JP2002536453A - 混合主鎖オリゴマー化合物の合成のための化合物、方法及び中間体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 １又はそれを越える前記ホスホロチオエート、ホスホルアミデート及びボラノホスフェートヌクレオシド間連結に加えて、少なくとも１つのホスホジエステルヌクレオシド間連結を有する混合主鎖オリゴマー化合物が調製される。その合成法に有用な新規なＨ−ホスホネート中間体も開示されている。その合成法は、新規な酸化工程を用いて、そのＨ−ホスホネートヌクレオシド間連結を、隣接するホスホロチオエート、ホスホルアミデート及びボラノホスフェートヌクレオシド間連結の劣化なしに、ホスホジエステルヌクレオシド間連結に酸化する。そのような方法に有用な合成中間体も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明は、少なくとも１つの２’−置換基を有する化合物中のＨ−ホスホネー
トヌクレオシド間連結を酸化する方法に向けられている。この発明は、更にホス
ホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート及びボラノホスフェー
トヌクレオシド間連結を包含するヌクレオシド間連結を有する混合主鎖オリゴマ
ー化合物の調製法に関する。本発明は、そのような方法に有用な合成中間体にも
関する。ホスホジエステル及びボラノホスフェートヌクレオシド間連結、又はホ
スホロチオエート及びホスホルアミデートヌクレオシド間連結のような他のヌク
レオシド間連結と組み合わせてホスホジエステル及びボラノホスフェートヌクレ
オシド間連結を有する混合主鎖オリゴマー化合物も含まれる。本発明の方法は、
１又はそれを越えるＨ−ホスホネートヌクレオシド間連結を、隣接するホスホロ
チオエート、ホスホルアミデート及びボラノホスフェートヌクレオシド間連結の
劣化なしに、ホスホジエステルヌクレオシド間連結に酸化することを可能にする
新規な酸化工程を包含する。

【０００２】

【発明の要旨】

本発明は、少なくとも１つの２’−置換基を有する化合物中のＨ−ホスホネー
トヌクレオシド間連結を酸化する方法を提供する。この酸化は、酸化剤、非プロ
トン系溶媒、塩基及び水を含んでなる酸化性溶液によって行われる。

【０００３】 本発明は、式：

【０００４】

【化１０】 （式中、 各々のＺは、独立して、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルア
ミデート又はボラノホスフェートヌクレオシド間連結であり； 各々のＴ₁ 及びＴ₂ は、独立して、ヒドロキシル又は保護されたヒドロキシル
であり； Ｂｘは、複素環塩基部分であり； 各々のＲ₁ は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、２’
−置換基又は保護された２’−置換基であり；そして ｎは、１より大きな整数である。

【０００５】 但し、前記Ｚの少なくとも１つは、ホスホジエステルであり、前記Ｚの少なく
とももう１つは、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート又はボラノホスフェ
ートヌクレオシド間連結である。） の混合主鎖オリゴマー化合物を調製する方法であって： （ａ）式：

【０００６】

【化１１】 （式中、 Ｐｇは、酸不安定性ヒドロキシル保護基であり；そして Ｔ₃ は、塩基不安定性ヒドロキシル保護基又は固体支持体への共有結合である
。） の化合物を提供する工程； （ｂ）前記酸不安定性ヒドロキシル保護基を脱保護して、脱保護されたヒドロ
キシル基を形成させる工程； （ｃ）前記脱保護されたヒドロキシル基を式：

【０００７】

【化１２】 を有する更なる化合物及び縮合剤と、追加されたＨ−ホスホネートヌクレオシド
間連結を有する延長された化合物を形成するのに有効な時間、温度及び圧力の条
件下で処理する工程； （ｄ）場合により、前記延長された化合物をキャッピング剤で処理してキャッ
プされた化合物を形成すること； （ｅ）場合により、前記キャップされた化合物をシリル化剤で処理してシリル
化された化合物を形成すること； （ｆ）場合により、前記延長された化合物、前記キャップされた化合物、又は
前記シリル化された化合物を、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホ
ルアミデート又はボラノホスフェートヌクレオシド間連結に対して不活性な酸化
性溶液で処理すること； （ｇ）場合により、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を繰り返
して保護されたオリゴマー化合物を形成させること； （ｈ）前記保護されたオリゴマー化合物を脱保護溶液で処理して、前記混合主
鎖オリゴマー化合物を形成させること を含んでなる方法を提供する。

【０００８】 好ましい態様においては、この混合主鎖オリゴマー化合物は、ホスホジエステ
ル及びホスホロチオエートヌクレオシド連結の隣接領域を含んでなる。 別の好ましい態様においては、この混合主鎖オリゴマー化合物は、ホスホジエ
ステル及びホスホルアミデートヌクレオシド連結の隣接領域を含んでなる。

【０００９】 更なる好ましい態様においては、酸化性溶液は、酸化剤、非プロトン系有機溶
媒、塩基及び水を含んでなる。 本発明の１つの態様では、酸化性溶液は約１８〜約４５％の酸化剤を含んでな
る。好ましい態様では、酸化性溶液は約２６〜約４０％の酸化剤を含んでなる。
より好ましい態様では、酸化性溶液は約３３％の酸化剤を含んでなる。

【００１０】 本発明は、式：

【００１１】

【化１３】 〔式中、 Ｔ₄ は、ヒドロキシル又は保護されたヒドロキシルであり； Ｂｘは、複素環塩基部分であり；そして Ｒ₂ は、式Ｉ又はII：

【００１２】

【化１４】 （式中、 Ｅは、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、Ｎ（Ｒ₄)（Ｒ₅)又はＮ＝Ｃ（Ｒ₄)（Ｒ₅)であり； Ｒ₃ は、ＯＸ、ＳＸ、又はＮ（Ｘ)₂であり； 各々のＲ₄ 及びＲ₅ は、独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、窒素保護基、又
はＲ₄ 及びＲ₅ が一緒になって窒素保護基であるか、又は、Ｒ₄ 及びＲ₅ は、窒
素又は酸素からなる群から選択される少なくとも１つの追加のヘテロ原子を含む
ことができる環構造に接合しており； 各々のＸは、独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₈ アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₈ ハロアルキル、
Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚ
であり； ＺはＨ又はＣ₁ 〜Ｃ₈ アルキルであり； Ｌ₁ 、Ｌ₂ 及びＬ₃ は、約４〜約７の炭素原子を有するか又は約３〜約６の炭
素原子を有しかつ少なくとも１つのヘテロ原子を有する環系を含んで成り、前記
ヘテロ原子が、酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択され、前記環系が、脂肪
族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和又は不飽和の複素環であり； Ｙは、１〜約１０の炭素原子を有するアルキル又はハロアルキル、２〜約１０
の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０の炭素原子を有するアルキニル、６
〜約１４の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ₄)（Ｒ₅)ＯＲ₄ 、ハロ、ＳＲ₄ 又
はＣＮであり； 各々のｑ₁ は、独立して、２〜１０であり； 各々のｑ₂ は、０又は１であり； ｐは、０〜１０であり；そして ｒは、１〜１０である。

【００１３】 但し、ｐが０であるときｒは１より大きい。） のうちの一方を有する。〕 を有する化合物も提供する。

【００１４】 好ましい態様では、Ｒ₂ は２’−置換基である。別の好ましい態様では、２’
−置換基は、−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ₃ 、−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−Ｎ（
Ｒ₆)（Ｒ₇)、又は−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｎ（Ｒ₆)（Ｒ₇)であ
って、Ｒ₆ 及びＲ₇ の各々が独立してＨ又はＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである。更に好
ましい態様では、各々のＲ₆ 及びＲ₇ が−ＣＨ₃ である。

【００１５】 本発明は、下式を有するキメラオリゴマー化合物：

【００１６】

【化１５】 ５’−Ｎｕ−（Ｌ₄ −Ｎｕ）_Z1−（Ｌ₅ −Ｎｕ）_Z2−（Ｌ₆ −Ｎｕ）_Z3−３’ 〔式中、 各々のＬ₄ 、Ｌ₅ 及びＬ₆ は、独立して、ホスホジエステル、ホスホロチオエ
ート、ホスホルアミデート又はボラノホスフェートから選択されるヌクレオシド
間連結であるが、Ｌ₄ とＬ₆ はＬ₅ と異なり、そしてＬ₄ 、Ｌ₅ 及びＬ₆ のうち
の１つは、ホスホジエステル及びホスホロチオエートより他のものであり； 各々のｚ₁ 、ｚ₂ 及びｚ₃ は、独立して、１より大きな整数であり； 各々のＮｕは、式：

【００１７】

【化１６】 （式中、 Ｂｘは、複素環塩基部分であり； 各々のＲ₁ は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、２’
−置換基又は保護された２’−置換基である。） を有するヌクレオシドであり；そして 前記キメラオリゴマー化合物の前記５’−及び前記３’−末端は、独立して、
ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、固体支持体への連結、活性化されたホ
スフェート基、活性化されたホスファイト基、ヌクレオシド間連結を形成するた
めの反応性基、ヌクレオチド、ヌクレオシド、又はオリゴヌクレオチドである。
〕も提供する。

【００１８】 １つの態様では、各々のＬ₄ 及びＬ₆ は、ホスホルアミデートヌクレオシド間
連結であり、そして各々のＬ₅ が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結であ
る。

【００１９】 別の態様では、各々のＬ₄ 及びＬ₆ は、ホスホルアミデートヌクレオシド間連
結であり、そして各々のＬ₅ が、ホスホジエステルヌクレオシド間連結である。 なお別の態様では、各々のＬ₄ 及びＬ₆ は、ボラノホスフェートヌクレオシド
間連結であり、そして各々のＬ₅ が、ホスホジエステルヌクレオシド間連結であ
る。

【００２０】 更なる態様では、各々のＬ₄ 、Ｌ₅ 及びＬ₆ は、ホスホルアミデート、ホスホ
ロチオエート、又はホスホジエステルヌクレオシド間連結である。 各々のＲ₁ が、独立して、−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ₃ 、−Ｏ−ＣＨ₂ Ｃ
Ｈ₂ −Ｏ−Ｎ（Ｒ₆)（Ｒ₇)、又は−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｎ（
Ｒ₆)（Ｒ₇)であるのが好ましい。Ｒ₆ 及びＲ₇ の各々が独立してＨ又はＣ₁ 〜Ｃ ₁₀ アルキルであるのも好ましい。

【００２１】 各々のＲ₆ 及びＲ₇ が−ＣＨ₃ であるのが更に好ましい。

【００２２】

【好ましい態様の詳細な説明】

本発明は、ホスホロチオエート及び／又はホスホルアミデートヌクレオシド間
連結に加えて、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を有する混合主鎖オリゴマ
ー又はキメラ化合物の調製のための化合物及び方法を提供する。この方法は、ボ
ラノホスフェートヌクレオシド間連結を本発明のオリゴマー化合物の中に取り入
れることも包含する。この方法は、一緒にカップリングして１又はそえを越える
Ｈ−ホスホネートヌクレオシド間連結の隣接領域を形成するＨ−ホスホネート中
間体を利用する。各々の隣接領域は、続いて、更なる延長の前にホスホジエステ
ル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、又はボラノホスフェートヌクレ
オシド間連結に酸化される。混合主鎖オリゴマー化合物は、このようにして、隣
接領域を異なる試薬で酸化することにより調製される。本発明のオリゴマー化合
物は、１又はそれを越えるＨ−ホスホネートヌクレオシド間連結の領域を、先に
酸化された存在する連結を劣化させることなく酸化する新規な酸化工程を用いて
調製される。

【００２３】 オリゴマー合成のこのＨ−ホスホネート法は、種々のヌクレオシド間連結を有
するオリゴヌクレオチド及びそれらの類似体の調製に使用されてきた。これらヌ
クレオシド間連結には、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホス
フェート、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、Ｓ−アリールホスホロ
チオエート、アシルホスホネート、ホスホロフルオリデート、ホスホロジチオエ
ート、セレノホスフェート、（ヒドロキシメチル）ホスホネート、及びボラノホ
スフェートが含まれる。

【００２４】 本明細書で使用される“キメラオリゴマー化合物”又は“混合主鎖オリゴマー
化合物”という用語は、ヌクレオシドサブユニットを含んで成り、少なくとも２
つの異なるヌクレオシド間連結を含有するオリゴマー化合物のことを言う。本発
明の混合主鎖オリゴマー化合物は、１を越えるタイプのヌクレオシド間連結によ
って一緒に結合している複数のヌクレオシドモノマーサブユニットを含有するこ
とができる。少なくとも１つのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結で
あり、少なくとも１つの他の連結は、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート
又はボラノホスフェートヌクレオシド間連結である。かくして“オリゴマー化合
物”という用語には、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、それらの類似
体、及び合成オリゴヌクレオチドが含まれる。

