JP5999639B2 - 免疫刺激因子担持微粒子 - Google Patents
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しかしながら、これらの文献には、特定のリン酸カルシウムに対して特定の金属イオンを特定濃度範囲で含有させた場合に免疫原性組成物の免疫原性及び免疫アジュバントの免疫刺激性が飛躍的に高まることは示唆ないし教示されていない。
例1:精製ツベルクリン担持メソポーラスシリカ微粒子の調製
0.28 gの水酸化ナトリウム(NaOH)と1 gのヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(C19H42BrN、別名:cethyltrimethylammonium bromide、以下「CTAB」と略す)を480 mLの水に溶解し、25℃又は60℃に保持し、激しく撹拌しながらオルトケイ酸テトラエチル(Si(OC2H5)4、別名:Tetraethyl orthosilicate、以下「TEOS」と略す)を10 mL滴下した。そのまま2時間撹拌を続け白色の沈殿を得た。沈殿を遠心分離し、超純水とエタノール(99.5%)で洗浄して乾燥させた。その後、沈殿中のCTABをエタノール/塩酸溶液(エタノール(99,5%):塩酸(36.5% HCl)=50 mL:1 mL)で抽出した。得られた固相を超純水及びエタノール(99.5%)でpHが中性になるまで数回洗浄し、これをメソポーラスシリカ(MS)とした。得られたメソポーラスシリカの粒子径は、30〜200 nmであった。
MS:メソポーラスシリカ;
MS/CaP:メソポーラスシリカをPPD非含有RSM液に投入しメソポーラスシリカ上に低結晶性リン酸カルシウムを沈着させた微粒子;
PPD-MS:メソポーラスシリカをPPD含有PBS(-)に投入しメソポーラスシリカにPPDを吸着させた微粒子;及び
PPD-MS/CaP:メソポーラスシリカをPPD含有RSM液に投入しメソポーラスシリカに低結晶性リン酸カルシウムを用いてPPDを担持したPPD担持メソポーラスシリカ微粒子。
これらの微粒子の粉末X線回折図を図1に示す。
24孔プレートを用い、1x104個のNIH3T3細胞をL-グルタミン(0.3 mg/mL)と10%牛血清を添加した1.0 mLのダルベッコ変法MEM培養液中で6時間培養した。次に培養液を5、20、50、100、300 μg/mLの濃度でMS又はMS/CaPを含有する培養液に交換して、さらに72時間NIH3T3細胞を培養した。培養後細胞数をWST-8法で測定した。比較対照はMSもMS/CaPも含有しない培養液で培養した細胞数とし、それと比較した相対細胞数(%)を生体適合性の指標とした。図4に相対細胞数測定結果を示す。
動物実験でPPD-MS/CaP及びPPD-MSの抗腫瘍免疫反応の誘導効果を確認した。PPD-MS/CaP及びPPD-MSはMSが150 μg/100 μLとなるように調製して生理食塩水に懸濁させて免疫アジュバントとした。MSを添加せず、0.25 μg/mL となるようにPPDのみを添加した生理食塩水(PPD sol.)も作製し、比較対照の免疫アジュバントとした。
ネジ口の蓋付きガラス容器中で作製した10 mLの濃塩酸(36.5% HCl)と65 mLの超純水の混合溶液を40℃に保持しながら撹拌し、その中に、2.0 gのトリブロック共重合体 (poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide)、PEO20PPO70PEO20、一般名称: Pluronic(登録商標)P123、以下「P123」と記載する)を添加し溶解させた。P123の溶解後、この溶液を激しく撹拌しながら4.56 mLのTEOSを添加し、ガラス容器の蓋を固く閉めた。そのまま5分間撹拌した混合物は、40℃に保持しながら20時間静置した後、さらに加熱温度を35℃、60℃、100℃、又は130℃に変更して24時間静置した。得られた混合物中の固相中間生成物は遠心分離(4000 rpm、10分間)により回収し、超純水で十分に洗浄した後に100℃で乾燥させた。その後抽出法または焼成法で有機物を除去した。なお、抽出法の場合、50 mLのエタノール(99.5%)と1 mLの濃塩酸(36.5% HCl)の混合溶液中に分散し、P123を抽出除去後、超純水で1度洗浄した後、エタノール(99.5%)でpHが中性になるまで数回に渡って洗浄し、100℃で乾燥させ、これを最終生成物のメソポーラスシリカ微粒子とした。焼成法の場合、固相中間生成物を550℃で5時間焼成し、P123を完全に燃焼除去して最終生成物のメソポーラスシリカ微粒子とした。得られたメソポーラスシリカ微粒子(BS)は、調製時の加熱温度の低い順にBS-A(35℃)、BS-B(60℃)、BS-C(100℃)及びBS-D(130℃)と命名した。
