CZ20004695A3 - Způsob výroby ve vodě nerozpustného alfa-1,4- glukanu - Google Patents

Abstract

Reakcí sacharózy in vitro ve vodném systému neobsahujícím pufřy pomocí enzymu s enzymatickou aktivitou amylosacharázy vznikají ve vodě nerozpustné a-l,4-glukany a fřuktoza. Výhodně je amylosacharáza enzym prokargontického organismu Neisseria polysacharea.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká in vitro procesu výroby ve vodě nerozpustného α-1,4-glukanu v systému neobsahujícím pufry.

Dosavadní stav techniky

Zájem průmyslu na biotechnologickém způsobu výroby polysacharidů, obzvláště ve vodě nerozpustných α-1,4-glukanů, které jsou cestou klasické organické syntézy nepřístupné nebo jen velmi obtížně je velký. Z důvodů nákladů však dosud jen omezený počet těchto způsobů dosáhl komerčního využití. Oproti klasickým cestám organické chemické syntézy nabízej i biotechnologické procesy výhody. Zpravidla totiž probíhají enzymaticky katalyzované reakce s mnohem vyšší specifikací (regiospecifita, stereospecifita), s vyšší reakční rychlostí , za mírněj ších reakčních podmínek a vedou k vyšším výtěžkům. Tyto faktory mají při výrobě nových polysacharidů mimořádný význam.

Biotransformace, to znamená in-vitro reakce substancí s čištěnými nebo částečně čištěnými enzymy nabízejí ve srovnání s in-vivo procesy další výhody. Vyznačují se oproti procesům in-vivo lepší kontrolovatelností a vyšší reprodukovatelností, protože reakční podmínky in vitro, v protikladu k podmínkám v žijícím organismu, mohou být definovaně nastaveny. To umožňuje výrobu rovnoměrných produktů o vyso-

• · · · * · • ♦ · » -» · • ♦ · · · • · ♦ · · · · « · · · 9 • · · 9 9 9 9 · ······· · · « · ké jednotnosti a čistotě a tím vysoké kvality, která má pro další průmyslové využití velký význam. Zpracování produktů o rovnoměrné kvalitě vede ke snížení nákladů, protože procesní parametry, které jsou ke zpracování nutné, nemusí vždy znovu optimalizovány pro každou zpracovávanou várku. Další výhoda procesů in vitro spočívá v tom, že produkty na rozdíl od procesů in-vivo neobsahují organismy. Pro určitá použití v potravinářském průmyslu a ve farmaceutickém průmyslu je toto naléhavě nutné. Aby bylo možné využívat výhodné vlastnosti α-1,4-glukanu v technickém měřítku, existuje naléhavá potřeba dát ho cenově dostupným způsobem k dispozici. Ve větším měřítku jsou dosud dostupné jen ve vodě rozpustné α-1,4-glukany, příkladně ve formě amylozy. K výrobě ve vodě nerozpustných α-1,4-glukanů byl dosud popsán v patentové přihlášce VO 95/31553 a v Remaud-Simon a spol. (Remaud- Simon, in Petersen, Svenson a Pedersen (Eds.) Carbohydrate bioengineering, Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands (1995) , strany 313-320 způsob za použití amylosacharozy z Neisseria polysaccharea. Tento způsob in-vitro je založen na reakci sacharozy na a-l,4-glukan a fruktozu s částečně čištěnou amylosacharázou a provádí se v natrium- citrátovém pufru (pH 6,5) případně v natrium-maleátovém pufru (pH 6,4).Ve VO 95/31553 se popisuje následující mechanismus

Sacharoza + (α-1,4-glukan)_n=f ruktoza+(α-1,4-glukan)_n+-_L

Vycházejíce z tohoto reakčního schématu slouží lineární oligomemí nebo polymerní α-1,4-glukany jako akceptory pro reakci prodlužující řetězec, která vede k ve vodě nerozpustným polymerům α-1,4-glukanu. Na rozdíl od VO 95/31553 používá Remaud-Simon a spol. (supra) navíc 0,1 g/1 glykogenu jako exogeního polysacharidického akceptoru. Tento rozvět• 9 «· ·· » · · · · · • · « · » • · · · · · • · · · ··«· «·· · ··· ···· ·· ·« • · ««>· *

-3vený polysacharidický akceptor vede ke zvýšení reakční rychlosti ve srovnání s biotransformací za nepřítomnosti exogeního polysacharidického akceptoru.