【００２５】 好ましい態様では、固体支持体に結合した第１モノマーが、Ｈ−ホスホネート
モノマーを用いて延長される。本発明の方法は、所望の長さと配列の混合主鎖オ
リゴマー化合物を合成するのに、自動ＤＮＡ合成装置で使用されてきた。ホスホ
ジエステル及びホスホロチオエートヌクレオシド間連結だけを有する幾つかのオ
リゴマー化合物は、合成されている。ホスホジエステル、ホスホロチオエート、
及びホスホルアミデートヌクレオシド間連結を有する他のオリゴマー化合物は、
合成されている。実施例１４は、ボラノホスフェート混合主鎖オリゴマー化合物
の合成を例示している。表Ｉは、本発明の方法及び中間体を用いて合成された選
択されたオリゴマー化合物を例示している。

【００２６】 好ましい態様では、本発明の方法は、反復固相オリゴヌクレオチド合成法に使
用するのに用いられる。代表的固相技術は、標準的なＨ−ホスホネート化学を用
いるＤＮＡ及びＲＮＡ合成に典型的に用いられるものである。オリゴヌクレオチ
ド合成のＨ−ホスホネート法は、１９９２年９月２２日に発行された米国特許第
５，１４９，７９８号及び。１９９６年８月２０日に発行された米国特許第５，
５４８，０７６号に開示されている。各々の全体の開示内容は、参照により本明
細書中に組み入れられる。好ましい合成固相合成は、活性ホスフェート化合物と
してＨ−ホスホネートを用いる。この技術では、Ｈ−ホスホネートモノマーは、
成長オリゴマー鎖上のフリーのヒドロキシルと反応して、中間体ホスファイト化
合物をもたらし、それはＰ^V 状態に参加される。この技術は、ホスホジエステル
、ホスホロチオエート、及びホスホルアミデート連結を包含する幾つかのタイプ
の合成に広く使用される。標準的なＨ−ホスホネート化学を用いるＨ−ホスホネ
ート連結のホスホジエステルへの酸化は、成長オリゴマー化合物が存在している
ときは、ホスホロチオエート及びホスホルアミデート連結の劣化をもたらす。オ
リゴマー化合物中の隣接する連結のこの劣化は、標準的Ｈ−ホスホネート化学を
混合主鎖合成で使用するのに限界となってきた。

【００２７】 典型的には、そのような方法の第１工程は、保護された５’−ヒドロキシルを
含有するモノマー又はより高いオーダーのサブユニットの固体支持体への結合で
ある。支持体結合モノマー又は高いオーダーの第１シントンは、次いで、５’−
保護基を除くために処理される。典型的には、これは、酸での処理で達成される
。固体支持体に結合したモノマーは、次いで、ヌクレオシド間連結を形成するた
めの反応性基を有する第２モノマー又は高オーダーシントンと反応される。好ま
しい態様では、このカップリング反応は、縮合剤の存在下で無水条件下で行われ
る。

【００２８】 各々のモノマー又は高オーダーシントンを添加した後、未反応ヒドロキシル基
をキャップするためにキャッピング工程が行われる。ヌクレオシド間連結の酸化
又は硫化の前又は後にキャッピング工程を行うのが好ましい。そのようなキャッ
ピング工程は、カップリングサイクルで反応しなかった鎖をブロックするぉとに
より短くなったオリゴマー鎖を阻止することにより恩恵があることが知られてい
る。キャッピングに使用される代表的試薬は、無水酢酸である。他のキャッピン
グ試薬及び方法論は、米国特許第４、８１６、５７１に記載されている。

【００２９】 “酸化性溶液”という用語は、Ｈ−ホスホネートヌクレオシド間連結又はその
シリル化誘導体をホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート
又はボラノホスフェートヌクレオシド間連結に酸化するのに有効な試薬の混合物
を含む。そのような酸化は、オリゴマーの領域上で、同じオリゴマー化合物の他
の先に酸化された部分の劣化を起こさずに行われることができる。各々のタイプ
のヌクレオシド間連結の酸化は以下の実施例で例示する。ヌクレオシド間連結の
酸化は、各々のカップリング工程後に反復して行っても、所望の数又は配列のモ
ノマーをカップリングした後に行ってもよい。これは、１つのタイプの連結の１
又はそれを越える領域を他のタイプの連結の１又はそれを越える他の領域と共に
有するギャップマータイプのオリゴマー化合物の調製を可能にする。ギャップマ
ーの代表例は、３’及び５’末端にホスホロチオエート領域を、内部に位置する
ホスホジエステル領域と共に有するオリゴマー化合物である。

【００３０】 成長オリゴマー化合物の酸での処理は、５’−ヒドロキシル保護基を除いて他
の合成反復を可能にする。成長オリゴマー化合物は、所望の長さのオリゴマー化
合物が生成するまで、選択された段階での選択された酸化剤での続く酸化で延長
される。

【００３１】 次いで、完成したオリゴマーを固体支持体から切り離す。この切り離し工程は
保護された官能基の脱保護に先行しても後になってもよい。本明細書で使用され
る“脱ブロック溶液”という用語は、液相又は固相技術により調製されたオリゴ
マー化合物の脱ブロックに日常的に使用される溶液を包含する。固体支持体上で
合成されたオリゴマーの脱ブロックに使用される普通の溶液はアンモニア水であ
る。

【００３２】 本明細で使用される“複素環塩基部分”という用語は、核酸塩基を包含するこ
とが意図されている。本明細書に記載された化合物及び方法に有用な核酸塩基に
は、アデニン、シトシン、ウリジン、及びチミン、並びにキサンチン、ヒポキサ
ンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアル
キル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、５
−ハロウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウ
ラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、オキサ、アミノ、
チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、及び他の８−置換アデニン及びグアニ
ン、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチ
ルグアニンのような他の天然に存在しない核酸塩基及び天然に存在する核酸塩基
が含まれるが、これらに限定されない。更なる天然に存在する核酸塩基及び天然
に存在しない核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号；Sanghvi 、Anti
sense Research and Application, Chapter 15, S.T.Crooke and B.Lebleu 編,
CRC Press, 1993；English ら, Angewandte Chemie, International Edition,
1991, 30, 613-722（特に622-623 頁) ；the Concise Encyclopedia of Polyme
r Science and Engineers, J.I. Kroschwitz, Ed., John Willy & Sons, 1990,
pp.858-859；及び Cook, Anti-Cancer Drug Design, 1991, 6, 585-607に開示さ
れたものが含まれる。これらは全て、参照によりその全内容が本明細書に組み入
れられたものとする。“ヌクレオシド塩基部分”という用語は、最も古典的な意
味ではヌクレオシド塩基ではないがヌクレオシド塩基として役立つ一定の“ユニ
バーサル塩基”を含む、ヌクレオシド塩基として役立つことができる複素環化合
物を含めるよう意図されている。ユニバーサル塩基として特に言及されるのは３
−ニトロピロールである。

【００３３】 本明細書で使用される“２−置換基”という用語は、２’−糖修飾を包含する
。本発明の２’−糖修飾には、フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、
Ｏ−アルキルアルコキシ、保護されたＯ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアミノ
アルキル、Ｏ−アルキルイミダゾール、及び式（Ｏ−アルキル）_m （式中、ｍは
１〜約１０である）のポリエーテルが含まれる。これらの中で好ましいポリエー
テルは、クラウンエーテル及び Ouchiら, Drug Desigh and Dictionary 1992, 9
, 93；Ravasio ら, J. Org. Chem., 1991, 56, 4329 ；及び Delgardo ら, Crit
ical Reviews in Therpeutic Drug Carrier Systems 1992, 9, 249 により開示
されたもののような線状又は環状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＥＧ
含有基である。なお、これらは各々参照により本明細書中に組み入れられるもの
とする。更なる糖修飾は、Cook, Anti-Cancer Drug Design, 1991, 6, 585-607
に開示されている。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキ
ルイミダゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキル、及びアルキルアミノ置換基が米
国特許出願第０８／３９８，９０１号に記載されている。これは参照により本明
細書に組み入れられる。

【００３４】 本発明で使用される追加の２’−糖修飾には、２’−ＳＲ及び２’−ＮＲ₂ 基
が含まれ、各々のＲは、独立して、水素、保護基又は置換又は未置換のアルキル
、アルケニル、又はアルキニルである。２’−ＳＲヌクレオシドは、米国特許第
５，６７０，６３３号に記載されている。これは、参照により本明細書中に組み
入れられる。２’−ＮＲ₂ モノマーシントンの組み込みは、Hammら,, J. Org. C
hem.,1997, 62, 3415-3420に開示されている。２’−ＮＲ₂ ヌクレオシドは、Go
ettingen, J. Org. Chem., 1996, 61, 6273-6281及び Polushin ら, Tetrahedro
n Lett., 1996, 37, 3227-3230に開示されている。本発明に使用できる代表的な
２’−糖修飾には、式Ｉ又はII：

【００３５】

【化１７】 （式中、 Ｅは、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、Ｎ（Ｒ₄)（Ｒ₅)又はＮ＝Ｃ（Ｒ₄)（Ｒ₅)であり； 各々のＲ₄ 及びＲ₅ は、独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、窒素保護基、又
はＲ₄ 及びＲ₅ が一緒になって窒素保護基であるか、又は、Ｒ₄ 及びＲ₅ は、窒
素又は酸素からなる群から選択される少なくとも１つの追加のヘテロ原子を含む
ことができる環構造に接合しており； Ｒ₃ は、ＯＸ、ＳＸ、又はＮ（Ｘ)₂であり； 各々のＸは、独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₈ アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₈ ハロアルキル、
Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚ
であり； ＺはＨ又はＣ₁ 〜Ｃ₈ アルキルであり； Ｌ₁ 、Ｌ₂ 及びＬ₃ は、約４〜約７の炭素原子を有するか又は約３〜約６の炭
素原子を有しかつ少なくとも１つのヘテロ原子を有する環系を含んで成り、前記
ヘテロ原子が、酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択され、前記環系が、脂肪
族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和又は不飽和の複素環であり； Ｙは、１〜約１０の炭素原子を有するアルキル又はハロアルキル、２〜約１０
の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０の炭素原子を有するアルキニル、６
〜約１４の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ₄)（Ｒ₅)ＯＲ₄ 、ハロ、ＳＲ₄ 又
はＣＮであり； 各々のｑ₁ は、独立して、２〜１０であり； 各々のｑ₂ は、０又は１であり； ｐは、０〜１０であり；そして ｒは、１〜１０である。

【００３６】 但し、ｐが０であるときｒは１より大きい。） のうちの一方を有するものが含まれる。 式Ｉの代表的な２’−糖置換基は、米国特許出願第０９／１３０，９７３号に
開示されており、参照により本明細書中に組み入れられる。

【００３７】 式IIの代表的な２’−糖置換基は、米国特許出願第０９／１２３，１０８号に
開示されており、参照により本明細書中に組み入れられる。 環酸素原子が他の原子により置換されている糖も、本発明に従う。環酸素につ
いての代表的な置換基には、S、CH₂、CHF、およびCF₂が含まれる（例えば、本明
細書中でその全体を参考文献として援用する、Secrist et al., Abstract 21, P
rogram & Abstracts, Tenth International Roundtable, Nucleosides, Nucleot
ides and their Biological Applications, Park City, Utah, Sept. 16-20, 19
92を参照）。

【００３８】 本明細書中で使用されるように、“アルキル"という用語には、直鎖、分岐鎖
、および脂環式の炭化水素基が含まれるが、これらには限定されない。本発明の
アルキル基は、置換されていてもよい。代表的なアルキル置換基は、本明細書中
でその全体を参考文献として援用する、米国特許第5,212,295号のカラム12、41
〜50行に開示されている。本明細書中で使用されるように、“低級アルキル"と
いう用語は、6以下の炭素数を有するアルキルを意味することを企図している。 本明細書中で使用するように、“アラルキル"という用語は、例えばベンジル
基などのアリール基を有するアルキル基を意味する。“アルカリール"という用
語は、アルキル基、例えばメチルフェニル基、を有するアリール基を意味する。
本明細書中で使用されるように、“アリール"という用語は、フェニル、ナフチ
ル、アントラシル、フェナントリル、およびピラニルを含む、芳香族環基を意味
するが、これらには限定されない。

