JP2006523720A - 胸腺再生前の移植片に対する寛容 - Google Patents

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Abstract

本開示は、患者における性ステロイドシグナル伝達を妨害することにより、器官、組織、および/または細胞の不適合移植片に対するレシピエントにおける寛容を誘導するための方法を提供し、ここで骨髄および他の免疫細胞の機能性が胸腺の再生なしに、再生前に、または再生と同時に改善するものである。いくつかの実施形態において、患者における性ステロイドシグナル伝達は、LHRH作動薬、LHRH作動薬、抗LHRH受容体抗体、抗LHRHワクチン、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)、選択的アンドロゲン受容体モジュレーター(SARM)、選択的プロゲステロン応答モジュレーター(SPRM)、ERD、アロマターゼ阻害剤、またはそれらの様々な組み合わせの投与によって中断または妨害される。

Description

本発明は、細胞免疫および移植片移植の分野に属す。さらに具体的には、本発明は骨髄(BM)の造血および機能性の増強と、造血幹細胞移植(HSCT)後のBM生着の増強と、新生および既存のT細胞ならびに免疫系の他の細胞の機能性の増大とに関する。本発明は、レシピエントによる同種移植片受容の改善にも関する。
[免疫系]
免疫系の主な機能は、「外来」(すなわち体外の任意の供与源から得られた) 抗原と「自己」(すなわち体内由来物)とを識別して、結果的に身体を感染から防御するように応答することである。さらに実際的にいうと、免疫応答は危険信号に応答しているとも説明されてきた。これらの危険信号は、問題となるこの細胞/組織がもはや「正常」ではないと免疫系の細胞に警報を発する、細胞または組織の性質における任意の変化でありうる。そのような警報は例えばウイルス、細菌、寄生虫および真菌感染などの外来因子の拒絶を引き起こす上で非常に重大でありうるし、それらを抗腫瘍応答を誘導するためにも使用できる。しかし、そのような危険信号は、自己細胞におけるおのおのの細胞の不適当な変化が次に免疫系の標的(例えば糖尿病における膵島β細胞)となることが原因となってなぜ一部の自己免疫疾患が開始するかの理由でもありうる。あるいは、免疫細胞自体の不適当な刺激は、初期応答を誘導した外来細胞または微生物以外に、正常な自己細胞の破壊をもたらしうる。
正常な免疫応答では、連続するイベントには、外来抗原を捕捉し、低分子量ペプチド断片にプロセシングしてから抗原提示細胞(APC)表面の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の溝で提示する専用のAPCを必要とする。MHC分子は、(細胞傷害性T細胞(TcまたはCTL)によって認識される)全ての有核細胞上に発現するクラスIか、または(ヘルパーT細胞(Th)によって認識される)免疫系の細胞によって主として発現されるクラスIIのどちらかでありうる。Th細胞はAPC上のMHC II/ペプチド複合体を認識して応答する。次に、これらの細胞によって放出された因子が、Tc細胞もしくは特定の抗原に特異的な抗体産生B細胞の一方または両方の活性化を促進する。事実上全ての免疫応答におけるTh細胞の重要性は、HIV/AIDSで最もよく例示され、HIV/AIDSではウイルスによる破壊によってTh細胞が存在しないことから重症免疫不全が生じ、ついには日和見感染による死亡に至る。Th(およびより少ない程度でTc)の不適当な発達によっても、アレルギー、癌、および自己免疫などの多様な他の状態に至りうる。
そのような細胞の不適当な発達は、構造の構成が顕著に変化した異常な胸腺が原因のおそれがあり、例えば自己免疫疾患の多くでは、成熟胸腺細胞の発達に必要な髄質上皮細胞は未熟T細胞が通常存在する皮質に異所性発現する。これは、発達中の未熟T細胞が後期成熟シグナルを受け取るのが早すぎ、これにより、通常自己反応性の細胞を削除する可能性のある負の選択シグナルに無感受性になることを意味しうる。実際、この種の胸腺異常はループス様症状を発現するNZBマウス(Takeokaら、(1999) Clin. Immunol. 90: 388頁)で発見され、最近ではI型糖尿病を発現するNODマウス(Thomas-Vaslinら、(1997) P.N.A.S. USA 94: 4598頁;Atlan-Gepnerら、(1999) Autoimmunity 3: 249〜260頁)で発見された。これらの形式の胸腺異常がいつ、いかにして発現するかは分からないが、自然の加齢過程によるか、またはウイルス感染(AIDS患者において胸腺の変化が記載されている)、ストレス、化学療法および放射線療法などの破壊因子が原因のおそれがある(Mackallら、(1995) N. Eng. J. Med. 332: 143頁;Heitgerら、(1997) Blood 99: 4053頁;MackallおよびGress、(1997) Immunol. Rev. 160: 91頁)。出生時に欠陥が存在する可能性もある。
抗原を認識する能力は、Tリンパ球およびBリンパ球における原形質膜受容体に包含されている。これらの受容体は、多数の遺伝子が複雑な一連の再配列を行うことによってランダムに発生して、各個別のT細胞またはB細胞が独特の抗原受容体を有するようになる。この莫大な潜在的多様性は、身体が遭遇しうる任意の単一抗原に対して、多数のリンパ球が様々な程度の結合強度(親和性)でその抗原を認識でき、様々な程度の応答を誘発できることを意味する。抗原受容体の特異性は偶然に生じることから、なぜ身体が自己抗原に対して反応するリンパ球によって自己破壊しないかという問題が生じる。幸運にもT細胞およびB細胞がそのようなことを行うことを防止するメカニズムがいくつか存在する。共同で、これらのメカニズムは免疫系が自己に対して寛容である状況を創造している。
最も効率的な自己寛容は、潜在的に反応性の任意のリンパ球をそれらの産生部位で物理的に排除または死滅させることである。これらの部位としては、T細胞についての胸腺およびB細胞についてのBMがある。これは中枢性寛容と呼ばれている。寛容のための重要な追加の方法は、直接またはサイトカインの産生を介したどちらかで自己反応性細胞を阻害する調節性Th細胞による。事実上全ての免疫応答がTヘルパー細胞による開始および調節を必要とすると仮定すると、いかなる寛容誘導の主な目的もこれらのTヘルパー細胞を標的とすることとなるであろう。同様に、Tcは非常に重要なエフェクター細胞であることから、それらを産生させることが、例えば抗癌療法および抗ウイルス療法のための治療方法の主要な目標である。さらに、CD4+CD25+細胞およびNKT細胞などの調節性T細胞(Treg)は潜在的に自己反応性の細胞を抑制できる手段を提供する。
[胸腺]
胸腺は(大部分は上皮細胞サブセットの)多様なストロマ細胞に散在した発達中の胸腺細胞(胸腺内のTリンパ球)から本質的になり、ストロマ細胞は微小環境を構成し、T細胞の最適な発達に必要な増殖因子(GF)および細胞相互作用を提供する。
胸腺はTリンパ球産生の主要な部位であることから、免疫系における重要な器官である。胸腺の役割は、下に記載するように血液から適当なBM由来前駆細胞を誘引し、抗原に対するT細胞受容体(TCR)の産生に必要な遺伝子再配列を含めたT細胞系列への分化の方向付けを誘導することである。各T細胞は単一のTCRを有し、個々に特別な特異性を有する。このTCR産生には細胞分裂が伴い、これによってその型のTCRを有するT細胞数が増大し、よってそれぞれの外来抗原が認識され削除される見込みが増加する。しかし、T細胞が抗原を認識する独特の性質は、B細胞とは異なり、TCRはMHC分子と物理的に会合したペプチド断片を認識するだけである。通常はこれは自己MHCであり、自己MHC/ペプチド複合体を認識する能力またはTCRは胸腺で選択される。この過程は正の選択と呼ばれ、皮質上皮細胞の専門的な特性である。TCRが自己MHC/ペプチド複合体に結合しないならば、T細胞は「無視(neglect)」によって死滅する。それは、T細胞は生存の継続および成熟のためにTCRを介したシグナル伝達をある程度必要とするからである。
TCR遺伝子再配列の結果がランダムなイベントであることから、偶発的に高親和性で自己MHC/ペプチド複合体を認識できる一部のT細胞が発達する。したがって、そのようなT細胞は潜在的に自己反応性であり、多発性硬化症(MS)、慢性関節リウマチ(RA)、糖尿病、甲状腺炎、および全身性エリテマトーデス(SLE)などの自己免疫疾患に関与しうる。幸いにも、自己MHC/ペプチド複合体に対するTCRの親和性が高すぎて、胸腺でT細胞がこの特異的複合体に遭遇した場合、発達中の胸腺細胞は自殺性活性化を受けるように誘導され、負の選択と呼ばれる過程であるアポトーシスによって死滅する。この過程は中枢性寛容とも呼ばれる。そのような「自己に対して高親和性の」T細胞は、応答するよりもむしろ死滅する。それは胸腺でそれらのT細胞はまだ未熟であるからである。胸腺におけるこの負の選択の最も強力な誘導因子は樹状細胞(DC)と呼ばれるAPCである。DCはT細胞に最強のシグナルを送達し、そのシグナルは胸腺における削除を引き起こす。しかし、T細胞がさらに成熟している末梢リンパ器官では、同じTCRに同じMHC/ペプチド複合体を提示しているDCは、TCRを保有しているそのT細胞の活性化を引き起こす。
[胸腺の萎縮と年齢]
胸腺は1日あたりに自己が含むT細胞の約1%を血流に放出しており、機能的免疫系の根幹をなすが、哺乳動物および他の動物の胸腺の明白な異常の一つは、この器官が性ステロイド産生の結果として高度の萎縮を受けることである。この萎縮は約5〜7年にわたり徐々に生じ、年齢約20歳にはT細胞のアウトプットは最低レベルとなり(Douekら、Nature (1998) 396: 690〜695頁)、コルチコステロイドに対するストレス応答の間に誘導される可逆性萎縮と対照的である。構造的には、胸腺の萎縮は、リンパ球含量の漸進的な減損、皮質上皮ネットワークの崩壊、細胞外マトリックス物質の増加、ならびに腺への脂肪細胞(adipocyte)および脂質沈着物の浸潤(Haynesら、(1999) J. Clin. Invest. 103: 453頁)を伴う。この過程は若齢の小児(例えば約5歳;Mackallら、(1995) N. Eng. J. Med. 332: 143頁)でも開始するおそれがあるが、性ステロイドレベルが最大に達する思春期からが最も顕著である。
胸腺萎縮の影響は末梢にも反映され、胸腺からT細胞プールへの投入は低減し、その結果としてTCRレパートリーの多様性が乏しくなる(このTCRレパートリーは新しいナイーブT細胞からのみ供給できることから)。変化したサイトカインプロフィール(Hobbsら、(1993) J. Immunol. 150: 3602頁;Kurashimaら、(1995) Int. Immunol. 7: 97頁)、CD4+およびCD8+サブセットにおける変化、ナイーブT細胞に対し記憶T細胞への偏り(Mackallら、(1995) N. Engl. J. Med.332: 143頁)、ならびに抗原またはマイトジェン刺激に応答する能力の低減も観察される。
胸腺は末梢T細胞プールの産生と維持のための主要部位であることから、この萎縮は高齢者における免疫に基づく障害の発生率の増加の主要原因であると広く主張された。具体的には、全身免疫不全などの状態、日和見感染およびワクチンへの応答性の不足、ならびに多発性硬化症、慢性関節リウマチ、およびループスなどの自己免疫疾患の頻度の増加(Doriaら、(1997) Mech. Age. Dev. 95: 131〜142頁;Weyandら、(1998) Mech. Age. Dev. 102: 131〜147頁;Castle、(2000) Clin Infect Dis 31(2): 578〜585頁;Muraskoら、(2002) Exp. Gerontol. 37: 427〜439頁)は年齢と共に発生率および重症度が増加する。免疫系のそのような不全は、T細胞依存性免疫機能(例えば細胞溶解性T細胞活性およびマイトジェン応答)における減少によって説明されることが多い。健康な個体においてホメオスタシスメカニズムがT細胞数を維持しているが、例えばAIDS、および化学療法または放射線療法後にT細胞の大きな減少があると、成人患者は日和見感染に非常にかかりやすくなる。それは、これらの状態の全てがT細胞および/または他の血液細胞の減少を伴うからである(下記参照)。リンパ球の回復も著しく遅れる。萎縮した胸腺はHIV感染の間に減損したCD4+T細胞を再構成できず(Douekら、Nature (1998) 396:690〜695頁)、思春期前の患者に比べて思春期後の患者では化学療法後にCD4+T細胞が正常レベルに戻るのに3から4倍の時間がかかる(Mackallら(1995) N. Engl. J. Med. 332:143〜149頁)。その結果、これらの患者は感染に応答するのに必要な細胞を欠き、重度の免疫抑制状態になる(Mackallら、(1995) N. Eng. J. Med. 332:143頁; Heitgerら、(2002) Blood 99:4053頁)。その後の人生で癌および腫瘍の負荷も増加する(Hirokawa、(1998)「Immunity and Ageing」PRINCIPLES AND PRACTICE OF GERIATRIC MEDICINE、(M. Pathy編) John Wiley and Sons Ltd;Doriaら、(1997) Mech. Age. Dev. 95: 131頁;Castle、(2000) Clin. Infect. Dis. 31:578頁)。
しかし、Douekら((1998) Nature 396: 690頁)の最近の研究は、(例えば65歳以上や老齢HIV患者への抗レトロウイルス治療後であっても) 老齢ヒトにおいてたとえごくわずか(若齢者レベルの5%)でも胸腺からのアウトプットが起こっていることを示した。これは、T細胞受容体切断環状産物(T Cell Receptor Excision Circle)(TREC)を有するT細胞の存在によって例示された。TRECは、抗原を認識するTCRが生じる際に形成され、新たに産生したT細胞にのみみられる。さらに、TimmおよびThoman ((1999) J. Immunol. 162: 711頁)は、骨髄移植(BMT)後の老マウスにおいてCD4+T細胞が再生するが、それらのT細胞は、高齢末梢微小環境と胸腺からのナイーブT細胞の産生の欠乏とが一緒に原因となって記憶細胞への偏りを示すようである。造血幹細胞移植後のTRECレベルも分析された(Douekら、(2000) Lancet 355: 1875頁)。
[胸腺および神経内分泌軸]
胸腺は神経内分泌系と双方向的な伝達を行うことによって大きく影響を受ける(Kendall、(1988)「Anatomical and physiological factors influencing the thymic microenvironment」THYMUS UPDATE I、第1巻(M. D. KendallおよびM. A. Ritter編) Harwood Academic Publishers、27頁)。特に重要なのは、栄養作用 (甲状腺刺激ホルモンすなわちTSHおよび成長ホルモンすなわちGH)および萎縮作用(黄体形成ホルモンすなわちLH、卵胞刺激ホルモンすなわちFSH、および副腎皮質刺激ホルモンすなわちACTH)を含めた胸腺機能に及ぼす下垂体、副腎、および生殖腺の相互作用である(Kendall、(1988)「Anatomical and physiological factors influencing the thymic microenvironment」THYMUS UPDATE I、第1巻(M. D. KendallおよびM. A. Ritter編) Harwood Academic Publishers、27頁;Homo-Delarcheら、(1993) Springer Sem. Immunopathol. 14: 221頁)。実際、胸腺の生理の特徴的な性質の1つは、構造および機能の進行性衰退であり、これは、ヒトでは12〜14歳以後に一般に発生する思春期頃に、循環中の性ステロイドの産生が増加することに対応している。(HirokawaおよびMakinodan、(1975) J. Immunol. 114: 1659頁; Tosiら、(1982) Clin. Exp. Immunol. 47: 497頁;およびHirokawaら、(1994) Immunol. Lett. 40: 269頁)。
胸腺は、(大部分は上皮細胞サブセットの)多様なストロマ細胞に散在した発達中の胸腺細胞から本質的になり、ストロマ細胞は微小環境を構成し、T細胞の最適な発達に必要な増殖因子および細胞相互作用を提供する。ホルモンの厳密な標的ならびにホルモンが胸腺萎縮および免疫応答の改善を誘導するメカニズムはまだ決定されていない。しかし、睾丸性女性化突然変異マウスを用いた実験は、萎縮が起こるには胸腺のストロマ細胞に機能的性ステロイド受容体が発現しなければならないことを指摘した。分化および成熟を制御する、胸腺細胞と上皮サブセットとが共生的に発達する関係(Boydら、(1993) Immunol. Today 14: 445頁)は、性ステロイドの阻害がどちらの細胞型でも起こる場合があることを意味し、それは次にもう一方の細胞型の状態に影響することを意味する。高齢患者では骨髄幹細胞の数は減少し、質が異なっている。若齢者よりも低い程度ではあるが、HSCは胸腺を再増殖させることができる。このように、胸腺萎縮に影響する主要な因子は胸腺内に存在すると思われる。さらに、(例えば、≧18カ月の)高齢動物における胸腺細胞は少なくともある程度分化する能力を保持する(GeorgeおよびRitter、(1996) Immunol. Today 17: 267頁;Hirokawaら、(1994) Immunology Letters 40: 269頁;Mackallら、(1998) Eur. J. Immunol. 28: 1886頁)。しかし、Aspinallの最近の研究は、高齢マウスにおいて胸腺細胞の産生に欠陥があることを示した。これはトリプルネガティブ前駆細胞集団、すなわちCD44+CD25+(TN2)段階の細胞集団内でのブロックとして明らかとなった(Aspinallら、(1997) J. Immunol. 158: 3037頁)。
[造血]
[骨髄および造血幹細胞]
免疫系の主な細胞は、Bリンパ球およびTリンパ球(白血球の主要クラス)ならびに抗原提示細胞(APC)である。全ての免疫細胞は、造血幹細胞(HSC)ならびにその子孫である共通リンパ系始原細胞(CLP)および共通骨髄系始原細胞(CMP)から得られ、これらの細胞はBMで産生する。前駆細胞の一部は胸腺に遊走し、T細胞および胸腺DCになる。DCは自己寛容の誘導に役割を果たす。
わずかに小さな割合(若齢動物の約0.01%)のHSCがBMから放出され、血液の供給を通過して胸腺にたどり着き、そこでHSCは分裂、成熟してT細胞を形成し、T細胞は次に全身循環に戻る。これらの新たなrecent thymic emigrant)(RTE)細胞は免疫系の主要な部分を形成し、主としてThおよびTcであり、ほぼ全ての免疫応答の開始のために多様なTCRレパートリーを有する新たなT細胞の一定の供給を維持するのに重要である。上記のように、胸腺を離れるT細胞は、体内の細胞の全てを自己として認識し、正常な状況ではそれらの細胞に対して応答しないように胸腺中で「選択」されることから、胸腺を離れる前にThおよびTc細胞は外来抗原を効果的に識別できる。
B細胞もHSCから最終的に得られ、末梢免疫系に存在するようになる前にBMで発達する。T細胞および免疫系の他の細胞と相互作用した後にB細胞は大量の抗体を産生して放出する形質細胞に発達し、抗体は身体が感染性生物および異常細胞を破壊するのを助ける。
BMによって産生される他のHSCも、NK細胞、調節性細胞、共通骨髄系始原細胞由来細胞、好中球、好塩基球および好酸球、樹状細胞、単球、マクロファージ、血小板ならびに赤血球などの他の全ての血液細胞の産生に利用される。
[造血幹細胞移植]
骨髄移植(BMT)としても一般に知られる造血幹細胞移植(HSCT)は、例えばある危険な癌状態において免疫系の回復を増強するために用いられる治療である。「HSCT」および「BMT」および「移植」は相互交換可能に使用され、レシピエントへの、HSC、BM細胞、幹細胞;および/もしくは血液、胸腺、BMを生じる他の任意の細胞;および/もしくはHSC、上皮細胞、共通リンパ系始原細胞(CLP)、共通骨髄系始原細胞(CMLP)、多系列始原細胞(MLP)を含むがそれらに限定されない他の任意の免疫細胞;および/もしくはBMにおける間葉幹細胞を含むか、またはそれらが濃縮された移植として本明細書において定義される。いくつかの実施形態において、移植は末梢血幹細胞移植(PBSCT)でありうる。HSCは、BMから動員された後、血液から回収される場合もあるし、またドナーから物理的に抽出されたBM内に含まれる場合がある。HSCは採取されたBMまたは血液を精製、濃縮したものか、または単にその一部の場合もあり、HSCは次にレシピエントに注入される。移植は同種移植、自己移植、同系移植、または異種移植である場合もあるし、比較的少数の細胞しか必要としない「ミニ移植」を含めた任意の細胞数の移植を含みうる。いくつかの実施形態において、HSCTは性ステロイド阻害前、阻害と同時、または阻害後に施行される。
HSCは、本出願全体で使用される場合、移植および/または遺伝子組み換えされていてもよい限定されない例示的な細胞型である。しかし、当業者に容易に理解されるように、本明細書に提供した本発明を実施するにあたり、過度な実験なしにBM細胞、幹細胞;および/または血液、胸腺、BMを生じる他の任意の細胞;および/またはHSC、上皮幹細胞、CLP、CMLP、MLPを含むがそれらに限定されない他の任意の免疫細胞;および/またはBMにおける間葉幹細胞を含むがそれらに限定されない多数の代理の細胞型のうち任意の1つ(または複数)にHSCを置換できる。ある実施形態では、HSCは胎児の肝臓および/または脾臓由来である。
化学療法および放射線療法はどちらも癌細胞を破壊できる。しかし、特異性を欠くため、これらの治療法は、事実上全ての白血球(WBC)およびBM中のHSCを含めた健康な細胞も死滅させる。患者がHSCTを必要とするのは、WBCおよびHSCのこうした破壊が理由である。HSCTは、例えば化学療法または放射線治療によって損傷した幹細胞およびその子孫細胞を、例えば患者が必要とする血液細胞を最終的に産生できる健康な幹細胞に置換することを可能にする。
HSCTは、白血病およびリンパ腫(血液および免疫系細胞の癌)などの多数の血液癌と、重症複合免疫不全、ファンコーニ貧血、骨髄異形成症候群、アミロイド症、再生不良性貧血、ダイアモンドブラックファン貧血、血球貪食性リンパ組織球症、コストマン症候群、ウィスコットアルドリッチ症候群、血小板減少症、ならびに鎌状赤血球症およびサラセミアなどのヘモグロビン病などの非悪性免疫障害との基本的治療法である。体内から癌細胞を除くために通常は骨髄破壊または骨髄細胞枯渇によって治療される白血病およびリンパ腫では、通常、次いでHSCTを実施して免疫機能を回復させる。本発明の方法は、単独で、またはサイトカイン(例えばG-CSFまたはGM-CSF)もしくは薬物(例えばシクロホスファミド)などのHSC動員剤の投与と組み合わせて、より迅速でかつ/またはより良好な生着を可能とし、化学療法および放射線療法をさらに高用量および/またはさらに高頻度に与えることも可能としうる。
現代の臨床医学の方法は、別のドナーの血液(同種HSCT)から得られたHSCの移植を使用することが多く、この方法で宿主癌細胞に対して反応するドナーT細胞を利用するが(移植片対白血病効果(GVL))、これは一般に宿主に対して反応する他のドナーT細胞によって相殺され(移植片対宿主(GVH)疾患)、これが致死的になりうる。HSCTの成功（患者の生存）は、注入されたHSCの数および生着速度に直接関係することから、本発明の方法の使用は現行のHSCTプログラムがさらに好結果となり、現在可能な数よりもずっと多くの患者がHSCTを受けることができることを意味している。
BMからのHSC動員を増強するメカニズムは、可能な限り多数のHSCがドナーから採取して入手できることを確認する上で重要である。GM-CSFおよびG-CSFはこの目的のために現在使用されているが、化学療法およびサイトカインなどの他の薬剤も有効であることが示されている。さらに効果的にHSCを動員できることにより、血液学的修復を超えた適用が可能である。最近の研究は、HSCが多能であり、損傷した組織、例えば心筋、骨格筋、肝臓、骨、結合組織、上皮組織、膵臓、血管系の修復に利用できることを示した。
現行のHSCT方法の1つの限界は、長期の免疫不全が原因の感染、詳細にはウイルス、真菌および莢膜を有する細菌による感染に関連し、これは成人における移植後の罹患および死亡の重大な原因のままである。HSCTに関連した感染は、最新の抗菌薬を用いても一般に制御が非常に困難である。小児はHSCT後、数カ月で免疫能力を一般に回復する(Parkmanら、(1997) Immunol. Rev. 157: 73頁)、これは、成人レシピエントにおいてリンパ球の回復が遅れ数年かかる場合があり、その後でさえも若齢者の最適をほとんど反映していないことと対照的である。成人におけるこの遅れは多様な要因に依存するが、感染に対する感受性は、年齢に伴うT細胞およびB細胞産生の十分に認識されている減少が主な原因である(Parkmanら、(1997) Immunol. Rev. 157: 73頁)。
現行のHSCT方法の第二の限界は、移植された細胞が細胞のレシピエントを「拒絶」する場合に起こる。これは「移植片対宿主疾患」(GVHD)として臨床的に知られている。自己移植はGVHDを避けることができる。しかし、自己移植の全般的な抗癌成功率は同種移植に比べて低い。癌患者では、自己移植は(GVH作用に類似した)移植片対腫瘍(GVT)作用を生じず、移植と共に癌細胞が患者に戻るリスクがあるという欠点を有する。マウス同種HSCTモデルおよび同種HSCTの去勢レシピエントにおける性ステロイドの阻害は、骨髄系列およびリンパ系列の両方の細胞の移植後再構成を改善することが発見された。本明細書に提示したデータは、GVHDの悪化またはGVT活性の減損なしにT細胞およびB細胞の再構成に顕著な増加を示す(例えば実施例19参照)。
HSCT治療のさらなる限界は、潜在的候補の全てを取り扱うためのドナーが欠如していることである。さい帯血(UCB)がかなり限られた程度で利用されているが、各ドナーからの細胞数はわずかであり、その結果、UCBは必要なHSCの総数が比較的低い小児で主に使用されている(必要なHSCの数は患者の体重に関連している。)UCB以外でもドナーからの供給は限られ、受容できるMHC適合でなければならず、さもなければGVHのリスクが高くなる。生着の改善の結果として少数の細胞しか必要ないか、またはあまり厳密な適合が必要なく、拒絶またはGVHのリスクを低減できるならば、潜在的にHSCTをさらに広く、例えば自己免疫疾患を治療するために使用でき、さい帯血などの供給源を利用できるようになるであろう(例えばレシピエントの生着に1.5×107細胞/kg)。
[T細胞]
T細胞は免疫系の主な構成要素であり、胸腺で生成する。最も重要なT細胞はTh細胞であり、それはTh細胞が事実上全ての免疫応答を開始する細胞であることが理由である。(例えばHIV感染、化学療法、放射線などによって引き起こされる)これらのTh細胞の不在は、免疫抑制、ならびにその結果の感染および腫瘍に対する感受性を直接招き、速やかに死に至る。Th細胞のサブセットの重要な役割は免疫応答を調節することである。T細胞およびB細胞の機能の増強と抑制の間のバランスは、例えばワクチンが有効であるかどうか、癌または腫瘍が攻撃されるかどうか、または移植が寛容されるか拒絶されるかどうかに主な作用を有する。
胸腺は若齢では非常に活性であるが、年齢と共に大きさと機能的アウトプットが徐々に低下する。これは思春期の始まりで特にはっきりとする。胸腺細胞の運び出しは胸腺における細胞充実性に直接関係することから(Scollayら、(1980) Eur. J. Immunol. 10: 210頁;Berzinsら、(1998) J. Exp. Med. 187: 1839頁)、年齢に関係する胸腺萎縮は新鮮胸腺移出(RTE)の漸進的減少(Steffensら、(2000) Clin. Immunol. 97: 95頁;Sempowskiら、(2002) Mol. Immunol. 38: 841〜848頁;Sutherlandら(投稿中))および記憶T細胞に対するナイーブT細胞の比の減少を招き(Ernstら、(1990) J. Immunol. 145: 1295頁);Kurashimaら、(1995) Int. Immunol. 7:97頁;Utsuyamaら、(1992) Mech. Ageing Dev. 63: 57頁)、CD4+およびCD8+T細胞の両方で拘束されたTCRレパートリーを生じる(Mosleyら、(1998) Cell. Imrunol. 189: 10頁;LeMaoultら、(2000) J. Immunol. 165: 2367頁)。その結果、非特異的および受容体介在性(CD3/TCR)刺激に応答するT細胞増殖は年齢と共に大きく弱まる(Hertogh-Huijbregtsら、(1990) Mech. Ageing Dev. 53: 141〜155頁;Flurkeyら、(1992) J. Gerontol.47: B115頁;Kirschmannら、(1992) Cell. Immunol. 139: 426頁)。
年齢の増加と共に、ヒトの免疫機能は徐々に低下する。小児は非常に良好に応答し、青少年は妥当に応答するが、中年以降からはこの応答が非常に乏しくなる。この低下は事実上全ての応答に関与する3つの主要細胞型である(i)(抗原を捕捉しそれをTリンパ球に提示することによって活性化させる)抗原提示細胞、(ii)Tリンパ球、および(iii)Bリンパ球のうちの1つまたは複数における欠乏または変更の存在を示している。これらの3つの細胞型のうち任意の1つにおける欠乏または変更から、抗原に対する刺激に応答した免疫応答がなぜ不十分になるかを説明できる。欠乏または変更は細胞レベルでありうるし、また、量または機能性にもあてはまりうる。性ステロイドの影響が主な原因となって胸腺の機能が年齢と共に劇的に低下することから、これらのうち最も起こり得る欠陥はT細胞区画内に包含される。これによって、新しい抗原に対する応答に必要な、血流に運び出される新しいT細胞、言い換えると「ナイーブ」T細胞の喪失に至る。潜在的に応答するT細胞数の減損以外に、先在するT細胞が性ステロイドの存在によってある程度抑制される場合もある。
[癌療法]
上に指摘したように、癌を治療するために使用される化学療法および放射線療法は、患者の非癌細胞、詳細には血液細胞にしばしば有害である。そのような治療の回数および用量の増加の主な制限は、患者が治療から生還し、損なわれた免疫系の結果として日和見感染を起こしやすくなることを避ける能力による。このように免疫の回復がより迅速であるか、または損傷が比較的重くないならば患者に大いに有益であろう。
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本発明は、性ステロイドおよび他のホルモンのシグナル伝達を妨害することにより、BMの造血および機能性を増強すること、HSCT後のBM生着を増強すること、および先在するT細胞および他の免疫細胞の機能性を増加させることによって患者レシピエントによるドナー移植片受容を増強するための方法に関する。一新された胸腺機能によって産生されたナイーブT細胞、ならびにまた活性化したBM機能を介して産生されたBリンパ球および免疫系の他の細胞のレベル増加によって、免疫能力もまた増強する。
性ステロイドおよび/または他のホルモンシグナル伝達の中断が、直接作用もしくは間接作用のどちらかによって、BM、HSC、T細胞および免疫系の他の細胞の機能性を増強することが発見された。この発見は本発明を作り出すために活用され、本発明は一態様においてBMの造血および/または機能性を増強する方法を提供する。いくつかの実施形態において、先在するBMの造血および/または機能性が改善する。別の実施形態において、患者はHSCTを受け、その患者におけるHSC造血および/または生着が改善する。
一態様において、本発明はHSCT後の生着を増強する方法を提供する。一実施形態において、生着はBMで増強される。別の実施形態において、生着および/または再構成は胸腺において増強され、胸腺の回復が最終的に誘導される。なお別の実施形態において、生着ならびに/または再構成は脾臓および/もしくは他のリンパ器官、組織、ならびに/または血液において増強される。いくつかの実施形態において、HSCは同種であり、他の実施形態において、HSCは自己である。一実施形態において、T細胞前駆細胞数は性ステロイドシグナル伝達の中断を行わずにHSCTを受けた患者に存在する数に比べて増加する。他の実施形態において、総白血球、ドナー由来DC、BM前駆細胞、HSC、CLP、MLP、リンパ球、骨髄細胞、顆粒球、好中球、マクロファージ、NK、NKT、血小板、ナイーブT細胞、記憶T細胞、ヘルパーT細胞、エフェクターT細胞、調節性T細胞、RBC、B細胞、ドナーおよび/もしくは宿主由来末梢T細胞、APC、ならびに/またはドナー由来末梢B細胞は、性ステロイドシグナル伝達の中断を行わずにHSCTを受けた患者に存在する数に比べて増加している。なお別の実施形態において、患者は、免疫の回復および/または生着を増強するために、HSCTの後に、患者は免疫の回復および/または生着を増強するためにHSCTの後にサイトカイン(例えばIL-7、SCF、IL-11、G-CSF、またはGM-CSF)またはホルモン(例えば成長ホルモン、またはそのメディエーターであるインスリン依存性増殖因子(IGF-1)もしくは線維芽細胞増殖因子ファミリーの任意のメンバー、例えばFGF7/ケラチン細胞増殖因子(KGF))を用いても治療する。別の実施形態において、本発明は、単独で、またはサイトカイン(例えばG-CSFまたはGM-CSF)などの増血剤の投与と(同時または連続的に)組み合わせて、より迅速かつ/もしくはより良好な生着および/または標的細胞へのホーミングおよび/または免疫細胞の増強した回復を可能にする。
本発明の第二の態様において、HSCT後の患者における免疫細胞の機能性を増強する方法が提供される。一実施形態において、免疫細胞はT細胞である。別の実施形態において、T細胞受容体(TCR)の刺激に対するT細胞の増殖応答性が改善される。別の実施形態において、抗原(例えば破傷風トキソイド(TT)またはヤマゴボウマイトジェン(PWM))の刺激に対するT細胞の応答性が改善される。一実施形態において、リコール抗原に対するT細胞の応答性が改善される(すなわちT細胞記憶応答の改善)。なお別の実施形態において、補助刺激シグナル伝達または二次シグナル伝達に関するT細胞増殖応答性が改善される。いくつかの実施形態において、T細胞応答性のカイネティクスが改善される。他の実施形態において、APCにより提示された抗原に対するT細胞応答が改善される。本発明のいくつかの実施形態において、免疫細胞の応答性は移植後約5、4、3または2カ月以内に改善される。本発明のある実施形態において、免疫細胞の応答性は移植後約1カ月以内に改善される。本発明の他の実施形態において、免疫細胞の応答性は移植後2週間以内に改善される。本発明の別の実施形態において、免疫細胞の応答性は移植後1週間以内に改善される。本発明のなお他の実施形態において、免疫細胞の応答性は移植後3日以内に改善される。他の実施形態において、治療の3カ月以上後に、この時点で先在するT細胞以外に新たに胸腺由来T細胞からのインプットを伴って免疫応答が改善される。
第三の態様において、本発明は、末梢における免疫細胞を含む（それに限定されない）先在する免疫細胞の機能性を増強する方法を提供する。一実施形態において、細胞はT細胞である。別の実施形態において、細胞はDCまたは他のAPCである。なお別の実施形態において細胞は、NK細胞またはCD4+CD25+T細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞などの調節性細胞である。本発明の一実施形態において、患者におけるTCR刺激に対するT細胞の増殖応答性が改善される。別の実施形態において、抗原(例えばTT、PWM、またはKLM)の刺激に対するT細胞応答性が改善される。なお別の実施形態において、二次シグナル伝達または補助刺激シグナル伝達に対するT細胞の増殖応答が改善される。他の実施形態において、APCにより提示された抗原に対するT細胞応答が改善される。特定の一実施形態において、GnRH/LHRHアナログは先在する免疫細胞の応答性に直接または間接作用を有する。いくつかの実施形態において、LHRH/GnRHアナログなどの性ステロイドアナログ(それに対する作動薬および拮抗薬)が、性ステロイド介在性シグナル伝達、免疫細胞またはBMを妨害するために本発明の方法に使用される。他の実施形態において、性ステロイドアナログは胸腺、BM、ならびに/またはT細胞、B細胞、およびDCなどの免疫系の先在する細胞を直接刺激する(すなわちこれらの機能的活性を直接増大させる)。
第四の態様において、本発明は、患者における、または血液、HSC、もしくはBMドナーにおける、HSCの生着および動員を増強する方法を提供する。一実施形態において、性ステロイドシグナル伝達の妨害は、HSC、CD34+細胞、CLP、もしくはCMPなどの末梢免疫始原細胞の数および/または機能性を増大させる。一実施形態は、性ステロイドシグナル伝達を単独で、あるいはHSC動員剤、例えばサイトカイン、GM-CSF、G-CSF、CSF、化学療法剤、シクロホスファミド、flt-3リガンド、KGF/FGF7もしくはFGFファミリーの他のメンバーまたはIL-7の投与と組み合わせて妨害することを含む、HSC動員を増強するための方法を提供する。
一実施形態において、本発明は化学療法および放射線療法をさらに高用量でおよび/もしくはさらに高頻度で与えることを可能にし、かつ/または化学療法および放射線療法後に免疫系のさらに迅速な回復もしくはさらに軽い損傷を可能にする方法を提供する。
第五の態様において、本発明は性ステロイド介在性シグナル伝達の妨害およびその後の胸腺の再活性化を提供する。一実施形態において、性ステロイド介在性シグナル伝達を妨害するために去勢を使用する。特定の実施形態において、化学的去勢が使用される。別の実施形態において、(例えば精巣の除去または卵巣切除による)外科的去勢が使用される。いくつかの実施形態において、性ステロイドシグナル伝達の完全な阻害が起こる。別の実施形態において、性ステロイドシグナル伝達の部分的妨害が起こる。一実施形態において、去勢は胸腺の状態を思春期前の状態に逆転させることによって胸腺を再活性化する。別の実施形態において、去勢は先在する免疫細胞に例えば直接作用を有することによって免疫細胞の応答性および/または増殖および/または活性化状態を増強する他の分子のレベルを改変する。
第六の態様において、本発明は胸腺への性ステロイド介在性シグナル伝達の妨害およびその後の胸腺の再活性化を提供する。一実施形態において、性ステロイド介在性シグナル伝達の妨害に去勢を使用する。特定の実施形態において、化学的去勢が使用される。別の実施形態において、(例えば精巣の除去または卵巣切除による)外科的去勢が使用される。いくつかの実施形態において、性ステロイドシグナル伝達の完全な阻害が起こる。別の実施形態において、性ステロイドシグナル伝達の部分的妨害が起こる。一実施形態において、去勢は胸腺の状態を思春期前の状態に逆転させることによって胸腺を再活性化する。別の実施形態において、去勢は先在する免疫細胞に例えば直接作用を有することによって免疫細胞の応答性および/または増殖および/または活性化状態を増強する他の分子のレベルを改変する。
ある実施形態において、性ステロイド介在性シグナル伝達は、性ホルモンの産生、作用、結合またはシグナル伝達の修飾剤の投与によって直接または間接的に遮断(例えば阻害、不活性化または無効に)されうる。その修飾剤には性ホルモンもしくはその受容体と結合する薬剤、性ホルモンの作動薬または拮抗薬があるがそれらに限定されず、それらにはLHRH/GnRH、抗エストロゲン剤および抗アンドロゲン剤、SERM、SARM、抗エストロゲン抗体、抗アンドロゲンリガンド、抗エストロゲンリガンド、LHRHリガンド、受動性(抗体性)または能動性(抗原性)抗LHRH(または他の性ステロイド)ワクチン接種、またはそれらの組み合わせ(「遮断薬」)があるがそれらに限定されない。一実施形態において、1つまたは複数の遮断薬が使用される。いくつかの実施形態において、1つまたは複数の遮断薬は徐放性ペプチド製剤で投与される。徐放性ペプチド製剤の例はWO98/08533に提供され、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれている。
本明細書において参照される特許および科学文献は、当業者に利用できる知識を確立している。本明細書に引用された、発行された米国特許、出願、公開された外国出願およびGenBankデータベース配列を含めた参照は、それぞれが参照により組み込まれていると具体的かつ個別に指摘されているのと同程度に、本明細書によってその全体が参照により組み込まれている。
本発明は、胸腺再生なしに、再生前に、または再生と組み合わせた、性ステロイドの除去後および/または性ステロイドシグナル伝達の中断後のBMの機能性を増大させるための方法を含む。「BMの機能を増大させる」および「BMの機能性を増強する」は、本明細書において、HSCT後の造血および/または生着の増強の改善を含めた前駆細胞（例えばBMからのHSC）を含めた免疫細胞の産生および/またはアウトプットにおける改善(および結果としての血液細胞の増加)として定義される。「アウトプットにおける改善」は、末梢または標的組織、具体的には免疫組織もしくは損傷した組織にHSCを含めた免疫細胞を動員する能力の改善を含むが、それに限定されない。一実施形態において、HSCの造血が改善される。別の実施形態において、HSCのアウトプットが改善される。ある実施形態において、血液および/または免疫細胞数が増加する。なお別の実施形態において、HSCT後にHSCの生着が改善される。別の実施形態において、末梢へのHSCの動員または標的組織へのホーミングが改善される。なお別の実施形態において、増殖能および/または造血もしくは非造血性の子孫への分化能が改善される。
本発明は、胸腺再生なしに、再生前に、または再生と組み合わせた性ステロイドの除去後および/または性ステロイドシグナル伝達の中断後のT細胞および他の免疫細胞の機能を増大させるための方法も含む。「免疫細胞」および「免疫系の細胞」という用語は相互交換可能に使用され、本明細書においてHSC、T細胞、B細胞、DC;および/またはHSCの後代を含むがそれに限定されない他の血液細胞;CLP、MLP、リンパ球、骨髄細胞、好中球、顆粒球、好塩基球、好酸球、NK、NKT、血小板、赤血球、単球、マクロファージ、ナイーブT細胞、ならびに前記の前駆細胞として定義される。細胞は末梢性である場合もあるし、またそうでない場合もあり、細胞はBM、血液、脾臓、リンパ節、胸腺、粘膜、皮膚または他の組織の任意の1つまたは複数から見出されうる。
免疫細胞の「増大した」または「増強した機能性」は、性ステロイドの除去なしに通常期待される免疫応答に比べて、免疫細胞が、必要とされる妥当な免疫応答をより提供可能であることを意味する。ある場合には、免疫細胞はT細胞である。他の例では、免疫細胞はB細胞、DC、および/またはHSCである。「増大した機能性」は、標的細胞の殺滅の改善;リンパ球増殖応答の増大;シグナル伝達能の改善;ホーミング能の改善;APC活性化の改善;受容体、細胞接着分子、もしくは補助刺激分子のレベルまたは活性の増大;アポトーシスの減少;サイトカイン、インターロイキン、および他の増殖因子の放出増大;血漿中抗体(Ab)レベルの増大;ならびに血液中および全身における先天免疫(例えばナチュラルキラー(NK)細胞、DC、好中球、マクロファージなど)のレベルの増大があるが、それらに限定されない。
新しいTリンパ球を発生するために、胸腺は前駆細胞を必要とし、これらの前駆細胞は短期間はその器官自体から得ることができるが、3〜4週間後にはそのような前駆細胞は枯渇し、概して骨髄から血液を介して新しい造血幹細胞(HSC)を取り込まなければならなくなる。しかし、たとえ若齢の正常な機能的胸腺でもそのような細胞の取り込みは非常に低く、すなわちホメオスタシスによって調節されたレベルにT細胞産生を維持するのに足る取り込み、それらの細胞はHSCまたはT細胞系列に沿ってすでに選択的に発達した少なくともプロ胸腺細胞に事実上限定されている。性ステロイド阻害時に、胸腺は血中に循環している新しい前駆細胞を非常に受容しやすくなる。血液前駆細胞レベルを増大させることによって、それらの細胞から得られるT細胞は漸進的にT細胞プールに入るようになる。これは、前駆細胞(例えばHSC)に導入された遺伝子が全ての後代T細胞に伝わり、ついには大量のT細胞プールに存在するようになることを意味する。内因性宿主HSCから得られた細胞に対するこれらの細胞の優占レベルは移入される外因性HSCの数を増大させることによって増大しうる。
