JP2002518058A

JP2002518058A - 水不溶性α−１，４−グルカンの製造方法

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Publication number: JP2002518058A
Application number: JP2000556052A
Authority: JP
Inventors: マルチンクアンツ; ニコラスプロヴァルト; ロナルドバナジアク
Original assignee: セラニーズベンチャーズゲー・エム・ベー・ハー
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2002-06-25
Also published as: KR20010025078A; PL345055A1; NO20006427D0; NO20006427L; EP1095157B1; HUP0102474A2; ATE275634T1; WO1999067412A1; US20020052029A1; EP1095157A1; DE59910464D1; DK1095157T3; AU4773399A; DE19827978A1; DE19827978C2; CA2332373A1; CN1306581A

Abstract

(57)【要約】インビトロでの水不溶性α‐1,4‐グルカンの製造方法が記載されており、アミロサッカラーゼを使用してサッカロースがバッファーを含まない系において反応される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、バッファーを含まない系における水不溶性α−1,4−グルカンのイ
ンビトロ製造方法に関する。

【０００２】ポリサッカライド、特に、古典的な有機合成経路の経路を利用することができ
ないか、又は多大な困難を伴ってのみ利用することができる水不溶性α−1,4−
グルカンの生物工学的な製造方法には、大きな工業的興味がある。しかし、コス
ト的な理由から、これらの方法のうちわずかなものだけが、今までに商業的に利
用されてきたにすぎない。生物工学的方法は、有機化学合成の古典的経路に対し
て利点がある。例えば、酵素に触媒される反応は、一般的により穏やかな条件下
で、より高い反応速度で非常に高い特異性（部位特異性、立体特異性）を伴って
進行し、より高い収量をもたらす。これらの要素は、新規なポリサッカライドの
製造において非常に重要である。

【０００３】生物変換、すなわち精製された又は部分的に精製された酵素による物質のイン
ビトロでの変換は、生物工学的インビボ方法に比べて更なる利点がある。インビ
ボ方法に比べて、改善された制御性及びより顕著な再現性により特徴付けられる
。なぜなら、インビトロの反応条件は、生きている生物における条件とは対照的
に、限定された方法にセットされ得るからである。これにより、顕著な均一性及
び純度従って高品質である一定の生産物を生産することが可能になり、このこと
は更なる工業的使用において非常に重要である。一定の質の生産物のワークアッ
プ（workup）は、コストの削減につながる。なぜなら、ワークアップに必要なプ
ロセスパラメータは、それぞれのワークアップバッチを再度最適化する必要がな
いからである。インビトロ方法の更なる利点は、インビボ方法に対比して、生産
物が本質的に生物を含まないことである。食品工業及び製薬工業における特定の
用途にとって、このことは絶対的に必要である。工業的規模で水不溶性α−1,4
−グルカンの有利な特性を利用することができるようにするためには、それらが
安く供給される緊急の必要性がある。今までのところ、工業的規模では水溶性α
−1,4−グルカンのみが、例えばアミロースの形で利用可能であった。水不溶性
α−1,4−グルカンを製造するために、今までのところ特許出願WO 95/31553及び
レマウド−シモン（Remaud-Simon）ら（Remaud-Simon, in Petersen, Svenson a
nd Pedersen (Eds.) Carbohydrate bioengineering; Elsevier Science B.V., A
msterdam, The Netherlands (1995), pp. 313-320）において、ナイセリア・ポ
リサッカレア（Neisseria polysaccharea）由来のアミロスクラーゼを使用する
方法が記述されている。このインビトロ方法は、部分的に精製されたアミロスク
ラーゼを使用してスクロースをα−1,4−グルカン及びフルクトースに変換する
ことに基いており、クエン酸ナトリウムバッファー（pH 6.5）又はマレイン酸ナ
トリウムバッファー（pH 6.4）中で行われる。以下の反応メカニズムは、WO 95/
31553において仮定された。スクロース＋（α−1,4−グルカン）_n→フルクトース＋（α−1,4−グルカン）_n ₊₁ この反応機構に基いて、直鎖のオリゴマー又はポリマーのα−1,4−グルカン
は、水不溶性α−1,4−グルカンポリマーを導く鎖延長反応のためのアクセプタ
ーとして役立つ。WO 95/31553と対照的に、レマウド−シモン（Remaud-Simon）
ら（上記）は、更に0.1 g/lのグリコーゲンを外来性のポリサッカライドアクセ
プターとして使用した。この分岐したポリサッカライドアクセプターは、外来性
のポリサッカライドアクセプターが存在しないときの生物変換に比較して、反応
速度を上昇させた。

