman et al., (2002)Unit. Immunol. 14: 813). Sempowski et al은 고령 인간에서 rRNA 스테디-스테이트 레벨을 모니터링하고, Leukemia Inhibitory Factor(LIF), Oncostatin M, IL-6 and SCFmRNA의 유의한 증가를 보였다 (J.Immunol. (2000) 164: 2180).

상기 연구는 거세에 대한 반응이 다중인자로 인한 것임을 시사한다. IL7^-/- 마우스의 거세를 이용한 실험들은 IL-7의 증가된 생성이 거세 효과의 주요 성분임을 시사한다. 그러나, 수령자를 높은 투여량의 IL-7 및 거세로 처리시 흉선 세포질에 대한 부가적인 효과가 관측되었으며, 이는 거세가 증가된 IL-7 레벨 단독 보다 흉선세포 생성 효과를 제공함을 시사한다.

DC는 흉선 내 음성 선별의 주요 중재자이며(Jenkinson et al., (1985) Transplantat. 39: 331; Matzinger et al., (1989) Nature 338: 74-60),일시적 세팅에서 이식후 흉선 내 동종항원을 제시하여 이식 허용을 유도하고, 공여체-특이성 T 세포를 제거하는데에 수반되어 왔다. Tomita et al은 MHC 클래스 I 미스매칭된 수령자의 흉선 내 공여체-유도된 세포가 공여체 반응성 세포의 고갈을 중재함을 입증하였다(Tomita et al., (1994) J.Immunol. 153: 1087-1098). 이들은 또한 정맥내 주입된 흉선-유도 DC가 숙주 흉선과 교환됨을 보였다. 또한, 동종-항원, 공여 세포, 또는 공여체 가용성 펩타이드로 펄싱된 숙주 세포의 흉선내 주입은 이식 허용성을 증가시키는 것으로 보여졌다(GalTovillo et al., (1999) Transplantation 68 : 1827; Ali et al., (2000) Transplantation 69:221 ; Garrovillo et al., (2001)Am. J. Transplant. 1: 129; Oluwole et al., (1993) Transplantation 56: 1523-1527). 이러한 연구는 동종이형 HSCT 후 흉선 내에서 거세가 숙주 및 공여체-유도 DC 수를 상당히 증가시킴을 보인다. 즉, 성 스테로이드 제거가 흉선 DC의 증식 및/또는 분화를 증진한다. 따라서, 조혈 줄기 세포 및 고체 기관 이식와 함께 사용되는 거세는 이식 허용성을 증가시킨다.

결론:

현재 연구는 성 스테로이드 블로킹이 골수제거 및 HSCT 이후의 면역 재구성에 중대한 긍정적 영향을 미침을 보였다. HSCs, 및 B 및 T 전구체가 현저히 증진된다. 이는 이식 효율성을 증가시키고 미손상 조혈 시스템, 예컨대 종양 또는 미생물 항원 또는 공여체 HSCT를 표적으로 하는 유전자 요법, 에 의존하는 이식후 전략에 대한 중요한 발판을 제공한다. 흉선 내 DC 증가는 동종이형 이식에 대한 내성을 유도하고 지속시킴에 있어 중요하다. 또한, 거세된 수령자에서 GVHD는 악화되지 않으며 GVT 활성은 감소되지 않는다. 이러한 결과는 일시적 성 스테로이드 제거(예컨대, LHRH 아날로그 사용)가 면역 재구성을 증진시키는 예방 요법으로서 유용함을 입증한다.

실시예 18

성 스테로이드 제거는 조혈 간세포 이식후 TCR-특이적 자극을 증진시킨다.

재생된 T 세포의 기능적 특성을 평가하기 위하여, TCR 특이적 자극에 대한 반응성에 대하여 환자를 분석하였다.

재료 및 방법:

환자. 테스트 환자에게 간세포 이식 3주 전에 Zoladex (LHRH-A)를 주입한 다음, 4 개월 동안 매월 주입하였다. 모든 환자를 처리전, 이식 5주 후 매주, 및 12개월까지 매월 분석하였다. The Alfred Committee for Ethical Research on Humans (Trial Number01/006)로부터 도덕적 승인을 받았다.

PBMC의 제조. 정제된 림프구를 T-세포 자극 분석에 사용하였고, TREC 분석 nd를 상기와 같이 제조하였다.

T 림프구 자극 분석. TCR 분석 특이적 자극을 달리 지시하지 않는한 이식후 1-12개월로부터 항-CD3 및 항-CD28 교차결합을 사용하여 수행하였다. TCR-특이적 자극을 위하여, 세포를 정제된 항-CD3 (1-10㎍/ml) 및 항-CD28 (10㎍/ml)로 미리 코팅된 플레이트 상에서 48 시간 인큐베이션하였다. 플라크 형성후(48-72시간), 1 μCi의 ³H- 티미딘을 각각의 웰에 가하여 플레이트를 추가 16-24 시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 필터 매트 상으로 수확하고 3H-티미딘의 혼입을 p-카운터(Packard-Coulter, USA) 상에서 액체 섬광에 의해 결정하였다.

I. LHRH-A 투여는 동종이형 간세포 이식후 TCR 특이적 자극에 ㄷ대miㅎni하한 반응성을 증진시킨다.

LHRH-A 처리된 환자는 6 및 9개월에서의 낮은 환자 수로 인하여 이때를 제외하고 모든 시간 지점에서 대조 환자와 비교하여 증진된 증식 반응성 (³H-티미딘 혼입에 의해 평가)을 보였다(도. 57A-B). LHRH-A로 처리된 동종이형 이식 환자에서, 항-CD3/CD28 자극에 대한 반응성의 현저한 증가가 대조 환자와 비교하여 이식 후 4 및 5개월에 관찰되었다. 대조 환자가 이식 후 6 및 9 개월에 증진된 반응을 보인 반면, LHRH-A 처리 환자는 이식 후 12개월에서 보다 큰 반응성을 보였다. 이식 후 6 및 9개월에서, 대조 환자는 전처리 값과 유사한 반응성을 가졌다. 그러나, 모든 시간 지점에서, 상당히 낮았다. 대조적으로, LHRH-A 처리 환자는 전처리와 비교하여 6개월을 제외한 모든 시간 지점에서 동등한 반응성을 가졌다. LHRH-A 처리 환자는 이식후 1, 3 및 4 개월에서 대조 환자와 비교하여 증진된 증식 반응성(³H-티미딘 혼입에 의해 평가)을 보였다. 새로운 CD4+ T 세포나 이식후 적어도 1-2개월까지는 명백하지 않으므로 이는 말초 T 세포 영향을 나타낸다(도 57A-B).

