JP2002533136A

JP2002533136A - シトクロム発現の遺伝子型決定

Info

Publication number: JP2002533136A
Application number: JP2000591220A
Authority: JP
Inventors: パウルセン，アイメー・デイムフヌ・カトリーヌ; アームストロング，マーテイン
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2002-10-08
Also published as: CN1331756A; GB9828619D0; AU769159B2; AU1878300A; US7060435B1; EP1141398A1; IL143860A0; CA2355658A1; WO2000039332A1; NZ512932A

Abstract

(57)【要約】シトクロムＣＹＰ３Ａ５発現と関連する高いかまたは低い代謝表現型を有する被験体を同定するための方法が開示され、その方法は、ＣＹＰ３Ａ５をコードする配列の転写調節領域内の１個またはそれ以上の多型変異体の存在または不存在に関する該被験体からのゲノムＤＮＡのスクリーニングを含んでなる。スクリーニングを実施するためのオリゴヌクレオチド分子も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、アッセイに関し、そして具体的には、シトクロム発現、この場合に
はＣＹＰ３Ａ５に関連する表現型の予測である多型性の遺伝子型決定にためのア
ッセイに関する。

【０００２】シトクロムＰ４５０サブファミリーＣＹＰ３Ａは、Ｐ４５０スーパーファミリ
ーの最も重要なファミリーの一つであり、治療用化合物の拡大を続ける表の代謝
において主要な役割を有する（２３、２４）。このファミリーは、ヒト肝臓内で
最も多量に発現されるＰ４５０類を含んでなり、そしてジヒドロピリジン、サイ
クロスポリン、エリスロマイシンおよびバルビツールを含む臨床的に使用される
すべての薬剤の５０％以上の代謝に関係している（１）。ＣＹＰ３Ａ５基質の代
謝における大きい個体間変動が認められており、そしてこれはそれぞれの薬剤効
力を決定する因子である。一連の脂肪親和性環境汚染物の代謝に対する証拠も存
在し、これにはこのサブファミリーの成員による前発癌物質、例えばアフラトキ
シンＢ１の活性化が含まれる（２）。

【０００３】現在、人体内で４種のＣＹＰ３ＡｃＤＮＡ、すなわちＣＹＰ３Ａ３、ＣＹＰ
３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５およびＣＹＰ３Ａ７が同定されている。ＣＹＰ３Ａ３はＣ
ＹＰ３Ａ４の対立遺伝子変異体であり、一方ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ７は
、それぞれ成人および胎児肝臓にのみ見いだされると信じられている（３）。初
期の実験は、ＣＹＰ３Ａ４内に多型が存在することを示唆した（４）。しかし、
別の研究は、ＣＹＰ３Ａ４発現における広範な個体間変動は確認したけれども、
当初の二モード性は確認できなかった（５、６）。ＣＹＰ３Ａ５とＣＹＰ３Ａ５
との間の重複した基質特異性は、これらのアイソフォームによる代謝を分離する
ことをこれまで困難としている。その結果、人体内でのＣＹＰ３Ａ５活性におけ
る変動の研究に対して、表現型データはほとんど得られていない。しかし、ＣＹ
Ｐ３Ａ５の多型発現に関する証拠がある。免疫ブロット法およびノーザン分析の
両方の使用は、ヒト肝臓の１０〜３０％のみの内でＣＹＰ３Ａ５発現が検出され
た（７、８、９）。さらに最近では、免疫ブロット法を用いるヒト肝臓３０例の
分析が、３％だけが検出可能なＣＹＰ３Ａ５を示さないで、一方、大多数は痕跡
量を有することを見いだし、この酵素内の多型性が、構造性ではなく調節性では
ないかと示唆する（１０）。ＣＹＰ３Ａ４、３Ａ５および３Ａ７遺伝子からの５
’隣接領域の比較から、すべてのアイソフォームに共通して数種の転写調節因子
に対する推定結合部位が同定された（１１、１２、１３）。しかし、分子ベース
では、もしあったとしても、ＣＹＰ３Ａサブファミリー成員の発現におけるこの
個体間変動は、まだ不明確である。実際、宿主細胞環境は、遺伝子構造よりも大
きい誘導性の決定因子ではないかと示唆されている（１４）。しかし、変異体発
現および活性に対する主要な遺伝子成分の決定は、容易なスクリーニング法と関
連させると、これらのアイソフォームにより代謝される薬剤に対する個別の応答
の予測を提供するだけでなく、ＣＹＰ３Ａ５と疾患経過との間の関連研究を容易
にする点で、高度に有益である。

【０００４】ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ５代謝の記述は、プローブ薬剤としての鎮静薬
ミダゾラム(midazolam) を用いると可能であることが示されている（１５）。こ
の場合に、２種の代謝物、１−ヒドロキシミダゾラム（１−ＯＨＭ）および４−
ヒドロキシミダゾラム（４−ＯＨＭ）が形成される。ＣＹＰ３Ａ４と比較してＣ
ＹＰ３Ａ５を高い割合で含むこれらの試料は、１−ＯＨＭ経路に向けて駆動され
るこれらの代謝を有し、従ってＣＹＰ３Ａ４のみを含むものよりも高い１−ＯＨ
Ｍ／４−ＯＨＭの比率を示す。本発明者は、高いＣＹＰ３Ａ５遺伝子発現および
代謝活性を起こし、推定転写調節領域に位置する２種の多型性がリンクしている
ことをここに証明し、そしてこれらの検出のためのアッセイを開発した。これら
のアッセイは、このアイソフォームによる薬剤代謝への応答における個体間変動
性の予測を可能とし、ならびに疾患関連研究を容易とするであろう。

【０００５】従って、本発明の第一の態様によると、シトクロムＣＹＰ３Ａ５発現と関連す
る高いかまたは低い薬剤代謝表現型を有する被験体を同定する方法であって、転写調節領域、例えばＣＹＰ３Ａ５をコードする領域に隣接するプロモーターま
たはエンハンサー内の多型変異体の、被験体のゲノム内における存在または不存
在に関してスクリーニングすることを含んでなる方法を提供する。好ましくは、
本方法は、該転写領域の転写因子に対する認識領域内、そしてさらに好ましくは
、アクチベータータンパク質−３モチーフまたは基本転写要素内での変異体に関
するスクリーニングを含む。さらに好ましくは、本方法は、隣接領域の配列が図
７に記載されているＣＹＰ３Ａ５をコードする領域に隣接する５’隣接領域のＤ
ＮＡの位置−４７５または−１４７のいずれか一方における変異体、そして好ま
しくは、位置−４７５または−１４７の両者におけるにおける変異体に関するス
クリーニングを含む。

【０００６】本発明の方法の一つの態様において、野生型配列または変異体配列に選択的に
ハイブリダイジングが可能なオリゴヌクレオチド分子を用い、該分子からの増幅
されたＤＮＡの生成が、該野生型または突然変異が存在するかどうかを指示する
ように、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応によりゲノムＤＮＡを増幅する。この
方法において、ＰＣＲプライマーは、突然変異または野生型配列のいずれかにハ
イブリダイジングするが。両方ではない。それぞれのプライマーを用いるそれぞ
れの突然変異または野生型遺伝子型のＤＮＡの増幅は、野生型または突然変異し
たヌクレオチド突然変異の存在の指示を提供する。

【０００７】本発明の別の方法は、関係する部位へのハイブリダイジングに加えて、野生型
配列または多型変異体のいずれかの中に存在しない制限部位の導入が可能なプラ
イマーとしてオリゴヌクレオチド分子を有利に利用する。従って、本発明の別の
態様によると、ＣＹＰ３Ａ５発現と関連する高いかまたは低い薬剤代謝表現型を
有する被験体を同定する方法であって、１）分析する位置において野生型配列お
よび／または多型変異体配列にハイブリダイジングが可能なオリゴヌクレオチド
分子を用いる被験体からのゲノムＤＮＡを増幅し、その分子は野生型または変異
体配列中に存在しない該位置に制限部位を導入できるものでありそして２）段階
１からの増幅されたＤＮＡに、該変異体の存在または不存在の指示である制限消
化を与える制限部位でＤＮＡを開裂する制限酵素を作用させる、段階を含んでな
る方法を提供する。

【０００８】この方法は、好ましくは該調節領域の転写因子のための認識部位内および好ま
しくはアクチベータータンパク質−３モチーフ（ＡＰ−３）および／または基本
転写要素（ＢＴＥ）内のＤＮＡを増幅することを含んでなる。好ましくは、この
方法は、配列が図７に記載されている、ＣＹＰ３Ａ５の調節領域の位置−４７５
または−１４７のいずれかに存在するＤＮＡを増幅することを含んでなる。

【０００９】本発明に従うそれぞれの方法で同定される位置における多型性は、Ｔ_-475→Ｇ
およびＡ_-147→Ｇを含んでなる。下記の実施例中に記載するように、Ａ_-147→Ｇ
における変異を検出するために使用される分子は、野生型Ａヌクレオチドが位置
−１４７に存在する場合にのみ、酵素ＴａｉＩに対する制限部位の導入が可能
である。あるいは、Ｔ_-475→Ｇヌクレオチド変異を検出するために使用される分
子は、野生型Ｔヌクレオチドが位置−４７５に存在する場合にのみ、酵素Ａｌｕ
Ｉに対する制限部位の導入が可能である。