【０００４】アミロスクラーゼを使用してポリグルカンを製造するための、今までに述べら
れた系は、緩衝剤で処理された水溶液中で進行する。これらの全ての方法により
、水不溶性α−1,4−グルカンが得られるというわけではない。緩衝薬品の使用
及び必要なバッファー条件を確立するために必要な作業時間によって、相当なプ
ロセスコストがかかり、従ってこれらの系を商業的に使用することがより困難に
なる。生物変換産物（α−1,4−グルカン及びフルクトース）からバッファー塩
の残渣を除去するために必要な、精製段階によっても更なるコストが生じる。こ
のことは、特にこれらの生産物が食品及び製薬工業において使用されるときに非
常に重要である。それ故に、商業的に利用可能で、高純度生産物が得られる水不
溶性α−1,4−グルカンの効率の良い製造方法の必要性がある。

【０００５】従って、本発明の目的は、高純度な生産物も得られ、水不溶性α−1,4−グル
カンの工業的製造に適した方法を提供することである。

【０００６】この目的は、特許の請求項において特徴付けられる実施態様の提供によって達
成される。

【０００７】従って、本発明は、アミロスクラーゼの酵素活性を有する酵素によってスクロ
ースが水不溶性α−1,4−グルカン及びフルクトースに変換される、水不溶性α
−1,4−グルカンの製造方法に関し、該方法は水性のバッファーを含まない系で
変換を行うことを含む。

【０００８】驚くべきことに、ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）
由来のアミロスクラーゼによる水不溶性α−1,4−グルカンのインビトロでの製
造のために、水性のバッファーを含まない系を使用できることを発見した。フル
クトースの遊離又はスクロースの消費を基礎にして測定され得るこの方法の効率
は、緩衝剤で処理された系のものに相当する。このことは驚くべきことである。
なぜなら、使用された酵素の機能性は、以前は緩衝剤で処理された溶液において
のみ検出できたからである（MacKenzieら., Can. J. Microbiol. 23 (1977), 13
03-1307; Okada and Hehre, J. Biol. Chem. 249 (1974), 126-135; Taoら., Ca
rbohydrate Res. 182 (1988), 163-174; Buttcherら., J. Bacteriol. 179 (199
7), 3324-3330; WO 95/31533）。

【０００９】本発明の方法は、今や不溶性α−1,4−グルカンのインビトロでの生産のコス
トを顕著に削減することを可能にした。特に、以下のことが避けられる：バッフ
ァー溶液の調製及びpHのセッティング及び適当な場合にはその維持に関連する作
業工程及び装置。本発明方法の更なる決定的な利点は、生産物の増大した純度で
あり、このことは、特に食品分野、及び食品、化粧品及び製薬工業における用途
にとって非常に重要である。バッファーを含まない系はまた、生産物がバッファ
ー塩の残渣を含んでいないという利点を提供する。それ故に、食品及び製薬工業
における特定の用途を妨げるであろう、これらの塩を除去するための複雑な精製
工程は必要でない。このことは更に顕著なコストの削減につながる。水不溶性α
−1,4−グルカンに加えて、本発明の方法では、フルクトースが作られる。これ
は、“高フルクトースシロップ（HFS）”の安価な製造に使用され得る。バッフ
ァーを含まない反応条件のために、本発明の方法によって、高純度の生産物がも
たらされる。それ故に、イオン交換によってバッファーの塩を除去するコストの
かかる作業工程を含む、コーンスターチからのHFS製造のための従来の方法とは
対照的に、フルクトースの複雑な精製は必要でない（Crabb and Mitchinson, TI
BTECH 15 (1997), 349-352）。本発明の目的の“インビトロ変換”は、生きてい
る生物の外で進行する変換、すなわち反応である。“インビトロ”は、特に本発
明の方法が反応容器中で起こることを意味する。

