JP2002524491A - 燐酸カルシウム送出ビヒクル及びアジュバント - Google Patents
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Abstract
Description
びにそれらの製造方法に関する。
で制御可能な速度で放出させるように設計されるべきである。また、キャリアー
は、非毒性であるべきであり且つその使用後に宿主内に留まるべきではない。ア
ジュバントと免疫原の双方は製薬的に安定であるべきであり、送出系は投与が容
易であるべきである。更に、免疫原に対する宿主応答は、ワクチンの投与後に最
大のレベルに迅速に到達し且つできるだけ早く保護効果をもたらすべきである。
うな複雑な免疫原を典型的に使用してきた。このようなワクチンは、悪い副作用
(例えば、肉芽種の形成、発熱及び過敏症)としばしば結び付いていた。サブユ
ニットワクチンの使用は、より複雑な免疫原により産生したワクチンと関連した
望まない副作用の数と酷さを削減させた。サブユニットワクチンは、標的病原体
からの1個のみの又は数個の蛋白質又は多糖類よりなる。鈴江氏他は、Expe
rientia(77;1996;p451−465)において、サブユニット
ワクチンとして熱ショック蛋白質(HSP)を教示している。サブユニットワク
チンは、それ自体小さい寸法のために、ごく弱い免疫原性に過ぎない傾向があり
、しばしば満足できるレベルの免疫を誘発し損ねている。従って、サブユニット
ワクチンの使用は、有効であるためには、免疫原性を高めるための戦略、例えば
、高められたアジュバント及び特異性送出の戦略を使用することを要求する。
移植可能な貯蔵所送出系による徐放性ワクチンの送出を使用することによってい
た。徐放技術は、免疫系への抗原及びアジュバントの時間的及び区間的な提供を
最適化することによって向上した効能を与える。免疫原の制御された長期間の放
出は、一般に、有効なワクチンを産生させるのに必要な抗原決定基の数を削減さ
せ且つブースター(追加抗原)注射の必要を省く。理想的には、徐放技術は、初
期に大量の免疫原を送出させ、次いで宿主に放出された免疫原の量を徐々に減少
させることによる自然の免疫攻撃を真似ている。制御された送出系は、抗原を抗
原提供細胞(APC)に効率的に向けて細胞応答と体液性応答の双方を発生させ
、意図したワクチンに関して最適な免疫応答を潜在的に導くことができる。アジ
ュバント、特に再吸収性アジュバントは、複雑な脈動的動き及び抗原放出を達成
するように徐放性デバイスとして働くことができる。ザオ氏は、J.of Ph
arma.Sci.(85;1996;p1261−1267)において、腫瘍
ワクチンを力説して重合体を使用する徐放技術を教示している。
って増強された。伝統的なワクチン並びにサブユニットワクチンは、一般にアジ
ュバントの使用を要求した。斯界で知られた典型的なアジュバントは、アルミニ
ウム化合物、ムラミルジペプチド、フロイント完全アジュバント及び不完全アジ
ュバントを包含する。アルミニウム化合物及び合成重合体はアジュバントとして
広く使用されたが、それらは再吸収性ではなく、使用後に体内に留まり、また合
成重合体を製造するのに使用された単量体は毒性である可能性がある(Phar
maceutica Acta Helvetica 53;1978;p17
−23)。
めに、アジュバント及び送出ビヒクルとして魅力的である。更に、燐酸カルシウ
ムは、抗原、ワクチン、免疫原、蛋白質及びその他の活性剤に対して高親和性結
合特性を所有することが知られている。燐酸カルシウムゲルを製造する方法がト
ウエイ氏他により米国特許第2,967,802号に記載されている。トウエイ
氏は、これらの燐酸カルシウムゲルをワクチン送出ビヒクル又は免疫学的アジュ
バントとして並びに錠剤崩壊剤、懸濁剤、凝集剤、経口解毒性制酸剤及びその他
の薬剤として使用することを示唆しているが、それらの例を提供し又はこれらの
具体例を可能にし損なっている。しかし、製造されたゲルを使用してどのように
免疫応答を増強させ又は高めるかを述べていない。更に、レリベルド氏は、米国
特許第4,016,252号及びDevelopment in Biol.S
tandardization(65;1985;p131−136)において
、ワクチンを吸着できる注射可能燐酸カルシウムゲルの製造を記載している。レ
リベルド氏の燐酸カルシウムゲルの目的は、高濃度で安定なワクチンを提供する
ことであり、アジュバント適性を増大させることではない。
きる。クリューター氏他は、Vacine(6;1988;p125−129)
において、粒子直径の減少はノナ粒子重合体のアジュバント効果を増大させたこ
とを報告した。グラフ氏はArzneim.−Forsch(21;1971;
p903)において及びクリューター氏はInfection and Imm
unology(19;1978;p667)において、Al2O3アジュバン
ト及びγ線重合ポリ(メタクリル酸メチル)粒子アジュバントをそれぞれ使用し
て類似の知見を報告した。クールブリュー氏他は、米国特許第4,329,33
2号において、合成重合体ナノ粒子であって、この重合体の生分解速度と類似す
る速度で宿主に放出される生物活性物質を含有するものを記載している。アレマ
ン氏他は、Europ.J.of Pharm.and Biopharm.(
39;193;173−191)において、ナノ粒子により頻繁に起こる問題が
網内皮細胞系(RES)による迅速な取り込みであったことを検討している。R
ESは血液循環から小さい外来粒子を除去するように機能するので、そのような
粒子に含有された薬物はそれらの目的部位に到達せず、むしろ肝臓及び脾臓に高
濃度で見出される。クリューター氏は、J.of Controlled Re
lease(16;1991;p169−176)において、RESのノナ粒子
による取り込みを回避させる種々の方法、例えば、界面活性剤、磁場及び種々の
投与経路(例えば、皮下、筋内及び眼)の使用を教示している。皮下及び筋内注
射の後、これらの方法で処置されたナノ粒子は、注射部位に留まっている(クリ
ューター氏、J.of Pharma.Sci.(72;1983;p1146
−1149))。また、薬物及び抗生物質は、ナノ粒子と併用したときに、毒性
の低下及び(又は)効能の増大を生じさせることが示された。また、ガーニー氏
(眼科薬送出の生物薬剤学、CRCプレス、ボカ・ラートン、1993;p81
−90)により、ピロカルピンをナノ粒子に組み入れた後にそれの角膜前の滞留
時間は増大したことが報告された。アメロンゲン氏他は、米国特許第5,443
,832号において、好適な寸法(0.01〜0.1μ)のヒドロキシアパタイ
トが上皮を通して抗原を運ぶことができることを開示しているが、粒度のアジュ
バント適性を教示していない。更に、ヒドロキシアパタイトは非再吸収性又は低
再吸収性であることが知られていた。
ト適性を最適化させなかった。これらの燐酸カルシウムアジュバントの多くは、
一つ以上の追加的な欠点、例えば、劣った生体適合性、低い再吸収性、活性剤の
徐放を提供できないこと、多数の免疫処置の必要性及び投与の困難性を被る。更
に、どれも非晶質燐酸カルシウム又はナノ結晶性燐酸カルシウムではなかった。
事実、オルソン氏は、「生体物質及び免疫系」(「生体物質及びバイオエンジニ
アリングハンドブック」、Pt.A、Vol.1、マーセル・デッカー社、NY
、1995)(ここで引用することによりここに含めるものとする)において、
燐酸トリカルシウムを含めてセラミックス及び無機複合体が免疫学的に良性であ
ると信じられることを報告した。従って、より望ましい特性(例えば、再吸収性
、徐放性、生体適合性及び投与の容易性)を共に組み入れた改善された燐酸カル
シウム送出系についてのニーズが存在する。そして、所望の宿主応答を向上させ
又は高める改善された生体適合性再吸収性燐酸カルシウムアジュバント及び送出
ビヒクルに対するニーズが存在する。
ルシウムアジュバントを開示する。アジュバント適性向上手段を持つ燐酸カルシ
ウムアジュバントを開示する。向上手段は外因性又は内因性であってよく、単一
の処方物内に併用することができる。
じさせ又は高めることができる任意の物質をいう。時には、アジュバントは活性
剤を使用することなく単独で宿主応答を顕在化させることができる。“アジュバ
ント適性”は、任意の物質が宿主応答を顕在化させる能力を説明する。このよう
なアジュバントは、ここでは非特異的アジュバント適性を有するものとして説明
される。
ことができる任意の物質をいう。また、送出ビヒクルはアジュバントであること
もできる。
又は宿主により認識された後にある一定の時間内に該物質に対して宿主によって
発生された生物学的反応をいう。この反応は、物質に対する応答における炎症、
免疫学的、ミトゲン性、毒性又はその他の反応であることができる。“宿主応答
”は、適応性か又は先天的なもののいずれかでよいが、両者は十分に機能的な応
答のために要求される。
るのに使用する。物質は、酵素的過程、細胞反応、溶解又はその他の生物学的若
しくは物理学的分解機構により“再吸収”できる。再吸収は、数日から数年の時
間的経過にわたり起こり得る。再吸収とは、ここで使用するときは、物質の骨へ
のリモデリングも包含する。
された物質に対する特異的抗体応答を顕在化させる任意の物質又は活性剤をいう
。
は、抗原、ワクチン、トレロゲン、免疫原、成長因子、蛋白質、核酸及びその他
の物のような物質を包含する。
免疫又は部分的免疫を生じさせる任意の物質をいう。ワクチンは、制限なく、生
きた、弱毒化した(非病原性の)若しくは死んだ病原体、抗原又はサブユニット
ワクチンであってよく、これは病原体からの1個のみの又は数個の蛋白質又は多
糖類である。
ント適性向上手段の不存在下でのアジュバントに対する宿主応答と比べて、アジ
ュバントに対して増大した宿主応答をもたらす物質、処置又はアジュバント構成
である。増大されたアジュバント適性は、しばしば、免疫又は異物応答の何らか
の要素の向上された又は高められた状況として測定することができる(例えば、
特異的免疫細胞型、例えば、マクロファージ、CD4、CD8、リンパ球の増加
又は体液性若しくは細胞性経路の特異的な増加)。 向上手段は、外因性又は内因性であってよい。“外因性向上手段”は、標準的
宿主応答を更に増大させる任意の見込まれる燐酸カルシウム送出系への一つ以上
の付加(物)であると考えられる。外因性向上手段は、アジュバントの燐酸カル
シウム物質の製造の前に、その間に又はその後にアジュバントに適用することが
できる。このような外因性向上手段の組み入れは、アジュバントへの活性剤の組
み入れに匹敵する類似の態様で達成することができる(例えば、吸着、混合、共
有結合)。好ましい外因性向上手段は、サイトカイン及びアジュバント、例えば
、ムラミルジペプチド、水酸化アルミニウム、燐酸アルミニウム、フロイント完
全アジュバント、フロイント不完全アジュバント及び重合体を包含する。“内因
性向上手段”は、増強されたアジュバント適性を導くアジュバント自体の変更又
は向上をいう。典型的には、内因性向上手段は、アジュバントにその製造中に組
み入れられるが、このような変更はアジュバントを製造した後に行なうこともで
きる。内因性アジュバント適性向上手段の例は、燐酸カルシウム物質内の結晶化
度の増大、ここでの実施例に従う特異的化学的及び(又は)相の組成の変化、ア
ジュバント物質の増大した粗さ並びに粒子寸法及び数(容量%として測定して)
を含むが、これらに限らない。
非晶質特性を有する燐酸カルシウム物質をいう。有意の非晶質特性は、75%以
上の非晶質含有量、好ましくは90%以上の非晶質含有量を意図し、広い特色の
ないX線回折(XRD)図形により特徴づけられる。
シウム”(PCA燐酸カルシウム)は、合成低結晶性アパタイト質燐酸カルシウ
ムを説明する。PCA燐酸カルシウム物質は、それが特徴的なXRD及びフーリ
エトラスファー赤外(FTIR)分光分析法図形を有することを条件として、単
一の燐酸カルシウム相に必ずしも限定されない。PCA燐酸カルシウムは、骨と
実質的に同じXRDスペクトルを有する。このスペクトルは、20°〜35°の
領域に2θ値で2個のみの広いピークで、一方が26°に中心を、他方が32°
に中心があるもの、並びに27°から34°の2θ値で肩及び鋭いピークの不存
在により特徴づけられる。特に、210、112又は300のミラー指数に相当
する鋭いピーク又は肩は存在しない。肩は、ほぼ29°及び33.6°の2θ値
で存在できる。更に、それは、563cm−1、1034cm−1、1638c