II. LHRH-A 투여는 자가 간세포 이식 후 TCR 특이적 자극에 대한 반응성을 증진시킨다.

동종이식 수령자에서 보여지는 유사한 반응이 또한 자가이식 수령자에서 관찰되었다(도 57C). LHRH-A 처리된 환자들은 이식후 4 및 9 개월 모두에서 TCR 자극에 대한 증진된 증식 반응을 보였다. LHRH-A 처리된 환자는 5개월을 제외한 모 든 시간 지점에서 대조 환자와 비교하여 증진된 증식 반응을 보였다 (³H-티미딘 혼입에 의해 평가). 전처리 값으로의 회복이 대조군 및 LHRH-A 처리 환자 모두에서 이식후 12개월까지 관찰되었다.

III. LHRH-A 투여는 만성 암 환자에 대한 치료후 TCR 특이적 자극 반응성을 증진시킨다.

CD4 < 0.4 x 109/L; 또는 림프증식성 질환 (예컨대, CLL, 골수종, 임파종)과 관련된 보고된 심각한 감염에 의해 결정되는 면역억제된 만성 혈액학적 종양을 가지고, 통상적인 예방적 정맥 감마글로뷸린 (보고된 하이포감마글로뷸리네이마)을 투여받거나; 또는, 플루다라빈, 디옥시코르포마이신 및 2-CdA로 4 년 내에 처리되거나; 또는, 동종이형 또는 자가유전자 간세세포 이식 전의 환자가 본 연구에 수반되었다. The Alfred Committee for Ethical Research on Humans (Trial number01/006)로부터 도덕적 승인을 받았다. 환자에게 LHRH-A를 다음과 같이 주입하고, 결과를 LHRH-A 투여 후 6주까지 제시한다.

d-1 (또는 그 전): 동의에 서명하였으며 전처리 조사를 수행함

dO : Zoladex 투여됨(남성 lO.8mg ; 여성 3.6mg)

d+28: 여성-Zoladex 3.6mg 투여됨

d+56: 여성-Zoladex 3.6mg 투여됨

d+84: 여성 및 남성-Zoladex 3.6mg 투여됨

TCR 특이적 자극의 분석을 D7 투여후 항-CD3 및 항-CD28 교차결합을 사용하 여 수행하였다. LHRH-A 처리 환자는 전처리 레벨과 비교하여 증진된 증식 반응을 (³H-티미딘 혼입에 의해 평가) "주기적" 방식으로 보였다 (도 63). 즉, 주입 당일에, T 세포 증식 증가가 관찰되었고, 이는 이후 주입 전에 약간 감소하는 것으로 보였다. 이는 또한 LHRH-A의 말초 T 세포에 대한 직접적인 영향의 가능성을 나타낸다. 이는 매월 디포 주입으로 작용제 투여를 반영한다. 이러한 결과는 말초 T 세포 상에 직접적인 영향을 나타낸다. 그러나, 작용제 투여를 모든 환자에 대하여 4 개월부터 중단하므로, 이식후 12 개월에서 보여지는 증진된 반응은 흉선-유도 T 세포에서 변화된다.

결론:

TCR-특이적 자극에 대한 증가된 반응성이 이식후 D35에 관찰되었으므로, 새로 유도된 T 세포가 이 단계에서 단지 흉선을 떠나기 시작하므로, 이는 주로 이미 존재하는 T 세포로 인한 거이다. 새로 유도된 흉선-생성된 T 세포의 영향은 이 시점 이후에만 관찰되며, 따라서 증가된 T 세포 기능은 이미 존재하는 T 세포내 증진으로 인한 것이며 재생된 흉선으로부터 유도된 T 세포로 인한 것이 아닌 것으로 결론지을 수 있다.

실시예 19

성 스테로이드 제거는 조혈 간세포 이식후 유사분열 자극을 증진시킨다 .

재생된 T 세포의 기능적 특성을 평가하기 위하여, 환자들의 유사분열 자극에 대한 반응성에 대해 분석하였다.

재료 및 방법:

환자. Clinical Trial protocol No. 01/006 에 수반된 환자들이었다. 간세포 이식 전에, 환자에게 LHRH-A (3주 전)를 주입하였다. 작용제를 투여받지 않은 환자를 대조 환자로 사용하였다.

PBMC의 제조. 정제된 림프구를 T-세포 자극 분석 및 TREC 분석을 위해 사용하고 상기와 같이 제조하였다.

유사분열 자극 분석. 유사분열 반응성의 분석을 이식후 1-12개월로부터 pokeweed 유사분열(PWM) 및 테타누스 톡소이드(TT)를 사용하여 수행하였다. 유사분열 자극을 위하여, PBMC를 100㎕의 RPMI-FCS 내에 96-웰 둥근바닥 플레이트 내에 1 x 10⁵/웰의 농도로 플레이팅하였다. 세포를 37℃ 5% CO₂에서 TT (2LFAU/ml) 또는 PWM (10㎍/ml)으로 인큐베이셨하였다. 플라크 형성후(48-72시간), 1μCi의 ³H-티미딘을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 추가 16-24시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 필터 매트 상으로 수확하고 3H-티미딘 혼입을 p-카운터(Packard-Coulter, USA)상에서 액체 섬광을 사용하여 결정하였다.

I. LHRH-A 투여는 동종이형 간세포 이식후 유사분열 자극 반응성을 증진시킨다.

유사분열 반응성 분석은 LHRH-A 처리를 받고 있는 동종 유전자 환자가 대조군과 비교하여 이식후 모든 시점에서 PWM에 대한 반응서이 증가되었음을 보였다9도 58A). 즉, 간세포 이식 전에 LHRH-A 처리된 환자는 대조 환자와 비교하여 모든 시 점에서 PWM 자극에 대한 증진된 반응성을 보였다.

유사한 결과가 TT에 대한 반응성 분석 후에 명백하였다(도 58B). LHRH-A 처리된 환자는 대조환자와 비교하여 이식 후 12개월을 제외하고 모든 시점에서 증진된 반응성을 가졌다.

II. LHRH-A 투여는 자가 간세포 이식후 유사분열 자극에 대한 반응성을 증진시킨다.

간세포 이식 전에 LHRH-A 처리된 환자는 대조군과 비교하여 대부분의 시점에서 PWM 자극에 대한 증진된 반응성을 보인다 (p < 0.001, 3개월에서) (도 59A). 이식후 12 개월까지, LHRH-A 처리 환자는 전처리 레벨로 반응성을 회복하였으나, 대조 환자는 여전히 상당히 감소되었다.