【００３９】 本明細書中で使用するように、“アルカノイル"という用語は、式-C(=O)アル
キルの基として示されるものの慣用的な意味を有する。好ましいアルカノイル基
は、アセチル基である。

【００４０】 一般的に、“ヘテロ"という用語は、炭素以外の原子を意味し、好ましくは、
窒素、酸素または硫黄をいうが、これらには限定されない。したがって、“ヘテ
ロシクロアルキル"という用語は、1以上のヘテロ原子、すなわち、非炭素原子を
有するアルキル環系を意味する。好ましいヘテロシクロアルキル基には、例えば
モルホリノ基が含まれる。本明細書中で使用されるように、“ヘテロシクロアル
ケニル"という用語は、1以上の二重結合および1以上のヘテロ原子を有する環系
を意味する。好ましいヘテロシクロアルケニルには、例えばピロリドン基が含ま
れる。

【００４１】 本発明の好ましい一態様において、オリゴマー合成は、固相支持体を使用する
自動化合成機において行われる。固相支持体は、例えば、米国特許第4,415,732
号；第4,458,066号；第4,500,707号；第4,668,777号；第4,973,679号；第5,132,
418号；第4,725,677号；第Re. 34,069号に記載されているものなどの、固相合成
法において固相として機能することができる基剤である。リンカーは、固相合成
技術において、最初のシントン分子の官能基、例えば、ヒドロキシル基、に対し
て固相支持体を結合するために供される短分子として、当該技術分野において既
知である。適したリンカーは、例えば、Oligonucleotides And Analogues A Pra
ctical Approach（Ecstein F., Ed., IRL Press, N.Y., 199 1, Chapter 1, pag
es 1-23）中に開示されている。

【００４２】 本発明の固相支持体には、固相法において使用するために適している、一般的
に当該技術分野において既知のものが含まれ、例えば、調節化孔ガラス（CPG）
、オキサリル-調節化孔ガラス（例えば、本明細書中でその全体を参考文献とし
て援用される、Alul et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527を参照）
、TentaGel支持体；アミノポリエチレングリコール誘導化支持体（例えば、本明
細書中でその全体を参考文献として援用する、Wright et al., Tetrahedron Let
ters 1993, 34, 3373を参照）およびPoros；ポリスチレン／ジビニルベンゼンの
コポリマーが含まれる。

【００４３】 本発明のいくつかの態様において、T₁およびT₂のぞれぞれは、独立して保護化
ヒドロキシル基であり、そしてT₃はヒドロキシル保護基である。幅広く様々なヒ
ドロキシル保護基を本発明の方法において使用することができる。好ましくは、
保護基は、酸性条件および塩基性条件のいずれにおいても安定である。これによ
り、酸性条件下で塩基-安定性保護基を除去することができ、そして塩基性条件
下で酸-安定性保護基を除去することができる。一般的には、保護基は、化学官
能基を特異的な反応条件に対して不活性な状態にし、そして分子の残りの部分に
実質的なダメージを与えることなく、分子中のそのような官能基に付加すること
ができあるいは除去することができる。代表的なヒドロキシル保護基は、Beauca
geら（Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311）により開示され、そしてGreeneおよ
びWuts（Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2d ed, John W
iley & Sons, New York, 1991）にも開示されるものがあり、これらの文献は本
発明中にその全体を参考文献として援用する。好ましい保護基には、ジメトキシ
トリチル（DMT）、モノメトキシトリチル（MMT）、9-フェニルキサンテン-9-イ
ル（Pixyl）および9（p-メトキシフェニル）キサンテン-9-イル（Mox）が含まれ
る。

【００４４】 本発明のいくつかの好ましい態様において、アミノ基にアルキル基あるいは例
えば2'-アルコキシ基などのその他の基を付加する。このようなアミノ基も、天
然に存在するヌクレオ塩基および天然に存在しないヌクレオ塩基に一般的に存在
する。これらのアミノ基は、本発明のオリゴマー化合物の合成の間、保護化型で
存在することが一般的に好ましい。これらの目的に適した代表的なアミノ保護基
は、GreeneおよびWuts（Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 7,
2d ed, John Wiley & Sons, New York, 1991）中で検討されている。一般的に
、本明細書中で使用されているように、“保護化された"という用語は、“ヌク
レオ塩基"などの分子部分とともに使用される場合には、その分子部分が保護基
により保護化された1以上の官能基を含有することを意味する。

【００４５】 現在、オリゴヌクレオチド合成のH-ホスホネート法に従う、当該技術分野にお
いて既知の多くの有用な濃縮試薬が存在する（Wada et al., J Am. Chem. Soc.,
1997, 119, 12710-12721）。有用な濃縮試薬には、酸クロリド、クロロホスフ
ェート、カーボネート、カルボニウム型化合物、およびホスホニウム型化合物が
含まれるが、これらには限定されない。好ましい一態様において、濃縮試薬は、
ピヴァリル（pivaloyl）クロリド；アダマンチルクロリド、2,4,6-トリイソプロ
ピル-ベンゼンスルホニルクロリド、2-クロロ-5,5-ジメチル-2-オキソ-1,3,2-ジ
オキサホスフィナン、ジフェニルホスホロクロリデート（phosphorochloridate
）、ビス（2-オキソ-3-オキサゾリジニル）ホスフィンクロリド、ビス（ペンタ
フルオロフェニル）カーボネート、2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3
,3-テトラメチルウロニウム（uronium）ヘキサフルオロホスフェート、O-（アザ
ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ
フォスフェート、6-（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ
-tris-ピロリジノホスホニウム（pyrrolidinophosphonium）ヘキサフルオロホス
フェート、ブロモ-tris-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェー
ト、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-tris-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサ
フルオロホスフェートおよび2-（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）-1,3-ジメ
チル-2-ピロリジン-1-イル-1,3,2-ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホス
フェートからなる群から選択される。

【００４６】 ホスホロチオエート結合およびホスホロジチオエート結合を形成するための酸
化の間に使用された硫黄化試薬には、それらのみがただ存在する場合には、Beau
cage試薬（Iyer et.al., J. Chem. Soc., 1990, 112, 1253-1254；およびIyer e
t.aL, J Org. Chem., 1990, 55, 4693-4699）；テトラエチルチウラムジスルフ
ィド（Vu and Hirschbein, Tetrahedron Lett., 1991, 32, 3005-3008）；ジベ
ンゾイルテトラスルフィド（Rao, et.aL, Tetrahedron Lett., 1992, 33, 4839-
4842）；ジ（フェニルアセチル）ジスルフィド（Kamer, Tetrahedron Lett., 19
89, 30, 6757-6760）；ビス（O,O-ジイソプロポキシホスフィノチオイル）ジス
ルフィド（Stec et al., Tetrahedron Lett., 1993, 34, 5317-5320）；3-エト
キシ-1,2,4-ジチアゾリン-5-オン（Nucleic Acids Research, 1996 24, 1602160
7；およびNucleic Acids Research, 1996 24, 3643-3644）；ビス（p-クロロベ
ンゼンスルホニル）ジスルフィド（Nucleic Acids Research, 1995 23, 4029-40
33）；硫黄、およびトリアリール、トリアルキル、トリアラルキル、あるいはト
リアルカリールホスフィンなどのリガンドと組み合わせた硫黄；が含まれる。上
述した参考文献のそれぞれは、本明細書中にその全体を参考文献として援用する
。

【００４７】 ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を形成するために使用される
有用な酸化剤には、それらの結合が唯一存在する結合である場合は、ヨウ素／テ
トラヒドロフラン／水／ピリジン、過酸化水素／水、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロ過
酸化物、またはｍ−クロロパー安息香酸のようないずれかの過酸が含まれる。酸
化の場合は、反応は水を含む条件下で行われうるが、硫黄種を使用する酸化の場
合には、反応は空気、特に酸素を排除した無水条件下で行われる。

【００４８】 Ｈ−ホスホネートヌクレオシド間結合の酸化は、同時にすでに存在する酸化さ
れた結合の分解を生じることなしに、新たな酸化溶液を用いて行われる。酸化溶
液は、Ｈ−ホスホネート結合から調製される酸化結合に依存して、特定の化合物
／試薬を含む。 一般的には、酸化溶液は、酸化剤、非プロトン性溶媒および塩基を含む。

【００４９】 塩基は、酸化剤溶液中に酸化プロセスを助長するために存在させる。選択され
た塩基は、約９から約１２の範囲のpkaを有し、それはオリゴマー化合物の主鎖
の開列を生じずに、Ｈ−ホスホンネートまたは水を脱プロトン化するのに至適な
範囲であると考えられる。理論に拘束されるわけではないが、本pkaの範囲内塩
基、および約０．０１から約０．８Ｍの濃度で酸化溶液中に存在することが、同
時にすでに存在する酸化結合の分解を伴うことなしにＨ−ホスホネート結合の酸
化にとって必要であると考えられる。塩基の更に好ましい濃度範囲は、酸化溶液
中約０．０５から約０．２Ｍの範囲である。本発明において有用な代表的な塩基
には、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）、トリエチルアミン（ＴＥ
Ａ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）が含まれる。

【００５０】 当業者に知られている多くの非プロトン性溶媒は、本発明に使用しうる。幾つ
かの代表的な非プロトン性溶媒には、ピリジン、アセトニトリルおよびジメチル
ホルムアミドが含まれる。

【００５１】 酸化剤の選択は、特定のヌクレオシド間の結合に依存して行われ、酸化される
べきＨ−ホスホネートヌクレオシド間結合の領域にとって望ましいものが選択さ
れる。ホスホジエステルヌクレオシド間結合の調製に有用な代表的な酸化剤には
、四塩化炭素、四臭化炭素、Ｎ−クロロスクシンイミドおよびＮ−ブロモスクシ
ンイミドが含まれる。酸化剤に加えて、ホスホジエステル結合調製のためには、
水が酸化溶液中の必要な成分である。

【００５２】 ホスホロチオエート・インターヌクレオシド・リンケージは、酸素でなく硫黄
の添加によってリンを酸化する酸化剤の使用により調製される。エレメンタル硫
黄を用いてＨ−ホスホネートを硫黄化して、ホスホロチオエート・インターヌク
レオシド・リンケージを、下記実施例に記載するごとく形成する。酸化溶液中で
、エレメンタル硫黄を用いると、所望のホスホロチオエート・インターヌクレオ
シド・リンケージを生じるが、同じオリゴマー化合物中に予め存在する酸化され
たリンケージに影響をあたえない。

【００５３】 混合基本骨格オリゴマー化合物中の、Ｈ−ホスホネート・インターヌクレオシ
ド・リンケージの、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデー
ト、およびボラノホスフェート・インターヌクレオシド・リンケージへの選択的
酸化は、酸化溶液に依存する。酸化溶液は酸化を受けている最中のオリゴマー化
合物中の、予め存在するリンケージに影響してはならない。酸化溶液は酸化剤、
中性溶媒および塩基の混合物である。ホスホジエステル・リンケージのためには
、水もまた酸化溶液の成分である。所定の酸化のために、酸化溶液中での試薬の
濃度は変化してよい。試薬の最適濃度は、過度の実験を要することなく、当業者
に明らかである。

【００５４】 混合基本骨格オリゴマー化合物中の、Ｈ−ホスホネート・リンケージの酸化に
使用する酸化溶液中の試薬の組成および濃度は、目的の酸化されるリンケージが
、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホルアミデートであるかに
依存して変化する。ボラノホスフェート・インターヌクレオシド・リンケージの
場合には、シリル化工程も含まれる。二つの主な成分は、塩基および酸化剤であ
る。ホスホジエステルおよびホスホロチオエート・インターヌクレオシド・リン
ケージの場合には、中性有機溶媒もまた使用される。ホスホジエステル・リンケ
ージを形成するためには、水もまた酸化溶液中に用いられる。

【００５５】 本発明の混合基本骨格オリゴマー化合物中のホスホジエステル・インターヌク
レオシド・リンケージの調製に使用する酸化溶液は、一般に、中性有機溶媒中に
溶解して、約１８％〜約４５％の酸化剤、約２％〜約１５％の水、約４０％〜約
８０％の中性有機溶媒、および約０．０１Ｍ〜約０．８Ｍの塩基を含んでいる。
より好ましい濃度範囲は、中性有機溶媒中に溶解した、約２６％〜約４０％の酸
化剤、約４％〜約１０％の水、約５０％〜約７０％の中性有機溶媒、および約０
．０４Ｍ〜約０．４Ｍの塩基である。更により好ましくは、中性有機溶媒中に溶
解した、約３３％の酸化剤、約７％の水、約６０％の中性有機溶媒、および約０
．０５Ｍ〜約０．２Ｍの塩基である。