本発明は、ドナー細胞 (例えばHSC)の投与前、投与と同時、または投与後にドナー同種移植片移植を必要とする患者における性ステロイドシグナル伝達の妨害が、患者によるドナー同種移植片の受容を促進するという発見に由来する。いくつかの実施形態において、患者はドナーからHSCなどの細胞の移入も受ける。胸腺が再活性化するにつれ、新しく改変された免疫系、すなわち同種移植片上の抗原をもはや認識せず、かつ/またはその抗原に対して応答しない免疫系が創出される。言い換えると、同移植片は、外来としてではなく「自己」としてみなされる。
一実施形態において、ドナー細胞の生着またはドナー移植片に対する寛容を改善するために胸腺移植片を本発明の方法に使用できる。いくつかの実施形態において、胸腺移植片は患者が無胸腺の場合、患者の胸腺が再生または再生の促進に抵抗性である場合である。ある実施形態において、寛容を誘導するために胸腺異種移植片が使用される(例えば米国特許第5658564号参照)。他の実施形態において、胸腺同種移植片が使用される。
移植された細胞はHSC、リンパ系前駆細胞、骨髄系前駆細胞、上皮幹細胞またはそれらの組み合わせでありうる。本発明は、細胞の取り込みおよび/またはT細胞への細胞の分化を促進するこれらの細胞の送達のための新しい方法も提供する。移植された細胞は遺伝子組み換えされている場合もあるし、またそうでない場合もある。細胞は胸腺が本発明の方法によって再活性する過程にある患者に注入される。任意選択で改変された幹細胞および始原細胞が胸腺に取り込まれT細胞、樹状細胞, NK細胞、および胸腺で産生される他の細胞に転換する。移植された細胞に遺伝子組み換えが存在する場合、これらの新しい細胞のそれぞれが親幹細胞/始原細胞の遺伝子組み換えを含むことになる。
いくつかの実施形態において、胸腺が再活性化し始めたときに細胞を患者に投与する。他の実施形態において、胸腺の再生なしに、再生前に、または再生と同時に細胞を投与する。なお他の実施形態において、性ステロイド介在性シグナル伝達の妨害が開始したときに細胞を投与する。一実施形態において、幹細胞をレシピエントに移植する。幹細胞は、造血幹細胞、上皮幹細胞、またはそれらの組み合わせでありうる。別の実施形態において、始原細胞はレシピエントに移植される。始原細胞は、リンパ系始原細胞、骨髄系始原細胞、またはそれらの組み合わせでありうる。なお別の実施形態において、細胞はCD34+またはCD34lo HSCである。いくつかの実施形態において、移植された細胞は自己細胞である。他の実施形態において、移植された細胞は非自己細胞である。
非自己(ドナー)細胞が使用されるイベントにおいて、胸腺再活性の過程中にこれらの細胞に対する寛容が作り出される。性ステロイド介在性シグナル伝達の遮断の開始中または開始後に、関連する(遺伝子組み換え(GM)または非遺伝子組み換えされた)ドナー細胞がレシピエントに移植される。
ドナー細胞はレシピエントに属するとして胸腺によって受容され、胸腺が新しいT細胞およびDCを産生する一部となる。結果として生じたT細胞集団は、レシピエントおよびドナーの両方を自己として認識し、それによってドナーからの移植片に対する寛容を創出する。移植片はドナーの細胞、組織もしくは器官、またはそれらの組み合わせでありうる。
本明細書において定義されるように、患者において「寛容を創出する」または「寛容を誘導する」という句および他の類似の句は、完全および部分的な寛容誘導を指す(例えば患者は本発明の方法によって治療されていない患者に比べて移植片に対してさらに寛容になるか完全に寛容になるかのどちらかでありうる)。当技術分野で公知の方法を用いて、例えばMLR反応によって寛容の誘導を試験できる。
一実施形態において、本発明の方法は、特定抗原による攻撃に抵抗性の免疫系を産生するために遺伝子組み換えしたHSC、リンパ系始原細胞、骨髄系始原細胞、上皮幹細胞またはそれらの組み合わせ(まとめてGM細胞と呼ぶ)を使用する。
レシピエントの胸腺は下にさらに詳細に記載するように性ステロイド介在性シグナル伝達を妨害する方法によってついには再活性化しうる。この妨害はレシピエントのホルモン状態を逆転する。ある実施形態において、レシピエントは思春期後である。本発明の方法によれば、レシピエントのホルモン状態は逆転して、レシピエントのホルモンが思春期前のレベルに近づく。レシピエントにおける性ステロイドホルモンのレベルを低下させることによって、胸腺へのこれらのホルモンのシグナル伝達は低下し、それによって胸腺が再活性化することが可能になる。
上に記載するように、高齢(思春期後) 胸腺は身体の免疫系を(若齢の思春期前の胸腺にみられるような)ピークレベルよりも低いレベルで機能させる。「思春期後」は、本明細書において胸腺が実質的に萎縮に達した時期として定義される。ヒトにおいて、これは年齢約20〜25歳で起こるが、所定の個体ではその前後で起こる場合がある。「思春期」は本明細書において胸腺が萎縮し始めるが、完全に萎縮する前でありうる時期として定義される。ヒトにおいてこれは年齢約10〜20歳から起こるが、所定の個体ではその前後で起こる場合がある。「思春期前」は本明細書において個体における性ステロイドが増加する前の時期として定義される。ヒトにおいてこれは年齢約0〜10歳で起こるが、所定の個体ではその前後で起こる場合がある。
「レシピエント」、「患者」および「宿主」は相互交換可能に使用され、本明細書において性ステロイド除去療法および/もしくは性ステロイド介在性シグナル伝達を中断するための治療法を受ける被験者、ならびに/または適当な場合にHSC移植を受ける被験者として定義される。「ドナー」は、本明細書において同系、同種または異種でありうる移植の供給源として定義される。いくつかの場合において、患者は後の時点でその患者に移植するためのその患者自身の自己細胞を提供しうる。同種HSC移植片を使用でき、そのような同種移植片は同種の不適合メンバーの間で起こるものであり、一方、異種HSC移植片においてドナーおよびレシピエントは異なる種である。適合した動物間での同系HSC移植片も使用できる。HSC移植片に関して「適合」、「不適合」、「非適合」および「非同一」という用語は、本明細書においてドナーおよびレシピエントのMHCおよび/または副組織適合性マーカーが同じである(適合している)か、そうでない(不適合、非適合または非同一である)こととして定義される。
移植片または他の外因性抗原に対する患者における寛容を「改善」、「増強」、または「増大」するという用語は、本明細書において移植片または他の外因性抗原に対する患者の寛容が、性ステロイドシグナル伝達の妨害を有さない患者にさもなければ起こったであろう寛容に比べて改善しているという意味として定義される。
胸腺の「再生」、「再活性化」および「再構成」 という用語ならびにそれらの派生語は、本明細書において相互交換可能に使用され、本明細書において萎縮または(例えば化学物質、放射線、移植片対宿主疾患、感染症、遺伝的素因によって)損傷した胸腺の活性状態への回復として定義される。「活性状態」は、本明細書において性ステロイドホルモン介在性シグナル伝達が妨害された患者における胸腺が思春期前の胸腺(すなわち思春期に達していない患者における胸腺)のアウトプットの少なくとも10%、または少なくとも20%、または少なくとも40%、または少なくとも60%、または少なくとも80%、または少なくとも90%であるT細胞のアウトプットを達成することを意味するとして定義される。
性ステロイドが駆動する成熟および免疫系を有する、哺乳動物および有袋動物などの任意の(ヒトを含めた)動物種で本発明を使用できる。いくつかの例において、ヒトなどの大型哺乳動物で本発明を使用する。
本明細書全体で、「含む」または「含んでいる」などの変形は、述べられた要素、完全体もしくは工程、または要素、完全体もしくは工程の群の包含を意味するが、他の任意の要素、完全体もしくは工程、または要素、完全体もしくは工程の群の除外を意味しないものとする。
性ステロイド介在性シグナル伝達の妨害
本発明は患者における性ステロイド介在性シグナル伝達の妨害方法をさらに提供し、ここで患者の胸腺はその後再活性化される場合もあるし、再活性化されない場合もある。追加的に、本発明は患者の免疫細胞(例えばT細胞)の機能的状態を改善する方法を提供する。T細胞に関して、胸腺は初期前駆細胞(CD3-CD4-CD8-細胞)の増殖速度を増大させ始め、それらの細胞をCD4+CD8+細胞に、その後新しい成熟したCD3hiCD4+CD8-(Tヘルパー(Th)リンパ球)またはCD3hiCD4-CD8+(細胞傷害性Tリンパ球(CTL))に転換する。若返った胸腺は、血流からHSCもしくは他の幹細胞、またはT細胞を形成できる始原細胞の取り込みを増大させ、それらの細胞を新しいT細胞および胸腺内DCに転換する。胸腺における活性増加は、正常な若齢胸腺(例えば思春期前の患者)にみられるのと多くの様式で類似している。この若返った胸腺アウトプットの結果として血中のナイーブT細胞(まだ抗原に遭遇していないT細胞)のレベルが増加する。末梢T細胞が例えば抗CD28Abの交差結合もしくは例えば抗CD3抗体を用いたTCR刺激による刺激、またはヤマゴボウマイトジェン(PWM)などのマイトジェンを用いた刺激に応答する能力も増加し、このT細胞応答性の増加は、2、3、4、56、7、14、または21日以内などの胸腺再生前に起こりうる。
追加的に非自己(ドナー)細胞がレシピエントである患者に移植されるイベントにおいて、これらの細胞に対する寛容が胸腺再活性化の過程の間に創出される。性ステロイド介在性シグナル伝達の遮断の開始中またはその後に、関連する(遺伝子組み換え(GM)されたか、または遺伝子組み換えされていない)ドナー細胞がレシピエントに移植される。これらの細胞はレシピエントに属するとして胸腺に受容され、胸腺による新しいT細胞およびDC産生の一部となる。結果として生じたT細胞集団はレシピエントおよびドナーの両方を自己として認識し、それによってドナーからの移植片に対する寛容を創出する。
本明細書において使用する「性ステロイド除去」、「性ステロイド介在性シグナル伝達の阻害」、「性ステロイド妨害」「性ステロイドシグナル伝達の中断」および他の類似した用語は、本明細書において直接作用または間接作用のいずれにせよ性ステロイド(および/または他のホルモン)の産生および/または性ステロイド(および/または他のホルモンの)シグナル伝達の少なくとも部分的な妨害と定義される。一実施形態において、胸腺への性ステロイドシグナル伝達は中断される。容易に理解されるように、性ステロイド介在性シグナル伝達を当業者に周知の一連の方法で妨害でき、そのいくつかを本明細書に記載する。例えば、性ステロイド作動薬および/もしくは拮抗薬の投与、または能動性(抗原性)もしくは受動性(抗体性)抗性ステロイドワクチン接種の投与などの、性ホルモンの産生阻害または1つもしくは複数の性ホルモン受容体の遮断は望みの妨害を成し遂げる。
性ステロイド介在性シグナル伝達の妨害を創出するための限定されない方法は、去勢による。去勢の方法には化学的去勢および外科的去勢があるが、それらに限定されない。
「去勢」は、本明細書において体内の性ステロイドの産生、作用および/または分布の低減または消失として定義される。去勢は、患者を去勢直前よりも胸腺がさらに完全に機能している思春期前の状態に最終的に効果的に戻す。外科的去勢は患者の生殖腺を取り除く。外科的去勢の方法は、日常的に訓練された獣医師および医師に周知である。雄性動物を去勢するための限定されない方法を下の実施例に記載する。ヒト患者を去勢するための他の限定されない方法には、(女性を去勢するための)子宮摘出および卵巣切除処置ならびに(男性を去勢するための)精巣を取り除くための外科的去勢がある。一部の臨床例では、物理的去勢による生殖腺の永久排除が適当な場合がある。
化学的去勢は永続性の低い種類の去勢である。本明細書に定義されるように、「化学的去勢」は、体内の性ステロイドの産生、作用、および/または分布の低減または消失をもたらす化学物質をある期間投与することである。多様な化学物質がこのように機能できる。そのような化学物質の限定されない例は、下記の性ステロイド阻害剤および/またはアナログである。化学物質を送達する間およびその後の期間に患者のホルモン産生は調整されるか、または低減しうる。去勢は、化学物質の送達の終了によって、または関連する性ホルモンの送達によって逆転しうる。
「性ステロイドアナログ」、「性ステロイド除去剤」、「性ステロイド阻害剤」、「性ステロイドシグナル伝達の阻害剤」、「性ステロイドシグナル伝達修飾剤」、および他の類似した用語は、本明細書において性ステロイド(および/または他のホルモン)介在性シグナル伝達を減少、妨害、防止、または撤廃する任意の1つまたは複数の医薬として定義される。GnRH(本明細書においてLHRHまたはGnRH/LHRHとも呼ばれる)およびそのアナログは、本出願全体に使用される性ステロイドシグナル伝達の限定されない例示的な阻害剤である。しかし、当業者に容易に了承されるように、本明細書に提供された発明を実施するにあたり、過度の実験を行うことなしに、GnRH/LHRHまたはそのアナログを、本明細書に記載される多数の代替の性ステロイド阻害剤もしくはアナログ(または他の遮断薬または物理的去勢)のうちの任意の1つ(または複数)に置換できる。
性ステロイドを除去するか、または性ステロイド介在性シグナル伝達を中断する任意の医薬または他の去勢法を本発明の方法に使用できる。例えば、性ステロイドシグナル伝達を阻害し、胸腺を再活性化し、かつ/またはBMおよび免疫細胞の機能性を増強する限定されない一方法は、下垂体に及ぼすGnRHの正常な作用(すなわちゴナドトロピンであるFSHおよびLHの放出)を改変し、その結果生殖腺からの正常な性ステロイドの産生または放出を低減させることによる。このように、1つの場合では性ステロイド除去はGnRHアナログなどの1つまたは複数の性ホルモンアナログを投与することによって達成される。GnRHは下垂体ゴナドトロピンである黄体形成ホルモン(LH)および卵胞刺激ホルモン(FSH)の分泌を刺激する視床下部デカペプチドである。このように、(例えばSynarel(登録商標)またはLupron(登録商標)の形の)GnRH作動薬は、初め受容体の過剰刺激を生じ、フィードバックメカニズムを介してLHRH受容体を脱感作することにより下垂体からのFSHおよびLHの産生を抑制する。これらのゴナドトロピンは普通は生殖腺に作用し、性ステロイド、具体的には女性ではエストロゲン、男性ではテストステロンを放出させる。その放出はFSHおよびLHの不在によって顕著に低減する。この直接の結果は、性ステロイドの血漿中レベルの急低下であり、その結果として胸腺に阻害シグナルが連続的に放出される。循環中の性ステロイドレベルのさらに急激な急低下を、例えばGnRH拮抗薬の使用によって達成できる。
いくつかの実施形態において、性ステロイド介在性シグナル伝達は、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)のアナログなどの性ステロイドアナログの投与によって妨害される。性ステロイドアナログならびに治療法および化学的去勢へのそれらの使用は周知である。性ステロイドアナログは市販されており治療法および化学的去勢へのそれらの使用は周知である。そのようなアナログには以下のLHRH受容体(LHRH-R)の作動薬があるが、それらに限定されない: ブセレリン（Buserelin）(例えば酢酸ブセレリン、商品名Suprefact(登録商標)(例えば0.5〜02mg s.c./日)、Suprefact Depot(登録商標)、およびSuprefact(登録商標)鼻腔スプレー(例えば鼻孔あたり2μg、8時間毎)、Hoechst、米国特許第4003884号、第4118483号、および第4275001号にも記載);Cystorelin(登録商標)(例えばゴナドレリン二酢酸塩四水和物、Hoechst);デスロレリン(deslorelin)(例えば酢酸デソレリン(desorelin acetate)、Deslorell(登録商標)、Balance Pharmaceuticals);ゴナドレリン(例えばゴナドレリン塩酸塩、商品名Factrel(登録商標)(100μg i.v.またはs.c.)、Ayerst Laboratories);ゴセレリン(Goserelin) (酢酸ゴセレリン、商品名Zoladex(登録商標)、AstraZeneca、オークランド、ニュージーランド、米国特許第4100274号および第4128638号ならびにGB9112859およびGB9112825にも記載);ヒストレリン(histrelin)(例えば酢酸ヒストレイン、Supprelin(登録商標)、(s.c.、10μg/kg.日)、Ortho、EP217659にも記載);ロイプロリド(Leuprolide) (酢酸ロイプロリド、商品名Lupron(登録商標)またはLupron Depot(登録商標);Abbott/TAP、レークフォレスト、イリノイ州、米国特許第4490291号、第3972859号、第4008209号、第4992421号、および第4005063号、ならびにDE2509783にも記載);ロイプロレリン(leuprorelin)(例えば酢酸ロイプロレリン、商品名Prostap SR(登録商標)(例えば単回用量3.75mgをs.c.またはi.m./月)、Prostap3(登録商標)(例えば単回用量11.25mg、s.c.、3カ月毎)、Wyeth、米国、Ploskerら、(1994) Drugs 48: 930頁にも記載);ルトレリン(lutrelin)(Wyeth、米国、米国特許第4089946号にも記載); メテレリン（Meterelin）(登録商標)(例えばAvorelina(例えば10〜15mgの徐放性製剤)、EP23904およびWO91/18016にも記載);ナファレリン(Nafarelin) (例えば商品名Synarel(登録商標)(i.n.200〜1800μg/日)、Syntex、米国特許第4234571号、WO93/15722、およびEP52510にも記載);およびトリプトレリン(triptorelin)(例えばパモ酸トリプトレリン、商品名Trelstar LA(登録商標)(3カ月かけて11.25mg)、Trelstar LA Debioclip(登録商標)(プレフィル、単回投与送達)、LA Trelstar Depot(登録商標)(1カ月かけて3.75mg)、およびDecapeptyl(登録商標)、Debiopharm S.A.、スイス、米国特許第4010125号、第4018726号、第4024121号および第5258492号ならびにEP364819にも記載)。LHRHアナログには以下のLHRH-Rの拮抗薬もあるがそれらに限定されない:アバレリクス(abarelix)(商品名Plenaxis(商標)(例えば1、15および29日目、その後4週間毎に100mg、i.m.)、Praecis Pharmaceuticals, Inc.、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)およびセトロレリクス(cetrorelix)(例えば酢酸セトロレリクス、商品名Cetrotide(商標)(例えば0.25または3mg s.c.)、Zentaris、フランクフルト、ドイツ)。追加の性ステロイドアナログには、ユーレクシン（ユーレクシン）(登録商標)(例えばフルタミド(例えば2カプセル2回/日、総量750mg/日)、Schering-Plough Corp.、FR7923545、WO86/01105およびPT100899にも記載)、およびジオキサン誘導体(例えばEP413209に記載)、ならびにEP181236、米国特許第4608251号、第4656247号、第4642332号、第4010149号、第3992365号、および第4010149号に記載されているような他のLHRHアナログがある。作動薬の組み合わせ、拮抗薬の組み合わせ、および作動薬と拮抗薬との組み合わせも含まれる。本発明の限定されない一アナログはデスロレリン(deslorelin)である(米国特許第4218439号に記載)。さらに広範囲のリストについては、Vickeryら、(1984) LHRH AND ITS ANALOGS: CONTRACEPTIVE & THERAPEUTIC APPLICATIONS(Vickeryら編) MTP Press Ltd.、ランカスター、ペンシルベニア州を参照のこと。当業者に周知である酢酸塩、クエン酸塩、およびその他の塩などの修飾された形でも各アナログを使用できる。
性ステロイド除去剤の投与の限定されない一例は、GnRH作動薬の「持続放出」デポー剤の皮下/皮内注射(例えば1、3または4カ月のLupron(登録商標)注射液)またはGnRH含有「持続放出」インプラントの皮下/皮内注射(例えば1または3カ月Zoladex(登録商標)、例えば3.6または10.8mg埋込み)である。適当な製剤に応じてこれらを筋肉内(i.m.)、静脈内(i.v.)または経口的に与えることもできる。別の例は、例えば約30mgのLupron(登録商標)(例えばLupron Depot(登録商標)(デポー懸濁液用酢酸ロイプロリド)TAP Pharmaceuticals Products, Inc.、レークフォレスト、イリノイ州)を含有する「デポー剤」または「含浸埋込み剤」の皮下注射による。Lupron(登録商標)注射液30mgは、4カ月間性ステロイドを除去し、胸腺を若返らせ新しいナイーブT細胞を血流に運び出すことを可能にするのに十分である。
本明細書に記載される性ステロイドシグナル伝達を阻害するメカニズムの多くは周知であり、これらの薬物の一部、具体的にはGnRH作動薬は、乳癌および前立腺癌を含めたいくつかのホルモン感受性癌、子宮内膜症、生殖器障害、多毛症、早発思春期、性的異常などの生殖器官の障害の治療ならびに生殖能力の制御に長年使用されてきた。
ある実施例において、患者の胸腺は性ステロイド除去および/または性ステロイド介在性シグナル伝達の中断もしくは妨害によって最終的に再活性化する。いくつかの場合において、妨害は患者のホルモン状態を逆転させる。本発明の方法によれば、レシピエントのホルモン状態は逆転して、レシピエントのホルモンは思春期前のレベルに近づく。レシピエントにおける性ステロイドホルモンレベルを低下させることにより、胸腺へのこれらのホルモンのシグナル伝達を低下させ、それによって胸腺が再活性化することが可能となる。患者は思春期もしくは思春期後の場合もあるし、また患者は少なくとも部分的に胸腺を萎縮させた疾患を有する(もしくは有していた)場合もある。あるいは、疾患の治療が少なくとも部分的に患者の胸腺を萎縮させたような疾患の治療を患者は受けている(または受けた)。そのような治療は抗ウイルス治療、免疫抑制、化学療法、および/または放射線治療でありうる。他の実施形態において、患者は更年期であるか、または例えば外傷、薬物などの別の手段によって性ステロイド(または他のホルモンレベル)が減少している。
性ステロイドの除去または性ステロイド介在性シグナル伝達の中断は、BMおよび/または免疫系の細胞に1つまたは複数の直接作用を有し、その作用において機能性が改善される。作用は胸腺再活性化前に、または再活性化と同時に起こりうる。
いくつかの実施形態において、性ステロイドの除去または性ステロイドシグナル伝達の阻害は、アンドロゲン遮断薬などの抗アンドロゲン(例えばビカルタミド、商品名Cosudex（コスデックス）(登録商標)またはCasodex(登録商標)、5〜500mg、例えば50mg、po、1日4回、AstraZeneca、オークランド、ニュージーランド)を単独、またはLHRHアナログもしくは他の任意の去勢法と組み合わせて投与することによって達成される。性ステロイドの除去または性ステロイドシグナル伝達の中断は、酢酸シプロテロン(商品名Androcor(登録商標)、Shering AG、ドイツ;例えば10〜1000mg、100mg就寝時もしくは1日3回、または300mg、IM、1週間1回、プロゲスチンとして作用する17-ヒドロキシプロゲステロン酢酸塩)を単独またはLHRHアナログもしくは他の任意の去勢法と組み合わせて投与することによっても達成されうる。他の抗アンドロゲンも使用できる(例えばリアロゾール(Liazol(登録商標)、例えば150mg/日、アロマターゼ阻害剤)およびケトコナゾール、フルタミド(商品名Euflex(登録商標)およびユーレクシン(登録商標)、Shering Plough Corp、ニュージャージー州;50〜500mg、例えば250または750mg、po、1日4回)、酢酸メゲストロール(Megace(登録商標)、例えば480〜840mg/日またはニルタミド(商品名Anandron(登録商標)およびNilandron(登録商標)、Roussel、フランス、例えば経口、150〜300mg/日)などのイミダゾール系の抗真菌剤)。抗アンドロゲンは、GnRHアナログによる発赤に対処するために通常利用されることから、治療において、しばしば重要である。抗アンドロゲンには、アンドロゲン受容体の移行を阻害することによって働くものがあり、そのことは負のフィードバックを中断する結果、テストステロンレベルが増加し、性欲/性交能の喪失を最小に抑える。本発明に有用な別のクラスの抗アンドロゲンは、選択的アンドロゲン受容体モジュレーター(SARM)(例えばキノリン誘導体であるビカルタミド(商品名Cosudex(登録商標)またはCasodex(登録商標)、上記)およびフルタミド(商品名ユーレクシン(登録商標)、例えば経口、250mg/日))である。他の周知の抗アンドロゲンには両方の5アルファレダクターゼイソ酵素を阻害し結果としてさらに大きくさらに迅速なDHT抑制を生じる5アルファレダクターゼ阻害剤(例えばデュタステリド、(例えばpo、0.5mg/日));5アルファレダクターゼ2およびその結果としてのDHT産生を阻害するがテストステロンおよびLHレベルにはほとんどまたは全く作用を有さないフィナステリド(商品名Proscar(登録商標);0.5〜500mg、例えば5mg、po、1日1回)がある。
他の実施形態において、性ステロイドの除去または性ステロイドシグナル伝達の阻害は、抗エストロゲンを単独またはLHRHアナログもしくは他の任意の去勢法と組み合わせて投与することによって達成される。一部の抗エストロゲン(例えばアナストロゾール(商品名Arimidex(登録商標))およびフルベストラント(商品名Faslodex(登録商標)、10〜1000mg、例えば250mg、IM、1カ月1回)はエストラジオールに類似した高い親和性でエストロゲン受容体(ER)に結合し、その結果エストロゲンの結合を阻害することによって作用する。Faslodex(登録商標)の結合は、FSHおよびLHレベルに重大な変化を起こさずに受容体に対するコンホメーション変化およびエストロゲン受容体のダウンレギュレーションも誘発する。抗エストロゲンの他の限定されない例は、タモキシフェン(商品名Nolvadex(登録商標));作動薬/拮抗薬の混合特性を有する非ステロイド系ERリガンでありゴナドトロピンの放出を刺激するクロミフェン(商品名Clomid(登録商標))、例えば50〜250mg/日;エストロンに類似するがそれよりも大きいエストロゲン活性を示し、よってエストロゲン作動薬とみなされるが、アンドロゲン受容体およびエストロゲン受容体の両方に結合して下垂体によるFSHおよびLH産生へのフィードバック阻害を誘導するジエチルスチルベストロール((DES)、商品名Stilphostrol(登録商標))例えば1〜3mg/日、2リン酸ジエチルスチルベストロール、例えば50から200mg/日;ならびにそれぞれ拮抗薬として働くダナゾール、ドロロキシフェン、およびヨードキシフェン(iodoxyfene)である。単独または他の去勢法と組み合わせて使用できる別なクラスの抗エストロゲンは、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)(例えばトレミフェン(商品名Fareston(登録商標)、5〜1000mg、例えば60mg、po、1日4回)、ラロキソフェン(raloxofene)(商品名Evista(登録商標))、および骨および心血管系においてエストロゲン受容体での作動薬として、ならびに乳腺においてエストロゲン受容体での拮抗薬として挙動するタモキシフェン(商品名Nolvadex(登録商標)、1〜1000mg、例えば20mg、p
o、1日2回)である。エストロゲン受容体ダウンレギュレーター(ERD)(例えばタモキシフェン(商品名Nolvadex(登録商標)))も本発明に使用できる。
単独または他の去勢法と組み合わせて使用できる性ステロイドシグナル伝達を阻害する方法の限定されない他の例には、アロマターゼ阻害剤および他の副腎遮断薬 (例えばアミノグルテチミド、ホルメスタン、ヴォラゾール、エキセメスタン、エストラジオールを低下させLHおよびテストステロンを増大させるアナストロゾール(商品名Arimidex(登録商標)、0.1〜100mg、例えば1mg、po、1日4回))、レトロゾール(商品名Femara(登録商標)、0.2〜500mg、例えば2.5mg、po、1日4回)、ならびにエキセメスタン(商品名Aromasin(登録商標))1〜2000mg、例えば25mg/日);アルドステロン拮抗薬(例えばアンドロゲンチトクロムP-450受容体を遮断するスピロノラクトン(商品名Aldactone(登録商標)、例えば100から400mg/日))および選択的アルドステロン受容体拮抗薬であるエプレレノン)、抗プロゲストゲン(例えば、テストステロン合成およびLH合成を阻害する酢酸メドロキシプロゲステロン、例えば5mg/日);ならびにプロゲスチンおよび選択的プロゲステロン応答モジュレーター(SPRM)などの抗プロゲスチン(例えば酢酸メゲストロール、例えば160mg/日、ミフェプリストン(RU486、Mifeprex(登録商標)、例えば200mg/日);ならびにエストロゲン/抗エストロゲン活性を有する他の化合物(例えばフィトエストロゲン、フラボン、イソフラボンおよびクメスタン誘導体、リグナン、ならびにフェノール環を有する工業化合物(例えばDDT))がある。また、抗GnRHワクチン(例えばHsuら、(2000) Cancer Res. 60: 3701頁;Talwar、(1999) Immunol. Rev. 171: 173〜92頁参照)または前記の薬物によって産生される作用を模倣する他の任意の医薬も使用できる。さらに、胸腺および/またはBM特異的にターゲティングできるステロイド受容体に基づくモジュレーターも開発され使用され得る。性ステロイドシグナル伝達を阻害するこれらのメカニズムの多くは周知である。酢酸塩、クエン酸塩およびその他の塩などの修飾された形でも各薬物は使用でき、このことは当業者に周知である。
ホルモン系の複雑でからみ合ったフィードバックメカニズムが原因で、性ステロイドの投与の結果として性ステロイドシグナル伝達の阻害が生じうる。例えば、エストラジオールはゴナドトロピン産生およびGnRHの作用に対する感受性を減少させる。しかし、より高レベルのエストラジオールはゴナドトロピンの急増を招く。同じく、プロゲステロンはLH放出の頻度および量に影響する。男性においてテストステロンはゴナドトロピン産生を阻害する。男性に投与されたエストロゲンはLHおよびテストステロンを減少させ、抗エストロゲンはLHを増加させる。
他の実施形態において、患者におけるプロラクチンを阻害する。性ステロイド介在性シグナル伝達を阻害する別の手段は、プロラクチンレベルの直接または間接モジュレーションによる場合がある。プロラクチンは、プロホルモンとして合成される一本鎖タンパク質ホルモンである。プロラクチンの正常値は男性および妊娠していない女性で概して約0から20ng/mlの範囲であるが、妊娠している場合はその範囲は概して約10から300ng/mlである。全体で、プロラクチンには数百の異なる作用が報告されている。プロラクチンは女性における乳房の発達および母乳の産生を刺激する。プロラクチンの異常は下垂体腫瘍、月経不順、不妊症、インポテンス、および乳汁漏出症(母乳産生)に関与することが知られている。かなりの量の研究が、正常免疫応答および病的免疫応答におけるプロラクチンの役割を詳細に説明するために進行中である。プロラクチンは免疫機能のいくつかの側面において調整的な役割を有するようであるが、高プロラクチン血症は免疫抑制性であると示唆する事実がある(Matera L、1997 Neuroimmunomodulation、7〜8月、4(4): 171〜80頁)。薬用量のプロラクチンの投与は、敗血症マウスにおける生存減少および細胞性免疫機能の阻害に関連している(Oberbeck R、2003 J Surg Res. 8月、113(2): 248〜56頁)。プロラクチンのドーパミン作動性阻害を不全にして高プロラクチン血症を生じる薬物も多数存在する。抗ドーパミン作動薬には、上部消化管の運動障害の治療に臨床的に開発されたハロペリドール、フルフェナジン、スルピリド、メトクロプラミドおよび消化管運動改善薬(例えばブロモプリド、クレボプリド、ドンペリドン、およびレボスルピリド)がある。
ゴナドトロピンに応答して生殖腺で作られるインヒビンAおよびBペプチドは、下垂体をダウンレギュレートしFSHを抑制する。アクチビンは、普通はGnRH受容体をアップレギュレートしFSH合成を刺激するが、過剰産生は性ステロイド産生を停止しうる。このように、これらのホルモンは性ステロイド介在性シグナル伝達の阻害の標的にもなりうる。
ある実施形態において、LHRH-R拮抗薬の後でLHRH-R作動薬が患者に送達される。例えば、5〜8日以内に去勢を引き起こす(例えばアバレリクスではこれが普通である)のに十分な用量の単回注射として拮抗薬を投与できる。性ステロイドがこの去勢レベルに達したときに作動薬を与える。このプロトコールは、性ステロイドの産生が減少する前の、作動薬の投与によって生じるおそれのある性ステロイド産生のいかなる急上昇も撤廃または制限する。代替の実施形態において、LHRH-R拮抗薬の事前投与を行った場合または行わなかった場合において、性ステロイド産生の急上昇をほとんどまたは全くもたらさないLHRH-R作動薬が使用される。
[性ステロイドシグナル伝達の阻害]
性ステロイドは多数のアンドロゲン、エストロゲンおよびプロゲスチンファミリーのホルモン分子を含む。プロゲスチンファミリーのC21ステロイドの限定されないメンバーには、プロゲステロン、17α-ヒドロキシプロゲステロン、20α-ヒドロキシプロゲステロン、プレグナンジオン、プレグナンジオール、およびプレグネノロンがある。アンドロゲンファミリーのC19ステロイドの限定されないメンバーには、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテステロン(DHT)、アンドロスタンジオン、アンドロスタンジオール、デヒドロエピアンドロステロンおよび17α-ヒドロキシアンドロステンジオンがある。エストロゲンファミリーのC17ステロイドの限定されないメンバーには、エストロン、エストラジオール-17α、およびエストラジオール-17βがある。
性ステロイドによるシグナル伝達は、生合成、分泌、代謝、区画化および作用を含めた経路の構成要素の複雑な成果の最終結果である。この経路の部分は、完全には理解されていないが、それでも性ステロイドシグナル伝達の阻害を達成するための多数のメカニズムが存在し、潜在する。本発明の一実施形態において、性ステロイドシグナル伝達の阻害は、生合成もしくは代謝、標的細胞上もしくは標的細胞内の性ステロイド受容体への結合、および/または性ステロイドの細胞内シグナル伝達を変えることによって、細胞レベルで生物学的に利用できる性ステロイドホルモンレベル、いわゆる「遊離」レベルを改変することによって達成される。
直接的または間接的のどちらかでシグナル伝達経路に影響することが可能である。直接法には、それぞれの受容体に結合しシグナルを細胞内で改変する、性ステロイドの生合成および代謝に影響する方法がある。間接法には、下垂体および生殖腺に存在するペプチドホルモンおよび増殖因子などの、性ステロイドホルモンの産生および作用に影響することが知られている方法がある。後者にはFSH、LHおよび下垂体によって作られるアクチビン、ならびに生殖腺によって作られるインヒビン、アクチビンおよびインスリン様増殖因子1(IGF-1)があるが、それらに限定されない。
当業者は、その分子に対する直接作用、あるいはその分子をコードもしくは調節する核酸を含めたその分子の前駆体または性ステロイドの作用を改変できる分子に対する作用のどちらかにより、関連するホルモン、酵素、受容体、結合分子および/またはリガンドのレベルの上記改変を行うことによって、性ステロイドシグナル伝達の阻害が起こり得ることを認識している。
[シグナル伝達を阻害する直接法]
[生合成]
生合成速度はステロイドホルモンの産生、したがって血清中の「遊離」ホルモンの生物学的利用性における主な律速段階である。P450などの主要酵素の阻害では経路前半のコレステロール側鎖の開裂(P450scc)が全ての主要な性ステロイドの産生を低減する。一方、アンドロゲンをエストロゲンに転換するP450アロマターゼ(P450arom)またはテストステロンをDHTに転換する5α-レダクターゼなどの経路後半の酵素の阻害は、それぞれエストロゲンまたはDHTの産生にのみ作用する。性ステロイドホルモン生合成の別の重要な面は、不活性ステロイドから生体活性ステロイド、例えば17-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(17-HSD)によるアンドロステンジオンからテストステロンまたはエストロンからエストラジオール-17βへの相互転換を触媒するオキシドレダクターゼ酵素ファミリーである。これらの酵素は組織および細胞特異的であり、一般に還元または酸化反応の一方を触媒する。例えば17βHSD3型は精巣のライディヒ細胞に専らみられ、一方で17βHSD1型は卵巣でみられる。したがって、これらはアンドロゲンまたはエストロゲンの活性型の産生を特異的に低減する可能性を提供している。
ステロイド生合成経路の酵素の公知の阻害剤が多数存在し、それらはすでに臨床使用されているか、または開発中である。これらの例を治療様式と共にいくつか上に列挙してある。これらの酵素阻害剤の作用が、代謝の安定に必須である副腎からのグルココルチコイドおよびミネラルコルチコイドなどの他のステロイドの産生に過度に影響しないことが重要である。そのような阻害剤を使用するときは、患者に代替となるグルココルチコイド、時にミネラルコルチコイドを提供することが必要な場合がある。
性ステロイドの生合成は多様な部位で起こり、多数の経路を利用して大部分は卵巣および精巣が産生するが、副腎で一部の産生があり、脂肪などの他の組織でも誘導体の合成がある。このように、性ステロイドシグナル伝達を阻害する多数のメカニズムが本発明を成し遂げるに足る阻害であることを確実にするために必要となりうる。
[代謝と区画化]
性ステロイドホルモンは、特に肝臓による迅速な代謝ならびに腎臓および脂肪によるクリアランスが原因で血中半減期が一般にわずか数分と短い。代謝にはグリコシル化および硫酸化による結合ならびに還元がある。これらの代謝物の一部はプロホルモン、例えば硫酸エストロンとして、または還元アンドロゲンなどの内因性生体活性によるどちらかで生物学的活性を保持している。代謝速度におけるいかなる干渉も性ステロイドホルモンの「遊離」レベルに影響を与えうるが、これを達成する方法は生合成に影響する方法として今のところ利用されていない。
「遊離」性ステロイドホルモンのレベルを低減する別の方法は、性ホルモン結合性グロブリン、コルチコステロイド結合性グロブリン、アルブミンおよびテストステロン-エストラジオール結合性グロブリンなどの血清中に存在するタンパク質への性ステロイドホルモンの結合による区画化による。担体分子などの性ステロイドリガンドに対する結合は、性ステロイドを受容体との結合に利用できなくする場合がある。結合の増加は、SHBGなどの担体のレベルの増加または可溶性受容体などの性ステロイドに結合する他のリガンドの導入に起因しうる。あるいは、担体分子レベルの減少は、性ステロイドを分解に対して更に感受性にしうる。
特定の性ステロイドホルモンに対する能動免疫または受動免疫は、区画化の一形態である。文献にはこの取り組みの例があり、そこではエストロゲンまたはアンドロゲンに対する免疫後の動物において排卵率の増加に成功している。性ステロイドは分泌小胞の細胞から分泌される。分泌メカニズムの阻害または改変は、性ステロイドシグナル伝達の別の阻害法である。
[受容体および細胞内シグナル伝達]
性ステロイドは細胞内に、または最近示されたように標的細胞膜上に存在しうる特異的受容体を介して細胞に作用する。
細胞内受容体は、核受容体スーパーファミリーのメンバーである。細胞内受容体は、細胞の細胞質に局在し、性ステロイドホルモンと結合した後に核に輸送され、核で特定遺伝子の転写を変える。性ステロイドホルモンに対する受容体はいくつかの形式で存在する。文献で周知であるのは2つの形式のプロゲステロン受容体、PRAおよびPRB、ならびに3つの形式のエストロゲン受容体ERα、ERβ1およびERβ2である。遺伝子のプロモーター領域に存在するステロイド応答エレメントへの性ステロイドホルモン受容体の結合に応答した遺伝子の転写を多数の方法で改変できる。コアクチベーターおよびコリプレッサーは標的細胞の核内に存在し、DNAに対するステロイド受容体複合体の結合を改変することによって転写に影響しうる。これら多くのコアクチベーターおよびコリプレッサーの同一性は公知であり、ステロイド受容体に及ぼすそれらの作用を改変する方法は最新研究の主題となっている。性ステロイドホルモンの作用に関与する転写因子の代表的な例は、NF-1、SPl、Oct-1およびTFIIDである。これらのコレギュレーターはステロイドが完全に作用するのに必要である。これらの核レギュレーターの作用を改変する方法は、拮抗薬の使用によるか、またはレギュレーターをコードする遺伝子の発現制御を介したアクチベーターとリプレッサーとの間のバランスを必要としうる。
エストロゲンおよびプロゲステロンに対する特異的受容体は細胞膜上に同定されており、それらの構造は細胞内PRとは異なる。ゲノムに作用する古典的ステロイド受容体とは違って、これらの受容体は完全には理解されていない細胞内経路を通過して迅速な非ゲノム作用を送達する。膜受容体と相互作用するエストロゲンは細胞増殖に関係するスフィンゴシン経路を活性化できる。
細胞質受容体を介してステロイドの作用を変えるために利用できる方法または開発中の方法がある。この場合、特定のステロイド受容体と相互作用する抗アンドロゲン、抗エストロゲン、および抗プロゲスチンが上記などの文献および臨床使用に周知である。それらの作用は、受容体のレベル、感受性、コンホメーション、会合またはシグナル伝達を改変するために受容体と競合することか、受容体を遮断することでありうる。これらの薬物は、多様な形態、すなわちステロイド系および非ステロイド系、競合性および非競合性がある。特に関心を集めているのは、特定の組織にターゲッティングされ、上に例示される選択的受容体モジュレーターSARM、SERMおよびSPRMである。
受容体のダウンレギュレーションを2つの方法で達成できる。第一は、過剰の作動薬(ステロイドリガンド)により、第二は受容体をコードするそれぞれの遺伝子の転写を阻害することによる。第一の方法は、タモキシフェンなどの選択的作動薬の使用により達成できる。
[シグナル伝達を阻害する間接法]
[生合成]
性ステロイドシグナル伝達を阻害する間接法の1つは、生殖腺における性ステロイドホルモンの生合成の駆動を担う下垂体ゴナドトロピンであるFSHおよびLHの利用性または作用を改変することによって、それぞれのステロイドの生合成をダウンレギュレーションすることを伴う。よく使用されるFSH分泌阻害剤は、FSHに応答して生殖腺によって産生されるホルモンであるインヒビンである。動物へのインヒビンの投与によって、下垂体からのFSH分泌が減少することが原因で血清中FSHレベルが低減することが示された。両ゴナドトロピンの低減を達成する公知の一方法は、視床下部ホルモンであるGnRH/LHRHによるものであり、GnRH/LHRHはFSHおよびLHの下垂体での合成および分泌を駆動する。FSHおよびLHの分泌を減らし、よって生殖腺での性ステロイド産生を減らすGnRHの作動薬および拮抗薬を、本明細書に記載するように臨床使用に現在利用できる。
性ステロイドホルモンの生合成を低減させる別の間接法は、生殖腺レベルでFSHおよびLHの作用を改変することである。FSHおよびLHに対する抗体、または性ステロイドホルモンを産生する生殖腺細胞上のそれぞれの受容体をFSHおよびLHと競合するように設計された分子を用いることによって、これを達成できる。生殖腺細胞に及ぼすFSHおよびLHの作用を改変する別の方法は、ゴナドトロピンの作用のコレギュレーターを使用することによる。例えばアクチビンは、卵巣の卵胞膜細胞および精巣のライディヒ細胞がLHに応答してアンドロゲンを産生する能力を低減できる。
シグナルペプチド（例えばGnRHのシグナルペプチド）の開裂の阻害のようにホルモン前駆物質のレベルで改変を行うことができる。
[受容体と細胞内シグナル伝達]
性ステロイドホルモンのシグナル伝達作用を改変する間接法には、ステロイドのゲノム作用または非ゲノム作用に至る受容体経路のダウンレギュレーションがある。この例は、プロゲステロンが標的組織のERレベルをダウンレギュレートする能力である。将来的な方法として、細胞がステロイドに応答する能力の低下をもたらす、細胞核内の受容体のコレギュレーターに影響することが知られている分子を用いた治療が考えられる。