또한, 동종이식 환자와 유사하게(도 58B), 자가이식 환자 또한 처리전에 LHRH-A를 투여받았을 때 TT에 대한 증가된 반응성을 보였다. 간세포 이식전에 LHRH-A 처리된 환자는 대조 환자와 비교하여 대부분의 시점에서 TT 자극에 대한 증진된 반응성을 보였다(도 59B). 이식후 12개월까지, LHRH-A 처리 환자는 전처리 레벨로 반응성을 회복하였으나, 대조 환자는 여전히 상당히 낮았다.

결론:

유사분열 자극에 대한 증가된 반응성이 이식 후 D35에 관찰되었는데, 새로 유도된 T 세포는 이 단계에서 단지 흉선을 떠나기 시작할 뿐이므로, 이는 주로 이미 존재하는 T 세포로 인한 것이다. 새로 유도된 흉선-생성된 T 세포의 영향이 이 시점 후에 비로소 관찰된다..

실시예 20

성 스테로이드 제거는 조혈 줄기 세포 이식 환자 내에서 이식 비율을 증진시킨다.

재료 및 방법:

실험에 사용된 재료 및 방법을 상기한 바와 같다. 부가적인 재료 및 방법은 다음과 같다:

동종이형 및 자가 환자(대조군 또는 LHRH-A 처리)를 HSCT 후 전체 WBC 및 전체 과립구 또는 호중성 백혈구 수에 대하여 분석하였다. HSCT 전 3주에, 환자를 LHRH-A 처리하였다. 작용제를 투여받지 않은 환자를 대조 환자로 사용하였다. 혈액 ㎕ 당 전체 백혈세포(WBC) 수, 과립구(G) 및 호중구 수를 이식 후 35일까지 결정하였다. 전체 말초 혈액 샘플을 Cell-Dyn 1200 자동화 세포 카운터(Abbott) 또는 ㅎ혈구계산기 카운트를 사용하여 2중으로 분석하였다. 이는 이식 후 전체 백혈세포, 림프구 및 과립구 수의 계산을 허용하였다. 이식 분석을 이식후 D14-D35로부터 수행하였다.

결과:

I. 이식 전에 LHRH-A 처리를 받는 자가 줄기 세포 이식 환자는 이식 비율을 증진시킨다.

혈액 ㎕ 당 전체 백혈 세포(WBC) 카운트 및 과립구(G) 카운트를 이식 후 14, 28 및 35일에 결정하였다. 도 60A-D에서 도시되는 바와 같이, LHRH-A 처리된 환자는 대조군과 비교하여 이식후 D14에서 현저히 높은 WBC 수를 보였으며(도 60B), 이 시점에서 대조군 45%와 비교하여 87%가 과립구 이식(>500세포/혈액)을 보였다 (p<0.05). LHRH-A 처리된 자가 환자 또한 대조군과 비교하여 이식후 D10-12에서 현저히 높은 호중구 수를 보였다(도 60C: 데이터를 8-20 환자의 평균±1SEM으로 표시함.*=p < 0.05). 또한, 현저하지는 않으나, 자가 환자는 대조군과 비교하여 LHRH-A 처리에서 분석된 시점을 통하여 높은 림프구 카운트를 가졌다(도 60D). 이는 LHRH-A 치료법이 간세포 이식후 림프구 레벨을 현저히 증가시킴을 나타낸다.

II. 이식 전 LHRH-A 처리된 동종이형 간세포 이식 환자는 이식 비율을 증진시킨다.

도 61A에 도시된 바와 같이, LHRH-A 처리된 동종이형 환자는 대조군과 비교하여 이식후 D14에서 현저히 높은 WBC 수를 보였으며(도 61A) (p < 0.05), 이 시점에서 44% 대조군과 비교하여 64%가 과립구 이식(>500 세포/㎕ 혈액)을 보였다(p<0.05). 또한, LHRH-A 처리된 동종이형 환자는 대조군과 비교하여 이식후 D9, 12, 19에서 현저히 높은 호중구 수를 보였다(도 61C: 데이터를 8-20 환자의 평균±1SEM으로 표시.*=p < 0.05). 또한, 말초 혈액 간세포 이식이 진행중인 환자의 분석은 동종이형 이식 전에 LHRH-A 처리되었을 때 림프구수의 현저한 증가를 보였다(이식후 10, 12, 13 및 17-21일에 P<0.05)(도 61D).

결론:

동종이형 및 자가 이식 모델 모두에서, 대조군과 비교하여 LHRH-A 처리 환자에서 이식후 D14에 WBC 및 과립구 수의 현저한 증가가 관찰되었다(도 60 및 61). 이와 같이 증진된 이식 비율은 증가된 감염율을 보이는 호중구감소증(≤200 호중구/ml 혈액)으로 인한 가진 전체 환자 사망율에 결정적이다. 이와 같이, 초기 WBC 및 과립구 수 회복은 LHRH-A 처리 환자의 보다 나은 생존율을 입증한다. 성 스테로이드의 억제는 완전한 흉선 재생 또는 완전한 흉선 재생의 결과로서 새로운 T 세포 방출 이전에 이식 및 재구성을 증진한다.

실시예 21

성 스테로이드 제거는 1주일 이내에 T 세포 증식 반응을 증가시킨다.

본 연구는 성 스테로이드 제거가 마우스 내 거세 후 3-7일에 증식 반응을 증진시킬 수 있은지 여부를 결정하기 위하여 수행되었다.

재료 및 방법:

8주 나이의 마우스를 거세시키고 수술후 3일(도 62A, C, E) 및 7일(도 62B, D, F)에 항-CD3/항-CD28 자극 T 세포 증식 반응에 대하여 분석하였다. 말초(경부,겨드랑이, 팔 및 서혜부) 림프절(도 62A, B), 장간막 림프절(도 62C, D) 및 비장 세포(도 62E, F)를 다양한 농도의 항-CD3으로 자극시키고, 항-CD28로 10㎍/ml의 일정농도로 48 시간 동안 동시 자극시켰다. 다음, 세포를 적정된 티미딘으로 18 시간동안 펄싱하고 증식을 3H-T 혼입으로서 측정하였다. 대조 마우스를 모의 거세시켰다, n=4,*p < 0.05 (non-parametric, cunpaired, Mann-Whitney statistical test).

결과:

성 스테로이드 제거된 마우스는 거세후 3일(도 62A, C, E) 및 7일(도 62B, D, F)에 증진된 CD28/CD3-자극된 T 세포 증식을 보인다. 말초 LN으로부터 단리된 T 세포는 거세후 3일(10㎍/ml 항 CD-3) 및 7일(2.5㎍/ml 및 1.25㎍/ml 항-CD3)에 현저히 증가된 증식 반응을 보였다. 또한, 장간막 림프절(도 62C, D) 및 비장(도 62E, F)으로부터 단리된 T 세포도 거세후 3일에 모의 거세된 마우스에 비하여 현저히 증가된 항-CD3-자극된 증식을 보였다.

