JP2002513814A - 化学修飾された核酸および核酸の固体支持体への結合方法 - Google Patents

化学修飾された核酸および核酸の固体支持体への結合方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ガラスなどの固体支持体に対する強化された反応性を有する新規な化学的に修飾された核酸に関する。このような修飾された核酸は、固体支持体、例えば、ガラス表面に、ガラス表面を最初に誘導体化することなく容易に固定することができる。このような修飾された核酸に基づく高密度マイクロアレイならびにこのようなマイクロアレイの調製方法もまた有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） １．発明の技術分野 本発明は、ゲノムの広範囲にわたる遺伝子マッピングおよび遺伝子の発現研究
などの領域において結合させた核酸試料に対する科学的研究または日常的な試験
を行うために核酸を固体支持体に固定するための非常に関連した一連の化合物、
装置、および固定化技術に関する方法を特許請求する。
【０００２】 ２．先行技術 生化学分野における研究の大部分は、核酸（特に、デオキシリボ核酸、すなわ
ち、ＤＮＡ）が関与する研究に向いている。ＤＮＡは、溶液（すなわち、水系溶
液）状態に置かれた場合に加水分解などで分解しやすい水溶性化合物である。明
らかなことではあるが、このために、ＤＮＡが関与する研究はいずれも期待通り
にならず、従って、ＤＮＡが関与する正確で信頼性の高い研究には、ＤＮＡの一
体性が保証される方法または装置が必要である。ＤＮＡの研究を容易にするため
に、多くの場合、ＤＮＡを、ガラスの平滑なシートなどの固体表面に固定または
固定化することは望ましい。このような方法で所定の位置に固定されると、ＤＮ
Ａは容易に操作することができる（すなわち、他の物質と反応させることができ
る）。ＤＮＡが長鎖であると考えられる場合、ＤＮＡの固定化は、鎖の一方の端
が固体支持体に固定され、その結果、鎖の残り部分が修飾されず、特定の研究に
依存するさらなる反応を自由に受けることを意味する。実際、これは、ＤＮＡが
関与する実験研究を行うために広く使用されている方法である。
【０００３】 ＤＮＡを固体支持体に固定化することに伴う大きな問題は、おそらくは、（実
際に固体支持体に結合している比較的小さな部分を除いて）ＤＮＡを変化させる
ことなく、いかにしてＤＮＡを固定化するかということそのものである。使用さ
れる固体支持体はどれも本質的に不活性でなければならないから、これは非常に
難しい問題である。すなわち、固体支持体は、ＤＮＡを固体支持体に単に固定化
すること以外にＤＮＡと反応してはならない。ガラスは、安価で非常に不活性で
あるので特に好適な固体支持体である。現在、現行の正統な慣行は、固体支持体
（例えば、ガラスの表面）を、ＤＮＡの一方の端がその表面に結合できるように
、最初に処理または誘導体化しなければならないことである。これを行うための
技術が多数存在する。
【０００４】 残念なことに、ガラスのそれ以外の点で不活性な表面を誘導体化することによ
って、ＤＮＡが関与する実験研究の結果を混乱させ得る様々な問題が生じている
。１つの問題は、ガラス表面を誘導体化することによって、正味の正の静電気電
荷がガラス表面に生じることである。ＤＮＡは（正味の）負の電荷を帯びている
ので、他のＤＮＡ（または研究の後期で使用されるが、ガラス表面に意図的に固
定されないＤＮＡ）が（非特異的な静電気的引力によって）ガラス表面に付着し
やすい。すなわち、（二本鎖よりもむしろ）一本鎖のＤＮＡであるＤＮＡ「プロ
ーブ」が、多くの場合、固体支持体に固定されたＤＮＡ一本鎖のアレイと接触さ
せられる。プローブは既知のヌクレオチド配列を有し、かつ特定の一本鎖ＤＮＡ
は相補鎖に優先的に結合するので、プローブが反応する特定の固定化された鎖に
よって、以前には知られていない固定化された鎖のヌクレオチド配列が明らかに
される。しかし、このタイプの簡便な実験（プローブ研究）は、誘導体化された
（従って、静電気的に帯電した）ガラス表面にプローブが静電気的に付着するこ
とによってひどく混乱させられる。例えば、プローブは、多くの場合、その存在
が通常の放射線検出器で検出できるように放射性標識されている。従って、検出
器により示されるガラス表面におけるプローブの位置によって、（事前に知られ
、指定されている）ガラス表面におけるその特定の位置に固定化されているＤＮ
Ａ鎖の化学的同一性または配列が明らかにされる。しかし、放射線検出器は、固
体支持体に固定されたＤＮＡの相補鎖に化学的に結合したプローブと、（ＤＮＡ
鎖に対してではなく）ガラス表面に単に静電気的に付着したプローブとを識別す
ることができない。
【０００５】 第２に、誘導体化された表面は、「スプレッディング」として知られているこ
とが生じる。スプレッディングは、誘導体化されたときに固体支持体表面が親水
性になるために生じる。その結果、（固体支持体に固定化されることが望ましい
）ＤＮＡを固体支持体の表面と接触させた場合、ＤＮＡは、離れた「スポット」
で留まるのではなく広がる。理想的には、ＤＮＡを、離れた「スポット」で留ま
るようにしなければならない。なぜなら、放射性標識プローブが特定のスポット
または別のスポットで検出されるかどうかによって、科学者は、プローブがあち
こちの固定化されたＤＮＡと反応したことを推定するかどうかを決定するからで
ある。スプレッディングは、アレイ密度（すなわち、１つの固体支持体上に配列
させることができる種々の核酸試料の数）に対する大きな制約である。従って、
スプレッディングを縮小し、従って、アレイ密度を大きくする何らかの手段が非
常に望ましい。
【０００６】 核酸試料を結合させるガラス表面を調製するために使用されている１つの非常
に一般的な物質は、ポリ−Ｌ−リシンである。例えば、デリシ（ＤｅＲｉｓｉ）
ら、ヒトのガンにおける遺伝子の発現パターンを分析するためのｃＤＮＡマイク
ロアレイの使用、１４、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４５７（１９９６）
；シャロン（Ｓｈａｌｏｎ）ら、２色蛍光プローブハイブリダイゼーションを使
用する複雑なＤＮＡ試料を分析するためのＤＮＡマイクロアレイシステム、６、
Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６３９（１９９６）；およびシェナ（Ｓｃｈｅｎａ）ら
、相補的ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現パターンの定量的モニターリ