Dosud popsané systémy k výrobě polyglukanů za použití amylosacharáz probíhají v pufrovaných vodných roztocích. Ne všechny tyto způsoby poskytují ve vodě nerozpustné α-1,4glukany. Používání pufrovacích chemikálií a čas potřebná k nastavení požadovaných pufrovacích podmínek vedou ke značným provozním nákladům a ztěžují tak komerční využití těchto systémů. Další náklady vznikají čištěním, které je nutné k odstranění zbytků pufrovací soli z produktů biotransf ormace (α-1,4-glukany a fruktoza). To má velký význam především při používání těchto produktů v potravinářském a farmaceutickém průmyslu. Vzniká proto potřeba dát k dispozici způsob efektivní výroby ve vodě nerozpustných α-1,4-glukanů, který by byl komerčně využitelný a vedl k vysoce čistým produktům.

Předložený vynález si klade za úkol dát k dispozici způsob výroby ve vodě nerozpustných α-1,4-glukanů vhodný pro velkoprovozní výrobu, který navíc vede k vysoce čistým produktům .

Podstata vynálezu

Předložený vynález se tedy týká způsobu výroby ve vodě nerozpustných α-1,4-glukanů, při kterém reaguje sacharóza in vitro pomocí enzymu s enzymatickou aktivitou amylosach.arázy za vzniku ve vodě nerozpustných α-1,4-glukanů a fruktozy, vyznačující se tím, že se reakce provádí vodném systému neobsahuj ícím pufry.

• » » 0 0 0000

0000 0 0 000000

0 00 0000 • 00 0 «00 0000 «0 00

-4Překvapivě bylo objeveno, že se k in vitro výrobě ve vodě nerozpustných α-1,4-glukanů pomoci amylosacharázy z Neisseria polysacharea může použít vodný systém neobsahuj ící pufr. Účinnost tohoto způsobu, která se může stanovit na základě uvolnění fruktozy případně spotřeby sacharozy odpovídá pufrovaným způsobům. To je překvapivé, protože funkcionalitu použitých enzymů bylo dosud možné prokázat pouze v pufrovaných roztocích (MacKenzie a spol., Can.J. Microbiol. 23 (1977), 1303-1307; Okada a Hehre,

J.Biol.Chem. 249 (1974) 126-135; Tao a spol., Carbohydrate Res. 182 (1988), 163-174; Butcher a spol., J.Bacteriol 179 (1997), 3324-3330; VO 95/31553).

Způsob podle vynálezu nyní umožňuj e výraznou redukci nákladů in vitro výroby nerozpustných α-1,4-glukanů. Obzvláště odpadají pracovní kroky a zařízení v souvislosti s výrobou pufrovacích roztoků a rovněž s úpravou a případně udržováním pH hodnoty. Další rozhodující výhoda způsobu podle vynálezu spočívá ve zvýšené čistotě produktu, která má velký význam především při použití v oblasti potravin a v potravinářském, kosmetickém a farmaceutickém průmyslu. Systém neobsahující pufr kromě toho poskytuje tu výhodu, že produkty neobsahují zbytky tohoto pufru. Nákladné čistící kroky k odstranění těchto solí, které mohou vadit při určitém užití v potravinářském a farmaceutickém průmyslu proto nejsou nutné. To vede k další výrazné redukco nákladů. Vedle ve vodě nerozpustného α-1,4-glukanu vzniká při způsobu podle vynálezu fruktoza. Ta se může použít k nákladově příznivému získávání tak zvaného high-fruktose sirupu (HFS). Způsob podle vynálezu vede na základě reakčních podmínek bez pufru k produktům vysoké čistoty. Na rozdíl od obvyklých způsobů výroby HFS z kukuřičného škrobu tedy není nutné nákladné • ♦ ···· ·

-5• ·· ·· ·· • '· · 9 9 9 9 9

9 9 4 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

999 9 999 9999 99 99 čištění fruktozy k odstranění pufrovacích solí zahrnující výměnu iontů (Crabb a Mitchinson, TIBTECH 15 (1997),

349-352).