以後の実験には抽出法で作製したBSを用いた(単にBSと記述した場合でも抽出法で作製したBSを示す)。BSにメソ孔があるかどうかを、粉末X線回折法によって確認した。図7に、各BSの小角X線回折図を示す。
例1と同じ方法でBS-X (X=A〜D)を含有する培養液中でのNIH3T3細胞の相対細胞数を測定した。比較対照は微粒子を含有しないDMEMで培養した細胞数とし、比較対照と比較した相対細胞数(%)を生体適合性の指標とした。その結果、粒子濃度を100 μg/mLに設定するとBSが細胞毒性を示さないことが判明したので、BSにSSMを担持したSSM-BS-X/CaP (X=A〜D)について、1、4、10 μg/mLの微粒子濃度の範囲でこれらの微粒子のヒト単球様細胞株THP-1に対する免疫刺激性を測定した。実験方法は例1と同様である。すなわちマクロファージ様に分化したTHP-1細胞(以下、分化THP-1細胞)を24孔プレート内でコンフルエントの状態にし、PBS(-)で洗浄後、さらに培養液(RPMI1640)で1日培養し、その後SSM-BS-X/CaP (X=A〜D)を上記各濃度で含む培養液、又は微粒子を含まない培養液に交換した。一定時間培養後、分化THP-1細胞が産生するGM-CSFをELISA法で測定した。GM-CSFの産生量が多いほど免疫刺激性能が高いことを意味する。その結果を表6に示す。
4種類の粒子径の異なるメソポーラスシリカ微粒子を合成するため、表7に従って0.28 gのNaOHと1 g又は2 gのCTABを480 mLの超純水に溶解し、25℃又は60℃に保持し、激しく撹拌しながらTEOSを5又は10 mL滴下した。
例1と同じ方法でMS-A、MS-B、MS-C、MS-D、MS-A/CaP、MS-B/CaP、MS-C/CaP、MS-D/CaP 微粒子の生体適合性を評価したところ、全ての微粒子で細胞毒性を示さない粒子濃度は20 μg/mL以下であることが判明したので、分化THP-1細胞を用い、1、4、又は10 μg/mLの粒子濃度の範囲でSSM-MS-X/CaP (X=A〜D)の免疫刺激性を測定した。例1と同様にして分化THP-1細胞をPBS(-)で洗浄後、培養液(RPMI164)で1日培養し、その後SSM-MS-X/CaP (X=A〜D)を含む培養液、微粒子を含まない培養液に交換した。一定時間の培養後、分化THP-1細胞が産生するGM-CSFをELISA法で測定した。GM-CSFの産生量が多いほど免疫刺激性能が高いことを意味する。結果を表9に示す。
細胞試験で最も免疫刺激性能が高かったSSM-MS-A/CaP(以下、例8ではこれをMSと標記する) を用いた免疫アジュバントの抗腫瘍免疫反応の誘導能力を検討した。動物実験モデルは例3と同じである。摘出腫瘍組織は液体窒素に30分浸漬して固定した後、物理的に破砕し均質化した。均質化した固定化腫瘍組織(以下「T」と略す)は、150 μgのMSを分散した100 μLの生理食塩水と混合した。また、固定化腫瘍組織が単独で免疫刺激性能を示す可能性についても検討するため、生理食塩水(以下「S」と略す)と混合した固定化腫瘍組織、及び生理食塩水のみの2試料も調製し、これらを投与した。表10に動物群と投与機会毎の投与内容物の対応を示す。
以下、リン酸三カルシウムをTCP、亜鉛含有リン酸三カルシウムをZnTCP、マグネシウム含有リン酸三カルシウムをMgTCPと記す。免疫刺激因子を担持する亜鉛、又はマグネシウム含有リン酸三カルシウム微粒子を作製するために、亜鉛を11.8 mol%含有するZnTCP(ADVANCE)及びマグネシウムを6.8 mol%含有するMgTCP(ADVANCE)をそれぞれの原料粉とした。各原料粉は純粋なTCP(ADVANCE)粉末と表12に示す重量比混合した後、さらに乳鉢・乳棒を使用してよく粉砕混合し、850℃で1時間加熱処理を行うことで亜鉛含有量の異なるZnTCP又はマグネシウム含有量の異なるMgTCP粉末とした。比較対照としてTCPも使用した。表12の金属元素含有量は、亜鉛の場合Zn/(Zn+Ca)mol%、マグネシウムの場合はMg/(Mg+Ca)mol%を示す。
例1と同じ方法でTCP、ZnTCP、MgTCPを含有する培養液中でのNIH3T3細胞の相対細胞数を測定した。比較対照は微粒子を含有しないDMEMで培養した細胞数とし、比較対照と比較した相対細胞数(%)を生体適合性の指標とした。その結果、粒子濃度を10μg/mLまで細胞毒性を示さないことが判明したので、SMMを担持し、亜鉛含有量とマグネシウム含有量の異なるZnTCP、MgTCP、TCP微粒子のヒト単球様細胞株THP-1に対する免疫刺激性を、4 μg/mLの粒子濃度の範囲で測定した。その結果を表13に示す。
例1と同様の方法で、メソポーラスシリカ上にIL-1βを担持し、THP-1細胞を用いてGM-CSFの産生量を測定した。なお、IL-1βは1μg/mLの濃度でRSM液に添加して担持した。その結果、GM-CSFの産生量は何も添加しない培養液と同レベルであった。