m−1及び3432cm−1(±2cm−1)でのFTIRピークにより特徴づ
けられる。鋭い肩は603cm−1及び875cm−1で観察され、1442c
m−1及び1457cm−1に最大値を有するダブレットである。
的直径を説明する。ナノ粒子は1.0nm〜1000nm即ち1.0μmの範囲
にある。ここで検討するように、アジュバントの寸法は、別に説明してなければ
、走査電子顕微鏡により決定したときの、平均ナノ粒子の寸法をいう。
わせて存在するときに、抗原若しくはワクチンに対する宿主応答を顕在化させ又
は宿主応答を増強させるカルシウム含有アジュバント及びワクチン送出ビヒクル
を提供する。本発明のアジュバント又は送出ビヒクルは、宿主に抗原又はその他
の活性剤の連続的な、遅延された、逐次的な及び(又は)断続的な貯蔵所の送出
を提供できる。その他の場合には、この物質は、活性剤の迅速な一時の薬量を宿
主に送出させることができる。
きるが、燐酸カルシウム及び硫酸カルシウムが好ましい。非晶質及び低結晶性ア
パタイト質の燐酸カルシウムが特に好ましい。ある場合には、アジュバント適性
を増強させるために追加の物質をカルシウムベースのアジュバントと組合わせて
使用することができる。一般に、カルシウム化合物は注射可能ゲル又は固体ナノ
粒子に形成される。好ましいアジュバント又はビヒクルは、抗原、サブユニット
ワクチン又はその他の活性剤を吸収し、結合し、捕捉し又は含有し若しくは存在
させるように設計することができる。有用なカルシウムアジュバントには、硫酸
カルシウム並びに燐酸カルシウム、例えば非晶質燐酸カルシウム(ACP)、低
結晶性アパタイト質燐酸カルシウム(PCA)、燐酸ジカルシウム二水塩(DC
PD)、燐酸トリカルシウム(TCP)、燐酸テトラカルシウム(TTPC)、
モネタイト、燐酸モノカルシウム位置水塩(MCPM)、燐酸オクタカルシウム
(OCP)、ヒドロキシアパタイト(HA)が含まれるが、これらに限定されな
い。また、これらの燐酸カルシウムの炭酸化された又は置換された変種も本発明
で意図される。本発明においてアジュバントとして有用な好適な燐酸カルシウム
の製造及び特性の詳細な説明は、共に継続中の米国特許出願第08/729,3
44号(名称:反応性非晶質燐酸カルシウムの物理的変換と関連した方法及び生
成物)並びに米国特許:リー氏他の第5,683,461号及び同じく5,78
3,217号(これらはいずれも引用によってここに含めるものとする)に見出
すことができる。R.Z.レジロス氏は、「経口生物学及び薬品における燐酸カ
ルシウム」(カーガー出版社、NY、1991)において追加の有用なカルシウ
ム化合物を列挙している。
、ワクチン接種法の完了後に送出ビヒクルの外科的除去の必要を省く。また、再
吸収性カルシウムアジュバントは、宿主への抗原のような活性剤の制御された送
出を特定の速度で可能にさせる。抗原は、一般に、再吸収速度に匹敵できる速度
で宿主に送出される。本発明のアジュバントの注文設計された再吸収性特性は、
免疫の発生のために要求されるときに特異的免疫原のための選定された送出速度
を提供する。好ましい具体例では、弱再吸収性カルシウムアジュバントが、宿主
への抗原の遅い放出貯蔵所の送出を提供するように使用される。他の具体例では
、カルシウムアジュバントは強再吸収性であって、迅速な薬量の抗原を宿主に送
出させるための手段を提供する。更に他の具体例では、弱再吸収性カルシウムと
強再吸収性カルシウムとの組合せが一次免疫処置及びその後のブースターを真似
るように可変的な又は脈動的な放出を生じさせるのに使用される。例34は、可
変的な送出速度が異なった再吸収速度のアジュバントの組合せの結果である脈動
的送出アジュバントの使用を立証する。再吸収速度、従って送出速度は、種々の
再吸収性成分の製剤を変えることによって数時間、数日、数ヶ月又は数年までも
調節することができる。好ましい具体例では、アジュバントは所望の抗原送出速
度で再吸収される。
とができる。ある場合には、カルシウムベースのアジュバントは再吸収性ではな
く、身体内にいつまでも留まる。焼結燐酸カルシウムのようなセラミックスアジ
ュバント(例えば、高結晶性ヒドロキシアパタイト)は、ワクチン送出後も体内
に留まる。好ましい具体例では、アジュバントは再吸収性である。再吸収性アジ
ュバントは、時間と共に生分解し、究極的に体内に残留物質を殆ど又は全然残さ
ない。アジュバントは、強再吸収性又は弱再吸収性であってよい。本発明の好ま
しい具体例では、強再吸収性アジュバントは次のように特徴づけられる。少なく
とも1g(好ましくは1〜5g)が皮下又は筋内の部位に移植され、アジュバン
トの少なくとも80%が1年以内に再吸収される。更に好ましい具体例では、1
gのアジュバントが9ヶ月、6ヶ月以内に、理想的には1ヶ月以内に再吸収され
る。弱再吸収性とは、1gの出発アジュバントの80%未満が1年後に再吸収さ
れることを意味する。再吸収とは、ここで使用するときは、溶解度に基づく過程
並びに活性細胞性の又は酵素に基づく過程を包含する。好ましいカルシウムベー
スのアジュバントは、活性細胞性又は酵素的な過程を経て再吸収される。アジュ
バントの活性な分解速度を制御することによって、本発明のアジュバントは線再
吸収速度を有するように調整することができる。
粒度、多孔率、密度及び(又は)結晶化度を含めて一つ以上の物理的パラメータ
ーを調節することにより変えることができる。一般に、最終の再吸収速度を微調
整するためにこれらのパラメーターの二つ以上が一斉に調節される。更に、ビヒ
クルには、体内のビヒクル再吸収を通常調停する細胞性又は酵素的過程に影響を
及ぼすことによってその再吸収速度に影響するように使用できるある種の分子因
子を組み入れることができる。これらの組み入れられた因子はしばしば生物活性
分子又はその収集物であって、これらは骨の代謝過程、例えば破骨細胞及び(又
は)骨芽細胞の活性に影響を及ぼす。他の場合には、組み入れられた因子は、マ
クロファージ、単核細胞又は異物巨大細胞の一つ以上を誘引し又はこれらの活性
に影響を及ぼす。このような有用な因子には、成長因子、酵素阻害剤、細胞外マ
トリックス成分、サイトカインなどが含まれる。
の正確な効果を評価するために1種以上の小動物モデルにおいてアジュバントの
筋内又は皮下移植を使用することによって実験的に確立される。これらのモデル
系では、種々の候補処方物を同時に試験することができ、再吸収速度を斯界で知
られた標準的な組織学的、X線撮影又はその他の方法を使用して種々の時点で比
較することができる。
も迅速に再吸収する。モノリスデバイスは、1g程度では、粒状形態の時の同じ
物質の1gよりも更にゆっくりと再吸収する。沈殿した燐酸カルシウムについて
は、粒度は、沈殿速度の注意深い制御により調節することができる。迅速な沈殿
、次いで沈殿の迅速な取得は、小さい粒度(例えば、2nm〜150nmの範囲
の粒度)の製造に有用である。例えば、例1に記載するようなACP(30秒間
熟成)は、操作電子顕微鏡により決定して、5nm〜50nmの粒度範囲を有し
た。これよりも遅い沈殿速度並びに長時間にわたる沈殿剤又は母液の存在下での
沈殿の保持は、大きい粒度(例えば、300nmよりも大きい粒度)の成長を促
進させる。例えば、例13に記載するアパタイト質燐酸カルシウムアジュバント
(48時間熟成)は、ほぼ300nmの平均粒度を有した。斯界で知られた標準
的なミル粉砕法(例えば、ボールミル、ローラーミル、ジェットミル)の使用、
次いで正確な篩い分けも、特定粒度の粒子ビヒクルを製造するのに有用である。
その他の場合に、斯界で記載されたようなエマルジョン又はスラリーから製造さ
れた物質は、有用な粒度の物質を生じさせる。1μm以下、好ましくは0.5μ
m以下の粒度は、一般に、6ヶ月以内に再吸収されるように意図したアジュバン
ト及び送出ビヒクルにとって好ましい。ある好ましい具体例では、ACP燐酸カ
ルシウム粒子は、ほぼ100nmの平均粒度に篩い分けられ、3ヶ月以内に再吸
収できる。
ストローム又はナノメーター程度の最小粒度を使用するのが好ましい。これらの
場合には、更なる粒度調節を使用して再吸収速度を調節することは可能ではない
かもしれず、その他の物理的パラメーター、例えば、アジュバントの密度又は結
晶化度を変えることにより或いは再吸収速度に影響する蛋白質又は成長因子を添
加することにより再吸収速度を更に制御し又は微調整することが有益であろう。
ジュバントを圧縮することにより最も容易に制御される。型及びプレスを使用し
て8MPa〜50MPaの圧縮力を加えることができる。圧縮の他に、ビヒクル
の密度を調節するのに有用である種々のその他の方法が斯界で知られており、使
用することができる。本発明のアジュバント及びビヒクルの燐酸カルシウムの密
度は、比重瓶法、例えばヘリウム比重瓶法(HP密度)を使用して最良に決定さ
れる。ほぼ3.0g/cm3のHP密度で製造された燐酸カルシウムは、遅い再
吸収性ビヒクルを製造するのに有用である。更に迅速な再吸収性ビヒクルは、一
般に2.5〜2.8g/cm3の範囲、好ましくは2.5g/cm3のHP密度
の燐酸カルシウムから製造される。2.5g/cm3未満の値のHP密度は、特
に迅速に再吸収することを意図したビヒクルにとってしばしば好ましい。
を使用して全体のビヒクル再吸収速度に影響を与えることができる。1.3〜1
.75のカルシウム対燐の比を持つアパタイト質燐酸カルシウムについては、低
結晶性形態は高結晶性形態よりも迅速に再吸収するものと信じられる。高結晶性
の化学量論的ヒドロキシアパタイト(例えば、NIST(登録商標)カタログN
o.2910)が弱再吸収性ビヒクルの例である。その他の燐酸カルシウムにつ
いては、所定のカルシウム対燐の比では、更に非晶質の形態は一般に更に結晶性
の形態よりも可溶性である。再吸収速度の増大は、格子欠陥、例えば空格子点又
は置換を含むアパタイト質燐酸カルシウムの製造により達成することができる。
好ましい具体例には、炭酸化された又はカルシウム欠乏アパタイトが含まれ、そ
のどれも増大されたインビボでの再吸収速度を有する傾向がある。類似するこの
ようなアパタイト質燐酸カルシウムの製造のための更なるガイダンスは「アパタ
イト及びその他のオルト燐酸カルシウムの構造及び化学」(J.C.エリオット
、エルスバイアー、アムステルダム、1994)並びに上記の参考文献(これら
は引用によりここに含めるものとする)に見出すことができる。
意の多孔率のものであってよい。多孔率は、物質剤の本発明の物質への拡散及び
それからの拡散の双方を、ある適用では、細胞及び細胞過程の物質マトリックス
への進入を容易にさせる。従って、低い多孔率のアジュバントは、高い多孔率の
ものよりもインビボでゆっくりと再吸収する傾向があり、従って、多孔率が大き
いほど、再吸収速度は大きい。本発明の一具体例では、多孔率は、制御された粒
度の反応体の乾燥混合物を使用して増大される。例えば、大きい粒度(例えば、
300〜500nm)の反応体である例1〜16に記載した物質は、より多孔質
の物質を生成しよう。他の具体例では、多孔率を変化させるために化学的又は物
理的エッチング及び浸出技術が使用される。好ましい一具体例では、例16に従
って、NaCl結晶(例えば、50μmから500μm)が手動プレスによりペ
ースト状物質に組み入れられ、製造される。使用された結晶の寸法は、所望の細
孔寸法に従って選定される。一般に、結晶の量は、20重量%以下である。ペー
スト状物質は硬化せしまられ、NaCl結晶は硬化した物質から結晶を可溶化さ
せるのに好適な水溶液、例えば蒸留水又は塩水を使用して洗浄される。元のNa
Cl結晶の寸法である表面細孔及びマクロ空隙はこのような処理から生じる。
ある。大きい粒子細孔(マクロ空隙)(例えば、50μm以上)の存在又は不存
在は、再吸収速度に有意の効果を及ぼすかもしれない。このようなマクロ空隙は
、細胞性再吸収を容易にさせることができる。迅速再吸収性のビヒクルの好まし
い具体例では、直径が50〜300μmのマクロ空隙が存在する。ある具体例で
は、ビヒクル内のマクロ空隙の%は、全容積の20%以上である。多くの具体例
では、ビヒクルの容積の10%以下はマクロ空隙からなる。更に低い再吸収性の
具体例では、ビヒクルの容積の1%以下が直径50μm以上のマクロ空隙により
示される。マクロ空隙は、アジュバントの製造中に浸出性固体多孔形成剤、例え
ば、結晶性の、粒状の及び(又は)繊維状の糖類、でんぷん及び(又は)塩類を
使用することにより組み入れることができる。好ましい一具体例では、直径が2
00〜300μmのNaCl結晶が例16及び17の燐酸カルシウムに20重量
%の割合で組み入れられる。これらの多孔形成剤は製造後にアジュバントから浸