[追加の因子]
BMの機能性、BMのリンパ球生成、および免疫細胞の機能性に及ぼす直接および間接作用に対する刺激が、性ステロイドの作用および/またはLHRHアナログの直接作用の阻害に基本的に基づくが、協同して作用して胸腺、BM、および/もしくは免疫細胞の作用ならびに機能性を(相加的、相乗的、または相補的に)増強または増大できる追加の物質を含めることは有用でありうる。追加の物質を使用する場合もあるし、使用しない場合もある。そのような化合物には、インターロイキン2 (IL-2;100000から1000000IU、例えば600000lU/Kg、IV繰り返し投薬により8時間毎)、インターロイキン7 (IL-7;治療上の自由裁量を条件に10ng/kg/日から100mcg/kg/日)、インターロイキン15(IL-15;1日0.1〜20mug/kgのIL-15)、インターロイキン11(IL-11;1〜1000μg/kg)、上皮および線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、幹細胞因子(SCF;SL因子またはc-kitリガンドとも知られている;0.25〜12.5mg/ml)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF;1および15μg/kg/日、IVまたはSC)、顆粒球マクロファージ刺激因子(GM-CSF;50〜1000μg/m2/日、SCまたはIV)、インスリン依存性増殖因子(IGF-1)、ならびにケラチン細胞増殖因子(KGF;1μg/kgから100mg/kg/日)(例えばSempowskiら、(2000) J. Immunol. 164: 2180頁;AndrewおよびAspinall、(2001) J. Immunol. 166: 1524〜1530頁;Rossiら、(2002) Blood 100: 682頁);エリスロポエチン(EPO;10〜500ユニット/kg、IVまたはSC)などのサイトカインならびに増殖因子があるが、それらに限定されない。本発明との同時併用適用または連続併用適用のための他の適当なヘマトポエチン、CSF、サイトカイン、リンホカイン、造血成長因子およびインターロイキンの限定的でないリストには、Meg-CSF(巨核球コロニー刺激因子、最近c-mplリガンドと呼ばれる)、MIF(マクロファージ阻害因子)、LIF(白血病増殖阻止因子)、TNF(腫瘍壊死因子)、IGF、血小板由来増殖因子(PDGF)、M-CSF、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、LIF、flt3/flk2、ヒト成長ホルモン、B細胞増殖因子、B細胞分化因子および好酸球分化因子、またはそれらの組み合わせがある。
これらの追加の化合物の1つまたは複数を、初回のLHRHアナログ(または他の去勢法)の適用時に1回与えることができる。各治療を作動薬、拮抗薬または性ステロイド妨害の任意の他の形式と組み合わせて与えることができる。増殖因子は比較的迅速な半減期(例えば時間単位)を有することから、増殖因子を毎日(例えば7日間以上毎日)与える必要がありうる。増殖因子/サイトカインの生物学的活性を保つために、製造業者が指示したような最適の形態で、例えば精製タンパク質の形態でそれらを与えることができる。しかし、これらの物質の任意の1つまたは組み合わせの追加の用量を、BMおよび他の免疫細胞の機能性をさらに刺激するために任意の時間に与えることができる。ある場合には、性ステロイドの除去または性ステロイドシグナル伝達の中断を追加のサイトカイン、増殖因子、またはそれらの組み合わせの投与と同時に行う。他の場合には、性ステロイドの除去または性ステロイドシグナル伝達の中断を、追加のサイトカイン、増殖因子、またはそれらの組み合わせの投与に連続して行う。
本明細書において使用する「動員剤」は、BMからの幹細胞の動員を増強するSDF-1(例えばAMD3100)、成長ホルモン、GM-CSF、G-CSFおよび化学療法剤(例えばシクロホスファミド)などの薬剤を指す。
G-CSFおよびGM-CSFは、それぞれ顆粒球(主に好中球)およびマクロファージを動員し、BMからのDC産生増加も招くことが知られており、これらは抗原の攻撃に対する患者の非特異的免疫応答をもたらすのを助長する(Janewayら、(2001) Immunobiology、第5版、325頁)。臨床的にはG-CSFおよびGM-CSFは、例えば、概して重症好中球減少症および発熱の重大な発生に関連している骨髄抑制性抗癌薬を投与されている非骨髄性悪性疾患を有する患者での(熱性好中球減少症として出現する)感染の発生率を減少させるために使用される。追加的に、これらの薬物の両方は、HSCTを投与されている患者における感染を予防するために臨床的に承認されている。G-CSFおよびGM-CSFの両方は、末梢血始原細胞の回収および治療法を受けている患者に現在使用されている。BM幹細胞の分化および/または増殖を刺激するコロニー刺激因子(CSF)は、造血幹細胞由来細胞の低下したレベルから回復させる治療能力が原因で大きな関心を集めている。CSFはヒトおよびマウス系において同定され、その活性によって分類される。例えば、顆粒球CSF(G-CSF)およびマクロファージCSF(M-CSF)は、それぞれ好中性顆粒球およびマクロファージのコロニーのin vitro形成を刺激し、一方でGM-CSFおよびインターロイキン3(IL-3)は幅広い活性を有し、マクロファージ、好中性および好酸性顆粒球のコロニー両方の形成を刺激する。IL-3は、(エリスロポエチンを添加した場合に)マスト細胞、巨核球ならびに純粋および混合赤芽球コロニーの形成も刺激する。GM-CSFは、好中球の回復を促進し機能的能力を維持するが、血小板の回復には実証できる効果をほとんど有さない。対照的に、IL-3は好中球および単球の回復の増大は比較的ゆっくりとしか増進しないが、血小板の回復を促進する。
このようにG-CSFおよび/またはGM-CSFは、本発明の方法のいくつかの是認に使用される。G-CSFおよび/またはGM-CSF療法と(連続または同時に) ともに行った性ステロイドの除去は、リンパ系細胞および骨髄細胞の両方のBMからのアウトプットの増加を招く。これは次に感染症を患うか、感染症を患いそうな患者に対する短期および長期転帰の両方を有意に改善する。別の方法では、化学療法または放射線療法の3〜4日後にCSFを投与する。CSFの使用にすでに関連した臨床転帰も、性ステロイドシグナル伝達の中断によって大きく増強する。具体的には、CSFと一緒に本発明の方法を使用することで、例えば癌放射線療法または化学療法を受けている患者における感染のより大きな防除が可能になる。追加的に、免疫系を効果的かつ機敏に「再ブースト」できるならば、増加した用量および/または頻度の化学療法薬または放射線療法を使用できる。これは、免疫系の機能性の適時回復をさらに増強するであろう同種もしくは自己HSCの導入の存在下または非存在下で起こりうる。去勢によっても、移植しなければならないHSCの数がさらに少なくなり、それは限られた数のHSCしかドナーから得ることができない場合またはさい帯血幹細胞を移植に使用する場合に有用である。
例えば、2つの別々のクラスの薬物(例えばLupron(登録商標)などのGnRHアナログ、およびCosudex(登録商標)などのアンドロゲン遮断薬)の同時使用によっても免疫系の同じ再生が可能になりうるが、低い薬用量のG-CSFまたはGM-CSFしか必要ない場合がある。同様に、これらの2つの別々のクラスの薬物の同時使用によって、同じ薬用量のG-CSFまたはGM-CSFを利用しても、免疫系細胞のさらに大きくさらに長期の若返りが可能になりうる。追加的に、2つの別々のクラスの薬物の同時使用によって、性ステロイドシグナル伝達の除去、もしくは中断に使用される薬物または薬物の組み合わせの薬用量を減らして(すなわち前立腺癌、子宮内膜症、または乳癌の治療に使用される「通常」使用される投薬量に比べて低減させて)用いても、免疫系細胞の同じ若返りが可能になりうる。さらに、これら2つの別々のクラスの薬物の同時使用によって、性ステロイドシグナル伝達の除去もしくは中断に使用される薬物または薬物の組み合わせの薬用量を減らして用いても、免疫系細胞のさらに大きくさらに長期の若返りが可能になる。
[適応]
前記の増殖因子およびサイトカインの存在下もしくは非存在下での、性ステロイドの除去を起こすことが知られている薬物または性ステロイドシグナル伝達を中断する薬物の単独使用または併用を、以下に使用できる:HSC生着を可能にする補助剤として(例えば実施例22参照);同種もしくは自己器官移植または細胞移植を効果的に管理する補助剤として(例えば実施例21および22、ならびに同時係属の共有の米国特許出願第10/419039号および第10/749119号)。これらの疾患へのこれらの薬物の使用は、さらに有効な治療の転帰を招くか、または全般的な治療プロトコールがさらに効率的であることを招く。追加的に、例えば実施例25および26に記載するように、多様な化学療法薬の用量もしくは投与(または放射線療法の線量)を変更してそれらの副作用をさらに小さくし、かつ/またはさらに質のよい患者の生命転帰を招くようにできる。さらに、多様なサイトカインおよび増殖因子の同時投与によって、移植に必要なHSCの数を低減することが可能になりうる。例えば、生着を得るために少数の細胞しか必要ないことから、本発明の方法を使用して成人HSCTにヒトさい帯血を使用することが今や可能となりうる。
[医薬組成物]
本発明に使用される化合物を、薬学的に許容できる任意の担体中に供給できるし、また担体なしでも供給できる。医薬組成物の製剤を標準法により調製できる(例えばRemington、2000「The Science and Practice of Pharmacy」、Gennaro A.R編、第20版、Williams & Wilkins、ペンシルベニア州、米国)。薬学的に許容できる担体の限定されない例には、生理学的に適合できるコーティング剤、溶媒および希釈剤がある。非経口、皮下、静脈内、および筋肉内投与のために、組成物を例えば被包によって保護できる。あるいは、有効成分を保護する担体を組成物にもたらす一方で、これらの成分を低速で放出させることもできる。多様な種類の乳酸/グリコール酸コポリマーなどの多数のポリマーおよびコポリマーが、持続放出調製物のために当技術分野で公知である。例えば、生分解性コーティング剤としてポリエチレングリコール(PEG)の修飾ポリマーを使用している米国特許第5410016号を参照のこと。
経口的に送達することを意図した製剤を、液剤、カプセル剤、錠剤などとして調製できる。これらの組成物には例えば賦形剤、希釈剤および/または有効成分を分解から守る被覆剤がありうる。そのような製剤は周知である(例えばRemington、2000参照)
本発明の任意の製剤において、LHRHアナログの活性に負の影響を与えない他の化合物(すなわちLHRHアナログが性ステロイドホルモンシグナル伝達を妨害する能力を遮断しない化合物)が含まれうる。例は、本明細書に記載するような多様な増殖因子および他のサイトカインである。
[用量]
日常的に訓練された医師または獣医師は、本発明により性ステロイドホルモンシグナル伝達を妨害するために使用される性ステロイドアナログまたは阻害剤の用量を容易に決定でき、医学文献を調べることによってもそれを決定できる(例えばTHE PHYSICIAN'S DESK REFERENCE、第52版、Medical Economics Company、1998)。
薬物の作用を改変する多様な要因、例えば患者の状態、体重、性別および食事、任意の病気の重症度、投与時間ならびに他の臨床要因を考慮する主治医が、上記の状態を治療するための方法に含まれる投薬方式を決定する。血液学的プロフィール、例えばディファレンシャルな細胞数などの定期的評価によって治療された患者の経過をモニターできる。
治療組成物に入れた追加の構成要素を補正するために、上に列挙した投薬を調整する。これらには他のCSF、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、造血成長因子との同時投与;化学療法薬および/または放射線の同時投与;ならびに例えば患者の状態、体重、性別および食事、任意の病気の重症度、投与時間ならびに他の臨床要因などの薬物の作用を改変する要因などの、主治医によって確認された患者に関係する多様な問題がある。
上記の用量決定に追加して、例えばLHRHアナログおよび他の性ステロイドアナログを、ある期間(例えば3から6カ月)持続する1回用量で投与できる。ある場合に、製剤は1から2カ月間有効である。標準用量は使用されるアナログの種類によって変動するが、過度の実験を行わずに当業者に容易に決定されうる。用量は一般に約0.01mg/kgと約10mg/kgとの間、または約0.01mg/kgと約5mg/kgとの間である。
性ステロイドの阻害またはLHRH/GnRHアナログによる治療の期間は胸腺の萎縮および損傷の程度に応じて変動し、過度の実験を行わずに当業者に容易に決定されうる。例えば、患者の年齢が高いほど、または患者が化学療法または放射線療法などのT細胞枯渇試薬に大きく曝露されるほど、例えばGnRHを用いた治療に必要な期間は長くなると思われる。4カ月が一般に血中に新しいT細胞を検出するのに足る期間とみなされている。血中に新しいT細胞を検出する方法は、当技術分野で公知である。例えばT細胞を検出する一方法は、T細胞受容体切断環状産物(TREC)の存在を決定することによる。TRECはTCRが形成中のときに形成され、細胞が分割した後は細胞から消失する。このように、TRECは新しい(ナイーブ)T細胞にのみみられる。TRECのレベルはヒトにおける胸腺の機能の指標である。これらおよび他の方法は、WO/00230256に詳細に記載されている。
用量は使用されるLHRHアナログによって変動する。ある実施形態において、必要な期間持続する用量が調製される。例えば、LHRHアナログの製剤を作り、本明細書に記載されるように2カ月以上送達させ、追加の用量を必要に応じて2カ月以上毎に送達させることができる。
免疫系を増強する製剤を作ることができる。あるいは、GM細胞をLHRHアナログ製剤と共にまたは空間的および/もしくは時間的に別々に、投与できる。非GM細胞と同様に、所定の外因性抗原に対する寛容を創出する必要がある患者に経時的に多数回の用量を投与できる。
当業者に了承されるように、性ステロイドシグナル伝達を妨害するための手段の少なくともいくつかは、適当な化合物が投与される限り有効である。結果として、本発明のある実施形態の長所は、いったん本発明の望みの免疫学的影響が達成されたとき(2〜3カ月)に、治療を中止でき、その被験者の生殖系が正常に戻ることである。
[化学的去勢のための薬剤の送達]
性ステロイド除去剤の投与は、これを体内に送達するあらゆる方法により行うことが可能である。したがって、性ステロイド除去剤は、本発明による静脈内、真皮下、皮下、筋肉内、局所および経口経路を含むがこれに限定されない、あらゆる経路により投与することができる。
上記の方法に加えて、本発明の方法で使用される化合物の送達は、当業者に公知の多くの方法を通じて達成することが可能である。性ステロイド介在性シグナル伝達を阻害する化学的阻害剤を投与する1つの標準的方法では、3カ月間有効なLHRH作動薬の単回投与を利用する。このためには、作動薬が3カ月経過するかなり前に患者の体から除去されるため、簡単な単回静注または筋肉内注射は十分でない可能性がある。代わりに、デポー注射もしくはインプラント錠、または阻害物質の徐放を可能にする阻害剤の他の任意の送達手段を使用してもよい。同様に、本発明で要求される機能を維持しながら、化学物質の修飾などの体内で阻害剤の半減期を延長する方法を使用してもよい。
有用な送達機構には、皮膚のレーザー照射が含まれるが、それに限定されない。この実施形態は、共同所有される同時係属出願の米国出願第10/418727号ならびに米国特許第4775361号、第5643252号、第5839446号、第6056738号、第6315772号および第6251099号で更に詳細に記載される。他の有用な送達機構には、皮膚の高圧インパルス過渡応答(応力波またはインパルス過渡応答とも呼ばれる)の生成が含まれる。この実施形態は、共同所有される同時係属出願の米国出願第10/418727号ならびに米国特許第5614502号および第5658822号で更に詳細に記載される。それぞれの方法は、担体の有無にかかわらず同じ部位に化合物を配置することによってなされ、またはそれを伴うことができる。この配置の1つの方法は、皮膚上に置かれ、治療期間中皮膚上に維持されるパッチによるものである。
[タイミング]
一例では、性ステロイドを除去するか、性ステロイドシグナル伝達を妨害する薬剤の投与は、例えば一部のBM骨髄細胞破壊を引き起こす、および/または免疫細胞の循環を損なう可能性のある化学療法または放射線治療方法の前に行われる。
[細胞]
例えばCD34+造血細胞(理想的には自己由来)として広く定義される造血前駆細胞の注射は、胸腺再成長の程度および動態を高めることが可能であり、ならびに/または胸腺再生の前または同時に、もしくは胸腺再生なしに、免疫細胞およびBM内で、機能性および生着を高める。HSCは更にThy-1 lowおよびCD38-として定義されることがあり、CD34+CD38-;Thy-1 low細胞は、また、他の細胞系列(lin-ve)のマーカーを欠き、より長く存続するか、より長く再増殖する能力を有するより原始的なHSCである。
ここに記載のさまざまな発明の方法は、例えばCD34+HSCおよび/または上皮幹細胞の追加により補うことができる。ある場合では、これらの細胞は自己由来または同系で、胸腺再活性化の前に患者または双生児から得られる。HSCは、患者の血液および/またはBMからCD34+またはCD341oを選別することにより得ることができる。HSC数は、細胞の採取前の患者へのG-CSF(Neupogen、Amgen)の投与、SCGFでの採取細胞の培養および/またはCD34+細胞補充後の患者へのG-CSFの投与を含む(しかし、限定されない)いくつかの方法で増加できる。あるいは、CD34+細胞は、これらの集団が患者への事前のG-CSF注射により増加している場合には、血液またはBMから選別する必要はない。
HSCを遺伝子組換えに使用することができる。これらはBM、末梢血もしくは臍帯、またはHSCの他のあらゆるソースから得ることが可能で、自己由来または非自己由来のことができる。また、同様に有用なのは、リンパおよび骨髄前駆細胞、間葉間細胞(これも骨髄で発見される)および上皮幹細胞で、これらも自己由来または非自己由来である。本幹細胞には臍帯血が含まれることがある。また、これらには、例えば胚幹細胞ならびに例えば多くの組織(例BM、膵臓、脳および嗅覚系など)で現在発見される成人の幹細胞などの、多くの異なる細胞型を形成する可能性のある幹細胞も含まれる。
非自己由来(ドナー)細胞を使用する場合には、胸腺再活性化の間か後に、これらの細胞に対する寛容が生じる。性ステロイド介在性シグナル伝達の妨害の開始の間か後に、関連の(遺伝子組み換え(GM)又は非遺伝子組み換え)ドナー細胞をレシピエントに移植する。これらの細胞は、理想的には幹細胞または前駆細胞であり、これらに対して偶然に反応性を有することになる新しく産生されるすべてのT細胞を除去することにより、これらがドナーに対する寛容を発現する胸腺に取り込まれ、受け入れられる。それから、これらが「レシピエントに属し」、胸腺による新しいT細胞およびDC生産の一翼を担うことになる。その結果生じたT細胞は、レシピエントおよびドナーの両方を自己として認識するので、このドナーの移植片に対する寛容を作り出す(共同所有される同時係属出願の米国出願第10/419039号およびPCT/IB01/02740号)。
他の実施形態では、幹細胞または前駆体ドナー細胞(遺伝子組み換えまたは非遺伝子組み換えの)の投与は、複数の個人の細胞を含むので、レシピエントは、様々なMHC型に対して寛容を生じる。そのため広範のドナーにMHC適合するので、より容易にまたは素早く、レシピエントを細胞、組織または器官の移植の適切な候補と考慮できるようになる。
また、本発明は外来DCを患者の胸腺に取り込む方法を提供する。これはドナー細胞をレシピエントに投与して、レシピエントの寛容を発現させることにより達成することが可能である。ドナー細胞として、HSC、上皮幹細胞、成人幹細胞もしくは胚幹細胞、または造血前駆細胞が候補となる。またドナー細胞として、CD34+HSC、リンパ系前駆細胞または骨髄性前駆細胞が候補となる。一部の例では、ドナー細胞は、CD34+またはCD34loHSCである。ドナーHSCは、レシピエントにおいてDCに発達する。ドナー細胞をレシピエントに投与し、末梢血液系を介して、直接またはBM経由で活性化胸腺に移行させることができる。寛容誘導のための胸腺取り込みを高めるために、例えばLHRH/GnRH類似体などの性ステロイド阻害剤の使用による胸腺再成長の活性化とあわせて、幹細胞を胸腺内に注射してもよい。非HSCですら誘発されて、胸腺の微小環境およびそのような細胞の適切な成長因子の内容物内でDCを形成する可能性がある。
造血前駆細胞の胸腺への取り込みは、性ステロイドの阻害または欠如でかなり増加する。これらの細胞は胸腺に組み込まれ、レシピエント細胞がするのを同じ方法で、DC、NK、NKTおよびT細胞を産生する。結果として、T細胞、DCおよび他の細胞のキメラが生じる。レシピエントの胸腺内でのドナーDCの取り込みは、この胸腺により産生されるT細胞が、これらがドナー細胞に寛容を示すというように選択されることを意味する。移植物質がレシピエントの免疫系に自己として認識されるので、そのような寛容は、免疫抑制剤の必要性を減らすと共に、ドナー細胞、組織および器官などの移植片のドナー(またはドナーに厳密にマッチする)からの更なる移植を可能にする。
[オプションの幹細胞または前駆細胞の遺伝子組換え]
また本開示は、場合により、個人の免疫系を変更する方法および遺伝子組み換えの造血幹細胞、リンパ系前駆細胞、骨髄性前駆細胞、上皮幹細胞またはその組み合わせ(GM細胞)を使用した遺伝子治療法を含む。他の研究者らによるそのような細胞を送達する以前の試みは、組み換え細胞がごくわずか生じたのみで、不成功に終わっている。この開示は、所望のT細胞の取り込みおよび細胞の所望のT細胞への分化を促進するこれらの細胞を送達する新しい方法を提供する。組み換え細胞を患者に注射する。組み換え幹細胞および組み換え前駆細胞を、胸腺に取り込ませ、T細胞、樹状細胞および胸腺において産生される他の細胞に変換させる。これらの新しい各細胞は、親幹/前駆細胞の遺伝子組換えを含む。
去勢の間か後に、ドナーの造血幹細胞もしくは前駆細胞、または上皮幹細胞をレシピエント患者に移植することが可能である。これらの細胞は、レシピエントに属するものとして胸腺に受け入れられ、胸腺により新しいT細胞およびDCの産生の一翼を担う。性ステロイド介在性シグナル伝達の遮断の開始3〜4週以内に(LHRH治療の開始の約2〜3週後)、最初の新しいT細胞が血流に現れる。T細胞プールの完全な発現には、3〜4カ月を要すると考えられる。生じたT細胞の集団は、レシピエント(および非自己移植の場合はドナーも)を自己と認識する。また、ドナー由来の移植片に対する寛容を、レシピエントで生じさせることが可能である。
ドナーの移植片に対する患者の寛容を生じさせる適切な遺伝子またはポリヌクレオチド(すなわち、特定のタンパク質を規定する核酸配列)を、幹細胞および/または前駆細胞へ遺伝子工学で導入する。特定の遺伝子をHSCに導入することにより、細胞は例えばAPCに分化し、MHCクラスIまたはIIと関連して発現するペプチドとしてタンパク質を発現する。
患者に性ステロイド類似体を投与して、胸腺を活性化および/または骨髄機能(HSCを取り込み、産生する能力を高めることを含む)を増進することが可能である。一例では、胸腺再活性化の前または同時に、患者の体の免疫能を高める造血細胞を患者に供給する。一実施形態では、去勢の間か後に患者にHSCTを投与する。患者に、自己のHSCを注射するか、例えばG-CSFで3日間治療後(1日2回皮下注射)、4日および5日後に血液からHSCを採取した、適切なドナーのHSCを注射してもよい。HSCに遺伝子(例えば、タンパク質、ペプチドまたは薬剤の抗原をコードする遺伝子)を移入または形質導入して、要求されるタンパク質または抗原を産生することができる。患者へ注射した後、HSCは血液から骨および骨髄に入り、このうちいくらかは血液中に戻り、最終的に体中でT細胞、DC、APCに変換される。抗原は、これらAPCの表面で、MHCクラスIおよび/またはMHCクラスIIと関連して発現する。
幹細胞および前駆細胞を単離および形質導入するための方法は、当業者によく知られている。これらの工程の実施例は、例えばPCT公報第WO95/08105号、第WO96/33282号、第WO96/33281号、米国特許第5559703号、第5061620号、第5681559号および第5199942号に記載されている。
[アンチセンスポリヌクレオチド]
「アンチセンス」という用語は、ここでは本発明のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド配列と定義される。ポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAと考えられる。アンチセンス分子は、相補鎖を合成できるウィルスプロモーターと対象とする遺伝子を反対の配置で結合させる合成を含む、いかなる方法でも生成することが可能である。一旦細胞に導入されたならば、この転写鎖は細胞により自然に生成された配列と結合して二重鎖を形成する。これらの二重鎖は更なる転写または翻訳のいずれかを妨げる。このようにして、変異表現型が生じると考えられる。
[触媒核酸]
「触媒核酸」という用語は、ここでは特異的に明確な基質を認識し、この基質の化学修飾を触媒するDNA分子もしくはDNA含有分子(当業者に「デオキシリボザイム」または「DNAザイム」として知られる)またはRNA分子もしくはRNA含有分子(「リボザイム」として知られる)と定義される。触媒核酸の核酸塩基は、その誘導体と同様に、塩基A、C、G、TおよびUであると考えられる。これら塩基の誘導体は、当業者によく知られている。
一般的に、触媒核酸は、標的核酸を特異的に認識するアンチセンス配列および切断酵素活性を有する核酸を含む。触媒鎖は、標的核酸の特定部位を切断する。特に本発明で有用なリボザイムのタイプは、ハンマーヘッドリボザイム(Haseloff and Gerlach(1988) Nature 334:585頁、Perrimanら、(1992) Gene 113:157頁)およびヘアピンリボザイム(Shippyら、 (1999) Mol. Biotechnol.12: 117頁)である。
[dsRNA]
二重鎖RNA(dsRNA)は、特定のタンパク質の産生を特異的に阻害するために特に有用である。理論に縛られることは望まないが、あるグループが、dsRNAを使用してタンパク質産生を減少することが可能なメカニズムのモデルを示している(Dougherty and Parks, (1995), Curr. Opin. Cell Biol. 7:399頁)。このモデルは最近変更され、発展されている(Waterhouseら、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959頁)。この技術は、対象遺伝子のmRNAと基本的に同一である配列を含むdsRNA分子の存在に依存し、この場合、mRNAは本発明の第1の側面に従いポリペプチドをコードする。都合の良いことに、dsRNAは、組み換えベクターまたは宿主細胞の単一のオープンリーディングフレームで作成することが可能である(ここでは、センス配列およびアンチセンス配列が、センス配列とアンチセンス配列をハイブリッド形成させて、ループ構造を形成する無関係の配列とdsRNA分子を形成させることが可能な無関係な配列と隣接する)。本発明に適したdsRNA分子のデザインおよび生産は当業者によく知られており、特にDougherty and Parks, (1995), Curr. Opin. Cell Biol. 7:399頁、Waterhouseら、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959頁およびPCT公報第WO99/32619号、第WO99/53050号、第WO99/49029号および第WO01/34815号が挙げられる。
［遺伝子］
本発明に有用な遺伝子と遺伝子断片(ポリヌクレオチド)には、ドナー抗原またはアレルゲンなどの特定の外因性抗原に対する抵抗性をコードするものも含まれる。本発明の限定を意図しない実施例では、ドナーはレシピエントと血縁であるが、更なるMHC分子またはY染色体(例えば、レシピエントが女性で、ドナーが男性)により発現される分子を発現し、この分子をコードする遺伝子を、レシピエントとドナーのHSCの再構成前に、ドナーのHSCに移入または発現させるか、レシピエント自身のHSC(例えば、性ステロイド除去前または同時にレシピエントから集める)に移入または発現させることが可能である。
これらの遺伝子または遺伝子断片を、安定して発現可能な形で使用する。これらの遺伝子または遺伝子断片を、安定して発現可能な形で使用することが可能である。「安定して発現可能」という用語は、ここでは遺伝子または遺伝子断片(「機能的断片」)の生成物(RNAおよび/またはタンパク質)が、宿主細胞への遺伝子または遺伝子断片の移入後の宿主細胞だけでなく、分割および/または分化後のこの細胞の後代においても少なくとも半永久的に発現することが可能であることを意味すると定義される。このことは遺伝子または遺伝子断片がベクターに含まれているかいないかにかかわらず、DNAのRNAへの転写のための適切なシグナル伝達配列を有することを必要とする。さらに、遺伝子または遺伝子断片によりコードされるタンパク質が患者の状態に影響を及ぼす活性分子であるならば、DNAも翻訳シグナルをコードする。
ほとんどの場合、遺伝子または遺伝子断片は、ベクターに含まれる。所望のRNAまたはタンパク質を発現するために使用することが可能な発現ベクターは、当業者に知られている。発現ベクターは、そこに含まれるDNA配列の翻訳および生じたRNAの翻訳を指示することが可能なベクターである。発現ベクターは、細胞で複製して遺伝子組換えすることが可能で、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスおよびミニ染色体を含む。あるいは、遺伝子または遺伝子断片は、細胞の染色体DNAと一体部分となる。組換えベクターとこの方法は、通常よく知られている。
本開示のタンパク質を発現するために有用な発現ベクターは、複製開始点を含むことが可能である。適切に作成された発現ベクターは、細胞における自律複製の複製開始点を含むか、宿主細胞染色体に組み込むことが可能である。また、そのようなベクターは、選択マーカー、少数の有用な制限酵素部位、多いコピー数および強力なプロモーターを含むことが可能である。プロモーターは、RNAポリメラーゼのDNAへの結合と、RNA合成の開始を指示するDNA配列である。強力なプロモーターは、そのような開始を高頻度で引き起こす。
一実施形態では、DNAベクター構築物は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを含む。このプロモーターは、長端反復配列(LTR)、シミアンウイルス40(SV40)、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、Rous肉腫ウイルス(RSV)、モロニーウイルス、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、ヒトメタロチオネインなどのHIVからなる群から選択される。一実施形態では、挿入する遺伝子またはポリヌクレオチドの発現の量とタイミングが制御できるように誘導プロモーターを使用する。
エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、ならびにCMV、RSVおよびEBVなどのウイルスエンハンサーを含む群から選択することができるが、それらに限定されない。プロモーターおよびエンハンサーは、同一または異なる遺伝子に由来する可能性がある。
ポリアデニル化シグナルは、LTRポリアデニル化シグナルおよびSV40ポリアデニル化シグナルの特にSV40マイナーポリアデニル化シグナルからなる群より選択することができる。
本開示の発現ベクターは、本発明で使用されるRNAまたはタンパク質をコードするDNAに機能するように結合することが可能である(すなわち、本ベクターは結合DNA分子の複製およびDNA分子にコードされるRNAまたはタンパク質の発現の両方を指示することができる)。したがって、タンパク質のために、制御配列の制御の下でDNA分子を発現し、DNA分子によりコードされる所望のタンパク質を生産するように正しい読み枠が維持しながら、発現ベクターは、結合したDNA分子の上流に適切な転写開始シグナルを有する必要がある。発現ベクターには、クローニングベクター、修飾クローニングベクターおよび特にデザインされたプラスミドまたはウイルスを含めることが可能だが、これらに限定されない。挿入する遺伝子またはポリヌクレオチドの発現の量とタイミングを制御できるように誘導プロモーターを使用してもよい。
当業者は、細胞で機能的であるDNA構築物を生産することができる。発現を検査するために、遺伝子構築物に関して、遺伝子を組換えたDNA構築物と同じタイプの細胞の組織培養を使用して、in vitroで発現レベルを検査することが可能である。
[遺伝子組み換えの方法]
標準的な組み換え法を使用して、遺伝子治療に使用する細胞へ遺伝子組み換えを導入することが可能である。例えば、培養HSCのレトロウイルスベクター導入は、当技術分野で公知の成功を生み出す方法である(Belmont and Jurecic (1997)、「Methods for Efficient Retrovirus-Mediated Gene Transfer to Mouse Hematopoietic Stem Cells,」、in Gene Therapy Protocols (P.D. Robbins, ed.), Humana Press、223〜240頁、Bahnsonら(1997) 「Method for Retrovirus-Mediated Gene Transfer to CD34+- Enriched Cells,」、in Gene Therapy Protocols (P.D. Robbins, ed.), Humana Press、249〜263頁)。さらにベクターには、アデノウイルス由来ベクターもしくはレンチウイルス由来ベクターおよびモロニーマウス白血病ウイルス由来ベクターが含まれるが、それらに限定されない。
また、有用なHSCの遺伝子組換えには、遺伝子銃などの粒子媒介遺伝子移入(Yang and Ziegelhoffer, (1994)「The Particle Bombardment System for Mammalian Gene Transfer,」In Particle Bombardment Technology Gene Transfer (Yang, N.-S. and Christou, P., eds.), Oxford University Press, New York、117〜141頁)、リポソーム媒介遺伝子移入(Nabelら(1992) Hum. Gene Ther 3:649頁)、リン酸カルシウムによる遺伝子組換えベクターの共沈(Graham and Van Der Eb, (1973) Virol. 52:456頁)、電気穿孔法(Potterら、(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161頁)ならびに微量注入(Capecchi, (1980) Cell 22:479頁)に加えて、おそらくベクターにおける遺伝子およびオリゴヌクレオチドをHSCおよび、少なくとも一時的に遺伝子が発現するように遺伝子を組換えた他の細胞に安定して移入する他のすべての方法が挙げられる。
［遺伝子治療］
また、本開示は、患者の胸腺の再活性化を通した遺伝子治療の方法を提供する。これはレシピエントへのGM細胞の投与および性ステロイド介在性シグナル伝達の破壊により達成される。ここに記載の方法により、最終的に、性ステロイド誘発の萎縮胸腺が、現在のすべての定義で、構造的および機能的に、ほぼ最適な思春期前の能力に回復する。これにはT細胞の全サブセットの数量、タイプおよび比率が含まれる。また、これには複合間質細胞およびT細胞を生産するために必要な胸腺の微小環境を構成するこれらの三次元構造が含まれる。新しく産生したT細胞は、胸腺から遊出して、末梢T細胞の濃度と機能を回復する。
最終的な胸腺の再活性化は、CD34+造血幹細胞(HSC)および/または上皮幹細胞を、胸腺が再生を始めるわずか前もしくは再生時に加えることにより補うことができる。これらの細胞は自己由来または同系であると考えられ、胸腺再活性化の前に患者または双生児から得られる。HSCは患者の血液および/または骨髄からCD34+細胞を選別することにより得ることができる。HSC数は、細胞の採取前の患者へのG-CSF(Neupogen、Amgen)の投与、幹細胞成長因子での採取細胞の培養および/またはCD34+細胞補充後の患者へのG-CSFの投与を含む(しかし、限定されない)いくつかの方法で増加できる。あるいは、CD34+細胞は、これらの数が患者への事前のG-CSF注射により増加している場合には、血液またはBMから選別する必要はない。
一実施形態では、胸腺再活性化の前または同時に、患者の体の免疫能を高める造血細胞を患者に供給する。造血細胞は、遺伝子組換えしても、しなくてもよい。
遺伝子組換え細胞には、HSC、上皮幹細胞、胚幹細胞もしくは成人の幹細胞、または骨髄前駆細胞もしくはリンパ系前駆細胞を挙げることができる。一実施形態では、遺伝子組換え細胞は、CD34+もしくはCD34lo HSC、リンパ系前駆細胞、または骨髄性前駆細胞である。他の実施形態では、遺伝子組換え細胞はCD34+ HSCである。遺伝子組換え細胞は、患者に投与され、末梢の血液系を通して胸腺に移る。これらの造血前駆細胞の胸腺への取り込みは、性ステロイドがない場合、かなり増加する。これらの細胞は、胸腺に組み込まれ、樹状細胞、および改造細胞からの遺伝子組換えを運ぶT細胞を産生する。この結果、患者の末梢血に所望の遺伝子変化を有するT細胞集団が循環し、同時に患者の胸腺の再活性化により、細胞、組織および器官の集団が増加する。
性ステロイド介在性シグナル伝達の遮断の開始3〜4週以内に(LHRH治療の開始の約2〜3週後)、最初の新しいT細胞が血流に現れる。しかし、T細胞プールの完全な発現には、3〜4カ月（以上）を要すると考えられる。
[寛容の誘導]
個人のT細胞集団を、本発明の方法によって変更することが可能である。特に、同一でない(すなわち、同種間または異種間の)移植片の寛容を創造することによって改変を誘発することができる。外因性抗原の特に臨床的な移植片における非自己ドナー抗原に対する寛容の確立は、ドナー由来の樹状細胞がレシピエントの胸腺に取り込まれる場合に最もよく達成することができる。また、この形の寛容は、抑制免疫調節細胞(例えば、CD25+CD4+T細胞、NKT細胞、γδT細胞)を使用することで、より効果的と考えられる。しかし、後の発現の基となるメカニズムに関しては解明されていないが、樹状細胞が関与する可能性がある。
自己抗原に対して反応するT細胞の阻止の基にある主なメカニズムが、胸腺樹状細胞によるそのような細胞の負の選択(クローン除去による)に起因すると考えると、潜在的器官または組織のドナー由来の樹状細胞を有する胸腺を作成する能力は、移植片拒絶の防止において極めて重要である。これは潜在的に移植片を拒絶する可能性のあるT細胞が胸腺でドナーの樹状細胞に遭遇し、これらが血流に入る機会を有する前に除去することにより達成される。樹状細胞を生じる血液前駆細胞と、T細胞自身を生じる血液前駆細胞とは同じものである。
一部の実施形態では、完全な骨髄破壊または骨髄細胞枯渇の後にHSC移植が行われ、したがって完全にHSCを移植(例えば、移植あたり5×106細胞/kg体重)することができる。一部の実施形態では、例えば2〜3Gy照射(または300ラド)後、約3〜4×105細胞/kg体重の投与などのごく軽度の骨髄破壊を行う必要がある。一部の実施形態では、T細胞除去(TCD)および/または他の免疫細胞除去の方法を使用する(実施例2参照)。ドナーの移植片に対する寛容を達成するにはわずか10%のキメラ化で十分であると考えられる。一部の実施形態では、ドナーHSCは、臍帯血より得られる(例えば、レシピエント生着のために1.5×107細胞/kg)。
最初にBMに定着し、血球(生着)に変換するHSCの能力は、注射するHSCの絶対数および質、ならびにレシピエントの骨髄微小環境およびHSCニッチの機能的能力に直接結びつく。本発明の方法単独または例えばサイトカイン(例えば、G-CSFまたはGM-CSF)もしくは薬剤(例えば、シクロホスファミド)などのHSC動員剤の投与との併用により、より速い、および/またはより良好な移植を可能にし、高用量および/または高頻度の化学療法または放射線療法も可能にする。
他の実施形態では、骨髄破壊的化学療法の最高45日前までに、患者にリュープリン投与を開始し、本薬剤に対する総曝露時間をおよそ9カ月(3カ月間にリュープリン注射が薬剤を送達する注射の3回分と同等)というようにリュープリンをBMTと継続して併用する。試験の経過における様々な時点で、血液検体を採取し、T細胞の数量(特に新しく胸腺に定着したT細胞)と機能(特にin vitroでのT細胞刺激に対する反応)を分析する。また、この実施形態は、ここに記載の他の目的のHSCTに通常適応可能である。
他の実施形態では、HSCの移植をリンパ球除去に引き続き行うことができる。一部の実施形態では、T細胞および/またはB細胞を、必要に応じて選択的に破壊して排除することがある(例えば、これらの細胞は自己免疫またはアレルギーに関与する)。この選択で、活性化した細胞または自己免疫もしくはアレルギー応答に関与する細胞型を除去することもある。細胞は、おそらくCD4、CD8、B220、thyl、TCR、CD3、CD5、CD7、CD25、CD26、CD23、CD30、CD38、CD49b、CD69、CD70、CD71、CD95、CD96、抗体特異的もしくはIg鎖、または上方制御されたサイトカイン受容体(例えば、IL2-R B鎖、TGFβ)などの細胞表面マーカーに基づいて選択される。除去のよく知られた方法は、抗リンパ球グロブリンを使用するものである。細胞の他の選別および選別法には、磁気および蛍光細胞分離、遠心分離、ならびにより具体的には、血液フェレーシス、白血球フェレーシスおよびリンパ球フェレーシスなどのよく知られた方法が含まれる。
一部の実施形態では、HSCTを骨髄破壊、骨髄細胞枯渇、リンパ球枯渇、T細胞除去および/または他の選択的免疫細胞除去なしに実施する。
他の実施形態では、本発明の方法は、例えば免疫抑制剤(例えば、シクロスポリン、プレドニゾン、オゾチオプリン、FK506、イミュンランおよび/またはメトトレキセート)(米国特許第5876708号参照)の投与などによる患者の免疫抑制を更に含む。一実施形態では、HSCTがない場合、免疫抑制を実施する。一実施形態では、HSCTと併せて(例えば、HSCTの前、同時、後)免疫抑制を実施する。他の実施形態では、骨髄破壊、リンパ球除去、T細胞除去および/または他の選択的免疫細胞除去、除去または枯渇がない場合、免疫抑制を実施する。さらにもう一つの実施形態では、骨髄破壊、リンパ球除去、T細胞除去および/または他の選択的免疫細胞除去、除去もしくは枯渇と併せて(例えば、前、同時、後)免疫抑制を実施する。
上記のように、骨髄破壊、骨髄細胞枯渇、リンパ球除去、免疫抑制、T細胞除去および/または他の選択的免疫細胞除去は、免疫細胞除去の非制限の典型例で、この適用を通して使用する。一般名「免疫細胞除去」という用語は、これらの各方法、すなわち骨髄破壊、骨髄細胞枯渇、リンパ球除去、T細胞除去および/または他の選択的免疫細胞除去(例えば、B細胞またはNK細胞除去)を含むものとして、ここに定義される。当業者により容易に理解されるように、ここに提供される発明を実践する際に、これら「枯渇」の方法のうちのいずれか1つを、他の「枯渇」の方法のいずれか1つ(または複数)と交換することが可能である。
一実施形態では、NK細胞を除去する。NK細胞集団を除去するために有用なNK抗体は、当技術分野で公知である。例えば、抗NK抗体の1つのソースは、抗ヒト胸腺細胞ポリクローナル抗血清である。米国特許第6296846号では、NK細胞およびT細胞の除去方法に加えて、非骨髄破壊的療法およびキメラリンパ球造血集団の形成について記載しており、これらのすべては、本発明の方法において使用することが可能である。
一部の実施形態では、本発明の方法は、例えばHSCTの前に、ドナーから得た器官(例えば、肝臓または腎臓)の血液灌流によりレシピエントの血液から自然抗体を取り込む方法を更に含む。