ング、２７０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、４６７（１９９５）を参照のこと。事前に誘導
体化されたガラス支持体の他のタイプが市販されている（例えば、シリル化され
た顕微鏡スライドガラス）。例えば、シェナ（Ｓｃｈｅｎａ）ら、並行的なヒト
ゲノム分析：１０００遺伝子のマイクロアレイ型発現モニターリング、９３、Ｐ
．Ｎ．Ａ．Ｓ．１０６１４（１９９６）を参照のこと。
【０００７】 多数の他の表面コーティングが開示されている。例えば、米国特許第５，６３
０，９３２号（承継人：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）は
、走査トンネル顕微鏡法で使用されるプローブ（白金）チップのコーティングを
開示している。多数の手段が、表面をコーティングするために開示されているが
、Ｓｉ（ＯＣＨ3 ）ＣＨ2 Ｉが注目される。米国特許第５，６１０，２８７号（
承継人：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｏｌ）は、固体表面を塩またはカチオン性界
面活性剤でコーティングして、核酸をその表面に非共有結合的に結合させること
を開示している。米国特許第５，０２４，９３３号（承継人：Ｅｎｚｏ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ）は、天然に存在するイガイの接着性タンパク質の単離物で固体支持体
をコーティングすることを開示している。米国特許第４，９３７，１８８号（承
継人：Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）は、酵素の基質とし
て作用する分子鎖を介して酵素を固体支持体に共有結合させることを開示してい
る。米国特許第４，８１８，６８１号（承継人：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ）は、ヌクレオシドの複素環部分を介してヌクレオシドホスフェ
ートで固体支持体をコーティングすることを開示している。この場合、核酸は、
次いで、酵素的に結合させることによって固体支持体に固定化される。米国特許
第４，８０６，６３１号（承継人：Ｍｉｌｅｓ）は、ナイロン表面のアミン基の
部分的な加溶媒分解によって（例えば、アルキル化基で処理することによって）
ナイロンの固体支持体を活性化することを開示している。
【０００８】 この問題に対する別の取り組みには、固体支持体および固定化しようとする核
酸の両方を誘導体化することが含まれる。例えば、米国特許第５，６４１，６３
０号（承継人：ＡｍｇｅｎおよびＡｂｂｏｔｔ）は、結合させようとする核酸が
同様に結合する複合化剤に結合する別の複合化剤で固体支持体をコーティングす
ることを開示している。米国特許第５，５５４，７４４号（承継人：Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｎ）は、固体支持体をジイソプロピルカルボジイミドおよび酸触媒と接触さ
せること、およびヌクレオシドを固定化するためのスクシニル化ヌクレオシドを
開示している。米国特許第５，５１４，７８５号（承継人：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ）は、固体支持体を、好ましくは一級アミンおよび二級アミンで
コーティングし、その後、塩化シアヌルを使用して核酸を活性化することを開示
している。米国特許第５，２１５，８８２号（承継人：Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、固定化しようとする核酸を一級アミンまたは
等価物で修飾し、その後、修飾された核酸を還元剤の存在下で固体支持体（支持
体は遊離のアルデヒド基を有しなければならない）と反応させることを開示して
いる。
【０００９】 最後に、核酸を固体支持体物質に固定化するという問題に対する第３の取り組
みには、新規な固体支持体を作製することが含まれる。例えば、米国特許第５，
０５５，４２９号、同第５，００８，２２０号、同第４，９６３，４３６号、同
第４，８２６，７９０号および同第４，８２６，７８９号（承継人：ＥＣＣ イ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を参照のこと。これらは、アルミノケイ酸塩物質か
ら作られる固体支持体を開示している。
【００１０】 核酸試料を固定する前にガラス表面（の全体）を誘導体化することの上記欠点
のために、固体支持体に対して、直接、核酸試料を合成することを含むいくつか
の方法が開発されている。例えば、ハシア（Ｈａｃｉａ）ら、高密度オリゴヌク
レオチドアレイおよび２色蛍光分析を使用するＢＲＣＡ１におけるヘテロ接合変
異の検出、１４ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４４１（１９９６）；ロッ
クハート（Ｌｏｃｋｈａｒｔ）ら、高密度オリゴヌクレオチドアレイに対するハ
イブリダイゼーションによる発現のモニターリング、１４、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６７５（１９９６）；マスコス（Ｍａｓｋｏｓ）お
よびサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、ガラス支持体でのオリゴヌクレオチドハイブ
リダイゼーション：オリゴヌクレオチド合成用の新規なリンカーおよびインサイ
チュで合成されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性、２０ Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６７９（１９９２）（およびその引用参
考文献、特に、５〜１１）を参照のこと。
【００１１】 繰り返すが、現在、生化学分野における一般的な考えは、核酸を固体表面に効
果的に固定化するために、固体支持体は、最初に誘導体化しなければならず、す
なわち、化学的に不安定にしなければならず、そうすることによって、次に、核
酸を固体支持体と反応させることができることである。さらに、エポキシドは発
ガン性であると知られている。すなわち、エポキシドは、核酸（特に、ＤＮＡ）
に損傷を与えることが知られている。
【００１２】 従って、生化学分野における現在の知識水準とは全く逆に、今回提示された本