出することができる。
は、アジュバントの再吸収速度に有意の効果を及ぼすことができる。従って、本
発明のアジュバントへの骨形態発生蛋白質の組み入れは、特に軟質組織移植部位
においてビヒクルのより迅速な再吸収を導く。更に、破骨細胞を誘引する因子(
例えば、インターロイキン−1,リンフォトキシン、カルシトニン)を使用して
ビヒクルの分解を促進させることができる。破骨細胞又はマクロファージ活性阻
害剤(例えば、中性燐酸塩、グルココルチコイド、プリカマイシン、硝酸ガリウ
ム)を使用して再吸収過程を延長させることができる。細胞外マトリックス成分
、例えばラミネン、RDGペプチド、コラーゲン、フィブロネクチンもアジュバ
ントと一緒に含めることができる。燐酸カルシウムの再吸収速度の調節に有用な
特定の因子に関する詳細なガイダンスは、PCT/US97/18528(引用
することによりここに含める)に見出すことができる。一般に、これらの因子は
、20%w/w以下、好ましくは10%w/w以下、大抵の具体例では5%以下
の濃度で本発明のアジュバントに組み入れられる。
されないか又は所望されない。ある具体例では、本発明のアジュバント適性の向
上は、弱再吸収性又は非再吸収性のいずれかであるカルシウムアジュバントを使
用して得ることができる。長期間の抗原送出が数年にわたって起こるときは、非
再吸収性のアジュバントを使用できる。また、非再吸収性アジュバントは、アジ
ュバントが組織修復又は成長のための支持マトリックスとして、疾病のための治
療として、或いはワクチン接種の目的のために追加的に使用される場合に望まし
いであろう。非再吸収性燐酸カルシウムアジュバントは、その優れた生体適合性
のために宿主に有害な効果を及ぼすことなく体内に留まることができる。別法と
して、非再吸収性アジュバントは、所望の送出期間の後に外科的に除去すること
ができる。好適な非再吸収性又は弱再吸収性の燐酸カルシウムアジュバントには
、焼結ヒドロキシアパタイトから製造されたものが含まれる。
レベルを示す。ビヒクルにより変化した免疫応答を誘発させるアジュバント又は
送出ビヒクルのどの変形もそのアジュバント適性を達成したものと見なされる。
アジュバント適性向上手段を使用して、抗原又はその他の異物に対する細胞性免
疫応答、体液性免疫応答又は任意のその他の応答の一つ以上を誘発させ、特に増
大させることができる。アジュバント適性に影響を及ぼすことができる送出系の
好適な変形には、アジュバントの細胞性認識、免疫原の細胞性認識及びある場合
にはアジュバントの生体適合性に影響を及ぼす変更が含まれる。外因性の変更に
は、免疫応答を局所的に変化させる免疫調節性分子(例えば、fas−L)のア
ジュバントへの取り込みが含まれる。粒度、粒子形状、粒子粗さ、比表面積、p
H、多孔率、化学反応性/発熱性を含めてアジュバントにとって内因性のその他
のパラメーターを、細胞性認識を達成するように変更することができる。しかし
、好ましい具体例は、しばしば、所望の宿主応答を作るような態様で整えられた
上記のパラメーターの組合せを伴う。
因的に変化させるように調節することができる。燐酸カルシウム送出ビヒクルは
、アジュバント自体と同じか又は類似した物質から製造したナノ粒子を含み又は
それの存在下に送出されてもよい。最もしばしばであるが、これらの粒子は免疫
原も含有する。ナノ粒子の存在は、免疫原に対する宿主応答を増強させる効果を
有する。好ましい具体例では、ナノ粒子はアジュバントの1〜100%を占める
。更に好ましい具体例では、ナノ粒子はアジュバントの25〜100%を占める
。最適には、ナノ粒子はアジュバントの50〜100%を占める。
もアジュバントとして使用することができる。例28は、種々の粒度を使用して
特異的に望ましい宿主応答を増強させることを立証する。一般に、本発明のアジ
ュバント活性を得るためには、好ましいアジュバントの粒度は約0.1nm〜約
50μmの範囲にある。更に好ましい具体例では、粒度は約0.1nm〜約90
0nm、更に好ましくは1.0nm〜約500nm、最も好ましくは約100n
m〜約250nmの範囲にある。最適には、粒度範囲は、約20nm〜約80n
mである。ある場合には、5〜50nmの範囲が、アジュバント活性を高めるの
に有用であった。大きい粒子(50μm以上)は、典型的には、その他のアジュ
バント適性向上剤、例えばサイトカイン、その他のアジュバント又は物理的パラ
メーター(例えば、多孔率)を使用し、宿主反応を高めるために含有される。
れによってより有効な送出法を提供できる。特異的免疫原がアジュバントに吸収
され又は共有結合される具体例では、アジュバントからの免疫原の放出プロフィ
ルは粒度への敏感な依存性を示す。小さい粒子(例えば、ナノ粒子)は、大きい
粒子よりも、その大きい表面対容積比のために高い速度で抗原を放出できる。大
きい粒子(例えばミクロ粒子)は、それらが小さい粒子に分解されるまでは食細
胞の付属細胞によって飲み込むことができない。従って、大きい粒子は連続抗原
刺激の貯蔵所として働く。これらの大きい粒子からの抗原放出速度は、粒子自体
の再吸収速度に少なくとも間接的に依存する。一具体例では、小さい粒子と大き
い粒子の組合せが、抗原放出の脈動的パターンを作り出し、これによって初期の
一次注射、次いで多数のブースター注射を利用する免疫処置のシナリオ中に典型
的に見られる抗原濃度のプロフィルを真似ることができる。
因的に影響を及ぼすかもしれない。一般に、ACPアジュバントは、球状及び(
又は)時として融合して現われる粒子を含有する。球状のACP粒子は、例1に
従って製造される。PCA燐酸カルシウム粒子は、外観が針状である。針状粒子
を含有するアジュバントは、一般に、板状又は球状粒子を含有するアジュバント
と比較したときに大きい応答を生じる。ある好ましい具体例では、アジュバント
は、例12に従って製造される針状粒子を含む。別の場合には、球状及び針状の
両者並びに板状粒子を使用することができる。例13に従って製造されたアジュ
バント粒子は、異なった粒子形状の組合せを表わす。
含む個々の粒子の物理的表面形状又は浮き彫り模様として説明される粒子の粗さ
を調節することによって内因的に制御することができる。多孔率、結晶化度及び
エッチングのような因子を含むパラメーターを使用して粒子の粗さを調節するこ
とができる。表面粗さの度合は、生体適合性に特異的な効果を及ぼすことが知ら
れており、極度の表面粗さは生体適合性の低下と関連している。理想的には、好
ましい具体例では、アジュバントは生体適合性であって、その上免疫応答を高め
ることができる。しかし、ある場合には、それは、あるレベルを犠牲にするよう
に表面粗さを増大させることによって満足できよう(“粒状生体物質に対する宿
主反応”(「生体物質及びバイオエンジニアリングハンドブック、Pt.A」V
ol.1、マーセル・デッカー社,NY、1995)(参照することにより含め
る)。この著書は、大きい宿主防御反応を誘発し得る骨よりも高い結晶化度を持
つ燐酸カルシウム物質を記載する。全表面積並びに表面粗さは、多孔率及び(又
は)細孔寸法を増大させることによって高められる。シャンバーグ氏は、最近、
チタニア及びポリスチレン粒子の高い表面積に相当するIL−1レベルの増大を
報告した(J.of Biomedical Materials Resea
rch Vol.28;p81−90;1994)。大きい表面積は増大された
免疫応答を促進させる。単位g当たりの表面積(比表面積)として報告される粒
子の表面積はガス収着により測定することができる。カンタクロム社から入手で
きるChemBET(登録商標)3000が液体窒素により冷却して粒子上に窒
素とヘリウムの種々の混合物を流すことによって表面積を測定する。
って更に特徴づけられる。粒子の粗さは、アジュバントを含む粒子の形状(例え
ば、球状、針状、板状)により影響されよう。ある具体例では、粒子の粗さの程
度は、所望の細胞又は免疫応答の補充(例えば、細胞性及び(又は)体液性活性
)に影響し得る。大きい粗さ度を持つ粒子よりなるアジュバントは、一般に、平
滑な粒子によるアジュバントよりも所望の細胞を引き付けそうである。免疫系は
、宿主に導入されたどんな異物にも応答する。粗い表面(ピーク及び谷)のアジ
ュバント(異物)は、宿主に対して一層険悪であり、完全な保護又は攻撃のため
の大きな免疫応答を生じさせるように思われる。更に、骨の成長のような別の技
術では、表面粗さは、骨形成細胞を結合させるための改善された接着性構造、即
ちスカフォルドを提供する(鈴木、1997)。この概念は、免疫応答と関連し
た細胞を引き付け且つ固定するようにアジュバントの表面に適合される。粒子の
粗さの度合は、走査電子顕微鏡並びにその他の高度の表面積測定装置により決定
することができる。好ましい具体例では、負荷された粗い表面のアジュバントは
、所望の免疫細胞(例えば、抗体)を結合させるための接着性構造を提供する。
顕在化させない。アジュバントのpHは、アジュバントの適用及び使用された抗
原に依存して変化する(ある種の抗原の安定性はpHにより影響を受ける)。一
般に、アジュバントのpHは、約4.0〜約10.0であり、更に好ましくはp
H値は約6.0〜約9.0であるべきである。ある具体例では、アジュバントの
pHは、発熱性又は細胞毒性宿主応答を顕在化させるためには一層酸性(例えば
、0〜3)又は塩基性のpH(例えば、11〜14)であってよい。 好ましい具体例では、カルシウムベースのアジュバントの内因性pHは、製造
中の出発物質又は先駆物質により調節される。出発物質の製造及び比率は、アジ
ュバントのpHを制御するように変えることができる。その他の場合に、沈殿又
はゲルのpHを調節することができる。好ましい具体例では、カルシウム塩は、
アジュバントの所望のpH又はその近傍でのpKaによって選択される。その他
の具体例では、pHは酸又は酸性緩衝液(例えば、燐酸、塩酸、一塩基性燐酸ナ
トリウム、酢酸)を添加することによって低下され、或いはpHは塩基又はアル
カリ性緩衝液(例えば、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム
)を添加することにより或いは斯界で知られているように所望の範囲にpKaを
有する緩衝剤を使用することにより上昇される。さらに他の具体例では、ペース
ト又はスラリー形態のアジュバントのpHは、特定のpH緩衝溶液を水和剤とし
て導入することによって制御することができる。pHの極端なものは抗原−抗体
結合の静電的相互作用を弱め得るので、好ましい具体例では、アジュバントのp
Hは、抗原−抗体錯体のpHと相関される。しかし、希な場合には、アジュバン
トの活性を助成するためにはアジュバントの生体適合性を犠牲にし、pHを極端
な値に拡げることができる。
せ、高め、又はある場合には抑制することができる。マクロファージ(例えば、
Mac−3)、T細胞(例えば、CD3e、CD4、CD8a)並びに及びB細
胞(例えば、CD45R/B220)は、特定の処方のために内因的に高められ
たアジュバント適性を有した異なった燐酸カルシウムアジュバントの注射又は移
植の後に選択的に増強することができる(例18)。また、特異的免疫応答成分
の操作は、投与経路、アジュバントの組合せ、抗原の取り扱い、サイトカインの
存在下での免疫処置及び(又は)種々のキャリアーの使用の選定によって影響を
受け得る。これらのアジュバント操作法を特定のワクチンに適用するためには、
免疫系のどの成分を標的にすべきか(例えば、体液性又は細胞性)を認識するこ
とが役立つ。場合によっては、免疫系の全ての成分が身体を攻撃から保護するよ
うに機能するが、ある場合には、ある成分を他のものよりも最初に顕在化させる
ことが望ましい。例えば、好酸球は寄生虫感染を保護するように望まれ、肥満細
胞はアレルギー応答において重要である。更に、Tヘルパー細胞タイプは、細胞
媒介免疫応答が望まれるときに顕在化させることができ、B細胞は体液性応答が
望まれるときに顕在化させることができる。更に、CD8細胞は補充することが
でき、又はサイトカインは、腫瘍組織を標的にする時にアジュバントと併用でき
る。何故ならば、これらの細胞タイプは腫瘍組織と戦うことが知られているから
である。所望のタイプの細胞応答が一度認識されれば、上記のパラメーターは、
所望の細胞又は細胞タイプからの高められた応答を顕在化させるように、ここで
説明した通りに調節することができる。例18の表1は、所望の免疫応答に基づ
いた適当なアジュバント処方物を選定するためのガイダンスを提供する。細胞性
免疫応答のレベルは、製造された燐酸カルシウムアジュバントのアジュバント活