【００１０】アミロスクラーゼ（E.C. 2.4.1.4.）の酵素活性を有する酵素は、以下の反応
を触媒する酵素を意味するものと理解される。スクロース＋（α−1,4−グルカン）_n→フルクトース＋（α−1,4−グルカン）_n ₊₁ アミロスクラーゼの酵素活性は、例えば、本願の実施例で述べられるように、
検出され得る。

【００１１】本発明に関連して、アミロスクラーゼはまた、スクロース及び分岐したポリサ
ッカライドアクセプター、例えばグリコーゲン、アミロペクチン又はデキストリ
ンから始まって、スクロース及び直鎖のα−1,4−グルカン鎖をこれらのポリサ
ッカライドアクセプター上に合成するのを触媒する酵素を意味するものとも理解
される。つまり、アミロスクラーゼは、これらの分岐したアクセプター上にα−
1,4−グルカン鎖の伸長を触媒する。得られた生産物は、使用された分岐した開
始材料と比較して、分岐の程度が低い。これらの生産物もまた、本発明に関連し
て水不溶性α−1,4−グルカンと称される。

【００１２】原則として、本発明の方法において、任意のアミロスクラーゼが使用できる。
好ましくは原核生物起源のアミロスクラーゼが使用される。このタイプの酵素は
、例えば、ナイセリア・ぺルフラバ（Neisseria perflava）（Okada and Hehre,
J. Biol. Chem. 249 (1974), 126-135; MacKenzieら., Can. J. Microbiol. 23
(1977), 1303-1307）又はナイセリア・キャニス（Neisseria canis）、ナイセ
リア・シネレア（Neisseria cinerea）、ナイセリア・デニトリフィカンス（Nei
sseria denitrificans）、ナイセリア・シッカ（Neisseria sicca）及びナイセ
リア・スブフラバ（Neisseria subflava）（MacKenzieら., Can. J. Microbiol.
24 (1978, 357-362)由来のものが知られている。更に、WO 95/31553はナイセリ
ア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）由来のアミロスクラーゼにつ
いて記述している。特に好ましくは、原核生物から自然に分泌されたアミロスク
ラーゼが使用される。

【００１３】本発明の方法の好ましい実施態様において、ナイセリア（Neisseria）属の細
菌由来のアミロスクラーゼが使用され、特に好ましくは、ナイセリアポリサッカ
レア（Neisseria polysaccharea）種由来のアミロスクラーゼが使用される。

【００１４】本発明の目的のために、水不溶性α−1,4−グルカンは、アミロスクラーゼを
使用した上記のスクロースの変換によって製造されたポリサッカライドである。
“水不溶性グルカン”という用語は、特にドイツ薬局方の定義（DAB＝Deutsches
Arzneimittelbuch, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart,
Govi-Verlag GmbH, Frankfurt, 第９版, 1987）に従って、“溶けにくい”化合
物、“極めて溶けにくい”又は“ほとんど溶けない”化合物の範疇に入る、アミ
ロスクラーゼを使用した上述のスクロースの変換によって製造されるポリサッカ
ライドを意味するものと理解される。