発明は、修飾または誘導体化が行われていないガラス表面に核酸が容易に接着す
るように修飾されたＤＮＡ（より一般的には、核酸）を開示し、特許請求する。
詳細には、本発明は、修飾されていない固体支持体に容易に固定されるエポキシ
ド修飾された核酸（特に、ＤＮＡ）を開示し、特許請求する。
【００１３】 （発明の開示） 本発明の目的の１つは、その後の生化学的研究が可能であるように固体表面に
接着する修飾された核酸である。
【００１４】 従って、本発明の１つの側面により、環状エーテル基およびアルコキシシラン
基の２つの極めて重要な官能基を含有する部分に共有結合した核酸を含む修飾さ
れた核酸が特許請求される。本発明の他の側面により、上記の修飾された核酸を
調製するための方法が特許請求される。
【００１５】 さらに、本発明の別の側面により、ガラスまたは他の不活性な表面を含む高密
度マイクロアレイであって、多数の高度に区別される修飾型ＤＮＡ試料のスポッ
トをその表面にプリントすることによって作製される高密度マイクロアレイが特
許請求される。
【００１６】 本発明の別の側面により、核酸およびハロゲン化シランから調製される別の修
飾された核酸が特許請求される。
【００１７】 本発明のさらに別の側面により、核酸を臭素化部分と反応させ、その後、アミ
ン化シランと反応することによって調製される別の修飾された核酸が特許請求さ
れる。
【００１８】 本発明の別の側面により、上記の高密度マイクロアレイのプリントを可能にす
る装置が特許請求される。
【００１９】 本発明のさらに別の側面により、試料密度および検出感度を最適化するために
、当業者が固体表面の静電特性を調節させることができる修飾されたシランが特
許請求される。
【００２０】 本発明は、先行技術を上回る多数の利点を有する。そのような利点の多くは、
典型的には通常のガラスである固体表面が非常に化学的に不活性のままであると
いう事実から得られる。従って、ガラスに付着するプローブ（または他の反応物
）の前記の問題は、「スプレッディング」と同様に完全に除かれる。最大の結果
は、特に、現在の技術水準の誘導体化された固体支持体と比較して、はるかによ
り大きな検出感度である。
【００２１】 さらに、固体支持体に固定化される核酸は容易に誘導体化される。本発明のエ
ポキシド誘導体の反応は簡単に実施することができ、穏和な条件のもとで生じる
。反応速度は速く、平衡は非常に有利である。さらに、本発明のエポキシド修飾
された核酸は、本質的には永久的に安定であり、従って、後で使用するために調
製して保存することができる。さらに、より具体的な利点が、本発明の特定の実
施形態が議論されている下記に開示される。
【００２２】 他の目的、特徴および利点ならびにさらなる目的、特徴および利点は、開示の
目的で示される本発明の現時点での好ましい実施形態の下記の説明から、添付さ
れた図面と組み合わせた場合に明らかである。
【００２３】 図面は必ずしも縮尺が合っていない。本発明のいくつかの特徴は一定の割合で
誇張されている場合があり、あるいは明快化および簡略化のために概略的な形式
で示されている場合がある。
【００２４】 （好適な態様の詳細な説明） 様々な代替および改変を、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本
明細書中に開示された本発明に対して行い得ることは、当業者には容易に理解さ
れる。
【００２５】 本発明の骨子は、固定化しようとする核酸の化学的修飾である。この化学的に
修飾された核酸は、次いで、ガラス表面などの固体支持体に対して容易に反応す
る。これにより核酸は固定化される。再度ではあるが、これは、核酸自体ではな
く、むしろ固体支持体の修飾を教示する先行技術に対する直接的な否定である。
【００２６】 本発明の修飾された核酸は、ヒドロキシル基を有する様々な固体表面に容易に
接着する。これらには、石英ガラス、雲母、アルミナ（Ａｌ2 Ｏ3 ）、チタニア
（ＴｉＯ2 ）、ＳｎＯ2 、ＲｕＯ2 、ＰｔＯ2 、ならびに多数の他の金属酸化物
の表面が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】 一群の実施形態において、本発明の化学的に修飾された核酸は、環状エーテル
基およびアルコキシシラン基の２つの極めて重要な官能基を有する化合物でその
ように修飾される。核酸を環状エーテルと反応させ、次いで、新たに修飾された
核酸を、それ以外の点では不活性なガラス表面と接触させると、その表面でアル
コキシシラン基がガラス表面のＳｉ−ＯＨ基と反応する。
【００２８】 別の異なる種類の実施形態において、本発明の化学的に修飾された核酸は、ア
ミノ基およびアルコキシシラン基の２つの極めて重要な官能基を有する化合物で
そのように修飾される。核酸をアミノ基と反応させ、次いで、新たに修飾された
核酸を、それ以外の点では不活性なガラス表面と接触させると、その表面でアル
コキシシラン基がガラス表面のＳｉ−ＯＨ基と反応する。
【００２９】 さらに別の異なる種類の実施形態において、核酸は、ハロゲン化シラン化合物
と反応させることによって修飾される。さらに別の種類の実施形態において、核
酸は、アミン含有シランおよび臭素化された核酸との最終的な反応を含む２段階
プロセスによって誘導体化される。
【００３０】 他の実施形態は、本発明の先の実施形態の修飾された核酸を利用する高密度マ
イクロアレイの調製および最適化に関する。
【００３１】 実施例１ ３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランを使用する修飾された核酸の調
製 本実施例は、本発明の修飾された核酸の一形態を記載する。化学的修飾の目的
は、誘導体化されていない固体表面に核酸を容易に固定させることができること
である。本実施例において、核酸（好ましくは、ＤＮＡ）は、図１に従って、３
−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＳ）との反応によって修
飾される。ＧＰＴＳは、実際には、（修飾されていない）ＤＮＡ試料をその後で
接触させて固定化するガラス表面を誘導体化するために以前から使用されている
。しかし、ＧＰＴＳの使用は、これとは反対の目的のためである。すなわち、誘
導体化されていないガラス表面に対するその後の結合のためにＤＮＡを修飾する
ことは、以前には開示も示唆もされていない。さらに、エポキシド基を含有して
いるために、ＧＰＴＳはインビボでＤＮＡを損傷することが知られている。これ