결론:

거세후 3-7일에(새로운 T 세포가 흉선으로부터 이동하기 전에), 항-CD3 및 CD28 가교결합 자극에 대한 T 세포 반응성의 증가가 있다. 이러한 데이터는 성 스테로이드 제거가 흉선 재활성화 전에 말초 T 세포 풀의 작용성에 직접적인 영향을 가짐을 입증한다.

인간 환자내에 말초 T 세포에 대한 LHRH-A의 직접적인 영향의 정도를 결정하기 위하여, 연구를 수행하였다. 대조 환자 T 세포를 다양한 투여량의 LHRH-A로 인큐베이션하고, 대조군(배지만) 샘플과 비교하여 증식 레벨에 대하여 다양한 시점에서(D3, D7, D14) 분석하였다. 이는 마우스 모델에서 관찰되는 것과 같이 LHRH-A가 존재하는 T 세포 상에 그들의 활성화를 야기함으로써 직접적으로 작용하는지 여부의 결정을 허용한다.

실시예 22

성 스테로이드 제거가 컨제닉(congenic) HSCT 후 조혈을 증진시킨다.

결과:

I. 거세는 HSCT 후 BM, 흉선 및 비장 내에서 이식을 증진시킨다.

마우스를 컨제닉 HSCT 1일전에 거세시켰다. 5 x10⁶ Ly5.1+ BM 세포를 조사된 (800 rads) C57/BL6 마우스 내로 정맥내 주입하였다. BM, 비장 및 흉선을 이식후 다양한 시점에서(2-6 주) 유세포 측정에 의해 분석하였다(도 35). 도 35B에 도시된 바와 같이, 거세 및 HSCT 후 2주에, 모의 거세된 대조군과 비교하여 거세된 마우스의 BM 내에 현저히 많은 세포가 있었다. 유사하게, 도 35C에서와 같이, 모의 거세 대조군과 비교하여 이식 후 2, 4, 6주에 현저한 흉선 세포 증가가 있었다. 도 35C에서와 같이, 말초에, 비장 세포 수 또한 거세된 수령자 내에서 이식 후 4 및 6 주에 대조군 보다 현저히 높았다.

II. 거세는 컨제닉(congenic) HSCT 후에 BM 내 HSC의 이식을 증진시킨다.

마우스를 컨제닉 HSCT 1일 전에 거세시켰다. 5x10⁶ Ly5.1+ BM 세포를 조사된(800 rads) C57/BL6 마우스 내로 정맥내 주입하였다. BM을 이식 후 2주에 유동 혈구 계산에 의해 lin-c-kit+sca-l+ HSC에 대해 분석하였다(도 36). BMT 이식 및 거세 후 2주에, 모의 거세 대조군과 비교하여 거세된 마우스의 BM 내에 현저히 많은 공여체-유도 HSC가 있었다.

III. 거세는 컨제닉 HSCT 후 BM 내 HSC의 이식을 증진시킨다(2.5x10 ⁶ 세포).

마우스를 컨제닉 HSCT 1일 전에 거세시켰다. 2.5x10⁶ Ly5. 1+ BM 세포를 조사된(800 rads) C57/BL6 마우스내로 정맥내 주입하였다. BM을 이식후 2주에 lin-c-kit+sca-l+ HSC에 대해 유세포 측정으로 분석하였다(도 37A-B). 도 37A는 BM 내 림프계 전구체를 도시한다. 도 37B는 BM 내 공통 림프계 전구체를 도시한다. BMT 이식 및 거세 후 2주에, 모의 거세 대조군과 비교하여 거세된 마우스의 BM 내에 현 저히 증가된 비율의 공여체-유도된 HSCs가 있었다.

IV. 거세는 컨제닉 HSCT 후에 BM 내 HSC 이식을 증진시킨다(5x10⁶ 세포).

5x10⁶ Ly5. 1+ BM 세포를 조사된(800 rads) C57/BL6 마우스 내로 정맥내 주입하였다. BM을 이식후 2주에 lin-c-kit+sca-l+ HSC에 대하여 유세포 측정에 의해 분석하였다(도 37C-D). 도 80A는BM 내 공통 림프계 전구체 퍼센트를 도시한다. 도 37D는 BM 내 공통 림프계 전구체 수를 도시한다. BMT 이식 및 거세후 2주에, 모의 거세 대조군과 비교하여 거세된 마우스의 BM 내에 증가된 비율의 공여체-유도된 HSCs가 있었다.

V. 거세는 컨제닉 HSCT 후 흉선내 공여체-유도된 DC의 이식 비율을 증진시킨다.

5x10⁶ LyS. l+ BM 세포를 조사된(800 rads) C57/BL6 마우스 내로 정맥내 주주입하였다. 이식후 2주에 흉선을 유세포 측정에 의해 분석하였다. 공여체-유도된 DC를 CD45.1+CDllc+MHC class II+CDllb^+또는- 로 정의하였다. 공여체-유도된 CDllb+ 및 CDllb- DC는 BMT 후 2주에 모의 거세 대조군과 비교하여 거세된 마우스의 흉선 내에서 현저히 증가되었다(도 38).

VI. 거세는 컨제닉 HSCT 후 비장내 공여체-유도된 B 세포의 이식 비율을 증진시킨다.

5x10⁶ Ly5.1+ BM 세포를 조사된(800 rads) C57/BL6 마우스 내로 정맥내 주입 하였다. 비장 세포를 이식 후 2주에 유동 혈구계상으로 분석하였다. 컨제닉 BMT 후 2주에, 모의 거세 대조군과 비교하여, 거세된 마우스의 비자 DSO에 현저히 많은

B220+ B 세포가 있었다(도 39).