Jako reakce in-vitro se v rámci předloženého vynálezu rozumí přeměna, to znamená reakce, která probíhá mimo živoucí organismus. In vitro znamená obzvláště, že se způsob podle vynálezu provádí v reakční nádobě.

Jako enzym s enzymatickou aktivitou amylosacharázy (E.C.2.4.1.4.) se rozumí enzym, který katalyzuje následující reakci :

Sacharoza + (α-1,4-glukan)_n=fruktoza+(a-l,4-glukan)_n+1

Enzymatická aktivita amylosacharázy se může příkladně prokázat tak, jak se popisuje v příkladech předložené přihlášky .

V rámci předloženého vynálezu se jako amylosacharáza rozumí také enzym, který s použitím výchozí sacharózy a rozvětvených akceptorů polysacharidů katalyzuje syntézu fruktozy a lineárních α-1,4-glukanů na těchto polysacharidických akceptorech. To znamená, že amylosacharáza katalyzuje prodloužení řetězce α-1,4-glukanu také na těchto rozvětvených akceptorech. Přitom vznikající produkty vykazují ve srovnání s použitými rozvětvenými edukty nepatrný stupeň rozvětvení. Také tyto produkty se v rámci předloženého vynálezu označují jako ve vodě nerozpustné α-1,4-glukany.

V zásadě se může při způsobu podle vynálezu použít každá libovolná amylosacharáza. S výhodou se použije amylosacharáza prokaryontického původu. Enzymy tohoto druhu jsou » · ···*

-6• · · · · · • · ·»···· * · · · · · · příkladně známé z Neisseria perflava (Okada a Hehre,

J.Biol.Chem. 249 (1974), 126-135; MacKenzie a spol., Can.J. Microbiol. 23 (1977), 1303-1307 nebo Neisseria canis, Neisseria cinerea, Neisseria denitrificans, Neisseria sicca a Neisseria subflava (MacKenzie a spol., Can.J.Microbiol.

(1978), 357-362). Dále popisuje VO 95/31553 amylosacharázu z Neisseria polysaccharea. Obzvláště výhodně se použije amylosacharáza sekretovaná přirozeně z prokaryontů.

V jedné výhodné formě provedení způsobu podle vynálezu se použije amylosacharáza z bakterií rodu Neisseria, obzvláště výhodně amylosacharáza z druhu Neisseria polysaccharea.

Ve vodě nerozpustné α-1,4-glukany ve smyslu vynálezu jsou polysacharidy vyrobené výše popsanou reakcí sacharozy s amylosacharázou. Pod pojmem ve vodě nerozpustné glukany se rozumí obzvláště polysacharidy vyrobené výše popsanou reakcí sacharozy s amylosacharázou, které podle definice v Deutsches Arzneimittelbuch (DAB = Deutsches Arzneimittelbuch, Vissenschaftliche Verlagsgessellschaft mbH, Stuttgart, Govi-Verlag GmbH, Frankfurt, 9. vydání, 1987) spadá do kategorie těžko rozpustné sloučeniny, velmi těžko rozpustné nebo prakticky nerozpustné.

Pod pojmem systém neobsahující pufr se v rámci tohoto vynálezu rozumí vodný systém, který v podstatě neobsahuje žádné pufrovací sole. Pod pojmem pufrovací sole se v této souvislosti rozumí anorganické a organické soli, obzvláště soli slabých kyselin a bází.

Pod pojmem v podstatě žádné se v této souvislosti rozumí koncentrace pufru nejvýše 25 mM, ve výhodné formě • 0 00 00 • 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 • 0 0 0 · 0 • 0 0 0 0

0000 00 00 • · • •0* ·

-7provedení nejvýše 10 mM, v další výhodné formě provedení nejvýše 5 mM a ve zcela obzvláště výhodné formě provedení nejvýše 1 mM.