【００１０】この態様において、適当なプライマーの例は、３Ａ５Ｆ１ＧＧＧＴＣＴＧＴＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣおよび３Ａ５Ｆ２（ＧＧＧＧＴＣＴＧＴＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣ）および３Ａ５Ｒ１（ＴＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＣＧ）のいずれかである。

【００１１】オリゴヌクレオチドミスマッチプライマー３Ａ５Ｒ１を用いると、野生型Ａヌ
クレオチドが位置−１４７に存在する場合にのみ、ＴａｉＩ認識部位を創製す
る。ＴａｉＩを用いる３６９ｂｐ産生物の消化は、野生型配列に対して３４９
および２０ｂｐの断片を生成し、一方突然変異体、例えばＧヌクレオチドが存在
すると、産生物は未消化のままで残る（図２）。同様に、Ｔ_-475Ｇ突然変異の検
出のためには、第二のオリゴヌクレオチドミスマッチプライマー３ＡＦ２を用い
るとよい。このプライマーは、野生型Ｔが位置−４７５に存在する場合には制限
酵素ＡｌｕＩに対する認識部位を導入し、産生物を３１８、３３および１８ｂ
ｐの断片を生成して消化する。この部位は、突然変異体Ｇヌクレオチドが存在す
る場合には消失し、３３６および３３ｂｐの消化産物を生成する（図３）。

【００１２】単一ヌクレオチド多型性の評価のための既知の方法（シェーファー、Ａ．Ｊ．
およびホーキンス、Ｊ．Ｒ．(Schafer A.G. and Hawkins, J.R., Nature Biotec
hnology, Vol 16, pp33-39 (1998))の総説参照）は、質量分光測定、特にはマト
リックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分光測定（ＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ−ＭＳ、ロスキー、Ｍ．Ｔ．ら(Rosky, M.T. et al., 1996, PNAS USA, 93:
4724-4729) 参照）、単一ヌクレオチドプライマーエキステンション（シューメ
ーカー、Ｊ．Ｍ．ら(Shumaker, J.M. et al., 1996, Hum. Mutat., 7:346-354)
、パスチネンＴ．ら(Pastinen, T. et al., 1997, Genome Res., 7: 606-614)）
およびＤＮＡチップまたはマイクロアレー（アンダーヒル、Ｐ．Ａ．ら(Underhi
ll, P.A. et al., 1996, PNAS USA, 93: 196-200) 、ジルズ、Ｐ．Ｎ．ら(Gille
s, P.N. et al., Nat. Biotech., 1999, 17: 365-370) ）を含む。ＤＮＡチップ
またはマイクロアレーの使用は、単一個体内の多数の異なる多型座における同時
遺伝子型決定または複数個体における単一多型座の同時遺伝子型決定を可能とす
るであろう。

【００１３】上記に加えて、ＳＮＰは一般にＰＣＲ−ＳＳＣＰに基づく方法、例えば対立遺
伝子特異性プライマーを用いるＰＣＲ−ＳＳＰを用いて評価される（バンス(Bun
ce, 1995) により記述）。ＳＮＰが制限部位の廃止または創製をもたらす場合に
は、遺伝子型決定は多型部位に存在する非対立遺伝子特異性プライマーを用いる
ＰＣＲを行い、そして得られたＰＣＲ産物を適当な制限酵素を用いて消化して行
うことができる。多型性評価のための既知の技術は、一般に適用できるものであ
り、従って、当該技術分野の熟練者には、既知技術が、ＣＹＰ３Ａ５の調節領
域内の単一ヌクレオチド多型性の評価のために適用できることは容易に分かるで
あろう。

【００１４】技術分野の熟練者には容易に分かるように、遺伝子型決定は、一般に、試験す
る被験体から得た適当な組織試料から調製したゲノムＤＮＡに関して行われる。
最も好ましくは、ゲノムＤＮＡは、当該技術分野ではよく知られている標準方法
に従って、血液試料から調製される。

【００１５】本発明により、高いかまたは低い薬剤代謝表現型に関連するシトクロムＣＹＰ
３Ａ５をコードする配列に隣接する５’調節領域内の多型変異体を検出するため
に少なくとも１０個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが提供される
。オリゴヌクレオチドは、突然変異または野生型ヌクレオチドのいずれかを含む
領域に対して該隣接領域の位置−４７５または−１４７において、多型変異体が
該位置のいずれかでおきているかどうかに従って、該位置の増幅が該プライマー
から進行するか進行しないように、ハイブリダイジングが可能である。

【００１６】本発明のオリゴヌクレオチド分子は、好ましくは長さ１０〜５０ヌクレオチド
であり、さらに好ましくは長さ２０〜３０ヌクレオチドであり、そしてＤＮＡ、
ＲＮＡもしくは合成核酸であってもよく、そして化学的または生化学的に変性さ
れてもよく、または非天然性もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んで
もよく、これは当該技術分野の熟練者には容易に認められる。可能な変性は、例
えば、同位体または非同位体ラベルの付加、１個またはそれ以上の天然に存在す
るヌクレオチド塩基の類似体を用いる置換、ヌクレオチド間の変性、例えば非荷
電リンケージ（例えばメチルホスホネート、ホスホアミデート、カルバメートな
ど）または荷電リンケージ（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート
など）を含む。指定の配列に結合して安定なハイブリッドを形成する能力に関し
てポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。このような分子は、当該技
術分野では既知であり、例えばペプチドリンケージが分子の骨格内のリン酸結合
の置換を連結するいわゆるペプチド核酸（ＰＮＡ）である。本発明に従うオリゴ
ヌクレオチド分子は、当該技術分野ではよく知られている技術、例えば化学合成
または組換え手段により製造してもよい。

【００１７】本発明のオリゴヌクレオチド分子は、二本鎖でも一本鎖であってもよいが、し
かし、好ましくは一本鎖であり、その場合には、これらはＣＹＰ３Ａ５の５’調
節領域のセンスストランドまたはアンチセンスストランドに相当してもよい。オ
リゴヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡ合成／ＤＮＡ増幅を開始するためのプロ
ーブとしてまたはプライマーとして使用してもよい。これらは、ＣＹＰ３Ａ５の
調節領域の１個またはそれ以上の変異体対立遺伝子の存在を検出するための診断
キットなどに使用してもよい。これらの試験は、一般に、プローブを試験核酸の
試料（通常ゲノムＤＮＡ）とハイブリダイジング条件下で接触させ、そしてプロ
ーブと試料中の相補核酸の間のあらゆる二倍体または三倍体の存在を検出するこ
とを含んでなる。プローブは、固体の支持体に固定されてもよく、これらの使用
はこれらの変異体の検出における使用を容易にする。好ましくは、これらは、目
標核酸の単一試料に複数のプローブを同時にハイブリダイズできるようにアレイ
上に存在する。プローブは、アレイ上にスポットするかまたはアレイ上のその場
で合成してもよい（ロックハートら(Lockhart et al., Nature Biotechnology,
vol. 14, December 1996, "Expression monitoring by hybridisation to high
density oligonucleotide arrays")参照）。アレイ１個で、１００、５００さら
には１，０００個以上の異なるプローブを隔離した位置で含むことができる。好
ましくは、オリゴヌクレオチドは、本明細書で定義したプライマー３Ａ５Ｆ１、
３Ａ５Ｆ２および３Ａ５Ｒ１のいずれかを含んでなる。

【００１８】本発明に従う方法を実施するためのキットも提供される。好ましくは、キット
は、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドを含んでなり、そしてさらに好まし
いキットは、本明細書中で定義したように野生型または多型変異体の間の区別が
可能な１種またはそれ以上の制限酵素を含んでなる。好ましくは、制限酵素はＴ
ａｉＩまたはＡｌｕＩを含んでなる。

【００１９】本発明の別の態様によると、試験化合物、例えばＣＹＰ３Ａ５により代謝され
た薬剤、トキシンまたは前発癌物質の毒性または突然変異誘発性作用を同定する
方法も提供し、その方法は、シトクロムＣＹＰ３Ａ５発現に関連して高い薬剤代
謝表現型を有する細胞および低い薬剤代謝表現型を有する細胞のそれぞれを該試
験化合物と接触させ、そして高いかまたは低い薬剤代謝表現型の該細胞または該
化合物に対して感受性の他の細胞のそれぞれに対する該化合物の作用を同定する
ことを含んでなる。さらに好ましい態様は、ＣＹＰ３Ａ５により代謝された環境
トキシンまたは前発癌物質と関連する疾患に対する個体の感受性を診断する方法
を含んでなり、その方法は、１）ＤＮＡを含む試料を調製し、そして２）該調節
部位内のヌクレオチドの存在または不存在の区別が可能な試薬を用いてＣＹＰ３
Ａ５をコードするＤＮＡ配列に隣接する転写調節領域内の突然変異の存在または
不存在を同定する段階を含んでなる。本発明のこの態様によると、突然変異は、
該調節領域の転写因子に対する認識領域内、そして好ましくはアクチベータータ
ンパク質−３モチーフ（ＡＰ−３）および／または基本転写要素（ＢＴＥ）内に
起きる。好ましくは、突然変異は、調節領域の位置−４７５および−１４７のい
ずれかで起き、そしてさらに好ましくは突然変異がＴ_-475ＧまたはＡ_-147Ｇであ
ってもよい両方の位置で起きる。