【００５６】 本発明の混合基本骨格オリゴマー化合物中のホスホロチオエート・インターヌ
クレオシド・リンケージの調製に使用する酸化溶液は、一般に、中性有機溶媒中
に溶解して、約１％〜約１５％の酸化剤、酸化剤を溶解する約４０％〜約６０％
の溶媒、約４０％〜約６０％の中性有機溶媒、および約０．０１Ｍ〜約０．８Ｍ
の塩基を含んでいる。より好ましい濃度範囲は、中性有機溶媒中に溶解した、約
１％〜約１０％の酸化剤、酸化剤を溶解する約４０％〜約６０％の溶媒、約４０
％〜約６０％の中性有機溶媒、および約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍの塩基である。
更により好ましくは、中性有機溶媒中に溶解した、約３％〜約８％の酸化剤、酸
化剤を溶解する約４０％〜約６０％の溶媒、約４０％〜約６０％の中性有機溶媒
、および約０．０４Ｍ〜約０．１Ｍの塩基である。

【００５７】 本発明の混合基本骨格オリゴマー化合物中のホスホルアミデート・インターヌ
クレオシド・リンケージの調製に使用する酸化溶液は、酸化剤との組み合わせで
、第一または第二アミンを含んでいる。第一または第二アミンの溶媒として作用
する酸化剤が好ましい。好ましい酸化剤は四塩化炭素である。酸化溶液は、約１
％〜約１５％の第一または第二アミン、および約８５％〜約９９％の酸化剤を含
む。好ましい濃度は、約１％〜約１０％の第一または第二アミン、および約９０
％〜約９９％の酸化剤である。第一または第二アミンのより好ましい濃度は、酸
化溶液中で容量で約２％〜約５％である。

【００５８】 Ｈ−ホスホネート・インターヌクレオシド・リンケージの、ボラノホスフェー
ト（Ｏ＝Ｐ−ＢＨ５３）・インターヌクレオシド・リンケージへの変換は、酸化
工程の前に付加的シリル化工程を必要とする。Sergueev et al., J. Am. Chem.
Soc., 1998,120, 9417-9427。多くのシリル化剤がシリル化工程に有効であるこ
とが示されており、それらには、クロロトリメチルシラン、Ｎ，Ｏ−ビス−（ト
リメチルシリル）アセタミド 、ヘプタメチルジシラザンおよびＮ，Ｏ−ビス−
（トリメチルシリル）トリフルオロアセタミドが含まれる。シリル化工程の後に
、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＢＨ３ ×ＤＩＥＡ， ０．１ｍｍｏｌないし１ｍｍｏｌ）、ボラン−２−クロロピリジンまたはボラン
アニリンによる酸化を行う。

【００５９】 本発明の一側面において、本発明の化合物は、その生成または活性を変更（モ
ジュレート）しようとする蛋白質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡの変更のため
に使用される。したがって、使用する組成物の標的部分は、ＤＮＡまたはＲＮＡ
の予め選択された部分に相補的であるように選択する。すなわち、組成物の標的
部分はＤＮＡの予め選択された部分にハイブリダイズ可能である。

【００６０】 本発明の方法は、診断、治療および研究試薬としておよびキットとして使用さ
れるオリゴマー化合物の調製に用いることができる。このオリゴマー化合物は適
当な薬学的に許容される希釈剤または担体を含めて医薬組成物として使用可能で
ある。それらはまた、不所望な蛋白質産生を特徴とする病気を有する生物の治療
に用いることができる。生物を、不所望蛋白質をコードする核酸の鎖に特異的に
ハイブリダイズ可能な配列を有するオリゴヌクレオチドと接触させる。このタイ
プの治療は、単細胞性の原核および真核生物から多細胞の真核生物にわたる広範
な生物に実施可能である。遺伝、代謝または細胞のコントロールの基本的部分と
して、ＤＮＡ−ＲＮＡ転写またはＲＮＡ−蛋白質翻訳を利用する全ての生物は、
本発明の治療および／または予防処置に適する。恐らく、多彩な生物、例えばバ
クテリア、イースト、原核生物、藻類、全ての植物および温血動物を含む全ての
高等動物体が処置可能である。さらに、多細真核生物の各細胞の処置が可能であ
る；何故ならそれらの細胞はＤＮＡ−ＲＮＡ転写およびＲＮＡ−蛋白質翻訳の双
方を細胞活動の不可欠な部分として含んでいるからである。さらにまた、真核生
物細胞の多くの器官（例えばミトコンドリアおよび葉緑体）もまた転写および翻
訳機構を有している。したがって、単一細胞、細胞集団または器官も、治療もし
くは診断用オリゴヌクレオチドで処置できる生物の定義内に含めることができる
。

【００６１】 理解されるとおり、本発明の方法の工程は、いかなる特定回数で行うまたはい
かなる特定の順序で行うことは必要としない。さらなる、本発明の目的、利点お
よび新規構成は、限定でなく説明の目的のための以下の実施例を見れば、当業者
にとって明らかであろう。

【００６２】

【実施例】

実施例１ 一般的操作 ２' −Ｏ−メトキシエチル−３' −Ｈ−ホスホネートモノマーを使用する混合主
鎖オリゴマー化合物の固相合成試薬 選択された溶媒及び試薬は、Aldrich Chemical Company及び J.T. Baker Comp
any から購入した。三塩化リン、塩化ピバロイル、Ｎ−メチルモルホリン、トリ
エチルアミン、ジアザビシクロ〔５．４．０〕７−ウンデセン及び１，２，４−
トリアゾールは、Fluka から購入した。塩化ピバロイルは、固相合成に使用する
前に蒸留した。５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−メトキシエチルモノヌクレオシド
を公知文献の方法より調製した。Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-50
4; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. S
oc. Trans., 1996, 24, 630-637;及び Altmann et al., Nucleosides Nucleotid
es, 1997, 16, 917-926 。未修飾Ｈ−ホスホネートモノヌクレオチド、及びキャ
ップ試薬であるイソプロピルホスファイトは、Glen Research から購入した。固相合成 固相合成は、Applied Biosystems（Perkin Elmer Corporation）DNA/RNA synt
hesizer 380B及び調整された孔質ガラス（５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥモノ
ヌクレオシド−３' −スクシネート：R.I. Chemical, Costa Mesa, CA ）若しく
は固相支持体としてのプライマーサポート（５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥモ
ノヌクレオシド−３' −スクシネート：Pharmacia ）を用いて実行した。オリゴ
ヌクレオチド合成のＨ−ホスホネート方法は、１９９２年９月２２日に発行され
た米国特許第５，１４９，７９８号、及び１９９６年８月２０日に発行された米
国特許第５，５４８，０７６号に開示されている。各公報の全体の開示は、本明
細書中に援用される。

【００６３】 合成サイクルは、Ｈ−ホスホネート方法に基づき、そして以下の３つの反応工
程及び洗浄工程： （ｉ）ジクロロメタン中のジクロロ酢酸（３％）で脱ブロッキングすること（Ｄ
ＭＴ分裂）； アセトニトリルで洗浄すること；そして アセトニオリル／ピリジン（１：１）で洗浄すること （ｉｉ）アセトニトリル／ピリジン（１：１）中の１０当量のモノヌクリオチド
及び４０当量の塩化ピバロイル（０．２Ｍ）を用いる脱ブロックしたヌクレオチ
ドで５' −Ｏ−ＤＭＴ−Ｈ−ホスホネートモノヌクレオチドをカップルすること
；そして アセトニトリル／ピリジン（１：１）で洗浄すること （ｉｉｉ）未反応の５' −ヒドロキシル基を１６当量のイソプロピルホスファイ
ト及び６４当量の塩化ピバロイル（０．２Ｍ）でキャップすること（任意に）； アセトニトリル／ピリジン（１：１）で洗浄すること；そして アセトニトリルで洗浄すること を含んだ。

【００６４】 オリゴヌクレオチドの固相支持体からの切り離し及び脱保護は、カラム上で１
．５時間、アンモニア水（２５−２８％）を使用し、続いて５５℃で６時間加熱
することによって実行した。酸化操作 混合主鎖オリゴマー化合物におけるホスホジエステルヌクレオシド間連結： 混合主鎖オリゴマー化合物は、ホスホジエステル連結並びにホスホロチオエー
ト及び／又はホスホルアミデート連結を用いて調製した。Ｈ−ホスホネートヌク
レオシド間連結のホスホジエステル連結への酸化は、ホスホロチオエート及びホ
スホルアミデート連結の存在に不活性な試薬で行った。Ｈ−ホスホネートをホス
ホジエステルに転化するのに効果的であり、そしてホスホロチオエート及びホス
ホルアミデートヌクレオシド間連結の存在に不活性な１つの酸化溶液は、ピリジ
ン／四塩化炭素／水（９：５：１）中のトリエチルアミン（０．１Ｍ）若しくは
４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ，０．１Ｍ）であった。この酸化工
程の反応時間は、６０ないし１２０分であった。

【００６５】 Ｈ−ホスホネート合成に使用した標準酸化手法は、酸化試薬としてのヨウ素を
含む種々の調剤に基づいた。しかしながら、ホスホジエステルに加えて、存在す
るホスホロチオエート及びホスホルアミデートヌクレオシド間連結のうちの１つ
又は両方を有する混合主鎖オリゴマー化合物を調製する場合、ヨウ素の使用は、
製造物の均一性に有意に影響を与え、ホスホジエステル連結を伴うホスホロチオ
エートの部分分解若しくはホスホルアミデート連結の置換へと導く。

【００６６】 以下の反応スキームにおいて示した穏やかな酸化操作は、混合主鎖オリゴマー
化合物の容易な調製を例証する。Ｈ−ホスホネートからホスホジエステルへの１
つ又はそれ以上の連続的なヌクレオシド間連結の酸化は、ホスホロチオエート若
しくはホスホルアミデートヌクレオシド連結に不活性な反応条件下で実行される
。

【００６７】

【化１８】 ホスホロチオエートヌクレオシド間連結：ホスホロチオエート連結は、二硫化
炭素／ピリジン／トリエチルアミン（１０：１０：１）中の５％の元素状態の硫
黄を用いてＨ−ホスホネート連結の酸化を介して調製した。硫化前に、固相支持
体はアセトニトリルで入念に洗浄し、真空下で乾燥させた。反応時間は、６０−
１２０分である。

【００６８】 ホスホロチオエート連結及びホスホルアミデート連結を含むオリゴマー化合物
については、酸化は二硫化炭素／ピリジン（１：１）中の５％の元素状態の硫黄
及びＤＡＭＰ（０．１Ｍ）又はトリエチルアミン（０．１Ｍ）を用いて行われた
。硫化前に、固相支持体はアセトニトリルで入念に洗浄し、真空下で乾燥させた
。反応時間は、６０−１２０分である。 ホスホルアミデートヌクレオシド連結：ホスホルアミデート連結を含むオリゴマ
ー化合物は、四塩化炭素中の第一又は第二アミンの混合物（１０％：９０％、ｖ
／ｖ）を用いて固相支持体上で、対応するＨ−ホスホネートオリゴマーブロック
体を酸化することにより調製した。酸化前に、固相支持体はアセトニトリルで入
念に洗浄し、真空下で乾燥させた。反応時間は、６０ないし１２０分であった。 ボラノホスフェートヌクレオシド間連結：ボラノホスフェート連結を含むオリゴ
マー化合物は、Ｈ−ホスホネートヌクレオシド間連結を乾燥テトラヒドロフラン
中のＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（０．３Ｍ）
で２０ないし３０分間処理し、テトラヒドロフランで洗浄し、そしてその後ボラ
ン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＢＨ₃ ：ＤＩＥＡ、０．１ｍｍｏｌ
：１ｍｍｏｌ）、ボラン−２−クロロピリジン若しくはボラン−アニリンで処理
することによって調製する。酸化前に、固相支持体はアセトニトリルで入念に洗
浄し、そして真空下で乾燥する。反応時間は、６０ないし２４０分である。 実施例２ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥ−チミジン−３' −Ｈ−ホスホネート ジクロロメタン（３３０ｍＬ）中の１，２，４−トリアゾール（７．７５ｇ，
０．１１２モル）及びＮ−メチルモルホリン（３３．４ｇ，０．３３モル）の攪
拌溶液に、三塩化リン（４．５３ｇ，０．０３３モル）を加えた。室温で３０分
攪拌した後、その混合液を℃に冷却した。続いて、ジクロロメタン（１００ｍＬ
）中の５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥ−チミジン（４ｇ，６．６ミリモル）を
２０分かけて滴下した。もう２０分攪拌した後、その混合液が室温まで温まって
から、攪拌しながら重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝水（３５０ｍＬ，ｐＨ８
．５）中に注いだ。その混合液を分液ロートに移して分液した。水相をジクロロ
メタン（３００ｍＬ）で一回抽出して、合わせた有機相を別の重炭酸トリエチル
アンモニウム緩衝水（３５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥
させた後、溶媒を留去してから粗生成物を減圧乾燥した。その粗生成物を、ジク
ロロメタン中の０．５％トリエチルアミンからジクロロメタン／メタノール（９
：１）中の０．５％トリエチルアミンへの段階的勾配を用いて、シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーにより精製した。合わせた生成物画分を泡状になるまで濃
縮してから、過剰のトリエチルアミンを除くためにアセトニトリルで２回濃縮し
た。続いて、その精製した生成物をジクロロメタン（３００ｍＬ）中に溶解させ
、０．２Ｍジアザビシクロ〔５．４．０〕７−ウンデセン重炭酸緩衝液（３５０
ｍＬ，ｐＨ８．７）各々で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして泡状
になるまで濃縮した。それを固相合成に使用する前に、その生成物を高減圧下で
乾燥して、４．６２ｇ（８５％）の標題化合物を得た。