V další obzvláště výhodné formě provedení způsobu podle vynálezu se může použít vodný systém, který obsahuje anorganické a organické soli jako nečistoty pouze ve stopách (méně než 1 mM). Zcela obzvláště výhodný jako vodný systém neobsahující pufr je čistá voda.

V jedné obzvláště výhodné formě provedení způsobu podle vynálezu se použije čištěná amylosaccharáza. Jako čištěná amylosacharáza se přitom rozumí enzym, který prakticky neobsahuje buněčné součásti buněk, ve kterých se protein syntetizuje. S výhodou znamená pojem čištěná amylosacharáza amylosacharázu, která má stupeň čistoty nejméně 80 %, s výhodou nejméně 90 % a obzvláště výhodně nejméně 95 %.

Použití čištěného proteinu k výrobě α-l,4-glukanu nabízí různé výhody. Ve srovnání se způsoby které pracují s částečně vyčištěným proteinovým extraktem, neobsahuje reakční medium při způsobu podle vynálezu žádné zbytky produkčního kmene (mikroorganismy), který se použije k čištění proteinu nebo k jeho výrobě genovými technikami.

Proto je možné vidět v použití čištěného proteinu výhodu pro použití v potravinářském a ve farmaceutickém průmyslu. Definované složení reakčního media a především zbavení všech nepotřebných složek způsobuje že i produkt je v jeho složkách přesněji definován. To vede k podsta-tně menšímu rozsahu schvalovacího procesu pro tyto biotechnologicky vyrobené produkty v potravinářském a ve farmaceutickém • fl flfl flfl flfl · · fl · » flflfl · • flfl · · · • · flfl flflflfl flflfl · ······· tt ·· fl · • flflfl ·

-8průmyslu, obzvláště proto, že tyto produkty by neměly vykazovat ani stopy transgeních mikroorganismů.

V jedné obzlváště výhodné formě provedení způsobu podle vynálezu je amylosacharáza rekombinantně vyrobený protein. Tím se v rámci předloženého vynálezu rozumí protein, který se vyrobil tak, že se sekvence DNA kódující protein zavede do hostitelské buňky a tam se uvede k expresi.

Protein se potom může následně získat z hostitelské buň ky a/nebo z media kultury. Hostitelská buňka je přitom s výhodou bakterium nebo protist (příkladně houby, obzvláště kvasinky, řasy) jak jsou příkladně definovány v Schlegel Allgemeine Mikrobiologie (Georg Thieme Verlag, 1985,

1-2). Obzvláště výhodně se sekretuje amylosacharáza z hostitelské buňky. Výroba takových hostitelských buněk k produkci rekombinantní amylosacharázy se může provádět metodami odborníkům známými.

Přehled o různých expresních systémech lze nalézt příkladně v Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516 a v Bitter a spol. Methods in Enzymology 153 (1987),

516-544. Expresní vektory jsou v literatuře popsány bohatě. Vedle selekčních markergenů a jednoho zpravidla bakteriálního nebo virálního promotoru zajišťujícího replikaci ve zvoleném hostiteli a rovněž většinou jeden terminační signál pro transkripci. Mezi promotorem a terminačním signálem se nachází nejméně jedno místo restrikčního řezu nebo polylinker, který umožňuje inzerci kódující sekvence DNA. Jako sekvence promotoru, pokud je ve zvoleném hostitelském organizmu aktivní, se může použít sekvence DNA řídící přirozeným způsobem transkripci odpovídajícího genu. Tato sekvence se ale také může vyměnit za j iné sekvence promotorů. Mohou se použít jak promotory, které ovlivňují

-9• · · · · · • · · · · · · ··· · ··· ···· ·· ·· konstitutivní expresi genu, tak i indukovatelné promotory, které umožňují cílenou regulaci exprese následovně zařazeného genu. Bakteriální a virální sekvence promotorů s těmito vlastnostmi jsou v literatuře podrobně popsány. Regulační sekvence k expresi v mikroorganismech (přkladně E.coli, S. cerevisíae) se v literatuře dostatečně popisují. Promotory, které umožňují obzvláště silnou expresi následovně zařazeného genu jsou příkladně promotor T7 (Studier a spol., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), Lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer a spol., v Rodriguez and Chamberlin (Eds),