他の実施形態では、本発明は、例えば、直接的または間接的(例えば、第二サイトカインの活性レベルの刺激または阻害によって)に移植片に対する寛容を促進するサイトカイン(例えば、IL-10、IL-4またはTGF-β)の活性レベルを高めるか、移植片の拒絶反応を促進するサイトカイン(すなわち、寛容に対して拮抗的または寛容を阻害するサイトカイン[例えば、IFNβ、IL-1、IL-2またはIL-12])の活性レベルを減少させるT細胞補助減少治療を更に含む。一部の実施形態では、寛容を促進するためにサイトカインを投与する。このサイトカインはドナー種またはレシピエント種から得ることができる(例えば、その使用目的で豚のインターロイキン10をコードするDNAについて記載する米国特許第5624823号参照)。介助減少治療の期間は、おそらくレシピエント種の成熟T細胞が、抗原による最初の刺激を受けた後、この抗原に対する拒絶反応を開始するために必要な期間とほぼ同じか、これより短い期間となる(ヒトではこれは通常8〜12日)。他の実施形態では、この期間は、レシピエント種の成熟T細胞が、抗原による最初の刺激を受けた後、この抗原に対する拒絶反応を開始するために必要な期間と同じか、これより2、3、4、5または10倍短い期間となる。介助減少治療の短いコースを、レシピエントの成熟T細胞によるサイトカインの放出を刺激することが可能な治療の有無で、実施することがある(例えば、プレドニゾン治療のない場合[17,21-ジヒドロキシプレグナ-1,4-ジエン-3,11,20-トリオン])。介助減少治療は、移植片が導入される前またはほぼ同時に開始してもよい。介助減少治療の短いコースは、術前または術後に実施してもよい。一部の実施形態では、ドナーとレシピエントはクラスIが一致する。
さらに、造血幹細胞の胸腺への取り込みを高める能力は、樹状細胞の性質およびタイプが操作可能なことを意味する。例えば、幹細胞に胸腺(および体の他の部位)の樹状細胞で最終的に発現する特定の遺伝子を移入することが可能である。本発明の限定を意図しない実施例では、ドナーはレシピエントと血縁であるが、更なるMHC分子またはY染色体(例えば、レシピエントが女性で、ドナーが男性)を発現し、この分子をコードする遺伝子を、レシピエントとドナーのHSCの再構成前に、ドナーのHSCに移入または発現させるか、レシピエント自身のHSC(例えば、性ステロイド除去前または同時にレシピエントから集める)に移入または発現させることが可能である。例えば、MHC(HLAまたはSLA)遺伝子を挿入するための遺伝学的な細胞の修飾法は、当技術分野で公知である(例えば、米国特許第5614187号、第6030833号、第6306651号および第6558663号参照)。ドナーまたはレシピエントのどちらかのHSCの一部は、樹状細胞に発達し、新しく形成したT細胞を、新しい分子が「自己」であると教育する。したがって、教育されたT細胞は、ドナーの移植組織により発現したそのような分子に遭遇すると、この組織を自己と認識して、拒絶しようとはしない。実際に、正の選択には、皮質上皮が特定の分化分子を提供し、第三者細胞がMHC/ペプチドリガンドを提供するというように複数の細胞型を伴う可能性がある。
[BMおよびHSCに及ぼす効果]
本発明は、HSCの産生を増加し、造血を増進することを含む患者のBMの機能を高める方法を提供する。これらの方法は、多くの適用で有用である。例えば、癌または他の目的により施行される化学療法または放射線療法の困難な副作用のうちの1つは、患者のBMにマイナスの影響を及ぼす恐れがある。化学療法の用量によって、BMは損傷または破壊され、血球の産生が妨げられる可能性がある。化学療法後の本発明による性ステロイド類似体(LHRH類似体など)の投与は、化学療法によるBMおよび血球に対する損傷からの回復を助成する。あるいは、化学療法の遂行前の数週間にLHRH類似体を投与することで、化学療法の有害な作用の一部が減少してHSCおよび他の血球の集団が増加する。
BM機能の改善は、例えば血液疾患患者に適用することが可能である。本書では、「血液疾患」は、患者の血流系に直接または間接的に関与する、例えば白血病などの血球新生に伴う障害を含むが、これらには限定されない、あらゆる障害または疾患を意味する。したがって、例えば本発明の方法は、癌に冒された血液系細胞を、同種間HSCTにおいて、または患者自身の細胞による自己由来HSCTの後に、ドナー(一致または一致しない)の新しい細胞と交換するために有用である。
BMによるHSC産生の増加の結果として赤血球の増加が起こり、結果として、RBC産生の管理に有用となる。これは、例えばヘマトクリット値の増加を調べることで容易に判定することができる。
一部の実施例では、増加するHSCは、CD34+HSCである。集結したHSC(例えば、G-CSFを用いて)は、心組織および肺組織などの組織の「修復」または若返りを助けることが可能である。HSCは非造血組織を産生する潜在性を有する。多くの研究がin vitroで実施されているが、ロチェスターのMayo Clinicにおける研究では、BMT後、少数の心筋細胞がドナー由来であることを示している。同様に、ミシガン州のBeuamont病院では、HSCを使用して心筋の損傷を修復しているが、HSCが筋細胞または脈管構造になるかどうかは不明である。また、マウスによる実験では、HSCがインスリン産生β細胞になる可能性を示している。他の研究では、HSCが骨格筋(筋細胞)、肝臓(肝細胞)、骨、結合組織、上皮組織(例えば、肺、腸管および皮膚の)、脈管構造、ニューロンおよび島β細胞になることが可能なことを示している。
ここに記載の方法は、BMに対する損傷を修復および/または様々な治療(例えば、癌の化学療法薬、放射線療法)もしくは疾患(例えば、HIV、慢性腎不全)によって損傷もしくは破壊されている可能性のある血球の交換を助けるために有用である。
すべての血液癌を治療する高用量化学療法などの、一部の化学療法レジメンでは、BMのアブレーションは、所望の効果である。患者の回復時間を短縮するために、アブレーションが生じた直後に本発明の方法を使用してBMを刺激し、HSCの産生およびこれらの後代の血球を増加させることが可能である。化学療法の実施後、通常、化学療法剤が患者の体から取り除かれる1日または数日おいて、ここに記載の方法により、LHRH類似体を患者に投与する。これは自己由来BMもしくは異種BM、または造血幹細胞もしくは前駆細胞との併用に加えて、さらにコロニー刺激因子(CSF)および幹細胞因子(SCF)などの他の因子との併用が可能である。
あるいは、患者はBM機能が不十分(または「疲労する」)で、十分な数または正常な数のHSCおよび他の血球を産生しないことがある。これは、おそらく正常な老化、長引く感染症、化学療法後、放射線療法後、癌、遺伝的異常および移植により誘発される免疫抑制を含む慢性疾患の状態を含む様々な状態によって起こると考えられる。さらに全身照射などの放射線はBMの生産性に対して重大な影響を及ぼす可能性がある。また、これらの状態はマイナスの影響(化学療法および/または放射線療法など)を最小化するために事前に治療するか、この影響をくつがえすために発生後に治療することが可能である。
[T細胞に対する影響]
性ステロイド介在性シグナル伝達の撹乱物質(例えば、GnRH作動薬)を服用することにより、男性および女性の性ステロイドを一時的に阻害することが可能である。ステロイドの減少が、胸腺機能の再活性化を引き起こし、ナイーブT細胞の産生を高めることが認められている。さらに、これら新しいT細胞が胸腺を離れる機会を持つ前でさえ、現存のT細胞は刺激に対して感受性がきわめて高く、この結果、きわめて有効な免疫応答を生じる。この反応性の増進は、性ステロイドの減少の数日以内に明白になる(実施例23参照)。これは、おそらく性ステロイドの抑制作用がないことによると考えられる。これは、外来の刺激と共にT細胞を同時刺激できる、再活性化または再活性化された胸腺による「ヘルパー」因子または「アジュバント」因子の産生によると考えられる。また、免疫系の多くの細胞がGnRHの表面受容体を有するので、GnRH自身がT細胞に対する追加の刺激を加える可能性がある。性ステロイド減少の末梢T細胞に及ぼす作用は非常に迅速なので、GnRHは、例えばワクチンの送達と同時に1回の治療として実施することができる。1カ月間の処方は有用で、長期の性ステロイド減少による副作用なしに免疫応答を刺激する有益な作用を有する。また、抗体の「追加免疫」注射も引き続いて施行することができる。
性ステロイド阻害剤(例えば、GnRH類似体)は、癌患者の特に化学療法または手術から逃れた癌細胞の除去に加えて、日和見感染に対する防御におけるすべての免疫療法を促進するために有用である。また、これらの類似体は、例えば感染症または癌を予防することを目的としたワクチン接種プログラムに対する免疫応答を向上させるために、予防的に使用することも可能である。
本発明の方法では、性ステロイドシグナル伝達の阻害を利用する。性ステロイドは身体の全体を通じて、胸腺およびBMの機能、ならびに血液、リンパ節、粘膜組織(例えば、呼吸器、消化管、生殖器)を含むが、これらには限定されない身体の主要なリンパ領域に集結するTおよびBリンパ球の機能を抑制する。性ステロイドのアブレーションおよび/または性ステロイド介在性シグナル伝達の中断が、胸腺を再生するだけでなく(したがって、さらにT細胞の数量と「質」)、現存および新しく産生されたT細胞の機能性を改善するために(さらに、免疫系の他の細胞)、胸腺再生なしに、胸腺再生前または胸腺再生と同時に使用できることが驚いたことに発見されている。
不十分な免疫応答は、即時の転帰および臨床的に重要な転帰をもたらす可能性がある。これは一般的な感染症(例えば、インフルエンザ)に対する感受性の増加、癌および腫瘍に対する感受性の増加ならびに/またはワクチン接種に対する不十分な反応性を意味する可能性がある。
総T細胞プールにおけるナイーブT細胞の数量および/または比率の増加は、癌、免疫不全(特に、例えば後天性免疫不全症候群(AIDS)および重症急性呼吸器症候群(SAR)またはインフルエンザなどのウイルス感染)、自己免疫、移植、アレルギーを含むが、これらに限定されない多くの臨床(または潜在的臨床)状態および疾患に対して陽性で即効の治療効果を有するだけでなく、ワクチンプログラムの有効性を全般的に向上する。これらの、それぞれの適用は、共同所有される同時係属出願の米国出願連続番号第10/418747、10/419039、10/418953、10/418727、10/419066および10/419068に詳述されている。
また、性ステロイドシグナル伝達の阻害は(例えば、LHRH/GnRH類似体による)、複数の機会で行われる可能性がある。即効は、現存のリンパ球(および非リンパ球)の機能性を高めることによりもたらされる。時間と共に、性ステロイドの減少は、T細胞、B細胞およびAPCの産生および機能性を高め、相加的、相乗的または相補的にこれらの応答を継続して高める。T細胞、B細胞および他の免疫細胞と共に新しいAPCを増加することは、現存のT細胞、B細胞およびAPCの刺激に対する感受性を高めることと共に、患者のドナー移植片に対する寛容を高めるために使用される可能性がある。
したがって、本発明の方法による性ステロイドシグナル伝達撹乱物質が著明な胸腺の再成長を引き起こすことが可能となる前でさえ、これら薬物を、これら免疫細胞の活性および機能性を増加させることにより、臨床的に陽性の効果を引き起こすために使用する。
［DCに及ぼす効果］
また、本発明はDCの機能性および/またはDC数を増加する方法を提供する。性ステロイド除去後(例えば、LHRH類似体の送達後)、DCは胸腺と、T細胞への刺激を助けると考えられる末梢で増加する。
以下の実施例は、本発明の特定の実施例を提供するが、これら内容に対して本発明を制限するものとして解釈されない。
[実施例1：年齢誘発による胸腺萎縮の逆転]
（材料および方法）
動物。
CBA/CAHおよびC57B16/Jオスマウスをモナッシュ大学のCentral Animal Servicesから入手し、通常の状態の下で飼育した。C57B16/J Ly5.1+をモナッシュ大学のCentral Animal Services、Walterand Eliza Hall Institute for Medical Research(ビクトリア州パークビル)およびA.R.C.(ウェスタンオーストラリア州パース)から入手し、通常の状態で飼育した。年齢は4〜6週齢から26カ月齢の範囲で、適切であることを示していた。
外科的去勢
動物を、生理食塩水によるキシラジン0.3mg(Rompun(登録商標);Bayer Australia Ltd.オーストラリア、ボタニーNSW)および塩酸ケタミン1.5mg(Ketalar(登録商標);Parke-Davisオーストラリア、カリンバNSW)の0.3mlの腹腔内注射により麻酔した。外科的去勢は、陰嚢切開により、精巣を出して縫合糸で縛り、周囲の脂肪組織と共に切除した。創傷は外科ステープルを使用して閉鎖した。擬似去勢を、精巣の切除なしの上記の手技によって実施し、全試験で対照として使用した。
ブロモデオキシウリジン(BrdU)取り込み。
マウスに100μLのPBSによりBrdU(Sigma Chemical Co.,ミズーリ州セントルイス)の1回量100mg/kg体重を4時間離して(すなわち、4時間おきに)2回腹腔内注射した。対照マウスには、溶媒のみを注射した。2回目の注射の1時間後、胸腺を解剖し、FACS分析のために細胞懸濁液を作成したか、直ちにTissue Tek(O.C.T.化合物、Miles Inc、インディアナ州)に包埋し、液体窒素で瞬間冷凍して、使用するまで-70℃で保存した。
フローサイトメトリー分析。
マウスをCO2窒息により屠殺し、胸腺、脾臓および腸間膜リンパ節を摘出した。冷却PBS/1%、FCS/0.02%アジドのなかで、器官を200μmのふるいを通して静かに押し、遠心し(650g、5分間、4℃)、PBS/FCS/Azのいずれかに再懸濁した。脾臓細胞は、赤血球溶解緩衝液(8.9g/Lの塩化アンモニウム)で、4℃で10分間インキュベートし、PBS/FCS/Azで洗浄して再懸濁する。細胞の濃度と生存度は、血球計、臭化エチジウム/アクリジンオレンジおよび蛍光顕微鏡(Axioskop;Carl Zeiss、ドイツ、オーバーコッヘン)を通して見ることにより、2回判定した。
3色蛍光抗体法において、細胞を抗αβTCR-FITC、抗CD4-PEおよび抗CD8-APC(すべてPharmingenより入手、カリフォルニア州サンディエゴ)で標識後、フローサイトメトリー分析を実施した。脾臓およびリンパ節懸濁液は、αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APCまたはB220-B(Sigma)+CD4-PEおよびCD8-APCのいずれかにより標識した。B220-Bは、ストレプトアビジン-3-色標識(Caltag Laboratories, Inc.より購入、カリフォルニア州バーリンゲーム)に暴露した。
細胞のBrdU検出のために、細胞の表面をCD4-PEおよびCD8-APCで標識した後、前述のように固定および透過化処理を行った(Carayon and Bord, (1989) J. Imm. Meth. 147:225頁)。簡潔に述べると、染色細胞は1%パラホルムアルデヒド(PFA)/0.01%Tween-20で、4℃で一晩固定した。DNAを変性させるために、洗浄した細胞を、500μLデオキシリボヌクレアーゼ(100 Kunitz units、ロッシュ、米国)で、37℃で30分間インキュベートした。最後に、FACS分析のために、細胞を抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson)で、室温で30分間インキュベートし、洗浄および再懸濁した。
TNサブセットのBrdU分析のために、細胞を、APCでLin-cellをまとめて廃棄後、BrdU検出前に、CD44-ビオチンおよびCD25-PEを検出した。すべての抗体は、Pharmingen(カリフォルニア州サンディエゴ)から入手した。
4色蛍光抗体法のために、胸腺は、抗ラットIg-Cy5(Amersham、イギリス)により一括して検出したCD3、CD4、CD8、B220およびMac-1に対して標識して、陰性細胞(TN)は分析のために廃棄した。さらに、CD25-PE(Pharmingen、カリフォルニア州サンディエゴ)およびCD44-B(Pharmingen、カリフォルニア州サンディエゴ)を染色した後、以前の報告のように(Godfrey and Zlotnik, (1993) Immunol. Today 14:547頁)ストレプトアビジン-3-色標識(Caltag、カリフォルニア州)に暴露した。それから、前述のようにBrdU検出を実施した。
試料はFACSCalibur(商標)(Becton Dickinson)により分析した。生存可能なリンパ球は、0°および90°光散乱プロフィールにより回収し、データはCellQuest(商標)ソフト(Becton-Dickinson)を使用して解析した。
免疫組織学。
凍結した胸腺切片(4μm)は、クリオスタット(Leica)を使用して切断し、直ちに100%アセトンで固定した。
2色蛍光抗体法のために、切片はモノクローナル抗体(のパネル)(MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35および44[Godfreyら、(1990) Immunol. 70:66頁;表1]、本研究室で作成)で二重標識し、同時発現する上皮細胞の決定因子を多価ウサギ抗サイトケラチンAb(Dako、カリフォルニア州カーピンテリア)により評価した。結合したmAbを、TRITC接合ヒツジ抗ラットIg(Silenus Laboratories、オーストラリア、ビクトリア)に暴露し、抗サイトケラチンを、FITC接合ヤギ抗ラットIg(Silenus Laboratories、オーストラリア、ビクトリア)に暴露した。
切片のBrdU検出のために、切片は抗サイトケラチン染色後、抗ウサギTRITCに暴露するか、特定のmAbで染色後、抗ラットIg-Cγ3 (Amersham、スウェーデン、ウプサラ)に暴露した。次にBrdU検出は、以前の報告のように実施した(Penitら、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86:5547頁)。簡潔に述べると、切片を70%エタノールで30分間固定した。半乾燥切片を4M HCl内でインキュベートし、ホウ酸塩緩衝液(Sigma)で洗浄し、引き続いてPBSで2回洗浄することにより中和した。BrdUは、抗BrdU-FITC (Becton-Dickinson)を使用して検出した。
3色蛍光抗体法のために、切片は抗サイトケラチンと共に特定のMTS mAbに対して標識した。それから、前述のようにBrdU検出を実施した。
切片は、Leica蛍光顕微鏡およびNikon共焦点顕微鏡を使用して分析した。
移行試験(すなわち、新たな胸腺定着(RTE)の分析)。
動物を、生理食塩水によるキシラジン0.3mg(Rompun(登録商標);Bayer Australia Ltd.オーストラリア、ボタニーNSW)および塩酸ケタミン1.5mg(Ketalar(登録商標);Parke-Davisオーストラリア、カリンバNSW)の0.3mlの腹腔内注射により麻酔した。
胸腺細胞技術のFITC標識の詳細は、他の文献で報告されたものと同様である(Scollayら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86:5547頁; Berzinsら、(1998) J. Exp. Med. 187: 1839頁)。簡潔に述べると、胸腺葉を暴露し、各葉におよそ10μmのFITC350μg/mL(PBS内)を注射した。創傷は外科ステープルを使用して閉じ、マウスが完全に麻酔からさめるまで保温した。注射の約24時間後、マウスをCO2窒息により屠殺し、分析のためにリンパ臓器を摘出した。
細胞数の計測後、試料を抗CD4-PEおよび抗CD8-APCで染色し、引き続いてフローサイトメトリーにより分析した。移行細胞は、CD4またはCD8を発現するlive-gated FTTC+細胞として同定した(自己蛍光細胞およびダブレットを取り除くために)。それぞれリンパ節および脾臓の総移行比を得るために、FITC+CD4およびCD8細胞の比率を加えた。Berzinsらの報告のように((1998) J. Exp. Med. 187: 1839頁)、毎日の搬出率を算出した。
独立スチューデントのt検定またはノンパラメトリックなマンホイットニーのU検定により解析したデータを使用して、少なくとも3回実施した実験の対照と試験結果との統計的有意性を判定した。対照値と有意に異なる実験値は以下のように示す、*p≦0.05、**p≦0.01 and ***p≦0.001。
（結果）
I. 年齢の胸腺細胞集団に及ぼす影響。
(i)胸腺重量および胸腺細胞数
年齢が高くなるにつれて、マウスの胸腺重量(図1A)および総胸腺細胞数(図1B)の双方で、極めて有意な(p≦0.0001)減少が認められた。若齢成体の相対胸腺重量(mg胸腺/g体重)の平均値は3.34で、18〜24カ月齢では0.66に減少する(脂肪の蓄積により、正確な測定が制限される)。胸腺重量の減少は、総胸腺細胞数の減少に起因する可能性がある。1〜2カ月齢(すなわち若齢成体)の胸腺は、6.7×107の胸腺細胞を含み、24カ月齢までにおよそ4.5×106の細胞に減少する。去勢によって性ステロイドの胸腺に及ぼす影響を取り除くことにより、胸腺細胞数は再生し、去勢の4週間後までに、胸腺は、重量(図1A)および細胞充実性(図1B)において若齢成体のものと同等となる。興味深いことに、去勢の2週間後に胸腺細胞数の有意な(p≦0.001)減少が認められたが(1.2×108)、去勢の4週間後までに正常な弱齢生体のレベルまで回復する。
胸腺により産生されるT細胞数の減少は末梢には反映されず、脾臓での細胞数は年齢を通じて一定である(図2Aおよび2B)。末梢での恒常性のメカニズムは、脾臓およびリンパ節におけるT細胞対B細胞比が年齢に影響されず、末梢に到達するT細胞数が引き続き減少ずることから(図2C)、明白であった。しかし、CD4+T細胞対CD8+T細胞比は、2カ月齢の2:1から、2歳の1:1へ、年齢につれて有意に減少した(p≦0.001;図2D)。去勢および続いて起こる末梢に達するT細胞数の増加の後、末梢T細胞数の変化は認められなかった。脾臓およびリンパ節における脾臓T細胞数とB:T比は、去勢後に変化しなかった(図2A-C)。年齢による末梢でのCD4:CD8比の減少は、去勢の2週間後に依然として明白であったが、去勢の4週間後までには完全に逆転した(図2D参照)。
(ii)年齢および去勢後に関する胸腺細胞亜集団
年齢と共に見られる胸腺細胞数の減少が、特定の細胞集団の除去の結果によるものであるか判定するために、胸腺に識別マーカーの標識をして独立した亜集団を分析した。さらに、これは去勢後の胸腺再生における動態の分析を可能にした。主要な胸腺細胞亜集団の比率を、若齢成体(2〜4カ月齢)の胸腺(図3)の亜集団の比率と比較したところ、年齢を通じて均一であることが認められた。さらに、αβTCRの発現による別の腺細胞の亜集団は、年齢を通じて、これらの比率に変化が見られなかった。去勢の2週後と4週後、胸腺細胞亜集団は同じ比率を維持していたが、胸腺細胞数が去勢後に最高で100倍増加したので、このことは増殖の発達的進行というよりむしろすべての胸腺細胞亜集団の同調的な増殖を示している。
T細胞集団における有意な変化は検出されず、したがって、老齢(2歳)の動物の胸腺で見られる細胞数の減少は、すべての細胞の表現型でのバランスのとれた減少の結果と思われた。胸腺再生は同調的な様式で生じ、すべてのT細胞亜集団が経時的というよりむしろ同時に補充される。
II. 胸腺細胞の増殖
図4A〜4Bで示すように、胸腺細胞の15〜20%は、2〜4カ月齢時に増殖していた。これらの大半(約80%)は、ダブルポジティブ(DP)(すなわちCD4+、CD8+)で、2番目に大きな集団(約6%)のサブセットはトリプルネガティブ(TN)(すなわちCD3-CD4-CD8-)である(図5A)。これらのTN細胞は胸腺において最も未成熟な細胞で、胸腺内前駆細胞を含む。したがって、大部分の分裂は、免疫組織検査により莢膜下および皮質において見られる。若齢個体(2カ月齢)の胸腺分裂では、シングルポジティブ(すなわちCD4+CD8- またはCD4-CD8+)細胞が見られる(CD4+T細胞の9%、CD8+T細胞の25%) FACS分析に合わせると、一部の分裂は、延髄部位で見られる(図5B)。
老齢マウスの胸腺(2歳)では、細胞数が著明に減少するが、増殖する胸腺細胞の総比率は一定を維持した(図4Bおよび5C)。しかし、CD4-CD8-では、分裂細胞の比率が減少し、CD4-CD8+T細胞の増殖も有意に減少した(p≦0.001)(データの掲載なし)。免疫組織検査では、1歳時での分裂細胞の分布は、若齢成体(2〜4カ月齢)で見られる分布に反映することを示した。しかし、2歳時では、増殖は主に外側の皮質と周辺の脈管構造において見られ、髄質では分裂は非常に少ない。
早くも去勢の1週間後に、増殖するCD4-CD8-細胞およびCD4-CD8+細胞の比率が著明に増加した(データの掲載なし)。去勢は、明らかに年齢によるこれら細胞の増殖の阻害を克服している。去勢後、増殖するCD4+CD8-細胞の対応比率に減少が見られた(データの掲載なし)。去勢の2週間後、胸腺細胞数は著明に増加したが、増殖する胸腺細胞の全体的比率に変化は認められず、再度、細胞の同調的な増殖が認められた(図4A、4B、5C)。免疫組織検査では、胸腺細胞増殖の局在性および分裂細胞の範囲が、去勢の2週間後の2カ月齢個体の胸腺の状況と類似することを示した。
胸腺細胞前駆体に加えて、DN亜集団は、SP細胞への移行で両方の補助受容体を下方制御すると考えられる(Godfrey and Zlotnik, (1993) Immunol. Today 14:547頁)αβTCR +CD4-CD8-胸腺細胞を含む。これらの成熟細胞を廃棄することで、真のTN区画(CD3-CD4-CD8-)およびCD44およびCD25を発現するこれらの亜集団を分析することができた。図5E-Hは、若齢、老齢および去勢マウスにおけるTN細胞の各サブセット内の増殖範囲を示している。ここでは、TN1サブセット(CD44+CD25-CD3-CD4-CD8-)の増殖で、正常な若齢マウスの約10%から18カ月齢マウスの約2%(去勢の1週間後に回復)へと(図5E)有意(p<0.001)な減少を示している。
III. 胸腺細胞遊出
若齢マウスでは、胸腺から毎日およそ1%のT細胞が遊離する(Scollayら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86:5547頁)。14カ月齢の(2歳ですら)去勢マウスでの遊離が、正常な若齢マウスと同等な比率で起こることが認められているが、数量では有意に減少する(p≦0.0001)(図6Aおよび6B)。新たな胸腺定着でのCD4:CD8比が、2カ月齢の約3:1から26カ月齢の約7:1へ増加していることが認められた(図6C)。去勢の1週間後までに、この比は正常化した(図6C)。去勢の2週間後までに、末梢に移行する細胞数は、胸腺の増殖を反映して移行の全体的な比率が0.4%に減少したことに伴い、実質的に増加した(図6B)。
考察
老齢マウスの胸腺は極度に萎縮しているが、若齢成体マウスと同等なレベルで起こるT細胞の増殖、分化および移行により、年齢を通じて機能的能力を維持していることが認められている。胸腺機能は、神経-内分泌-免疫軸の間のいくつかの複雑な相互作用によって制御されているが、性ステロイド産生により誘発される萎縮は、去勢後の胸腺再生の程度によって示される、最も著明で、長期的な影響を及ぼす。
胸腺重量は、以前の報告のように(Hirokawa and Makinodan, (1975) J. Immunol. 114:1659頁、Aspinall, (1997) J. Immunol. 158:3037頁)年齢と共に著明に減少し、胸腺細胞数の著明な減少と相関する。去勢術により誘発されるストレスは、コルチコステロイド作用による更なる胸腺萎縮を引き起こす可能性があるが、去勢の2週間後、性ステロイドの影響が取り除かれ、細胞充実度が去勢以前の胸腺から20〜30倍増加することにより無効にすることができる。去勢の3週間後までに、老齢マウスの胸腺は、胸腺の大きさと細胞数の両方で著明な増加を示し、おそらく、すでに2歳のマウス自身で発揮されていた性ステロイドの作用により、若齢成体マウスの胸腺の大きさと細胞数を凌ぐようになる。
本データは、年齢を通じて継続した胸腺細胞の分化する能力および一定のサブセット比率を維持する能力について強調する以前の知見を確認している(Aspinall, (1997) J. Immunol. 158:3037頁)。さらに、胸腺細胞の分化は、去勢後に同時に起こることが認められており、胸腺細胞セブセットにおける同調的な増殖を示す。胸腺細胞数は年齢に伴い著明に減少するので、このことが胸腺萎縮の寄与因子であるか判定するために胸腺細胞の増殖を分析した。
胸腺細胞の増殖は、年齢誘発の胸腺萎縮による影響または胸腺細胞が全体で約14%増殖した去勢後の性ステロイドの影響を排除することによる影響を受けなかった。しかし、この分裂の局在化は年齢により異なることが認められた。2カ月齢マウスの胸腺では、被膜下および皮質領域(TNおよびDP T細胞)を通して、豊富な分裂が見られ、髄質でも多少の分裂が認められた。年齢に伴う胸腺上皮の分裂による増殖の局在化を区別することは難しいかったが、若齢成体に比べて、パターンが均一ではなく、外側の皮質において行われると考えられた。去勢の2週間後までに、皮質を通して分裂する胸腺細胞が検出され、髄質では明白で、2カ月齢マウスの胸腺と同等な分布が認められた。
CD4およびCD8分析により判定された増殖集団の表現型は、年齢または去勢後による変化は認められなかった。しかし、胸腺細胞亜集団内の増殖の分析は、TNおよびCD8+細胞の増殖が年齢と共に著明に減少することを示していた。さらに、マーカーのCD44およびCD25を基にしたTNサブセット内の分析では、TN2(CD44-CD25+)集団の増加により補われるTN1(CD44+CD25-)集団の著明な減少を示した。これらのTN集団内における異常は、Aspinall((1997) J. Immunol. 158:3037頁)の知見を反映している。驚いたことに、TNサブセットは、性ステロイド作用の抑制に対して直ちに反応し、去勢の2週間後までには正常レベルで増殖していた。さらに、去勢の2週間後と4週間後、増殖するCD8+T細胞の比率は、対照の胸腺に比べて顕著な増加を示し、おそらく、このことは再確立における末梢のT細胞プールの役割を示していた。
以前のScollayら( (1980) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86:5547頁)による胸腺細胞の末梢への移行率が10分の1に減少することを示すデータと相反して、胸腺細胞の移行は、年齢を通じて一定の胸腺細胞比で起こることが認められた。これらの結果の差は、2歳マウスの胸腺における胸腺内FITC標識の難しさ、または脂肪蓄積のFITC取り込みに及ぼす影響によると考えられる。しかし、移行するT細胞の絶対数は、Scollayにより発見されたように著明に減少し、この結果、末梢T細胞プールへのRTEの比率が著明に減少した。このことはT細胞レパートリーに主に影響を及ぼす抹消に変化をもたらす(Mackallら、(1995) N. Eng. J. Med. 332: 143頁)。以前の文献では(例えば、Mackallら、(1995) N. Eng. J. Med. 332: 143頁)、T細胞レパートリーが年齢と共にナイーブT細胞表現型よりむしろ記憶T細胞レパートリーへそれることを示している。しかし、T細胞レパートリーの減少は、個人が新たな病原に遭遇した場合、対処することができず、おそらく、このことは老齢マウスでの免疫不全によって説明される。明らかに、免疫無防備状態の個人において、T細胞プールを再確立する必要がある。去勢により、ナイーブT細胞の産生を著明に高めることによって、胸腺が再び末梢のT細胞を増加するようになる。
末梢では、脾臓およびリンパ節のB細胞:T細胞比で証明されたように(Mackallら、(1995) N. Eng. J. Med. 332: 143頁、Berzinsら、(1998) J. Exp. Med. 87: 1839頁)T細胞数は一定レベルで維持されるが、これはおそらく末梢の恒常性によるものと考えられる。しかし、末梢の細胞構成の破壊は、老齢マウスの胸腺で明白であり、CD4:CD8比において若齢成体の2:1から2歳マウスの1:1への著明な減少が認められた。このことはCD4+T細胞が加齢に対してより感受性を示すか、胸腺以外の供給源からのCD8+T細胞の産生が増加していることによると考えられる。去勢の2週間後までに、再度、外科的去勢に対する免疫系の即座の反応に反映して、この比率は正常化されている。
上記の所見は、第1に、老齢マウスの胸腺が、思春期前のマウスの胸腺と同等の性質で機能することが可能なことを示している。この点で、T細胞数は著明に減少するが、胸腺細胞の分化する能力は妨げられることはない。重ねて、これらの増殖する能力および最終的に末梢に移行する能力は、胸腺の年齢に関連する萎縮によって影響されるものではない。しかし、2つの重要な知見が認められた。第1に、Aspinall((1997) J. Immunol. 158:3037頁)による知見と関連して、TN細胞の増殖能でTN細胞に対する有害作用があると考えられる。この欠陥は、胸腺細胞自身の固有の欠陥に起因する可能性がある。ここではデータは示していないが、以前の試験では、胸腺細胞の分化は減少するが、依然として起こり、BMからの幹細胞の移行も加齢の影響を受けないことを示している(Hirokawa, (1998), "Immunity and Ageing," in PRINCIPLES AND PRACTICE OF GERIATRIC MEDICINE, (M. Pathy, ed.) John Wiley and Sons Ltd、Mackall and Gress, (1997) Immunol. Rev. 160:91頁)。第2に、CD8+T細胞は、年齢に伴い増殖能が著明に減少し、去勢後、2歳のマウスと比べて、CD8+T細胞の比率が著明に増加した。成熟T細胞の増殖は、移行前の最終段階と考えられ(Suda and Zlotnik, (1991) J. Immunol. 146:3068頁)、CD8+増殖の著明な減少は、これらの移行の潜在性を減少することを示している。この仮説は、RTEにおけるCD4:CD8T細胞比が年齢と共に増加し、このことはCD8T細胞の移行の減少を示すという知見により裏付けられる。あるいは、胸腺上皮がCD8T細胞維持のために主要な要因を提供している場合、リンパ間質分子またはサイトカインの影響にかかわらず、この要因は性ステロイドの産生増加により妨げられる可能性がある。性ステロイドの影響を取り除くことにより、CD8T細胞集団は、再度、最適に増殖することができる。
観察されたTN1サブセットの増殖での欠陥は、皮質上皮の減少がTCR遺伝子再配列の重要な段階で胸腺細胞の発達に影響を及ぼし、それによって皮質上皮は、胸腺形成に必要なIL-7およびSCFなどの因子を提供することを示している(Godfrey and Zlotnik, (1993) Immunol. Today 14:547頁; Aspinall,(1997) J. Immunol. 158:3037頁)。実際に、IL-7-/-およびIL-7R-/-マウスは、老齢マウスと同様の胸腺形態を示す(Wilesら、(1992) Eur. J. Immunol. 22:1037頁、Zlotnik and Moore, (1995) Curr. Opin. Immunol. 7:206頁); von Freeden-Jeffry, (1995) J. Exp. Med. 181: 1519頁)。
結論として、老齢マウスの胸腺は機能的能力を依然として維持するが、老齢マウスで発達する胸腺細胞は、胸腺微小環境の構造上の完全性を欠いているため、正常な若齢マウスで見られるような胸腺上皮細胞による厳密な管理下にはない。したがって、これら細胞の増殖、分化および移行は最適の制御下に置かれることはなく、結果として、末梢において自己反応性/免疫機能障害性T細胞の放出が増加する可能性がある。TNおよび特にCD8+集団内の欠陥は、末梢のT細胞プール内で年齢に伴う変化をもたらす可能性がある。去勢による胸腺機能の回復は、末梢のT細胞プールを再生させ、したがって、免疫抑制を受ける、免疫不全の、または免疫無防備状態の個人における免疫を再確立させるために必要な手段を提供する。
[実施例2：化学療法または放射線誘発胸腺萎縮の逆転]
（材料および方法）
材料および方法は実施例1の記載に準ずる。さらに、下記の方法を使用した。
BM再形成。
レシピエントマウス(3〜4カ月齢C57BL6/J)に、3時間の間隔をおいて5.5Gy照射を2回当てた。2回目の放射線照射の1時間後、マウスに5×106ドナーBM細胞を静注した。BM細胞は、RPMI-1640培養液をドナー(2カ月齢コンジェニックC57BL6/J Ly5.1+)マウスの脛骨および大腿骨の中を通して、培養液で収集した細胞を採取した。
照射。
3〜4カ月齢マウスに、625ラドの全身γ-照射を当てた。
シクロホスファミドによるT細胞の除去。
老齢マウス(例えば、2歳)に、シクロホスファミド(2日にわたり200mg/kg体重)を注射し、去勢した。
（結果）
去勢は、高度のT細胞除去(TCD)の後に再生を高めた。2つのT細胞除去試験モデル(シクロホスファミドを使用する化学療法または625ラドを使用する致死量以下の照射)において、去勢(Cx)マウスは、擬似去勢(ShCx)対照と比べて、胸腺の再生率で著明な増加を示した(図7Aおよび7B)。治療の1週間後までに、この初期ですら去勢マウスは著明な胸腺再生を示した(図7および9〜11)。それとは対照的に、非去勢マウスは、DNおよびDP胸腺細胞(急速に分裂する細胞)の大きな消失とこれに引き続くCD4およびCD8細胞(放射線抵抗性)の比率の増加を示した。これは去勢マウスの胸腺細胞数の違いを最もよく示す例証で、治療の1週間後ですら、少なくとも胸腺サイズが4倍拡大する。2週後までに、非去勢マウスでは、DNおよびDP胸腺細胞の再生において、相対的に正常な胸腺が認められる。しかし、胸腺細胞の比率は、若齢成体の対照胸腺とはまだ同等でない。実際に、去勢マウスと非去勢マウスの制御率の大きな差は、2週間後に最大であった(4週後までに、胸腺細胞数は、治療群間で同等だった)。
シクロホスファミド治療の1週間後、胸腺の細胞充実度は、対照マウス(未治療、年齢一致、p≦0.001)およびCxマウス(p≦0.05)に比べて、ShCxマウスで有意に減少した(図7A)。この時点で、胸腺再生率は、治療の1週間前および治療当日に去勢したマウスの間に差は認められず、両群ともShCxマウスと比べて細胞数が最低2倍の増加を示した(図7Aおよび8A)。同様に、シクロホスファミド治療の2週間後、Cxマウスの両群は、胸腺細胞数がShCxマウスより有意に多かった(5〜6倍、p≦0.001)(図7A)。対照マウスでは、4週間にわたって、胸腺細胞数が漸進的な回復を示したが、去勢により1週間以内ですら顕著に増加した(データの掲載なし)。同様に、1週間後、去勢マウスにおいて脾臓およびリンパ節数が増加した(データの掲載なし)。
去勢のタイミングの胸腺回復に及ぼす影響について、照射の1週間前(図10)または照射の当日(図11)に去勢することにより判定した。1週間前に実施すると、去勢は胸腺回復に対して、より迅速な影響を及ぼした(図11Aと比較して図10A)。2週間までに、当日に去勢したマウスの胸腺回復は、1週間前に去勢したマウスの胸腺回復に「追いついた」。両方の場合とも、脾臓またはリンパ節に対して主要な影響は認められなかった(図10Bおよび図10C、ならびに図11Bおよび図11C)。
照射治療後、ShCxおよび治療と同日に去勢したマウス(SDCx)とも、対照マウス(p≦0.001)(図7Bおよび11A)および治療の1週間前に去勢したマウス(p≦0.01)(図7B)と比べて、有意な胸腺細胞充実度の減少を示した。治療の2週間後、去勢レジメンは、去勢マウスの両群において胸腺細胞数の回復になんら役割を果たすことはなく、ShCxマウスと比べて、照射後(PIrr)、胸腺細胞充実度の有意な増大を示した(p≦0,001)(図7B、10Aおよび11A)。したがって、去勢は、高度のT細胞除去(TCD)の後に胸腺再生を高め、免疫系侵襲の最低1週間前に実施することができる。
興味深いことに、胸腺サイズは、ベースラインの対照胸腺から「行き過ぎる」ようである。胸腺内では迅速な増殖を示すが、これら新しく誘導された胸腺細胞の移行はまだ起こらない(胸腺細胞が末梢を通して、および末梢へ移行するには約3〜4週を要する)。したがって、各亜集団の比率は同等であるが、胸腺細胞数は、末梢に放出される前に増加する。
若齢マウス(約2〜3カ月齢)のシクロホスファミド治療の後、Cxマウスの脾臓内の総リンパ球数は、分析の時間経過を通して減少したが、対照マウスと著明な差は認められなかった(データの掲載なし)。しかし、ShCxマウスは、治療の1週間後および4週間後、総脾細胞数に有意な減少を示した(p≦0.05)(図8A)。治療の1週間後、リンパ節内において、擬似去勢マウスおよび去勢マウスに、ストレスステロイドの影響を反映すると考えられる細胞充実度の有意な減少が観察された(p≦0.01)(図8B)。治療の2週間後までに、去勢マウスのリンパ節細胞充実度は、対照マウスと同等となったが、擬似去勢マウスは治療の4週間後まで、リンパ節細胞数が回復せず、治療の2週間後、対照マウスおよびCxマウスと比べて細胞充実度が有意(p≦0.05)に減少した(図8B)。これらの結果は、去勢がシクロホスファミド治療後の総リンパ節数の回復率を高めることが可能なことを示している。
致死量以下の照射(625ラド)は、治療の1週間後、両治療群(CxおよびShCx)が、対照マウスと比べて脾臓およびリンパ節の細胞充実度に有意な減少を示す(p≦0.001)というように重大なリンパ球減少を誘発した(図12Aおよび12B)。照射の2週間後までに、去勢マウスおよび擬似去勢マウスにおいて、脾臓細胞数は対照値と同等となったが(図12A)、リンパ節細胞数は依然として対照値より有意に低かった(擬似去勢マウスp≦0.001、去勢マウスp≦0.01)(図12B)。CxマウスおよびShCxマウスの間で有意な差は観察されなかった。
図9は、T細胞再生を増進することにおける外科的治療と比較した化学的去勢の使用を示している。本実施例で使用した化学物質のデスロレリン(LHRH-A)を、4週間注射して、外科的去勢と比較したところ、シクロホスファミド治療後の再生率と同等の比率を示した。胸腺増殖に及ぼす増進効果、さらに脾臓およびリンパ節の回復に及ぼす増進効果は同等であった。化学的去勢での動態は、外科的去勢より緩やかであり、循環する性ステロイド濃度を減少するために、さらに約3週間を要した。しかし、化学的去勢は、依然として外科的去勢同様に有効で、同等の効果を持つと考えられる。
（考察）
去勢の胸腺構造およびT細胞産生に及ぼす影響を免疫除去の動物モデルで調査した。特に実施例2では、致死量以下の照射およびシクロホスファミド治療後の免疫系回復に対する去勢の影響について調査した。これらの免疫除去法は、DNA合成を阻害するために作用することで、迅速に分裂細胞を標的にする。胸腺において、これらの細胞は主に未成熟の皮質胸腺細胞であるが、すべてのサブセットが影響を受ける(Fredrickson and Basch, (1994) Dev. Comp. Immunol. 18:251頁)。正常で健康な老齢マウスにおいて、末梢T細胞の定性的および定量的な偏りは、ほとんど病理学的状態には至らない。しかし、T細胞の極度の除去の後、T細胞再生のための胸腺の能力が減少するため、重大な問題が発生する。そのような損傷がHIV/AIDS、さらに癌治療の特に化学療法および放射線療法の後に起こる(Mackallら、(1995) N. Eng. J. Med. 332: 143頁)。
致死量以下の照射を受けたマウスとシクロホスファミド治療を受けたマウスで、去勢により胸腺再生が顕著に増進した。免疫除去の当日および7日前に去勢を実施して、外科的去勢に対する主にコルチコステロイド誘発のストレス反応の胸腺再生に及ぼす影響について評価した。胸腺の細胞充実度および構造の増加が、早くも免疫除去の1週間後に見られたが、主な相違は去勢の2週間後に観察された。これは去勢が免疫除去の当日または1週間前に実施されたかどうかという場合である。
免疫組織検査は、去勢の2週間後、すべての場合で、胸腺構造が表現型の上では正常のように見え、一方、非去勢マウスの胸腺構造はみだれていることを実証した。パン上皮マーカー(pan epithelial marker)は、免疫除去が皮質上皮の崩壊および非去勢マウスの胸腺における胸腺構造の全体的破壊を引き起こすことを実証した。延髄のマーカーはこの知見を裏付けた。興味深いことに、去勢誘発の胸腺再生に関する最初の特徴の1つは、MTS16で同定される細胞外基質での著しい上方制御であった。