【００１５】本発明の目的のために、“バッファーを含まないの系”という用語は、本質的
にバッファー塩を含まない水性の系である。“バッファー塩”という用語は、こ
の文脈中、無機及び有機塩、特に弱い酸及び塩基の塩を意味するものと理解され
る。“本質的にない”という用語は、この文脈中、最大25mM、好ましい実施態様
においては最大10mM、更に好ましい実施態様においては最大5mM、非常に特に好
ましい実施態様においては最大1mMのバッファー塩濃度を意味するものと理解さ
れる。

【００１６】本発明の方法の更に特に好ましい実施態様において、不純物として痕跡量（＜
1mM）の無機及び有機塩のみを含む水性の系が使用され得る。非常に特に好まし
くは、水性のバッファーを含まない系は純水である。

【００１７】本発明の方法の特に好ましい実施態様において、精製されたアミロスクラーゼ
が使用される。ここでの精製されたアミロスクラーゼとは、蛋白質が合成される
細胞の細胞構成要素を実質的に含まない酵素を意味するものと理解される。好ま
しくは、“精製されたアミロスクラーゼ”という用語は、少なくとも80%、好ま
しくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%の純度を有するアミロスク
ラーゼを意味する。

【００１８】 α−1,4−グルカンの製造のために精製された蛋白質を使用することは、様々
な利点がある。部分的に精製された蛋白質抽出物を用いて操作する方法と比較し
て、本発明の方法の反応媒体は、蛋白質の精製又は生物工学的産生のために使用
される生産菌株（微生物）の残渣を含有しない。

【００１９】更に、精製された蛋白質を使用することにより、食品及び製薬工業における応
用に、利点が見られ得る。全ての不必要な構成要素を含まない、限定された反応
媒体組成のために、産生物の構成要素はまた、より正確に限定される。このこと
は、食品及び製薬工業において生物工学により製造されたこれらの生産物の、相
当狭い範囲の承認手順につながる。なぜなら特に、これらの生産物は、トランス
ジェニック微生物の痕跡を有しないからである。

【００２０】本発明の方法の特に好ましい実施態様において、アミロスクラ―ゼは、組換体
として製造された蛋白質である。本発明に関連して、これは、該蛋白質をコード
するDNA配列を宿主細胞に導入し、それをそこで発現させることにより産生され
る蛋白質を意味するものと理解される。次に蛋白質は、宿主細胞及び／又は培養
培地から単離され得る。この場合の宿主細胞は、好ましくは例えばシュレーゲル
（Schlegel）の“一般微生物学（Allgemeine Mikrobiologie）”（Georg Thieme
Verlag, 1985, 1-2）で定義される細菌又は原生生物（例えば真菌、特に酵母菌
、藻類）である。特に好ましくは、アミロスクラーゼは宿主細胞により分泌され
る。組換えアミロスクラーゼの産生のためのこのタイプの宿主細胞は、当業者に
知られている方法によって生産され得る。