Promotors, Structure and Function; Praeger, New York (1982), 462-481; DeBoer a spol., Proč.Nati.Acad.Sci. USA (1983), 21-25), lpi, rac (Boros a spol., Gene 42 (1986) , 97-100). Zpravidla dosahují množství proteinu od středu až téměř ke konci logaritmické fáze cyklu růstu mikroorganizmů svého vrcholu. K synteze proteinů se proto s výhodou používají indukovatelné promotory. Tyto vedou často k vyšším výtěžkům proteinů než konstitutivní promotory. Použití silně konstitutivních promotorů vede přes trvalou transkripci a translaci klonovaného genu část k tomu, že se energie pro ostatní podstatné funkce buňky ztratí a tím se zpomalí růst buňky (Bernard R. Glick/Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie (1995), Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg Berlin Oxford, strana 342).

K dosažení optimálního množství proteinu se proto často používá dvoustupňový způsob. Nejprve se hostitelské buňky za optimálních podmínek kultivují až k dosažení relativně vysoké hustoty buněk. Ve druhém kroku se potom indukuje transkripce podle druhu použitého promotoru. Obzvláště vhodný je v této souvislosti tac-promotor indukovatelný laktozou nebo IPTG (= isopropyl- b-D-thiogalaktopyranosid) (DeBoer a spol., Proč.Nati.Acad. Sci. USA 80 (1983),

21-25). V literatuře jsou rovněž popsány terminační signály • 0

-ι η 0000000 000000

J-V 00 0 0 0 0 0 0

000 0 000 0000 00 00 pro transkripci.

Transformace hostitelské buňky DNA kódující amylosacharázu se může zpravidla provádět standardními metodami, jaké jsou příkladně popsány v Sambrook a spol. (Molecular Cloning; A Laboratory Course Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Press, New York). Kultivace hostitelské buňky se provádí v živných mediích, která odpovídají vždy požadavkům použité hostitelské buňky, obzvláště se zohledněním pH hodnoty, teploty, koncentrace solí, provzdušnění, obsahu antibiotik, vitaminů, stopových prvků a tak dále.

Čištění enzymů produkovaných hostitelskými buňkami se může provádět obvyklými metodami čištění jako je srážení, iontoměničová chromatografie, afinitní chromatografie, gelová filtrace, HPLC chromatografie s reverzní fází a tak dále.

Modifikací DNA exprimované v hostitelské buňce a kódující DNA se může v hostitelské buňce vyrobit polypeptid, který se na základě určitých vlastností může z kultivačního media snadněji izolovat. Vzniká tak možnost exprimovat exprimovaný protein jako fuzní protein s další polypeptidovou sekvencí, jejíž specifické vazební schopnosti umožňují izolaci fuzního proteinu pomocí afinitní chromatografie (příkladně Hopp a spol., Bio/Technology 6 (1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88-93).

Při jedné výhodné formě provedení způsobu podle vynálezu se použije rekobinantně vyrobená amylosacharáza sekretovaná z hostitelské buňky do živného media, takže není nutné oddělování od buněk ani další čištění proteinu, protože

-11·· ·» ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · * ····· ·· · · se sekretovaný protein může získat z horní vrstvy. K odstranění zbytkových součástí kultivačního media se mohou použít běžné metody procesní techniky, jako příkladně dialyza,reverzní osmoza, chromatografické metody a tak dále. To samé platí i pro koncentrování proteinu sekretovaného do kultivačního media. Sekrece proteinů mikroorganismy se obvykle zprostředkuje pomocí N-terminálních signálních peptidů (signální sekvence, leader peptid). Proteiny s touto signální sekvencí mohou proniknout buněčnou membránou mikro- organismu. Sekrece proteinu se může dosáhnout tím, že se sekvence DNA, která kóduje tento signální peptid, připojí na odpovídající region kódující amylosacharázu. Výhodný je signální peptid z přirozeného signálního peptidu exprimované amylosacharázy, obzvláště výhodný je signální peptid amylosacharázy z Neisseria polysaccharea.