실시예 23

LHRH-A 처리가 효율적으로 혈청 테스토스테론을 고갈시킨다

재료 및 방법:

환자 혈청에서 성 스테로이드 레벨 검출을 테스토스테론 방사면역분석(RIA)을 이용하여 수행하였다. 분석 전에, 모든 시약, 샘플 및 대조군을 실온으로하였다. 대조 튜브는 완충액 단독의 비-특이적 결합(NSB) 튜브 또는 0 ng/ml 테스토스테론 표준(B₀)을 가졌다. 완충액단독, 표준(0-10 ng/ml 테스토스테론) 또는 테스트 을 각각의 튜브에 가한 다음, 성적 결합 글로뷸린 억제제(SBGI)를 가하여 방사성 표지된 테스토스테론의 비특이적 결합을 억제하였다. ¹²⁵I-테스토스테론을 각각의 튜브에 가한 다음, 항-테스토스테론 항체를 가하였다(NSB 튜브 제외). 다음, 튜브를 37℃에서 2시간 인큐베이션하였다. 그 후, 2차 항체를 와동된 모든 튜브에 가하고 추가 60분 인큐베이션하였다. 튜브를 15분간 원심분리하고(l000_gmax), 상청액을 제거하고 침전물을 a Packard Cobra auto-beta counter 상에서 카운트하였다. 삼중 cpm 결과에 대하여 평균을 내고, 표준 곡선을 결합된 테스토스테론(B/B₀) 퍼센트에 대한 식을 사용하여 그렸다:

% B/Bo = 샘플-NSB/B₀-NSB

샘플 = 특정 테스트 샘플의 평균 cpm

NSB = 비특이적 결합 튜브의 평균 cpm

Bo = 0 ng/ml 표준 (전체 결합 튜브)의 평균 cpm

각각의 테스트 샘플 내 테스토스테론 레벨을 표준 곡선으로부터 결정하였다.

결과:

전립선암 환자에게 LHRH-A 투여는 혈청 테스토스테론의 거세 레벨을 초래한다. LHRH-A 처리 효율성을 판단하기 위하여, 처리 전에 및 LHRH-A 처리 4개월에 모든 환자에 대하여 혈청 테스토스테론 레벨을 분석하였다. 분석을 ¹²⁵I-테스토스테론으로 방사면역분석(RIA)을 사용하여 수행하였다. 혈청 테스토스테론의 농도는 호르몬 처리 전에 1-3 ng/ml 테스토스테론 (평균 = 2.3 ng/ml) 범위 내였다(도 46A). 처리 4 개월에, 환자는 검출가능한 혈청 테스토스테론을 가지지 않았으며, 이는 성 스테로이드 방출의 성공적인 억제를 나타낸다.

LHRH-A 투여는 말초 혈액 내에 림프구 서브세트의 퍼센트에 영향을 미치지 않는다. LHRH-A 처리 4개월 후, 전처리값과 비교하여 임의의 림프구 서브세트의 비율에 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 값은 모두 정상 범위 내이다. 말초 혈액 림프구를 T, B, 및 골수-유도(NK 및 대식세포) 세포의 비율 및 수에 대하여 FACS에 의해 분석하였다. 임의의 세포 서브세트의 비율에 대한 변화가 LHRH-A 투여 후 관찰되지 않았다. 또한, 모든 림프구 서브세트의 비율은 이 연령 군에서 정 상 범위 내였(도 84C); Hannet etal., 1992; Xu etal., 1993).

실시예 24

자가 또는 동종이형 간세포 이식을 받은 환자 내 고세렐린 아세테이트(ZOLADEX)로 일시적 성 스테로이드 제거 후 흉선 재활성화

본 실시예에서, 자가 또는 동종이형 말초 혈액 간세포 이식(PBSCT) 전에 고세렐린 아세테이트(Zoladex)를 투여한다. 1차 엔드포인트는 실험관내 분석에 의해 측정되는 흉선 재활성화이다. 이식후 6개월간 환자를 대상으로 한다. 20 (10 동종이식 및 10 자가이식) 환자를 본 연구의 대상으로 한다. 본 실시예는 LHRH 레벨에서 그 작용제를 사용하여 성 스테로이드 생산을 억제하여 뇌하수체의 감도를 줄이고 따라서 LH 및 FSH 방출을 예방하는 효과를 조사한다. 결국, 이는 흉선 기능에 억제 효과를 제거하는 안드로겐 및 에스트로겐의 생식선 생산의 차단을 야기한다. 본 실험에서 검사된 그룹은 고 투여량 화학방사요법(HDT) 및 PBSCT를 받은 환자들이다.

고세렐린 아세테이트(Zoladex)는 LHRH의 잠재적인 합성 데카펩타이드 유사체이다. 급성 투여시, 고세렐린 아세테이트는 뇌하수체로부터 LH를 방출할 것이다. 그러나, 만성 투여 후, 고세렐린 아세테이트는 고나도트로핀 생산의 잠재적 억제제이므로 생식선 억제 및 따라서 성적 기관 퇴화를 야기할 것이다. 동물 및 인간에서, 초기 뇌하수체 자극, LH 분비 및 일시적 혈청 테스토스테론 상승 후, 만성 투여는 고나도트로핀 분비를 억제할 것이다. 결과는 치료 개시 약 3주 이내에 일어나는 뇌하수체 LH의 지속 억제 및 남성 내 혈청 테스토스테론 레벨의 수술 거세한 남성에서 보여지는 범위로의 감소이다. 이러한 억제는 치료가 지속되는 한 유지된다.

환자는 악성 질환 또는 BM 이상에 대하여 PBSCT로 고 투여량 요법(HDT)을 받은 18세 이상의 남성 또는 여성이다. Zoladex 10.8mg 삽입 배합물(남성에 대하여)을 생분해가능하고 생물학적으로 융화되는(biocompatible) 원통형 막대 내에 분산시키고, 피하 주입 후 12주에 걸쳐 지속적으로 방출시켰다. 3.6mg 삽입물(여성)을 생분해가능하고 생물학적으로 융화되는 폴리글락틴의 원통형 막대 내에 분산시키고, 피하 주입 후 28일에 걸쳐 지속 방출시켰다. 상기 삽입물은 14-16 게이지 바늘이 구비된 목적에 따라 고안된 도구 내에 상업적으로 공급된다.

혈액 내에 성 스테로이드의 최소값으로의 감소는 몇 주 걸릴 것이다. 따라서, PBSC 주입(0일) 21 전에, 환자에게 LHRH 작용제 Zoladex(삽입물) 형태로 성 스테로이드 제거 요법을 주입한다. 남성에 대하여, 10.8mg 고세렐린을 단일투여로 (3개월간 유효) -21에 투여하고, 63에 3.6mg 주입한다(28일 유효). 여성에 대해서는, -21, 7, 35 및 63일에 3.6 mg (28일 유효)를 투여한다. 이는 성 스테로이드 레벨을 감소시켜 흉선을 재활성화(PBSCT 후 4개월로 예측)하는데에 효과적일 것이다. 따라서, 본 실시예에서, 처리 4-6개월만이 투여된다. 기타 투여는 당업자에 의해 결정되는 바에 따라 허용가능한 것으로 간주될 것이다.