フローサイトメトリー分析データは、去勢マウスで胸腺細胞の全サブセットの細胞数が著明に増加することを示している。各時点で、免疫除去および去勢の後、すべてのCD4、CD8およびαβ-TCR定義のサブセットに同調的な増加が認められた。これは普通ではないが、一致した結果が見られる。そして、T細胞の発達が進行性過程なので、おそらく、前駆細胞で最初に増加し(CD4-CD8-ゲートを含む)、さらに、これが最初の測定時点の前に起こると予測される。さらに、前駆体は全胸腺細胞の非常に小さな部分に過ぎないので、これらの数量の変化は検出できなかったのであろう。また、去勢のマクロファージおよび顆粒球を含む他の細胞に及ぼす影響について分析した。通常、胸腺内のマクロファージおよび顆粒球の数量に変化は見られなかった。
免疫除去の照射モデルおよびシクロホスファミドモデルにおいて、胸腺細胞数は2週ごとにピークに達し、治療の4週間後減少した。照射または化学療法のほぼ直後に、胸腺の重量および細胞充実度は劇的に減少し、およそ5日後に第一段階の胸腺再生が始まった。再形成の第一波は(5〜14日)、放射線抵抗性胸腺細胞(主にダブルネガティブ)の増殖によりもたらされ、すべての胸腺細胞サブセットに引き起こした(Penit and Ezine, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86:5547頁)。2番目の減少は、16〜22日目に観察され、放射線抵抗性細胞の増殖能が限られていたことに加えて、BMによる胸腺前駆体の産生が減少したことにより引き起こされた(また、照射にも影響された)。2番目の再生期は、BM誘導前駆体による胸腺の補充により引き起こされた(Huiskampら、(1983) Radiat. Res. 95: 370頁)。
成熟マウスにおいて、HSCから成熟T細胞への発達には、約28日を要する(Shortmanら、(1990) Sem. Immunol. 2:3頁)。したがって、治療の4週間後まで末梢のT細胞に、ほとんど変化が見られないのは驚くにはあたらない。末梢は一部の胸腺の搬出によって維持されているが、治療の4週間後までに末梢で発見される大部分のT細胞は、除去細胞が存在しない場合に広がるシクロホスファミドまたは照射耐性クローンを増殖させると推測される。抹消におけるいくつかの長期の変化が去勢後に予期されるが、このなかには最も重要な胸腺の搬出の増加によるTCRレパートリーの多様化も含まれる。
[実施例3：性ステロイド阻害後の胸腺再生は、不十分な末梢T細胞機能の回復を引き起こす]
（材料および方法）
材料および方法は、実施例1および2の記載に準ずる。さらに、下記の方法を使用した。
HSV-1免疫。
老齢マウス(≧18カ月齢)を外科的に去勢した。去勢の6週間後(胸腺の再活性化後)。麻酔後、マウスに対して、20ゲージ針を使用して無菌PBSによる4×105プラーク形成単位の(pfu)HSV-1(KOS系)を後肢(足-踵関節)に注射した。感染したマウスを隔離したケージに入れて飼育し、免疫接種の5日後に人道的に屠殺して、膝窩(流入領域)リンパ節を分析のために摘出した。
ウイルスはFrank Carbone準教授(メルボルン大学)から入手した。ウイルス株は5%FCS(Gibco-BRL、オーストラリア)を追加したMEMにおいて、ベロ細胞単層で増殖および滴定した。
流入領域(膝窩)リンパ節の分析は、感染の5日後に実施した。HSV-1試験では、膝窩リンパ節細胞を抗CD25-PE、抗CD8-APCおよび抗Vβ10-ビオチンに対して染色した。CD45.1-FITC、I-Ab-PEおよびCD11c-ビオチンの染色前に、DC検出のために、FcRブロックを使用した。すべてのビオチン化抗体をストレプトアビジン-PerCPで検出した。HSC検出のため、抗CD3、CD4、CD8、Gr-1、B220およびMac-1(すべてFITCに結合)で一括して染色することにより、BM細胞をLin-細胞で回収した。HSCをCD117-APCおよびSca-1-PEで染色することにより検出した。TN胸腺分析では、細胞をLin-集団で回収し、CD44-ビオチン、CD25-PEおよびc-kit-APCで染色することにより検出した。
リンパ節細胞の細胞毒性測定。
リンパ節細胞を6.5%CO2、37℃で3日間インキュベートした。特異性はgB498-505ペプチド(gBp)で標識した非形質移入細胞系(EL4)および対照としてEL4細胞単独を使用して判定した。開始エフェクター:標的比30:1を使用した。プレートを6.5%CO2、37℃で4時間インキュベートし、650gmaxで5分間遠心した。上澄み(100μL)を、各ウェルから収集し、Packard Cobra auto-gamma計数管による測定のためにガラス発酵管に移した。
（結果）
胸腺再生の機能的結果を判定するために(例えば、去勢が免疫反応を高めるかどうか)、疾患進行およびCTLの試験を可能にする単純ヘルペスウイルス(HSV)免疫接種に対して検討した。去勢マウスでは、本ウイルスに対する反応性が質的および量的に改善していることが認められた。
マウスは、足蹠に免疫接種し、免疫接種の5日後に膝窩(流入領域)リンパ節を分析した。さらに、足蹠を摘出およびホモジナイズして、試験期間中の特定の時点のウイルス価を測定した。HSV-1感染(図13-17)に対する局所(膝窩)リンパ節反応を検査した。
年齢に伴うリンパ節細胞充実度の著明な減少が観察された(図13A、13Bおよび14)。免疫接種の5日後、去勢マウスは、老齢マウスより著明に高いリンパ節細胞充実度を示した(データの掲載なし)。活性化(CD84+CD25+)細胞集団において、年齢に伴う差または去勢後の差は見られなかったが(図15)、老齢対照マウスと比べて、リンパ節内の活性化細胞数は去勢により著明に増加した(データの掲載なし)。さらに、活性化細胞数は若齢成体で発見された値と相関しており(データの掲載なし)、このことは去勢マウスではCTLの活性化の程度がより大きいが、若齢成体ではB細胞活性化によりリンパ節が肥大していた可能性を示していた。これは、加齢または去勢後に生じる特定の溶解の比率を検出するCTL測定で確認された(図16)。老齢マウスは、エフェクター:標的比が若齢成体(2カ月齢)マウスの3:1に比べて、10:1で標的細胞の著明な減少を示した。去勢により、HSV感染後の特定のCTL反応を生成するマウスの能力を回復させた(図16)。
さらに、活性化細胞によるVβ10の全体的な発現は年齢を通じて一定であったが(データの掲載なし)、老齢(18カ月齢)マウスの亜集団では、このクローン反応の減退が認められた(図14A〜C)。去勢の6週間後までに、浸潤するリンパ節細胞の総数および活性化CD25+CD8+細胞数は若齢成体レベルまで増加した(データの掲載なし)。しかし、より重要なことは、去勢は、老齢マウスでは非常に減少した(図16)HSV感染標的細胞に対するCTL反応性を著明に高め、リンパ節のCD4:CD8比を回復したことである(図17B)。実際、若齢成体マウスと去勢マウスと比べて、年齢による流入領域リンパ節でのCD4+T細胞の減少が見られ(図17B)、したがって、このことは最大の免疫反応を得るには、一生を通じて胸腺からのT細胞の産生を増加する必要があることを強く示している。
[実施例4：性ステロイドの阻害は、新しい造血前駆細胞の胸腺への取り込みを高め、宿主とドナーリンパ細胞(T、BおよびDC)のキメラ混合を可能にする。]
リンパ細胞(T、BおよびDC)のキメラ混合を可能にする。
材料および方法は、実施例1〜3の記載に準ずる。さらに、下記の技術を使用した。
以前の試験は、マイクロキメラ形成が臓器移植の受け入れにおいて、重要な役割を果たすことを示している。また、DCも移植抗原に対する寛容において複合的な役割を果たすことを示している。したがって、胸腺のキメラ形成および樹状細胞数に対する去勢の影響について検討した。
胸腺再生での幹細胞取り込みの役割を評価するために、実施例2に記載のようにBM再形成を実施した。
同系実験では、各治療群で3カ月齢マウス(n=4)を使用した。すべての対照は年齢が一致した未治療のマウスであった。
（結果）
去勢および非去勢再構成マウスと年齢の一致した対照マウスとの胸腺細胞数を比較し、図18Aに要約した。再構成の1日前去勢したマウスにおいて、擬似去勢(ShCx)対照マウスと比べて、胸腺再生率で有意な増加が認められた(p≦0.01)。擬似去勢マウスの胸腺細胞充実度は、コンジェニックBMTの2週間および4週間後、未治療対照のレベル以下(7.6×107± 5.2×106)であったが、去勢されたマウスの胸腺細胞充実度は、BMTの4週間後に対照レベルを上回って増加した(図18A)。6週間後、細胞数は対照レベル以下を維持した。しかし、去勢マウスの細胞数は、非去勢マウスより3倍高かった(p≦0.05) (図18A)。
また、BMTの4週後、去勢マウスのBMに有意に多い(p≦0.05)細胞が認められた(図18D)。BM細胞充実度は、2週間後までに擬似去勢マウスで未治療対照レベル(1.5×107±1.5×106)に達したが、去勢マウスでは、BM細胞充実度は、コンジェニックBMTの2週間後および4週間後に対照レベルを上回って増加した(図18D)。腸間膜リンパ節細胞数は、照射および再構成の2週間後、去勢マウスおよび非去勢マウスの両方で減少した。しかし、4週間後までに、細胞数は対照レベルに達した。去勢処置群および非去勢処置群の間でリンパ節細胞数に著明な差は認められなかった(図18C)。脾臓細胞充実度は、2週間後までに擬似去勢マウスおよび去勢マウスで未治療対照レベル(1.5×107±1.5×106)に達したが、擬似去勢群では4〜6週間にわたって減少し、一方、去勢マウスでは脾臓細胞は依然として高いレベルであった(図18B)。繰り返すが、去勢マウスは、非去勢マウスと比べてこれらの時点で(すなわち、再構成の4週間後および6週間後)リンパ球数が増加したが(p≦0.05)、2週間後では、去勢治療群および非去勢治療群で総脾臓細胞数に差は認められなかった(図18B)。
したがって、再構成の1日前に去勢したマウスでは、擬似去勢(ShCx)対照マウスと比べて、胸腺再生率が有意に増加した(p≦0.01)(図18A)。擬似去勢マウスの胸腺細胞充実度は、コンジェニックBMTの2週間後および4週間後、未治療対照のレベル以下(7.6×107± 5.2×106)であったが、去勢されたマウスの胸腺細胞充実度は、BMTの4週間後に対照レベルを上回って増加した(図18A)。去勢マウスは、非去勢動物と比べて、コンジェニック(Ly5.2)細胞が著明に増加した。
非去勢マウスでは、4週間にわたって、胸腺細胞数が顕著に減少したが、再生のエビデンスがほとんど認められなかったか、まったく認められなかった(データの掲載なし)。しかし去勢群では、すでに2週間後までに非去勢マウスより10倍多い広範な胸腺形成があったが、4週間後までに対照レベルに戻った。CD45.2(ドナー由来抗原)細胞に関する胸腺のフローサイトメトリー分析では、4週間後、ドナー由来細胞は非去勢群で検出できなかったが、意外なことに、この時点で、去勢マウスのすべての胸腺細胞は実質的にドナー由来細胞であった(データの掲載なし)。ドナー由来造血前駆体からの胸腺形成の大きな増進を考慮すると、T細胞の分化が正常に進行しているか測定することは重要である。CD4、CD8およびTCR定義の亜集団をフローサイトメトリーにより分析した。再構成の2週間後、胸腺細胞サブセットの比率に差は認められなかった(データの掲載なし)。これは、非去勢マウスではドナー由来細胞により再構成されなかったので、4週間後では観察できなかったためである。しかし、この時点で去勢マウスの胸腺細胞率は正常と考えられた。
平行設定試験において、BMTの1日前に3カ月齢若齢成体C57/BL6マウスを去勢または擬似去勢した。コンジェニックBMTのために、マウスに800ラドで全身照射(TBI)し、5×106Ly5.1+BM細胞を静注した。2週間後および4週間後にマウスを屠殺し、免疫再構成についてBM、胸腺および脾臓を分析した。ドナー/宿主の起源について、ドナー起源の白血球にのみに反応する抗CD45.1抗体によって判定した。
この平行設定試験の結果を図19〜28に示す。図20および21は、去勢マウスのBMにおけるドナー由来HSCの数量および割合の増加を示している。このことは、移植の向上を示し、BMTからのより速い回復を示唆している。
図22は、去勢マウスのBMにおけるドナー由来B細胞前駆体およびB細胞の増加を示している。しかし、図24および25は、去勢の2週間後および4週間後に、去勢により末梢のB細胞の数量または割合が変化しないことを示している。
図26は、胸腺のドナー由来TN、DP、CD4およびCD8細胞の数量の去勢による増加を示している。しかし、図23は、CD4およびCD8細胞のドナー胸腺細胞比が去勢により変化しないことを示している。末梢では、CD4またはCD8細胞がごく少数認められ、検討を行った時点で、去勢によるこれら細胞の増加は見られなかった。
重要なことに、図28は、去勢の4週間後までの胸腺におけるドナーDCの数量の増加を示している。
（考察）
実施例4は、去勢の同系BMおよびコンジェニックBMの移植に及ぼす影響について示している。Starzlら((1992) Lancet 339:1579頁)は、リンパ組織および非リンパ組織で明白なマイクロキメラが同種移植に関する優れた予後指標であることを報告した。すなわち、これらは移植片に対する寛容の誘導に必要であると仮定された(Starzlら、(1992) Lancet 339:1579頁)。ドナー由来DCは、これらのキメラで存在し、移植片拒絶の軽減において複合的な役割を果たすと考えられた(ThomsonおよびLuら、(1999) Immunol: Today 20:20頁)。DCは、負の選択過程で中心的役割を果たすと考えられ、レシピエントの胸腺にドナー由来胸腺が存在した場合、移植片反応性T細胞は除去される可能性がある。
去勢がキメラ形成を増加することが可能か判定するために、胎生期肝臓移植による試験を実施した。試験の結果は、去勢マウスで胸腺の再生が増進することを示していた。これらの傾向は、コンジェニック(Ly5)マウスを使用して実験を繰り返したとき、再度認められた。コンジェニックマーカーの存在により、マウスのキメラ状態を評価することが可能であった。早くも胎生期肝臓再構成の2週間後、胸腺で検出可能なドナー由来樹状細胞が認められ、細胞数は、去勢マウスが非去勢マウスより4倍多かった。再構成の4週間後、非去勢マウスでは、ドナー由来細胞による再構成が見られず、このことは去勢がキメラ形成の可能性を実際に増加することを示唆していた。去勢が、致死性照射および胎生期肝臓再構成の後、胸腺再生を増進するだけでなく、胸腺のドナー由来樹状細胞数を増加することを考慮すると、幹細胞移植と共に、このアプローチにより移植片受け入れの可能性が高まる。
[実施例5：免疫細胞除去]
潜在的な移植患者において、現存するT細胞による移植片との干渉を防ぐために、患者にT細胞除去(アブレーション)を実施した。この工程の1つの標準操作は以下の通りである。ヒトの患者に、アトガム(異物抗T細胞グロブリン、Pharmacia Upjohn) 15mg/kgを毎日1回10日間注射するという方法により抗T細胞抗体を投与し、併用してT細胞活性化阻害薬サイクロスポリンA 3 mg/kgを3〜4週間持続注入した。この後、必要に応じて、9mg/kgの錠剤を毎日投与した。しかし、この治療は患者の胸腺の早期T細胞発達に影響を及ぼさなかった。これはヒトの胸腺の大きさおよび構造により、そのような影響を及ぼすために必要な抗体量を与えることができなかったためである。この治療を、性ステロイドが減少するように約4〜6週間維持し、その後、胸腺の再構成を行った。
また、T細胞反応性の予防は、T細胞除去および/または他の免疫細胞除去を高めるインターロイキン、アクセサリー分子(例えば、CD28などを阻害する抗体)、シグナル伝達分子または細胞接着分子などの第2レベルのシグナルの阻害剤と併用してもよい。胸腺再構成期は、ドナーHSC(問題の器官または組織と同時に、血液から(G-CSF(皮内注射を1日2回3日間)により血液から事前に集められた)またはドナーのBMから直接集められた)の注射と結びつくと考えられる。循環するHSCのレベルが高まることで胸腺(性ステロイドの欠如および/またはGnRH値の上昇により活性化する)による取り込みを促進すると考えられる。これらHSCは胸腺内DCに発達し、ことによると「ドナー反応性」となるすべての新しく作成されるT細胞の除去を引き起こすと考えられる。これはドナー細胞およびドナー組織に対する中枢性寛容を確立し、したがって宿主によるいかなる拒絶も防止または最小化する可能性がある。また、T細胞の新しいレパートリーの発達により、T細胞除去レジメンが原因の免疫不全を解決する可能性もある。
末梢T細胞の除去は、外来のドナーに反応する可能性があるT細胞を含む、すべての非特定T細胞を除去するので、移植片拒絶のリスクを最小化する。しかし、同時に、T細胞が欠如するので、本操作は、患者が感染症の特にウイルス感染症に高い感受性を示すことを意味する全身免疫不全の状態を誘発する。
[実施例6：性ステロイドのアブレーション療法]
患者に、LHRH作動薬を与えるという形で性ステロイド除去療法を実施した。本療法では、Leucrin(蓄積注射、22.5mg)またはZoladex(登録商標)(植込錠、10.8mg)のいずれかを、3カ月間有効な一回量として投与した。これは胸腺を充分に再活性化する性ステロイド濃度を減少することにおいて有効である。一部の例では、これは性ステロイドの副腎産生抑制因子を送るためにも必要である。また、性ステロイド除去療法の期間中にCosudex(登録商標)(5mg/日または50mg/日)を1日1錠投与した。あるいは、患者に、例えば皮下注射によりセトロレリクスまたはアバレリクスなどのGnRH拮抗薬を投与した。
血中の性ステロイドの最低値への減少には、外科的去勢後では約1〜3週間を要し、化学的去勢後では約3〜4週間を要する。一部の例では、治療を延長して、2回目の3カ月間の注射/植込錠を投与する必要がある。胸腺増殖は、おそらく同種ドナー(外来組織の移植片の場合)または自己由来HSC(これらHSCをBMから胸腺に集結させるために、宿主にG-CSFを注射することにより)として血液HSCが同時に増加することにより増加する。
[実施例7：代替の送達法]
LHRH作動薬の3カ月の蓄積注射または植込錠投与の代わりに、代替法を使用することができる。1実施例では、患者の皮膚にEr:YAGレーザーなどのレーザーを照射して、角質層の妨害作用を減少させるために、皮膚を破壊または変化させることがある。
レーザーによりアブレーションまたは変化は、米国特許第6251100号、第6419642号および第4775361号に記載される。
他の実施例では、送達はレーザー生成圧力波によって行われる。LHRH作動薬の用量を、プラスチック軟質ワッシャー(直径約2.54cm(1in)、厚さ約0.16cm(1/16in))などの適切な容器により圧力波が生じる部位の皮膚に乗せる。次に、この部位を約1mm厚の黒いポリスチレンシートなどの標的材で被う。Q-スイッチ固体ルビーレーザー(最高2joules/パルスまで発生可能な20nsのパルス幅)を使用して、標的材に当てる単一のインパルス過渡応答を発生する。黒いポリスチレン標的は完全にレーザー放射線を吸収するので、皮膚はレーザー放射ではなく、インパルス過渡応答のみに暴露する。この操作は毎日または必要に応じて繰り返し、作動薬の循環血液濃度を維持する。
[実施例8：ドナー細胞の投与]
差し支えなければ、ドナーの血液での造血幹細胞(HSC)の濃度を、細胞採取前の2〜5日間に10μg/kgをドナーの顆粒状コロニー刺激因子(G-CSF)に注射することにより増加させる(例えば、各2〜5日間で毎日1回または2回10μ/kgを注射する)。また、ドナーにはLHRH作動薬および/またはG-CSFもしくはGM-CSFなどのサイトカインを採取前(例えば、7〜14日前)に注射して、血中幹細胞の濃度および質を高めてもよい。CD34+ドナー細胞を、ドナーの血液またはBMから、フローサイトメーターまたは免疫磁気ビーズなどを使用して精製する。特にヒトCD34に結合する抗体は市販されている(Research Diagnostics Inc.,フランダース NJ、Miltenyi-Biotec、ドイツ)。ドナー由来HSCを、フローサイトメトリーによりCD34+と同定する。また、これらCD34+HSCを、支持細胞(例えば、線維芽細胞)、幹細胞因子(SCF)などの成長因子およびLIFを使用して、in vitro培養で増殖し、特定の細胞型への分化を防止してもよい。LHRH作動薬送達の約3〜4週間後(すなわち、胸腺が再生する直前または再生を開始する時)、患者に、最適量の一回量約2〜4×106細胞/kgのドナーHSCを注射する。また、G-CSFをレシピエントに注射して、ドナーHSCの増殖を助けてもよい。臨床症状が危険な状態のため、この日程が不可能ならば、GnRHと同時にHSCを投与することが可能である。約2〜3週間後、HSCの2回目の用量を投与して、胸腺再成およびドナーDCの発達(特に胸腺内において)を助けなければならないことがある。一旦、HSCがBMおよび胸腺に移植(すなわち、取り込まれる)および/または移行すれば、HSCは自己複製するので、効果は永続的と考えられる。
再活性化または再活性化した胸腺は、ドナーHSCを取り込み、これをドナー型T細胞とDCへ変換する一方、レシピエントHSCをレシピエント型T細胞およびDCへ変換する。細胞死により除去を誘発するか、免疫調節細胞を通して寛容性を誘発することにより、ドナーおよび宿主DCは、ドナーまたはレシピエント細胞と反応する可能性のあるすべての新しいT細胞またはNK細胞を寛容化する。
[実施例9：移植片の移植]
発明の一実施形態では、レシピエントが依然としてT細胞枯渇および/もしくは他の免疫細胞除去、ならびに/または免疫抑制療法を受ける間、少なくとも部分的にドナーT細胞を欠く器官、組織または細胞群をドナーからレシピエントの患者へ移植する。レシピエント胸腺を、GnRH治療により活性化し、外因性HSCを取り込む。
LHRH療法の約3〜4週間以内に、最初の新しいT細胞がレシピエントの血流に存在するようになる。しかし、宿主およびドナーの造血細胞の安定したキメラを生成させるために、免疫抑制療法を約3〜4カ月継続することがある。新しいT細胞は、再活性化する胸腺にドナーDCおよび宿主DCの両方が存在することにより、潜在的なドナー反応細胞およびホスト反応細胞から排出される。宿主胸腺上皮により正の選択をされて、T細胞はレシピエントの末梢血における宿主APCにより提示されるペプチドを認識することにより通常の感染に反応する能力を保つ。ドナー樹状細胞のレシピエントのリンパ器官への取り込みは、ドナー細胞、組織および器官の寛容以外の実質的に宿主単独の免疫系環境と同一の免疫系環境を確立する。それゆえに、正常な免疫調節メカニズムが存在する。これらにはIL4、IL5、IL10、TGF-β、TNF-αなどのサイトカインを使用して免疫反応のスイッチを入れるか、スイッチを切る制御T細胞の発達も含まれる。
［実施例11：代替のプロトコール］
ドナー細胞、組織または器官の移植に使用できるのが短時間の場合、実施例1〜10で使用したスケジュールを変更する。T細胞除去および/または他の免疫細胞除去ならびに性ステロイド除去を同時に開始する。T細胞除去および/または他の免疫細胞除去を約10日間維持する一方、性ステロイド除去は約3カ月維持する。一実施形態では、HSC移植は、併用療法開始の約10〜12日後、胸腺が再活性化を開始したとき実施する。
さらに短いスケジュールでは、2種類のアブレーションとHSC移植を同時に開始する。このイベントでは、T細胞除去および/または他の免疫細胞除去は、3〜12カ月(例えば、3〜4カ月)維持する。
［実施例12：免疫抑制の終止］
胸腺キメラが確立され、成熟T細胞の新しいコホートが胸腺から出始めたとき、患者の血液を採取し、in vitroで標準的混合リンパ球培養反応(参照、Current Protocols In Immunology, John E. Coliganら、(eds), Wiley and Sons, New York, NY (1994)および2002年を含む毎年1回の改訂版)によりT細胞がドナー細胞に対して反応性を欠くかを検査する。反応がない場合、免疫抑制療法を段階的に減らして感染に対する防御を可能にさせる。血中の活性T細胞の存在など、一部示される、拒絶反応の徴候がないならば、免疫抑制療法を最終的に完全に停止する。HSCは強力な自己複製能力を有するので、よく形成された造血キメラは理論的に患者(正常で、寛容化されず、移植をうけていない個人)の生涯を通じて安定である。
［実施例13：ヒトの胸腺を再活性化させるためのLHRH作動薬の使用］
（材料および方法）
本発明の方法によりヒト胸腺を再活性化できることを示すために、これらの方法を前立腺癌のための化学療法を受けている患者に用いた。
患者。
ステージI〜IIIの前立腺癌(前立腺特異抗原(PSA)スコアにより評価)の16人の患者を、分析のために選んだ。全被験者は、年齢が60から77歳の男性であって、4〜6カ月間、月1回のGnRH作動薬である酢酸ゴセレリン(Zoladex(登録商標))3.6mgの注射または月1回のロイプロリド(Lupron(登録商標))7.5mg処置と、その後に必要に応じて行われる前立腺癌の局所放射線療法とを基本にして、標準的併用アンドロゲン遮断療法(CAB)を受けていた。
FACS分析。
適当な抗体カクテル(20μl)を、全血200μlに加え、室温(RT)で30分間、暗所でインキュベートした。FACS分析用に、RBCを溶解し、残った細胞を洗浄し、1% PFAに再懸濁させた。試料は、CD19-FITC、CD4-FITC、CD8-APC、CD27-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-CyChrome、CD62L-FITCおよびCD56-PE(全てPharmingen、San Diego、CAから入手)などに対する抗体で染色した。
統計分析。
各患者は、治療前と治療後の結果を比較することにより内部標準としての役割を果たし、対応のあるスチューデントのt検定、またはWilcoxon符号順位検定を用いて解析した。
（結果）
前立腺癌患者を、性ステロイド除去療法の前および4カ月後に評価した。結果を図19〜23にまとめる。このデータは、全体的に、多くの患者でT細胞の状態が定性的および定量的に改善されたことを示している。
I. LHRH療法がリンパ球およびそのT細胞サブセットの総数に及ぼす影響:
末梢血リンパ球の表現型の構成を、前立腺癌のLHRH作動薬治療を受けている患者(全て>60歳)で分析した(図40)。患者の試料を、治療前およびLHRH作動薬治療開始4カ月後に分析した。血液1ml当たりの全リンパ細胞数は、治療前は全患者で対照値の下端であった。
治療後、9人中6人が総リンパ球数のかなりの増加を示した(一部の症例では、総細胞数の倍増が観察された)。これに関連して、総T細胞数が9人中6人で増加した。CD4+サブセットではこの増加は更に明白であり、9人中8人の患者がCD4+T細胞レベルの増加を示した。CD8+サブセットでは、あまり際立った傾向は見られず、9人中4人の患者でレベルの上昇が認められたが、CD4+T細胞より一般的にその程度は小さかった。
II. LHRH療法がT細胞サブセットの割合に及ぼす影響:
LHRH作動薬治療の前後での患者の血液の分析では、T細胞、CD4+またはCD8+T細胞の全体の割合には実質的変化はみられず、治療後にCD4+:CD8+割合で一定しない変化が見られた(図41)。このことは、治療後に総T細胞数が実質的に増加したにもかかわらず、T細胞サブセットの恒常性維持に対する治療の影響はほとんどなかったことを示している。全ての値は対照の値との比較によった。
III. LHRH療法がB細胞および骨髄細胞の割合に及ぼす影響:
LHRH作動薬治療を受けた患者の末梢血のB細胞および骨髄細胞(NK、NKTおよびマクロファージ)の割合の分析は、サブセット内で様々な程度の変化を示した(図42)。治療後、NK、NKTおよびマクロファージの割合が比較的一定であったのに対し、B細胞の割合は、9人中4人で減少した。
IV. LHRH作動薬療法がB細胞および骨髄細胞の総数に及ぼす影響:
治療後の末梢血のB細胞および骨髄細胞の総細胞数の分析では、治療後にNK(患者9人中5人)、NKT(患者9人中4人)およびマクロファージ(患者9人中3人)細胞数レベルの明らかな増加を示した(図43)。B細胞数は、レベルの増加を示した患者が9人中2人、変化を示さなかった患者が9人中4人、レベルの減少を示した患者が9人中3人と、明確な傾向を示さなかった。
V. LHRH療法が記憶細胞と比較したナイーブ細胞のレベルに及ぼす影響:
LHRH作動薬治療後に、末梢血のT細胞集団で主要な変化が見られた。特に、ナイーブ(CD45RA+)CD4+細胞の割合が選択的増加し、CD4+T細胞サブセットにおけるナイーブ(CD45RA+)対記憶(CD45RO+)の比は、9人中6人の患者で増加した(データは示さず)。
VI. 結論
したがって、胸腺萎縮を有するヒトなどの動物のLHRH作動薬治療により、胸腺の再生を誘発させることが可能であると結論づけることができる。性ステロイド除去療法を受けたこれらの前立腺癌患者の血中Tリンパ球の状態には、全面的な改善が示された。メインストリーム(TCRαβ+CD8αβ鎖)のT細胞の他の源は記述されなかったので、このような細胞は胸腺に由来すると思われる。消化管のT細胞は、主にTCRγδまたはCD8αα鎖である。
［実施例14：ヒトにおける寛容性の誘発］
皮膚または臓器移植を必要とするヒト男性患者に、実施例10で上記したように0〜6カ月間、GnRH作動薬(Lucrin、3.6mg)治療を基本とした、標準的併用アンドロゲン遮断療法(CAB)を施す。アンドロゲン遮断治療が行われている間、患者に同種ドナーの末梢血から採取したCD34+細胞を静脈内注射した。CD34+細胞を採取するために、ドナー(すなわち、その男性/女性の臓器または皮膚をレシピエントに提供する人)の末梢血を採取し、CD34+細胞を標準的方法により末梢血から単離する。限定されない一つの方法として、末梢血をヒトCD34(例えば、Abcam Ltd.、Cambridge、UKから商業的に入手可能なマウスモノクローナル抗ヒトCD34+抗体)に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、二次的に検出可能な程度に標識した抗マウス抗体(例えば、FITC-標識ヤギ抗マウス抗体)で細胞を染色し、FITC-標識CD34+細胞を蛍光活性化細胞分別(FACS)で単離する。循環末梢血で見られるCD34+細胞の数が少ないため、ドナーに多数回にわたる採取および細胞分別を要求することがある。CD34+は、レシピエント患者を再構成するのに使用するまで凍結保存してもよい。一実施例では、少なくとも5×105 HSC/kg体重をレシピエント患者に投与する。
レシピエント患者をモニターして、その末梢血中のドナーの血液および樹状細胞の存在を検出する。このようなドナー細胞が検出されたとき、ドナー組織(すなわち、皮膚および/または臓器)の移植を行う。このドナー組織は、胸腺が再活性化されず、ドナーCD34+細胞で再構築されなかったレシピエントよりもかなり、このレシピエントに受け入れられる(すなわち、このレシピエント中でより長く存続する)。
［実施例15：遺伝子操作されたHSC細胞により促進される移植片の受容］
MHCが適合する雄および雌のマウスを用いて、HSCの遺伝子組み換えが移植片の受容を促進し得るか否かを評価する。
これを行うために、高齢(すなわち、2歳)の雌Balb/cJ(H-2d)マウスを、外科的に去勢するか(例えば、標準的方法により卵巣を除去することによる)、または化学的に去勢する。化学的去勢では、1カ月の持続放出製剤としてLupron(GnRH作動薬)10mg/kgをマウスに皮下注射する。あるいは、マウスにGnRHアンタゴニスト(例えば、CetrorelixまたはAbarelix)を注射する。性ステロイドの消失の確認は、製造元の指示に従い、血漿試料の標準的なラジオイムノアッセイにより行い、この手順を通して観察することができる。通常、注射後3〜4週間までに去勢レベル(<0.5ngエストロゲン/ml)が達成される。
発現条件下で、雌Balb/cJ由来の骨髄細胞に、雌ではなく雄のBalb/cJマウスの細胞で発現するH-Yタンパク質をコードする遺伝子を形質移入する。換言すると、H-Yタンパク質をコードする遺伝子(またはcDNA)を、発現ベクター(例えば、プラスミドまたはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクター)に挿入し、その後、雌Balb/cJ骨髄細胞に形質移入する(例えば、Bonyhadiら、(1997) J.Virol.71: 4707頁参照)。トランスフェクトした細胞でのH-Y抗原の発現は、標準的な方法により決定する(例えば、ウェスタンブロット法、ノーザンブロット法、細胞表面の染色)。
次いで、形質移入した骨髄細胞を、骨髄破壊、または免疫抑制化され(immunosuressed)、去勢された(化学的または外科的)雌マウスに投与し、上記のように胸腺を再構築する。同時に、または再構築後1週間もしくは1カ月後に、再構築され、去勢された雌マウスに、雄Balb/cJマウスからの植皮を移植する。
この結果は、雄Balb/cJマウスからの植皮は、H-Yタンパク質をコードする遺伝子を形質移入された雌Balb/cJマウス骨髄細胞で再構築されなかった雌去勢マウスより、H-Yタンパク質をコードする遺伝子を形質移入された雌Balb/cJマウス骨髄細胞で再構築された雌去勢マウスでよく「生着する」ことを示すであろう。
レシピエント雌Balb/cJマウスが完全に雄Balb/cJマウスからの植皮を受け入れるとすぐに、レシピエントが化学的に去勢されている場合には、化学物質の投与を中止し、胸腺を萎縮させ、受胎能を回復させることができる。
［実施例16：ヒトでの造血幹細胞移植後の末梢免疫細胞プールの再生］
I. 同種および自己HSCT
この実施例は、HSCT患者で実施される臨床試験に関する。ヒトでの胸腺および骨髄機能を回復させる臨床的な能力を評価するために、LHRH作動薬(化学的去勢)治療を基本とした、性ステロイド除去療法を日常的に受けている前立腺癌患者(>60歳)を分析した。患者を、来院時および4ヵ月治療後に調べ、その時点までに血清テストステロン濃度は全患者で去勢レベルであった。
（材料および方法）
患者。
82人の患者は、全て悪性疾患または骨髄機能不全のためのPBSCTを用いた高用量療法(HDT)を受けることになっていた(同種対照患者はn=22、同種LHRH-A処置患者はn=20、自己対照群はn=20および自己LHRH-A処置患者はn=20)。試験患者には、自己または同種幹細胞移植の3週間前にゾラデックス(Zoladex)(LHRH-A) 3.6mg(4週間有効)を投与し、その後、4カ月間毎月注射した。全ての患者は、治療前、移植後5週間毎週、その後、12カ月まで毎月分析した。Alfred Committee for Ethical Research on Humansから倫理的認可を得た(Trial Number 01/006)。
全末梢血のFACS分析。
適当な抗体カクテル(20μl)を全血200μlに加え、室温(RT)で30分間、暗所でインキュベートした。FACS分析用に、RBCを溶解し、残った細胞を洗浄し、1% PFAに再懸濁させた。試料は、CD19-FITC、CD4-FITC、CD8-APC、CD27-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-CyChrome、CD62L-FITCおよびCD56-PE(全てPharmingen、San Diego、CAから入手)に対する抗体で染色した。
Ki67分析。
増殖細胞の検出用に、試料はCD27-FITC、CD45RO-CyChrome、およびCD4-またはCD8-APC (Pharmingen、San Diego、CA)で表面染色した。赤血球の溶解後、試料を室温で20分間、暗所で1X FACS透過液(Becton-Dickinson、USA、1X溶液をR.O.H2Oの10Xストックから調製した)500μl中でインキュベートした。洗浄した試料(2ml FACS 緩衝液、5分、600gmax、室温)を、抗Ki67-PEまたは抗Ki67-FITC(または、適当なアイソタイプ対照群)のいずれかと共に、室温で30分間、暗所でインキュベートした。次いで、分析用に、試料を洗浄し、1% PFAに再懸濁させた。
PBMCの調製。
精製したリンパ球を、T細胞活性化測定法およびTREC分析用に、ficoll-hypaque分離法により調製し、遠心後、血漿層を除去し、性ステロイドレベル分析に先立ち-20℃で保存した。Tリンパ球刺激アッセイ法に用いなかった細胞は、凍結培地に再懸濁させ、TREC分析に先立ち液体窒素に保管した。
Tリンパ球活性化測定法。
マイトジェン刺激では、精製したリンパ球を、96ウェル丸底プレートに、RPMI-FCS100μl中1×105細胞/ウェルの濃度で蒔いた。細胞を1回分1〜10μg/mlのPHAと共に、5% CO2、37℃でインキュベートした。TCR特異的刺激では、細胞を予め精製した抗CD3(1〜10μg/ml)および抗CD28(10μg/ml)でコーティングしたプレート上で48時間インキュベートした。プラーク形成後(48〜72時間)、1μCiの3H-チミジンを各ウェルに加え、プレートを更に16〜24時間インキュベートした。プレートをフィルターマットに採取し、3H-チミジンの導入をβ-カウンター(Packard-Coulter、USA)で液体シンチレーションを用いて測定した。
（TREC分析）
細胞分別。
凍結試料を迅速に解凍し、氷上で抗CD4-FITCおよび抗CD8-APCを用いて30分間染色し、洗浄して(FACS緩衝液2ml)、3%ホルマリンのPBS溶液で(かき混ぜながら)固定させた。分別用に、試料を更に30分間インキュベートし、洗浄し、FACS緩衝液500μlに再懸濁させた。CD4+およびCD8+細胞集団を、MoFlo(登録商標)セルソーター(Cytomation Inc.)で分別した。
DNA単離。
細胞を分別し、プロテイナーゼK(PK)消化用緩衝液(2×105細胞/20μlの0.8mg/mL溶液)に再懸濁させた。試料を56℃で1時間、次いで、95℃で10分間インキュベートし、プロテイナーゼを不活性化した。
Molecular Beaconsを用いたリアルタイムPCR。
分別した細胞中のTREC含量の分析のために、リアルタイムPCRを前述のように行った(Zhangら、(1999)J.Exp.Med.190:725頁)。プライマーは、センス鎖5'-GGATGGAAAACACAGTGTGACATGG-3'(SEQ ID NO:4)およびアンチセンス鎖5'-CTGTCAACAAAGGTGATGCCACATCC-3'(SEQ ID NO:5)であった。1サイクルの変性(95℃で10分)、次いで、45サイクルの増幅(94℃で30秒、60℃で30秒、および72℃で30秒)を行った。DNAの投入量を細胞同等物で標準化するために、別のリアルタイムPCRアッセイを用いて、偽遺伝子を含まないCCR5をコードする配列を定量した。
統計分析。
統計分析をInstat IIソフトウェアを用いて行った。前立腺癌HSCT試験では、Mann-Whitney U検定を行った。ヒトの試験では、各患者は、治療前と治療後の結果を比較することにより内部標準としての役割を果たし、対応のあるスチューデントのt検定、またはWilcoxon符号順位検定を用いて解析した。
（結果）
図49は、対照患者でのHSCT後の様々な時点(2〜8週間)でのナチュラルキラー(NK)細胞の回復の分析を示す。図49A〜Bに示すように、それぞれ、対照の同種および自己移植レシピエントの両方で類似の傾向が観察された。その一方で、HSCTの3週間前にLHRH-A治療を受けた同種患者は、移植後14日〜5カ月できわめて高い数のNKT(Vα24+Vβ11+)細胞を示した(図49C、データは、6〜20人の患者の平均±1 SEMとして示す。*=p≦0.05)。NKT細胞を、それらのVα24+Vβ11+表現型に基づき分析した。
図50は、対照患者でのHSCT後の様々な時点(14、21、28および35日)でのNKT細胞の再構成のFACS分析を示す。同種患者で早期回復が観察され、移植後早期にCD8+集団での優位性が見られ、このことから再生の胸腺外経路が示された。また、CD4+NKT細胞は、移植後1カ月で明白であった。
図51は、対照患者でのHSCT後の様々な時点(2〜12カ月)でのB細胞の再構成を示す。図51Bに示すように、B細胞の再生が自己移植患者では、同種患者のものと比較してかなり早く生じた(図51A)。しかしながら、対照値(斜線部)への回復は、両方の集団で、移植後少なくとも6カ月までは明白でなかった。
図52は、対照患者でのHSCT後の様々な時点(2〜12カ月)でのCD4+の再構成を示す。B細胞数が移植後6カ月までには対照値に回復したのに対し(図48A〜B参照)、CD4+T細胞数は、移植後12カ月でさえ、自己(図52B)および同種(図52A)レシピエントの両方で大幅に減少した。
図53は、対照患者でのHSCT後の様々な時点(2〜12カ月)でのCD8+再生を示す。図53A〜Bに示すように、CD8+T細胞の数は、同種および自己レシピエントの両方で、それぞれ移植後かなり急速に回復した。しかしながら、図53Cに示すように、CD8+T細胞は、TCRγδ+T CD8+T細胞、CD8ααT細胞およびCD28-CD8+T細胞の増加により示されるように主に胸腺外由来である。
図54は、マーカーとしてKi-67を用いた、対照患者でのHSCTの前(図54A)およびHSCTの28日後(図54B)のCD4+およびCD8+T細胞の様々な集団の増殖のFACS分析を示す。細胞は、マーカーとしてCD45ROおよびCD27を用いて、ナイーブ、記憶および活性表現型に基づいて分析した。増殖の大部分は、CD8+T細胞サブセットで生じ、このことは更に、これらの細胞が胸腺外に由来し、優勢な増殖が末梢T細胞サブセットで生じたことを示した。
図55は、対照患者およびLHRH-A治療患者でのHSCT後の様々な時点(2〜12カ月)でのナイーブCD4+T細胞の再生を示す。図55Aは、ナイーブCD4+T細胞(CD45RA+CD45RO-CD62L+)のFACS分析を示し、また、試験を通してのこれらの細胞の重度の消失を示す。図55B〜Cに示すように、ナイーブCD4+T細胞は自己移植患者ではHSCT後12カ月までには再生が始まったが(図55C)、同種患者の対照値よりもまだかなり低かった(図55B)。これらの結果は、患者の年齢のために、移植後に胸腺が十分な数のナイーブT細胞を再構築できなかったことを示していた。これに対して、同種HSCTの3週間前にLHRH-Aを与えられた患者は、移植後9および12カ月の両方で、対照群と比較して、著しく高い数のナイーブCD4+T細胞を示した(対照群(LHRH-A非処置)と比較して、移植後9および12カ月の両方でp≦0.05)(図55D)。このことは、胸腺依存性T細胞経路の再生が性ステロイド除去療法で高められたことを示している。
図56は、対照患者でのHSCT後様々な時点(1〜12カ月)でのTRECレベルを示す。最新胸腺移出(RTE)でしか見られないTRECレベルの分析は、同種(図52A)および自己(図52B)患者の両方で、移植後のレベルを再構築する能力が胸腺にないことを際立たせた。また、このことは、患者の年齢のためであると同時に、胸腺萎縮のため、胸腺機能が欠如しているためでもあったが、このことはこれらの患者の罹患率および死亡率における重要な示唆を有している。これに対して、同種末梢血幹細胞の移植を受けた患者は、同種移植前にLHRH-Aで治療したときに、CD4+TREC+細胞/ml血液の顕著な増加を示した(対照(LHRH-A非治療)を比較して移植9カ月後にP≦0.01)。LHRH-A処置された同種患者は、移植後9カ月で、対照群と比較して著しく高い数のCD4+TREC+細胞/ml血液を示した(図56C)。自己LHRH-A処置患者は、移植後12カ月でも顕著に高いレベルを示した(図56D)。このことは、性ステロイド除去療法で胸腺の再生が高められたことを示している。データは、5〜18人の患者の平均±1 SEMとして示す。*=p≦0.01。
LHRH-Aの投与は、末梢血のNK細胞数を有意に増加させたが、B細胞数は増加させなかった。全体的に、B細胞数の有意な変化はLHRH-A治療では観察されなかった(図47)。しかし、NK細胞数では、治療で有意な増加が観察された(p≦0.01)(図47)。したがって、性ステロイドの除去により、T細胞およびNK細胞数の有意な増加が生じる。
LHRH-作動薬で治療した患者の従前の試験(Garzettiら、(1996) Obstet.Gynecol.88:234〜40頁;Oliverら、(1995)Urol.Int.、54:226〜229頁; Umesakiら、(1999)Gynecol.Obstet.Invest.48:66〜8頁)と一致して、全リンパ球、T細胞(主にCD4+)およびNK細胞の有意な増加が観察された(図45および47)。T細胞区画の更に詳細な分析により、LHRH-A治療後に、ナイーブCD4+T細胞並びにナイーブおよび記憶CD8+T細胞の両方の数で有意な増加が示された(図44)。