Zcela obzvláště výhodný je signální peptid α-CGTasy z Klebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler a spol., J.Mol.Biol. 256 (1996), 279-291) nebo signální peptid, který je kodován sekvencí přístupnou v genové bance pod přístupovým číslem X86014 z nukleotidů 11529-11618.

Alternativně se může při způsobu podle vynálezu používaná amylosacharáza také za použití in-vitro transkripčního a translačního systému, který vede k expresi proteinu bez použití mikroorganizmů.

V jedné výhodné formě provedení se při způsobu podle vynálezu při rekaci sacharózy s amylosacharázou přidá externí uhlohydrátový akceptor.

V rámci předloženého vynálezu se jako externí uhlohydrátový akceptor rozumí molekula, která je schopná zvýšit po• 0 • 0 • ·

-120 0 0 0 čáteční rychlost reakce sacharozy s amylosacharázou. S výhodou se externí uhlohydrátový akceptor přidá na začátku reakce k reakční směsi. Použití externího akceptoru vede k redukci doby procesu a tím ke snížení nákladů na proces. Uhlohydrátový akceptor je s výhodou oligo- nebo polysacharid, s výhodou lineární polysacharid a obzvláště výhodně rozvětvený polysacharid jakopříkladně dextrin, glykogen nebo amylopektin. Dochází-li na těchto akceptorech k prodloužení řetězce α-1,4-glukanu, pak vznikají produkty, které ve srovnání s rozvětveným eduktem vykazuj i podstatně nižší stupeň rozvětvení. Míra snížení stupně rozvětvení přitom závisí na stupni polymerace n. Použije-li se sacharóza ve větším molárním přebytku ve srovnání s akceptorem, potom již v produktu nejsou měřitelné α-1,6-rozvětvení pomoci methylační analyzy (stupeň rozvětvení < 1 %). Také tyto produkty se v rámci předloženého vynálezu označují jako ve vodě nerozpustné α-1,4-glukany.

V jedné další výhodné formě provedení je enzym s enzymatickou aktivitou amylosacharázy imobilizován na nosném materiálu. Imobilizace amylosacharázy poskytuje tu výhodu, že se enzym jako katalyzátor syntezní reakce může jednoduchým způsobem znovu získat z reakční směsi a může se opakovaně použít. Protože čištění enzymů je zpravidla nákladné a časově náročné, umožňuje imobilizace a opětovné využití enzymu značné úspory nákladů. Další výhodou je stupeň čistoty reakčního produktu, který neobsahuje žádné zbytky proteinu.

K imobilizaci proteinů je k dispozici množství nosných materiálů, přičemž vazba na nosný materiál se může provádět kovalentními nebo nekovalentními vazbami (pro přehled viz : Methods in Enzymology 135, 136, 137). Značně rozšířené jako

-13···· · * »4 44 »4 9 4 9 9 9

4 4 4 9

9 4 4 9 4

9 9 4 9

494 4494 94 nosné materiály jsou příkladně agarozy, algenát, celulózy, polyakrylamid, silika nebo nylon.

Obrázek 1 ukazuje srovnání účinnosti in-vitro výroby ve vodě nerozpustných α-1,4-glukanů pomocí amylosacharázy z Neisseria polysaccharea při použití různých koncentrací pufrů. Účinnost procesu se stanoví na základě úbytku množství sacharózy.

Následující příklady vysvětlují vynález.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Čištění amylosacharázy

K výrobě amylosacharázy se použijí buňky E. coli, které se transformují amylosacharázou z Neisseria polysaccharea (viz VO 9531553). DNA pochází z genomické knihovny N. polysaccharea.