性を指示するものであり、応答が高いほど、アジュバント活性は大きい。例えば
、特異的ACPアジュバント(例7に従って製造した)は、増強されたB細胞及
びマクロファージ応答を顕在化させるために使用される。更なるガイダンスは、
ゴールデイング氏の文献(Annuals N.Y.Academy of S
cience 754;1995;p127−137)及びニューマン氏の文献
(J.of Immunology 148;1992;p2357−2362
)に見出すことができる。
/アジュバントの組合せの使用を説明する。腫瘍細胞の近傍にある持続的に高濃
度のサイトカイン(例えば、IL−2、IL−4、IL−6、IFN−γ、TN
F−α、GM−CSF)は、抗原特異性及び非特異性T細胞の双方により腫瘍に
対する免疫応答を増幅させることによって、抗腫瘍活性を刺激することが知られ
ている。免疫応答を適当な本発明のアジュバントと組合わせることによってサイ
トカイン遺伝子に基づく癌ワクチンは、注入した腫瘍細胞を一般的に根絶させる
ことに加えて、長期間の全身抗腫瘍活性を誘発させる。本発明の燐酸カルシウム
アジュバントへのγ−インターフェロン及びIL−12のようなサイトカインの
外因的な組み入れは、組み入れられた抗原に対する体液性応答と細胞性応答の双
方を押し上げることができる。IL−1は、Bリンパ球を直接刺激することによ
って抗体の産生を増加させ、IL−2の産生を増加させることによってT細胞の
増殖を強化させることが知られている。IL−6は、免疫グロブリンの産生を刺
激する能力を有する。IFN−γはヘルパーT細胞を活性化させる。IL−12
は、ウイルス感染の制御のため細胞媒介免疫を増大させることが立証された。ア
ジュバントにサイトカインを使用することについての更なるガイダンスは、「ワ
クチン設計」(パウエル氏、プレナムプレス社、NY.1995)及び「免疫微
生物学 付録II」(カレント・バイオロジー社/ガードランド・パブリッシング
社、N.Y.1996)(共に参照することによってここに含める)に見出すこ
とができる。徐放性燐酸カルシウムアジュバントは、腫瘍の成長を調節又は抑制
するためにサイトカインを送出するのに特に有用である。大きいミクロスフェア
(20〜40μm)に封入された抗原は抗原の遅い放出のために使用できるが、
ミクロン未満の粒子(<1μm)に封入された抗原は迅速なマクロファージの取
り込み及びその過程を誘発させるのに使用することができる。サイトカインの放
出を特異的に誘発させ、これにより応答の増強をもたらすアジュバントの使用は
、また本発明の範囲内にあるものと思われる。
向上手段と組合わせて製造できる。更に詳しくは、アジュバント適性向上剤は、
その他の既知のアジュバント、例えば水酸化アルミニウム、燐酸アルミニウム、
ムラミルジペプチド、生分解性重合体ミクロスフェア、リポソーム及びその他の
物であってよい。例えば、フロイント完全アジュバント(CFA)はTh1細胞
を活性化して遅延型の過敏性を生じるが、明礬はTh2細胞を活性化して体液性
応答を開始させる。それぞれのアジュバント単独は独特の応答を与えるので、ア
ジュバントの組合せは、単一のアジュバントによるよりも更に可能性ある免疫応
答を与えることができる。このようなアジュバントの組合せは、特定のタイプの
免疫応答を増強させて追加的な又は相乗的な最終効果を生じさせる別々の成分か
ら作られよう。例えば、体液性(B細胞)応答を顕在化させる適当な特性を持つ
本発明の燐酸カルシウムアジュバント(例1、3及び5に従って製造)は、細胞
性(T細胞)効果を誘発させて完全な宿主応答を生じさせることが知られたムラ
ミルジペプチドと併用できよう。抗原の選択及び所望のアジュバント適性のよう
な多くの決定因子がアジュバントの適当な組合せを決定しよう。本発明の燐酸カ
ルシウムアジュバントは、基本的又は一次アジュバント及び任意の内因性応答向
上剤として働く。更に特定の生物学的応答のためには追加の外因性アジュバント
適性向上剤が添加されよう。好ましい具体例では、燐酸カルシウム物質(例1〜
17に従って製造)は、アジュバントの>50%、更に好ましくは>75%、最
も好ましくは>90%を占める。残りのアジュバント成分は、単独で又は組合わ
せて選定できる。このようにして、アジュバントは、特異的ワクチン接種の要求
及び所望の応答に従って形成される。大抵の場合に、水酸化アルミニウムを使用
する具体例は、非再吸収性又は低再吸収性の燐酸カルシウムアジュバントを伴う
。ムラミルジペプチドは、燐酸カルシウムアジュバントに組み入れて宿主応答、
特に細胞性免疫を高め又は増強させることができる。更に、その他のアジュバン
ト適性向上剤、例えばQS−21及びMPL−Aを細胞性応答を誘発させるのに
使用することができる。
リ(ホスファゼン)、部分生分解性重合体)も、それ自体本発明の燐酸カルシウ
ムアジュバントのための送出ビヒクルとして働くことによってアジュバント活性
を増大させることができる。更に、リポソーム及び重合体は、グリュック氏によ
る「抗原のリポソームによる表出」(パウエル編「ワクチン設計」、プレナムプ
レス社、N.Y.1995)に報告されているように、アジュバントポテンシャ
ルを有するものと思われる。好ましい具体例では、リポソーム又は重合体は、燐
酸カルシウムアジュバントを封入してミクロスフェアを生じさせる。重合体及び
リポソームを使用するカプセル化法は、当業者に周知である。ミクロスフェアの
寸法は、製造中に制御される。小さいミクロスフェア(<10μm)と大きいミ
クロスフェア(>10μm)との共同使用は、第一及び第二の免疫処置及びブー
スターのそれぞれについて典型的に見られる抗原放出の脈動的動きを作り出す。
抗原は、リポソーム又は重合体、燐酸カルシウムアジュバント又は両者と結合(
組み入れ又は吸着)させるできる。燐酸カルシウム/リポソームアジュバントも
、ワクチンを改善させる任意の物質、例えば所望のサイトカイン、その他のアジ
ュバント及び複合体物質を捕捉することができる。
バント物質単独では可能でない程度まで変えることが望ましいかもしれない。そ
のような場合には、アジュバントは、1種以上の補充物質の添加により複合体形
態で使用できる。補充物質は、本発明のアジュバントに添加されてアジュバント
の物性又は特性、例えば、引張強さ、弾性又は屈曲を変化させる物質である。あ
る場合には、補充物質は、向上剤としても働くことができる。補充物質は、任意
の好適な形で(例えば、粒状、繊維状)で供給できる。好ましい具体例では、補
充物質は、本発明の燐酸カルシウムアジュバントに1〜50%、好ましくは1〜
20%の容量比で合成中に又は製造後に添加される。再吸収性燐酸カルシウムア
ジュバントを包含する具体例では、補充物質もまた生体再吸収性であることが好
ましいが、しかし、再吸収速度は変化できる。 複合体アジュバント系は、伝統的な一次/ブースター免疫処置作戦で観察され
るようなものと類似する送出速度で設計することができる。そのような具体例で
は、抗原は、最適な免疫処置と関連した適当な抗体応答レベルを誘発させるよう
に、計算された間隔及び(又は)速度で放出される。そのような複合体アジュバ
ントは、それらが一層再吸収性のアジュバントとそれほど再吸収性でないアジュ
バントの双方の望ましい特性を含むので有用である。また、追加のオプションと
して、その相対比は、異なった再吸収プロフィルを生じさせるように変えること
ができる。ある具体例では、複合体は、その製造と関連するアジュバントの追加
の特性の一つ以上、外科的又は貯蔵での特性を向上させる。
への1種以上の補充物質の添加を要求する。補充物質は、それ自体で複合体であ
ってよい。補充物質は、カルシウムアジュバントのためのマトリックスとして働
いてよく、アジュバントはこのマトリックス内に埋め込まれ又は分散される。別
法として、カルシウムアジュバントは、補充物質のためのマトリックスとして働
いてよく、補充物質はその中に分散される。好ましい具体例では、カルシウムベ
ースのアジュバントは、可撓性を増大させるためにポリ−L−乳酸(PLLA)
及び(又は)ポリグリコリド(PGA)と混合される。燐酸カルシウム複合体の
製造についてのガイダンスは、共に継続中の米国特許出願第08/732,01
6号に見出される(ここで参照することによりここに含める)。好ましい具体例
では、燐酸カルシウムアジュバントは、異なった再吸収速度を持つ燐酸カルシウ
ムの複合体として製造される(例34を参照)。異なった再吸収速度を有する多
数の燐酸カルシウムを一つのアジュバント系に併用させることによって可変の送
出速度を達成することができる。
シウム複合体として製造することができる。特定の移植部位のためには、それは
曲がったり又はねじれたりする(例えば、皮下の位置又は鞘内の位置)可撓性ア
ジュバントを有することが望ましいであろう。その他の場合には、更に硬質のア
ジュバントが望ましい(例えば、腹腔又は中枢神経系)。一般に、複合体物質の
製造者及び製作者に知られた方法がこれらの場合に有用である。斯界で知られた
充填剤及び結合剤のような補充物質を使用して複合体カルシウムアジュバントの
強度及び弾性を変えることができる。好ましい一具体例では、10〜20容量%
のDextran(登録商標)(シグマ・ケミカル社製)が本発明の燐酸カルシ
ウムアジュバントに可撓性を付与するために添加される。Dextranの量を
増加させれば可撓性の度合は高くさせるであろう。
を製造する方法を提供する。具体的には、本発明のアジュバントのRESの取り
込みが表面処理、被覆、界面活性剤及び(又は)磁場を使用することによって回
避されるため、特異的な適当な免疫細胞の補充が増強され得る。RESの取り込
みを遅らせるようにナノ粒子の表面を被覆するためにポロキサマー(例えば、P
oloxamer188及びPoloxamer338)が使用された。好まし
い具体例では、燐酸カルシウムアジュバント/免疫原−ナノ粒子が、ナノ粒子の
表面に強く吸着する選定されたポロキサマーを1%含有する塩水又は水に懸濁さ
れる。被覆された粒子は静脈内投与に特に有用である。被覆された粒子は、特に
静脈内で注射されるときに、被覆してない粒子よりも一層他の標的部位(例えば
、腫瘍組織)に到達しそうである。また、斯界で知られたその他の好適な被覆及
び界面活性剤も抗原を負荷された粒子を所望の部位に向けさせるのに有用であろ
う。界面活性剤を使用することについての更なるガイダンスは、イラム氏(FE
BS Letters167;1984;p79−82)及びロイ氏(J.of
Pharm.Sci.73;1984;p1433−1437)の論文に見出
すことができる。
活性剤の標的部位への制御された送出を管理することが望ましいであろう。効能
を向上させるように磁場が標的の周囲に加えられる。磁性アジュバント粒子は磁
場に引き付けられ、標的の周囲に濃縮する傾向があり、これによって活性剤を適
当な部位に焦点として送出させる。この具体例の一例では、燐酸カルシウムアジ
ュバント/抗原−ナノ粒子が蒸留水又は塩水中で適当な量のマグネタイトと混合
される。被覆されたナノ粒子は静脈内投与される。大抵の場合に、どんな部位も
選定できるが、腫瘍部位が特に標的とされる。磁性材料を使用することについて
の更なるガイダンスは、ビッダー氏(Europ.J.of Cancer a
nd Clin.Oncology19;1983;p135−139、p14
1−147)(参照することによりここに含める)に見出すことができる。 他の具体例では、カルシウム塩と任意の追加の物質との複合体が、カルシウム
アジュバントと補充物質との混合物に流体を添加することによりペースト状で製
造される。次いで、このペーストは乾燥により又は硬化反応と組合わせて硬化さ
れる。
及び(又は)送出するように製造することができる。ニーズに従って調節できる
パラメーターには、表面処理、多孔率、粒度及びその他のものが包含される。低
温条件で製造されるヒドロキシアパタイトのような燐酸カルシウム及びPCA燐
酸カルシウムが非晶質燐酸カルシウムと共に好ましいアジュバントである。これ
らの燐酸カルシウムの製造は、それぞれ継続中の米国特許出願第08/554,
817号並びに発行されたリー氏他の米国特許第5,650,176号、同じく
リー氏他の5,676,976号及び同じくリー氏他の5,683,461号、
更に本例1〜17に記載されている。好ましい具体例では、アジュバントはゲル
、ペースト、ペレット、ガーゼ/メッシュ又は焼結ブロックとして製造される。
ゲルは、一般に沈殿により形成される。沈殿の熟成時間は種々の粒度を生じさせ
るように変えられる。一般に、熟成時間が長いほど、粒度は大きくなる。ある具
体例では、ろ過し洗浄した後、ゲルはアジュバント物質として使用することがで