【００２１】様々な発現系のレビューは、例えばMethods in Enzymology 153 (1987), 385-
516及びビッター（Bitter）ら（Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544）
に見られ得る。発現ベクターは、文献にかなりの程度記述されている。選択マー
カー遺伝子及び選択された宿主中で確実に複製する複製起点に加えて、それらは
一般的に細菌又はバクテリアのプロモーター、及び通常転写の終止シグナルを含
有している。プロモーターと終止シグナルとの間には、コーディングDNA配列を
挿入することができる、少なくとも１つの制限部位又はポリリンカーが位置して
いる。もし選択された宿主生物中で活性があるとすると、使用されたプロモータ
ー配列は、対応する遺伝子の転写を自然に制御するDNA配列であり得る。しかし
、この配列もまた、他のプロモーター配列により置き換えられ得る。構成的に遺
伝子を発現させているプロモーターが使用され得るか、又は後に続く遺伝子の発
現を特異的に制御することができる誘導プロモーターが使用され得る。これらの
特性を有する細菌及びウイルスのプロモーター配列は、文献に広範に記述されて
いる。微生物（例えば、E. coli、S. cerevisiae）における発現の調節配列は、
論文に充分に記述されている。特に後に続く遺伝子を高度に発現させることがで
きるプロモーターは、例えば、T7プロモーター（Studierら., Methods in Enzym
ology 185 (1990), 60-89）、lacuv5、trp、trp-lacUV5（DeBoerら., in Rodrig
uez and Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, Ne
w York, (1982), 462-481; DeBoerら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 2
1-25）、lp1、rac（Borosら., Gene 42 (1986), 97-100）である。一般的に、蛋
白質量は、微生物の成長サイクルの対数期の中間から終点に向かって最大となる
。それ故に、蛋白質合成のために、好ましくは誘導プロモーターが使用される。
これらにより、しばしば構成プロモーターよりも蛋白質の高い収量を得る。強力
な構成プロモーターの使用は、クローン化された遺伝子の一定の転写及び翻訳を
経て、他の必須の細胞機能のためのエネルギーが失われ、従って細胞の成長の延
長をもたらす（Bernard R. Glick/Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnolo
gie (1995), Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heiderberg Berlin Oxford,
p. 342）。それ故に、蛋白質の最大量を得るために、しばしば2段階法が用いら
れる。第一に、宿主細胞を最適条件下に比較的高い細胞密度で培養する。第2段
階では、使用されるプロモーターのタイプに依存して転写が誘導される。この文
脈中の特に適したプロモーターは、ラクトース又はIPTG（＝イソプロピル‐β‐
D‐チオガラクトピラノシド）によって誘導され得るtacプロモーターである（De
Boerら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25）。転写のための終止
シグナルもまた文献に記述されている。

【００２２】宿主細胞は、一般的に、例えばサムブルック（Sambrook）ら（Molecular Clon
ing: A Laboratory Course Manual, 第2版 (1989), Cold Spring Harbor Press,
New York）に記述されているような、標準的方法によってアミロスクラーゼを
コードするDNAを使用して形質転換され得る。宿主細胞は、特にpH、温度、塩濃
度、通気、抗生物質、ビタミン、微量元素等を考慮して、使用されるそれぞれの
宿主細胞の要求を満たす栄養培地中で培養される。

【００２３】宿主細胞により産生された酵素は、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相HPLC等のような、慣用の精製方
法により精製され得る。

【００２４】宿主細胞で発現し、アミロスクラーゼをコードするDNAを修飾することによっ
て、ある特性のために培養培地からより容易に単離され得るポリペプチドが宿主
細胞で産生され得る。従って、発現されるべき蛋白質を、特異的な結合特性によ
り融合蛋白質がアフィニティクロマトグラフィーによって単離できるように、更
なるポリペプチド配列との融合蛋白質として発現する可能性がある（例えば、Ho
ppら., Bio/Technology 6 (1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol
. 8 (1990), 88-93）。

【００２５】本発明の方法の好ましい実施態様において、組換体として産生されて宿主細胞
によって栄養培地中に分泌されたアミロスクラーゼが使用されるので、細胞の消
化及び蛋白質の更なる精製は必要でない。なぜなら、分泌された蛋白質は上清か
ら単離され得るからである。培養培地の残った構成要素を除去するために、プロ
セスエンジニアリングにおける通常の方法、例えば透析、逆浸透、クロマトグラ
フ法等が使用され得る。培養培地中に分泌された蛋白質を濃縮するためにも同じ
方法が適用される。微生物による蛋白質の分泌は、通常N末端シグナルペプチド
（シグナル配列、リーダーペプチド）によって媒介される。このシグナル配列を
有する蛋白質は、微生物の細胞膜を通ることができる。蛋白質の分泌は、対応す
るアミロスクラーゼをコードする領域に結合されるこのシグナルペプチドをコー
ドするDNA配列によって成し遂げられ得る。好ましくは、シグナルペプチドは、
発現されたアミロスクラーゼの自然のシグナルペプチドであり、特に好ましくは
ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）由来のアミロスクラ
ーゼのものが良い。