らの理由のために、ＤＮＡを誘導体化するためにＧＰＴＳを使用することは、実
際には先行技術によって思いとどまらされている。
【００３２】 概略的に記載すると、核酸を固体支持体に固定することは、本質的には２工程
からなる。最初の工程において、核酸をＧＰＴＳ分子のエポキシド端と反応させ
、第２の工程において、ガラス表面を反対側の端（すなわち、ＧＰＴＳで修飾さ
れた核酸のシラン端）と反応させ、それによって、核酸は、誘導体化されていな
いガラス表面に固定される。全体の反応は迅速であり、好ましい平衡を特徴とし
、最少量の安価な試薬を使用する非常に穏和な条件のもとで生じる。多数の方法
が反応のどちらかの工程を行うために存在することは極めて明らかであるが、好
ましい方法を本実施例および下記の実施例において示す。
【００３３】 図１に示されているように、環状エーテルおよびアルコキシシランを有する化
学化合物（この場合、それぞれ、エチレンオキシドおよびトリメトキシシラン）
は化合物の２つの端を構成する。２つの端は、炭素が４個のエーテルリンカーで
連結されている。示される化合物は、３−グリシドオキシプロピルトリメトキシ
シラン（すなわち、ＧＰＴＳ）である。最初の工程において、ＤＮＡを、好まし
くは９．５よりも高い塩基性ｐＨでＧＰＴＳと反応させて、修飾されたＤＮＡを
得る。次いで、この修飾されたＤＮＡを、誘導体化していないガラス（または他
のシラノール含有）表面と中性ｐＨで反応させる。このようにして、ＤＮＡがガ
ラス表面に固定化される。最初の工程において、環状エーテル官能基がＤＮＡと
反応する。再度ではあるが、環状エーテルは、ＧＰＴＳの場合のようにエチレン
オキシドである必要はない。しかし、小さな環が、比較的非反応性であるエーテ
ル官能基の反応性を大きくするために好ましい。
【００３４】 誘導体化されたＤＮＡに導く最初の反応は、ＤＮＡのリボース環の５位炭素が
関与すると考えられる開環反応である。この誘導体化されたＤＮＡは極めて安定
であり、実際に使用されるまでの長期間にわたって保存することができる。誘導
体化されたＤＮＡをガラス表面に固定化する第２の反応は、ガラス表面において
Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合が生成する単純な置換反応であり、ＧＰＴＳ分子からのアル
コキシ基の脱離反応である。
【００３５】 実施例２ ３−アミノプロピルトリエトキシシランを使用する修飾された核酸の調製 本実施例は、本発明の修飾された核酸の別の好ましい形態を記載する。化学的
修飾の目的は、誘導体化されていない固体表面に核酸を容易に固定させることが
できることである。本実施例において、核酸（好ましくは、ＤＮＡ）は、図２に
従って、３−アミノプロピルトリメトキシシランとの反応によって修飾される。
実施例１の場合のように、核酸を固体支持体に固定することは、本質的には２工
程からなる。最初の工程において、核酸を３−アミノプロピルトリメトキシシラ
ン分子のエポキシド端と反応させる。第２工程において、ガラス表面を、反対側
の端（すなわち、３−アミノプロピルトリメトキシシランで修飾された核酸のシ
ラン端）と反応させる。それによって、核酸は、誘導体化されていないガラス表
面に固定化される。
【００３６】 実施例１の場合のように、全体の反応は迅速であり、好ましい平衡を特徴とし
、最少量の安価な試薬を使用する非常に穏和な条件のもとで生じる。多数の方法
が反応のどちらかの工程を行うために存在することは極めて明らかであるが、好
ましい方法を本実施例および下記の実施例において示す。
【００３７】 図２に示されているように、アミノ基およびアルコキシシランを有する化学化
合物（この場合、それぞれ、−ＮＨ2 およびトリエトキシシラン）は化合物の２
つの端を構成する。２つの端はプロピル結合によってつながっている。示される
化合物は、３−アミノプロピルトリエトキシシランである。最初の工程において
、ＤＮＡを、好ましくは重亜硫酸ナトリウムの存在下、中性ｐＨで３−アミノプ
ロピルトリエトキシシランと反応させる。
【００３８】 誘導体化されたＤＮＡに導く最初の反応は、核酸のシトシン残基のアミノ基転
移反応である。実施例１の場合のように、誘導体化されたＤＮＡをガラス表面に
固定化する第２の反応は、ガラス表面においてＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合が生成する単
純な置換反応であり、ＧＰＴＳ分子からのアルコキシ基の脱離反応である。
【００３９】 実施例３ 高密度マイクロアレイの調製 実施例１および２に記載される修飾された核酸などの本発明の修飾された核酸
が調製されると、その後、そのような修飾された核酸を利用することができる。
再度ではあるが、このような修飾された核酸（好ましくは、ＤＮＡ）は、誘導体
化されていない表面に修飾されたＤＮＡを単に接触させることによってガラス表
面に固定化することができる。この重要性は、特に、スプレッディング（固定化
しようとするＤＮＡの所望する部位からの移動）および非特異的なプローブ付着
（正味の負電荷のＤＮＡが引き寄せられる表面での正味の正の静電電荷を生じさ
せるガラス表面の誘導体化によって生じる）が本質的になくなることである。
【００４０】 これらの利点によって、非常に望ましい極端に高密度のマイクロアレイの作製
が可能になる。例えば、スプレッディングがなくなり、プローブ付着が効果的に
なくなるために、１つの小さなガラス表面は、実際上、試験すべき数千のＤＮＡ
試料を含有することができる。この場合、そのそれぞれは、顕微鏡レベルの大き
さであり、すべてが１つのガラス表面に固定化されている。実際、ガラス表面に
置かれた５０ミクロンよりも小さい多数の単一試料スポットからなるマイクロア
レイを組み立てることができる。
【００４１】 多数のＤＮＡ試料からなるこのタイプの高密度マイクロアレイはまた、本発明
に従って容易に組み立てることもできる。修飾されたＤＮＡを、実際の使用に先
立って、（例えば、実施例１および２に従って）良好に調製することができる。
このような化学的に修飾されたＤＮＡ試料は、その後、例えば格子様式で、誘導
体化されていないガラスシートに容易に「印刷」され得る「ＤＮＡチップ」の類
似体である。図３には、本発明のＤＮＡチップを使用するそのような高密度マイ
クロアレイを調製するための装置の１つの実施形態が例示されている。１つの好
ましい実施形態において、この装置は、多数の安価な市販の毛細管マイクロピペ
ットから作製される。好ましくは１０ｃｍのマイクロピペットであるが、他の大
きさも当然に使用される。図３に示されているように、１０ｃｍのマイクロピペ