【００６９】 ³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃ 、外部標準として２％Ｈ₃ ＰＯ₄ を使用）４．２２
ｐｐｍ。 実施例３ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥ−Ｎ−６−ベンゾイルアデノシン−３' −Ｈ−
ホスホネート ３４０ｍＬジクロロメタン中の８．０３ｇ（０．１１６モル）１，２，４−ト
リアゾール及び３４．６ｇ（０．３４２モル）Ｎ−メチルモルホリンの攪拌溶液
に、三塩化リン４．７ｇ（０．０３４２モル）を加えた。その混合溶液を室温で
３０分間攪拌し、０℃に冷却した。続いて、ジクロロメタン（１００ｍＬ）中の
５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥ−Ｎ−６−ベンゾイルアデノシン（５ｇ、６．
８４ｍｍｏｌ）を２０分かけて滴下した。もう２０分攪拌した後、その混合液が
室温まで温まってから、攪拌しながら重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝水（３
５０ｍＬ、ｐＨ８．５）中に注いだ。その混合液を分液ロートに移して分液した
。水相をジクロロメタン（３００ｍＬ）で一回抽出して、合わせた有機相を重炭
酸トリエチルアンモニウム緩衝水（３５０ｍＬ、ｐＨ８．５）で洗浄した。有機
相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮し、そして減圧乾燥し
た。その粗生成物を、ジクロロメタン中の０．５％トリエチルアミンからジクロ
ロメタン／メタノール（９：１）中の０．５％トリエチルアミンへの段階的勾配
を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。合わせた生成
物画分を泡状になるまで濃縮してから、微量の（ｔｒａｃｅ）トリエチルアミン
を除くためにアセトニトリルで２回濃縮した。続いて、その精製した生成物をジ
クロロメタン（３５０ｍＬ）中に溶解させ、ジアザビシクロ〔５．４．０〕７−
ウンデセン重炭酸緩衝液（０．２Ｍ、３５０ｍＬ，ｐＨ８．７）各々で２回洗浄
し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして泡状になるまで濃縮した。それを固相
合成に使用する前に、その生成物を高減圧下で乾燥して、５．５ｇ（９０％）の
標題化合物を得た。³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃ 、外部標準：８５％Ｈ₃ ＰＯ₄ ）
：３．７７ｐｐｍ。 実施例４ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥ−Ｎ−４−ベンゾイル−メチル−シチジン−３
' −Ｈ−ホスホネート ジクロロメタン（３５０ｍＬ）中の１，２，４−トリアゾール（８．２９ｇ，
０．１２モル）及びＮ−メチルモルホリン（３５．７ｇ，０．３５３モル）の攪
拌溶液に、三塩化リン（４．８５ｇ，３５．３ｍｍｏｌ）を加えた。その混合溶
液を室温で３０分間攪拌し、０℃に冷却した。続いて、ジクロロメタン（１００
ｍＬ）中の５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥ−Ｎ−６−ベンゾイルシチジン（５
ｇ、７．０６ｍｍｏｌ）を２０分かけて滴下した。もう２０分攪拌した後、その
混合液が室温まで温まってから、攪拌しながら重炭酸トリエチルアンモニウム緩
衝水（３５０ｍＬ、ｐＨ８．５）中に注いだ。その混合液を分液ロートに移して
分液した。水相をジクロロメタン（３００ｍＬ）で一回抽出して、合わせた有機
相を重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝水（３５０ｍＬ、ｐＨ８．５）で洗浄し
た。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、そして得
られた残渣を高減圧乾燥した。その粗生成物を、ジクロロメタン中の３％トリエ
チルアミンからジクロロメタン／メタノール（９：１）中の３％トリエチルアミ
ンへの段階的勾配を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し
た。合わせた生成物画分を泡状になるまで濃縮してから、微量の（ｔｒａｃｅ）
トリエチルアミンを除くためにアセトニトリルで２回濃縮した。続いて、その精
製した生成物をジクロロメタン（３００ｍＬ）中に溶解させ、ジアザビシクロ〔
５．４．０〕７−ウンデセン重炭酸緩衝液（３００ｍＬ，０．２Ｍ，ｐＨ８．７
）各々で２回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして泡状になるまで濃縮
した。それを固相合成に使用する前に、その生成物を高減圧下で乾燥して、３．
９ｇ（６３％）の標題化合物を得た。³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃ 、外部標準とし
て８５％Ｈ₃ ＰＯ₄ を使用）：３．７６ｐｐｍ。 実施例５ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥ−Ｎ−２−イソブチリルグアノシン−３' −Ｈ
−ホスホネート ジクロロメタン（３５０ｍＬ）中の１，２，４−トリアゾール（１１．８４ｇ
，０．１７１モル）及びＮ−メチルモルホリン（５０．９８ｇ，０．５０４モル
）の攪拌溶液に、三塩化リン（６．９２ｇ，０．０５０モル）を加えた。室温で
３０分攪拌した後、その混合液を−２０℃に冷却した。ジクロロメタン（１００
ｍＬ）中の５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥ−イソブチリルグアノシン（６ｇ，
８．４ミリモル）を２０分かけて滴下した。２０分攪拌した後、その混合液が室
温まで温まってから、攪拌しながら炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝水（３
５０ｍＬ，ｐＨ８．５）中に注いだ。その混合液を分液ロートに移して分液した
。水相をジクロロメタン（３００ｍＬ）で一回抽出して、合わせた有機相を炭酸
水素トリエチルアンモニウム緩衝水（３５０ｍＬ、ｐＨ８．５）で洗浄した。有
機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を留去してから粗生成物を減圧乾燥
した。その粗生成物を、ジクロロメタン中の３％トリエチルアミンからジクロロ
メタン／メタノール（９：１）中の３％トリエチルアミンへの段階的勾配を用い
て、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。合わせた生成物画分
を泡状になるまで濃縮してから、過剰のトリエチルアミンを除くためにアセトニ
トリルで２回濃縮した。続いて、その精製した生成物をジクロロメタン（５０ｍ
Ｌ）中に溶解させ、ジアザビシクロ〔５．４．０〕７−ウンデセン炭酸水素緩衝
液（５０ｍＬ，０．２Ｍ，ｐＨ８．７）で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥さ
せ、そして泡状になるまで濃縮した。それを固相合成に使用する前に、その生成
物を高減圧下で乾燥して、０．８ｇ（１２％）の標題化合物を得た。³¹Ｐ−ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣｌ₃ 、外部標準：８５％ Ｈ₃ ＰＯ₄ ）：３．６８ｐｐｍ。 実施例６ 均一２' −ＭＯＥ−修飾ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの合成 Ｔ、Ｃ、Ａ及びＧの核酸塩基を含有しかつ各々のリボシル糖部分上に２' −メ
トキシエトキシ（ＭＯＥ）を有する均一なホスホジエステルオリゴヌクレオチド
（配列番号：８，２０ｍｅｒ）の固相合成を、５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥ
−メチルシチジン−３' −スクシニルＣＰＧを固体支持体として用いて、１μモ
ルスケールで行った。その合成サイクルは上の一般的操作に説明されている。合
成を完結した後、ピリジン／水（９８：２）中のヨウ素（０．１Ｍ）を用いてそ
のオリゴマーを酸化し、アセトニトリル／ピリジン（１：１）及びアセトニトリ
ルで洗浄した。一般的操作で説明したように、アンモニア水（２５〜２８％）で
固体支持体からの脱保護及び切り離しを行った。電子噴霧式質量スペクトル法に
より粗生成物の分析を行ったところ、８０２３．５（計算質量：８０２２．３）
の相対分子質量を得た。 実施例７ ２' −ＭＯＥ−修飾ギャップマーホスホジエステルオリゴヌクレオチドの合成 Ｔ、Ｃ、Ａ及びＧの核酸塩基を含有し、かつオリゴヌクレオチドの５' 末端の
リボシル糖部分の４位上及びオリゴヌクレオチドの３' 末端のリボシル糖部分の
５位上に２' −ＭＯＥ基を有する、均一なホスホジエステルオリゴヌクレオチド
（配列番号：２，１８ｍｅｒ）の固相合成を、５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥ
−チミジン−３' −スクシニルＣＰＧを固体支持体として用いて、１μモルスケ
ールで行った。その合成サイクルは実施例１の一般的操作に説明されている。合
成後、ピリジン／水（９８：２）中のヨウ素（０．１Ｍ）を用いてそのオリゴマ
ーを酸化し、アセトニトリル／ピリジン（１：１）及びアセトニトリルで洗浄し
た。一般的操作で説明したように、アンモニア水（２５〜２８％）で固体支持体
からの脱保護及び切り離しを行った。電子噴霧式質量スペクトル法により粗生成
物の分析を行ったところ、６４３５．５（計算質量：６４４０．７）の相対分子
質量を得た。 実施例８ ２' −ＭＯＥ−修飾ギャップマーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成 Ｔ、Ｃ、Ａ及びＧの核酸塩基を含有し、かつオリゴヌクレオチドの５' 末端の
リボシル糖部分の５位上及びオリゴヌクレオチドの３' 末端のリボシル糖部分の
６位上に２' −ＭＯＥ基を有する、均一なホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ド（配列番号：６，１９ｍｅｒ）の固相合成を、５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯ
Ｅ−チミジン−３' −スクシニルＣＰＧを固体支持体として用いて、１μモルス
ケールで行った。その合成サイクルは一般的操作に説明されている。合成を完結
した後、二硫化炭素／ピリジン／水（１０：１０：１）中の元素状硫黄（５％）
を用いてそのオリゴマーを酸化し、二硫化炭素、アセトニトリル／ピリジン（１
：１）及びアセトニトリルで洗浄した。一般的操作で説明したように、アンモニ
ア水（２５〜２８％）で固体支持体からの脱保護及び切り離しを行った。電子噴
霧式質量スペクトル法により粗生成物の分析を行ったところ、６８７３．４（計
算質量：６８７４．８）の相対分子質量を得た。 実施例９ ＰＯ−ＰＳ−ＰＯ混合主鎖を有する２' −ＭＯＥ−修飾ギャップマーオリゴマー
化合物の合成 ヌクレオシド６−１５間のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を伴う、３
' 及び５' 末端上のホスホジエステルヌクレオシド間連結を有し、そして、デオ
キシリボ部分である内部リボシル部分を有するギャップオリゴマーの５' 及び３
' の各末端においてリボシル糖部分の６位上に２' −ＭＯＥ基を有する、ギャッ
プオリゴマー（配列番号：９，２０ｍｅｒ）の固相合成を、５' −Ｏ−ＤＭＴ−
２' −ＭＯＥ−アデノシン−３' −スクシニルＣＰＧを固体支持体として用いて
、１μモルスケールで行った。その合成サイクルは実施例１の一般的操作に説明
されている。最初の５つのカップリングの後、ピリジン／四塩化炭素／水（９：
５：１）中の０．１Ｍ ＤＡＭＰを用いてそのオリゴマーを酸化した。次のセグ
メントの合成の前に、固相をアセトニトリル／ピリジン（１：１）及びアセトニ
トリルで十分に洗浄した。さらなる９個のＨ−ホスホン酸塩モノマー（計１５マ
ーとなる）の取り込みの後、一般的操作に記載されているように、二硫化炭素／
ピリジン／トリエチルアミン（１０：１０：１）中の元素状硫黄（５％）を用い
てそのオリゴマーを酸化した。次のセグメントの合成の前に、固相を二硫化炭素
、アセトニトリル／ピリジン（１：１）及びアセトニトリルで十分に洗浄した。
固相合成を完結した後、支持体に結合したオリゴマーを最後に、ピリジン／四塩
化炭素／水（９：５：１）中のＤＡＭＰ（０．１Ｍ）で処理し、そして、アセト
ニトリル／ピリジン（１：１）及びアセトニトリルで洗浄した。一般的操作で説
明したように、アンモニア水（２５〜２８％）で固体支持体からの脱保護及び切
り離しを行った。電子噴霧式質量スペクトル法により粗生成物の分析を行ったと
ころ、７４２５．９（計算質量：７４２６．０）の相対分子質量を得た。 実施例１０ ＰＮ−ＰＳ−ＰＮ混合主鎖を有する２' −ＭＯＥ−修飾ギャップマーオリゴマー
化合物の合成 ヌクレオシド４−１６間のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を伴う、３
' 及び５' 末端上の２つのジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）ホスホルアミデー
トヌクレオシド間連結を有し、そして、デオキシリボ部分である内部リボシル部
分を有するオリゴマー化合物の５' 末端のリボシル糖部分の３位上及びオリゴヌ
クレオチドの５' 末端のリボシル糖部分の４位に２' −ＭＯＥ基を有する、ギャ
ップオリゴマー（配列番号：４，１９ｍｅｒ）の固相合成を、５' −Ｏ−ＤＭＴ
−２' −ＭＯＥ−チミジン−３' −スクシニルＣＰＧを固体支持体として用いて
、１μモルスケールで行った。その合成サイクルは一般的操作に説明されている
。最初の２つのカップリングの後、四塩化炭素中の２−ジメチルアミノエチルア
ミン（１０％）を用いてそのオリゴマーを酸化した。次のセグメントの合成の前
に、固相をアセトニトリルで十分に洗浄した。さらなる１４個のＨ−ホスホン酸
塩モノマー（計１７マーとなる）の取り込みの後、一般的操作に記載されている
ように、二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン（１０：１０：１）中の元素
状硫黄（５％）を用いてそのオリゴマーを酸化した。次のセグメントの合成の前
に、固相を二硫化炭素、アセトニトリル／ピリジン（１：１）及びアセトニトリ
ルで十分に洗浄した。固相合成を完結した後、支持体に結合したオリゴマーを最
後に、四塩化炭素中の２−ジメチルアミノエチルアミン（１０％）で処理した。
一般的操作で説明したように、アンモニア水（２５〜２８％）で固体支持体から
の脱保護及び切り離しを行った。 実施例１１ ＰＮ−ＰＯ−ＰＳ−ＰＯ混合主鎖を有する２' −ＭＯＥ−修飾ギャップマーオリ
ゴマー化合物の合成 ５' 末端上のヌクレオシド１−３間のＤＭＡＥホスホルアミデートヌクレオシ
ド間連結、ヌクレオシド３−６及び１５ないし２０間のホスホジエステルヌクレ
オシド間連結、ヌクレオシド６−１５間のホスホロチオエートヌクレオシド間連
結、オリゴマー化合物の５' 及び３' 末端のリボシル糖部分の６位上の２' −Ｍ
ＯＥ基、並びに２' −デオキシリボシルである残りのリボシル単位を有する、ギ
ャップオリゴマー（配列番号：１０，２０ｍｅｒ）の固相合成を、５' −Ｏ−Ｄ
ＭＴ−２' −ＭＯＥ−アデノシン−３' −スクシニルＣＰＧを固体支持体として
用いて、１μモルスケールで行った。その合成サイクルは実施例１の一般的操作
に説明されている。最初の５つのカップリングの後、ピリジン／四塩化炭素／水
（９：５：１）中のテトラメチルアミン（０．１Ｍ）を用いてそのオリゴマーを
酸化した。次のセグメントの合成の前に、固相を、アセトニトリル／ピリジン（
１：１）及びアセトニトリルで十分に洗浄した。さらなる９個のＨ−ホスホン酸
塩モノマー（計１５マーとなる）の取り込みの後、一般的操作に記載されている
ように、二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン（１０：１０：１）中の元素
状硫黄（５％）を用いてそのオリゴマーを酸化した。次のセグメントの合成の前
に、固相を二硫化炭素、アセトニトリル／ピリジン（１：１）及びアセトニトリ
ルで十分に洗浄した。さらなる３個のＨ−ホスホン酸塩モノマー（計１８マーと
なる）の取り込みの後、ピリジン／四塩化炭素／水（９：５：１）中のテトラメ
チルアミン（０．１Ｍ）を用いてそのオリゴマーを酸化し、そして、アセトニト
リル／ピリジン（１：１）及びアセトニトリルで十分に洗浄した。固相合成を完
結した後、支持体に結合したオリゴマーを最後に、四塩化炭素中の２−ジメチル
アミノエチルアミン（１０％）で処理した。一般的操作で説明したように、アン
モニア水（２５〜２８％）で固体支持体からの脱保護及び切り離しを行った。電
子噴霧式質量スペクトル法により粗生成物の分析を行ったところ、７５６６．３
（計算質量：７５６６．３）の相対分子質量を得た。 実施例１２ ＰＮ−ＰＯ−ＰＳ−ＰＯ−ＰＮ混合主鎖を有する２' −ＭＯＥ−修飾ギャップマ
ーオリゴマー化合物の合成 ５' 末端上のヌクレオシド１−３間及び３' 末端上のヌクレオシド１８−２０
間のＤＭＡＥホスホルアミデートヌクレオシド間連結、ヌクレオシド３−６及び
１５ないし１８間のホスホジエステルヌクレオシド間連結、ヌクレオシド６−１
５間のホスホロチオエートヌクレオシド間連結、オリゴヌクレオチドの５' 及び
３' 末端のリボシル糖部分の６位上の２' −ＭＯＥ、並びに２' −デオキシリボ
シルである残りのリボシル単位を有する、ギャップオリゴマー（配列番号：１１
，２０ｍｅｒ）の固相合成を、５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −ＭＯＥ−アデノシン−
３' −スクシニルＣＰＧを固体支持体として用いて、１μモルスケールで行った
。その合成サイクルは実施例１の一般的操作に説明されている。最初の２つのカ
ップリングの後、四塩化炭素中の２−ジメチルアミノエチルアミン（１０％）を
用いてそのオリゴマーを酸化した。次のセグメントの合成の前に、固相を十分に
アセトニトリルで洗浄した。さらなる３個のＨ−ホスホン酸塩モノマー（計６マ
ーとなる）の取り込みの後、ピリジン／四塩化炭素／水（９：５：１）中のＤＡ
ＭＰ（０．１Ｍ）を用いてそのオリゴマーを酸化し、そしてアセトニトリル／ピ
リジン（１：１）及びアセトニトリルで十分に洗浄した。さらなる９個のＨ−ホ
スホン酸塩モノマー（計１５マーとなる）の取り込みの後、二硫化炭素／ピリジ
ン／トリエチルアミン（１０：１０：１）中の元素状硫黄（５％）を用いてその
オリゴマーを酸化した。次のセグメントの合成の前に、固相を二硫化炭素、アセ
トニトリル／ピリジン（１：１）及びアセトニトリルで十分に洗浄した。さらな
る３個のＨ−ホスホン酸塩モノマー（計１８マーとなる）の取り込みの後、ピリ
ジン／四塩化炭素／水（９：５：１）中のＤＡＭＰ（０．１Ｍ）を用いてそのオ
リゴマーを酸化し、そしてアセトニトリル／ピリジン（１：１）及びアセトニト
リルで十分に洗浄した。固相合成を完結した後、支持体に結合したオリゴマーを
、四塩化炭素中の２−ジメチルアミノエチルアミン（１０％）で処理した。アン
モニア水（２５〜２８％）で固体支持体からの脱保護及び切り離しを行った。電
子噴霧式質量スペクトル法により粗生成物の分析を行ったところ、７７０４．６
（計算質量：７７０６．６）の相対分子質量を得た。