【００２０】好ましくは、５’隣接領域の調節領域は、それぞれの多型変異体を含む５’領
域に結合する転写因子を同定または精製するために使用できることも意図する。
従って、本発明の別の態様によると、シトクロムＣＹＰ３Ａ５をコードする転写
調節領域隣接ＤＮＡからのＤＮＡ断片に結合が可能な転写因子を同定する方法を
提供し、該方法は、該転写調節領域を含む該ＤＮＡ断片を、可能性がある転写因
子と接触させ、そして該ＤＮＡ断片に複合したあらゆる転写因子を同定すること
を含んでなる。

【００２１】転写調節断片を使用して、ＣＹＰ３Ａ５の転写調節領域への作用を現すかまた
は及ぼす化合物または薬剤を同定することが可能である。従って、本発明のこの
態様に従って、ＣＹＰ３Ａ５をコードするＤＮＡ配列に隣接する転写調節領域に
対して作用する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、該調節領域の配列
を含んでなり、そしてその調節領域はレポーター分子をコードする配列に操作的
にリンクしているＤＮＡ構築物を用いて細胞を形質転換し、該細胞を試験化合物
と接触させ、そして該レポーター分子のあらゆる発現を同定することを含んでな
る。好ましくは、該細胞は、ＣＹＰ３Ａ５を発現するかまたはＣＹＰ３Ａ５活性
を示す。

【００２２】シトクロムＣＹＰ３Ａ５をコードするＤＮＡ配列に隣接する転写調節領域から
のＤＮＡに結合が可能な試料からの転写因子の精製の方法も本発明により提供さ
れ、その方法は、該転写調節領域を含むＤＮＡ配列を転写因子の混合物と接触さ
せ、そして該転写因子および該断片のあらゆる複合体を同定することを含んでな
る。

【００２３】本発明のさらに別の態様は、シトクロムＣＹＰ３Ａ５をコードするＤＮＡに隣
接する転写調節領域の活性の程度を与える方法または代わりに転写調節領域の活
性を改変する突然変異を同定する方法も含んでなり、その方法は、該調節領域を
含んでなるＤＮＡ断片に操作的にリンクするレポーター分子をコードする配列を
有するＤＮＡ構築物を調製し、そして該構築物を細胞内に導入し、そして該レポ
ーター分子の発現のレベルを測定することを含んでなる。転写調節制御領域の活
性を改変する変異体を同定するためにこの方法を使用する場合には、この方法は
、本明細書中に記載の野生型および多型調節領域の発現のレベルを比較する段階
をさらに含んでもよい。

【００２４】本発明の態様のそれぞれに従って、調節領域は、多型変異体を、好ましくは該
調節領域の転写因子に対する認識部位内、そして好ましくはアクチベータータン
パク質−３モチーフ（ＡＰ−３）および／または基本転写要素（ＢＴＥ）内に含
む。好ましい態様においては、変異は、ＣＹＰ３Ａ５をコードする配列に隣接す
る領域の位置−４７５または−１４７において起き、そしてその領域は図７に記
載してある。好ましくは、両方の変異体が存在する。

【００２５】本発明の方法は、薬剤を用いる処置の前に、薬剤が患者により有効に代謝され
るかどうかを確定するために特に価値がある。

【００２６】本発明は、添付の図面を参考にして下記の実施例によりさらに詳細に説明され
る。

【００２７】

【実験方法】

肝臓ミクロソーム調製ヒト肝臓試料を腎臓移植ドナーから入手し、そして摘出の後直ちにフラッシュ
冷凍した。ヒト肝臓ミクロソームは、以前に記載したプロトコール（２１）に従
って調製し、タンパク質含有量をミラー(Miller)により改正されたロウリー(Low
ry) の方法により測定した（２２）。ミダゾラム水酸化酵素アッセイミダゾラム総括代謝および１−および４−ＯＨ−ミダゾラムの形成の速度を以
下のようにして測定した。それぞれのインキュベーション容器は、１．１５％Ｋ
Ｃｌ−０．０１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７．４、ミダゾラム最終濃度６０μＭに達
するようにＤＭＳＯ中に溶かした６ｍＭミダゾラムのストック溶液１０μｌ、グ
ルコース−６−リン酸０．５ｍｇを含む補因子混合物５００μｌ、ＭｇＣｌ₂ ・
６Ｈ₂ Ｏ０．５ｍｇ、０．５ＭＮａ−Ｋ−リン酸塩緩衝液ｐＨ７．４および
１．１５％ＫＣｌ−０．０１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７．４中に溶かしたグルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素０．５単位中、インキュベーション体積０．９ｍｌと
したミクロソーム懸濁液（ミクロソームタンパク質１ｍｇを含む）のアリコート
試料を含んでいた。５分間、３７℃で予備インキュベーションした後、１．２５
ｍｇ／ｍｌＮＡＤＰ溶液１００μｌを加えて最終濃度０．１２５ｍｇ／ｍｌとし
てインキュベーションを開始した。ヘト(Heto)振とう水浴中で１００回振動/ 分
で試験管を連続的に振とうした。煮沸したミクロソームを用いたブランクインキ
ュベーション物を対照インキュベーション物と同じ条件下でインキュベーション
した。３０分後に試験管をドライアイス中に浸漬してインキュベーションを停止
した。分析するまで試料を≦−１８℃で保管した。インキュベーション試料を不
変のミダゾラムおよびその代謝物である１’−および４−ヒドロキシミダゾラム
に対して、ＵＶ検出を用いるＨＰＬＣにより分析した。ミダゾラム代謝物のＨＰＬＣ測定ミダゾラムの試料１−ｍｌを解凍しそして１ｍｌＤＭＳＯを用いて薄めた。
試料を１０分間超音波処理、遠心分離および上清のアリコート試料をＨＰＬＣカ
ラムに直接注入した。ＨＰＬＣ装置は、ウオーターズ(Waters)６００ＭＳポンプ
から成っていた。ＷＩＳＰ７１７プラス自動注入装置を用いて、試料を自動的に
注入した。ステンレス鋼カラム（３０ｃｍｘ４．６ｍｍ内径）にクロマジル
(Kromasill) １８（５μｍ）結合相をバランス密度スラリー法（ハスケル(Haske
l)ＤＳＴＶ１２２−Ｃポンプ、１０⁷ Ｐａ）により充填した。２３０ｎｍにおけ
るＵＶ検出は、ウオーターズ９９６ダイオードアレー検出器を用いて行った。１
−ｍｌ／分の溶出が、１００％０．１ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．０（溶剤系
Ａ）から溶剤系Ａの５０％と１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．０、メタノールお
よびアセトニトリル（１０／４５／４５）とを含む溶剤系Ｂの５０％までの短い
グラジエントの１分間で開始し、次いで１００％溶剤系Ｂの第二グラジエント１
５分を行った。この溶剤組成を２分間、開始条件と平衡に達するまで維持した。
ミダゾラム代謝物の本体は、質量分光測定を用いて確認した。ＵＶピーク面積の
ｎｇへの換算は、ミレニアム(Millenium) ２０２０ＣＤＳシステムによりミダゾ
ラムの校正曲線に基づいて行った。この校正曲線は、既知量の薬剤（０、１０５
９、２１１７、３１７６および５０２８ｎｇ）を注入し、相当するＵＶピーク面
積の線型（１／ｘで加重）回帰分析して作製した。校正曲線の式は、ｎｇ＝０．
０００３３３ｘ面積（ｒ² ＝０．９９９７、ｎ＝５）であった。代謝活性は、ｐ
ｍｏｌ（形成代謝物）／分・ｍｇ（タンパク質）として表し、そして代謝比は、
各試料について、各試料内の１−ＯＨＭ／４−ＯＨＭの比に従って決定した。ゲノムＤＮＡ調製ＱＩＡｍｐ組織キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、製造者の指示に従って冷凍肝
臓試料からＤＮＡを単離した。ＲＮＡ調製ＱＩＡＧＥＮＲＮＡｅａｓｙＭｉｄｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、製
造者の指示に従って肝臓試料からＲＮＡを単離した。ＲＮＡの２０μｇをＲＮＡ
ｓｅを含まないＤＮＡｓｅＩ（ベーリンガー・マンハイム(Behringer Mannhei
m)）を用いて、３０分間、３７℃で、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１
００ｍＭＭｇＣｌ₂ 中で処理した。試料をフェノール／クロロホルム抽出、沈
降しそしてＴＥ緩衝液３０μｌ中に再懸濁した。処理した試料２．５μｇを５０
分間、４２℃で、１ｘ第一ストランド緩衝液(first strand buffer) 、０．０１
ＭＤＴＴおよび０．５ＭｄＮＴＰ中、オリゴ（ｄｔ）ランダムプライマー０
．５μｇおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ジブコ(Gibco) ＢＲＬ
）２００単位を用い、ＡＢＩプリズム(Prism) ７７００配列検出システム（ＳＤ
Ｓ）に使用するために逆転写した。ＣＹＰ３Ａ５５’隣接領域の配列決定ＣＹＰ３Ａ５の１３４３ｂｐ５’隣接領域を、肝臓試料から単離したゲノムＤ
ＮＡから、ジュナイディら(Jounaidi et al.,)（１１）の公開された配列に基づ
いて、プライマー３Ａ５１（５’−ＧＧＡＡＧＣＡＡＣＣＴＡＣＡＴＧＴＣＣＡ
ＴＣ）および３Ａ５２（５’−ＡＴＣＧＣＣＡＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣ）を用
いて増幅した。ＰＣＲ条件は、１分間９５℃の１サイクル、１分間９５℃、３０
秒間５７℃、２．５分間７２℃の３０サイクルおよび、１０分間７２℃の１サイ
クルであった。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥ
Ｎ）を用いて精製し、配列決定プライマーを設計し（表１）、そしてＡＢＩＢ
ｉｇＤｙｅターミネーター・サイクル・配列決定キット（パーキン・エルマー(P
erkin Elmer)）を用いるサイクル配列決定によりセンスおよびアンチセンススト
ランドの両者でＰＣＲ産物を直接配列決定するために使用した。配列決定反応産
物を、ＡＢＩ３７７自動化配列決定装置を用いて分析した。コンティグ配列を対
比配列(align) し、配列エディター・バージョン１．０．３ソフトウエア・パッ
ケージ（パーキン・エルマー）を用いて比較し、そして異型接合位置の同定のた
めに手作業で編集した。Ａ_-147ＧおよびＴ_-475Ｇ突然変異に対するＰＣＲ検出アッセイすべてのＰＣＲアッセイは、初めの３Ａ５１／３Ａ５２ＰＣＲ産物の１：１０
０希釈物を鋳型として用い、下記の条件下：１分間９５℃の１サイクル、１分間
９５℃、３０秒間５５℃、１分間７２℃の３０サイクル、および１０分間７２℃
の最終１サイクルで行った。すべての産物を配列決定して、ＣＹＰ３Ａ５として
の産物の本体を確認した。アッセイに使用したオリゴヌクレオチドミスマッチド
プライマーは：３Ａ５Ｆ１（５’−ＧＧＧＴＣＴＧＴＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣ），
３Ａ５Ｆ２（５’−ＧＧＧＧＴＣＴＧＴＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣ）、および３Ａ５
Ｒ１（５’−ＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＣＧ）であり、ミスマッチ
の位置に下線を付けた。