ナイーブT細胞の増加が末梢への進展を介したものであるか(例えばIL-7投与で見られるように(Soaresら、1998、J.Immunol. 161: 5909〜5917頁))、または胸腺再活性化の直接の結果としてのものなのかを決定するために、TRECレベルの分析と共に、細胞の増殖(Ki-67抗原+)の分析を行った(Hazenbergら、(2001) J.Mol.Med. 79: 631〜40頁)。
CD4+(図48A)およびCD8+T細胞(図48B)の両方のナイーブ、活性化または記憶集団での作動薬治療では、増殖レベルの変化は見られなかった(2〜4%の低い割合で残っている)。このことは、治療が直接T細胞の増殖を誘発せず、TRECレベルが末梢での過剰な増殖により影響されないであろうことを示す。このことは、早い段階での末梢の拡張の可能性を除外するものではない。しかし、このことは活性化/記憶細胞レベルの増加を恐らく説明するにすぎないであろう。胸腺の機能およびT細胞移出の増大の直接の証拠は、10人の患者のTRECレベルの分析後に見いだされた(図46B)。CD4+およびCD8+T細胞集団の両方で、LHRH-A治療の4カ月までには、10人中5人の患者が絶対TRECレベル(血液1mlに付き)の増加を示した(最初の提示値を越える、>25%)。これは、比例的増加にも反映されていた(1×105細胞に付き)。このことは、10人中6人の患者で全TRECレベルの全体的増加を示したことに関連付けられた。1人の患者だけが全TRECの減少を示した(約30%の減少)。正常なT細胞の発生の一部としてまたは移出後に胸腺内で生じ得るであろう(Hazenbergら、(2001) J.Mol.Med. 79: 631〜40頁)、有糸分裂でTRECは希釈されるので(Zhangら、(1999) J. Exp. Med. 190: 725〜732頁)、絶対的TRECレベルは、T細胞移出が非常に低く見積もられていることを示すであろう。したがって、作動薬を用いた治療後の末梢における全TREC+細胞の有意な増加は、完全に胸腺依存性T細胞経路の再生と一致する(Douekら、 (1998) Nature 396: 690〜695頁 (1998); Douek ら、 (2001)J. Immunol. 167 : 6663〜8頁; Hochbergら、(2001) Blood 98: 1116〜21頁)。同時に、これらのデータは、性ステロイド阻害の成人ヒトにおける胸腺の産出を改善する能力を実証しており、多くの病態で、深刻なT細胞の枯渇後にナイーブT細胞の数を再構築するための基盤を提供している。
［実施例17：性ステロイドの消失は、造血幹細胞移植後のマウスで免疫再構築を増進する］
この実験は、同種HSCTのレシピエントでの性ステロイド阻害により移植後の免疫再構築が改善されるという仮定を検証するために実施した。したがって、これらの実験は、性ステロイドの消失が同種HSCT後の造血の回復に影響を与えるか否かを明確にすることを目的としていた。HSCT後14日で、去勢したマウスのBMおよび胸腺細胞数は、偽対照群と比較して有意に増加した。これらは28日目でも上昇したままであり、その時点で去勢したものには、脾臓細胞充実性の増加も見られた。胸腺では、T細胞前駆体およびDCは、HSCTおよび去勢後に顕著に増加した。BM前駆体および発生中のB細胞もまた、HSCTおよび去勢後に顕著に増加した。これらの重要な増加は、同種HSCT後のドナー由来の末梢T細胞およびB細胞の顕著な増加をもたらした。どの免疫強化戦略も、移植片対宿主病(GVHD)の進行を悪化させるリスクを有している。マウスを、同種設定で、GVHD誘発時に去勢した。去勢マウスと偽去勢マウスとを比較した際に、GVHD発生率または重症度に有意な差はなかった。更に、GVT活性は、性ステロイドの非存在下で減少しなかった。リンパ球の回復が、IL-7処置後に同種HSCTレシピエントで向上することを以前に示した。IL-7処置と去勢との組み合わせにより、HSCT後の胸腺に相加作用があるようであった。これらの結果は、去勢およびその結果得られる性ステロイドの消失が、GVHDを増加しかつGVTを維持することなく、同種HSCT後の造血の回復を向上させることを示している。
（材料および方法）
試薬。
抗マウスCD16/CD32 FcR block(2.4G2)およびマウス抗原に対する以下の全ての蛍光色素標識抗体は、Pharmingen(San Diego、CA)から入手した。Ly-9.1(30C7)、CD3(145-2C11)、CD4(RM4-5)、CD8β.2(53-5.8)、T細胞受容体β(TCR-β、H57-597)、CD45R/B220(RA3-6B2)、CD43(S7)、IgM-FITC(R6-60.2)、CD11b(M1/70)、Ly-6G(Gr-1)(RB6-8C5)、c-kit(2B8)、Sca-1(D7)、CD11c(HL3)I-Ak(11-5.2)、均一型対照群:ラットIgG2a-k(R35-95)、ラットIgG2a-l(B39-4)、ラットIgG2b-(A95-1)、ラットIgG1-k(R3-34)、ハムスターIgG-グループ1-k(A19-3)、ハムスターIgG-グループ2-l(Ha4/8)、および2.4G2およびFcr(FcRブロッキング)。ストレプトアビジン-FITC、PercP-フィコエリトリン(PE)もPharmingen(San Diego、CA)から入手した。組み換えヒトIL-7は、Dr Michel Morre (Cytheris、Vanves、France)から提供された。
ヒト組換えIL-7がマウスの細胞を刺激することを確認するために、チミジン取り込み増殖アッセイをIL-7依存性マウスの前駆B細胞系2E8で行い、試験で用いたヒトIL-7が、マウスIL-7と同等の増殖効果をマウス細胞に与えることを見出した。組織培養培地は、10%熱失活したウシ胎児血清、100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、および2mM L-グルタミン(同様に50 mM 2-メルカプトエタノールも32Dp210細胞の培養および増殖アッセイ用に)が補充されたRPMI 1640から構成されていた。
マウスおよびHSCT。
雄C57BL/6J(B6、H-2b)、C3FeB6F1/J([B6 3 C3H]F1、H-2b/k)、B10.BR(H-2k)、B6D2F1/J(H-2b/d)、CBA/J(H-2k)、Balb/c(H2-d)、IL7-/-およびKGF-/-マウスは、Jackson Laboratory(Bar Harbor、ME)から入手し、8から12週齢のときに実験に使用した。KGF-/-およびIL7-/-は、4から7カ月齢の間で用いた。HSCTプロトコールは、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committeeにより認可された。BM細胞を、大腿骨および頚骨から無菌的に取り出した。ドナーBMは、抗Thy-1.2と共に、4℃で30分間インキュベートし、次いで、Low-TOX-Mウサギ補体(Cedarlane Laboratories、Hornby、ON、Canada)と共に、37℃で1時間インキュベートすることによりT細胞を枯渇させた。脾臓のT細胞(GVHD分析用)は、ナイロンウールカラムで精製し、次いで、塩化アンモニウム赤血球溶解緩衝液で赤血球を除去することにより得た。細胞(脾臓のT細胞および白血病細胞含有または不含の5×106 BM細胞)を、Dulbecco変更必須培地(Life Technologies、Grand Island、NY)に懸濁させ、0日目に、致死的な放射線を浴びたレシピエントに尾静脈注入(0.25ml、全容量)により移植した。移植に先立ち、0日目に、レシピエントは、分割線量として、3時間間隔で1300cGy全身照射(137Cs線源)を受けた(胃腸毒性を低減させるために)。マウスは、消毒したマイクロアイソレーターケージで飼育し、正常な食事および加熱滅菌した超塩素処理飲料水(pH3.0)を与えられた。
去勢手術。
マウスは麻酔し、小さく陰嚢切開して精巣を曝した。これらを縫合し、囲んでいる脂肪組織と一緒に取り除いた。傷を手術用ホチキスを用いて閉じた。偽去勢は、精巣の除去以外は同じ手術手順を必要とした。免疫再構築試験およびGVHD試験のために、BM移植の一日前に去勢を行った。
IL-7の投与。
IL-7は、免疫再構築試験のために0から13日目または21から27日目のいずれかに、10μg/日で腹腔内に投与された。PBSは、対照マウスに同時点で注射された。
フローサイトメトリー分析。
BM細胞、脾細胞または胸腺細胞をFACS緩衝液(リン酸緩衝食塩水(PBS)/2%ウシ血清アルブミン(BSA)/0.1%アジ化物)で洗浄し、1〜3×106細胞を4℃で30分間、CD16/CD32 FcR blockと共にインキュベートした。次いで、細胞を一次抗体と共に4℃で30分間、インキュベートし、FACS緩衝液で2回洗浄した。必要な場合には、細胞を更に4℃で30分間、標識ストレプトアビジンと共にインキュベートした。染色した細胞を、FACS緩衝液に再懸濁させ、CellQuest(商標)ソフトウェアを用い、FACSCalibur(商標) flow cytometer (Becton Dickinson、San Jose、CA)で分析した。
増殖アッセイ。
脾細胞(4×105細胞/ウェル)を、刺激剤(2×105細胞/ウェル)としての照射した(2000cGy)BALB/C脾細胞と共に、5日間、96ウェルプレートでインキュベートし、脾細胞(4×105細胞/ウェル)をαCD3(145-2c11)およびαCD28(37.51)(最終濃度として2.5mg/mL)と共に4日間刺激した。最後の18時間、培養液に1mCi/ウェル[3H]-チミジンでパルスし、DNAをHarvester96(Packard)で採取した。刺激指数(SI)は、刺激細胞(cpm)と非刺激細胞(cpm)の比として算定した。
51Cr放出アッセイ。
標的細胞を、37℃および5%CO2で2時間、2×106細胞/mLの100mCi51Crを用いて標識化した。3回洗浄後、標識化した標的を2.5×lO3細胞/ウェルでU底プレートに蒔いた(Costar、Cambridge、MA)。放射したBALB/C脾細胞(1:2の割合)と共に5日間培養した脾細胞を、様々なエフェクター対標的の比で、4から6ウェルに対して200mLの最終容積で加え、37℃および5%CO2で4から6時間インキュベートした。続いて、上清35mLを各ウェルから除き、ガンマーカウンターでカウントして(Packard、Meriden、CT)実験の放出を決定した。標的細胞および培地のみを入れたウェルから自然放出が得られ、全放出は5% Triton X-100を入れたウェルから得た。細胞毒性の割合は、以下の式により算出した。毒性割合=100×[(実験の放出-自然放出)/(全放出-自然放出)]。
細胞内のIFN-γ染色したアロ反応性のT細胞クローンの検出。
概説すると、細胞を、Brefeldin A(10mg/mL)と共に12から15時間インキュベートし(T細胞を消失させた[TCD]照射刺激細胞を用いた、二次的同種刺激のため)、採取し、洗浄し、一次(表面)蛍光色素(FITC、PerCP、およびAPC)標識抗体で染色し、固定化し、Cytofix/Cytoperm kit(Pharmingen)で透過処理し、続いてαIFNγ-PEで染色した。FACS分析は、指定された集団でゲートコントロールすることにより行われた。フローサイトメーターおよびソフトウェアは後述したものを用いた。
遅延型過敏症アッセイ。
偽去勢および去勢マウスを同種BMT後42日目に0.01%ヒツジ赤血球(Colorado Serum、Denver、CO)のPBS溶液200μlを尾静脈注入することにより感作した。感作した動物に46日目に右後肢足蹠に20%ヒツジRBC懸濁液50μlを投与し、他方で左後肢足蹠に同体積の50μlのPBS溶液を対照として与えた。24および48時間後、足蹠の腫張をダイヤルシックネスゲージ(Mitutoyo、Kanagawa、Japan)で測定した。応答の大きさは、実験の右足蹠から差し引いたPBS注射した左足蹠の差長により決定した。
GVHDの評価。
GVHDの重症度を、Cookeら((1996) Blood 88: 3230〜9頁)により最初に記載されたように臨床的GVHD採点法で評価した。概説すると、コード化したケージ中の耳に標識した動物について、個別に週ごとに5つの臨床的指標(体重減少、体位、活性、毛、および皮膚)により0から2の基準で採点した。臨床的GVHD指数を5つの基準スコア(0〜10)の合計により算出した。毎日生存個体を観察した。5以上のスコアの動物は、瀕死状態と考えられ、人道的に殺処分した。
GVT-P815(H-2d)肥満細胞腫誘導の評価および肥満細胞腫による死対GVHDによる死の評価。
B6D2F1/Jレシピエントは、同種HSCTの0日目に、1×103 P815 (H-2d)細胞を静脈内に投与された(5×106 T細胞除去(TCD)BM細胞および5×105 C57/BL6由来のT細胞)。生存個体を毎日観察し、HSCT後の死の原因を前述のように剖検により決定した。概説すると、白血病による死は肝脾腫および顕微鏡検査での肝臓および脾臓における肥満細胞腫細胞の存在により特徴付けられたが、GVHDによる死は、肝臓および脾臓での肝脾腫および白血病細胞の非存在、および死亡時の臨床的GVHD採点法により評価されるようなGVHDの臨床症状の存在として確認された。
半定量RT-PCR 骨髄全体から得られる全細胞のRNAを、スーパースクリプト II 逆転写酵素(Life Technologies、Rockville、USA)を用いて逆転写した。PCR Master Mix (Promega、Madison、USA. HPRT:5'CACAggACTAgAACACCTgC3'および5'gCTggTgAAAAggACCTCT3'、TGFβ1:5'CTACTgCTTCAgCTCCACAg3'および5'TgCACTTgCAggAgCgCAC3'、並びにKGF:5'gCCTTgTCACgACCTgTTTC3'および5'AgTTCACACTCgTAgCCgTTTg3')で、cDNAを35サイクルでPCR増幅した(94℃で30秒、56℃で30秒、72℃で60秒)。
IL7-/-胸腺の酵素消化。
IL7-/-マウスは、大部分のCD45-胸腺間質細胞を含み、各胸腺は0.1%(w/v)DNエースを含む0.125% (w/v) コラゲナーゼ/ディスパーゼ(Roche Applied Sciences、Indianapolis、USA)中で、酵素消化されて、胸腺細胞充実性の正確な計算を斟酌すれば、胸腺由来のほとんどの間質細胞および造血細胞を放出した。抗CD45は、CD45-間質細胞を同定するのに用いた。
統計。
全ての値は、平均の標準誤差として示す。Mantel-Cox log-rank検定を生存データに用い、その他の全ての統計分析は、ノンパラメトリックの対応のないMann-Whitney U検定で行った。0.05未満のP値は、統計的に有意とみなされた。
（結果）
I. 同種HSCT後に去勢は、BM、胸腺細胞充実性および脾臓細胞充実性を増加する。
雄CBAマウスを、同種HSCTの1日前に去勢した。マウスを1300cGy放射線全身照射にかけ、次いで、5×106B10.BR TCD BM細胞を投与した。偽去勢対照群(それぞれ、9.5×106±3.0×105および25×106±2.6×106)と比較して、去勢マウスのBM(16×106±1.4×106)および胸腺(55.4×106±1.8×106)で、早くもHSCT後14日目には顕著に細胞が増加した(図29A〜B)。これらの数は、HSCT後28日目の去勢マウスでは著しく上昇した(BM:22×106±4.0×106対14×106±2.2×106、胸腺:72×106±5.9×106対45×106±2.9×106)。去勢マウスの脾臓細胞充実性でも、28日目の偽去勢された脾臓細胞数を超えて、顕著に上昇した(253×106±28.4×106対126×106±13.9×106)(図29C)。去勢マウスは、28日目までには移植前の細胞充実性に近づき始めた。HSCT後42日目には、胸腺および脾臓細胞充実性に関し、去勢および偽去勢マウス間にもはや顕著な差はなかった。偽レシピエントは若齢マウスだったので、活性な移植後のリンパ球新生がみられたが、一次および二次リンパ組織で正常細胞充実性で生じるのに必要とされる時間は去勢レシピエントに比較して著しく遅延した。
II. HSCT後28日目の去勢マウスのBMではドナー由来のHSCの数が著しく多い。
いくつかの試験により、性ステロイドが初期の造血前駆細胞の増殖および/または分化を阻害することが示されている(Thurmondら、(2000)Endocrinol. 141:2309〜2318頁、Medinaら、(2001)Nat. Immunol. 2: 718頁、Kouroら、 (2001) Blood 97: 2708頁)。したがって、去勢が同種移植設定でのHSC数に与える影響を調査した。ドナー由来のHSC数は、同種HSCT後14日目の偽去勢および去勢マウスの両方で非常に低かった(それぞれ、2.98×102±1.25×102および2.66×102±8.8×101)(図30A)。しかし、+28日目までには、偽去勢対照(4.8×103+1.1×103)に比べて去勢マウスでは極めて多数のLy9.1+Lin-Sca-1+c-kit+ドナー由来のHSCがみられる(1.1×103±4.1×102)(図30A)。
III. 同種HSCT前の去勢は、ドナー由来のB細胞の回復を高める。
B細胞の回復の分析により、B細胞発生における3段階の、プロB細胞(CD45R+CD43+IgM-)、プレB細胞(前駆細胞)(CD45R+CD43-IgM-)および未熟B細胞(CD45R+CD43-IgM+)が識別された。同種HSCT後14日目に、去勢マウスのBM(5.5×106±1.7×106)では、偽去勢対照群(2.08×106±5.0×104)に比べて前駆B細胞が著しく多かった(図30B)。28日目でも、去勢マウスのBMでは、前駆B細胞(偽-cx:3.1×106±3.7×105 c.f. cx:6.6×106±6.6×105)および未熟B細胞(偽-cx:1.3×106+2.6x105 c.f. cx:3.O×106±3.4×105)が著しく多かった(図30B)。BM B細胞およびそれらの前駆体の増加は、HSCT後28日目の去勢マウスの脾臓での未熟B細胞数の有意な増加をもたらしたことになる(偽-cx:64.9×106±6.4×106 c.f. cx:112.O×106±10.O×106)(図30C)。これらの結果は、去勢がB細胞産生およびBMからの移出を高めるということを示唆する従前の試験と一致する。
IV. 同種HSCT後のT細胞再構築が去勢により高められる。
胸腺細胞および末梢細胞をCD3、CD4およびCD8の発現に基づき、発生段階に分類した:トリプルネガティブ(TN)(CD3-CD4-CD8-)、ダブルポジティブ(DP)(CD4+CD8+)、シングルポジティブCD4(SP CD4) CD3+CD4+CD8-およびシングルポジティブCD8(SP CD8)CD3+CD4-CD8+(図31A〜D)。同種HSCT後早くも14日には、去勢マウスのTN、DP、SP CD4およびSP CD8胸腺細胞は、偽去勢対照群に比較して、著しく増加する。HSCT後28日は、去勢群のDPおよびCD4 SP細胞数は、著しく上昇したままである。42日までには、全ての胸腺細胞サブセットは、偽去勢および去勢マウスに等しくなる。ホスト由来およびドナー由来のDCは、移植片拒絶の回避に不可欠な役割を果たすと考えられる(Morelliら、(2001)Semin. Immunol. 13: 323〜335頁)。同種HSCT後14日目には、去勢マウスの胸腺ではホスト由来CD11chiDCが著しく上昇する。同種HSCT後28日目には、胸腺のホスト由来およびドナー由来のDCの両方が、去勢マウスで著しく増加した(図31E〜F)。去勢マウスの胸腺細胞数の増加は、28日目に偽去勢対照群と比較して、去勢マウスの脾臓におけるドナー由来の成熟CD4+およびCD8+T細胞数の有意な増加をもたらした(図31G)。
V. 細胞ごとで、偽去勢由来のT細胞と去勢マウス由来のT細胞との間に有意差はない。
同種HSCT後の去勢マウスの末梢T細胞の機能的能力を決定するために、一連のin vitroアッセイを行った。同種HSCT後6週間の去勢および偽去勢対照群のドナー由来T細胞の数を、図32Aに示す。脾臓T細胞の増殖能力を、2つの方法で試験した:αCD3/αCD28架橋(図32B)および3rd party MLR(刺激剤として照射BALB/C脾細胞を用いた)(図32C)。これらのどちらかの設定で偽去勢および去勢マウスを比較した場合、末梢T細胞の増殖能力に有意差はない。同種HSCT後6週間目に、脾細胞を5日間、BALB/C脾細胞(3rd party)で照射しながら培養した。同種刺激の5日後、培養液中の細胞の大部分は、CD8+T細胞であった。これらの細胞の半分をCTL(51Cr放出)アッセイに用いて、偽去勢および去勢マウス由来の脾細胞の細胞毒性を決定した。脾細胞について、異なるエフェクター:標的比でそれらが51Cr標識A20(BALB/C B細胞リンパ腫腫瘍細胞系)細胞を殺す能力を試験した(図32D)。細胞毒性に関し、偽去勢および去勢マウスの間で有意差は見られなかった。5日間培養した細胞の残りの半分を、3rd party(BALB/C)または同系(B10.BR)照射脾細胞およびブレフェルジンAのいずれかを用いて一晩再刺激し、IFN-γ産生を決定した。図32Eに、BALB/C一次刺激およびBALB/CまたはB10.BR二次刺激(対照)後のドナー由来CD8+脾臓のT細胞によるIFN-γ産生を示す。これを、図32Fに図示する。偽去勢および去勢マウスを比較した場合、IFN-γ産生ドナー由来CD8+の割合に有意差はない。
in vivoでの免疫機能を評価するために、DTHアッセイを用い、これにより、去勢および同種BMT後42日目のマウスをsRBCで感作した。46日目に、これらを検証し、24および48時間後に、足蹠腫張を測定した。DTH応答は、同種HSCT時に去勢したマウスの場合、偽去勢対照群と比較して、検証後48時間で著しく向上した(図32G)。
去勢したレシピエントのT細胞は、細胞ごとに偽去勢レシピエント由来のT細胞と同程度であり、完全な増殖、細胞毒性およびサイトカイン産生を有する新規抗原に応答し得ることをこれらの機能的アッセイは示している。しかし、去勢されたレシピエントの顕著に早いT細胞の再構築は、移植後6週間目にでさえ、DTM応答の向上をもたらす。
VI. 同種HSCT前の去勢はGVHDを悪化させず、GVT活性を維持する。
GVHDおよびGVTの両方は、最初にアロ反応性のドナー由来T細胞により媒介され、このドナー由来T細胞は同種移植片により移行される。免疫再構築を高めるどのような治療も、GVHDを悪化させ、あるいは、逆にGVT活性を減少させる可能性を有する。去勢がドナー由来のアロ反応性T細胞に刺激作用を及ぼさないと証明するために、GVHDを同種ドナーT細胞を同種移植片に加えることにより誘発させた。去勢マウスと偽去勢マウスを比較した場合に、GVHDによる罹患率または死亡率に有意差はなかった(図33A)。去勢がGVT活性に及ぼす影響を評価するために、肥満細胞腫細胞系P815(H-2d)を、B6D2F1/Jレシピエントに、移植時に注射した。実験の間に死亡した動物を解剖し、死亡(腫瘍対GVHD)の原因を決定した。肥満細胞腫による死亡率は、偽去勢対照群(マウス8匹中5匹)と比較して、去勢後も変化しないままであった(マウス9匹中6匹)。このことは、去勢がHSCT後のGVT応答を低減させないことを示唆している(図33B)。
VII. IL-7および去勢は、同種HSCT後に相加効果をもたらす。
IL-7処置は、他の実処置動物でT細胞およびB細胞の数を増加させることができ、また、シクロホスファミド処置、照射、同系および同種HSCT後にもリンパ球の回復を高めることができることが以前に示されている(Alpdoganら、(2001) Blood 98: 2256頁、Bolotinら、(1996) Blood 88: 1887頁、Faltynekら、 (1992) J. Immunol. 149: 1276頁、Morrisseyら、(1991) J. Immunol. 146: 1547頁)。IL-7は、末梢進展と同様に胸腺活性を増加させることにより、T細胞数を増加させることが知られている。
したがって、同種HSCTのレシピエントで、IL-7投与を去勢と併用することにした。治療後14日目では、去勢マウスの胸腺で細胞が著しく増加しており、これらに併用治療を施した(去勢およびIL-7投与)。この初期の時点では、PBS処置した偽去勢対照群とIL-7処置した偽去勢マウスとの間に相違は見られない。去勢群および併用治療を受けたものとの間にも有意な相違は見られず、このことは、同種HSCT、IL-7処置および去勢後14日目の去勢作用の影響のみであることを示唆している(図34A)。後の時点では、同種HSCT後28日目に、去勢のみの群およびIL-7のみの群で、胸腺の細胞充実性が対照群よりも有意に高くなっている。同種HSCT後28日目に解析した時、IL-7処置と去勢の併用は、胸腺の細胞充実性に相加効果を有していた(図34B)。
VIII. IL-7、TGF-β1およびKGFの半定量RT-PCRは、同種HSCTおよび去勢後に、KGFの増加およびTGF-β1の減少を示す。
全骨髄細胞のRT-PCR分析は、偽去勢および去勢マウスの両方で遅くとも同種HSCT後6週間目にはIL-7転写は検出不可能なレベルであることを示した。対照の移植されていないマウス由来の鋳型を用いた場合には、IL-7は検出された(データは示さず)。TGFβ1およびKGFは、造血の重要なメディエーターであることが知られている。去勢および同種BMT後2週間目で、HPRT平衡鋳型を用いると、TGFβ1の減少およびKGFの増加が現れる(図34C)。
IX. 去勢後に生じる変化がKGF-/-マウスで見られたが、IL7-/-マウスでは見られなかった。
去勢後の免疫の再構築の向上の背景にある可能な機構を更に試験するため、KGF-/-およびIL7-/-マウス(4〜6月齢)を去勢し、2週間後に、胸腺、脾臓およびBMを分析した(TGFβ1 -/-マウスは成熟期前に死ぬ(TGFβ1 -/- mice die prepubertally)、Shullら、(1992) Nature 359: 693頁)。胸腺の細胞充実性は、偽去勢および去勢KGF-/-マウスを比較した場合に著しく増加する。初期の時点では、BMおよび脾臓の全体的な細胞充実性には相違は見られなかったが、野生型マウスで以前に見られたように(Ellisら、(2001) Int. Immunol. 13: 553頁、データは示さず)、BMのB細胞区画では変化が見られた。IL7-/-マウスの胸腺の大部分の細胞がCD45-間質細胞であるという事実により、これらのマウスを用いた時は、酵素消化を用いて単細胞懸濁液を得た。こうすることで、より多くの細胞が懸濁液に放出されるが、このことは従前の文献に比較してこの実験で僅かに大きな胸腺細胞充実性が見られることの説明となる(von Freeden-Jeffryら (1995) J. Exp. Med. 181: 1519頁)。去勢マウスおよび偽去勢対照群を比較した場合、IL7-/-マウスの胸腺(図34G)、脾臓(図34H)またはBM(図34I)では、差は見られなかった。これらの発見は、去勢および同種HSCT後に見られる免疫再構築の向上におけるIL-7の重要な役割を示唆している。
（考察）
同種HSCTのレシピエントは、致命的感染に関わる長期免疫不全を経験する。レシピエントの齢が増すにつれて、この感染の危険性は増し、完全な免疫再構築に要する時間も増加する。HSCT後の免疫不全の期間は、一年より長くなる可能性があり、近年の長期試験により、そのドナーと比較してより高齢のHSCT患者ではTREC+CD4+T細胞の減少を示した(Storekら、(2001) Blood 98: 3505頁、Lewinら、 (2002) Blood 100: 2235頁)。このことは、胸腺の損傷およびその後のT細胞産生の減少が以前考えられていたよりもより長期であろうことを示唆している。HSCT後感染の大半は、CD4+末梢T細胞の欠如に関連している(Storekら、(1997) Am. J. Hematol. 54: 131頁)。したがって、去勢後に生じる末梢T細胞数の増加はこれらの感染の発生率を減少させ、移植患者の生存率を全般的に高めるであろう。
多くのグループが、HSCT後の造血再構築の試験に焦点をあててきたが、最も有望な結果が造血成長因子およびサイトカインの利用によりもたらされた。例えばG-CSFを用いてドナー幹細胞を集結させる(Dregerら、(1993) Blood 81: 1404頁)。Noachらは、SCFおよびIL-11またはSCFおよびFlt-3リガンドを用いた前処理により、ドナー細胞の移植が高められたことを示した((2002) Blood 100: 312頁)。KGFは、同系および同種設定の両方で移植および再構成を高め、同様にGVHDを改善するようである(Panoskaltsis-Mortariら、(2000) Blood 96: 4350頁、Krijanovskiら、(1999) Blood 94: 825頁)。IL-7は、同系HSCT後に免疫再構築を高め(Bolotinら、(1996) Blood 88: 1887頁)、また、同種HSCT後にGVHDの悪化することなく、免疫再構築を高めてGVT活性を維持することができる(Alpdoganら、(2001) Blood 98: 2256頁)。
雄マウスの性ステロイドの消失が、外科的去勢または化学的去勢によれば、BMおよび脾臓のB細胞数の両方を増加させることをいくつかの試験が示している(Ellisら、(2001)Int. Immunol. 13: 553頁、Erbenら、(2001)Horm. Metab. Res. (2001) 33: 491頁、Wilsonら、(1995) Blood 85: 1535頁、Masuzawaら、(1994) J. Clin. Invest. 94: 1090頁)。末梢B細胞数の増加は、主にB220loCD24hiの最新のBM移出の増加のためである(Ellisら、(2001)Int. Immunol. 13: 553頁)。Olsenらは、アンドロゲンがBM内で間質細胞によるTGF-βの産生を高め、次にB細胞の発生を抑制することを実証した(J. Clin. Invest. (2001) 108: 697頁)。さらに、in vitroでのTGF-βの中和は、ジヒドロテストステロンによるB細胞抑制を回復させる。TGF-βは、間質のIL-7産生を下方制御し、その後、B細胞前駆体の増殖を阻害することも示した(Tangら、(1997) J. Immunol. 159: 117頁)。したがって、去勢/アンドロゲン消失の効果の一つの可能な説明としては、この場合、同種HSCT後に、TGF-βの産生を抑制し、次にB細胞の発生を向上させることであり、このことは、去勢マウスのBMおよび脾臓のB細胞数が偽去勢対照群に比較して増加していることを説明している。
造血幹細胞の増殖も、TGF-βにより制御される。Batardらは、生理的濃度のTGF-β1がin vitroでHSCの増殖および分化を阻害することを実証した((2000) J. Cell. Sci. 113: 383〜90頁)。更に、(変異型II受容体の一時的発現を介する)HSCのTGF-Pシグナル伝達の途絶は、これらの細胞の生存率および増殖を向上させる(Fanら、(2002) J. Immunol 168: 755〜62頁)。したがって、同種HSCTおよび去勢後28日目に見られるHSC数の増加は、BM間質細胞によるTGF-β産生の減少のためであろうことがいえる。
エストロゲンおよびアンドロゲンの両方が、HSCの分化および増殖に影響を与え得る(Thurmondら、Endocrinol., (2000) 141: 2309〜18頁、Medinaら、(2001)Nat. Immunol. 2: 718〜24頁、Kouroら、(2001) Blood 97: 2708〜15頁)。エストロゲンは直接HSC、同様にいくつかのリンパ球前駆細胞サブセットの増殖および分化を阻害する(Medinaら、(2001)Nat. Immunol. 2: 718頁、Kouroら、(2001) Blood 97: 2708頁)。HSCは、機能的エストロゲン受容体(ER)を発現し、エストロゲン投与はLin-c-kit+Sca-1+ HSCの数を減少させる(Thurmondら、(2000)Endocrinol. 141: 2309頁、Kouroら、 Blood (2001) 97: 2708頁)。Thurmondらにより行われた試験は、c-kit+Sca-1+前駆体とより成熟したサブセット(c-kit+Sca-1-およびc-kit-Sca-1-)との間の移動が、ERαがBMの造血細胞に存在するときに遮断されることを示唆している(Endocrinol. (2000) 141: 2309頁)。ERは、BM間質細胞にも存在しており(Girasoleら、 (1992)J. Clin. Invest. 89 : 883頁、Smithsonら、 (1995)J. Immunol. 155: 3409頁)、このことはエストロゲンが間質による成長因子の産生にも影響を及ぼし、次に、HSC増殖および/または分化に影響を及ぼしていた可能性があることを示唆している。大半の証拠がBM間質を介するアンドロゲンのHSCに及ぼす間接的な影響を示唆しているにもかかわらず、BMのリンパ球成分上の機能的アンドロゲン受容体の存在は直接的影響を排除しない。
Olsenらは、それが、年齢に関連した胸腺の萎縮および性ステロイド消失によるその後の再生で重要である胸腺細胞ではなく、胸腺上皮の機能的アンドロゲン受容体の存在であることを示した(Olsenら、(2001)Endocrinol. 142: 1278頁)。
胸腺の萎縮および/または再生の分子機構はまだ知られていないままであるが、いくつかの可能性のある候補はある。胸腺のIL-7レベルは、年齢と共に下がる(Aspinallら、(2000)Vaccine 18 : 1629頁、Andrewら、(2002) Exp.Gerontol. 37: 455頁、Ortmanら、(2002) Int. Immunol. 14: 813頁)。これがIL-7産生細胞数の減少のためであるか、または存在する細胞がサイトカインを産生する能力が減少するためであるかは、不明なままである。しかし、加齢マウスのIL-7処置は、年齢に関連した胸腺アポトーシスの増加を阻止し、胸腺細胞増殖を高めることが可能である(Andrewら、(2001) J. Immunol. 166: 1524頁)。幹細胞因子(SCF)およびM-CSFmRNA発現もまた、年齢と共にマウスの胸腺で減少する(Andrewら、(2002) Exp. Gerontol. 37: 455頁)。細胞内シグナル伝達レベルでは、DN胸腺細胞の発生で重要な転写因子E2Aが減少するが、転写因子Foxn1(whn)は胸腺の上皮細胞の増殖および分化の際に存在し、関与する(Ortmanら、(2002)Int. Immunol. 14: 813頁)。Sempowskiらは、高齢のヒトでmRNAの定常状態レベルを観察して、白血病抑制因子(LIF)、オンコスタチンM、IL-6およびSCFmRNAの有意な増加を示した(J. Immunol. (2000) 164: 2180頁)。
上記の試験は、去勢に対する応答が多因子性であることを示唆している。IL7-/-マウスの去勢実験は、IL-7の産生の増加が去勢効果の重要な構成要素であることを示唆している。しかし、レシピエントを大量のIL-7および去勢の両方で処置したとき、胸腺の細胞充実性に与える相加効果が観察され、このことは、去勢がIL-7単独の増加レベルよりも高い胸腺細胞増殖効果をもたらすことを示唆しているであろう。
DCは、胸腺での陰性選択の重要なメディエーターであり(Jenkinsonら、(1985)Transplantat. 39: 331頁、Matzingerら、(1989) Nature 338: 74〜60頁)、一過性の設定では、移植後の胸腺で同種抗原を提示することにより移植片の受容を誘導し、ドナー特異的T細胞を除くことに関わっていた。Tomitaらは、MHCクラスI不適合レシピエントの胸腺のドナー由来細胞が、ドナー反応細胞の除去を媒介することを示した(Tomitaら、(1994) J. Immunol. 153: 1087〜1098頁)。彼らはまた、静脈内注射された胸腺由来DCがホストの胸腺に輸送されることも示した。更に、同種抗原、ドナー細胞、またはドナー溶解性ペプチドでパルスしたホスト細胞双方の胸腺内注入が、移植片受容を増大させることが示された(Garrovilloら、(1999)Transplantation 68 : 1827頁、Aliら、(2000)Transplantation 69: 221頁、Garrovilloら、(2001)Am. J. Transplant. 1: 129頁、Oluwoleら、(1993) Transplantation 56: 1523〜1527頁)。これらの試験は、去勢が、同種HSCT後に胸腺で、ホストおよびドナー由来のDCの数を著しく増加させたことを示す。すなわち、性ステロイドの消失が、胸腺のDCの分化および/または増殖を向上させる。したがって、造血幹細胞および固形臓器移植と併せて用いた去勢により、移植片受容が増大する。
（結論）
この試験により、性ステロイドの遮断が、骨髄機能廃絶およびHSCT後の免疫再構築に対し著しい陽性効果を有することが明らかになった。HSC並びにBおよびT前駆体は、顕著に高められた。これにより、移植の効率を高める重要なプラットフォームおよび腫瘍もしくは微生物抗原に対するワクチン接種、またはドナーHSCTを標的とする遺伝子治療などの正常な造血系に依存する移植後戦略が得られる。胸腺のDCの増加は、同種移植片に対する寛容性を誘発させ、維持するのに重要である。更に、去勢レシピエントでは、GVHDは悪化せず、GVT活性は減少しない。これらの結果は、一過性の性ステロイドの消失(例えばLHRH類似体を用いたもの)が予防療法として有用であり、免疫再構築を高めることを実証している。
［実施例18：性ステロイドの消失は、造血幹細胞移植後のTCR-特異的刺激を高める］
再生されたT細胞の機能的性質を評価するために、患者のTCR特異的刺激に対する応答を分析した。
（材料および方法）
患者。
試験患者は、幹細胞移植の3週間前にゾラデックス(LHRH-A)が与えられ、その後4カ月間、毎月注射された。全ての患者を、移植後5週間毎週、12カ月まで毎月治療前に分析した。倫理的認可は、Alfred Committee for Ethical Research on Humansから得た(Trial Number 01/006)。
PBMCの調製。
精製したリンパ球をT細胞活性化測定法およびTREC分析に用い、上記のように調製した。
Tリンパ球刺激アッセイ。
TCR特異的刺激の分析は、他に指示しない限り、移植後1〜12カ月、抗CD3および抗CD28架橋を利用して行った。TCR特異的刺激では、細胞を精製した抗CD3(1〜10μg/ml)および抗CD28(10μg/ml)で予めコーティングしたプレートで48時間インキュベートした。プラーク形成(48〜72時間)後、1μCiの3H-チミジンを各ウェルに加え、更に16〜24時間プレートをインキュベートした。プレートをフィルターマットに採取し、3H-チミジンの導入をβ-counter(Packard-Coulter、USA)で液体シンチレーションを用いて測定した。
I. LHRH-A投与は、同種幹細胞移植後のTCR特異的刺激に対する応答を向上させる。
LHRH-A治療した患者は、この時点で分析した患者数が少ないため6カ月および9カ月を除き、全ての時点で、対照患者に比べて増殖反応の向上を示した(3H-チミジンの導入により評価)(図57A〜B)。LHRH-Aで治療された同種移植患者では、移植後4カ月および5カ月で、対照患者と比較して、抗CD3/CD28刺激に対する応答の有意な増加が観察された。対照患者は移植後6カ月および9カ月で応答の向上を示したが、LHRH-A治療患者は、移植後12カ月目により大きな応答を示した。移植後6カ月および9カ月目に、対照患者は治療前の値と同様の応答であった。しかし、他の全ての時点では、それらは相当低かった。これに対して、LHRH-A治療患者は、6カ月目を除く全ての時点で治療前と比べて同等の応答を有していた。LHRH-A治療患者は、移植後1、3および4カ月目の対照患者に比較して、増殖反応の向上を示した(3H-チミジンの導入により評価)。新たなCD4+T細胞は移植後少なくとも1〜2カ月までは明白ではないので、このことは、直接的な末梢T細胞の効果の寄与を示している(図57A〜B)。
II. LHRH-A投与は、自己幹細胞移植後のTCR特異的刺激に対する応答を高める。
同種移植片レシピエントで見られたものと同様の応答が、自己移植レシピエントでも観察された(図57C)。これらのLHRH-Aで治療した患者は、移植後4および9カ月目にTCR刺激に対する増殖反応の向上を示した。LHRH-A治療患者は、5カ月目を除く全ての時点で、対照患者に比べて増殖反応の向上を示した(3H-チミジンの導入により評価)。治療前の値までの回復が、対照およびLHRH-A治療患者の両方で移植後12カ月目までに観察された。
III. LHRH-A投与は、慢性的な癌患者の治療後のTCR特異的刺激に対する応答を高める。
患者は、慢性的血液腫瘍を有し、免疫抑制患者であって、以下のように決定された。CD4<0.4×109/Lに関連する文献記載の深刻な感染、またはリンパ球増殖性疾患(例:CLL、骨髄腫、リンパ腫)で、通常の予防薬である静脈内ガンマグロブリン(文献記載の低ガンマグロブリン血)を受けていること、または4年以内のフルダラビン、デオキシコホルマイシン(deoxycorfomycin)および2-CdAによるそれまでの治療を受けていること、または2年以内の先行の同種もしくは自己幹細胞移植が試験に登録されたものであること。倫理的認可はAlfred Committee for Ethical Research on Humansから受けた(Trial number 01/006)。患者は、以下のようにLHRH-Aが与えられ、結果はLHRH-A投与後6週間までに与えられる。
d-1(またはそれより前):署名入りの承認および治療前に検査が行われた
dO: Zoladex投与(男性lO.8mg、女性3.6mg)
d+28: 女性-Zoladex 3.6mg投与
d+56: 女性-Zoladex 3.6mg投与
d+84: 女性および男性-Zoladex 3.6mg投与
TCR特異的刺激の分析を、投与後D7から抗CD3および抗CD28架橋を用いて行った。LHRH-A治療患者は、「臨床」様式の治療前のレベルに比較して、増殖反応が向上したことを示した(3H-チミジンの導入により評価)(図63)。すなわち、注射の日、T細胞増殖の増加が観察され、これは後の注射の前に僅かに減少したようであった。このことはまた、存在する末梢T細胞に及ぼすLHRH-Aの直接的影響の可能性も示す。これは、月一回の蓄積注射による作動薬の投与を反映した。これらの結果は、末梢T細胞への直接的影響を示す。しかし、全患者で作動薬投与を4カ月から中断したので、治療後12カ月目に見られる応答の向上は、同様に胸腺由来のT細胞の変化を反映する。
（結論）
TCR特異的刺激に対する応答の増加は移植後早くも35日目に観察されたので、これは主に前から存在するT細胞が原因である。新たに誘導されるT細胞は、この段階では胸腺に存在し始めるだけであるからである。新たに誘導されて胸腺に発生したT細胞の影響はこの時点の後にのみ観察され、したがってT細胞機能の増加は、再生した胸腺由来のT細胞ではなく、前から存在するT細胞の改善が原因であると結論することができる。
［実施例19：性ステロイドの消失は、造血幹細胞移植後の分裂刺激を高める］
再生したT細胞の機能的性質を評価するために、患者の分裂刺激に対する応答を分析した。
（材料および方法）
患者。
患者は、上記臨床試験手順No. 01/006で登録された。幹細胞移植前に、患者にLHRH-Aを与えた(3週間前)。作動薬を受けなかった患者は、対照患者として用いた。
PBMCの調製。
精製したリンパ球はT細胞活性化測定法およびTREC分析で用い、上記のように調製した。
マイトジェン刺激アッセイ。
マイトジェン応答アッセイを、移植後1〜12カ月目にポークウィードマイトジェン(PWM)および破傷風トキソイド(TT)を用いて行った。マイトジェン刺激では、PBMCを100μlのRPMI-FCS中に1×105/ウェルの濃度で96ウェル丸底プレートに蒔いた。細胞を、TT(2LFAU/ml)またはPWM(10μg/ml)と共に、37℃、5%CO2でインキュベートした。プラーク形成後(48〜72時間)、1μCiの3H-チミジンを各ウェルに加え、プレートを更に16〜24時間インキュベートした。プレートをフィルターマットに採取し、3H-チミジンの導入をβ-counter(Packard-Coulter、USA)で液体シンチレーションを用いて測定した。
I. LHRH-A投与は、同種幹細胞移植後の分裂刺激に対する応答を高める
分裂応答の解析により、LHRH-A治療を受けた同種患者は、移植後の全時点において対照群と比較してPWMに対する応答を増加させたことが示された(図58A)。すなわち、幹細胞移植前にLHRH-Aで治療した患者は、試験の全時点で対照患者と比較してPWM刺激に対する応答を高めたことを示した。