【００７０】 以下の表１は、上記実施例に記載された方法に従って調製されたオリゴマー化
合物を示す。

【００７１】

【表１】 ^* ＝２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ） Ｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド間連結 Ｎ＝ジメチルアミノエチルホスホルアミデートヌクレオシド間連結 実施例１３ ＰＮ−ＰＳ−ＰＮ混合主鎖を有する２' −ＭＯＥ−修飾ギャップマーの合成の一
般的方法 ５' 及び３' 末端にホスホルアミデートヌクレオシド間結合と、ホスホロチオ
エート結合を有する内部デオキシリボ部分とを有する２' −ＭＯＥギャップ有オ
リゴマーの固相合成をスクシニル結合基を介してＣＰＧに結合した５' −Ｏ−Ｄ
ＭＴ−２' −ヌクレオシドを固体支持体として用いて１ミリモルスケールで行う
。合成サイクルは、実施例１の一般的方法において上記した通りである。固体支
持体結合ヌクレオシドへ所望の数のさらなるヌクレオシドを結合した後、生じた
オリゴマーを四塩化炭素中２−ジメチルアミノエチルアミン（１０％）を用いて
酸化する。さらなる延長の前に、固体支持体をアセトニトリルで洗浄する。所望
の数のさらなるヌクレオシドを結合した後、ホスホロチオエートヌクレオシド間
結合への酸化を、ジスルフィド炭素／ピリジン（１：１）中硫黄元素（５％）及
び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．１Ｍ）を用いて行う。固体支持体を、
再び、ジスルフィド炭素、アセトニトリル／ピリジン（１：１）及びアセトニト
リルで洗浄する。所望の数のさらなるヌクレオシドを添加した後、支持体結合オ
リゴマーを四塩化炭素中１０％の２−ジメチルアミノエチルアミンによって処理
する。脱保護及び固体支持体からの切断をアンモニア水溶液（２５−２８％）を
用いて行い、所望のオリゴマー化合物を得る。 実施例１４ ＰＢＨ₃ −ＰＳ−ＰＢＨ₃ 混合主鎖を有する２' −ＭＯＥ−修飾ギャップマーの
合成の一般的方法 ５' 及び３' 末端にボラノホスフェートヌクレオシド間結合と、ホスホロチオ
エート結合を有する内部デオキシリボ部分とを有する２' −ＭＯＥギャップ有オ
リゴマーの固相合成をスクシニル結合基を介してＣＰＧに結合した５' −Ｏ−Ｄ
ＭＴ−２' −ヌクレオシドを固体支持体として用いて１ミリモルスケールで行う
。合成サイクルは、実施例１の一般的方法において上記した通りである。固体支
持体結合ヌクレオシドへ所望の数のさらなるヌクレオシドを結合した後、生じた
オリゴマー化合物を乾燥テトラヒドロフラン中Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル
）トリフルオロアセトアミド（０．３Ｍ）で３０分間処理し、テトラヒドロフラ
ンで洗浄する。次に、支持体結合オリゴマーを乾燥テトラヒドロフラン中ボラン
−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５Ｍ）複合体で室温において２時
間処理する。次のセグメントの合成前に、固体支持体をアセトニトリルで洗浄す
る。所望の数のさらなるヌクレオシドを結合した後に、Ｈ−ホスホネートヌクレ
オシド間結合をジスルフィド炭素／ピリジン（１：１）中硫黄元素（５％）及び
４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．１Ｍ）を用いて、ホスホロチオエートヌ
クレオシド間結合へ酸化する。オリゴマーの延長の前に、固体支持体をジスルフ
ィド炭素、アセトニトリル／ピリジン（１：１）及びアセトニトリル洗浄する。
所望の数のさらなるヌクレオシドを結合した後、Ｈ−ホスホネートヌクレオシド
間結合を乾燥テトラヒドロフラン中Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフル
オロアセトアミド（０．３Ｍ）で室温において３０分間処理し、テトラヒドロフ
ランで洗浄する。次に、支持体結合オリゴマーを乾燥テトラヒドロフラン中０．
５Ｍボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン複合体で室温において２時間
処理する。脱保護及び固体支持体からの切断をアンモニア水溶液（２５−２８％
）を用いて行う。