【００２８】Ａ_-147Ｇ突然変異に対して、プライマー対３Ａ５Ｆ２および３Ａ５Ｒ１を用い
てＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物２０μｌを最短で３時間、６５℃において、Ｔａ
ｉＩの１５単位を用いて消化し、そして制限断片を１．５％アガロースゲル上
の電気泳動の後、臭化エチジウム染色により可視化した。

【００２９】Ｔ_-475Ｇ突然変異に対して、上記と同様のプライマー対３Ａ５Ｆ２および３Ａ
５Ｒ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物２０μｌを最短で３時間、Ａｌｕ
Ｉの１５単位を用いて消化し、そして制限断片をファルマシアマルティファー(P
harmacia Multiphor) 電気泳動システム（ファルマシア）において、１２．５％
ＥｘｃｅｌＧｅｌ上の電気泳動により分離した。断片を、ヘッファー(Hoeffer)
自動ゲル染色装置（ファルマシア）中で銀染色して可視化した。

【００３０】同じ染色体上の突然変異の存在の検出のために、プライマー３Ａ５Ｆ１および
３Ａ５Ｒ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物２０μｌを最短で３時間、６５
℃において、ＭｖｎＩの１５単位を用いて消化し、そして得られた制限断片を
１．５％アガロースゲル上の電気泳動の後、臭化エチジウム染色により可視化し
た。相対定量およびＣＹＰ３Ａ５ＲＮＡの比較ＣＹＰ３Ａ５ｍＲＮＡの相対レベルは、ＡＢＩ７７００ＳＤＳ（パーキン・
エルマー）を用いて実時間ＰＣＲにより測定した。ＣＹＰ３Ａ５の検出のための
最適プライマーおよびプローブは、プライマーエクスプレス(PeimerExpress) プ
ログラムを用いて設計し、次いでＣＹＰ３Ａ５に対する特異性を確認するために
検査した。定量ＰＣＲに用いたプライマーは下記であった：正方向−５’−ＡＡ
ＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣ−３’、逆方向−５’−ＧＡＧＧＡＧＣ
ＡＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣＡ−３’。ＴａｑＭａｎプローブを５’レポーター染料
６−カルボキシ−フルレシン(flouresine)（ＦＡＭ）を用いて標識し、そして配
列５’−ＣＡＡＡＴＴＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣ−３’を有してい
た。最適のプライマー／プローブ比率および濃度を決定し、そしてＡＢＩ７７０
０標準検出システムに対する標準プロトコールに従って実験を行った。すべての
試料に対するＣＹＰ３Ａ５ｍＲＮＡ発現をβ−アクチンｍＲＮＡの発現に対して
正規化した。閾サイクル（Ｃｔ）は、ＰＣＲ産物の線型増幅に関連する蛍光信号
の増加の検出をＡＢＩ７７００が開始した時のＰＣＲサイクル数である。Ｃｔ値
は、鋳型コピーの初期量に依存する。各試料内のＣＹＰ３Ａ５の量は、各試料３
回の別々のＰＣＲ反応からのＣｔを平均して決定した。試料間のＣｔの相対差異
は、各試料のＣｔを試料内の最高Ｃｔ（最低発現）から差し引いて算出した。Ｐ
ＣＲ産物の量はＰＣＲの線型範囲内のサイクル毎に２倍となるので、Ｃｔにおけ
る差異は、２^δctを算出して試料間のｍＲＮＡ量の推定差異に変換し、ここで、
δｃｔは、２個の試料間のサイクル閾値の差である。

【００３１】各実験において負の対照を行い、ＤＮＡ汚染による信号がないことを確認した
。対照試料は、逆転写酵素を加えなかったことを除いて、定量ＰＣＲと正確に同
様処置したＲＮＡ試料から成っていた。統計解析統計解析は、ＪＭＰ統計プログラムバージョン３．２．２（ＳＡＳインステ
ィチュート社(SAS Institute Inc.)）に基づいて行った。代謝比およびＣＹＰ３
Ａ５ｍＲＮＡ発現データを、これらが正規分布への適合を確認するために検査し
た。ＣＹＰ３Ａ５ｍＲＮＡ発現データは正規分布に適合しなかったので対数変換
し、これによりデータは正規分布となった。代謝比および発現レベルは、ｔ−検
定を用いて群間で比較した。ウエスタンブロット分析各肝臓から調製したミクロソームタンパク質４０μｇを同体積のレムリ(Laemm
li) 試料緩衝液（バイオラッド(Biorad)）中で、１０分間の冷凍および煮沸の４
サイクルにより可溶化した。試料をプレキャスト１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ既製ゲ
ル（バイオラッド）上に加え、そして１時間、１８０Ｖで電気泳動した。分離さ
れたタンパク質を、トランスブロット(Trans-blot)ＳＤ装置（バイオラッド）を
用いてハイボンド(Hybond)−Ｐ膜（アマーシャム(Amersham)）上に移した。膜を
一晩、５％（ｗ：ｖ）脱脂牛乳および０．１％（ｖ：ｖ）トウイーン(Tween) を
含む１ｘＰＢＳ中、４℃でインキュベーションしてブロックした。膜を室温で１
時間、１ＸＰＢＳ、２．５％脱脂牛乳中の特異性ヒトＣＹＰ３Ａ５抗体（ジェ
ンテスト(Gentest) ）の１：３０００希釈物中でインキュベーションし、次いで
、１ＸＰＢＳ、２．５％脱脂牛乳、０．１％（ｖ：ｖ）トウイーン中で４回リ
ンスした。膜を室温で１時間、１ＸＰＢＳ、２．５％（ｗ：ｖ）脱脂牛乳中の
抗−ラビットＩｇＧペルオキシダーゼ複合体（シグマ(Sigma) ）の１：５０００
希釈物中でインキュベーションし、前と同様にリンスした。膜をＥＣＬプラス・
ウエスタンブロット検出システム（アマーシャム）を用い、製造者の指示に従っ
て展開し、そしてコダック(Kodak) Ｘ−Ｏｍａｔフィルムを用いてオートラジオ
グラフにより可視化した。実施例１ミダゾラム表現型決定肝臓試料３９個のパネルを、活性のマーカーとしてミダゾラムのその１−ＯＨ
代謝物への代謝を用いて、ＣＹＰ３Ａ５活性に関して表現型決定した。ＣＹＰ３
Ａ４の他にＣＹＰ３Ａ５を含むヒト肝臓ミクロソーム試料は、ＣＹＰ３Ａ４のみ
を含む試料と比較して、著しく大きい１−ＯＨＭ／４−ＯＨＭ比を示す。５〜９
の間の１−ＯＨＭ／４−ＯＨＭ比が、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５の両方を含む
ミクロソームについて得られた。ＣＹＰ３Ａ４のみを含む試料は、１−ＯＨＭ／
４−ＯＨＭ比＜４を示した（１５）。我々のデータの組内のＣＹＰ３Ａ５表現型
の分析は、明瞭な二モード分布を示し、試料６個（１５％）は５以上の代謝比を
有し、残りの試料は１．５〜３．５の間の代謝比を有していた（図１ａ参照）。
代謝分析のためにミクロソームを調製した肝臓試料３９個から、２６個の完全な
ＤＮＡおよびＲＮＡ分析のために十分な組織が得られ、これには高い方の代謝範
囲に属する試料６個が含まれていた。これらの試料２６個の他に、タンパク質分
析のためのミクロソームが別の試料３個から得られ、そのすべては代謝比＜４を
有していた。ＣＹＰ３Ａ５遺伝子５’隣接領域の分析ＣＹＰ３Ａ５の５’隣接領域を、試料２６個すべてのゲノムＤＮＡからＰＣＲ
増幅し、そして完全に配列決定し、これを図７に示す。対比配列すると、領域が
良く保存されていることを示した。少数の個体間変動だけが、公開された配列か
らのいくらかの変動と同時に同定された（表２）。検出されたすべての変異体は
異型接合性であり、そしてさらに頻度が高いＡ_-147Ｇ突然変異に対して異型接合
性のすべての試料は、Ｔ_-475Ｇ突然変異に対しても異型接合性であり、２種の突
然変異がリンクしていることを示唆している。これら２個の突然変異は、二つの
別々の推定調節要素、すなわち基本転写要素（ＢＴＥ：Ａ_-147Ｇ）およびアクチ
ベータータンパク質−３モチーフ（ＡＰ−３：Ｔ_-475Ｇ）内にある。残りの変異
体で推定調節ドメイン内にあるものはない。