ットはそれぞれ、一方の端を先細り状にするために引っ張られる。マイクロピペ
ットは六方最充填配列で配列させられ、正方形のフレームによって結束される。
マイクロピペットは互いに接着され、フレーム内の安定なユニットを形成するこ
とができる。先細り端（図３Ｂ）は切断され、研磨されて光学的平坦にされる。
【００４２】 マイクロアレイを調製するために、装置のチップが、（本発明に従って化学的
に修飾された）試験すべきＤＮＡ試料を含有する多ウエル容器に浸漬される。従
って、そのウエルは装置のマイクロピペットとともに整列される。チップをウエ
ルと接触させたとき、少量の各ＤＮＡ試料が、単なる毛細管作用によって、特定
のウエルに対応するマイクロピペット内に入る。スポットのサイズは、先細り端
の大きさによって慎重に制御することができる。この装置および本発明のＤＮＡ
チップを使用して、数千の試料を、同時に、そして高価なロボット工学を必要と
することなく狭い領域に配列させることができる。実際、本発明の（ＤＮＡチッ
プおよびピペット装置を含む）方法は、高速度のスポット用ロボットを使用する
方法よりもさらに効率的であることが示されている。最後に、本発明の化合物、
方法および装置は、市販される充填済みキットに容易に組み入れられる。
【００４３】 本発明の高密度マイクロアレイはまた、上記の先行技術の節に開示されたマイ
クロアレイシステムなどの先行技術のマイクロアレイシステムに容易に組み込む
こともできる。これらの方法、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーショ
ン（ＦＩＳＨ）およびシャロン（Ｓｈａｌｏｎ）ら（２色蛍光プローブハイブリ
ダイゼーションを使用する複雑なＤＮＡ試料を分析するためのＤＮＡマイクロア
レイシステム、６、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６３９，１９９６）によって記載さ
れる方法は、参照により本出願において取り込まれる。シャロン（Ｓｈａｌｏｎ
）らの方法において、ＤＮＡ試料のマイクロアレイをガラス基板上に作製するこ
と、複雑な蛍光標識プローブとのハイブリダイゼーションによってそれらをプロ
ーブすること、およびレーザー走査顕微鏡を使用して、ハイブリダイゼーション
を示す蛍光シグナルを検出することを含むマイクロアレイシステムが、ＤＮＡ試
料を分析するために提供されている。同様に、サージェント（Ｓａｒｇｅｎｔ）
ら（米国特許第５，６０１，９８２号）は、走査トンネル顕微鏡法で核酸を走査
することを含む、ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法および装置を開
示している。
【００４４】 実施例４ ハロゲン化シランを使用する修飾された核酸の調製 本実施例は、本発明の修飾された核酸の別の形態を記載する。再度ではあるが
、ここで開示され特許請求される化学的修飾の目的は、誘導体化されていない固
体表面（例えば、通常は石英ガラス）に核酸を容易に固定させることができるこ
とである。図４に従って、本発明による修飾された核酸は、修飾されていない核
酸を、ほぼ中性ｐＨのもとで、好適なシラン化合物と反応させることによって調
製される。図４の「Ｘ」は任意のハロゲン化物を示し得るが、好ましくは、Ｃｌ
、ＢｒまたはＩを示し；Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 は同一または異なっていてもよく
、−−ＯＣＨ3 および−−ＯＣ2 Ｈ5 を含む。特に、好ましい実施形態において
、図４の矢印の左側に示されるハロゲン化シランは、８−ブロモオクチルトリク
ロロシラン、８−ブロモオクチルトリメトキシシラン、４−クロロブチルメチル
ジクロロシラン、および３−ヨードプロピルトリメトキシシランである。
【００４５】 図４に示される変換反応は、下記のように行われた。ハロゲン化シランをジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）に約３０ｍＭの濃度で溶解した。次に、３〜１０μ
ｇの核酸を１００μｌの０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。次
いで、１〜３μｇの３０ｍＭハロゲン化シランを加えて、溶液を十分に混合し、
約３７℃で約３時間反応させた（あるいは、周囲温度で一晩反応させることがで
きる）。反応後、所望する生成物（すなわち、修飾された核酸）をエタノール沈
澱で精製し、次いで修飾された核酸を水に溶解する。
【００４６】 実施例５ スポット密度／サイズの制御 本出願を通して議論されているように、本発明の１つの特定の利点は、研究者
が、核酸研究を行うための非常に高密度なマイクロアレイを調製できることであ
る。本実施例は、本発明による高密度マイクロアレイの調製が開示された実施例
３に関連して最も良く理解される。本実施例では、本発明に従って、固体支持体
における個々の核酸「スポット」のサイズを制御するために強化された方法が開
示される。
【００４７】 小さなスポットサイズは、高密度マイクロアレイに関連して、より高い試料密
度（すなわち、単位面積あたり、より多くの試料）および優れた検出感度を可能
にする（シグナルがほとんど拡散しないからである）。従来の固体支持体システ
ムでは、当業者は極めて重大なジレンマに直面している。（本明細書に記載され
る実験で使用されるタイプの）通常の清浄な石英ガラス表面は、非常に親水性で
ある。従って、核酸試料は、ガラス表面に置かれた場合には自然に広がりやすい
。再度ではあるが、これは望ましくない。スプレッディングを軽減するために、
当業者は、例えば、表面を疎水性薬剤で前処理するか、または表面を単に脱水す
ることのいずれかによって表面がより疎水性になるように処理することができる
。自然のことではあるが、このような選択肢はいずれも、ガラス表面のシラン修
飾核酸に対する反応性を低下させる。
【００４８】 本実施例で議論される本発明の一群の実施形態において、当業者はこのジレン
マから解放される。より詳細に記載すると、本発明の別のタイプのシランを使用
することによって、スプレッディングをなくすことができ、その上、修飾された
核酸に対する表面の反応性を維持することができる。例えば、加水分解後におけ
るこのようなシランの１つの極めて一般的な実施形態は、疎水性基で連結された
Ｓｉ（ＯＨ）3 をそれぞれの端に含有する。図６を参照のこと。任意の様々な疎
水性リンカーを使用することができる。特に好ましい実施形態には、１，６−ビ