きる。他の具体例では、ゲルは、ペースト又はパテを作るために生理学的/無菌
塩水又は水のような水性媒体と種々の濃度で混合される。更に他の具体例では、
ゲルは粉末にするために凍結乾燥される。この粉末は、ペースト又はパテを作る
ために塩水のような水性媒体と種々の濃度で混合される。このペースト又はパテ
は硬化させることができる。好ましい具体例では、アパタイト質燐酸カルシウム
アジュバントは約37℃又は体温で硬化する。硬化された物質は、種々の寸法の
粒子を形成させるように破壊、粉砕、ミル粉砕又は破砕することができる。次い
で、粒度を上記のようにして変性し又は調節することができる。これらのカルシ
ウム化合物は、斯界で知られた任意の好適な手段(例えば、吸着、共沈により又
は結合剤若しくは充填剤の使用)によって活性剤を混合することによりアパタイ
トとして形作ることができる。
からアジュバントゲルを製造するときは、結晶構造及び付随する粒度は熟成中に
又は温度によって調節することができる。この開示のために、熟成は、母液との
接触中の沈殿の熟成時間であると考えられる。好ましい具体例では、粒度は、ゲ
ルの熟成時間を増大させることによって増大される。更に結晶性のアパタイト質
燐酸カルシウムは、短い熟成時間を要求する一層非晶質形態のものと比べて長い
熟成時間を要求する。高い温度は通常一層結晶性の粒子を生じる。
粉末の(凍結乾燥され又はされていない)粒度は、篩い分け、ミル粉砕及び異な
った温度での処理によって制御することができる。粉末の篩い分けは、粒子を寸
法に従って、通常は最小から最大まで分離させることができる。好ましい具体例
では、粉末はミル粉砕される。大抵の場合に、ミル粉砕時間が長いほど粒度は小
さい。他の具体例では、粉末は、種々の温度に加熱される。ACP粉末の結晶化
度を増大させるのに高温(例えば、400℃〜600℃)を使用することができ
る。しかし、約450℃までの温度については、ACPの非晶質特性が保存され
るが、比表面積は低下し、粒度の低下を示す。他の具体例では、カルシウムベー
スのアジュバントの硬化形態をミル粉砕、微粉砕及びその他の方法によって粒子
に破砕することができる。ナノメーター以下の寸法範囲の微細粉末(例えば、A
CP)は、型内で圧縮し(例えば、圧縮強さ:500psi)、次いでミル粉砕
し、篩い分けして所望の粒度を得ることができる。粒度を制御するために斯界で
知られたその他の方法も本発明の範囲内にあるものと考えられる。
配合することができる。追加の部分を持つ活性剤をカルシウムベースのアジュバ
ントと溶解、吸着、共沈、水和媒体中での遠心分離、カプセル化、拡散をベース
とした過程又は斯界で知られた任意の方法により組み入れることができる。好ま
しい具体例では、活性剤は、特定の活性剤と相溶性の緩衝剤系の存在下にカルシ
ウムアジュバントに製造中に吸着される。好ましい具体例では、吸着は、最低の
緩衝剤濃度(例えば、0.001MのTRIS、pH7.0)の存在下に及び一
般に燐酸イオンを殆ど又は全く存在させないで(例えば、<0.1M)比較的低
いイオン強度(例えば、0.001M〜0.2MのNaCl)の条件下で起る。
活性剤を吸着させることについての更なるガイダンスは、レリベルド氏の米国特
許第3,925,545号及び同4,016,252号並びにレリベルド氏のD
evel.in Biolo.Standarization(65;1985
;p131−136)(参照することによりここに含める)に見出すことができ
る。トウエイ氏他は、米国特許第2,967,802号で、燐酸カルシウム−抗
原ゲル組成物を製造する方法を記載している。燐酸カルシウムに十分に吸着する
蛋白質及び核酸に特に有用な好ましい具体例では、燐酸カルシウムアジュバント
(例16に従って製造)は、ヌクレオチド又は蛋白質免疫原を含有する緩衝され
た低イオン強度(例えば、0.001MのNaCl;0.01MのTRIS、p
H7.4)の水性媒体中に置かれる。ヌクレオチド又は蛋白質免疫原の濃度は、
変動し、通常は10.0mg/ml以下である。免疫原は、アジュバントの表面
に吸着される。次いで、アジュバントは、表面に十分に吸着されなかった免疫原
を除去するようにすすぐことができる。
として製造される具体例では、活性剤は、ビヒクルと一体的に製造され得る。詳
しくは、活性剤は、その生物学的活性が保持又は増強され且つ硬化過程が起り得
る溶液中に、通常は緩衝された溶液中に懸濁することができる。この溶液は次い
でアジュバント先駆物質と混合されてペースト、ゲル又は固体が形成され、或い
はそれは沈殿反応に添加され、生じた沈殿と共沈され又はその中に捕捉される。
これにより活性剤はアジュバントの一体化した要素となる。アジュバントの製造
が完了した後に、アジュバント/ビヒクルは次いで受容者に移植される。このよ
うに仕上げられたアジュバント/ビヒクルは、一般に単一のデバイスの形である
か又は粒状形態である。
れる。活性剤はアジュバント粒子と凝集されて粒子/活性剤凝集体が形成される
。更に他の具体例では、活性剤はカルシウムアジュバントに結合される。結合方
法には、浸漬、ロール掛け、噴霧、プレス、糊付け、ペースト化及び塗装が含ま
れるが、これらにの限定されない。別法として、活性剤及び(又は)その他の部
分は、デバイスの製作に使用された充填剤又は結合剤中に存在できる。これらの
方法及びその他は斯界で周知である。化学的結合(共有、イオン及び水素)は、
アジュバントと抗原を結合させるのに使用される別の方法である。好ましい一具
体例では、免疫原は、斯界で知られた方法により、蛋白分解に敏感なリンカーの
使用によってビヒクルに共有結合される。
トによって包まれ又は封入される。そのような具体例では、アジュバントは抗原
を含有するためのカプセルとして作用する。アジュバントは再吸収性であるので
、抗原はアジュバントが枯渇したときに身体に導入され、宿主にある薬量の抗原
を提供する。ある具体例では、仕上げられたアジュバントビヒクル/デバイスは
、活性剤を層状形態で含有する。このような層は、活性剤が層から逐次放出され
て、多数回薬量の投与を可能にさせる。一般に、この処方で調製されたデバイス
は、適切な送出特性のために層の溶解度特性に頼っている。アジュバントが共に
浸透性で且つ再吸収性である更に他の具体例では、カプセル封入された抗原は、
カプセルが再吸収過程により破壊されるまで、制御された放出態様でアジュバン
ト/ビヒクルから拡散する。そのような時点では、残っている免疫原は最終送出
パルスに放出される。層状の構造を使用し又は固体を含まない形の技術により活
性剤を包むことによりビヒクルを製造するための特別の具体例がシーマ氏により
米国特許第5,490,962号及び同5,518,680号(参照することに
よりここに含める)に記載されている。固体を含まない形の技術は、アジュバン
トの三次元形状を変化させることによってアジュバントの性質(例えば、放出速
度、アジュバント適性)を修正することができる。この技術は、生物活性剤の徐
放並びに細胞の移植及び成長にとって有用である。固体を含まない形の一具体例
では、リー氏他により米国特許第5,676,976号(参照することによりこ
こに含める)に記載されているような再吸収性燐酸カルシウム粉末が、免疫原を
予め負荷させてある再吸収性の少ない燐酸カルシウム粉末をカプセル化するため
のマトリックスとして使用される。また、免疫原もマトリックス内に存在する。
再吸収が遅い燐酸カルシウムの存在は、免疫原の長期間送出速度を確実にさせる
。
ウムアジュバントの表面を変性することが望ましいであろう。アジュバントは、
斯界で知られているように二つの相の間の界面を変化させるようにプラズマエッ
チング又はスパッターコーチングのような表面処理に付すことができる。表面処
理は、蛋白質のような活性剤のためのアジュバントの親和性を増大させ又は増強
させるために使用することができる。プラズマエッチングは、デバイスの生体適
合性又は活性剤若しくはその他の剤のアジュバントに対する結合特性を変性でき
る変化された又は粗いアジュバント表面を提供するのに使用できる。プラズマエ
ッチングを利用する方法及び適用のための更なるガイダンスは、共に継続中の米
国特許出願第09/008,650号(参照することによりここに含める)に見
出すことができる。
割を果たす。大抵の場合に、粒子の粗さの増加は燐酸カルシウムアジュバントに
対する活性剤の結合能力を高める。他の場合には、粒子の粗さは、細胞(例えば
、マクロファージ)が本発明のアジュバントと相互作用する能力に影響するよう
に調節することができる。本発明のアジュバントは適切な免疫応答を補充するよ
うに設計することができ、適当に粗い表面はアジュバント−抗原構造に対するこ
れらの細胞の結合を高める。粒子の粗さは、上記したように、エッチング、コー
チング及び固体を含まない形の技術のような表面処理に加えて、沈殿物質の熟成
時間又は結晶化度に従って変えることができる。 本発明のアジュバントの結晶化度の度合は、共有結合によろうと又は吸着法に
よろうとアジュバントに対する抗原の結合に影響を与える。一般に、結晶化度が
大きいほど、結合のための親和性は大きい。結晶化度は、X線回折により決定す
ることができる。一般に、結晶化度は、沈殿したアジュバントについて長い熟成
時間によって及び加熱又は焼結によって増大させることができる。
に選定できる。他の場合には、最適な抗原−アジュバントの縁組みを決定するた
めに試験を実施することができる。種々のイオン条件及び緩衝剤の存在下でのア
ジュバントが抗原と結合する能力は、スクリーニング(例えば、蛍光標識付け又
は放射能標識付け)することができ、最良の縁組みは斯界で知られた種々のイオ
ン強度で固体燐酸カルシウムに対する部分の結合を評価するための方法によって
選定される。抗原又はその他の部分の効果的な組み込みは、抗原が塩基性分子と
強く相互作用し且つそれに結合するようになるときに起る。これらの場合には、
抗原は分子に結合したままであり、アジュバントに捕捉されたようになる。
これらの断片、核酸、蛋白質、熱ショック蛋白質(HSP)、ハプテン、トレロ
ゲン、アレルゲン、免疫原、抗生物質、そしてその他の生物活性部分又は生合成
経路の成分が包含されるが、これらに限定されない。宿主に送出させるのに好適
な化合物の更に完全なリストは、「ワクチンの設計、サブユニット及びアジュバ
ントによるアプローチ」(パウエル他編、プレナムプレス、NY、1995)(
参照によってここに含める)に見出すことができる。
激するために使用される。例えば、腫瘍付近への活性剤を含まないアジュバント
の局所移植は、腫瘍を拒否するのに十分な局所反応を補充するのに十分であるか
もしれない。これらの場合には、1種以上のアジュバント適性向上剤又は向上用
の戦略、例えば、特異的サイトカインの組み入れ及び粗い表面のビヒクルの使用
を採用することが有益であろう。他の場合には、アジュバントは、抗原の前に又
は後に宿主に導入されるが、アジュバント及び抗原は一体として併用されない。
れの適用についって決定されねばならない。絶対的な薬量はアジュバントに負荷
される活性剤の総量であるのに対して、長期の薬量は単位時間当たりの受容者に
放出し送出される活性剤の量である。薬量についてのこれらの二つの観点の相対
的重要性は、投与の目的及び活性剤の性質に依存する。一般に、免疫学的記憶を
確立するためには多量のワクチンが要求されよう。投薬は、好ましくはアジュバ
ントの再吸収速度と結び付けて調節される。再吸収が速いアジュバントは、再吸
収が遅いアジュバントよりも迅速に薬量を送出させる傾向がある。何故ならば、
それは宿主に迅速且つ増大した濃度で導入されるからである。好ましい具体例で
は、アジュバントの再吸収速度は、伝統的な初期免疫処置、次いで後続の又はブ
ースターの免疫処置を真似る。抗原特異性なリンパ球、特にメモリーBリンパ球
の導入及び有効なワクチン摂取のためには免疫処置の間の時間の長さ(安静期間
と呼ばれる)が通常必要である。一般に、長い安静期間(例えば、数週間又は数
ヶ月)は最高の抗体応答を生じさせる。
導入されるが、限られた場合には、それは固体、スラリー又は液体であってよい
。粒状形態のときは、アジュバントは、一般に1nm〜200μm、好ましくは
1nm〜10μm、最も好ましくは1nm〜900nmの粒子直径を有する。こ
れらの粒子は、単独で又は大きい粒子と共に存在する。送出ビヒクル又はアジュ
バントは、任意の有効な方法によって宿主に導入することができる。 好ましい具体例では、注射して注射後に体内で硬化するようなペースト状アジ
ュバントが調製される。例17に従って製造されたアパタイト質燐酸カルシウム