同様の結果が、TTに対する応答の解析後に明らかになった(図58B)。LHRH-A治療患者は、移植後12カ月目を除く、全時点で対照患者に比較して応答の向上を示した。
II. LHRH-A投与は、自己幹細胞移植後の分裂刺激に対する応答を高める。
幹細胞移植前にLHRH-Aで治療した患者は、試験のほとんどの時点で対照患者と比較して、PWM刺激に対する応答の向上を示した(3カ月でp≦0.001)(図59A)。移植後12カ月目までに、LHRH-A治療患者は、治療前のレベルまで応答を回復したが、対照患者はまだかなり減少していた。
また、上記同種移植片患者と同様に(図58B)、治療前にLHRH-Aを与えられた場合には、自己移植片患者もまたTTに対する応答の増加を示した。幹細胞移植前に治療前にLHRH-Aで治療された患者は、試験のほとんどの時点で対照患者に比較して、TT刺激に対する応答の向上を示した(図59B)。移植後12カ月までに、LHRH-A治療患者は、治療前のレベルまでに応答を回復したが、対照患者はまだかなり減少していた。
移植後早くも35日目にして分裂刺激に対する応答の増加が観察されたので、これは主に前から存在するT細胞が原因である。新たに誘導されるT細胞は、この段階では胸腺に存在し始めるだけであるからである。新たに誘導されて胸腺に発生したT細胞の影響はこの時点の後にしか観察されない。
［実施例20：性ステロイドの消失は、造血幹細胞移植患者で移植率を高める］
（材料および方法）
これらの実験に用いた材料および方法は、上述している。追加の材料および方法は、以下のとおりである。
同種および自己患者(対照またはLHRH-A治療)のHSCT後の全WBC数および全顆粒球または好中球数を分析した。HSCTの3週間前に、患者をLHRH-Aで治療した。作動薬を受けなかった患者を対照患者として用いた。移植後35日までに、血液1μlに付いての、全白血球(WBC)数、顆粒球(G)および好中球数を測定した。全末梢血の試料を、Cell-Dyn1200自動細胞計数器(Abbott)または血球計算板での繰り返し計数を用いて分析した。これにより、移植後の全白血球、リンパ球および顆粒球数の計算を可能にする。移植の解析は、移植後14〜35日目に行った。
（結果）
I. 移植前にLHRH-A治療を受けた自己幹細胞移植患者は、移植率を高める。
移植後14、28、および35日目に、血液1μlに付いての、全白血球(WBC)数および顆粒球(G)数を測定した。図60A〜Dに示すように、LHRH-A治療された自己患者は、移植後14日日目に、この時点で45%の対照群(p≦0.05)と比較して87%の顆粒球移植(≧500細胞/μl血液)を示し、対照群と比較して極めて高い数のWBCを示した(図60B)(p≦0.05)。LHRH-A治療された自己患者は、移植後10〜12日目で対照群と比較して、好中球の数も著しく高い値を示した(図60C、データは、8〜20人の患者の平均±1 SEMとして示す。*=p≦0.05)。更に、重要ではないが、自己患者は、対照群と比較して、LHRH-A治療した場合、分析した時点を通して、より高いリンパ球数を有していた(図60D)。このことは、幹細胞移植後に、LHRH-A治療がリンパ球レベルを顕著に増加させることを示している。
II. 移植前にLHRH-A治療を受けた同種幹細胞移植患者は、移植率を高める。
図61A、CおよびDに示すように、LHRH-A治療された同種患者は、移植後14日目に、この時点での対照群の44%と比較して64%の顆粒球移植(≧500細胞/μ1血液)を示し、対照群と比較して有意に多い数のWBCを示した(図61A)(p≦0.05)。更に、LHRH-A治療を受けた同種患者は、対照群と比較して、移植後9、12、および19日目に著しく高い数の好中球を示した(図61C、データは、8〜20人の患者の平均±1 SEMとして示す。*=p≦0.05)。更に、同種移植前にLHRH-Aで治療した場合、末梢血幹細胞移植を受けた患者の分析は、顕著なリンパ球数の増加を示した(移植後10、12、13および17〜21日目にp≦0.05)(図61D)。
同種および自己移植モデルの両方では、移植後14日目に、対照群と比較してLHRH-A治療患者でWBC数および顆粒球数の顕著な増加が観察された(図60および61)。この移植率の向上は、感染率の増加につながる好中球減少を伴う全般的な患者の罹患率(≦200好中球/ml血液)に重要である。このように、WBCおよび顆粒球数の早期回復は、LHRH-A治療患者では、より高い生存率を示す。性ステロイドの阻害は、完全な胸腺再生または完全な胸腺再生の結果としての新たなT細胞の放出前に、移植および再構築を向上させる。
［実施例21：性ステロイドの消失は、1週間以内にT細胞増殖反応を増加させる］
性ステロイドの消失によりマウスの去勢後早くて3〜7日で増殖反応を高めることができるか否かを決定するために、これらの試験を行った。
（材料および方法）
8週齢のマウスを去勢し、術後3日目(図62A、C、およびE)および7日目(図62B、D、およびF)に、抗CD3/抗CD28で刺激したT細胞増殖反応について分析した。末梢(頚部、腋窩、上腕、および鼠径部の)リンパ節(図62AおよびB)、腸間膜のリンパ節(図62CおよびD)、および脾臓細胞(図62EおよびF)を様々な濃度の抗CD3で刺激し、10μg/mlの一定濃度の抗CD28で48時間、同時刺激させた。その後、細胞をトリチウム標識したチミジンで18時間パルスし、増殖を3Hチミジン導入として測定した。対照マウスを偽去勢した、n=4、*p≦0.05(non-parametric, unpaired, Mann-Whitney統計的検定)。
（結果）
性ステロイドを消失したマウスは、去勢後3日目(図62A、C、およびE)および7日目(図62B、D、およびF)に、CD28/CD3刺激によるT細胞増殖の向上を示す。末梢リンパ節から単離されるT細胞は、去勢後3日目(10μg/ml抗CD-3)および7日目(2.5μg/mlおよび1.25μg/ml抗CD3)に、増殖反応の顕著な増加を示した。
更に、腸間膜のリンパ節(図62CおよびD)および脾臓(図62EおよびF)から単離したT細胞もまた、去勢後3日目で、偽去勢マウスよりも抗CD3刺激による増殖の顕著な増加を示した。
去勢後早くて3〜7日目に(胸腺からの新たなT細胞の移住の前に)、抗CD3およびCD28架橋の刺激に対するT細胞の応答の増加がみられる。これらのデータは、性ステロイドの消失が、胸腺の再活性化前に、末梢T細胞プールの機能性に直接的な影響を有することを示している。
ヒト患者での末梢T細胞に及ぼすLHRH-Aの直接的影響の程度を決定するために、試験を実施する。対照患者のT細胞を様々な用量のLHRH-Aと共にインキュベートし、様々な時点(3、7および14日目)で増殖レベルを、対照(培地単独)試料と比較して分析する。これにより、マウスモデルで観察されたように、LHRH-Aが、それらの活性化を引き起こすことにより、存在するT細胞に直接的に作用するか否かの判断が可能になる。
［実施例22：性ステロイドの消失は、遺伝子導入したHSCT後の造血を向上させる］
I. 去勢は、HSCT後のBM、胸腺、および脾臓での移植を高める。
マウスを遺伝子導入したHSCTの1日前に去勢した。5×106Ly5.1+BM細胞を、照射(800rad)C57/BL6マウスに静脈内注射した。BM、脾臓および胸腺を、移植後様々な時点(2〜6週間)で、フローサイトメトリーにより分析した(図35)。図35Bに示すように、去勢およびHSCT後2週間で、偽去勢対象群と比較して、去勢マウスのBMで極めて多数の細胞が存在する。同様に、図35Cに示すように、偽去勢対照に比較して、移植後2、4および6週間で胸腺細胞数の顕著な増加がみられる。図35Cに示すように、去勢レシピエントの末梢では、移植後4および6週目の脾臓細胞数も、対照群より極めて多い。
II. 去勢は、遺伝子導入したHSCT後のBMでHSCの移植を高める。
マウスを遺伝子導入したHSCTの1日前に去勢した。5×106Ly5.1+BM細胞を、照射(800rad)C57/BL6マウスに静脈内注射した。転写後2週間目に、BMのlin-c-kit+sca-1+HSCをフローサイトメトリーにより分析した(図36)。BMT移植および去勢後2週間目に、偽去勢対照群と比較して、去勢マウスのBMで極めて多数のドナー由来HSCが存在する。
III. 去勢は、遺伝子導入したHSCT後のBMでHSCの移植を高める(2.5×106細胞)。
マウスを遺伝子導入したHSCTの1日前に去勢した。2.5×106Ly5.1+BM細胞を、照射(800rad)C57/BL6マウスに静脈内注射した。BMを、移植後2週間目に、フローサイトメトリーによりlin-c-kit+sca-1+HSCについて分析した(図37A〜B)。図37Aは、BM中の共通リンパ球前駆細胞の割合を図示する。図37Bは、BM中の共通リンパ球前駆細胞の数を図示する。BMT移植および去勢後2週間目に、去勢マウスのBMで、偽去勢対照群に比較して、ドナー由来HSCの割合の著しい増加が見られる。
IV. 去勢は、遺伝子導入したHSCT後のBMでHSCの移植を高める(5×106細胞)。
5×106Ly5.1+BM細胞を、照射(800rad)C57/BL6マウスに静脈内注射した。BMを、移植後2週間目にフローサイトメトリーによりlin-c-kit+sca-1+HSCについて分析した(図37C〜D)。図37Cは、BM中の共通リンパ球前駆細胞の割合を図示する。図37Dは、BM中の共通リンパ球前駆細胞の数を図示する。BMT移植および去勢後2週間目に、去勢マウスのBMで、偽去勢対照群に比較して、ドナー由来HSCの割合の著しい増加がみられる。
V. 去勢は、遺伝子導入したHSCT後の胸腺でドナー由来DCの移植率を高める。
5×106Ly5.1+BM細胞を、照射(800rad)C57/BL6マウスに静脈内注射した。胸腺細胞を、移植後2週間目にフローサイトメトリーにより分析した。ドナー由来DCは、CD45.1+CD11c+MHCクラスII+CD11b+または-として定義した。ドナー由来CD11b+およびCD11b-DCは、去勢マウスの胸腺で、BMT後2週間目に、偽去勢対照群と比較して、著しく増加する(図38)。
VI. 去勢は、遺伝子導入したHSCT後の脾臓でドナー由来B細胞の移植率を高める。
5×106Ly5.1+BM細胞を、照射(800rad)C57/BL6マウスに静脈内注射した。脾細胞を、移植後2週間目にフローサイトメトリーにより分析した。去勢マウスの脾臓で、遺伝子導入したBMT後2週間目に、偽去勢対照群と比較して極めて多数のB220+B細胞が存在する(図39)。
［実施例23：LHRH-A治療は、効果的に血清テストステロンを消失させる］
（材料および方法）
患者の血清の性ステロイドレベルの検出を、125I-テストステロンラジオイムノアッセイ(RIA)を用いて行った。アッセイに先立ち、全ての試薬、試料、および対照群を室温に戻した。対照のチューブには、緩衝液単独-非特異的結合(NSB)チューブまたは0ng/mlテストステロン標準物質(B0)のいずれかを含む。各チューブに、緩衝液単独、標準物質(0〜10ng/mlテストステロン)または試験試料を加え、次いで、性結合グロブリン阻害剤(SBGI)を加え、放射能標識したテストステロンの非特異的結合を制限した。125I-テストステロンを各チューブに加え、次いで、抗テストステロン抗体を加えた(NSBチューブを除く)。次いで、チューブを37℃で2時間インキュベートした。この後、二次抗体を全チューブに加え、ボルテックスし、更に60分間インキュベートした。チューブを15分間遠心分離して(1000gmax)、上澄みを除き、沈殿をPackard Cobra auto-beta counterでカウントした。3回のcpm結果を平均し、標準曲線を、結合したテストステロンの割合(B/B0)の式を用いて作成した。
Figure 2006523720
試料=特定の試験試料の平均cpm
NSB=非特異的結合チューブの平均cpm
B0=0ng/ml標準物質(全結合チューブ)の平均cpm
各試験試料のテストステロンレベルを標準曲線から決定した。
（結果）
前立腺癌患者へのLHRH-Aの投与は、去勢レベルの血清テストステロンを生じる。
LHRH-A治療の有効性を判断するために、治療前およびLHRH-Aを用いた治療の4カ月目に、血清テストステロンレベルを全患者について分析した。分析は、125I-テストステロンを用いてラジオイムノアッセイ(RIA)を用いて行った。血清テストステロンの濃度は、ホルモン療法の前は、1〜3ng/mlテストステロン(平均=2.3ng/ml)の範囲内であった(図46A)。治療4カ月目に、患者は基本的に検出可能な血清テストステロンを有しておらず、このことは、性ステロイド放出の抑止が成功したことを示していた。
LHRH-A投与は、末梢血の範囲内では、リンパ球サブセットの割合に影響を与えない。
LHRH-Aを用いた治療の4ヵ月後、治療前の値と比べて、いずれのリンパ球サブセットの割合にも変化は観察されなかった。これらの値は、全て正常な範囲内である。末梢血リンパ球について、T細胞、B細胞、および骨髄由来(NKおよびマクロファージ)の細胞の割合および細胞の数をFACSにより分析した。LHRH-A投与後に、どの細胞サブセットの割合の変化も観察されなかった。更に、全てのリンパ球サブセットの割合は、この年齢の集団での正常の範囲であった(図84C)(Hannetら、1992; Xuら、1993)。
［実施例24：酢酸ゴセレリン(ゾラデックス(登録商標))を用いた自己または同種幹細胞移植を受けた患者の性ステロイドの一過性の消失後の胸腺再活性化］
この実施例では、自己または同種末梢血幹細胞移植(PBSCT)前に、酢酸ゴセレリン(ゾラデックス(登録商標))を投与する。最初のエンドポイントは、in vitroアッセイにより測定されるような胸腺の再活性化である。患者は、移植後6カ月間経過調査する。20人(10人の同種移植片および10人の自己移植片)の患者が、試験に参加する。この実施例は、下垂体を除感作し、それによってLHおよびFSHの放出を妨げるそれらの作動薬を用いてLHRHレベルでの性ステロイドの産生を阻害する効果を調査するものである。同様に、これは、胸腺機能に及ぼす阻害効果を取り除く生殖腺のアンドロゲンおよびエストロゲンの産生の遮断を引き起こす。この試みで検討するグループは、大量放射線化学療法(HDT)およびPBSCTを受けている患者である。
酢酸ゴセレリン(ゾラデックス(登録商標))は、強力なLHRHの合成デカペプチド類似体である。急に与えると、酢酸ゴセレリンは脳下垂体からLHを放出するであろう。しかし、慢性的投与後には、酢酸ゴセレリンはゴナドトロピン産生の強力な阻害剤であり、生殖腺の抑制および結果的に生殖器官の退行をもたらす。動物およびヒトでは、下垂体の最初の刺激、LH分泌および血清テストステロンの一過性の上昇の後の慢性的投与は、ゴナドトロピン分泌の阻害を生じる。結果は、治療の開始の約3週間以内の下垂体のLH発生の持続的抑制と、男性の血清テストステロンレベルの外科的に去勢した男性で通常見られる範囲までの減少である。その後、この抑制は、治療が続く限り持続される。
患者は、18歳またはより高齢の男性および女性であり、悪性疾患または骨髄不全でPBSCTによる高用量療法(HDT)を受ける予定になっている。ゾラデックス(登録商標)10.8mgインプラント処方(男性用)を、生分解性のおよび生体適合性のポリグラクチンの円筒状ロッドに分散し、皮下注射後12週間以上連続的に放出する。3.6mgインプラント(女性用)を生分解性のおよび生体適合性のポリグラクチンの円筒状ロッドに分散し、皮下注射後28日間以上連続的に放出する。インプラントは、14〜16の標準規格注射針を有する目的に合うように設計されたアプリケータで商業的に供給されている。
血中性ステロイドの最低値までの減少は、数週間かかってもよい。したがって、PBSC注入の21日前(0日目)に、患者は、性ステロイド除去療法で、LHRH作動薬のゾラデックス(登録商標)(インプラント)の形で注射される。男性では、単一用量として10.8mgのゴセレリン(3カ月間効果がある)を-21日目に投与され、63日目に更に3.6mgを注射される(28日間効果がある)。女性では、3.6mg(28日間効果がある)を-21日目並びに7、35、63日目に投与される。これは、性ステロイドレベルを減少させるのに十分に効果的であり、胸腺を再活性化させるであろう(PBSCT後4カ月と予測)。したがって、この実施例では、治療の僅か4〜6ヵ月目に投与する。その他の用量は、当業者に容易に決定されるように、受け入れられるとみなされるであろう。
PBPCは、0日目に注入される。再活性化された胸腺は、注入した前駆細胞を利用し、新しいTリンパ球および胸腺上皮細胞に変換する。最大性ステロイドの「消失」はPBSC注入の時点であり、それゆえ注入されたPBSCは胸腺の再構築を補助することが可能である。PBSCT後3〜4週間目で、最初の新しいT細胞が血流に出現するが、治療はPBSCT後3カ月間継続され、免疫系を完全に正常化させる。
胸腺機能は、フローサイトメトリーによるT細胞サブセット、in vitroのT細胞応答、およびTRECの産生の評価により決定される。
試験開始に先立って、通常の事前HDT試験を行い、および文献記載の基礎FBE、電気分解、LFTを行う。その他の治療前の分析としては、血清β-HCG(女性)、胸腺CT、骨密度試験、タンパク質電気泳動および免疫電気泳動、ホルモン試験:TFT、FSH、LH、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロンが挙げられる。更に、様々な基礎T細胞アッセイが行われる。白血球を50mlの血液から精製し、以下のように検査する:
(a)フローサイトメトリー
ナイーブ対記憶T細胞
CD27-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-PerCP、CD4-またはCD8-APC
CD27-FITC、CD45RO-PerCP、CD4/CD8-APC、Ki-67-PE
CD62L、CD45RO-PerCP、CD103、CD4/CD8-APC
T細胞サブセット
CD4-FITC、CD8-APC、αβTCR-PE、γδTCR-B/S-PerCP
CD25-PE、CD69-CyChrome、CD4-FITC、CD8-APC
CD28-CyChrome、αβTCR-PE、CD4-FITC、CD8-APC
B細胞/骨髄細胞
CD19-FITC、CD3-PerCP、CD56-PE、CD34-APC
CD11b-CyChrome、CD11c-PE、CD4-FITC、CD8-FITC
サイトカイン
IL-4-PE、IFNg-APC、CD4-FITC、CD8
その他のマーカー
CD11a、CD95、HLA-DR、CD2、CD5
治療の前後に診断されるので、全患者は内部標準としての役割を果たす。染色特異的対照群は、染色前にFITC/PE/APCおよびFcRのブロッキングを有するアイソタイプ対照群を含む。
(b)T細胞機能
血中リンパ球は、in vitroでCD3架橋に応答する能力について検討した。
(c)TREC分析
ナイーブT細胞は単離され、上記のようにTCR遺伝子の再構成の結果として形成されるT細胞受容体切除サークルの存在をプローブとする。これらの存在は、胸腺からの移出の非常に強い指標となる(メインストリームT細胞産生の唯一の源泉である)。細胞分裂はTCR遺伝子の再構成後の胸腺発生に関連するので、TRECレベルは胸腺移住を実際より小さく見積もる可能性がある(実際のレベルの約10%)。
上記明細書中に記載された全ての出版物は、参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明の記載した方法およびシステムの様々な変形および改変は、本発明の範囲および本質から逸脱しない限り、当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されたにもかかわらず、特許請求の範囲に記載された発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるであろう。実際、生物学または関連技術分野の当業者に明らかである本発明を実施するために記載された方法の様々な変形が特許請求の範囲の範囲内であることを意図するものである。
［実施例25：去勢は、同種移植片に対する寛容性を誘導する］
以下のマウスを、Jackson Laboratory(Bar Harbor、ME)から購入し、通常の条件下で飼育する。C57BL/6J(黒、H-2b)、DBA/1J(薄茶、H-2q)、DBA/2J(薄茶、H-2d)、およびBalb/cJ(アルビノ、H-2d)。齢は4〜6週齢から26カ月齢の範囲であり、関連性のある場合には指摘する。
C57BL/6JマウスをドナーBM再構成のレシピエントとして用いる。上述のように、受容マウス(9カ月齢より加齢のC57BL6/J、これは胸腺が顕著に萎縮し始めた齢であるためである)を、3時間以上の間隔で5.5Gy照射に2回かける。2回目の照射線量の1時間後、受容マウスを、DBA/1J、DBA/2J、またはBalb/cJマウス由来の5×106ドナーBM細胞を用いて静脈内注射する。BM細胞は、RPMI-1640培地をドナー(2カ月齢DBA/1J、DBA/2J、またはBalb/cJ)マウスの頚骨および大腿骨に通すことにより得られ、次いで、培地で採取した細胞を収集する。
上述したように、再構築と同時点または再構築の1週間前までに去勢された受容マウスでは、偽去勢(ShCx)対照マウスに比較して、胸腺の再構築の率の顕著な増加がみられる。更に、偽去勢マウスと比較すると、去勢マウスが胸腺細胞充実性を増加させ、それらのBM中でより多くの細胞を有し、BMT後にそれらのBM中でB細胞前駆体およびB細胞の発生を向上させたことがわかる。受容マウスのMHC(すなわち、マウスH-2遺伝子座)がドナーマウスのものと異なるので、偽去勢マウスと比較して、去勢マウスでドナー由来の血球数の増加を検出することは容易である。ネガティブ選択(寛容性誘導)をホストおよびドナーにさせるキメラ胸腺で、ホストおよびドナー由来DCの正常レベルおよび分布もみられる。
ドナーBM細胞を用いた受容マウスの再構築の4〜6週間後、植皮をドナーマウスから採取し、標準的な方法で受容マウスに移した(例えば、Unit 4.4 in Current Protocols In Immunology、John E. Coliganら(編)、Wiley and Sons、New York、NY 1994、2002年も含め、毎年更新参照)。概説すると、麻酔した受容マウス(例えば、Balb/cJBMで再構築されたC57BL/6Jマウス)の真皮および表皮を除去し、Balb/cJ由来の真皮および表皮と置き換える。ドナーの皮膚の毛が白色なので、受容C57BL/6Jマウスの本来の黒毛から容易に区別される。移植されたドナーの皮膚の健康状態を術後に毎日評価する。
例えば、偽去勢マウスはドナーHSCのDCを産生するホストの胸腺への十分に取り込まないので、結果は、去勢されたドナー再構築C57BL/6Jマウスに移植されたドナーBalb/cJ皮膚は、偽去勢されたドナー再構築C57BL/6Jマウスに移植されたドナーの皮膚よりもよく「取り込む」(すなわち、受け入れる)ことが示すであろう。ドナー植皮は、Balb/cJ BMで再構築されなかった受容偽去勢C57BL/6Jマウスに取り込まれないことがわかる。
実験は、ドナーBMを移植した受容マウスが、MHC適合だが他の異なる植皮の寛容性を誘導し得るかどうかを判断するためにも行われる。概説すると、雄C57BL/6Jマウス(H-2b)は、去勢または偽去勢される。次の日、マウスは、前述のようにBalb/cJ BM(H-2d)で再構築される。再構築の4週間後、2つの植皮(すなわち、真皮および上皮を含む)が受容C57BL/6Jマウスに移植される。最初の植皮は、DBA/2J(薄茶、H-2d)マウス由来である。第2の植皮は、Balb/cJマウス(アルビノ、H-2d)由来である。C57BL/6マウス、Balb/cJマウス、およびDBA/2Jマウスの被毛の色は全て異なるので、植皮は容易に互いにおよび受容マウスから区別し得る。
上述したように、Balb/cJマウス由来の植皮は、Balb/cJ-BM再構築され、偽去勢されたレシピエントマウスまたは偽去勢され、ドナーBMで再構築されなかった受容マウスよりも、Balb/cJ-BM再構築され、去勢された受容マウスに「取り込まれる」ことがわかる。更に、DBA/2Jマウス由来の植皮は、Balb/cJ-BM再構築され偽去勢された受容マウスまたは偽去勢され、ドナーBMで再構築されなかった受容マウスよりもBalb/cJ-BM再構築され去勢された受容マウスに「取り込まれる」ことがわかる。
［実施例26：去勢は、胸腺摘出マウスのBMおよび脾臓に影響を及ぼす］
これらの予備実験は、去勢の影響が胸腺摘出患者(マウス)で明白であったか否かを判断するために行われた。結果は、性ステロイドシグナル伝達の破壊は、免疫システム(例えば、BMおよび胸腺の免疫細胞)に直接的または間接的に影響を及ぼし、再生した胸腺の存在と無関係であることを示した。
（材料および方法）
マウスは、当業者に知られた通常の方法を用いて、去勢され、胸腺摘出された。マウスを以下のグループ、無処置(すなわち、ナイーブ、「無処置」)、偽去勢(「shcx」)、および去勢(「cx」)に分け、次いで、これらの3つのグループの各々を、胸腺摘出(「tx」)または偽胸腺抽出(thymectoized)(「shtx」)し、合計6つのグループを分析した。骨髄消失およびBMTの2週間および4週間後に、6つのグループのそれぞれを分析した(上記方法参照)。
（結果）
I. 胸腺摘出は、BMの性ステロイド阻害の効果に影響しない。
図64Aに示すように、BMT後4週間目に、Tx/Cxマウスは、ShTx/Cxマウスに相当する、BM共通リンパ前駆細胞(CLP)の数の増加を示した。
図64Bに示すように、BMT後4週間目に、Tx/Cxマウスは、ShTx/Cxマウスに相当する、BMのB細胞の合計数の増加を示した。Tx/CxマウスおよびShTx/Cxマウスは、ShCx/TxまたはShCx/ShTx対照群のいずれかと比較して、BMでB細胞の数も増加させた。
図64Cに示すように、BMT後4週間目に、Tx/Cxマウスは、ShTx/Cxマウスに相当する、BMの未熟B細胞の合計数も増加させた。Tx/CxマウスおよびShTx/Cxマウスは、ShCx/TxまたはShCx/ShTx対照群のいずれかと比較して、BMで未熟B細胞の数も増加させた。
したがって、図64A〜Cの結果は、移植の増加を含む、BMでの細胞の数および機能性の増加に去勢が与える影響は、胸腺の再活性化を必要とせず、むしろBMおよび免疫系の他の細胞に及ぼす直接的な効果のためであるという結論を支持する。
II. 胸腺摘出は、性ステロイド阻害が脾臓に与える効果に影響を及ぼさない。
図64Dに示すように、BMT後4週間目に、Tx/Cxマウスは、ShTx/Cxマウスに相当する、脾臓での細胞合計数の増加も示すようである。Tx/CxマウスおよびShTx/Cxマウスもまた、ShCx/TxまたはShCx/ShTx対照群のいずれかと比較して、脾細胞の合計数を増加させた。
図64Eに示すように、BMT後4週間目に、Tx/Cxマウスは、ShTx/Cxマウスに相当する、脾臓でのB細胞の合計数の増加も示すようである。Tx/CxマウスおよびShTx/Cxマウスは、ShCx/TxまたはShCx/ShTx対照群と比較して、脾臓でB細胞の数も増加させた。
このように、図64D〜Eの結果は、再構築の向上を含む、脾臓の免疫細胞の数および機能性を増加させることに及ぼす去勢の効果は、胸腺の再活性化を必要とせず、むしろBMおよび免疫系のその他の細胞に与える直接的な効果のためであるという結論を支持する。
上記明細書中に記載された全ての出版物は、参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明の記載した方法およびシステムの様々な変形および改変は、本発明の範囲および本質から逸脱しない限り、当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されたにもかかわらず、特許請求の範囲に記載された発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるであろう。実際、生物学または関連技術分野の当業者に明らかである本発明を実施するために記載された方法の様々な変形が特許請求の範囲の範囲内であることを意図するものである。
当業者は、通常の実験を利用するだけで、本明細書に詳細に記載された特定の実施形態と等価である多くのものを認識し、または確認し得るであろう。このような等価物は、特許請求の範囲に含まれるものであることを意図するものである。
去勢が速やかに胸腺の細胞充実性を再生することを示す図である。図1A〜Bは、去勢前後の胸腺重量および胸腺細胞数の変化を示すグラフである。胸腺の萎縮の結果、胸腺重量(図1A)または胸腺あたりの細胞数(図1B)で測定されるように齢に伴う胸腺細胞数の有意な減少が生ずる。これらの研究では高齢(すなわち2年齢の)雄性マウスを外科的に去勢した。高齢(1および2年齢)で去勢後(post-cx)2〜4週間の雄性マウスにおして体重(図1A)および胸腺の細胞充実性(図1B)に関する胸腺重量を分析した。若齢成(2カ月齢)マウスに比べ齢に伴う胸腺重量および細胞充実性の有意な減少がみられた。胸腺重量および細胞数におけるこの減少は、去勢によって回復したが、細胞数の減少は去勢の1週間後で依然として明らかであった(図1C)。去勢の2週後までに細胞数は若齢成体にみられるレベル近くまで増加することが分かった(図1B)。去勢の3週後までに、細胞数は若齢成体に比べ有意に増加し、これらの細胞数は去勢の4週後までに安定化した(図1B)。1群あたりマウス4〜8匹(図1A)または群あたりマウス8〜12匹(図1B)の平均±1SDとして結果を表す。若齢成体(2カ月齢)の胸腺および去勢の2〜6週後の胸腺に比べ**=p≦0.01、***=p≦0.001。 図１Ａの説明と同じ。 去勢は末梢におけるCD4:CD8T細胞比を回復させることを示す図である。これらの研究で、高齢(2年齢)マウスを外科的に去勢し、去勢の2〜6週後に末梢リンパ球集団を分析した。図2Aおよび2Bは脾臓における総リンパ球数を示す。ホメオスタシスが脾臓内の総細胞数を維持していることから、脾臓細胞数は齢によっても去勢後でも一定である(図2Aおよび2B)。しかし、高齢(18〜24カ月齢)マウスにおけるリンパ節中の細胞数は枯渇した(図2B)。リンパ節細胞充実性におけるこの減少は、去勢によって回復した(図2B)。図2Cは、脾臓およびリンパ節の両方においてT細胞に対するB細胞の比が齢によっても去勢後でも変化しなかったことを示す。それは、齢によっても去勢後でもこの比の変化がみられなかったからである。しかし、(プールされた)リンパ節および脾臓の両方において齢に伴うCD4+:CD8+T細胞比の有意な減少(p<0.001)がみられた(図2E)。この減少は、去勢の4〜6週後までに若齢成体(すなわち2カ月齢)のレベルに回復した(図2D)。1群あたりマウス4〜8匹(図2A、2C、および2E)または8〜10匹(図2B、2D、および2F)の平均±1SDとして結果を表す。若齢成体(2カ月齢)および去勢後マウスに比べ*=p≦0.05、**=p≦0.01、***=p≦0.001。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 図２Ａの説明と同じ。 胸腺萎縮または去勢による再生にかかわらず胸腺細胞亜集団が類似した比率に維持されていることを示す図である。これらの研究で、高齢(2年齢)マウスを去勢し、胸腺細胞サブセットをマーカーCD4およびCD8に基づいて分析した。CD4-CD8-DN、CD4+CD8+DP、CD4+CD8-およびCD4-CD8+SP胸腺細胞集団についてCD4(X軸)対CD8(Y軸)で表した代表的な蛍光発色セルソーター(FACS)のプロフィールを若齢成体(2カ月齢)、高齢(2年齢)、および高齢去勢後動物(2年齢、cx後4週)について示す。各四半部の百分率を各プロット上部に示す。齢および去勢後によりどのCD4/CD8確定サブセットの比率にも差が見られなかった。このように、胸腺細胞の亜集団は齢により一定で、去勢後に胸腺細胞が同時に増大した。 去勢による胸腺細胞増殖の再生を示す図である。BrdUのパルスをマウスに注射し、増殖中の(BrdU+)胸腺細胞を分析した。これらの研究で、高齢(2年齢)マウスを去勢しブロモデオキシウリジン(BrdU)のパルスを注射し、増殖レベルを決定した。齢および去勢後に伴う胸腺内のBrdU+細胞の比率の代表的なヒストグラムプロフィールを示す(図4A)。胸腺内の増殖の総比率に差を認めなかった。それは、この比率が齢によっても去勢後でも一定を維持するからである(図4Aおよび図4Bグラフ左)。しかし、齢に伴いBrdU+細胞数の有意な減少がみられた(図4Bグラフ右)。去勢後2週間までにBrdU+細胞数は若齢成体(すなわち2カ月齢)にみられるのに類似した数まで増加した(図4Bグラフ右)。1群あたりマウス4〜14匹の平均±1SDとして結果を表す。若齢成体(2カ月齢)対照マウスおよび去勢後2〜6週間のマウスに比べ***=p≦0.001。 去勢が全ての胸腺細胞サブセットの増殖を増強することを示す図である。これらの研究で、高齢(2年齢)マウスを去勢し、ブロモデオキシウリジン(BrdU)のパルスを注射し、増殖レベルを決定した。胸腺内のCD4およびCD8発現に基づく胸腺細胞の様々なサブセットの増殖の分析を行った。図5Aは、BrdU+集団内の各胸腺細胞サブセットの比率は齢および去勢後により変化しなかったことを示す。しかし、図5Bに示すように、増殖中のDN(CD4-CD8-)胸腺細胞の比率に齢に伴う有意な減少がみられた。図5Cは齢によっても去勢後でもTNサブセット内のBrdU+細胞(すなわち増殖中の細胞)の総比率に変化がみられなかったことを示す。しかし、齢に伴いTN1(CD44+CD25-CD3-CD4-CD8-)サブセットの増殖に有意な減少(図5E)およびTN2(CD44+CD25+CD3-CD4-CD8-)サブセットの増殖に有意な増加(図5F)がみられた。これは去勢後に回復した(図5D〜F)。1群あたりマウス4〜17匹の平均±1SDとして結果を表す。若齢成体(2カ月齢)マウスに比べ*=p<0.05、**=p≦0.01(有意)、***=p≦0.001(高度に有意)、^=去勢後2〜6週のマウスと有意に異なる(図5E〜H)。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 図５Ａの説明と同じ。 去勢が高齢胸腺からのT細胞運び出しを増加させることを示す図である。これらの研究で、高齢(2年齢)マウスを去勢し、FITCを胸腺内注射して胸腺からの運び出し率を決定した。末梢中のFITC+細胞数を24時間後に計算した。図6Aに示すように、24時間で末梢から検出された新鮮胸腺移出(RTE)細胞数の齢に伴う有意な減少を認めた。萎縮後、これらの値はcx後2週間までに有意に増加した。図6Bに示すように、移出率(運び出し/胸腺細胞充実性の総数)は齢により一定であったが、去勢後2週間で有意に低減した。齢に伴い、CD8+RTEに対するCD4+RTEの比率の有意な増加がみられた。これはcxの1週間後までに正常化した(図6C)。1群あたりマウス4〜8匹の平均±1SDとして結果を表す。若齢成体(2カ月齢)マウスに比べ(図6A)および他の全ての群に比べ(図6Bおよび6C)*=p≦0.05、**=p≦0.01、***=p≦0.001。高齢(1および2年齢)非cxマウスに比べ、およびcxの1週間後の高齢マウスに比べ^=p≦0.05。 去勢がT細胞枯渇後の胸腺細胞再生を増強することを示す図である。3カ月齢マウスをシクロホスファミド(200mg/kg体重のシクロホスファミドを2日間に2回腹腔内注射)(図7A)で処置するか、または亜致死照射(625Rad)(図7B)にかけた。検討したT細胞枯渇の両モデルについて去勢(Cx)マウスは模擬去勢(ShCx)対照に比べ胸腺再生速度の有意な増加を示した。T細胞枯渇(TCD)後1および2週間の総胸腺細胞数の分析は、去勢がシクロホスファミドまたは亜致死照射のどちらかの処置後の胸腺再生速度を有意に増加させることを示した(それぞれ図7Aおよび7B)。1群あたりマウス4〜8匹の平均±1SDとしてデータを表す。図7Aでは、対照(齢の一致した未処置)マウスに比べて***=p≦0.001、両群の去勢マウスに比べて^=p≦0.001。図7Bでは、対照マウスに比べて***=p≦0.001、処置の1週間前に去勢され照射1週間後のマウスに比べて、および照射2週間後の両群の去勢マウスに比べて^=p≦0.001。 シクロホスファミド処置後の脾臓およびリンパ節内のリンパ球の総数を示す図である。これらの研究で、シクロホスファミド(200mg/kg体重のシクロホスファミドを2日間に2回腹腔内注射)を用いて(3カ月齢)マウスのリンパ球を枯渇させ、最終シクロホスファミド注射と同じ日に外科的去勢または疑似去勢の一方を行った。胸腺、脾臓および(プールされた)リンパ節を単離し、総細胞充実性を評価した。疑似去勢マウスは、対照(齢の一致した未処置)マウスに比べて処置の1および4週間後に脾臓中の細胞数が有意に低下した(図8A)。両処置群について処置の1週間後にリンパ節内の細胞数の有意な減少を認めた(図8B)。処置の2週間後に、CxマウスはShCxマウスに比べて有意に高いリンパ節細胞数を有していた(図8B)。各棒線は1群あたりマウス7〜17匹の平均±1SDを表わす。対照(齢の一致した未処置)に比べ*=p≦0.05、**=p≦0.01。去勢マウスに比べ^=p≦0.05。 化学療法剤であるシクロホスファミドを用いた処置およびその同日に実施した外科的または化学的去勢後の胸腺(白棒線)、脾臓(灰色棒線)およびリンパ節(黒棒線)の細胞数の変化を示す図である。処置の1および2週間後の非去勢(シクロホスファミド単独)群に比べて去勢動物における胸腺の迅速な増大に注意。さらに去勢群の脾臓およびリンパ節細胞数はシクロホスファミド単独群に比べて十分増加した。(1処置群1時点あたりn=3〜4)。シクロホスファミド処置後の免疫系の再生においては外科的去勢に匹敵する。 外科的去勢の1週間後に照射(625Rad)を行った後の胸腺(図10A)、脾臓(図10B)およびリンパ節(図11C)の細胞数における変化を示す図である。これらの研究で、亜致死照射(625Rad)を用いて若齢(3カ月齢)マウスのリンパ球を枯渇させた。照射の1週間前にマウスに疑似去勢または去勢の一方を行った。去勢に伴い胸腺再生の有意な増加(すなわちより高速の胸腺再生)を認めた(図10A)。非去勢(照射単独)群に比べて処置の1および2週間後で去勢動物における胸腺の迅速な増大に注意。(1処置群あたり1時点あたりn=3〜4)。脾臓(図10B)またはリンパ節(図10C)細胞数に去勢マウスとの差はみられなかった。リンパ節細胞数は対照マウスに比べて処置の2週間後に依然として慢性的に低下していた(図10C)。1群あたりマウス4〜8匹の平均±1SDとして結果を表す。対照マウスに比べ*=p≦0.05、**=p≦0.01;対照および去勢マウスに比べ***=p≦0.001。 照射およびその同日の去勢後の胸腺(図11A)、脾臓(図11B)およびリンパ節(図11C)の細胞数の変化を示す図である。これらの研究で、亜致死照射(625Rad)を用いて若齢(3カ月齢)マウスのリンパ球を枯渇させた。照射と同日にマウスに疑似去勢または去勢の一方を行った。去勢マウスは、疑似去勢対照に比べ有意に高速の胸腺再生を示した(図11A)。非去勢(照射単独)群に比べて処置の2週間後で去勢動物における胸腺の迅速な増大に注意。去勢マウスと脾臓(図11B)またはリンパ節(図11C)細胞数に差はみられなかった。リンパ節細胞数は、対照マウスに比べて処置の2週間後に依然として慢性的に低下していた(図11C)。1群あたりマウス4〜8匹の平均±1SDとして結果を表す。対照マウスに比べ*=p≦0.05、**=p≦0.01;対照および去勢マウスに比べ***=p≦0.001。 照射処置後の脾臓およびリンパ節内のリンパ細胞の総数を示す図である。亜致死照射(625Rad)の1週間前に3カ月齢マウスに去勢または疑似去勢の一方を行った。処置の1週間後に脾臓(図12A)および(プールされた)リンパ節(図12B)の両方において重度のリンパ球減少が明らかであった。処置の2週間後までに脾臓リンパ球数は対照レベルに戻った(図12A)が、リンパ節の細胞充実性は対照(齢の一致した未処置)マウスに比べ依然として有意に低下していた(図12B)。処置群の間で差を認めなかった。各棒線は1群あたりマウス6〜8匹の平均±1SDを表す。対照マウスに比べ**=p≦0.01、***=p≦0.001。 去勢がHSV-1免疫に対する応答性を回復することを示す図である。マウスの後足踝関節に4×105pfuのHSVを免疫した。感染5日目に所属リンパ節(膝窩)について応答細胞を分析した。図13Aは単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)を足底に免疫した後のリンパ節細胞充実性を示す。高齢非去勢群に比べて高齢去勢後における細胞充実性の増加に注意。図13Bは、FACSによりCD25対CD8細胞としてゲートに入った全般的な活性化細胞数を示す(すなわち活性化細胞はCD8+CD25+細胞としてゲートに入る)。高齢マウスの去勢は若齢マウスに等しいCTL数を伴い、HSV-1に対する免疫応答を回復した。マウス8〜12匹の平均±1SDとして結果を表す。若齢(2カ月齢)および去勢マウスの両方に比べて**=p≦0.01。 HSV-1接種後の活性化LN(リンパ節)におけるCTL(細胞傷害性Tリンパ球)上のVβ10の発現(HSV特異的)を示す図である。高齢(すなわち18カ月齢)マウス全般においてVβ10の応答性は正常であるが、一部のマウスでVβ10の完全な喪失を認めた。代表的なヒストグラムのプロフィールを示す。高齢マウスにおけるクローン応答の減少および去勢後に期待される応答が回復することに注意されたい。 去勢がHSV-1感染後の活性化を増強することを示す図である。図15Aは、HSV-1感染マウスのLNにおける活性化(CD8+CD25+)細胞の代表的なFACSプロフィールを示す。齢または去勢後に伴い活性化CTLの比率に差がみられなかった。示すように、高齢マウスの去勢は若齢マウスに等しいCTL数を有してHSV-1に対する免疫応答を回復した。マウス8〜12匹の平均±1SDとして結果を表す。若齢(2カ月齢)および去勢マウスの両方に比べて**=p≦0.01。 HSV-1に対する免疫応答の特異性を示す図である。HSV-1で免疫したマウスから膝窩リンパ節細胞を取り出し(HSV-1感染5日後に取り出した)、3日間培養し、次にこれらの細胞がHSVペプチドをパルスしたEL4標的細胞を溶解する能力を試験した。溶解のバックグラウンドレベルに対する対照として非免疫マウスを用いたCTLアッセイを行った(51Crの遊離により決定)。高齢マウスは、E:T比10:1および3:1の両方でCTL活性の有意な減少(p≦0.01、**)を示した。これはリンパ節に存在する特異的CTLの百分率の低下を示している。高齢マウスの去勢はCTL応答を若齢成体レベルまで回復した。それは、去勢マウスが若齢(2カ月齢)マウスに匹敵したHSV-1に対する応答を実証したからである。マウス8匹で3回繰り返した平均±1SDとして結果を表す。若齢成マウスに比べて**=p≦0.01、^=高齢対照マウスと有意差あり(E:Tが3:1のときp≦0.05、E:Tが0.3:1のときp≦0.01)。 HSV-1に対する免疫応答におけるVβTCRの発現およびCD4+T細胞の分析を示す図である。HSV-1感染5日後に膝下リンパ節を取り出し、CD25、CD8および特異的TCR Vβマーカー(図17A)ならびにCD4/CD8T細胞(図17B)の発現をex-vivoで分析した。Vβ10またはVβ8.1の一方を発現している活性化(CD25+)CD8+T細胞の百分率を1群あたりマウス8匹についての平均±1SDとして図17Aに示す。齢および去勢後による差を認めなかった。しかし、休止LN細胞集団中のCD4/CD8比の減少が齢に伴ってみられた(図17B)。この減少は去勢後に回復した。1群マウス8匹あたりの平均±1SDとして結果を表す。若齢および去勢後マウスに比べ***=p≦0.001。 去勢がLy5コンジェニックマウスのBM移植(BMT)後の胸腺(図18A)、脾臓(図18B)およびBM(図18D)の再生を増強するが、リンパ節(図18C)の再生は増強しないことを示す図である。3カ月齢の若齢成C57/BL6 Ly5.1+(CD45.1+)マウスに(6.25Gyで)放射線照射し、C57/BL6 Ly5.2+(CD45.2+)成BM細胞(106細胞)を移植する1日前に去勢または疑似去勢を行った。その2および4週間後にマウスを屠殺し)、胸腺(図18A)、脾臓(図18B)、リンパ節(図18C)およびBM(図18D)について免疫の再構成を分析した。ドナー起源の白血球とのみ反応する抗CD45.2(Ly5.2)を用いてドナー/宿主起源を決定した。BMTの2および4週後、疑似去勢マウスに比べ去勢マウスの胸腺に有意に多数のドナー細胞が存在した(図18A)。処置後の全ての時点で非去勢群に比べて去勢動物で胸腺が迅速に増大したことに注意。BMTの2および4週後、疑似去勢マウスに比べ去勢マウスのこれらの脾臓およびBMに有意に多数の細胞が存在した(図18Bおよび18D)。BMTの2、4、および6週後、リンパ節の細胞充実性に有意差は存在しなかった(図18C)。