【００２６】非常に特別に好ましくは、シグナルペプチドは、Klebsiella oxytoca M5A1（F
iedlerら., J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291）由来のα‐CGTアーゼのもの
か、又はアクセス番号X864014でジーンバンクで入手できる配列の、ヌクレオチ
ド11529-11618でコードされるシグナルペプチドである。

【００２７】代わりに、本発明の方法に使用されるアミロスクラーゼはまた、微生物を使用
せずに、蛋白質の発現を導くインビトロでの転写及び翻訳系を使用して、産生さ
れる得る。

【００２８】好ましい実施態様において、本発明の方法において、外来性の炭水化物アクセ
プターが、アミロスクラーゼによるスクロースの変換に添加される。本発明の目
的のために、外来性の炭水化物アクセプターは、アミロスクラーゼによるスクロ
ースの変換の初期速度を上昇させることができる分子である。好ましくは、外来
性の炭水化物アクセプターは、変換の初めに反応混合物に添加される。外来性の
アクセプターを使用すると、処理時間が短くなり、従って処理コストが減少する
。炭水化物アクセプターは、好ましくはオリゴサッカライド又はポリサッカライ
ド、好ましくは直鎖のポリサッカライド、特に好ましくは分岐したポリサッカラ
イド、例えばデキストリン、グリコーゲン又はアミロペクチンである。もし、α
‐1,4‐グルカン鎖の伸長がこれらのアクセプター上で起こるとすると、分岐し
た出発材料と比較して、かなり低い程度の分岐を有する生成物が作られる。この
場合、分岐の程度の減少の範囲は重合度nに依存する。もしスクロースをアクセ
プターと比較してかなり過剰のモル数を使用すると、生産物中のα−1,6−分岐
はもはやメチル化分析によって測定され得ない（分岐程度＜1%）。これらの生産
物はまた、本発明に関連して水不溶性α−1,4−グルカンと呼ばれる。

【００２９】更に好ましい実施態様において、アミロスクラーゼの酵素活性を有する酵素は
、支持体材料に固定化される。アミロスクラーゼの固定化は、合成反応の触媒と
して酵素を簡単な方法で反応混合物から回収して、繰り返し使用することができ
るという利点がある。酵素の精製は、一般にコストがかかり、時間を消費するの
で、酵素を固定し、再利用すると、かなりのコスト削減が可能になる。更なる利
点は、蛋白質の残渣を含有しない反応生成物の純度である。

【００３０】支持体材料の多重度は、共有又は非共有結合により起こりうる支持体材料に結
合する、蛋白質の固定に利用できる（レビューとして：Methods in Enzymology
135, 136, 137を参照）。支持体材料として広く使用されている材料は、例えば
アガロース、アルギナート、セルロース、ポリアクリルアミド、シリカ又はナイ
ロンである。

【００３１】図1は、異なったバッファー塩濃度を使用して、ナイセリア・ポリサッカレア
（Neisseria polysaccharea）由来のアミロスクラーゼによる水不溶性α−1,4−
グルカンのインビトロでの生産効率の比較を示す。該方法の効率は、スクロース
の量の減少の基いて測定した。以下の実施例は、本発明を例示する。

【００３２】実施例１アミロスクラーゼの精製アミロスクラーゼを生産するために、ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseri
a polysaccharea）（WO 9531553参照）由来のアミロスクラーゼを使用して形質
転換されたE. coli細胞が使用された。DNAはエヌ．ポリサッカレア（N. polysac
charea）ゲノムライブラリー由来である。