アジュバントは、皮下又は筋内注射することができ、体温(37℃)で硬化する
。注射可能ペーストは、宿主に皮下、筋内、皮内又はその他の注射経路により導
入することができる。他の具体例では、アジュバント粒子は、ペーストと混合さ
れ、注射される(例えば、筋内、皮下、静脈内)。ペーストに関して粒子の容量
%は、所望の薬量又はアジュバント活性に依存して調節できる。更に、他の具体
例では、ペーストは経皮及び(又は)粘膜による送出を行なうためにローション
のように塗ることができる。 アジュバントが固体、例えばペレット又はブロックであるならば、それは一般
に外科的に移植される。また、それは座薬として提供できる。また、送出用カニ
ューレを使用する方法も採用できる。 ある種の具体例では、アジュバントは、液体又はその他の種々の粘稠な物質中
に懸濁することができる。好ましい具体例では、ナノメーター寸法のアジュバン
ト粒子がスラリー又は液体中に懸濁され、任意の適当な手段、好ましくは注射に
よって投与される。スラリー中の粒子の容量%は、所望の薬量又はアジュバント
活性に依存して調節できる。ある場合には、アジュバントは、経口的に又は眼を
経由して或いは吸入薬(鼻内投与)として投与することができる。吸入薬による
投与は、ナノ又はミクロ粒状形態で乾燥(水和されていない)ビヒクルを使用し
得る。アジュバントの眼を経由する投与を使用する具体例は、典型的に非毒性水
性媒体に懸濁された薬剤を負荷したナノ粒子よりなり、点眼剤として投与される
。ある場合には、粒子は軟膏に見出され、眼に投与される。
という利点を提供する。宿主に導入されるや、アジュバント/デバイスは活性剤
を送出させる。本発明のアジュバントは、抗原を所望の速度で送出させる。好ま
しい具体例では、アジュバントは、宿主への抗原の貯蔵所送出を提供する。更に
、アジュバントは、抗原の部位特異性送出を提供する。標的部位特異性送出は、
活性剤の治療効能を改善し且つ望ましくない副作用を削減させることが知られて
いる。特定な標的には、腫瘍組織、活性剤注射の優先の若しくはその後の部位及
び(又は)拒否を望む任意の部位が包含され、或いは特異的抗原に対するワクチ
ン接種の場合には好ましい部位は最適の免疫処置をもたらす部位(例えば、脾臓
、肝臓、腎臓、リンパ節など)である。
すもので、本発明の限定と見なすべきではない。
た、43gのCa(NO3)2・4H2Oを0.5Lの蒸留水に迅速に溶解する
ことによって室温で溶液Bを調製した。 次いで、迅速に攪拌している溶液Aに溶液Bを迅速に添加することにより室温
で炭酸化非晶質燐酸カルシウムを製造した。このようにして形成されたゲル状非
晶質燐酸カルシウムの沈殿を室温でほぼ30秒間熟成又は放置した。熟成した後
、沈殿をろ紙(0.05m2)を使用して中程度のろ過速度及び約10−2トー
ルの真空圧下にろ過した。沈殿は薄いケーキを形成していて、ろ過用ロートにほ
ぼ4Lの蒸留水を添加することによって水洗した。ゲルのpHをpHプローベを
使用して測定し、pH13.5であると決定された。
CPアジュバントを製造した。次いで、洗浄した物質をスパチュウラを使用して
集め、2.5Lの容器に入れた液体窒素中に浸漬した。固い凍結片の形成後、容
器を真空室(10−1〜10−2トール)に微細な乾燥粉末が得られるまで24
時間入れた。
正して、ACPアジュバントを製造した。
る。 例1に従うが、ただし以下のような修正を加えて、ACPアジュバントを製造
した。80gのNa2HPO4・7H2O、40gのNaHCO3、1gのNa4 P2O7・10H2Oを1.0Lの蒸留水に迅速に溶解することによって室温
で溶液Aを調製した。また、35gのCa(NO3)2・4H2O、1gのMg
Cl2・6H2Oを0.5Lの蒸留水に迅速に溶解することによって室温で溶液
Bを調製した。 次いで、迅速に攪拌している溶液Aに溶液Bを迅速に添加することにより室温
で炭酸化非晶質燐酸カルシウムを製造した。このようにして形成されたゲル状非
晶質燐酸カルシウムの沈殿を室温でほぼ30秒間熟成又は放置した。母液の存在
下に熟成した後、沈殿をろ紙(0.05m2)を使用して中程度のろ過速度及び
約10−2トールの真空圧下にろ過した。物質は薄いケーキを形成していて、ろ
過用ロートにほぼ4Lの蒸留水を添加することによって水洗した。沈殿のpHを
pHプローベを使用して測定し、pH7.3であると決定された。
した。洗浄した物質をスパチュウラを使用して集め、2.5Lの容器に入れた液
体窒素中に浸漬した。凍結に続いて、物質を真空室(10−1〜10−2トール
)に微細な乾燥粉末が得られるまで24時間移した。
した。沈殿を室温で30分間熟成した。
した。55gのNa2HPO4・7H2O、20gのNaOH、50gのNaH
CO3、2gのNa2P2O7を1.3Lの蒸留水に迅速に溶解することによっ
て室温で溶液Aを調製した。また、100gのCa(NO3)2・4H2O、1
gのMgCl2・6H2Oを0.7Lの蒸留水に迅速に溶解することによって室
温で溶液Bを調製した。ゲルのpHをpHプローベを使用して測定し、pH9.
0であると決定された。
した。沈殿を室温で30分間熟成した。洗浄した物質をスパチュウラを使用して
集め、2.5Lの容器に入れた液体窒素中に浸漬した。凍結に続いて、容器を真
空室(10−1〜10−2トール)に微細な乾燥粉末が得られるまで24時間移
した。
ュバントを製造した。
。 218gの燐酸ジナトリウムNa2HPO4・12H2Oを1.2Lの蒸留水
に溶解してなる溶液及び70gのCa(NO3)2・4H2Oを0.5Lの蒸留
水に溶解してなる溶液を調製した。カルシウム溶液を燐酸塩溶液に室温で攪拌し
ながら迅速に注いだ。沈殿は直ちに起り、実質的に完全であった。酸性燐酸カル
シウムの形成を回避するために水酸化ナトリウム溶液を添加することにより沈殿
をpH6.4に調節した。ろ過する前に沈殿を室温で5分間熟成した。次いで、
沈殿をブフナーフィルター(全表面積が約0.1m2)によりろ過し、約3Lの
蒸留水により洗浄した。ろ紙上に低結晶性燐酸カルシウムのゲル状ケーキが得ら
れた。
。 例10に従うが、ただし以下のような修正を加えて、燐酸カルシウムアパタイ
トアジュバントを製造した。洗浄した沈殿をスパチュウラを使用して集め、2.
5Lの容器に入れた液体窒素中に浸漬した。凍結に続いて、容器を真空室(10−1 〜10−2トール)に微細な乾燥粉末が得られるまで24時間移した。
。 例10に従うが、ただし水酸化ナトリウム溶液を添加することにより沈殿をp
H7.1に調節したことを除いて、燐酸カルシウムアパタイトアジュバントを製
造した。
。 例11に従うが、ただし沈殿を水酸化ナトリウム溶液を添加することにより沈
殿のpH7.1に調節したこと及びろ過する前に室温で48時間熟成したを除い
て、燐酸カルシウムアパタイトアジュバントを製造した。
。 例10に従うが、ただし以下のような修正を加えて、燐酸カルシウムアパタイ
トアジュバントを製造した。洗浄した沈殿をスパチュウラを使用して集め、2.
5Lの容器に入れた液体窒素中に浸漬した。凍結に続いて、沈殿を真空室(10−1 〜10−2トール)に微細な乾燥粉末が得られるまで24時間移した。
。 例10に従うが、ただし以下のような修正を加えて、燐酸カルシウムアパタイ
トアジュバントを製造した。沈殿用溶液のpHをろ過する前に水酸化ナトリウム
溶液を添加することによりpH7.1に調節し、また沈殿は室温で48時間熟成
した。
に溶液B(17.1gのCa(NO3)2・4H2O、0.250Lの蒸留水、
pH5.5〜6)を迅速に添加することにより室温で燐酸ジカルシウム二水塩(
DCPD)を製造した。その後直ちに、試料をろ紙(0.05m2)を使用して
中程度のろ過速度及び約10−2トールの真空圧下にろ過した。物質は薄いケー
キを形成していて、これを約2Lの蒸留水で洗浄し、次いで室温で24〜72時
間乾燥した。 例1に従って反応性非晶質燐酸カルシウムを製造した。洗浄した物質をスパチ
ュウラを使用して集め、2.5Lの容器に入れた液体窒素中に浸漬した。凍結に
続いて、物質を真空室(10−1〜10−2トール)に微細な乾燥粉末が得られ
るまで24時間移した。次いで、物質を455℃(±3℃)で80分間加熱した
。 反応性非晶質燐酸カルシウム物質を乳鉢及び乳棒を使用してCaHPO4・2
H2Oと50:50重量%で3〜5分間物理的に乾式混合した。次いで、粉末混
合物に水(混合物質1g当たり1mL)を添加してペースト状コンシステンシー
の水和先駆物質を生じさせた。H2Oの添加量は、濃いか又は薄いペーストを望
むかどうかで変化させた。次いで、ペースト物質を、体温(37℃)近くになる
と固体状の塊に硬化するような湿った組織環境に置いた。硬化の過程は、それを
4℃の冷蔵温度に置くことによって数時間遅らせることができた。
造を説明する。乾燥ACP先駆物質及びDCPD先駆物質を例16に記載のよう
に製造した。ACPとDCPDを、乳鉢及び乳棒による混合の代わりに、SPE
X8508アルミナセラミック粉砕室を備えたSPEX8510実験室用ミルを
使用して2分間混合した。水和先駆物質の製造は、混合乾燥先駆物質の1g当た
り0.7〜1.5mLの水を添加することによって達成した。
の注射に対するマウスの局所皮下応答を説明する。これらの結果は、特異的燐酸
カルシウムアジュバントによる細胞性免疫応答の特異的観点を選択的に高める能
力を証明する。 塩水を注射対照例として使用した。被検アジュバントは、例1〜8、11〜1
3及び15に従って製造し、次いで塩水中のスラリーとして調製し、肩甲骨/背
側胸部領域に両側面に皮下注射により投与した。薬量はそれぞれの注射部位につ
いて0.05mLであった。消えないマークにより引いた円形がそれぞれの注射
部位を確認させた。動物は特定の時点(注射後72時間、7日、14日)で安楽
死させた。 背側胸部/肩甲骨皮下注射部位(左及び右)とその周囲の範囲の双方に限った
部分的な総合病理学的検査を、安楽死させた全ての動物について直ちに実施した
。1個の堅く青白い上昇した範囲を、種々のカルシウムベースのアジュバントを
投薬し、そして処理後72時間、7日及び14日で安楽死させた全てグループか
らのマウスの皮下注射部位(左及び右)のそれぞれで記録した。これらの上昇し
た領域は被検アジュバントの皮下注射に起因していた。 検死が完了したならば、動物の認識マークを10%中性緩衝ホルマリン中で保
持した(ただし、処理せず)。終末的に安楽死させた動物について、脳、脾臓、
胸腺、右及び左の背側胸部/肩甲骨の皮膚(注射部位)、下顎リンパ節、肝臓及
び肺を切り取り、保存した。それぞれの研究動物について、右の皮下注射部位を
パラフィンワックスに埋め込み、切片に分け、ヘマトキシリン及びエオシンによ
り染色させることによって組織病理学的検査のために準備した。左の注射部位は
、次の抗体:CD3、CD4、CD8、CD45R/B220(又は別にCD1
9)及びMac−3によって評価した。終末マウスの右の注射部位をOCT媒体
に直接埋め込み、凍結させ、CD3e、CD4及びCD8aにより染色させた。
終末マウスの左の注射部位は、直ちに10%中性緩衝ホルマリンにより6〜24
時間固定し、次いでパラフィンワックスに埋め込み、ヘマトキシリンおよびエオ
シン並びにCD45R/B220及びMac−3により染色した。組織を、凍結
組織については低温槽により又はパラフィンに埋め込んだ組織については回転ミ
クロトームにより6μmの切片に切断し、Mac−3又はいくつかのCD抗原(
CD3e、CD4、CD8a及びCD45R/B220)に対するファーミンゲ
ンモノクロナールラット又はハムスター反マウス一次抗体により60分間染色さ
せた。 標識付きストレプタビジン−ビオチン錯体/HRP検出システム(Dako
No.K377)をAEC色原素と共に使用して抗原を目視化させた。切片をギ
ルのIIIヘマトキシリンにより対比染色させた。反ハムスターIgG(CD3e
について)、ヤギ反ラットIg(CD8a、CD45R/B220及びCD4に
ついて)及びマウス反ラットIgG1/IgG2a(Mac−3について)並び
にハムスターIgG同位元素標準(CD3eについて)を適当に希釈し、反応の
特異性を検証するために陰性の反応体対照例組織切片に対する一次抗体として代
用した。 N(陰性)及びP(陽性)認識プロトコルを使用する半定量的技術によって免
疫組織化学的染色を評価した。陽性の対照例組織における種々のCD及びMac
−3により染色された細胞に相当する細胞質レッドフッチア染色及び細胞組織が
存在したときに細胞は陽性と見なされた。
0個の細胞/フィールド/40X、陰性)、1(1〜3個の細胞/フィールド/
40X、僅かに少数の細胞)、2(4〜8個の細胞/フィールド/40X、少数