PBPCs를 0일에 주입한다. 재활성화된 흉선은 주입된 전구체 세포를 테이크업하여 이를 새로운 T 림프구 및 상피 흉선 세포로 전환시킨다. 최대 성 스테로이드 제거는 PBSC 주입시이며, 따라서 주입된 PBSC는 흉선 재구성을 보조할 수 있다. PBSCT 후 3-4주에, 최초의 새로운 T 세포가 혈류 내 존재하나, 치료를 PBSCT 후 3개월 지속하여 면역 시스템을 완전히 정상화하도록 한다.

흉선 기능을 유동 혈구 계산, 실험관내 T 세포 반응 및 TRECs 생산에 의한 T 세포 평가에 의해 판단한다.

연구 시작 이전에, 통상의 pre-HDT 조사를 수행하고, 기본 FBE, 전해질, LFTs를 기록한다. 기타 전처리 분석은 혈청-HCG (여성), 흉선 CT, 골밀도 연구, 단백질 전기영동 및 면역전기영동, 호르몬 연구: TFTs, FSH, LH, 에스트로겐, 프프로제스테론, 테스토스테론, 을 포함한다. 또한, 다양한 기본 T 세포 분석을 수행할 것이다. 백혈구를 50ml 혈액으로부터 정제하고 다음과 같이 검사한다:

(a) 유세포 측정

원시 vs. 기억 T 세포

CD27-FITC, CD45RA-PE, CD45RO-PerCP,CD4- 또는 CD8-APC

CD27-FITC, CD45RO-PerCP, CD4/CD8-APC, Ki-67-PE

CD62L, CD45RO-PerCP,CD103, CD4/CD8-APC

T 세포 서브세트

CD4-FTTC, CD8-APC, αβTCR-PE, γδTCR-B/S-PerCP

CD25-PE, CD69-CyChrome, CD4-FITC, CD8-APC

CD28-CyChrome, αβTCR-PE, CD4-FITC, CD8-APC

B 세포/골수 세포

CD19-FITC, CD3-PerCP, CD56-PE, CD34-APC

CDllb-CyChrome, CDllc-PE, CD4-FITC,CD8-FITC

사이토카인

IL-4-PE,IFNg-APC, CD4-FITC, CD8

기타 마커

CDlla, CD95, HLA-DR, CD2, CD5

모든 환자는 처리 전후로 검사되었으므로 내부 대조군으로 작용한다. 염색 특이성 대조군은 FITC/PE/APC 등을 가지고 염색 전 FcR 블로킹된 이소타입 대조군을 포함할 것이다.

(b) T 세포 기능

혈액 림프구를 CD 가교결합 능력에 대하여 실험관내 검사한다.

(c) TREC 분석

원시 T 세포를 단리하고 TCR 유전자 재배열의 결과로 형성된 T 세포 수용체 절개 서클의 존재를 탐침한다. 이들의 존재는 흉선으로부터의 이탈의 강한 증거이다 (메인스트림 T 세포 생산의 유일한 급원). 세포 분열은 TCR 유전자의 재배열 후 흉선 발달과 관련있으므로, TREC 레벨은 흉선 이주의 최저 예상치일 것이다(실제 레벨의 약 10%).

본 명세서에 언급된 모든 문헌이 본원에 참조로 통합된다. 본 발명에 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변경 및 변화가 본 발명의 사상 및 범위를 이탈함이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 구현예에 대하여 기재되었으나, 청구되는 바와 같은 본 발명은 그러한 특정 구현예로 과도하게 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 과연, 생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 실행하기 위하여 기재된 방식에 대한 다양한 변경이 첨부되는 청구항의 범위 내인 것으로 의도된다.

실시예 25

이식은 동종이형 이식체에 대한 허용성을 증진시킨다

아래 마우스는 잭슨 연구소(Bar Har, ME)에서 구입하였고 일반적인 조건하에 사육하였다:C57BL/6J(흑색:H-2b); DBA/1J(연갈색;H-2q); DBA/2J(연갈색; H-2d); 및 Balb/cJ(알비노;H-2d). 연령은 4-6주 내지 26개월이며 각각에 표시하였다.

C57BL/6J 마우스를 공여체 골수 재구성에 대한 수용체로 사용하였다. 전술한 바와 같이, 수용체 마우스(6월령 이상의 C57BL6/J, 이 시기는 흉선이 현저하게 퇴화되기 시작하는 시기이므로)를 3시간ㄴ 간격으로 2회 5.5 Gy 로 방사선 조하하였다. 2차 방사선 조산 하후 1시간 지나서, 수용체 마우스에서 DBA/1J, DBA/2J 또는 Balb/cJ 마우스로부터 유래된 공여체 BM 세포 5 x 10⁶을 근육내 주입하였다. BM 세포는 공여체(2월령의 DBA/1J, DBA/2J 또는 Balb/cJ) 마우스의 경골 및 대퇴골을 통해 RPMI-1640 배지를 통과시켜 수득하였고, 상기 배지에서 수집한 세포를 회수하였다.

전술한 바와 같이, 재구성과 동시에 또는 재구성 하기 최대 1주일 전에 거세한 수용체 마우스에서, 모의 거세(ShCx) 대조군 마우스에 비해 흉선의 재생율이 유의적으로 증가되었다 또한 모의-거세 마우스에 비해, 거세 마우스는 BMT 이후에 BM에 있어 증가된 세포 충실성, BM내 높은 세포수 및 B 세포와 B 세포 전구체의 증진된 재생을 가지는 것으로 확인되었다. 수용체 마우스의 MHC(즉, 마우스에서 H-2 위치)는 공여체 마우스와 상이하므로, 모의-거세된 마우스에 비해 거세된 마우스에서 공여체-유래 혈액세포의 수적 증가가 직선형으로 관찰되었다. 또한, 숙주 및 공여체에 대해 음성 선별(허용성 유도)을 발휘하는 키메라 흉선에서 숙주 및 공여체 유래 DC의 수치 및 분포가 정상적이다.

공여체 BM 세포를 가진 수용체 마우스의 재구성 후 4 내지 6주 후에, 공여체 마우스로부터 피부 이식체를 취하여 표준적인 방법에 따라 수용체 마우스 사ㅏㅇ에 위치시켰다(예, Unit4.4 in Current Protocols In Immunology, John E. Coligan et al.,(eds), Wiley and Sons, New York, NY 1994, 및 최근 2002 업데이트된 것을 포함함). 즉, 마취한 수용체 마우스(예, Balb/cJ BM으로 재구성된 C57BL/6J 마우스)의 진피 및 표피를 제거하고, Balb/cJ의 진피 및 표피를 두었다. 공여체 피부털은 백색이므로 쉽게 흑색인 수용체 C57BL/6J 마우스와 식별할 수 있다. 이식된 공여체 피부의 건강 상태는 수술후 매일 관찰하였다.