【００３３】ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea）由来のアミロスク
ラーゼを分泌するこれらのE. coli細胞の一夜培養物を、遠心分離し、約1/20の
容量の50mMクエン酸ナトリウムバッファー（pH6.5）、10mM DTT（ジチオスレイ
トール）、1mM PMSF（フェニルメチルスルフォニルフルオライド）中で再懸濁し
た。次に細胞を16000psiでフレンチプレスを使用して2回分解した。そして、1mM
のMgCl₂及びベンゾナーゼ（メルクより；100000単位；250単位μl^-1）を12.5単
位ml^-1の終濃度で細胞抽出物に添加した。次にその溶液を37℃で少なくとも30分
、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。抽出物は、少なくとも1.5時間氷
上に静置された。抽出物を上清が比較的透明になるまで、4℃、約40000gで30分
遠心分離した。孔径0.45μmを有するPVDF膜（ミリポア“デュラポア”、又は類
似のもの）の予備ろ過が行われた。抽出物は4℃で一夜静置された。疎水性相互
作用（HI）クロマトグラフィーを行う前に、抽出物に固体のNaClが添加され、2M
NaClの濃度が確立された。次に抽出物は再び4℃、約40000mgで30分遠心分離さ
れた。抽出物は、孔径0.22μmを有するPVDF膜（ミリポア“デュラポア”など）
で濾過することにより、最終的なE. coliの残渣から解放された。濾過された抽
出物は、ブチルセファロース‐4Bカラム（ファルマシア）（カラム容量：93ml、
長さ：17.5cm）上で分離された。1から5単位μl^-1のアミロスクラーゼ活性を有
する約50mlの抽出物が、カラムにアプライされた。非結合蛋白質は、150mlのバ
ッファーB（バッファーB ：50mMのクエン酸ナトリウム pH6.5、2M NaCl）でカラ
ムから洗浄された。アミロスクラーゼは、自動ポンプシステム（FPLC、ファルマ
シア）を使用して作られた最終的に直線的に低下するNaCl勾配（1.5ml min^-1の
流入速度で、433mlの容量で、50mMのクエン酸ナトリウム中2Mから0MのNaCl）を
使用して溶出された。。アミロスクラーゼは、0.7Mと0.1Mとの間のNaClで溶出さ
れる。フラクションは回収され、PD10セファデックスカラム（ファルマシア）で
脱塩され、8.7%のグリセロールで安定化され、アミロスクラーゼ活性が試験され
、そして最後に貯蔵バッファー（8.7%グリセロール、50mMクエン酸塩）中で凍結
された。

【００３４】実施例２アミロスクラーゼ活性の測定精製した蛋白質又は粗蛋白質抽出物は、5%スクロース、0.1%グリコーゲン及び
100mMクエン酸塩pH6.5を含有する1mlのバッチ中37℃で、様々な希釈度でインキ
ュベートした。5分後、10分後、15分後、20分後、25分後及び30分後に、各溶液
から10μlを取り、すぐに95℃に熱することによりアミロスクラーゼの酵素活性
を終わらせた。共役光度試験（coupled photometric test）で、アミロスクラー
ゼにより遊離されたフルクトースの含量を測定する。このために、1μlから10μ
lの不活性化サンプルを、50mMイミダゾールバッファーpH 6.9、2mM MgCl₂、1mM
ATP、0.4mM NAD及び0.5 U/mlのへキソキナーゼの1mlに添加した。グルコース‐6
‐リン酸デヒドロゲナーゼ（Leuconostoc mesenteroides由来）及びホスホグル
コースイソメラーゼを順次添加した後、340nmで吸収の変化を測定する。次いで
ランベルト−ベールの法則を用いて、遊離されたフルクトース量を計算する。

【００３５】もし得られた値がサンプリング時間と関係するならば、単位数（1U=μmol フ
ルクトース／分）（蛋白質抽出物のμl当たり又は精製した蛋白質のμg当たり）
を決定することができる。