の細胞)、3(9〜15個の細胞/フィールド/40X、中程度の細胞数)、4
(16個以上の細胞/フィールド/40X、顕著な細胞数)。この研究の結果を
上記の表1に要約する。アジュバントに対する細胞性反応は通常次のグループ:
強い、遅延した及び過渡的の一つに分類することができる。
)は、通常は、全ての回復期間においてアジュバント処方物の大部分の注射部位
で目立った細胞タイプであった。僅少から顕著までに等級分けされたマクロファ
ージの量は、種々のグループにおける時間と関係して増大する厳しさでもって通
常見られた。例2、4、12及び13は強いマクロファージ反応を生じた。遅延
したマクロファージ反応が例3、6、11及び15で観察された。過渡的なマク
ロファージ反応は、例1及び7で見られた。Mac−3陽性細胞は、主として被
検アジュバントに接して観察され、しばしばアジュバントの周辺領域を浸潤した
。それらは時としてアジュバントと一致した細胞質内物質を含有し、Mac−3
陽性細胞(マクロファージ)が種々のアジュバントの再吸収に主として係わった
ことを示唆た。 CD45R/B220抗体により検出されたBリンパ球は、注射部位で見られ
た第二の最も多いタイプの細胞であった。陽性Bリンパ球のグループの発生数並
びにこれらのグループにおけるCD45R/B220陽性細胞の量(通常、僅少
から中程度まで等級分けされた)は、72時間の安楽死の期間と比べて7日及び
14日で増大した。B細胞の最低量が例6及び8に従って製造されたアジュバン
トを受けるマウスの注射部位で記録された。更に詳しくは、B細胞反応は、遅延
された、強い又は過渡的なものにグループ分けすることができる。例1は、7日
で強いB細胞反応を生じた。例3及び5のアジュバントは、遅延された反応を生
じた。過渡的なB細胞反応が例7、12及び15で観察された。注射部位での比
較的多量のBリンパ球の存在は、体液性免疫応答の媒介物が被検物質と関連する
炎症過程において重要な役割を果たし得ることを示唆しよう。 陽性Tリンパ球(CD3e、CD4及びCD8a)のグループの時間と関連し
て増加する発生数が観察された。それぞれの安楽死期間の後、CD4が種々のア
ジュバントで観察された陽性T細胞の最も普通のタイプであった。処理後7日及
び14日では、CD8aが第二の最も普通に観察されるT細胞であった。 これらの結果を次の表2に記載する。
楽死させたマウスについては通常僅少(1〜3個の細胞/フィールド/40X )と等級分けされた。注射部位でのこれらの異なったタイプのT細胞の免疫組織
化学的検出を行なった。Tリンパ球の数は通常B細胞及びマクロファージの数よ
りも低かったが、注射部位でのそれらの存在は、アジュバントに応じた活性な局
所免疫反応を指示する。例4、5、7、8及び13に従って製造されたアジュバ
ントにより処置されたマウスでは、その他のアジュバントにより処置されたもの
と比べて、Tリンパ球の不存在又は低い量が認められた。例12及び13はCD
3に対して遅延されたT細胞反応を生じたが、例6でCD3に対する過渡的なT
細胞反応が観察された。例1及び12はCD4に対して遅延されたT細胞反応を
生じた。例4はCD8aに対して過渡的なT細胞反応を生じたが、例12はCD
8aに対して遅延されたT細胞反応を生じた。 好ましい具体例では、サイトカインがその作用に従ってアジュバントとさらに
アジュバント効果を増大させるように併用される。例えば、IFN−γ,IL−
1α及びIL−2βのようなサイトカインがマクロファージ応答を誘発すること
が示された選択的アジュバントと結合される。他の場合には、例1、3又は5に
従って製造されたアジュバントがB細胞応答を増大させるためにIL−4又はI
L−13と併用されよう。更に、CD27リガンド、IL−2及びIL−8のよ
うなサイトカインが高められたT細胞反応を生じさせるために例4、6、11、
12及び15のアジュバントに添加されよう。サイトカインの選定についての更
なるガイドラインは、「付録II:サイトカイン及びそれらの受容体」(「免疫生
物学:健康及び病気における免疫系」、ジェンウエイ・トラバース、カレント・
バイオロジー社/ガーランド・パブリッシング社、1996)(参照することに
よりここに含める)に見出すことができる。
変化は、種々のアジュバントを線維性被覆改正が覆った炎症性細胞の浸潤であっ
た。この変化は、72時間、7日及び14日に安楽死させた全てのマウスの検査
した注射部位で観察された。炎症性細胞性応答は、単核細胞(マクロファージ、
リンパ球及びプラズマ細胞を含めて)、好中球、好酸球及び(又は)多核性巨大
細胞の不定の割合での浸潤により特徴付けらた。他の処方物を受けるマウスと比
べて、僅かな炎症性細胞性応答及び線維性被覆形成が、全ての回復期間において
例3、5、7、11及び15の燐酸カルシウムアジュバントを受けるマウスの注
射部位で存在するように思われた。単核炎症性細胞は注射部位に常に見られ、僅
少から中程度まで等級分けされた。多核性巨大細胞は主として処理後7日及び1
4日で安楽死させたマウスで見られ、僅少から中程度まで等級分けされた。燐酸
カルシウムアジュバントを受けたグループでは、通常、単核炎症性細胞及び多核
性巨大細胞の浸潤並びに線維性被覆形成において時間と関連して増大した激しさ
があった。好中球及び好酸球は、主として72時間の回復期間後に安楽死させた
マウスに見られ、僅少から軽度まで等級分けされた。好酸球及び好中球の浸潤に
時間と関連して増大する激しさがあった。注射部位でのアジュバントの量は軽度
から重度(又は顕著)まで等級分けされた。72時間で安楽死させたマウスと比
べて、7日及び14日で安楽死させたマウスにおいてアジュバントの僅少から軽
度までの減少があった。
ュバントにどのように負荷させるかを示す。 全ての溶液を無菌状態で調製した。カルシウムアジュバントは、以下の修正を
して、例1〜16に従って製造する。百日咳菌(パスツールワクチンズ社から商
業的に入手できる)を殺し、遠心分離し、0.07M二塩基性燐酸ナトリウム無
菌溶液中で4×1010個の菌/mlを得るようにホモジナイズする。得られた
微生物の細菌懸濁液を溶液Aと混合してから溶液Bと混合する。百日咳菌は、本
発明の燐酸カルシウム沈殿に吸収されるようになる。
7℃で硬化させる。百日咳菌(パスツールワクチンズ社から商業的に入手できる
)を殺し、遠心分離し、0.07M二塩基性燐酸ナトリウム無菌溶液中で4×1
010個の菌/mlを得るようにホモジナイズする。百日咳菌を含有する懸濁液
にアジュバント(硬化した燐酸カルシウム沈殿)を入れ(例えば、浸漬し)、し
かしてアジュバントの表面に吸着させる。百日咳菌を燐酸カルシウムアジュバン
トの表面に少なくとも1時間吸着させる。
とを例示する。 燐酸カルシウムアジュバントは、例1〜16に従って粉末(粒度10nm〜3
00nm)として製造する。ハウスダストを燐酸ナトリウム緩衝液により抽出し
、硫酸アンモニウム沈殿により精製することによってハウスダスト抽出物を調製
する。ダスト抽出物を塩水溶液中で0.5mg/mlの濃度で調製し、水和媒体
として使用する。粉末を歯磨きペーストのコンシステンシー(104〜108ポ
イズ)まで懸濁させる。燐酸カルシウムアジュバントを加えたアレルゲンの2.
0ml薬量を腕の外側に皮下注射する。血液試料を一連の免疫療法の前後で、即
ち、1年間隔の同じ期間で及び平均して13回の注射して集める。血清試料を3
0℃で貯蔵し、全IgE濃度及び特異的IgE評価を実行する。免疫療法の前後
で決定されたレベルを全IgEについてはIU/mlで、特異的IgE(放射能
標識)については患者の血清/陰性参照血清の比率で表わす。処置の前後でIg
Eレベルの統計学的評価のために対のt−試験を使用する。全IgE結果につい
ては正規分布を得るようにlog値を使用する。
HIV−2)分裂全ウイルスのためにカルシウムベースのアジュバントを使用す
ることを例示する。 アジュバントは例1〜17に従って製造した。不活性化HIV−2分裂全ウイ
ルスを緩衝溶液に0.5mg/mlの濃度で懸濁させ、例20に記載した方法に
従ってアジュバントに吸着させる。それぞれのマウスは、0日目に腹部の皮膚に
皮下注射される0.5mlのアジュバントを受ける。マウスを10週間後に殺し
、血液を集め、血清を分離し、HIV−2抗体について個々に検定する。血清は
、HIV−2抗体の存在についてELISA及びウエスタン法により検定する。
用することを例示する。 カサガイ(keyhole−limpet)ヘモシアニン(シグマ社から商業
的に入手できる、製品番号:H2133及びH7017)を燐酸塩緩衝塩水pH
7.0中で0.5mg/mlの濃度で調製する。この溶液の0.8mlを例1〜
9の非晶質燐酸カルシウムアジュバントの沈殿に添加する。IL−2を例19の
方法に従ってACPアジュバント中に取り込む。次いで、生じた発泡性ゲルをボ
ール状に調製し、ラットに皮下移植する。この過程を4ヶ月後に繰り返す。血液
試料を規則的に採取し、ELISAを使用して抗カサガイヘモシアニン抗体タイ
ターを決定する。
トをサイトカインと共に使用することを例示する。 アジュバントは例1〜17に従って製造した。レッチュZM100ミルを使用
することによりナノ粒子を調製する。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(
GM−CSF)(Pepro Techから商業的に入手できる、製品番号30
0−03)を例19の吸着法によりアジュバントに組み入れる。500nmのG
M−CSF含有ナノ粒子と照射されたB16−F10形質導入腫瘍細胞(4×1
06)を1:1の比でマウスの左横腹に皮下注射する。2週間後に、マウスを1
05個の生きた野生型B16黒色腫細胞によって右横腹に攻撃する。腫瘍の成長
を触診により毎週2回評価する。
を立証する。 例1に従って、非晶質燐酸カルシウムアジュバントを選択的篩い分けにより3
0nm以下の平均粒度までに調製する。パスツールワクチンズ社から商業的に入
手できる蛋白質ワクチンのジフテリア及び破傷風のトキソイド(DPT)を例1
9に記載のようにアジュバントに0.5mg/mlの濃度で吸着させる。DPT
を吸着した燐酸カルシウムアジュバントの0.5mLの薬量をマウスに皮下注射
する。血液試料を注射してから14日及び3ヶ月後に採取し、ELISAで評価
して抗ジフテリア及び抗破傷風タイターを決定する。
ることを立証する。マラリア原虫Plasmodium yoeliiサーカム
スポロゾイト蛋白質(PyCSP)プラスミドは、寄生虫抑制抗体及び保護細胞
毒性T細胞を誘発させることが示された。 カルシウムアジュバントを例1〜17に従って製造する。プラスミドのPyC
SPをJ.of Immunology(V155;1995;p2039)に
記載のモールの方法に従って調製する。アジュバントペーストを、マラリア原虫
Plasmodium yoeliiのサーカムスポロゾイト蛋白質(PyCS
P)をコード化するプラスミドDNAと水和工程中に混合するだけで組み入れる
。1.0×106〜7.0×106ポイズの粘度である本発明のアジュバントペ
ーストの0.5mLの薬量をマウスに筋内注射する。血清試料を2ヶ月間毎週集
め、rPyCSP蛋白質と反応性のIgM又はIgG抗体の存在を検定する。種
々の時点で、マウスを眼窩後方穿刺により出血させ、血清を検定まで−20℃に
貯蔵する。マウスを安楽死させ、それらの器官を無菌状態で切除する。10%F
CSを補充したRPMI 1640よりなる媒体中の、脾臓、鼡径部及び腸間膜
のリンパ節、骨髄及び四頭筋から単細胞懸濁液を調製する。敏感で特異的なサイ
トカインELIスポット検定法を使用して顕在化された免疫応答の性質を検査す
る。
ルシウムアジュバントの使用を例示する。 アジュバントを例1〜17に従って製造する。500nmの平均粒度を選択的
に篩い分ける。肺炎連鎖球菌Strepococcus pneumococc
alを例20に記載のようにして燐酸カルシウムアジュバントの表面に吸着させ
る。Danish肺炎球菌血清型1、2、3、4,6A、7F、8、9N、12
F、14、18C、19F、23F及び25からの被膜多糖類のそれぞれ50μ
gを含有するワクチンの0.5mLを個々のウサギに皮下注射する。3週間後に
、血清試料を集め、血清を単離する。体液性免疫応答又はB細胞の存在を、ヤー
ネ溶血プラーク検定法及び放射能免疫検定法(RIA)を使用して循環している
肺炎連鎖球菌抗体のレベルを測定することによって評価する。
用を例示する。 アジュバントは、例1に従って製造するが、選定された粒度は50nm以下で
ある。不活性化ポリオワクチン(パスツールワクチンズ社から入手できる)を例