그 결과, 모의 거세 마우스는 공여체 HSC를 숙주의 흉선으로 충분히 흡수하여 DC를 생산하지 못하기 때문에, 공여체-재구성된 C57BL/6J 거세 마우스상에 이식된 공여체 Balb/cJ 피부가 공여체-재구성된 C57BL/6J 모의 거세 마우스상에 이식된 공여체 피부에 비해 더 잘 "받아들여지는(즉, 수용되는)" 것으로 확인되었다. 공여체 피부 이식체는 Balb/cJ BM으로 재구성되지 않은 수용체, 모의 거세한 C57BL/6J 마우스상에 받아들여지지 않는 것으로 확인되었다.

또한, 공여체 BM으로 이식된 수용체 마우스가 MHC는 매치되지만 피부 이식체는 다른 것에 대해 허용성을 유도할 수 있는 지를 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 즉, C57BL/6J (H-2b) 마우스를 거세하거나 또는 모의-거세하였다. 다음날, 전술한 바와 같이, 마우스는 Balb/cJ BM으로 재구성하였다. 재구성 4일 후, 2개의 피부 이식체(즉 진피 및 표피)를 수용체 C57BL/6J 마우스 상에 두었다. 제1 피부 이식체는 DBA/2J(연갈색; H-2d) 마우스로부터 유래된 것이다. 제2 피부 이식체는 Balb/cJ(알비노; H-2d)에서 유래된 것이다. C57BL/6J 마우스, DBA/2J 마우스 및 Balb/cJ 마우스의 털 색상의 차이로 인해 피부 이식체는 서로간, 및 수용체 마우스에서 쉽게 구별된다.

전술한 바와 같이, Balb/cJ 마우스 유래 피부 이식체는 Balb/cJ-골수로 재구성된 모의-거세 수용체 마우스나 또는 공여체 BM으로 재구성되지 않은 모의-거세 수용체 마우스에 비해, Balb/cJ-BM으로 재구성된 거세 수용체 마우스상에서 더욱 잘 "받아들여지는" 것으로 확인되었다. 또한 DBA/2J 마우스 유래 피부 이식체는 Balb/cJ-골수로 재구성된 모의-거세 수용체 마우스나 또는 공여체 BM으로 재구성되지 않은 모의-거세 수용체 마우스에 비해, Balb/cJ-BM으로 재구성된 거세 수용체 마우스상에서 더욱 잘 "받아들여지는" 것으로 확인되었다.

실시예 26

흉선절제된 마우스 내 BM 및 비장에 대한 거세 효과

흉선절제된 환자(마우스) 내에서 거세 효과가 분명한지 판단하기 위하여 예비 실험을 행하였다. 결과는 성 스테로이드 시그널링의 파괴가 재생된 흉선의 존 재와 무관하게 면역 시스템(예컨대, BM 및 흉선 내 면역 세포)에 직접적인 또는 간접적인 영향을 미침을 나타내었다.

재료 및 방법

마우스를 거세시키고, 당업계에 공지된 통상적인 방법으로 흉선절제하였다.

마우스를 다음의 그룹으로 나누고: 미처리(즉, 원시, "untreated"), 모의 거세("sham-cx"), 및 거세("cx"), 세 군 각각을 흉선절제("tx")하거나 모의 흉선절제("shtx")하여 전체 6 그룹을 분석하였다. 6 그룹 각각을 골수제거 및 BMT 후 2주 및 4주에 분석하였다.

결과

I. 흉선절제는 BM에 대한 성 스테로이드 억제의 효과에 영향을 미치지 않는다.

도 64A에 도시되는 바와 같이, BMT 후 4주에, Tx/Cx 마우스의 BM 공통 림프구 원종(CPLs)의 수가 증가되었으며, 니는 ShTx/Cx 마우스에 상응한다.

도 64B에 도시된 바와 같이, BMT 4주 후, Tx/Cx 마우스의 BM 내 전체 B 세포 수가 증가되었으며, 이는 ShTx/Cx 마우스에 상응한다. Tx/Cx 마우스 및 ShTx/Cx 마우스는 또한 ShamCx/Tx 또는 ShamCx/ShTx 대조군과 비교하여 BM 내 B 세포 수가 증가되었다.

도 64C에 도시되는 바와 같이, BMT 후 4주에, Tx/Cx 마우스의 BM 내 전체 미성숙 B 세포 수 또한 증가되었으며, 이는 ShTx/Cx 마우스에 상응한다. Tx/Cx 마우스 및 ShTx/Cx 마우스는 또한 ShamCx/Tx 또는 ShamCx/ShTx 대조군과 비교하여 BM 내 미성숙 B 세포수가 증가되었다.

따라서, 도 64A-C의 결과는 이식 증가를 포함하는 BM 내 세포 수 및 작용성 증가에 대한 거세의 효과는 재활성화된 흉선을 필요로 하지 않으며, 대신 BM 및 면역 시스템의 다른 세포에 대한 직접적인 영향을 인한 것이라는 결론을 지지한다.

II. 흉선절제는 비장에 대한 성 스테로이드 억제의 효과에 영향을 미치지 않는다.

도 64D에 도시된 바와 같이, BMT 후 4주에, Tx/Cx 마우스는 또한 전체 비장 세포 수가 증가한 것으로 보이며, 이는 ShTx/Cx 마우스에 상응한다. Tc/Cx 마우스 및 ShTx/Cx 마우스는 또한 ShamCx/Tx 또는 ShamCx/ShTx 대조군과 비교하여 전체 비장세포수가 증가되었다.

도 64E에 도시된 바와 같이, BMT 후 4주에, Tx/Cx 마우스는 또한 ShTx/Cx 마우스에 상응하는 비장내 전체 B 세포 수 증가를 가지는 것으로 보인다. Tx/Cx 마우스 및 ShTx/Cx 마우스는 또한 ShamCx/Tx 또는 ShamCx/ShTx 대조군과 비교하여 비장내 B 세포수가 증가되었다.

따라서, 도 64D-E의 결과는 증진된 재구성을 포함하는 비장내 면역 세포의 수 및 작용성 증가에 대한 거세의 효과가 재활성화된 흉선을 필요로 하지 않으며, 대신 BM 및 면역 시스템의 다른 세포의 직접적인 영향으로 인한 것이라는 결론을 지지한다.