【００３２】ＰＣＲアッセイが、Ａ_-147ＧおよびＴ_-475Ｇ突然変異の存在を個別に確認する
ため、および２種の突然変異が同じかまたは異なる染色体上にあるかどうかを確
認するために開発された。Ａ_-147Ｇ突然変異に対するＰＣＲアッセイは、オリゴ
ヌクレオチドミスマッチプライマー（３Ａ５Ｒ１）を用いることによる制限酵素
ＴａｉＩのための認識部位の創製に基づいていた。このプライマーは、野生型
”Ａ”ヌクレオチドが位置−１４７に存在する場合にのみＴａｉＩ認識部位を
導入する。ＴａｉＩを用いた３６９ｂｐ産物の消化は、野生型配列に対して３
４９および２０ｂｐの断片を生成し、一方、突然変異”Ｇ”ヌクレオチドが存在
すると、産物は消化されないままで残る（図２）。同様に、Ｔ_-475Ｇ突然変異の
検出に対しては、第二のオリゴヌクレオチドミスマッチプライマー（３Ａ５Ｆ２
）を用いた。このプライマーは、野生型Ｔヌクレオチドが位置−４７５に存在す
る場合に制限酵素ＡｌｕＩに対する認識部位を導入し、産物を消化して３１８
、３３および１８ｂｐの断片を生成する。この部位は、突然変異Ｇヌクレオチド
が存在する場合には消失し、３３６および３３ｂｐの消化生成物を生成する（図
３）。

【００３３】突然変異が同じ染色体上に存在するかどうかを決定するために、２種のオリゴ
ヌクレオチドミスマッチプライマー（３Ａ５Ｆ１および３Ａ５Ｒ１）を用いるＰ
ＣＲアッセイを開発し、両方のプライマーは、突然変異ヌクレオチドが位置−１
４７および−４７５に存在する場合には、制限酵素ＭｖｎＩに対する認識部位
を導入する。突然変異が異なる染色体上に存在する場合には、始めの３６９ｂｐ
生成物が消化されて３４９／３５０ｂｐおよび２０／１９ｂｐの生成物（ゲル電
気泳動では分離できない）を生成して消化し、一方、同じ染色体上に存在すると
、断片は消化されて３３０および２０／１９ｂｐの生成物を生成する（データは
記載せず）。配列決定により決定された試料の個別の遺伝子型の確認に加えて、
２種の突然変異はすべての場合に染色体上でリンクしていた（データは記載せず
）。ＣＹＰ３Ａ５対立遺伝子変異体、ＣＹＰ３Ａ５媒介代謝、ＣＹＰ３Ａ５ｍＲＮＡ
およびタンパク質発現の間の関係試料を遺伝子型：「野生型」または「突然変異体」（リンクした多型を含む）
に応じて群分けし、そして１−ＯＨＭ／４−ＯＨＭ代謝比（ｍｒ）を群間で比較
した（図４ａ）。１例のアウトライアー(outlier) （肝臓試料番号ｍｒ＝２．０
８）を除いて、リンクした突然変異を有するすべての個体は、５．０を越える代
謝比を有し、一方、野生型群はすべて３．５未満の代謝比を有していた。突然変
異群に対する平均代謝比は、野生型群からのものより著しく高かった（６．０±
２．０対２．７±０．４２、平均±標準偏差、ｐ＜０．００１）。

【００３４】５’隣接領域中の突然変異が遺伝子発現に影響するかどうかを確認するために
、定量ＰＣＲを使用した。ｍＲＮＡレベルは、代謝データより大きい変動を示し
たが、ある程度の二モード性が観察された（図１ｂ）。突然変異群は、発現範囲
の高い方に偏ったＣＹＰ３Ａ５ｍＲＮＡレベルを有し、野生型よりも著しく高い
ＣＹＰ３Ａ５ｍＲＮＡのレベルを示した（平均ｌｎＣｔ＝４．０３、標準偏差＝
０．９７、これに対して平均ｌｎＣｔ＝２．０６、標準偏差＝１．２、ｐ＜０．
００６）（図４ｂ）。この場合に、アウトライアー（突然変異遺伝子型を示すが
、野生型代謝比である）も、発現の低い方の範囲内のあった（ｌｎＣｔ＝２．９
）。

【００３５】ＣＹＰ３Ａ５タンパク質発現レベルのレベルは、ＣＹＰ３Ａ５特異性抗体を用
いるウエスタンブロット分析により、肝臓試料２９個に関して測定した。ＣＹＰ
３Ａ５に相当する５２ｋＤａの単一バンドが一部の試料で明瞭に現れた。高い発
現遺伝子型（突然変異）および低い代謝比表現型（野生型）を有する１個のアウ
トライアーを例外として、高い発現遺伝子型、高い代謝比および高いＲＮＡ発現
レベルを有するすべての試料は、低い発現遺伝子型および表現型の試料と比較す
ると、明らかに高いＣＹＰ３Ａ５発現レベルを示す（図５）。高い発現遺伝子型
であるがしかし低い発現表現型を有するアウトライアー１個は、低い発現遺伝子
型群中のものと同様のＣＹＰ３Ａ５発現のレベルを示した。ウエスタンブロット
法への長い暴露は、著しく低いＣＹＰ３Ａ５発現レベルが、大部分の試料中で明
らかなことを示した（データは記載せず）。

【００３６】本研究で得られたＣＹＰ３Ａ５の５’隣接領域は、本質的にジュナイディら（
１１）が公開したものと本質的に同等であり、そして配列においてほとんど個体
間変動を示さない。興味あることに、ジュナイディらは、２種のヒトゲノムクロ
ーンを配列決定し、その一つは、本報告に詳細に記載した２個のリンクした突然
変異を含んでいた。これは、１個のクローンが低い発現群内の個体から誘導され
、そして他方が高い発現／代謝群から誘導されたことを示唆する。

【００３７】以前の研究は、ＣＹＰ３Ａ５が肝臓の１０〜３０％内で発現されることを示唆
し（７、８、９）、一方他の研究は一部の発現はすべての試料において構成的で
あると述べている（１０）。本研究は、一部のＣＹＰ３Ａ５発現は構成的であり
、一方いくらかの代謝活性を有し、同時にｍＲＮＡが研究したすべての肝臓中で
検出されることを支持するが、しかし必要な手順を用いるとＣＹＰ３Ａ５タンパ
ク質はすべての試料中で確信できるほどには証明されない。我々は、組織が入手
できた試料の２３％内で増強されたＲＮＡおよびタンパク質発現を検出し（２６
例中６例）、これは以前の研究で発現を示した肝臓の割合に近い。これは、低い
レベルの発現を示す一部のものはすべての肝臓試料において構成的であるという
ブービズら(Boobis et al)（１０）の知見を支持するが、しかしこれはさらに敏
感な検出技術（例えばＰＣＲ、そしてウエスタンまたはノーザンブロット分析法
ではない）を用いてのみ検出できる。

【００３８】検出された両方の多型は推定転写調節要素内に存在するが、我々はＢＴＥ内の
変異体は改変された発現に関与する可能性が高いと考え、それは、ＴＡＴＡボッ
クスに隣接するＢＴＥがＣＹＰ１Ａ１の構成的発現を説明し、そして同様の領域
がＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｂ２、ＣＹＰ２Ｅ１（１６）、ＣＹＰ３Ａ４（１３）
およびＣＹＰ３Ａ７（１２）を含む他のＣＹＰ遺伝子内に見いだされているから
である。ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の場合に、この要素は核抽出物（１３）およびＣＹ
Ｐ３Ａ７に対する基本転写要素結合因子（１２）に結合することが示され、シト
クロムＰ４５０発現の一般的制御におけるこの領域の役割を指摘している。本明
細書に記載した対立遺伝子変異体内のＣＹＰ３Ａ５発現のアップレギュレーショ
ンの正確な機構はまだ決定されていないが、しかしＢＴＥ内での突然変異の一つ
の存在、および他のＰ４５０類の発現に対するこの要素の関連性が、可能な機構
的リンクを示す。メチル化干渉フットプリント法を用いて、ＢＴＥ内のすべての
グアニン残基、および近くの他のグアニン残基が、転写因子Ｓｐ１と相互作用す
ることが示された（１９）。本明細書中に記載したＢＴＥ（Ｓｐ１）内の突然変
異がアデニン残基をグアニン残基に改変するとすると、これはＳｐ１の変異形に
対する転写因子の結合を容易にすることができるであろう。