19に従ってアジュバントに結合させる。0.5mLのアジュバント薬量をマウ
スに皮下注射する。マウスを3ヶ月後に全ポリウイルスにさらす。マウスを生存
について評価する。
ントの使用を例示する。 燐酸カルシウムアジュバントを例16〜17に従って製造する。5μmの平均
粒度を選択的に篩い分ける。ワクチンはパスツールワクチンズ社から入手できる
OKA株水痘−帯状疱疹ウイルス(VZV)の細胞を含まない製剤である。VZ
Vを水和媒体に5.0mg/mlの濃度で包含させる。2.0mlのペーストワ
クチンを注射により皮下投与する。4週間後に、血清試料を採取し、血清を酵素
免疫検定法(EIA)、ラテックス凝集反応法(LA)、間接蛍光抗体法及び蛍
光抗体膜抗原検定法を使用してVZV抗体について分析する。
を立証する。 カルシウムアジュバントは例1及び17に従って製造した。商業的に製造され
たB型肝炎ワクチン(Hevac B)及びジフテリア−破傷風−百日咳(DT
P)−ポリオワクチンはパスツールワクチンズ社から入手できる。ワクチンをホ
ルムアルデヒドにより不活性化し、例1のアジュバントについては溶液AとBの
混合中にアジュバントと混合する。例17のアジュバントについては、ワクチン
を水和媒体に5.0mg/mlの濃度で包含させる。次いで、ペーストを湿った
環境で37℃で硬化させ、次いで250nmの粒度に粉砕する。製造された水和
アジュバントを皮下注射する。第二の注射を6ヶ月後に与え、また第三の注射を
6ヶ月後に与える。血液を最初の注射の日に、次いでその後の注射毎にその日に
採取する。HBウイルス血清マーカー(HbsAg、抗HBs、抗HBc)を商
業的放射能免疫検定法(アボット・ラボラトリーズ社)によって試験する。破傷
風及びジフテリアに対する抗毒素タイターを、グルタルアルデヒドにより成熟赤
血球に結合される高精製トキシンを使用する受動血球凝集技術によって決定する
。百日咳アグルチニンの決定のためには、測定はマイクロタイタープレートで達
成される凝集試験を使用して行なう。
立証する。 アジュバントは、例1〜17に従うが、ただし以下の修正をして製造する。ろ
過前の最終沈殿の熟成時間を30秒間、5分間、30分間、2時間、24時間及
び48時間であるように選定する。乾燥に続いて、燐酸カルシウム粉末を微粉砕
し、10nm、100nm、250nm,500nm及び900nmの平均粒度
に篩い分けし、走査電子顕微鏡により確認する。マウスに2.0mlの燐酸カル
シウムアジュバントをカサガイヘモシアニンの存在下に又はそれなしのいずれか
で注射し、例18に従って評価する。
パタイト質燐酸カルシウムビヒクル/アジュバントを、例16又は17に従い、
ヘリウム比重瓶により決定して2.33〜2.8g/cm3、好ましくは2.5
g/cm3の密度で製造する。嵩密度はほぼ0.9〜1.2g/cm3であり、
平均ミクロ細孔寸法は85Åである。PCA物質を0.5mg/mlのカサガイ
ヘモシアニン水和媒体の存在下にペーストとして調製する。アジュバントの1m
l薬量をペーストとして注射し、又はインビトロで硬化させ、凍結乾燥し、ペー
ストとして再懸濁させ、注射する。
置の最適化にどのように影響するかを例示する。 不活性化A型肝炎ワクチン(スミスクライン・ビーチャム社から商業的に入手
できる)をそれぞれのアジュバント粒度について水和媒体中で0.5mg/ml
の濃度で調製する。例16からのアジュバントをワクチン含有水和媒体により水
和させてドライペースト(例えば、模型用粘度のような)を生じさせる。次いで
、この物質を100%湿度で37℃で1時間硬化させる。硬化した物質を次いで
微粉砕し、篩い分けし、200nm及び50nmの粒子を別々に集める。それぞ
れの(200nm及び50nm)アジュバントの0.5mlの免疫薬量を0、4
及び8週間のスケジュールで皮下投与する。それぞれのアジュバントの第二の0
.5mlの免疫薬量を0、4及び24週間のスケジュールで皮下投与する。それ
ぞれの免疫処置の24時間後に血液試料を集め、血清を単離する。それぞれの時
点で、ELISAを使用して抗A型肝炎抗体タイターを測定する。
カルシウムとを併用することを例示する。 強再吸収性燐酸カルシウムは例16に従って製造する。弱再吸収性燐酸カルシ
ウム物質はアイソン氏の米国特許第5,683,496号の例1、2又は3或い
はチョウ氏の米国特許第5,522,893号の例4又は8に従って製造する。
両物質とも、SPEX8505アルミナセラミック粉砕室を備えたSPEX85
10実験室用ミルにおいて別個に粉砕する。全ての物質を篩い分けして100n
m〜250nmの粒度の粒子を集める。1:5重量又は容量比の弱再吸収性粒子
と強再吸収性粒子を、0.5mg/mlのカサガイヘモシアニンを含有する適当
量の緩衝溶液により注射可能ペーストとして調製する。このペーストを1時間貯
蔵して吸着させる。0.5mlの負荷されたアジュバントペーストをマウスに皮
下注射する。血液試料を7日、14日及び3ヶ月の時点で集め、血清を分離する
。抗カサガイヘモシアニン抗体のタイターレベルをELISAを使用して測定す
る。
水和媒体中で0.5mg/mlの濃度で調製し、ある場合には補充物質により吸
着させる。活性剤を含有する媒体を使用して燐酸カルシウムを水和させる。水和
された燐酸カルシウムに補充物質を0.5mg/mlの濃度で混合するだけで添
加する。それぞれのアジュバントペーストの0.5mlをマウスに皮下注射する
。下記の表3は、本発明のアジュバントの種々の処方物を示す。それぞれの処方
物を例18に従って評価する。更に、抗原1種又はそれ以上を含む処方物におい
ては、血液試料を採取し、血清を分離する。それぞれの抗体タイターをELIS
Aを使用して測定する。
Claims (37)
- 【請求項1】 第一アジュバントを含むアジュバント組成物であって、該第
一アジュバントが非晶質燐酸カルシウムからなるアジュバント組成物。 - 【請求項2】 該第一アジュバントの粒子を更に含む請求項1に記載の組成
物。 - 【請求項3】 該粒子が0.1nm〜900nmの直径を有する請求項2に
記載の組成物。 - 【請求項4】 該組成物の1〜100重量%が0.1nm〜900nmの直
径を有する該粒子からなる請求項3に記載の組成物。 - 【請求項5】 該組成物の25〜100重量%が0.1nm〜900nmの
直径を有する該粒子からなる請求項4に記載の組成物。 - 【請求項6】 該第一アジュバントが強再吸収性である請求項1に記載の組
成物。 - 【請求項7】 注射可能ペーストとして処方される請求項1に記載の組成物
。 - 【請求項8】 第二アジュバントを更に含む請求項1に記載の組成物。
- 【請求項9】 該第二アジュバントがムラミルジペプチド、水酸化アルミニ
ウム、燐酸アルミニウム、ヒドロキシアパタイト、フロイント不完全アジュバン
ト、フロイント完全アジュバント及び重合体から選択される請求項8に記載の組
成物。 - 【請求項10】 抗原を更に含む請求項1に記載の組成物。
- 【請求項11】 サイトカインを更に含む請求項1に記載の組成物。
- 【請求項12】 該サイトカインがIL−2、IL−3、IL−4、IL−
5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−11、IL−13、G−CSF、I
L−15、GM−CSF、OSM、LIF、IFN−γ、IFN−α、IFN−
β、B7.1、B7.2、TNF−α、TNF−β、LT−β、CD40リガン
ド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4−1BBL,I
L−8、MCP−1、MIP−α、MIP−β、RANTES、TGF−β、I
L−1α、IL−1β、IL−1RA、IL−10、IL−12及びMIFから
選択される請求項11に記載の組成物。 - 【請求項13】 哺乳類に非晶質燐酸カルシウムを含む組成物を投与するこ
とからなる、哺乳類における免疫応答を刺激させる方法。 - 【請求項14】 哺乳類に抗原と非晶質燐酸カルシウムを含む組成物との双
方を同時に投与することからなる、哺乳類における抗原の免疫原性を増加させる
方法。 - 【請求項15】 第一アジュバントを含むアジュバント組成物であって、該
第一アジュバントが低結晶性アパタイト質燐酸カルシウムからなるアジュバント
組成物。 - 【請求項16】 該第一アジュバントの粒子を更に含む請求項15に記載の
組成物。 - 【請求項17】 該粒子が0.1nm〜900nmの直径を有する請求項1
6に記載の組成物。 - 【請求項18】 該組成物の25〜100重量%が0.1nm〜900nm
の直径を有する該粒子からなる請求項15に記載の組成物。 - 【請求項19】 該第一アジュバントが強再吸収性である請求項15に記載
の組成物。 - 【請求項20】 注射可能ペーストとして処方される請求項15に記載の組
成物。 - 【請求項21】 第二アジュバントを更に含む請求項15に記載の組成物。
- 【請求項22】 該第二アジュバントがムラミルジペプチド、水酸化アルミ
ニウム、燐酸アルミニウム、ヒドロキシアパタイト、フロイント不完全アジュバ
ント、フロイント完全アジュバント及び重合体から選択される請求項21に記載
の組成物。 - 【請求項23】 抗原を更に含む請求項15に記載の組成物。
- 【請求項24】 サイトカインを更に含む請求項15に記載の組成物。
- 【請求項25】 該サイトカインがIL−2、IL−3、IL−4、IL−
5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−11、IL−13、G−CSF、I
L−15、GM−CSF、OSM、LIF、IFN−γ、IFN−α、IFN−
β、B7.1、B7.2、TNF−α、TNF−β、LT−β、CD40リガン
ド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4−1BBL,I
L−8、MCP−1、MIP−α、MIP−β、RANTES、TGF−β、I
L−1α、IL−1β、IL−1RA、IL−10、IL−12及びMIFから
選択される請求項24に記載の組成物。 - 【請求項26】 哺乳類に低結晶性アパタイト質燐酸カルシウムを含む組成
物を投与することからなる、哺乳類における免疫応答を刺激させる方法。 - 【請求項27】 哺乳類に抗原と低結晶性アパタイト質燐酸カルシウムを含
む組成物の双方を同時に投与することからなる、哺乳類における抗原の免疫原性
を増加させる方法。 - 【請求項28】 第一アジュバントとアジュバント適性向上手段を含み、該
第一アジュバントが燐酸カルシウムよりなり、該向上手段が外因性向上手段又は
内因性向上手段よりなる群から選択される、アジュバント組成物。 - 【請求項29】 該第一アジュバントの粒子を更に含む請求項28に記載の
組成物。 - 【請求項30】 該第一アジュバントが強再吸収性である請求項28に記載
の組成物。 - 【請求項31】 注射可能ペーストとして処方される請求項28に記載の組
成物。 - 【請求項32】 該アジュバント適性向上手段が第二アジュバントである請
求項28に記載の組成物。 - 【請求項33】 該第二アジュバントがムラミルジペプチド、水酸化アルミ
ニウム、燐酸アルミニウム、ヒドロキシアパタイト、フロイント不完全アジュバ
ント、フロイント完全アジュバント及び重合体から選択される請求項32に記載
の組成物。 - 【請求項34】 抗原を更に含む請求項28に記載の組成物。
- 【請求項35】 該アジュバント適性向上手段がサイトカインである請求項
28に記載の組成物。 - 【請求項36】 該サイトカインがIL−2、IL−3、IL−4、IL−
5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−11、IL−13、G−CSF、I
L−15、GM−CSF、OSM、LIF、IFN−γ、IFN−α、IFN−
β、B7.1、B7.2、TNF−α、TNF−β、LT−β、CD40リガン
ド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4−1BBL,I
L−8、MCP−1、MIP−α、MIP−β、RANTES、TGF−β、I
L−1α、IL−1β、IL−1RA、IL−10、IL−12及びMIFから
選択される請求項35に記載の組成物。 - 【請求項37】 哺乳類に燐酸カルシウムとアジュバント適性向上手段を含
む組成物を投与することからなる、哺乳類における免疫応答を刺激させる方法。
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