【００７２】 生物学的アッセイ 方法Ａ ＩＣＡＭ−１の発現 標的オリゴマー化合物を製造し、ＨＵＶＥＣ細胞を用いてアッセイし、ＩＣＡ
Ｍ−１の発現を阻害する能力を測定した。ＨＵＶＥＣ細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ(L
ife Technologies, Inc.) で３回洗浄し、これを３７℃に予備加温した。オリゴ
マー化合物をＯｐｔｉ−ＭＥＭ中リポフェクチン( １０μｇ／ｍＬ、Life Techn
ologies, Inc.)と予備混合し、所望の濃度に連続希釈し、洗浄した細胞に適用し
た。基底の未処理（オリゴマー化合物添加せず）対照細胞をまた、リポフェクチ
ンで処理した。細胞を３７℃で４時間インキュベートし、このときに、培地を除
去し、標準増殖培地（ＴＮＦ−ａ（５ｍｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ Systems ）を有する
または有しない）に取り替えた。３７℃のインキュベーションを以下に示す異な
る時間続けた。

【００７３】 蛍光活性化細胞ソーター（sorter）をＩＣＡＭ−１タンパク質発現を定量する
ために用いた。細胞を、ＰＢＳ中トリプシン（０．２５％）による簡単なトリプ
シン処理によってプレート表面から取り出した。トリプシン活性をＰＢＳ（＋Ｍ
ｇ／Ｃａ）中のウシ血清アルブミン（２％）及びアジ化ナトリウム（０．２％）
の溶液でクエンチした。細胞を遠心分離（１０００ｒｐｍ、Beckman GPR centri
fuge）によってペレット化し、ＰＢＳ中に再懸濁し、ＩＣＡＭ−１特異抗体（３
μＬ／１０５細胞）、ＣＤ５４−ＰＥ(Pharmingin)によって染色した。この抗体
をこの細胞と共に、暗所で穏やかに攪拌しながら４℃において３０分間インキュ
ベートした。細胞を遠心分離手段によって洗浄し、ホルムアルデヒド（０．５％
、Polysciences）含有ＦａｃｓＦｌｏｗ緩衝液（０．３ｍＬ、Becton Dickinson
）中に再懸濁した。

【００７４】 細胞表面ＩＣＡＭ−１の発現をBecton Dickinson FACScanを用いてフローサイ
トメトリーによって測定した。対照におけるＩＣＡＭ−１発現のパーセンテージ
を次のように算出した： [ （オリゴマー化合物処理ＩＣＡＭ−１値）−（基底ＩＣＡＭ−１値）／（非処
理ＩＣＡＭ−１値）−（基底ＩＣＡＭ−１値）] 。

【００７５】 １つの研究において、２' −Ｏ−（２−メトキシ）エチル−修飾坑細胞間接着
分子１（ＩＣＡＭ−１）オリゴマー化合物は、ヒト臍[ 帯] 静脈内皮細胞におい
て、ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡレベルを選択的に増加し、ＩＣＡＭ−１翻訳開始複合
体の形成を阻害することが示された（Baker 等、 The Journal of Biological C
hemistry, 1997, 272, 11994-12000）。

【００７６】 ＩＣＡＭ−１発現データは、アミダイト化学によって合成された均一なホスホ
ロチオエートＭＯＥオリゴマーＴ^* Ｃ^* Ｔ^* Ｇ^* Ａ^* Ｇ^* Ｔ^* Ａ^* Ｇ^* Ｃ^* Ａ^* Ｇ^* （* ＝２' −メトキシエトキシ（ＭＯＥ））配列及びＨ−ホスホネート化学
によって合成された同じ化合物は、ＨＵＶＥＣ細胞に対してＩＣＡＭ−１発現を
制御することにおいて効果的であることを示す。オリゴマーは、おそらく、直接
結合ＲＮａｓｅＨ独立機構によって作用している。異なる化学から合成された両
化合物は、ＩＣＡＭ−１発現の阻害において３−１００ｎＭ範囲の用量反応を示
す。

【００７７】 方法Ｂ Ａ５４９細胞におけるｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現 この研究においてデザインされたギャップマーは、均一なデオキシホスホロチ
オエートである、ＡＴＧ ＣＡＴ ＴＣＣ ＧＣＣ ＣＣＣ ＡＡＧ ＧＡ（配
列番号９）の親配列に基づく。この配列は、マウスｃ−ｒａｆを標的としたアン
チセンスオリゴマー化合物である。ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現アッセイは、報告
された方法（Monica等、Nature Medicinek, 1996, 2, 668）に従って実施された
。ヒトＡ５４９肺腫瘍細胞は、American Type Tissue Collection から得た。こ
れらを、１ｇのグルコース／Ｌ（ＤＭＥＭ）及びＦＣＳ（１０％）を含有するＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ修飾Ｅａｇｌｅ培地で増殖させ、９０−９５％コンフルエントに
なるまで、ルーチンに継代した。

【００７８】 ｃ−ｒａｆタンパク質合成のオリゴヌクレオシド阻害のアッセイ Ａ５４９細胞を６−穴プレート（Falcon Labware, Lincoln Park, NJ）にプレ
ート化し、２４−４８時間後（８０−９０％コンフルエントになるとき）、１μ
Ｍホルボル１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢｕ）で１８時間処理した。この方
法は、細胞から７５％より多い免疫反応性のｃ−ｒａｆタンパク質を取り出す。
次に、細胞をＤＭＥＭ（３ｍＬ）で３回洗浄し（ＰＤＢｕを除去するため）、Ｄ
ＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ溶液（２０μｇ／ｍＬ、LipofectinR, Bethesda Research L
aboratories ）含有ＤＭＥＭ（１ｍＬ）を加えた。次に、オリゴヌクレオシドギ
ャップマーを、１０μＭストック溶液から必要な濃度（本発明の最初のスクリー
ンでは、１μＭ）まで加え、この２つの溶液をディッシュを渦を巻くことによっ
て混合した。細胞を３７℃で４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ＋ＦＣＳ（１０
％）によって１回洗浄し、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ溶液を除去し、次に、さらなる
ＤＭＥＭ（３ｍＬ）＋１０％ＦＣＳを加え、細胞をさらに１０時間回復するよう
にした。全ＲＮＡをこの実験の２４時間後に調製し、Ｇ３ＰＤＨ ｍＲＮＡに対
して標準化した後、ｃ−ｒａｆ及びＧ３ＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対してアッセ
イした。

【００７９】 結果： ギャップ有オリゴマー化合物（配列番号９、１０および１１、表１）はＡ５４
９細胞のｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現を５０−４００ｎＭ範囲で用量依存的に阻害
する。ｃ−ｒａｆ発現を減少させる効果の期間は、改良されたヌクレアーゼ耐性
から予測されるようにＰ＝Ｎ含有ギャップマーに対してはるかに長い。

【００８０】 本明細書に言及されるまたは引用される各特許、出願、印刷刊行物、および他
の公表文献は、完全に本明細書に援用されることが意図される。 当業者は、本発明の好ましい態様に、多くの変化および修飾を作成してもよく
、そしてこうした変化および修飾は、本発明の精神から逸脱することなく作成さ
れることが可能であることを認識するであろう。したがって、付随する請求項は
、本発明の真の精神および範囲内に属する、こうした同等の変動をすべて包含す
ることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 メイアー，マーティン・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92008， カールズバッド，ジェファソン・ストリー ト 2730，ナンバー 16 Ｆターム(参考） 4C057 BB03 BB04 CC01 DD01 MM02 4H050 AA01 AB81