【００３９】同型接合および異型接合群内で見られるＣＹＰ３Ａ５ｍＲＮＡレベルの範囲に
かなりの重複があるけれども、代謝比の分布はＣＹＰ３Ａ５の量の場合と同様に
明らかに二モード性である。我々はＣＹＰ３Ａ５の翻訳効率またはタンパク質安
定性に影響を及ぼす他の多型性の存在を除外できない。しかし、ＤＮＡ多型とタ
ンパク質レベルとの間の良い相関およびＲＮＡの良く知られた変化性を考えると
、簡単な説明は、相違するＲＮＡ分解または生成（試料処理における相違による
）が、高および低発現体の間の区別を不鮮明にするというものである。ｍＲＮＡ
レベルにおけるこの食い違いに対してどのように説明するとしても、記載したＤ
ＮＡ多型の予測の価値をいかなる意味でも低下はさせない。

【００４０】しかし、遺伝子型（異型接合突然変異）がその代謝表現型（低発現）の予測で
はない一つの個体がある。ＣＹＰ３Ａ５タンパク質ならびにｍＲＮＡレベルが、
このアウトライアー内では低いという事実は、説明が、転写レベル、例えば転写
因子制御性ＣＹＰ３Ａ５発現に求められなければならないことを示す。

【００４１】ＢＴＥＢ遺伝子の５’非翻訳領域内のＡＵＧ要素は、少なくとも一部分は、Ｂ
ＴＥＢの細胞特異性翻訳制御に関与することを示している（２０）。この領域内
の突然変異は、ＢＥＴＢ翻訳に影響を及ぼすことが示されている。従って、我々
の研究におけるアウトライアーはＣＹＰ３Ａ５発現に対して高い発現遺伝子型を
示すけれでも、この個体はＢＴＥＢに対する「貧弱な」発現表現型を有するであ
ろう。さらに、ＣＹＰ１Ａ１発現の誘発への関与と同様な機構がＣＹＰ３Ａ５発
現に影響を及ぼすことも可能である。ＢＴＥの他にも、ＣＹＰ１Ａ１発現は異物
応答配列（ＸＲＥ）により媒介される。この場合に、誘発要因は、ＸＲＥを結合
する核内へ転座する（多分、Ａｒｎｔ遺伝子に対してコードするアクセサリータ
ンパク質と関連して）サイトソル受容体（Ａｈ受容体）に結合することにより発
現を増強する（１７、１８）。これらおよびその他の転写因子における変動はさ
らにＣＹＰ３Ａ５発現を変調できるけれども、これは本明細書に記載の多型が少
なくとも肝臓中で、ＣＹＰ３Ａ５発現の主要な決定因子であると考えられるとい
う事実を損なうものではない。

【００４２】本研究に利用できる試料の数は比較的少ないけれども、一方では２個のリンク
した多型と、他方では肝臓内の両者の発現とＣＹＰ３Ａ５ｍＲＮＡ、タンパク
質および活性レベルとの間の強い関連が見いだされた。ＣＹＰ３Ａ５による多型
代謝に対する遺伝的機構の解明は、薬理遺伝学の分野に重要な意義を有する。遺
伝子型決定による代謝の予測のための能力は、疾患関連研究を大幅に容易としそ
してこのシトクロムＰ４５０アイソフォームにより代謝される治療薬に対する不
利な反応または低い応答を説明するために助けとなるであろう。これは、ＣＹＰ
３Ａ５活性に影響を及ぼすどの因子が遺伝的であり、どれが環境的であるかを説
明するために役立つであろう。両者に対する将来の研究に対して、この酵素に関
して観察される発現における複雑な変動を完全に理解することが要求されるであ
ろう。推定プロモーター配列分析材料および方法：ＣＹＰ３Ａ５の制御領域の配列は、ＧＣＧ配列分析パッケージ(GCG, Madison,
Wisconsin) の「ファインドパターンズ(Findpatterns)」プログラムを用いて分
析した。このプログラムは、特定のＤＮＡ配列モチーフ、パターン、および転写
結合部位を発見し、その配列をプログラム中に記憶し、そして関係する配列中に
現す。本分析において、２例の報告された変異が既知のモチーフまたは転写結合
部位を変更させるかどうかを検出するために、関係する配列中で、パターンあた
りに多くとも１個の単一ミスマッチまたはエラーが許される。結果を図９〜９ｄ
に示す。第一、ＧＣＧＴＧからＧＣＴＴＧへの変異は、ＭＢＦ−ＩＣＳ、ＭＲＥＣＳ２、およびＣＮＢＰ−ＳＲＥに対する結合部
位を除去する。第二、ＣＣＡＣＣからＣＣＧＣＣへの変異は、ａｐｏＥ−未同定−部位−３、ＡｐｏＥＢ１、ＡＰＲＴ−ＣＨＯＵＳ、お
よびＡＰＲＴ−ヒトＵＳの結合部位をＧＣＦ−コンセンサスで置換し、ＡＰＲ
Ｔ−マウスＵＳ、ＧＣ−ボックス（１）、ＤＳＥ（１）、Ｓｐ１ＣＳ４
、Ｓｐ１−ｈｓｐ７０（１）、ｈｓｐ７０．２、Ｓｐ１−ＩＥ−３．３、Ｓｐ
１−ＩＥ−４／５、ＩＲＥ（１）、Ｓｐ１−ＴＰＩ（４）は、Ｙｉ−コンセ
ンサスパターンに影響しない。

【００４３】両方の突然変異は、転写因子結合部位に影響を及ぼす。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）ＥＭＳＡは、ジェネカ・バイオテクノロジー社(Geneka Biotechnology Inc.,
Montreal, Canada) からのＳｐ１ＮＵＳＨＩＦＴキットを用い、製造者の指示
に従って行った。要約すると、Ａ_-147Ｇ多型を含むＣＹＰ３Ａ５５’非翻訳領
域に相当する３１員二本鎖オリゴヌクレオチド（５’ＧＧＣＡＧＣＴＧＣ
ＡＧＣＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡ−３’）をＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²−Ｐで末端標識した。５０，０００ｃｐｍ
（０．５ｎｇ）オリゴヌクレオチドを２μｇのＨｅＬａ核抽出物と一緒に３０分
間、１６℃でインキュベーションした。非標識突然変異または野生型（５７−Ｇ
ＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡ
ＧＣＡ−３’）オリゴヌクレオチドを、指示に従って５０倍または１００倍過
剰に加えた。１または2 μｌの抗Ｓｐ１ラビットポリクローナル抗体を、指示に
従って核抽出物と一緒に４℃で３０分間予備−インキュベーションした。核抽出
物、抗Ｓｐ１抗体および結合緩衝液は、ジェネカ・バイオテクノロジー社からの
ものである。試料を５％ポリアクリルアミド（３９：１）ゲル上、ＴＧＥ緩衝液
（２５ｍＭトリス、１９０ｍＭグリシン、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中で
分離した。乾燥したゲルをＸ線フィルムに暴露した。結果ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の５’非翻訳領域の分析は、Ａ_-147Ｇ多型が、転写因子Ｓ
ｐ１に対する結合部位を創製するであろうことを示した。電気泳動移動度シフト
アッセイ（ＥＭＳＡ）をこの仮説をテストするために行った。Ａ_-147Ｇ多型を含
むオリゴヌクレオチドを、ＨｅＬａ核抽出物内に存在する結合因子に対するアッ
セイに使用した。バンドシフトが観察され（図８、レーン２）、これは非標識オ
リゴヌクレオチドのそれぞれ５０倍および１００倍過剰を用いて競合除去された
が（図８、レーン３および４）、しかし野生型オリゴヌクレオチドでは除去され
なかった（図８、レーン５および６）。これは、Ａ_-147Ｇ多型領域には結合が可
能であるが、しかし野生型領域には可能でないＨｅＬａ核抽出物内にタンパク質
因子が存在することを明らかに示している。転写因子Ｓｐ１に特異性の抗体の存
在下でのインキュベーションは、Ａ_-147Ｇ多型オリゴヌクレオチドのスーパーシ
フトをもたらし（図８、レーン７および８）、Ｓｐ１がＡ_-147Ｇ多型部位に結合
することを示している。

【００４４】ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の５’−非翻訳領域に対する転写因子Ｓｐ１の結合親和性
におけるこの変化は、Ａ_-147Ｇ多型プロモーターからの転写の増加を説明し、他
方ではＡ_-147Ｇ多型と相関する代謝速度の増加に寄与するであろう。シトクロム発現の遺伝子型決定健康な白人ボランティア３００人の群を、シトクロムＰ４５０３Ａ５遺伝子
の変異Ｔ_-475＞ＧおよびＡ_-147＞Ｇに関して遺伝子型決定した。試験の理論的説明第一の目的は、対立遺伝子／遺伝子型頻度に関する。

【００４５】最初の研究は３０〜３５例の異なる個体を含むだけであったので、対立遺伝子
／遺伝子型頻度は決定できなかった。被験者３００人の群の遺伝子型決定がこの
頻度の決定およびこれらがハーディ−ワインベルグ平衡と一致するかどうかの検
査を可能とした。

【００４６】第二の目的は、２種の変異体のリンケージに関する。最初の研究では、遺伝子
変異Ｔ_-475＞ＧおよびＡ_-147＞Ｇを有するすべての試料（全体で６例のみ）がリ
ンクしていた。示唆されたリンケージを確認するために、これらのＣＹＰ３Ａ
５多型の両方をさらに大きい集団に関して遺伝子型決定した。材料および方法遺伝子型決定誤差を最小とするために、健康な白人ボランティア３００人から
ゲノムＤＮＡ試料をマイクロタイタープレートに基づくフォーマットで遺伝子型
決定し、これは各個別試料のブラインドで完全に独立した２回分析で確認された
。