【００３６】実施例３緩衝剤で処理された系と比較した、バッファーを含まない系での反応溶液の容量：50ml 酵素活性：5単位／ml バッファー：酢酸ナトリウム pH6.5、0mM（水）から200mM（メルク）までの間
で変化する基質：10%スクロース（ICN）プライマー：0.1%デキストリン、タイプIV potato（シグマ）方法 10%スクロース、0.1%デキストリン、250単位のアミロスクラーゼ及び異なった
濃度の反応バッファー（25mM、50mM、100mM又は200mM酢酸ナトリウム、pH6.5）
を含有する、それぞれ50mlの反応容量の溶液を、37℃で46時間及び73.25時間イ
ンキュベートした。更に、反応混合物はバッファー無し、つまり、脱塩水（pH7.
0）中で作られた。バッファー物質を除いて、この反応溶液は上述した構成要素
を全て含有していた。

【００３７】スクロースのアミロース及びフルクトースへの変換を測定するために、様々な
時点で、6つの反応溶液からそれぞれ1mlのアリコートを取った。反応は、95℃で
10分間加熱することによりサンプル中で停止させた。変換速度は、光度計で共役
酵素試験を使用して、形成されたフルクトースを測定することにより、又は不活
性サンプル中にまだ存在するスクロースの濃度を測定することにより、測定した
。

【００３８】酵素アッセイアッセイ容量：1ml 酵素：酵母由来のへキソキナーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、ロイコノス
トックメセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来のグルコース‐6‐
リン酸デヒドロゲナーゼ、酵母由来のβ‐フルクトシダーゼ（全ての酵素：ベー
リンガーマンハイム）アッセイバッファー：1ml ATP 0.4mM NAD⁺ 50mM イミダゾール pH6.9 試験は、へキソキナーゼ及びホスホグルコースイソメラーゼを使用して、フル
クトースのグルコース‐6‐リン酸への変換に基く。次に、グルコース‐6‐リン
酸は、グルコース‐6‐リン酸デヒドロゲナーゼにより6‐ホスホグルコネートに
変換される。この反応は、NAD⁺のNADH＋H⁺への変換に関連付けられ、340nmの波
長で光度測定で測定されうる。ランベルト‐ベールの法則を使用して、フルクト
ースの量は、得られた吸収から計算され得る。

【００３９】スクロースの濃度を測定するために、上記の反応混合物に加えて、β‐フルク
トシダーゼが測定されるサンプルに添加される。この酵素は、スクロースをフル
クトース及びグルコースに開裂させる。この反応で得られる2つのモノサッカラ
イドの濃度は、NAD⁺のNADH＋H⁺への変換を使用して、上記のように測定される。
スクロースの濃度は、測定されたモノサッカライドの合計から計算され得る。

【００４０】結果約73時間後、全反応条件下で、反応溶液中に存在するスクロースは、約100%ア
ミロース及びフルクトースに変換されていた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、反応溶液中のスクロースの減少を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者バナジアクロナルドドイツ国デー−14467 ポツダムブルクシュトラッセ 24 Ｆターム(参考） 4B064 AF12 CA21 CC03 CC24 CD09 DA01 DA10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミロスクラーゼの酵素活性を有する酵素によって、スクロ
ースがインビトロで水不溶性α−1,4−グルカン及びフルクトースに変換される
水不溶性α−1,4−グルカンの製造方法であって、水性のバッファーを含まない
系で反応を行うことを含む方法。
【請求項２】アミロスクラーゼが原核生物由来の酵素である、請求項１に
記載の方法。
【請求項３】原核生物がナイセリア（Neisseria）属に属する、請求項２
に記載の方法。
【請求項４】原核生物がナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysacc
harea）である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】アミロスクラーゼが組換体として作られる、請求項１〜４の１
つに記載の方法。
【請求項６】精製されたアミロスクラーゼが使用される、請求項１〜５の１
つに記載の方法。
【請求項７】アミロスクラーゼが支持体材料に結合している、請求項１〜６
の１つに記載の方法。
【請求項８】外来性の炭水化物アクセプターが添加される、請求項１〜７の
１つに記載の方法。