ス−トリクロロシリルヘキサン、１，８−ビス−トリクロロシリルオクタン、１
，６−ビス−メトキシシリルヘキサン、および１，４−ビス−トリメトキシシリ
ルエチルベンゼンが含まれる。従って、本発明のこれらの実施形態により、シラ
ンの一方の端は表面に結合するが、もう一方の端は修飾された核酸に対する反応
性を有したままである。疎水性リンカーにより、疎水性が表面に付与される。従
って、当業者は、表面の静電特性（疎水性対親水性）を容易に調節させ得る方法
を容易に理解することができる。例えば、リンカーの鎖長を調節して疎水性を制
御することができ、表面の反応性を、表面と接触するシランの量を調節すること
によって制御することができる。
【００４９】 本発明のこの側面に従って固体支持体を調節するために、ガラス表面を、ドラ
フト内で、約２時間、３Ｍ ＨＣｌ中でゆっくり煮沸することによって清浄化し
た。次に、表面を脱イオン水でリンスし、次いで、使用できるまで０．１Ｍ Ｈ
Ｃｌ中で保管した。使用できるようになった場合、表面を再蒸留脱イオン水でリ
ンスし、存在する酸を除き、次いで無水エタノールでリンスした。次に、表面を
、直ちに、０．０００５％〜０．００２％の本発明のこの側面の二官能性シラン
を含有するエタノール溶液に移した。次いで、表面を室温で約４８時間処理した
。次いで、表面をエタノールでリンスし、風乾した。最後に、使用できるまで、
ガラス表面を無塵環境で保管した。
【００５０】 実施例６ アミン含有シラン化合物を使用する修飾された核酸の調製 本実施例は、本発明の修飾された核酸の別の形態を記載する。この一群の実施
形態において、修飾された核酸は、未処理の核酸をアミン含有シランと反応する
ことによって調製される。実践的に、アミン含有シランによる核酸の誘導体化は
２工程からなる：（１）核酸のハロゲン化（または、示されるように、臭素化）
（図５ａ、５ｂ）；および（２）ハロゲン化された核酸の誘導体化（図５ｃ）。
図５ａ、５ｂに示されているように、反応は、Ｎ−ブロモスクシンイミドの存在
下、穏和なｐＨ条件下で進行し得る。これらの反応変数のいずれかを変更するこ
とによって、当業者たる生化学者は反応速度を制御することができる。また、図
５ａ、５ｂによって明らかであるように、反応は、通常、ｐＨに依存してグアニ
ン塩基またはシトシン塩基で生じる。すなわち、中性からわずかに塩基性のｐＨ
はグアニン残基での反応に有利であり、より塩基性のｐＨはシトシン残基での反
応に有利である。
【００５１】 少し異なる反応プロトコルが、好ましくは、核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである
かに依存して使用される。ＤＮＡの場合、５μｇのＤＮＡを１００μｌの０．１
ＭのＮａＨＣＯ3 に溶解し、ｐＨを約９．５にした。この溶液を氷上で約５分間
保つ。同時に、濃度が約１０ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミド溶液を新しく調製
し、これも氷上で冷却した。次に、１μｌのＮ−ブロモスクシンイミド溶液をＤ
ＮＡ溶液に加える。次いで、溶液を（渦が巻くまで）激しく攪拌した。次いで、
反応を氷上で約１５分間進行させた。次に、ｐＨが約９．５〜１２の０．５Ｍア
ミノシラン溶液の１０μｌを臭素活性化ＤＮＡ溶液に加えた。この新しい混合物
を６５℃で約２時間反応させた。最後に、シランで修飾されたＤＮＡを、当該技
術分野でよく知られている方法で精製した。好ましくは、エタノール沈澱で精製
される。
【００５２】 類似するが、少し異なるプロトコルを使用した。５μｇのＲＮＡを１００μｌ
の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、ｐＨを約７．５にした。この溶液を氷上で約
５分間保つ。同時に、濃度が約１０ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミド溶液を新し
く調製し、これも氷上で冷却した。次に、１μｌのＮ−ブロモスクシンイミド溶
液をＤＮＡ溶液に加える。次いで、溶液を（渦が巻くまで）激しく攪拌した。次
いで、反応を氷上で約１５分間進行させた。次に、ｐＨが約８．０の１Ｍアミノ
シラン溶液の１０μｌを臭素活性化ＤＮＡ溶液に加えた。この新しい混合物を４
５℃で約２時間反応させた。最後に、シランで修飾されたＤＮＡを、当該技術分
野でよく知られている方法で精製した。好ましくは、エタノール沈澱で精製され
る。
【００５３】 これらの実施形態において、下記のシランがこのような理由で利用することが
できる：
【化４】 さらに、下記の形態を取る加水分解後の任意の他のアミノシラン化合物が有用で
ある：
【化５】 本明細書中において言及されているすべての特許、刊行物は、本発明が関係す
る分野の当業者の水準を示し得る。本明細書中におけるすべての特許、刊行物は
、個々の刊行物のそれぞれが参照により取り込まれるように明示的かつ個々に示
されている場合には同じ程度に参照により取り込まれる。
【００５４】 当業者であれば、本発明の対象を実施し、言及されている目的および利点なら
びにその固有的なそれらを得るために本発明を十分に適合させることを容易に理
解するであろう。化学的に修飾された核酸、その固体支持体への結合は、本明細
書中に記載されている配列、方法、手順、アッセイ、分子、装置および特定の化
合物とともに、現時点での好ましい実施形態を表し、例示であり、本発明の範囲
に対する限定として意図されるものではない。本発明の精神に包含され、かつ請
求項の範囲によって規定される、本発明における変化および他の使用が当業者に
は考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、核酸（この場合、ＤＮＡ）と３−グリシドオキシプロピルトリメトキ
シシランとのカップリング反応、その後の新しく修飾されたＤＮＡと固体支持体
（この場合、ガラス表面）との反応を示す。最終反応生成物、すなわち、固定化
ＤＮＡを下段に示す。
【図２】 図２は、核酸（この場合、ＤＮＡ）と３−アミノプロピルトリエトキシシラン
とのカップリング反応、その後の新しく修飾されたＤＮＡと固体支持体（この場
合、ガラス表面）との反応を示す。最終反応生成物、すなわち、固定化ＤＮＡを
下段に示す。
【図３】 図３は、高密度マイクロアレイを作製するための装置を示す。上面図（図３Ａ
）および側面図（図３Ｂ）をともに示す。
【図４】 図４は、ハロゲン含有シラン化合物のアルキル化による核酸のシラン処理を示
す。
【図５】 図５ａは、アミン含有シラン化合物を使用する核酸のシラン処理における最初