【００４７】ＣＹＰ３Ａ５の１３４３ｂｐ５’隣接領域を、プライマー３Ａ５１／３Ａ５２
を用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。両方の変異に対するＰＣＲアッセイ
は、最初の３Ａ５１／３Ａ５２ＰＣＲ産物の１／１００希釈物を鋳型として用
いて行った。ミスマッチプライマー３Ａ５Ｆ２および３Ａ５Ｒ１を両方のアッセ
イに使用した。Ａ_-147＞Ｇ突然変異に対して、ＰＣＲ産物を制限酵素ＴａｉＩ
を用いて消化し、そしてＴ_-475＞Ｇ突然変異に対してはＰＣＲ産物を制限酵素Ａ
ｌｕＩを用いて消化した。消化の後、制限断片をポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分離し、そして銀染色により可視化した。遺伝子型は、二人の独立し
た観察者によるＤＮＡ断片パターンに基づいて決定した。結果１．対立遺伝子／遺伝子型頻度３００個体の母集団内で、異型接合個体５３例（１８％）はそれぞれの変異１
コピーを有し、個体２４６例（８２％）は、Ａ_-147およびＴ_-475に関してホモジ
ニアスであり、そして１個体（０．３％）は両方の対立遺伝子に対して変異Ｇ_-1 ₄₇ およびＧ_-475を有していた（同型接合）。これらの頻度は、以前の試験（７、
８、９）で見いだされた３Ａ５発現と一致する。対立遺伝子頻度はハーディ−ワ
インベルグ平衡と一致する（表３）。２．変異Ｔ_-475＞ＧおよびＡ_-147＞Ｇのリンケージすべての個体において、それぞれ変異Ｔ_-475およびＡ_-147、および変異Ｇ_-147 およびＧ_-475は、遺伝子型内で同等に現れ、両方の変異の間の強いリンケージを
示している。両方の変異の間のこのリンケージがなんらかの機能的な意味を有す
るかどうかは、今後の解明を必要とする。リンケージの結果、今後の遺伝子型決
定は、機能的な変異体であるか否かに関係なく、変異の１種の分析を必要とする
だけとなる。

【００４８】

【表１】

【００４９】

【表２】

【００５０】

【表３】

【００５１】

【表４】

【００５２】

【表５】

【００５３】

【表６】

【００５４】

【表７】

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】図１ａは、ミダゾラム代謝比と、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の５’隣接領域内のリン
クしたＡ_-147ＧおよびＴ_-475Ｇ突然変異に対する遺伝子型との間の関係の図であ
る。ミダゾラム代謝比＝１−ＯＨＭ／４−ＯＨＭ、ｗｔ＝以前に公開（１１）さ
れた５’隣接領域内に野生型配列を有する試料、Ｈｅｔ＝リンク多型Ａ_-147Ｇお
よびＴ_-475Ｇに対する異型接合性の試料。

【図１ｂ】図１ｂは、ＣＹＰ３Ａ５ｍＲＮＡ発現と、ＣＹＰ３Ａ５の５’隣接領域内のリ
ンクしたＴ_-475ＧおよびＡ_-147Ｇ突然変異との間の関係の図である。相対Ｃｔ差
＝試料間の閾サイクルの差、方法の部に説明、ｗｔ＝以前に公開（１１）された
５’隣接領域内に野生型配列を有する試料、Ｈｅｔ＝リンク多型Ａ_-147Ｇおよび
Ｔ_-475Ｇに対する異型接合性の試料。

【図２ａ】図２ａは、プライマーの相対位置、および制限酵素ＴａｉＩに対する認識位
置の図であり、これは野生型”Ａ”ヌクレオチドが位置−１４７にある場合には
ミスマッチドプライマー３Ａ５Ｒ１を用いるＰＣＲ産物中に導入され、そして突
然変異”Ｇ”ヌクレオチドが存在する場合には消失する。

【図２ｂ】図２ｂは、Ａ_-147Ｇ変異体、すなわち同型接合野生型、異型接合型および同型
接合型突然変異体に対するそれぞれの可能な遺伝子型に対する予想される制限断
片の図示である。

【図２ｃ】図２ｃは、Ａ_-147Ｇ変異体の検出のための３Ａ５Ｆ２／３Ａ５Ｒ１ＰＣＲ産
物のＴａｉＩ制限消化の１．５％アガロースゲルの図である。レーン１．１０
０ｂｐラダー。レーン２および７．対照未消化ＰＣＲ産物、レーン３．位置−１
４７における野生型”Ａ”ヌクレオチドに対して同型接合の試料。レーン１０、
１１、１６．Ａ_-147Ｇ変異体に対して異型接合の試料。

【図３ａ】図３ａは、プライマーの相対位置、および制限酵素ＡｌｕＩに対する認識部
位の図である。野生型”Ｔ”ヌクレオチドが位置−４７５に存在する場合には、
ミスマッチドプライマー３Ａ５Ｆ２を用いるＰＣＲ産物中に正方向認識部位が導
入され、そして突然変異”Ｇ”ヌクレオチドが存在する場合には消失する。

【図３ｂ】図３ｂは、Ｔ_-475Ｇ変異体、すなわち同型接合野生型、異型接合型および同型
接合型突然変異体に対するそれぞれの可能な遺伝子型に対する予想される制限断
片の図示である。

【図３ｃ】図３ｃは、Ｔ_-475Ｇ変異体の検出のための３Ａ５Ｆ２／３Ａ５Ｒ１ＰＣＲ産
物のＡｌｕＩ制限消化の１２．５％ポリアクリルアミドＥｘｃｅｌＧｅｌの図
である。レーン１．１００ｂｐラダー。レーン２、５、６、７および８．位置−
１４７における野生型”Ｔ”ヌクレオチドに対して同型接合の試料。レーン３、
４、９．Ｔ_-475Ｇ突然変異に対して異型接合の試料。断片Ｘ−プライマー３Ａ５
１／３Ａ５２による最初の鋳型の再増幅からもたらされた追加の消化産物。

【図４ａ】図４ａは、リンクした突然変異を有する試料（ＨＥＴ群）と位置−１４７およ
び−４７５における突然変異に対するこれらの野生型（ＷＴ群）の間の１−ＯＨ
Ｍ／４−ＯＨＭ代謝比の比較。平均および四分値は、組み合わせた群に対する総
括平均として（中央線）、各群に対して示す。

【図４ｂ】図４ｂは、リンクした突然変異を有する群（ＨＥＴ群）と位置−１４７および
−４７５における突然変異に対する野生型のもの（ＷＴ群）の使用の間のＣＹＰ
３Ａ５発現（対数変換済）の比較である。平均および四分値は、組み合わせた群
に対する総括平均として（中央線）、各群に対して示す。

【図５】図５は、肝臓試料中のＣＹＰ３Ａ５タンパク質発現のウエスタンブロット分析
である。ミクロソームのウエスタンブロットは、肝臓から調製し、そしてＣＹＰ
３Ａ５特異性抗体を用いてプローブした。−１４７および−４７５においてリン
クした多型を含む肝臓試料（ｗｔ群）に＊印を付けた（ｋＤａで記載した大きさ
は、ワイドレンジカラーマーカー（サインズ）(Wide Range Coloour Marker (si
gns)) から）。

【図６】図６は、本発明に従って使用したオリゴヌクレオチドミスマッチプライマーの
表であり、ここで下線を施したヌクレオチドは配列ミスマッチを示す。

【図７】図７は、ＣＹＰ３Ａ５をコードするＤＮＡに対する５’隣接領域のヌクレオチ
ド配列の図である。

【図８】図８は、Ａ_-147Ｇオリゴヌクレオチドの電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭ
ＳＡ）から得た結果の図である。ＥＭＳＡは材料および方法の部に記載のように
して行った。レーン１：ＨｅＬａヌクレオチド抽出物を含まないＡ_-147Ｇオリゴ
ヌクレオチド。レーン２〜８：ＨｅＬａヌクレオチド抽出物が存在する場合。レ
ーン３および４：非標識Ａ_-147Ｇオリゴヌクレオチドの５０〜１００モル倍過剰
の存在。レーン５および６：非標識野生型オリゴヌクレオチドの５０〜１００モ
ル倍過剰の存在。レーン７および８：抗−Ｓｐ１抗体の１および２μｌの存在。