Přes noc vypěstovaná kultura těchto E. coli buněk, kterou sekretuje amylosacharáza z z Neisseria polysaccharea se odcentrifuguje a resuspenduje se v asi 1/20 objemu 50 mM natriumcitrátového pufru (pH 6,5) 10 mM DTT (dithiothreitol), 1 mM PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid). Následně se buňky dvakrát zpracují na French-lisu při tlaku 110,32 MPa. Potom se k buněčnému extraktu přidá 1 mM MgCl₂ a benzonáza (firma Merck, 100 000 jednotek, 250 jednotek μΙ^-4-) do konečné koncentrace 12,5 jednotek /ml. Potom se násada inkubuje při teplotě 37 °C a mírného míchání po dobu nejméně 30 minut. Extrakt se nechá stát nejméně 1,5 hodiny na ledu.

-14··» * ·

A · 4 4 · · · • · · · ♦ 4 4 ·

Následně se centrifuguje po dobu 30 minut při teplotě 4 °C při asi 40 000 g, dokud není zbytek relativně čirý. Provede se předfiltrace přes membránu PVDF (Millipore Durapore, o.á)., která má průměr pórů 0,45 gm. Extrakt se ponechá stát přes noc při teplotě 4 °C. K provedení HI (Hydrophobic interaktion)-chromatografie se extrakt smíchá s pevným chloridem sodným a upraví se na koncentraci 2 M chloridu sodného. Následně se opět centrifuguje po dobu 30 minut při teplotě 4 °C při asi 40 000 g. Potom se extrakt zbaví posledních zbytků E. coli filtrací přes membránu PVDF (Millipore Durapore, o.á)., která má průměr pórů 0,22 gm. Filtrovaný extrakt se rozdělí přes sloupec Butyl- sepharose-4B (Pharmacia) (objem sloupce : 93 ml, délka : 17,5 cm). Asi 50 ml extraktu s aktivitou amylosacharázy od 1 do 5 jednotek g/1 se uvede na sloupec. Následně se ze sloupce vymývají 150 ml pufru B nevázané proteiny (pufr B :

mM natriumcitrátu, pH 6,5, 2 M NaCl). Amylosacharáza se nakonec eluuje s pomocí klesajícího lineárního gradientu NaCl (od 2 M až do 0 M NaCl v 50 mM natriucitrátu v objemu 433 ml při průtoku 1,5 ml/min), který se generuje automatickým čerpacím systémem (FPLC, Pharmacia). K eluci amylosacharázy dochází mezi 0,7 M a 0,1 M NaCl. Frakce se spojí, odsolí se přes sloupec Sephadexu PD10 (Pharmacia), stabilizují se 8,7 % glycerinu, ověří se aktivita amylosacharázy a konečně se zamrazí v ukládacím pufru (8,7 % glycerinu, 50 mM citrátu).

Příklad 2

Stanovení aktivity amylosacharázy

Vyčištěný protein nebo proteinový extrakt se v rozdílných koncentracích uvede do 1 ml násady sestávaj ící z 5 % sacharozy,0,1 % glykogenu a 100 mM citrátu o pH 6,5 a inku• ♦

-15buje se při teplotě 37 °C. Po 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min a 30 minutách se z této násady odebere 10 μΐ a okamžitým zahřátím na teplotu 95 C se ukonči enzymatická aktivita amylosacharázy. V integrovaném fotometrickém testu se následně stanovuje podíl fruktózy uvolněné amylosacharázou. K tomu se 1 μΐ až 10 μΐ inaktivovaného vzorku vloží do 1 ml 50 mM imidazolového pufru o pH 6,9, 2 mM chloridu hořečnatého 1 mM ATP, 0,4 mM NAD a 0,5 U/ml hexokinázy. Po postupném přidávání dehydrogenázy glukózy-6-fosfátu (z Leuconostoc mesenteroides) a izomerázy fosfoglukozy se měří změna absorpce při 340 nm. Následně se s pomocí Lambert- Beerschenova zákona vypočítá množství uvolněné fruktozy.

Porovnají-li se získané hodnoty s dobou odběru vzorku, je možné stanovit počet jednotek (1 U = pmol fruktozy/min) (na μΐ proteinového extraktu případně pg vyčištěného proteinu) .