の工程を示す。この場合、反応は、中性ｐＨおよびわずかに塩基性ｐＨにおいて
グアニン塩基で優先的に生じる。 図５ｂは、アミン含有シラン化合物を使用する核酸のシラン処理における最初
の工程を示す。この場合、反応は、より塩基性ｐＨにおいてシトシン塩基で優先
的に生じる。 図５ｃは、アミン含有シラン化合物を使用する核酸のシラン処理における第２
で最終の工程を示す。
【図６】 図６は、本発明の１つの実施形態の概略図であり、疎水性リンカーによるシラ
ンリンカーを示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月２日（２０００．３．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 は、−Ｈ、−ＣＨ3 、−ＯＣＨ3 および−ＯＣ2
Ｈ5 からなる群より選択されるが、Ｒ1 、Ｒ2 またはＲ3 の少なくとも１つは−
ＯＣＨ3 または−ＯＣ2 Ｈ3 のいずれかである） からなる群より選択される請求項１６の修飾された核酸。
【化２】 （式中、Ｒは、−−ＣＨ3 、−−Ｃ2 Ｈ5 および−Ｃ3 Ｈ7 からなる群より選択
され； Ｒ1 およびＲ2 は同一または異なって、−Ｈ、−−ＣＨ3 、−−Ｃ2 Ｈ5 、−−
ＯＣＨ3 、−−ＯＣ2 Ｈ5 、−Ｃ3 Ｈ7 および−ＯＣ3 Ｈ7 からなる群より選択
され；ならびに Ｘ連結基は、少なくとも部分的な脂肪族鎖を含む）を有する化合物に共有結合し
た核酸を含んでなる修飾された核酸。
【化３】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 は同一または異なって、−ＯＣＨ3 、−ＯＣ2 Ｈ 5 、−ＯＣ3 Ｈ7 および−Ｃｌからなる群より選択され； Ｘは、前記核酸を前記化合物に連結するために化学的に好適な部分である）を有
する化合物に共有結合した核酸を含んでなる修飾された核酸。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 HA13 HA14 4B029 AA07 AA09 BB20 CC01 CC03 CC08 FA12 FA15 HA07 HA09 4B063 QA01 QA13 QA17 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR38 QR55 QR84 QS34 QX02 QX07 4C057 AA18 BB05 NN10

Claims (49)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の式： Ｒ1 −Ｘ−Ｒ2 （式中、Ｒ1 はエポキシド基、 Ｒ2 はアルコキシシラン基、 Ｘは前記エポキシド基と前記アルコキシシラン基とを連結するために化学的に好
    適な部分である）を有する化合物に共有結合した核酸を含んでなる修飾された核
    酸。
  2. 【請求項２】 前記エポキシド基がエチレンオキシドである請求項１の修飾
    された核酸。
  3. 【請求項３】 前記アルコキシシラン基が、−Ｓｉ（ＯＣＨ3 ）3 、−Ｓｉ
    （ＯＣ2 Ｈ5 ）3 、−Ｓｉ（ＯＣＨ3 ）Ｈ2 、−ＳＩ（ＯＣＨ）3 ）（ＣＨ3 ） 2 および−Ｓｉ（ＯＣＨ3 ）2 ＣＨ3 からなる群より選択される請求項１の修飾
    された核酸。
  4. 【請求項４】 前記化合物が３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラ
    ンである請求項１の修飾された核酸
  5. 【請求項５】 前記核酸がＤＮＡである請求項１の修飾された核酸。
  6. 【請求項６】 前記核酸がＲＮＡである請求項１の修飾された核酸。
  7. 【請求項７】 核酸を固体支持体に固定化する方法であって、 ３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランを核酸と反応させて、誘導体
    化された核酸を得る工程；その後、 前記誘導体化された核酸を前記固体支持体と反応させる工程 を含む方法。
  8. 【請求項８】 前記核酸がＤＮＡである請求項７の方法。
  9. 【請求項９】 前記核酸がＲＮＡである請求項７の方法。
  10. 【請求項１０】 前記第１の反応工程が塩基性ｐＨで行われる請求項７の方
    法。
  11. 【請求項１１】 前記第１の反応工程が約６〜約１２のｐＨで行われる請求
    項８の方法。
  12. 【請求項１２】 前記第１の反応工程が約６〜約８．５のｐＨで行われる請
    求項９の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ｐＨが９．５よりも大きい請求項１０の方法。
  14. 【請求項１４】 前記固体支持体がガラスである請求項７の方法。
  15. 【請求項１５】 前記第２の反応工程がほぼ中性ｐＨで行われる請求項７の
    方法。
  16. 【請求項１６】 下記の式： Ｒ1 −Ｘ−Ｒ2 （式中、Ｒ1 はアミノ基、 Ｒ2 はアルコキシシラン基、 Ｘは前記エポキシド基と前記アルコキシシラン基とを連結するために化学的に好
    適な部分である）を有する化合物に共有結合した核酸を含んでなる修飾された核
    酸。
  17. 【請求項１７】 前記アミノ基が一級アミンである請求項１６の修飾された
    核酸。
  18. 【請求項１８】 前記アルコキシシラン基が、−Ｓｉ（ＯＣＨ3 ）3 、−Ｓ
    ｉ（ＯＣ2 Ｈ5 ）3 、および 【化１】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 は、−Ｈ、−ＣＨ3 、−ＯＣＨ3 および−ＯＣ2
    Ｈ3 からなる群より選択されるが、Ｒ1 、Ｒ2 またはＲ3 の少なくとも１つは−
    ＯＣＨ3 または−ＯＣ2 Ｈ3 のいずれかである） からなる群より選択される請求項１６の修飾された核酸。
  19. 【請求項１９】 前記化合物が３−アミノプロピルトリエトキシシランであ
    る請求項１６の修飾された核酸。
  20. 【請求項２０】 前記核酸がＤＮＡである請求項１６の修飾された核酸。
  21. 【請求項２１】 前記核酸がＲＮＡである請求項１６の修飾された核酸。
  22. 【請求項２２】 前記核酸がシトシン残基を含有する請求項１６の修飾され
    た核酸。
  23. 【請求項２３】 核酸を固体支持体に固定化する方法であって、 ３−アミノプロピルトリエトキシシランを核酸と反応させて、誘導体化された