去勢マウスは非去勢動物に比べて有意に増加したコンジェニック(Ly5.2)細胞を有した。1群あたりマウス4〜5匹の平均+1SDとしてデータを表した。*=p≦0.05、**=p≦0.01。 図１８Ａの説明と同じ。 図１８Ａの説明と同じ。 図１８Ａの説明と同じ。 去勢がコンジェニックBMT後のBMおよび胸腺細胞充実性を増加させることを示す図である。図19Aに示すように、BMTの2および4週後、去勢マウスのBMにおいて有意に多数の細胞が存在する。疑似去勢では2週間までにBMの細胞充実性は未処置対照レベル(1.5×107±1.5×106)に達した。去勢マウスではコンジェニックBMTの2および4週間後にBM細胞充実性は対照レベルを上回っている。図19bはBMTの2および4週間後の去勢マウスの胸腺において有意に多数の細胞が存在することを示す。疑似去勢マウスにおける胸腺細胞充実性はコンジェニックBMTの2および4週間後に未処置対照レベル(7.6×107±5.2×106)を下回る。コンジェニックBMTおよび去勢の4週間後に胸腺細胞充実性は増加して対照レベルを上回る。図19Cは、BMTの2および4週間後に脾臓細胞充実性に有意差が存在しないことを示す。疑似去勢および去勢マウスにおいて2週間までに脾臓細胞充実性は対照レベルに達した(8.5×107±1.1×107)。各群は動物4から5匹を含む。白棒線は疑似去勢を、黒棒線は去勢を示す。 去勢がコンジェニックBMT後のHSCの比率を増加させることを示す図である。sca-1(x軸)対c-kit(y軸)の発現を描写する代表的なFACSドットプロット。HSCは、c-kithisca-1hiである。去勢後、BMTの2および4週間後に去勢後のドナー由来HSCの比率に有意な増加が存在する。 去勢がコンジェニックBMT後のHSCの比率および数を増加させることを示す図である。図21Aに示すように、BMTの2および4週間後に去勢後のHSCの比率に有意な増加が存在した,(*p<0.05)。図21BはHSC数が疑似去勢対照に比べて去勢マウスで、BMTの2および4週間後に有意に増加することを示す(*p<0.05、**p<0.01)。各群は動物4から5匹を含む。白棒線は疑似去勢を、黒棒線は去勢を示す。 BMT後の去勢マウスのBM中に有意に多数のドナー由来B細胞前駆細胞およびB細胞が存在することを示す図である。図22Aに示すように疑似去勢対照に比べて去勢マウスで有意に多数のドナー由来CD45.1+B220+IgM-B細胞前駆細胞が存在した(*p<0.05)。図22Bは、疑似去勢対照に比べて去勢マウスのBM中に有意に多数のドナー由来B220+IgM+B細胞が存在したことを示す(*p<0.05)。各群は動物4から5匹を含む。白棒線は疑似去勢を示し、黒棒線は去勢を示す。 去勢はコンジェニックBMT後にドナー由来胸腺細胞の比率に影響しないことを示す図である。疑似去勢および去勢の2週間後に、ドナー由来ダブルネガティブ(CD45.1+CD4-CD8-)初期胸腺細胞の比率に増加が存在する。この初期時点でドナー由来(CD45.1+)CD4およびCD8シングルポジティブ細胞はほとんど存在しない。BMTの4週間後に疑似去勢および去勢マウスのドナー由来胸腺細胞のプロフィールは、未処置対照に類似している。 去勢はコンジェニックBMT後の末梢B細胞の比率を増加させないことを示す図である。コンジェニックBMTの2および4週間後の去勢および疑似去勢マウスに比べて脾臓B220の発現に差はない。 去勢がコンジェニックBMT後の末梢B細胞数を増加させないことを示す図である。BMTの2および4週間後にB細胞数に有意差は存在しない。コンジェニックBMTの2週間後に疑似去勢および去勢マウスの脾臓中のB細胞数は未処置対照レベル(5.0×107±4.5×106)に近づく。各群は動物4から5匹を含む。白棒線は疑似去勢を示し、黒棒線は去勢を示す。 BMT後の去勢マウスにおいてドナー由来トリプルネガティブ、ダブルポジティブならびにCD4およびCD8シングルポジティブ胸腺細胞数が増加していることを示す図である。図26Aは、BMTの2および4週間後の疑似去勢対照に比べ去勢マウスでは有意に多数のドナー由来トリプルネガティブ(CD45.1+CD3-CD4-CD8-)胸腺細胞が存在したことを示す。(*p<0.05**p<0.01)。図26Bは、BMTの2および4週間後の疑似去勢対照に比べ去勢マウスでは有意に多数のダブルポジティブ(CD45.1+CD4+CD8+)胸腺細胞が存在したことを示す(* p<0.05**p<0.01)。図26Cに示すように、BMTの2および4週間後の疑似去勢対照に比べ去勢マウスでは有意に多数のCD4シングルポジティブ(CD45.1+CD3+CD4+CD8-)胸腺細胞が存在した(*p<0.05**p<0.01)。図26Dは、BMTの4週間後の疑似去勢対照に比べ去勢マウスでは有意に多数のCD8シングルポジティブ(CD45.1+CD3+CD4-CD8+)胸腺細胞が存在したことを示す(*p<0.05**p<0.01)。各群は動物4から5匹を含む。白棒線は疑似去勢を示し、黒棒線は去勢を示す。 コンジェニックBMTの2および4週間後にドナー由来末梢T細胞がほとんど存在しないことを示す図である。図27Aに示すように、コンジェニックBMTの2および4週間後に疑似去勢および去勢マウスの脾臓に非常にわずかな比率のドナー由来CD4+およびCD8+T細胞しか存在しなかった。図27Bは、BMTの2および4週間後にドナー由来T細胞数に有意差が存在しなかったことを示す。コンジェニックBMTの4週間後に齢が適合する未処置対照に比べて疑似去勢および去勢マウスの両方で有意に少数のCD4+およびCD8+T細胞が存在する(CD4+-1.1×107±1.4×106、CD8+-6.0×106±1.0×105)。各群は動物4から5匹を含む。白棒線は疑似去勢を示し、黒棒線は去勢を示す。 去勢はコンジェニックBMTの4週間後に胸腺におけるドナー由来DCの数を増加させることを示す図である。図28Aに示すように、ドナー由来DCはCD45.1+CD11c+MHCII+である。図28Bは、コンジェニックBMTの4週間後に去勢マウスに有意に多数のドナー由来胸腺DCが存在したことを示す(*p<0.05)。樹状細胞数はコンジェニックBMTの2週間後で未処置対照レベルである(1.4×105±2.8×104)。コンジェニックBMTの4週間後に去勢マウスにおける樹状細胞数は対照レベルを上回る。各群は動物4から5匹を含む。白棒線は疑似去勢を示し、黒棒線は去勢を示す。 去勢は同種HSCTレシピエントにおける免疫細胞の再構成を増強することを示す図である。致死照射(1300cGy)を行ったCBA/Jレシピエント(3カ月齢)にB10.BR TCD BM(5×106)を移植した。レシピエントに移植の1日前に去勢または疑似去勢の一方を行った。動物を14、28および42日目に人道的に屠殺し、BM(図29A)、胸腺(図29B)、および脾臓(図29C)器官の細胞充実性を評価した。*(p< 0.05)。各群は動物4から5匹を含む。 去勢は同種HSCTレシピエントにおけるドナー由来HSCおよびB細胞を増強することを示す図である。去勢および疑似去勢されたレシピエントに図29に記載するように移植した。図30Aに示すように、疑似去勢および去勢マウスの両方でHSCTの14日後にドナー由来HSC(Ly9.1-Lin-Sca-1+c-kit+)はほとんど存在しなかった。しかし、28日目までにドナーHSC数は去勢群で4倍高くなった。追加的に、図30B〜Cに示すように、去勢マウスのBM(図30B)および脾臓(図30C)では有意に多数のドナー由来B細胞が存在する。BMまたは脾臓の総細胞数およびマルチカラーフローサイトメトリーを使用して中枢および末梢B細胞集団を分析した。CD45R、IgMおよびCD43の発現に基づいてB細胞を発達段階毎に分離した。総B細胞(CD45R+)、プロB細胞(CD43+CD45R+IgM-)、プレB細胞(CD43-CD45R+IgM-)、未熟B細胞(CD43-CD45R+IgM+)である。宿主起源の白血球とのみ反応する抗Ly9. 1でドナー/宿主起源を決定した。各群は動物4から5匹を含む。白棒線は疑似去勢動物を示し、黒棒線は去勢動物を示す。*(p<0.05)は、疑似去勢対照に比べ去勢群で細胞数が有意に増加していることを表す。 去勢は同種HSCTレシピエントにおける胸腺細胞および末梢T細胞の再構成ならびに宿主およびドナー由来DC数を増強することを示す図である。図29に記載するように去勢および疑似去勢レシピエントに移植を行った。動物を14、28および42日目に人道的に屠殺し、胸腺(図31A〜F)または脾臓(図31G)の総細胞数およびマルチカラーフローサイトメトリーを使用して胸腺細胞およびT細胞集団を分析した。 DCはCD11chiIa-khiと定義された。図31Aは、TN(CD3-CD4-CD8-)胸腺細胞数を表す。図31Bは、DP(CD4+CD8+)胸腺細胞数を表す。図31Cは、CD4+SP(CD3+CD4+CD8-)胸腺細胞数を表す。図31Dは、CD8+SP(CD3+CD4-CD8+)胸腺細胞数を表す。図331Eに示すように、疑似去勢対照レシピエントに比べ去勢レシピエントでは同種HSCTの14および28日後の両方で有意に多数の宿主由来DCが存在する。追加的に、図31Fに示すように、疑似去勢対照に比べ去勢レシピエントでは同種HSCTの28日後に有意に多数のドナー由来DCが存在する。図31Gは、抗CD3、抗CD4、および抗CD8を用いて同定した末梢T細胞数を示す。宿主起源の白血球とのみ反応する抗Ly9. 1でドナー/宿主起源を決定した。ドナーCD4T細胞はLy9.1-CD3+CD4+CD8-であり、ドナーCD8T細胞はLy9.1-CD3+CD4-CD8+であった。各群は動物4から5匹を含む。白棒線は疑似去勢動物を、黒棒線は去勢動物を示す。*(p<0.05)および**(p<0.01)は疑似去勢対照に比べ去勢群で細胞数が有意に増加していることを表す。 図３１Ａの説明と同じ。 図３１Ａの説明と同じ。 図３１Ａの説明と同じ。 図３１Ａの説明と同じ。 図３１Ａの説明と同じ。 図３１Ａの説明と同じ。 去勢は同種HSCT後のドナー由来T細胞の機能を変えないことを示す図である。図29に記載するように、去勢および疑似去勢レシピエントに移植を行った。移植の42日後にT細胞の機能性を評価した。図32Aは、同種HSCTの6週間後のドナー由来T細胞(CD3+CD4+およびCD3+CD8+)の数を示す。図32Bは、去勢が同種HSCT後のT細胞の増殖能力に作用を有さないことを示す。図32Cは、MLRにおけるアロ反応性T細胞増殖に差がないことを示す。各群(n=5)からの脾臓T細胞(4×105細胞/穴)を、放射線照射(20Gy)されたBALB/C脾臓スティミュレーター細胞(2×105細胞/穴)と共に96穴平板中で5日間培養し、培養の最終20時間に[3H]-チミジンを添加した。図32Dは、ドナー由来T細胞の細胞溶解活性に差がないことを示す。図32Eは、アロ反応性T細胞の細胞内IFNγ発現を示す。上記のように疑似去勢または去勢レシピエントから42日目に脾臓B6 T細胞を回収し、放射線照射(20Gy)した(BALB/C、第3群)の脾臓スティミュレーター細胞と共に24穴平板に入れて5日間培養した。細胞を回収し、TCD放射線照射(20Gy)した(BALB/CまたはB10.BR生物学的内部対照の)脾臓スティミュレーター細胞で16時間再刺激した。培養1時間が終了した時点でブレフェルジンA(10mg/mL)を添加した。ドナー由来CD3+CD8+細胞における細胞内IFNγの発現をフローサイトメトリー分析で測定した。図32Eに代表的なプロットを示し、図32FにIFN-γを発現するドナー由来CD8+T細胞の百分率としてグラフを表す。図32Gは、同種HSCTの時点でマウスを去勢した場合、T細胞の機能性が攻撃の48時間後に有意に増強したことを示す。疑似去勢および去勢マウスにおいて同種HSCTの6週間後にDTHアッセイを行い、左後足底の腫脹から右足底の腫脹を差し引くことによって浮腫を測定した。白棒線は疑似去勢動物を示し、黒棒線は去勢動物を表す。 図３２Ａの説明と同じ。 図３２Ａの説明と同じ。 図３２Ａの説明と同じ。 図３２Ａの説明と同じ。 図３２Ａの説明と同じ。 図３２Ａの説明と同じ。 去勢は同種HSCTレシピエントにおけるGVHDを悪化させず、GVL活性も減少させないことを示す図である。図33Aに示す実験では、致死照射(1300cGy)された(B6×C3H)F1レシピエント(3カ月齢)にB6 TCD BM細胞(5×106)+脾臓T細胞(0.5×106)を移植した。カプラン‐マイヤー曲線で生存を示す。白丸は、TCD-BMのみ(T細胞なし)の対照群(n=4)を表す。黒丸は疑似去勢レシピエントを表し、白四角は去勢レシピエントを表す。各群は動物8匹を含む。図33Bに示す実験では、致死照射された3カ月齢のB6D2F1/JレシピエントにP815(H-2d)細胞(1×103)、C57/BL6 TCD BM細胞(5×106)およびC57/BL6 T細胞(5×105)を移植した。生存をカプラン‐マイヤー曲線として描写する。白丸はTCD-BMのみ(T細胞なし)の対照群(n=4)を示す。黒丸は疑似去勢レシピエントを表し、白四角は去勢レシピエントを表す。各試験群は動物8〜9匹を含んでいた。 去勢およびIL-7処置が同種HSCT後の胸腺に相加作用を有することを示す図である。図1に説明するように去勢および疑似去勢レシピエントに移植を行った。レシピエントを14日目に屠殺し、さらに0日目から13日目に腹腔内注射によって10g/日のIL-7またはPBS(対照)を投与した(図34A)。レシピエントに21日目から28日目に10g/日のIL-7またはPBS(対照)を投与し、28日目に屠殺した(図34B)。胸腺の細胞充実性を総細胞数から計算した。*(p<0.05)は、疑似去勢対照に比べ去勢群で細胞数が有意に増加していることを表す。対照:疑似去勢されPBSを注射されたレシピエントs、CX:去勢されPBSを注射されたレシピエント、IL-7:疑似去勢されIL-7を注射されたレシピエント、IL-7&CX:去勢されIL-7を注射されたレシピエント。同種HSCTおよび去勢の2週間後にBM全体で半定量RT-PCRを実施した。HPRT平衡後に去勢および疑似去勢マウスから得たのテンプレートについてTGFβ1およびKGFの発現を比較した(図34C)。KGF-/-およびIL7-/-マウスを去勢し、その2週間後に胸腺、BMおよび脾臓の細胞充実性を分析した。図34D〜Fは、 KGF-/-マウスの胸腺(図34D)、BM(図34E)、脾臓(図34F)から得た結果を示す。図34G〜Iは、IL7-/-マウスの胸腺(図34G)、BM(図34H)、および脾臓(図34I)から得た結果を示す。 図３４Ａの説明と同じ。 図３４Ａの説明と同じ。 図３４Ａの説明と同じ。 図３４Ａの説明と同じ。 図３４Ａの説明と同じ。 図３４Ａの説明と同じ。 図３４Ａの説明と同じ。 図３４Ａの説明と同じ。 去勢はHSCT後のBM、胸腺、および脾臓における生着を増強することを示す図である。コンジェニックHSCTの1日前にマウスを去勢した。放射線照射(800rad)したC57/BL6マウスに5×106個のLy5.1+BM細胞を静脈内注射した。移植後の種々の時点(2〜6週間)でBM、脾臓および胸腺をフローサイトメトリーで分析した。図35Bに示すように、去勢およびHSCTの2週間後に疑似去勢対照に比べ去勢マウスでBMに有意に多数の細胞が存在している。同様に、図35Cに示すように、移植の2、4および6週間後に疑似去勢対照に比べ胸腺細胞数の有意な増加が存在する。図35Cに示すように、末梢においても脾臓細胞数は移植の4および6週後に対照よりも去勢レシピエントにおいて有意に高い。灰色の棒線は去勢されたレシピエントを表す。黒色の棒線は疑似去勢された対照を表す。 去勢はコンジェニックHSCT後のBMにおけるHSCの生着を増強することを示す図である。コンジェニックHSCTの1日前にマウスを去勢した。放射線照射(800rad)したC57/BL6マウスに5×106個のLy5.1+BM細胞を静脈内注射した。移植の2週間後にフローサイトメトリーによってBMについてlin-c-kit+sca-1+HSCを分析した(図36A)。BMT移植および去勢の2週間後に疑似去勢対照に比べて去勢マウスのBMに有意に多数のドナー由来HSCが存在する(図36B)。 去勢はコンジェニックHSCT(細胞2.5×106個および5×106個)後のBMにおけるHSCの生着を増強することを示す図である。コンジェニックHSCTの1日前にマウスを去勢した。放射線照射(800rad)したC57/BL6マウスに2.5×106個(図37A〜B)または5×106個(図37C〜D)のLy5.1+BM細胞を静脈内注射した。移植の2週間後にフローサイトメトリーによってBMについてlin-c-kit+sca-1+HSCを分析した。図37A〜DはBMにおける共通リンパ系前駆細胞の百分率を表す。BMT移植および去勢の2週間後に疑似去勢対照に比べて去勢マウスのBMに有意に高い比率のドナー由来HSCが存在する。 去勢はコンジェニックHSCT(細胞2.5×106個および5×106個)後の胸腺におけるドナー由来DCの生着速度を増強することを示す図である。放射線照射(800rad)したC57/BL6マウスに5×106個のLy5.1+BM細胞を静脈内注射した。移植の2週間後にフローサイトメトリーで胸腺細胞を分析した(図38A)。ドナー由来DCは、CD45.1+CD11c+MHCクラスII+CD11b+または-と定義された。ドナー由来CD11b+およびCD11b-DCは、BMTの2週間後に疑似去勢対照に比べて去勢マウスの胸腺で有意に増加している (図38B)。 去勢はコンジェニックHSCT後の脾臓におけるドナー由来B細胞の生着速度を増強することを示す図である。放射線照射(800rad)したC57/BL6マウスに5×106個のLy5.1+BM細胞を静脈内注射した。移植の2週間後にフローサイトメトリーで脾臓細胞を分析した(図39A〜C)。コンジェニックBMTの2週間後に疑似去勢対照に比べて去勢されたマウスの脾臓には有意に多数のB220+B細胞が存在する(図39D)。 図３９Ａの説明と同じ。 図３９Ａの説明と同じ。 図３９Ａの説明と同じ。 前立腺癌に対するLHRH作動薬治療を受けているヒト患者(全て>60歳)において末梢血リンパ球の表現型組成を分析した図である。治療前およびLHRH作動薬治療を開始してから4カ月後の患者の試料を分析した。全ての患者において治療前の血液1mlあたりの総リンパ球細胞数は、対照値の下限であった。治療後に患者9人のうち6人は総リンパ球数に実質的な増加を示した(一部の場合では総細胞数の倍増を認めた)。これと相関しているのは患者9人中6人の総T細胞数の増加であった。CD4+サブセット中でこの増加は、患者9人中8人がCD4T細胞レベルの増加を実証していることで一層さらに顕著であった。CD4+T細胞よりも一般に程度が低いものの、CD8+サブセットで比較的特徴の小さい傾向がみられ、患者9人中4人がレベルの増加を示した。 LHRH作動薬治療前後のヒト患者血液の分析がT細胞、CD4T細胞またはCD8T細胞の全般的な比率における実質的な変化を実証せず、治療後のCD4:CD8比における多様な変化を実証した図である。これは、治療後に全般的なT細胞数が実質的に増加したにもかかわらず治療がT細胞サブセットのホメオスタシスによる維持に最小の作用しか有さないことを示している。全ての値は対照値と比較したものである。 LHRH作動薬治療を受けているヒト患者の末梢血中のB細胞および骨髄細胞(NK、NKTおよびマクロファージ)の比率の分析によって、サブセット内で多様な程度に変化することを実証した図である。治療後にNK、NKTおよびマクロファージの比率は比較的一定のままであるが、患者9人中4人でB細胞の比率は減少した。 治療後のヒト患者の末梢血中のB細胞および骨髄細胞の総細胞数の分析によって、治療後の NK(患者9人中5人)、NKT(患者9人中4人)およびマクロファージ(患者9人中3人)細胞数のレベルが明らかに増加したことを示す図である。B細胞数は独特な傾向を示さず、患者9人中2人はレベルの増加、患者9人中4人は変化なし、かつ患者9人中3人はレベルの減少を示した。 ヒトにおける化学的去勢がナイーブおよび記憶T細胞を増強することを示す図である。図44Aに示すように、LHRH-A治療後にナイーブ(CD62L+CD45RA+CD45RO-)CD4+T細胞の有意な増加を認めた。図44Bに示すように、LHRH作動薬治療後にナイーブおよび記憶(CD62L-CD45RA-CD45RO+)CD8+T細胞数の両方が増強した。各棒線は患者16人の平均±1SDを表す。治療前の値に比べて*=p≦0.05、**=P≦0.01。 ヒトにおける化学的去勢が末梢血リンパ球数を増強することを示す図である。前立腺癌に対する日常的な治療の一部としてLHRH-Aを用いた化学的去勢を受けているヒト患者(全て>60歳)における末梢血の表現型組成を分析した。治療前および治療の4カ月目に患者を分析した。図45Aに示すように、末梢血1μlあたりの総リンパ球数は、LHRH-A治療後に有意に増加していた。これは、総T細胞、CD4+T細胞およびCD8+T細胞における有意な増加を反映していた(図45B)。 LHRH-A治療は血清中テストステロンを効果的に枯渇させ胸腺の機能およびT細胞の運び出しを増加させることを示す図である。図46Aの実験において、前立腺癌患者をLHRH-Aで4カ月間治療した。治療前およびLHRH-A治療の4カ月後の両方で血液をFACSにより分析し、血清をRIAにより分析した。図83Aに示すように、LHRH-A治療後4カ月目の患者の血清からテストステロンは検出されなかった。棒線は分析した患者13人の平均を表す。図46Bの実験において、患者10人のTRECレベルの分析から胸腺機能およびT細胞運び出しが増加している直接の証拠を発見した。CD4+T細胞およびCD8+T細胞集団の両方で患者10人中5人が4カ月のLHRH-A治療による(血液1mlあたりの)TREC絶対レベルの増加を示した(初期提示値よりも>25%)。これは比例した増加も反映していた (細胞1×105個、データは示さず)。これは総TRECレベルに全般的な増加を示した患者10人中6人と相関していた。わずか患者1人が総TRECの減少を示した(約30%の減少)。 ヒトにおける化学的去勢がNK細胞数を増強することを示す図である。LHRH-A治療前および治療の4カ月目に分析を実施した。LHRH-A治療に伴いB細胞ではなくNK細胞の有意な増加を認めた。患者13人の平均±1SDとして結果を提示する。治療前の値に比べて**=p≦0.01。 ヒトにおける化学的去勢がT細胞の増殖を増大させないことを示す図である。図48A〜Bは、Ki-67抗原検出を用いて実施された細胞増殖の分析を示す。全ての患者において、CD4+(図48A)およびCD8+T細胞(図48B)の両方についてナイーブ、活性化および記憶細胞サブセットの増殖レベルは、LHRH-A治療によって変わらなかった。 対照患者およびLHRH-A治療された患者におけるHSCT後の様々な時点(2〜8週間)でのナチュラルキラー(NK)細胞の回復の分析を示す図である。図49A〜Bにそれぞれ示すように、対照同種移植レシピエントおよび自己移植レシピエントの両方で類似した傾向を認めた。対照的に、HSCT前に3週間LHRH-A治療を受けた同種移植患者は移植後D14〜5Mに有意に高い数のNKT細胞を示した(図49C、患者6〜20人の平均±1SEMとしてデータを表す、*=p≦0.05)。 図４９Ａの説明と同じ。 図４９Ａの説明と同じ。 対照患者におけるHSCT後の様々な時点(14、21、28および35日目)でのNKT細胞の再構成のFACS分析を示す図である。同種移植患者における初期の回復を観察した。移植後初期には回復は主にCD8+集団でみられた。これは胸腺外ルートの再生を意味した。また、移植の1カ月後には CD4+NKT細胞が明らかになった。 対照患者におけるHSCT後の様々な時点(2〜12カ月)でのHSCT後のB細胞の再構成を示す図である。図51Bに示すように、B細胞の再生は同種患者に比べ自己移植患者の方が比較的早期に起こる(図51A)。しかし、対照値(網掛け)への回復は両群で移植の少なくとも6カ月後まで明らかでない。 対照患者におけるHSCT後の様々な時点(2〜12カ月)でのHSCT後のCD4+再構成を示す図である。移植後6カ月までにB細胞数は対照値に戻った(図48A〜B参照)が、CD4+T細胞数は、自己(図52B)および同種(図52A)レシピエントの両方において移植の12カ月後でさえも大きく低下していた。 対照患者におけるHSCT後の様々な時点(2〜12カ月)でのHSCT後のCD8+再構成を示す図である。図53A〜Bに示すように、CD8+T細胞数は同種および自己レシピエントの両方においてそれぞれ移植後極めて速やかに再生した。しかし、図53Cに示すように、このCD8+T細胞はTCRγδ+TCD8+T細胞、CD8ααT細胞、およびCD28-CD8+T細胞の増加により示されるように主に胸腺外の起源である。 マーカーKi-67を用いた対照患者におけるHSCT前(図54A)およびHSCTの28日後(図54B)のCD4+T細胞およびCD8+T細胞の多様な細胞集団における増殖のFACS分析を示す図である。マーカーCD45ROおよびCD27を用いてナイーブ、記憶および活性化表現型に基づき細胞を分析した。大多数の増殖はCD8+T細胞サブセットに起こり、このことはこれらの細胞が胸腺外から得られ増殖が専ら末梢T細胞サブセット内で起こったことをさらに示した。 対照患者およびLHRH-A治療された患者におけるHSCT後の様々な時点(2〜12カ月)でのナイーブCD4+T細胞の再生を示す図である。図55Aは、対照(LHRH-A治療なし)患者におけるナイーブCD4+T細胞(CD45RA+CD45RO-CD62L+)のFACS分析を表し、研究全体でこれらの細胞が大きく減損していることを示す。図55B〜Cに示すように、自己移植患者においてHSCTの12カ月後までに対照患者においてナイーブCD4+T細胞は再生し始めた(図55C)が、同種対照患者では対照値よりも依然としてかなり低かった(図55B)。これらの結果は、患者の年齢が原因で移植後の対照患者において胸腺が十分な数のナイーブT細胞を回復できなかったことを示す。対照的に、同種HSCT前にLHRH-Aを3週間与えられた患者は、対照に比べて移植の9および12カ月後に有意に高い数のナイーブCD4+T細胞を示した(図55D)。これは、性ステロイド除去療法で胸腺依存性T細胞経路の再生が増強したことを示す。患者6〜20人の平均±1SEMとしてデータを表す。*=P≦0.05。 対照患者およびLHRH-A治療された患者におけるHSCT後の種々の時点(1〜12カ月)でのTRECレベルを示す図である。新鮮胸腺移出(RTE)でのみみられるTRECレベルの分析は、同種移植(図52A)および自己移植(図52B)患者の両方において移植後に胸腺がレベルを回復出来ないことを強調した。さらに、これは患者の年齢および胸腺萎縮による胸腺機能の欠如が原因であった。このことは、これらの患者の罹患率および死亡率にかなりの意味を有する。対照的に、同種末梢血幹細胞移植を受けている患者は、同種移植前にLHRH-Aで治療された場合、有意に高いCD4+TREC+細胞/ml血液を実証した((LHRH-Aで治療されていない)対照に比べて移植の9カ月後でp≦0.01。LHRH-Aの治療を受けた同種患者は、対照に比べて移植の9カ月後に有意に高い数のCD4+TREC+細胞/ml血液を示した(図56C)。自己移植、LHRH-A治療患者も移植の12カ月後に有意に高いレベルを示した(図56D)。これは性ステロイド除去療法で胸腺の再生が増強したことを示す。患者5〜18人の平均±1SEMとしてデータを表す。*=p≦0.01。 LHRH-Aの投与が同種(図57A〜B)および自己(図57C)HSCT後のTCR特異的刺激に対する応答性を増強することを示す図である。 HSCT前の3週間、患者にLHRH-Aを与えた。作動薬を投与されていない患者を対照患者として使用した。移植後様々な時点(1〜12カ月)で5μgの抗CD3および10μgの抗CD28交差結合抗体を用いてTCR特異的刺激の分析を行った。図57A〜Bに示すように、同種移植、LHRH-A治療患者は、6カ月および9カ月を除く(この時点で分析された患者数が少ないことが原因である)全ての時点で対照患者に比べて(3H-チミジン取込みで評価した)増殖応答の増強を示した。移植後 6および9カ月で対照患者は治療前の値に類似した応答性を有した。しかし、他の全ての時点で、応答性はかなり低かった。対照的に、LHRH-Aで治療された患者は治療前に比べて6カ月以外の全ての時点で等しい応答性を有した。LHRH-Aで治療された患者は、移植の1、3および4カ月後に対照患者に比べて(3H-チミジン取込みで評価した)増殖応答の増強を示した。これは、末梢T細胞の直接作用の寄与を示している。それは新しいCD4+T細胞が少なくとも移植後1〜2カ月までは顕著でないからである(図57B、患者5〜12人の平均±1SEMとしてデータを表す。*=p≦0.05、**=p≦0.01)。図57Cに示すように、自己移植、LHRH-A治療患者は、5カ月以外の全ての時点で対照患者に比べて(3H-チミジン取込みで評価した)増殖応答の増強を示した。治療前の値への回復を、対照およびLHRH-Aで治療された患者の両方で移植の12カ月後までに認めた。 LHRH-Aの投与が同種HSCT後のPWMおよびTTによるマイトジェン刺激に対する応答性を増強することを示す図である。HSCT前の3週間、患者をLHRH-Aで治療した。作動薬を投与されなかった患者を対照患者として使用した。移植後の種々の時点(1〜12カ月)でヤマゴボウマイトジェン(PWM)または破傷風トキソイド(TT)を用いてマイトジェン応答性の分析を行った。HSCT前にLHRH-Aで治療した患者は、検討した全ての時点で対照患者に比べてPWM(図58A)およびTT(図58B)による刺激に対する応答性の増強を示した。 LHRH-Aの投与が自己HSCT後のPWMおよびTTマイトジェンによる刺激に対する応答性を増強することを示す図である。HSCT前の3週間、患者をLHRH-Aで治療した。作動薬を投与されなかった患者を対照患者として使用した。移植後の種々の時点(1〜12カ月)でPWMまたはTTを用いてマイトジェン応答性の分析を行った。HSCT前にLHRH-Aで治療した患者は、検討した大部分の時点で対照患者に比べてPWM(図59A)およびTT(図59B)による刺激に対する応答性の増強を示した(3カ月でp≦0.001)。移植後12カ月前までにLHRH-Aで治療した患者は応答性が回復した。 LHRH-Aによる治療が自己HSCT患者における生着速度を増強することを示す図である。HSCT前の3週間、患者をLHRH-Aで治療した(図60A、CおよびD)。作動薬を投与されなかった患者を対照患者として使用した(図60B)。血液1μlあたりの総白血球(WBC)数および顆粒球(G)数を移植の14、28、および35日後に決定した。図60Aに示すように、 LHRH-A治療を与えられた自己の患者は、移植後D14に対照に比べ有意に高い数のWBCを示し(図60B)(p≦0.05)、この時点で対照が45%であったのに比べ87%が顆粒球の生着(≧500 細胞/μl血液)を有した(p≦0.05)。LHRH-A治療を与えられた自己移植患者は、移植後D10〜12に対照に比べて有意に高い数の好中球も示した(図60C、患者8〜20人の平均±1SEMとしてデータを表す。*=p≦0.05)。さらに有意ではないが、自己移植患者は対照群に比べてLHRH-A治療群で分析された時点にわたり高いリンパ球数を有した(図60D)。 図６０Ａの説明と同じ。 図６０Ａの説明と同じ。 図６０Ａの説明と同じ。 LHRH-A治療が同種HSCT患者における生着速度を増強することを示す図である。。HSCT前の3週間、患者をLHRH-Aで治療した(図61A、CおよびD)。作動薬を投与されなかった患者を対照患者として使用した(図61B)。血液1μlあたりの総白血球(WBC)数および顆粒球(G)数を移植の14、28、および35日後に決定した。図61Aに示すように、LHRH-A治療を与えられた同種移植患者は、移植後D14で対照に比べ有意に高い数のWBCを示し(図61B)(p≦0.05)、この時点で対照が44%であったのに比べ64%が顆粒球の生着(≧500 細胞/μl血液)を有した。さらに、LHRH-A治療を与えられた同種移植患者は、移植後D9、12および19で対照に比べて有意に高い数の好中球を示した(図61C、患者8〜20人の平均±1SEMとしてデータを表す。*=p≦0.05)。さらに、末梢血幹細胞移植を受けている患者の分析により、同種移植前にLHRH-Aで治療された場合にリンパ球数が有意に増加することを実証した(移植の10、12、13および17〜21後でp≦0.05) (図61D)。 図６１Ａの説明と同じ。 図６１Ａの説明と同じ。 図６１Ａの説明と同じ。 TCR特異的末梢T細胞増殖応答が去勢後1週間以内に増強することを示す図である。8週齢のマウスを去勢し、手術の3日後(図62A、C、およびE)および7日後(図62B、D、およびF)に抗CD3/抗CD28で刺激されるT細胞増殖応答を分析した。末梢(子宮頸、腋窩、上腕および鼠径)リンパ節(図62AおよびB)、腸間膜リンパ節(図62CおよびD)、および脾臓細胞(図62EおよびF)を様々な濃度の抗CD3で刺激し、10μg/mlの一定濃度の抗 CD28で48時間同時刺激した。次に、タイトレートしたチミジンで細胞を18時間パルスし、3H-Tの取込みとして増殖を測定した。ひし形は去勢された動物を示す。四角は疑似去勢された対照マウスを示す。n=4、*p≦0.05(対応のないノンパラメトリックなマン-ホイットニーの検定)。 図６２Ａの説明と同じ。 図６２Ａの説明と同じ。 図６２Ａの説明と同じ。 図６２Ａの説明と同じ。 図６２Ａの説明と同じ。 LHRH-Aの投与が慢性の癌罹患者の治療後のTCR特異的刺激に対する応答を増強することを示す図である。慢性悪性疾患を有する患者をLHRH-Aで治療した。LHRH-A投与後の様々な時点(7日目〜12カ月)で抗CD3および抗CD28の交差結合を用いてTCR特異的刺激の分析を行った。LHRH-Aで治療された患者は治療前のレベルに比べ周期的に(3H-チミジンの取込みで評価した)増殖応答の増強を示した。これは、1カ月デポー注射剤で作動薬を投与したことを反映していた。これらの結果は、末梢T細胞が受ける直接の影響を示している。しかし、治療の12カ月後に見られた応答の増強は、同様に胸腺由来T細胞における変化を反映している。それは、作動薬の投与が全ての患者で4カ月目から中断されたからである。 胸腺摘出がBMの共通リンパ系始原細胞(図64A)、BMの総B細胞(図64B)、BMの未熟B細胞(図64C)、脾臓中の総細胞数(図64D)または脾臓の総B細胞(図64E)に対する性ステロイド阻害/BMTの作用に影響しないことを示すグラフである。 図６４Ａの説明と同じ。 図６４Ａの説明と同じ。 図６４Ａの説明と同じ。 図６４Ａの説明と同じ。

Claims (31)

  1. 患者において不適合ドナーからの移植片に対する寛容を誘導するための方法であって、
    前記患者の免疫細胞を枯渇させること、
    前記患者における性ステロイド介在性シグナル伝達を妨害すること、
    前記ドナーからの幹細胞、前駆細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞を前記患者に投与すること、ならびに
    前記ドナーからの細胞または前記ドナーに適合するMHCに対する前記患者のT細胞の反応性を分析することであって、前記T細胞が治療前の前記患者のT細胞の応答性に比べてドナーまたはMHC適合細胞に対して減少した応答性を有することを含み、
    前記患者が未治療の患者に比べて前記ドナー移植片に対して増大した寛容性を有する方法。
  2. 患者において不適合ドナーからの移植片に対する寛容を誘導するための方法であって、
    前記患者の免疫細胞を枯渇させること、
    前記患者における性ステロイド介在性シグナル伝達を妨害することであって、前記患者の骨髄の機能性が前記患者の胸腺の再活性化なしに、再活性化前に、または再活性化と同時に増大する、
    前記ドナーからの幹細胞、前駆細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞を前記患者に投与すること、ならびに
    前記ドナーからの細胞または前記ドナーに適合するMHCに対する前記患者のT細胞の反応性を分析することであって、前記T細胞が治療前の前記患者のT細胞の応答性に比べてドナーまたはMHC適合細胞に対して減少した応答性を有することを含み、
    前記患者が未治療の患者に比べて前記ドナー移植片に対して増大した寛容性を有する方法。
  3. 患者において不適合ドナーからの移植片に対する寛容を誘導するための方法であって、
    前記患者の免疫細胞を枯渇させること、
    前記患者における性ステロイド介在性シグナル伝達を妨害すること、
    前記ドナーからの幹細胞、前駆細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞を前記患者に投与すること、
    前記患者の骨髄にドナーの細胞を生着させることであって、前記ドナー細胞の生着が胸腺の再活性化なしに、再活性化前に、または再活性化と同時に増強されること、ならびに
    前記ドナーからの細胞または前記ドナーに適合するMHCに対する前記患者のT細胞の反応性を分析することであって、前記T細胞が治療前の前記患者のT細胞の応答性に比べてドナーまたはMHC適合細胞に対して減少した応答性を有することを含み、
    前記患者が未治療の患者に比べて前記ドナー移植片に対して増大した寛容性を有する方法。
  4. 前記患者の胸腺が少なくとも部分的に萎縮している、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記患者が前記患者の胸腺を少なくとも部分的に萎縮させた疾患を有する、請求項4に記載の方法。
  6. 前記患者が前記患者の胸腺を少なくとも部分的に萎縮させた疾患に対する治療を受けていた、請求項4に記載の方法。
  7. 前記疾患の前記治療が免疫抑制、化学療法、または放射線治療である、請求項6に記載の方法。
  8. 前記幹細胞が造血幹細胞、上皮幹細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記前駆細胞がリンパ系前駆細胞、骨髄系前駆細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記細胞が造血幹細胞である、請求項8に記載の方法。
  11. 前記造血幹細胞がCD34+である、請求項10に記載の方法。
  12. 前記細胞が、性ステロイド介在性シグナル伝達の妨害が開始された時点で投与される、請求項1または2に記載の方法。
  13. 少なくとも1つのサイトカイン、少なくとも1つのヘマトポエチン、少なくとも1つのリンホカイン、少なくとも1つのインターロイキン、少なくとも1つのCSF、少なくとも1つの増殖因子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される物質を前記患者に投与することをさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記サイトカインがインターロイキン1(IL-1)、インターロイキン2(IL-2)、インターロイキン3(IL-3)、インターロイキン4(IL-4)、インターロイキン5(IL-5)、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン7(IL-7)、インターロイキン8(IL-8)、インターロイキン9(IL-9)、インターロイキン10(IL-10)、インターロイキン11(IL-11)、インターロイキン12(IL-12)、インターロイキン13(IL-13)、インターロイキン15(IL-15)、インターフェロンガンマ(IFN-γ)、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
  15. 前記増殖因子が上皮増殖因子ファミリーのメンバー、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、幹細胞因子、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、ケラチン細胞増殖因子(KGF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インスリン様増殖因子1(IGF-1)、成長ホルモン、甲状腺ホルモン、M-CSF、Meg-CSF、MIF、LIF、TNF、PDGF、ヒト成長ホルモン、B細胞増殖因子、B細胞分化因子、好酸球分化因子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
  16. 前記性ステロイド介在性シグナル伝達が去勢によって妨害される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記性ステロイド介在性シグナル伝達が外科的去勢によって妨害される、請求項16に記載の方法。
  18. 前記性ステロイド介在性シグナル伝達が化学的去勢によって妨害される、請求項16に記載の方法。
  19. 前記性ステロイド介在性シグナル伝達が1つまたは複数の医薬の投与によって妨害される、請求項18に記載の方法。
  20. 前記1つまたは複数の医薬がLHRH作動薬、LHRH拮抗薬、抗LHRHワクチン、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、SERM、SARM、SPRM、ERD、アロマターゼ阻害剤、副腎遮断薬、アルドステロン拮抗薬、抗プロゲステロン、プロゲスチン、抗プロゲスチン、ジオキサラン誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
  21. 前記LHRH作動薬がゴセレリン、ロイプロリド、リュープロン、トリプトレリン、メテレリン、ブセレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ルトレリン、ロイプロレリン、デスロレリン、シストレリン、デカペプチル、ゴナドレリン、ならびにそれらの酢酸塩、クエン酸塩、および他の塩、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
  22. 前記LHRH拮抗薬がアバレリクス、セトロレリクス、それらの酢酸塩、クエン酸塩、および他の塩、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
  23. 前記抗アンドロゲンがコスデックス(登録商標)、ビカルタミド、酢酸シプロテロン、リアロゾール、ケトコナゾール、フルタミド、酢酸メゲストロール、デュタステリド、フィナステリド、ユーレクシン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
  24. 前記抗エストロゲンが、アナストロゾール、フルベストラント、タモキシフェン、クロミフェン、ジエチルスチルベステロール、2リン酸ジエチルスチルベストロール、ダナゾール、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、トレミフェン、ラロキソフェン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
  25. 前記副腎遮断薬がアミノグルテチミド、ホルメスタン、ヴォラゾール、エキセメスタン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
  26. 前記ドナー移植片が前記ドナーの細胞、前記ドナーの組織、前記ドナーの器官、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  27. 胸腺への前記性ステロイド介在性シグナル伝達が性ステロイドホルモンレベルを低下させることによって妨害される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記不適合ドナーからの前記細胞が遺伝子組み換え飾されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記方法の結果としてキメラ胸腺、キメラ造血細胞、キメラリンパ系細胞、キメラT細胞、キメラB細胞、キメラ樹状細胞、キメラリンパ系器官、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるキメラが発生する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記患者への前記不適合ドナーと同じ組織適合性を有する移植片の同種移植をさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記方法が、前記患者に前記ドナーからの細胞を投与した約2日から約21日後に前記患者から血液試料を採取することを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
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