Příklad 3

Reakce v systému bez pufru v porovnání s pufrovaným systémem

Obj em násady : Aktivita enzymu Pufr :

Substrát : Primer :

ml

Units/ml

Na-acetát o pH 6,5, měněno mzi 0 mM (= voda) a 200 mM (Merck) % sachroza (ICN)

0,1 % dextrinu, typ IV bramborový (Sigma)

-16• · • · · · ·

Provedení :

Násady o reakčním objemu vždy 50 ml, obsahující 10 % sacharozy, 0,1 % dextrinu, 250 jednotek amylosukrázy a rozdílné koncentrace reakčního pufru (25 mM, 50 mM, 100 mM případně 200 mM Na-acetátu, ph 6,5) se inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 46 hodin případně 73,25 hodin. Navíc se nasadí reakční směs bez pufru, to znamená v demineralizované vodě (pH 7,0). S výjimkou pufrovací substance obsahuje tato reakční násada všechny výše uvedené složky.

Ke stanovení reakce sacharozy na amylozu a fruktozu se ze šesti reakcních násad odebere v rozdílných časových intervalech vždy 1 ml podíl. Reakce v odebraných vzorcích se zastaví 10-ti minutovým zahřátím na teplotu 95 °C. Stanovení reakčního podílu se provádí měřením vzniklé fruktozy případně měřením ještě zbylé koncentrace sacharozy v inaktivovaných vzorcích pomocí integrovaného enzymatického testu ve fotometru.

Assay enzymu :

Měřený obj em Enzymy :

Měrný pufr :

ml hexokináza z kvasinek, isomeráza fosfoglukozy, dehydrogenáza glukosy-6-fosfátu, z z Leuconostoc mesenteroides, β-fruktosidáza z kvasinek (všechny enzymy od firmy Boehringer Mannheim) mM ATP;

0,4 mM NAD⁺ mM imidauzolu pH 6,9

-17Test spočívá v reakci fruktozy pomocí hexokinázy a isaomerázy fosfoglukozy na glukozu-6-fosfát. Následně se provede převedení glukózy-6-fosfátu pomocí dehydrogenázy glukózy-6-fosfátu na 6-fosfoglukonát. Tato reakce je vázána na přeměnu NAD⁺ na NADH + H⁺, kterou je možné měřit fotometricky při vlnové délce 340 nm. S pomocí Lambert-Beerschová zákona se může ze zjištěné absorpce vypočítat množství fruktozy .

Ke stanovení koncentrace sacharozy se ke stanovovanému vzorku přidá navíc k výše popsané reakční směsi ještě β-fruktosidáza. Ta štěpí sacharózu na fruktozu a glukózu. Koncentrace obou monosacharidů vznikajících z reakční směsi se potom stanoví pomocí reakce NAD⁺ na NADH + H⁺. Ze sumy stanovených monosacharidů se může vypočítat koncentrace sacharozy.

Výsledek :

Po asi 73 hodinách za všech reakčních podmínek je sacharóza přítomná v reakční směsi zreagována prakticky ze 100 % na amylozu a fruktozu.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   ······· ·« · <

   advokát „«« řjft SWŮAA a WáBwva 2 . 'W)-^{! v} * '

   1. Způsob výroby ve vodě nerozpustných α-1,4-glukanů, při kterém reaguje sacharoza in vitro pomocí enzymu s enzymatickou aktivitou amylosacharázy za vzniku ve vodě nerozpustných α-1,4-glukanů a fruktozy, vyznačující se tím, že se reakce provádí ve vodném systému neobsahujícím pufry.
2. 2. Způsob podle nároku 1, při kterém je amylosacharáza enzym prokaryontického organismu.
3. 3. Způsob podle nároku 2, při kterém prokaryontický organismus patří k rodu Neisseria.
4. 4. Způsob podle nároku 3, při kterém je prokaryontický organismus Neisseria polysaccharea.
5. 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, při kterém se amylosacharáza vyrobí rekombinantně.
6. 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, při kterém se použije čištěná amylosacharáza.
7. 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, při kterém je amylosacharáza vázána na nosný materiál.
8. 8. Způsob podle některého z nároků 1 přidá externí uhlohydrátový akceptor.