【図９〜９ｄ】図９〜９ｄは、ＧＣＧ配列分析パッケージの「ファインドパターンズ」プログ
ラムから得た結果の図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者パウルセン，アイメー・デイムフヌ・カトリーヌベルギー・ビー−2340ビールセ・トウルンホウトセベーク30・ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ (72)発明者アームストロング，マーテインイギリス・ケントシーテイ３１エスジエイ・カンタベリー・ウイカムブルオクス・グローブロード・ピピンスＦターム(参考） 4B024 AA11 CA05 DA03 HA14 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ08 QQ12 QQ92 QR14 QR40 QR55 QR62 QS25 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シトクロムＣＹＰ３Ａ５発現と関連する高いかまたは低い薬
剤代謝表現型を有する被験体を同定する方法であって、高い薬剤代謝表現型を特徴とするＣＹＰ３Ａ５をコードする配列の転写調節領域
内の１種またはそれ以上の多型変異体の存在または不存在に関して該被験体から
のゲノムＤＮＡをスクリーニングする段階を含んでなる方法。
【請求項２】高い薬剤代謝表現型を特徴とするＣＹＰ３Ａ５をコードする
配列の転写調節領域内の１種またはそれ以上の多型変異体の存在または不存在に
関するスクリーニングを含んでなる、ＣＹＰ３Ａ５により代謝される薬剤を用い
る処理に対する適合性に関してヒト被験体をスクリーニングする方法。
【請求項３】該調節領域の転写因子に対する認識部位内の１種またはそれ
以上の該変異体に関してスクリーニングすることを含んでなる、請求項１または
２記載の方法。
【請求項４】アクチベータータンパク質−３モチーフ（ＡＰ−３）および
／または基本転写要素（ＢＴＥ）内の１種またはそれ以上の該変異体に関するス
クリーニングを含んでなる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】領域の配列が図７に記載されているＣＹＰ３Ａ５をコードす
る配列の転写調節領域の位置−４７５または−１４７のいずれか一方における１
種またはそれ以上の該変異体に関してスクリーニングすることを含んでなる、請
求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】ＣＹＰ３Ａ５の該転写調節領域の位置−４７５または−１４
７における該変異体の両者に関してスクリーニングすることを含んでなる、請求
項５記載の方法。
【請求項７】野生型または変異体配列それぞれに対して、それぞれの該分
子からの増幅されたＤＮＡの産生が該野生型または該変異体が存在するかどうか
を示すように選択的にハイブリダイジングが可能なオリゴヌクレオチド分子を用
いて、該ＤＮＡを増幅する、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】シトクロムＣＹＰ３Ａ５をコードするＤＮＡの転写調節領域
内の１種またはそれ以上の多型変異体を同定する方法であって、１）野生型および／または１種またはそれ以上の該変異体配列に選択的にハイブ
リダイジングが可能なオリゴヌクレオチド分子を用いる増幅を試料ＤＮＡに受け
させ、その分子は制限部位を増幅された該野生型または変異体配列の一つの中に
導入できるものであり、そして２）段階１からの増幅されたＤＮＡを、該制限部位で開裂する酵素を用いる制限
を受けさせて、該突然変異の存在または不存在の指示である制限消化を与える段階を含んでなる方法。
【請求項９】該分子が、該制限領域の転写因子に対する認識部位に相当す
る領域内に制限部位を導入する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】該分子が、アクチベータータンパク質−３モチーフ（ＡＰ
−３）および／または基本転写要素（ＢＴＥ）に相当する領域内に制限部位を導
入する、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】野生型Ａヌクレオチドが転写調節領域の位置−１４７に存
在する場合にのみ、該分子が制限部位を導入可能である、請求項１０記載の方法
。
【請求項１２】該制限部位がＴａｉＩ制限酵素に対するものである、請
求項１１記載の方法。
【請求項１３】該オリゴヌクレオチド分子が、図６に記載の３Ａ５Ｒ１と
指定した配列を含んでなる、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】野生型Ｔヌクレオチドが転写調節領域の位置−４７５に存
在する場合にのみ、該分子が制限部位を導入可能である、請求項１０記載の方法
。
【請求項１５】該制限部位がＡｌｕＩ酵素に対するものである、請求項
１４記載の方法。
【請求項１６】該分子が、図６に記載の３Ａ５Ｆ２と指定した配列を含ん
でなる、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】それぞれ高いかまたは低い薬剤代謝表現型に関連するシト
クロムＣＹＰ３Ａ５をコードする配列の転写調節領域内の野生型または多型変異
体を検出するためにＤＮＡ配列の増幅内に使用するための少なくとも１０個の連
続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチド分子であって、高い薬剤代謝表現型の
特性である該野生型または多型変異体のいずれかに相当する配列をオリゴヌクレ
オチドが含む場合にのみ、該野生型および多型変異体の増幅が該分子から進行す
るように、該領域内の多型変異体または野生型ヌクレオチドのいずれかを組み込
んだ領域にハイブリダイジングが可能な分子。
【請求項１８】該調節領域の転写因子に対する認識部位にハイブリダイジ
ングが可能な、請求項１７記載の分子。
【請求項１９】アクチベータータンパク質−３モチーフ（ＡＰ−３）また
は基本転写要素にハイブリダイジングが可能な、請求項１７または１８記載の分
子。
【請求項２０】図７に記載のＣＹＰ３Ａ５をコードする配列の転写調節領
域の位置−４７５または−１４７のいずれかにおける多型変異体を含んでなる領
域にハイブリダイジングが可能な、請求項１７から１９のいずれかに記載の分子
。
【請求項２１】図６に記載の３Ａ５Ｆ１、３Ａ５Ｆ２または３Ａ５Ｒ１を
指定した配列のいずれかを含んでなる、請求項１７から２０のいずれかに記載の
分子。
【請求項２２】請求項１７から２１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチ
ド分子および該分子とＣＹＰ３Ａ５をコードする配列の該転写調節領域とを接触
させるための手段を含んでなる、請求項１から７のいずれかに記載の方法を実施
するためのキット。
【請求項２３】該変異体または野生型配列の間の区別のための制限消化の
生成が可能な制限酵素をさらに含んでなる、請求項２２記載のキット。
【請求項２４】該酵素がＴａｉＩまたはＡｌｕＩのいずれかを含んで
なる、請求項２３記載のキット。
【請求項２５】ＣＹＰ３Ａ５により代謝された試験化合物、例えば薬剤、
トキシンまたは前発癌物質の毒性または突然変異誘発性作用を同定するための方
法であって、シトクロムＣＹＰ３Ａ５発現と関連する高い薬剤代謝表現型を有す
る細胞および低い薬剤代謝表現型を有するそれぞれの細胞を該試験化合物と接触
させ、そして高いかまたは低い該代謝表現型細胞または該化合物に対して感受性
のその他のそれぞれの細胞に対する該化合物の作用を同定することを含んでなる
方法。
【請求項２６】ＣＹＰ３Ａ５により代謝された環境トキシンまたは前発癌
物質に関連する疾患に対する個体の罹病性を診断する方法であって、ＣＹＰ３Ａ
５をコードする配列の転写調節領域内の多型変異体の存在または不存在に関する
スクリーニングを含んでなる方法。
【請求項２７】該調節領域の転写因子に対する認識部位内の該変異体に関
するスクリーニングを含んでなる、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】該転写調節領域のアクチベータータンパク質−３モチーフ
（ＡＰ−３）および／または基本転写要素（ＢＴＥ）内の該変異体に関するスク
リーニングを含んでなる、請求項２６または２７記載の方法。
【請求項２９】領域の配列が図７に記載されている、ＣＹＰ３Ａ５をコー
ドする配列の転写調節領域の位置−４７５または−１４７のいずれか一方におけ
る該変異体に関するスクリーニングを含んでなる、請求項２６から２８のいずれ
かに記載の方法。
【請求項３０】位置−４７５または−１４７における両方の変異体に関す
るスクリーニングを含んでなる、請求項２６から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】該転写調節制御領域内の変異体Ｔ_-475ＧおよびＡ_-147Ｇの
存在または非存在に関するスクリーニングを含んでなる、請求項２６から３０の
いずれかに記載の方法。
【請求項３２】シトクロムＣＹＰ３Ａ５をコードするＤＮＡ配列の転写調
節領域の活性の程度を与えるかまたはシトクロムＣＹＰ３Ａ５の転写を改変する
多型変異体を同定する方法であって、該転写調節領域を含んでなるＤＮＡ断片に
操作的にリンクしたレポーター分子をコードする配列を有するＤＮＡ構築物を調
製し、そして該構築物を細胞内に導入しそして該レポーター分子の発現のレベル
を測定することを含んでなる方法。
【請求項３３】シトクロムＣＹＰ３Ａ５をコードするＤＮＡに隣接する転
写調節領域からのＤＮＡ配列にハイブリダイジングが可能な転写因子を同定する
方法であって、該転写調節領域を含む該ＤＮＡ配列を可能性がある転写因子と接
触させ、そして該ＤＮＡ配列に複合したあらゆる転写因子を同定することを含ん
でなる方法。
【請求項３４】ＣＹＰ３Ａ５をコードするＤＮＡ配列の転写調節領域に対
して作用する化合物を同定する方法であって、該調節領域の配列を含んでなり、
そしてその調節領域がレポーター分子をコードする配列に操作的にリンクしてい
るＤＮＡ構築物を用いて細胞を形質転換し、該細胞を試験化合物と接触させそし
て該レポーター分子のあらゆる改変された発現を同定することを含んでなる方法
。
【請求項３５】シトクロムＣＹＰ３Ａ５をコードする配列の転写調節領域
からのＤＮＡに結合が可能な試料からの転写因子を精製する方法であって、該転
写調節領域を含むＤＮＡ配列を転写因子の混合物と接触させ、そして該転写因子
と該配列とのすべての複合体を同定することを含んでなる方法。
【請求項３６】該転写調節領域が、該調節領域の転写因子に対する認識部
位内の突然変異を含む、請求項３２から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】該突然変異が、アクチベータータンパク質−３モチーフ（
ＡＰ−３）および／または基本転写要素（ＢＴＥ）内で起きる、請求項３２から
３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】該突然変異が、領域の配列が図７に記載されている、ＣＹ
Ｐ３Ａ５をコードする配列に隣接する転写調節領域の位置−４７５または−１４
７のいずれか一方で起きる、請求項３６または３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】転写調節領域が突然変異Ｔ_-475ＧおよびＡ_-147Ｇを含んで
なる、請求項３２から３８のいずれかに記載の方法。