    核酸を得る工程；その後、 前記誘導体化された核酸を前記固体支持体と反応させる工程 を含む方法。
  24. 【請求項２４】 前記核酸がＤＮＡである請求項２３の方法。
  25. 【請求項２５】 前記核酸がＲＮＡである請求項２３の方法。
  26. 【請求項２６】 前記核酸がシトシン残基を含有する請求項２３の方法。
  27. 【請求項２７】 前記第１の反応工程が本質的には中性ｐＨで行われる請求
    項２３の方法。
  28. 【請求項２８】 前記第１の反応工程がｐＨ約６．０〜約７．０で行われる
    請求項２５の方法。
  29. 【請求項２９】 前記第１の反応工程が重亜硫酸ナトリウムの存在下で行わ
    れる請求項２３の方法。
  30. 【請求項３０】 前記固体支持体がガラスである請求項２３の方法。
  31. 【請求項３１】 遠位端および先細り状の近位端を有する多数の毛細管マイ
    クロピペットを含む高密度マイクロアレイ作製用装置であって、前記マイクロピ
    ペットは、 実質的に密着充填された配列で赤道上に配列され；かつ それぞれの前記近位端で先細り状であり、そして 前記両端は本質的に平面状である装置。
  32. 【請求項３２】 前記マイクロピペットが密着充填された正方形配列で配列
    されている請求項３１の装置。
  33. 【請求項３３】 前記マイクロピペットがフレームによって結束されている
    請求項３１の装置。
  34. 【請求項３４】 前記マイクロピペットが基部に固定されている請求項３３
    の装置。
  35. 【請求項３５】 固体支持体； 前記核酸を、３−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランおよび３−アミ
    ノプロピルトリエトキシシランを含む群から選択されるエポキシドと反応させる
    ことによって調製され、かつ規則正しく離れたスポットで前記固体支持体に固定
    化されている修飾された核酸 を含んでなる高密度マイクロアレイ。
  36. 【請求項３６】 前記固体支持体がガラスである請求項３５の高密度マイク
    ロアレイ。
  37. 【請求項３７】 前記離れたスポットが直径約５０ミクロンである請求項３
    ５の高密度マイクロアレイ。
  38. 【請求項３８】 請求項３５の修飾された核酸； 前記修飾された核酸試料を密着配置した試料の前記多数が設置されている固体
    支持体 を含んでなる高密度マイクロアレイ。
  39. 【請求項３９】 前記試料が高密度マイクロアレイ作製用装置を使用して前
    記固体支持体に設置されている請求項３５の高密度マイクロアレイ。
  40. 【請求項４０】 核酸試料に対するハイブリダイゼーション法を行うための
    キットであって、 固体支持体； ＤＮＡチップの配列を前記固体支持体につけるための装置 を含んでなるキット。
  41. 【請求項４１】 下記の式： Ｒ1 −Ｘ−Ｒ2 （式中、Ｒ1 は環状エーテル、 Ｒ2 は−ＮＲ4 であり、この場合、各Ｒ3 基は同一または異なるアルキル基、Ｒ 4 は−Ｈまたはアルキル基であり；および Ｘは、前記エポキシド基と前記アルコキシシラン基とを連結するために化学的に
    好適な部分である）を有する化合物に共有結合した核酸を含んでなる修飾された
    核酸。
  42. 【請求項４２】 下記の式： 【化２】 （式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 は同一または異なって、−−ＯＣＨ3 、−−ＯＣ 2 Ｈ5 、−ＯＣ3 Ｈ7 および−Ｃｌからなる群より選択され； Ｘは、前記核酸を前記化合物に連結するために化学的に好適な部分である）を有
    する化合物に共有結合した核酸を含んでなる修飾された核酸。
  43. 【請求項４３】 前記化合物が、−（ＣＨ2 ）8 ＳｉＣｌ3 、−（ＣＨ2 ） 8 Ｓｉ（ＯＣＨ3 ）3 、−−（Ｃｌ2 ）4 ＳｉＣｌ2 ＣＨ3 および−ＣＨ2 ＣＨ 2 ＣＨ2 Ｓｉ（ＯＣＨ3 ）3 からなる群より選択される請求項４２の修飾された
    核酸。
  44. 【請求項４４】 多数の修飾されたシラン部分が固定された固体支持体を含
    む高密度マイクロアレイであって、前記シラン部分は、−Ｓｉ−（ＣＨ2 ）n −
    −（ただし、ｎ＝３、４、５、６、７、８または９）および−Ｓｉ−ＣＨ2 −Ｃ
    Ｈ2 −Ｃ6 Ｈ4 −ＣＨ2 −ＣＨ2 −Ｓｉ−−からなる群より選択される高密度マ
    イクロアレイ。
  45. 【請求項４５】 ガラス固体支持体の静電特性を調節する方法であって、前
    記固体支持体を、１，６−ビス−トリクロロシリルヘキサン、１，８−ビス−ト
    リクロロシリルオクタン、１，６−ビス−トリメトキシシリルヘキサン、および
    １，４−ビス−トリメチルオキシシリルエチルベンゼンからなる群より選択され
    るシランと選択的に反応させる工程を含む方法。
  46. 【請求項４６】 前記核酸のグアニン塩基またはシトシン塩基をＮ−ブロモ
    スクシンイミドと約８．０のｐＨで反応させて、臭素化された核酸を得る工程；
    および 前記臭素化された核酸を、式Ｈ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）n −Ｓｉ（ＯＣ2 Ｈ5 ）3 （
    ただし、ｎ＝３、４、５、６、７、８または９）を有するシランと反応させる工
    程 によって調製される修飾された核酸。
  47. 【請求項４７】 式：−−ＨＮ−（ＣＨ2 ）n −Ｓｉ（ＯＲ）3 （ただし、
    ｎ＝３、４、５、６、７、８または９）を有する化合物に共有結合した核酸を含
    んでなる修飾された核酸。
  48. 【請求項４８】 Ｒが、−−ＯＣＨ3 、−−ＯＣ2 Ｈ5 および−ＯＣ3 Ｈ7
    からなる群より選択される請求項４７の修飾された核酸。
  49. 【請求項４９】 下記の式： 【化３】 （式中、Ｒは、−−ＣＨ3 、−−Ｃ2 Ｈ5 および−Ｃ3 Ｈ7 からなる群より選択
    され； Ｒ1 およびＲ2 は同一または異なって、−Ｈ、−−ＣＨ3 、−−Ｃ2 Ｈ5 、−−
    ＯＣＨ3 、−−ＯＣ2 Ｈ5 、−Ｃ3 Ｈ7 および−ＯＣ3 Ｈ7 からなる群より選択
    され；ならびに Ｘ連結基は、少なくとも部分的な脂肪族鎖を含む）を有する化合物に共有結合し
    た核酸を含んでなる修飾された核酸。
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