본 명세서에 언급된 모든 문헌이 본원에 참조로 통합된다. 본 발명에 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변경 및 변화가 본 발명의 사상 및 범위를 이탈함이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 구현예에 대하여 기재되었으나, 청구되는 바와 같은 본 발명은 그러한 특정 구현예로 과도하게 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 과연, 생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 실행하기 위하여 기재된 방식에 대한 다양한 변경이 첨부되는 청구항의 범위 내인 것으로 의도된다.

당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 특정 구현예에 대한 수많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 첨부하는 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (27)

1. 환자에게서 허용성을 유도하는 방법으로서,

   환자의 면역세포를 고갈시키는 단계;

   환자에게서 호르몬 매개 시그널링을 파괴시키는 단계; 및

   공여 세포를 환자에게 투여하며, 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단계를 포함하며,

   환자에게서 공여체 이식체에 대한 허용성이 유도되는 것을 특징으로 하는, 방법.
2. 환자에게서 허용성을 유도하는 방법으로서,

   환자의 면역세포를 고갈시키하는 단계; 및

   환자의 성 호르몬 매개 시그널링을 파괴시키는 단계로서, 상기 환자의 골수의 기능성을 환자 흉선의 재활성화 없이, 재활성화 이전에 또는 재활성화와 동시에 증가시키는 단계; 및

   공여 세포를 환자에게 투여하며, 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단계를 포함하며,

   환자에게서 허용성이 유도되는 것을 특징으로 하는, 방법.
3. 환자에게서 허용성을 유도하는 방법으로서,

   환자의 면역세포를 고갈시키하는 단계; 및

   환자의 성 호르몬 매개 시그널링을 파괴시키는 단계;

   공여 세포를 환자에게 투여하며, 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단계; 및

   환자의 골수에서 공여 세포가 흉선의 재활성화 없이, 재활성화 이전에 또는 재활성화와 동시에 생착되도록 하는 단계를 포함하며,

   환자에게서 허용성이 유도되는 것을 특징으로 하는, 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 있어서, 상기 환자의 흉선은 적어도 부분적으로 퇴화된 상태인 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 환자는 환자의 흉선이 적어도 부분적으로 퇴화되는 질환에 결린 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
6. 제 4항에 있어서, 상기 환자는 환자의 흉선이 적어도 부분적으로 퇴화되는 질환의 치료를 받고 있는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
7. 제 5항에 있어서, 상기 질환의 치료는 면역억제제, 화학요법 또는 방사선요법 치료인 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
8. 제 1 내지 제 3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포, 상피 줄기세포 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
9. 제 1 내지 제 3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 전구 세포는 림프계 전구 세포, 골수 전구 세포 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
10. 제 8항에 있어서, 상기 세포는 조혈 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 조혈 줄기세포는 CD34⁺인 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
12. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포는 성 스테로이드 매개 시그널링의 파괴 시작 시점에 투여되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
13. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 있어서, 1종 이상의 사이토카인, 1종 이 상의 성장 인자 또는 1종이상의 사이토카인과 1종 이상의 성장 인자의 조합을 환자에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 사이토카인은 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 7(IL-7), 인터루킨 15(IL-15), 줄기 세포 인자(SCF) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
15. 제 13항에 있어서, 상기 성장 인자는 상피세포 성장 인자계 일원, 섬유아세포 성장인자계 일원, 줄기세포 인자(SCF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 각질형성 세포 성장 인자(KGF), 과립구-대식세포 집락 형성 인자 (GM-CSF), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
16. 제 1항 또는 제 3항중 어느 한항에 있어서, 상기 성 스테로이드 매개 시그널닝은 거세에 의해 파괴되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 성 스테로이드 매개 시그널닝은 외과적 거세에 의해 파괴되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
18. 제 16항에 있어서, 상기 성 스테로이드 매개 시그널닝은 화학적 거세에 의해 파괴되는 것을 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 성 호르몬 매개 시그널링은 1종 이상의 약제의 투여에 의해 파괴되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
20. 제 19항에 있어서, 상기 1종 이상의 약제는 LHRH 작용제, LHRH 길항제, 항-LHRH 백신, 항-안드로겐, 항-에스트로겐, SERM, SARM, SPRM, ERD, 아로마타제 저해제, 부신 차단제, 알도스테론 길항제, 항-프로게스토겐, 프로게스틴, 항-프로게스틴 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
21. 제 20항에 있어서, 상기 LHRH 작용제는 에울렉신(Eulexin), 고세레린(Goserelin), 레우프롤리드(Leuprolide), 디옥살란 유도체(Dioxalan derivatives), 트립토렐린(Triptorelin), 메테렐린(Meterelin), 부세렐린(Buserelin), 히스트렐린(Histrelin), 나파레린(Nafarelin), 루트렐린(Lutrelin), 레우프로펠린(Leuprorelin), 데슬로렐린(Deslorelin), 시스토렐린(Cystorelin), 데카펩틸(Decapeptyl), 고나도렐린(Gonadorelin), 그것의 아세테이트, 그것의 시트레이트, 그것의 그외 염, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
22. 제 120항에 있어서, 상기 LHRH 길항제는 아바렐릭스(Abarelix), 세트로렐릭스(Cetrorelix) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
23. 제 20항에 있어서, 상기 항-안드로겐은 비카울타미드(bialutamide), 시프로테론 아세테이트(cypreoterone acetate), 리아로졸(liarozole), 케토코나졸(ketoconazole), 플루타미드(flutamide), 메게스트롤 아세테이트(megestrol aetate), 두타스레라이드(dutasteride), 핀아스테라이드(finasteride) 및 이들의 혼합믈로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
24. 제 20항에 있어서, 상기 항-에스트로겐은 아나스트로졸(anastrozole), 풀베스트란트(fulvestrant), 타목시펜(tamoxifen), 클로미펜(lomipene), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 디에틸스틸베스트롤 디포스페이트(diethylstilbestrol diphosphate), 다나졸(danazol), 드롤록시펜(droloxifene), 요오드옥시펜(iodoxyfene), 토레미펜(toremifene), 락록소펜(raloxofene) 및 이들의 혼합믈로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
25. 제 20항에 있어서, 상기 부신 차단제는 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 포르메스탄(formestane), 보라졸(vorazole), 엑시메스탄(exemestane), 아나스트로졸(anastrozole), 레트로졸(letrozole) 및 엑시메스탄(exemestane)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
26. 제 1항 또는 제 3항중 어느 한항에 있어서, 상기 허용성은 공여 이식체에 대해 유발되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.
27. 제 26항중 어느 한항에 있어서, 상기 공여 이식체는 공여체의 세포, 조직, 기관 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 환자에게서 허용성을 유도하는 방법.

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