ゾルゲル法により、ルチル型構造の酸化チタン微粒子、及びアナターゼ型構造の酸化チタン微粒子を作製した。例4と同様の方法でこれらの酸化チタン微粒子にヒト型結核菌熱水抽出物を担持し、THP-1細胞を用いてGM-CSFの産生量を測定した。その結果、GM-CSFの産生量は何も添加しない培養液と同レベルであった。なお、アナターゼ型酸化チタンのほうがルチル型酸化チタンより、GM-CSF産生量が高い傾向があった。
例9と同じ方法で、TCPにヒト型結核菌熱水抽出物を担持し、実施例6よりさらに高い微粒子濃度(7、10μg/mL)で培養液に添加して、THP-1細胞を用いてGM-CSFの産生量を測定した。その結果、GM-CSFの産生量は何も添加しない培養液と同レベルか僅かに低いレベルであった。
例1記載の方法でMS/CaP微粒子を作製した。このMS/CaP(乾燥メソポーラスシリカとしては1 mg)を9 mLのRSM液に懸濁し、BCG菌製剤として作製したBCGワクチンのアルコール抽出液1 mLを添加し、一夜37℃でインキュベートした。BCGワクチンのアルコール抽出液とは、市販の乾燥BCGワクチン(経皮用・1人用)2本にエタノール1 mLを加え、一夜、室温で抽出した液である。
例8と同様の動物実験モデルを用いて、本発明の免疫刺激因子担持微粒子と免疫刺激剤として古くから広範に使用されている水酸化アルミニウムアジュバントの抗腫瘍免疫反応誘導能を比較した。C57BL/6J(6週齢、メス、日本クレア)マウスにLewis肺癌細胞(LLC)を左後背部に播種して腫瘍を形成した。使用した本発明の免疫刺激因子担持微粒子は例8のSSM-MS-A/CaP (以下、例15でもこれを「MS」とする)である。比較物として市販の水酸化アルミニウムアジュバント(ALUM水酸化アルミニウムゲルアジュバント、コスモバイオ(株)) とSSMの混合物を使用した(以下、この水酸化アルミニウムアジュバントとSSMの混合物を「AL」と記す)。摘出腫瘍組織は液体窒素に30分浸漬して固定した後、物理的に破砕し均質化した。均質化した固定化腫瘍組織(以下「T」と略す)とMS又はALを混合した。両混合物ともメソポーラスシリカ又は水酸化アルミニウムの動物への投与量が600μgになるように、さらにSSM投与量も群間に差が出ないように調整した。これをさらに生理食塩水(以下「S」と略す)に懸濁して投与した。表15に動物群と投与機会毎の投与内容物の対応を示す。
Claims (9)
- メソポーラスシリカ、亜鉛含有量0.5〜7 mol%の亜鉛含有リン酸三カルシウム、及びマグネシウム含有量0.5〜7 mol%のマグネシウム含有リン酸三カルシウムからなる群から選ばれる1種又は2種以上の材料を含む微粒子の表面にツベルクリン、精製ツベルクリン、BCG菌製剤、ヒト型結核菌熱水抽出物、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、及びインターロイキン-2からなる群から選ばれる1種又は2種以上の免疫刺激因子をリン酸カルシウムと共に担持させた免疫刺激因子担持微粒子。
- 上記メソポーラスシリカを含む微粒子の粒子径が30 nm〜50μmである請求項1に記載の免疫刺激因子担持微粒子。
- 上記亜鉛含有リン酸三カルシウムを含む微粒子又は上記マグネシウム含有リン酸三カルシウムを含む微粒子の粒子径が50 nm〜50μmである請求項1に記載の免疫刺激因子担持微粒子。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載の免疫刺激因子担持微粒子を有効成分として含む免疫アジュバント。
- 抗原とともにヒトを含む哺乳類動物の体内に投与して該抗原に対する全身性免疫反応を誘導するための免疫アジュバントとして用いるための請求項1ないし3のいずれか1項に記載の免疫刺激因子担持微粒子。
- 抗原が腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、腫瘍抗原タンパク、及び腫瘍抗原ペプチドからなる群から選ばれる1種又は2種以上の抗原であり、抗腫瘍免疫反応を誘導するために用いる請求項5に記載の免疫刺激因子担持微粒子。
- 腫瘍組織を物理的手段で変性させた後の腫瘍組織内に投与することにより抗腫瘍免疫反応を誘導するための請求項1ないし3のいずれか1項に記載の免疫刺激因子担持微粒子。
- 物理的手段がマイクロウエーブ照射、ラジオフリークエンシー凝固法、凍結凝固法、電気メス加熱、熱水注入、アルコール注入、塞栓法、放射線照射、レーザー光照射、及び超音波破壊からなる群から選ばれる1種又は2種以上の手段である請求項7に記載の免疫刺激因子担持微粒子。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載の免疫刺激因子担持微粒子と抗原とを含むワクチン。
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