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式： 【化１】 （式中、 各々のＺは、独立して、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルア
   ミデート又はボラノホスフェートヌクレオシド間連結であり； 各々のＴ₁ 及びＴ₂ は、独立して、ヒドロキシル又は保護されたヒドロキシル
   であり； Ｂｘは、複素環塩基部分であり； 各々のＲ₁ は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、２’
   −置換基又は保護された２’−置換基であり；そして ｎは、１より大きな整数である。 但し、前記Ｚの少なくとも１つは、ホスホジエステルであり、前記Ｚの少なく
   とももう１つは、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート又はボラノホスフェ
   ートヌクレオシド間連結である。） のオリゴマー化合物を調製する方法であって： （ａ）式： 【化２】 （式中、 Ｐｇは、酸不安定性ヒドロキシル保護基であり；そして Ｔ₃ は、塩基不安定性ヒドロキシル保護基又は固体支持体への共有結合である
   。） の化合物を提供する工程； （ｂ）前記酸不安定性ヒドロキシル保護基を脱保護して、脱保護されたヒドロ
   キシル基を形成させる工程； （ｃ）前記脱保護されたヒドロキシル基を式： 【化３】 を有する更なる化合物及び縮合剤と、追加されたＨ−ホスホネートヌクレオシド
   間連結を有する延長された化合物を形成するのに有効な時間、温度及び圧力の条
   件下で処理する工程； （ｄ）場合により、前記延長された化合物をキャッピング剤で処理してキャッ
   プされた化合物を形成すること； （ｅ）場合により、前記キャップされた化合物をシリル化剤で処理してシリル
   化された化合物を形成すること； （ｆ）場合により、前記延長された化合物、前記キャップされた化合物、又は
   前記シリル化された化合物を、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホ
   ルアミデート又はボラノホスフェートヌクレオシド間連結に対して不活性な酸化
   性溶液で処理すること； （ｇ）場合により、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を繰り返
   して保護されたオリゴマー化合物を形成させること； （ｈ）前記保護されたオリゴマー化合物を脱保護溶液で処理して、前記混合主
   鎖オリゴマー化合物を形成させること を含んでなる方法。
2. 【請求項２】 Ｒ₁ が２’−置換基である、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記２’−置換基が、−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ₃ 、−
   Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−Ｎ（Ｒ₆)（Ｒ₇)、又は−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｎ（Ｒ₆)（Ｒ₇)であって、Ｒ₆ 及びＲ₇ の各々が独立してＨ又はＣ₁ 〜
   Ｃ₁₀アルキルである、請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 各々のＲ₆ 及びＲ₇ が−ＣＨ₃ である、請求項３記載の方法
   。
5. 【請求項５】 前記シリル化剤が、クロロトリメチルシラン、Ｎ，Ｏ−ビス
   （トリメチルシリル）アセトアミド、ヘプタメチルジシラザン、又はＮ，Ｏ−ビ
   ス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドである、請求項１記載の方法
   。
6. 【請求項６】 前記縮合剤が、酸塩化物、クロロホスホネート、カーボネー
   ト、カルボニウム型化合物、又はホスホニウム型化合物である、請求項１記載の
   方法。
7. 【請求項７】 前記縮合剤が、塩化ピバロイル、塩化アダマンチル、２，４
   ，塩化６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル、２−クロロ−５，５−ジメチ
   ル−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスフィネート、ジフェニルホスホロク
   ロリデート、ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸塩化物、
   ビス（ペンタフルオロフェニル）カーボネート、２−（１Ｈ−ベンゾチアゾール
   −１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホス
   フェート、Ｏ−（アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テト
   ラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート、６−（トリフルオロメチル
   ）ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウム・ヘキ
   サフルオロホスフェート、ブロモ−トリスピロリジノホスホニウム・ヘキサフル
   オロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホ
   スホニウム・ヘキサフルオロホスフェート、又は２−（ベンゾトリアゾール−１
   −イルオキシ）−１，３−ジメチル−２−ピロリジン−１−イル−１，３，２−
   ジアザホスホリジニウム・ヘキサフルオロホスフェートである、請求項６記載の
   方法。
8. 【請求項８】 前記混合主鎖オリゴマー化合物が、前記ホスホジエステル及
   び前記ホスホロチオエート部分の隣接領域を含んでなる、請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】 前記混合主鎖オリゴマー化合物が、前記ホスホジエステル及
   び前記ホスホルアミデート部分の隣接領域を含んでなる、請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記混合主鎖オリゴマー化合物が、少なくとも１つの前記
    ホスホジエステルヌクレオシド間連結に加えて、１又はそれを越える前記ホスホ
    ロチオエート、ホスホルアミデート及びボラノホスフェートヌクレオシド間連結
    を有するヌクレオシドの隣接領域含んでなる、請求項１記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記酸不安定性ヒドロキシル保護基が、ジメトキシトリチ
    ル、モノメトキシトリチル、トリチル、又は９−フェニルキサンテンである、請
    求項１記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記複素環塩基部分がプリン又はピリミジンである、請求
    項１記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記プリン又はピリミジンが、アデニン、シトシン、５−
    メチルシトシン、チミン、ウラシル、グアニン又は２−アミノアデニンである、
    請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 Ｔ₃ が固体支持体への共有結合である、請求項１記載の方
    法。
15. 【請求項１５】 前記混合主鎖オリゴマー化合物が、約５〜約５０ヌクレオ
    シド９含んでなる、請求項１記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記混合主鎖オリゴマー化合物が、約８〜約３０ヌクレオ
    シド９含んでなる、請求項１記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記混合主鎖オリゴマー化合物が、約１５〜約２５ヌクレ
    オシド９含んでなる、請求項１記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記酸化性溶液が、酸化剤、非プロトン系有機溶媒、塩基
    及び水を含んでなる、請求項１記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記酸化剤が、四塩化炭素、四臭化炭素、Ｎ−クロロスク
    シンイミド、又はＮ−ブロモスクシンイミドである、請求項１８記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記非プロトン系有機溶媒が、ピリジン、アセトニトリル
    又はジメチルホルムアミドである、請求項１８記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記塩基が、約９〜約１２のｐＫａ値を有する四級アミン
    である、請求項１８記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記四級アミンが、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、ト
    リエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである、請求項２１記
    載の方法。
23. 【請求項２３】 前記酸化性溶液が、四塩化炭素、ピリジン中の４−（ジメ
    チルアミノ）ピリジン、及び水を含んでなる、請求項１８記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記酸化性溶液が、約１８〜約４５％の酸化剤、約２〜約
    １５％の水、約４０〜約８０％の非プロトン系有機溶媒、及び前記非プロトン系
    有機溶媒中に溶解した約０．０１Ｍ〜約０．８Ｍの塩基を含んでなる、請求項１
    ８記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記酸化性溶液が、約２６〜約４０％の酸化剤、約４〜約
    １０％の水、約５０〜約７０％の非プロトン系有機溶媒、及び前記非プロトン系
    有機溶媒中に溶解した約０．０４Ｍ〜約０．４Ｍの塩基を含んでなる、請求項１
    ８記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記酸化性溶液が、約３３％の酸化剤、約７％の水、約６
    ０％の非プロトン系有機溶媒、及び前記非プロトン系有機溶媒中に溶解した約０
    ．０５Ｍ〜約０．２Ｍの塩基を含んでなる、請求項１８記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記酸化性溶液が、酸化剤、前記酸化剤を溶解する溶媒、
    非プロトン系有機溶媒、及び塩基を含んでなる、請求項１記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記塩基が、約９〜約１２のｐＫａ値を有する四級アミン
    である、請求項２７記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記四級アミンが、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、ト
    リエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである、請求項２８記
    載の方法。
30. 【請求項３０】 前記非プロトン系有機溶媒が、ピリジン、アセトニトリル
    又はジメチルホルムアミドである、請求項２７記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記酸化剤を溶解する前記溶媒が二硫化炭素である、請求
    項２７記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記酸化性溶液が、元素状硫黄、二硫化炭素、ピリジン及
    び４−（ジメチルアミノ）ピリジンを含んでなる、請求項２７記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記酸化性溶液が、約１〜約１５％の酸化剤、前記酸化剤
    を溶解する約４０〜約６０％の溶媒、約４０〜約６０％の非プロトン系有機溶媒
    、及び前記非プロトン系有機溶媒中に溶解した約０．０１Ｍ〜約０．８Ｍの塩基
    を含んでなる、請求項２７記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記酸化性溶液が、約１〜約１０％の酸化剤、前記酸化剤
    を溶解する約４０〜約６０％の溶媒、約４０〜約６０％の非プロトン系有機溶媒
    、及び前記非プロトン系有機溶媒中に溶解した約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍの塩基
    を含んでなる、請求項２７記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記酸化性溶液が、約３〜約８％の酸化剤、前記酸化剤を
    溶解する約４０〜約６０％の溶媒、約４０〜約６０％の非プロトン系有機溶媒、
    及び前記非プロトン系有機溶媒中に溶解した約０．０４Ｍ〜約０．１Ｍの塩基を
    含んでなる、請求項２７記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記酸化性溶液が、約５％の元素状硫黄及び約０．１Ｍの
    ４−（ジメチルアミノ）ピリジンを二硫化炭素とピリジンの混合液中に含んでな
    る、請求項２７記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記酸化性溶液が、一級又は二級アミンと酸化剤とを含ん
    でなる、請求項１記載の方法。
38. 【請求項３８】 前記酸化性溶液が、約１〜１０％の前記一級又は二級アミ
    ンと約９０〜９９％の前記酸化剤とを含んでなる、請求項３７記載の方法。
39. 【請求項３９】 前記酸化性溶液が、約２〜５％の前記一級又は二級アミン
    を前記酸化剤中に含んでなる、請求項３７記載の方法。
40. 【請求項４０】 前記酸化性溶液が、約３％の前記一級又は二級アミンを四
    塩化炭素中に含んでなる、請求項３７記載の方法。
41. 【請求項４１】 式： 【化４】 〔式中、 Ｔ₄ は、ヒドロキシル又は保護されたヒドロキシルであり； Ｂｘは、複素環塩基部分であり；そして Ｒ₂ は、式Ｉ又はII： 【化５】 （式中、 Ｅは、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、Ｎ（Ｒ₄)（Ｒ₅)又はＮ＝Ｃ（Ｒ₄)（Ｒ₅)であり； 各々のＲ₄ 及びＲ₅ は、独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、窒素保護基、又
    はＲ₄ 及びＲ₅ が一緒になって窒素保護基であるか、又は、Ｒ₄ 及びＲ₅ は、窒
    素又は酸素からなる群から選択される少なくとも１つの追加のヘテロ原子を含む
    ことができる環構造に接合しており； Ｒ₃ は、ＯＸ、ＳＸ、又はＮ（Ｘ)₂であり； 各々のＸは、独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₈ アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₈ ハロアルキル、
    Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚ
    であり； ＺはＨ又はＣ₁ 〜Ｃ₈ アルキルであり； Ｌ₁ 、Ｌ₂ 及びＬ₃ は、約４〜約７の炭素原子を有するか又は約３〜約６の炭
    素原子を有しかつ少なくとも１つのヘテロ原子を有する環系を含んで成り、前記
    ヘテロ原子が、酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択され、前記環系が、脂肪
    族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和又は不飽和の複素環であり； Ｙは、１〜約１０の炭素原子を有するアルキル又はハロアルキル、２〜約１０
    の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０の炭素原子を有するアルキニル、６
    〜約１４の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ₄)（Ｒ₅)ＯＲ₄ 、ハロ、ＳＲ₄ 又
    はＣＮであり； 各々のｑ₁ は、独立して、２〜１０であり； 各々のｑ₂ は、０又は１であり； ｐは、０〜１０であり；そして ｒは、１〜１０である。 但し、ｐが０であるときｒは１より大きい。） のうちの一方を有する。〕 を有する化合物。
42. 【請求項４２】 Ｒ₂ が２’−置換基である、請求項４１記載の方法。
43. 【請求項４３】 前記２’−置換基が、−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ₃ 、
    −Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−Ｎ（Ｒ₆)（Ｒ₇)、又は−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ ₂ ＣＨ₂ −Ｎ（Ｒ₆)（Ｒ₇)であって、Ｒ₆ 及びＲ₇ の各々が独立してＨ又はＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである、請求項４２記載の方法。
44. 【請求項４４】 各々のＲ₆ 及びＲ₇ が−ＣＨ₃ である、請求項４３記載の
    方法。
45. 【請求項４５】 下式を有するキメラオリゴマー化合物： 【化６】 ５’−Ｎｕ−（Ｌ₄ −Ｎｕ）_Z1−（Ｌ₅ −Ｎｕ）_Z2−（Ｌ₆ −Ｎｕ）_Z3−３’ 〔式中、 各々のＬ₄ 、Ｌ₅ 及びＬ₆ は、独立して、ホスホジエステル、ホスホロチオエ
    ート、ホスホルアミデート又はボラノホスフェートから選択されるヌクレオシド
    間連結であるが、Ｌ₄ とＬ₆ はＬ₅ と異なり、そしてＬ₄ 、Ｌ₅ 及びＬ₆ のうち
    の１つは、ホスホジエステル及びホスホロチオエートより他のものであり； 各々のｚ₁ 、ｚ₂ 及びｚ₃ は、独立して、１より大きな整数であり； 各々のＮｕは、式： 【化７】 （式中、 Ｂｘは、複素環塩基部分であり； 各々のＲ₁ は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、２’
    −置換基又は保護された２’−置換基である。） を有するヌクレオシドであり；そして 前記キメラオリゴマー化合物の前記５’−及び前記３’−末端は、独立して、
    ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、固体支持体への連結、活性化されたホ
    スフェート基、活性化されたホスファイト基、ヌクレオシド間連結を形成するた
    めの反応性基、ヌクレオチド、ヌクレオシド、又はオリゴヌクレオチドである。
    〕
46. 【請求項４６】 各々のＬ₄ 及びＬ₆ が、ホスホルアミデートヌクレオシド
    間連結であり、そして各々のＬ₅ が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結で
    ある、請求項４５記載のキメラオリゴマー化合物。
47. 【請求項４７】 各々のＬ₄ 及びＬ₆ が、ホスホルアミデートヌクレオシド
    間連結であり、そして各々のＬ₅ が、ホスホジエステルヌクレオシド間連結であ
    る、請求項４５記載のキメラオリゴマー化合物。
48. 【請求項４８】 各々のＬ₄ 及びＬ₆ が、ボラノホスフェートヌクレオシド
    間連結であり、そして各々のＬ₅ が、ホスホジエステルヌクレオシド間連結であ
    る、請求項４５記載のキメラオリゴマー化合物。
49. 【請求項４９】 各々のＬ₄ 、Ｌ₅ 及びＬ₆ が、ホスホルアミデート、ホス
    ホロチオエート、又はホスホジエステルヌクレオシド間連結である、請求項４５
    記載のキメラオリゴマー化合物。
50. 【請求項５０】 各々のＲ₁ が、独立して、−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ ₃ 、−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−Ｎ（Ｒ₆)（Ｒ₇)、又は−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−
    ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｎ（Ｒ₆)（Ｒ₇)であって、Ｒ₆ 及びＲ₇ の各々が独立してＨ又は
    Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである、請求項４５記載のキメラオリゴマー化合物。
51. 【請求項５１】 各々のＲ₆ 及びＲ₇ が−ＣＨ₃ である、請求項５０記載の
    方法。
52. 【請求項５２】 式： 【化８】 （式中、 Ｐｇは、酸不安定性ヒドロキシル保護基であり； Ｂｘは、複素環塩基部分であり；そして Ｒ₁ は、２’−置換基又は保護された２’−置換基である。） の化合物。
53. 【請求項５３】 Ｒ₁ が式Ｉ又はII： 【化９】 （式中、 Ｅは、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、Ｎ（Ｒ₄)（Ｒ₅)又はＮ＝Ｃ（Ｒ₄)（Ｒ₅)であり； 各々のＲ₄ 及びＲ₅ は、独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、窒素保護基、又
    はＲ₄ 及びＲ₅ が一緒になって窒素保護基であるか、又は、Ｒ₄ 及びＲ₅ は、窒
    素又は酸素からなる群から選択される少なくとも１つの追加のヘテロ原子を含む
    ことができる環構造に接合しており； Ｒ₃ は、ＯＸ、ＳＸ、又はＮ（Ｘ)₂であり； 各々のＸは、独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₈ アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₈ ハロアルキル、
    Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚ
    であり； ＺはＨ又はＣ₁ 〜Ｃ₈ アルキルであり； Ｌ₁ 、Ｌ₂ 及びＬ₃ は、約４〜約７の炭素原子を有するか又は約３〜約６の炭
    素原子を有しかつ少なくとも１つのヘテロ原子を有する環系を含んで成り、前記
    ヘテロ原子が、酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択され、前記環系が、脂肪
    族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和又は不飽和の複素環であり； Ｙは、１〜約１０の炭素原子を有するアルキル又はハロアルキル、２〜約１０
    の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０の炭素原子を有するアルキニル、６
    〜約１４の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ₄)（Ｒ₅)ＯＲ₄ 、ハロ、ＳＲ₄ 又
    はＣＮであり； 各々のｑ₁ は、独立して、２〜１０であり； 各々のｑ₂ は、０又は１であり； ｐは、０〜１０であり；そして ｒは、１〜１０である。 但し、ｐが０であるときｒは１より大きい。） のうちの一方を有する、請求項５２記載の化合物。
54. 【請求項５４】 Ｒ₁ が−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ₃ である、請求項５
    ２記載の化合物。