JP2002512607A

JP2002512607A - タンパク質の経口デリバリー法

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Publication number: JP2002512607A
Application number: JP54201598A
Authority: JP
Inventors: ペッパス，ニコラス，エー．; ローマン，アンソニー，エム．; 恒司永井; まり子森下
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 1997-04-02
Filing date: 1998-04-02
Publication date: 2002-04-23
Also published as: CA2285457A1; AU6880998A; NO994757D0; EP0975328A1; IL132176A0; KR20010005952A; NZ500075A; TR199903240T2; PL335974A1; YU49699A; BR9808466A; NO994757L; AU727053B2; CN1259045A; WO1998043615A1

Abstract

(57)【要約】生物活性成分を脊椎動物に経口投与するための組成物および方法が記載されている。前記方法は膨潤性ヒドロゲルマトリックスと、そのヒドロゲルマトリックス内に含まれた生物活性組成物とを含んでなる組成物を脊椎動物に経口投与する段階を含む。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質の経口デリバリー法発明の分野本発明は膨潤性ヒドロゲルマトリックスおよびそれに含まれるタンパク質を含む組成物、および活性型の生物活性化合物を脊椎動物の腸に経口デリバリーするためのこのような組成物の使用に関する。発明の背景インスリン等のタンパク質化合物の経口デリバリーシステムの開発には二つの主要問題が存在する。第一の問題は多くのタンパク質が消化器（ＧＩ）系、主として胃において、消化酵素によって不活性化されることである。これは、タンパク質を胃の苛酷な環境から防御し、その後薬剤をＧＩ管のより好ましい領域、特に腸の下部領域に放出する担体を設計することによって克服できる。さらに、プロテアーゼインヒビターを用いて、経口投与されたタンパク質を分解し得る消化器系酵素作用を遅らせることができる。もう一つの問題は、完全無傷の大きいペプチド類の、腸の内面から血流への輸送が遅いことである。研究者らは、境界を介する高分子輸送を促進する吸収エンハンサーを付加することによってこのハードルを回避しようと試みた。しかし、現在使用できるデリバリービヒクル類は効果不足という欠点を有する。よって、有効で、比較的低コストで製造できる経口デリバリーシステムが所望される。発明の概要本発明はヒドロゲルマトリックスと生物活性化合物とを含む組成物、および上記化合物を活性型で腸に運搬するための上記組成物の使用に向けられる。一好適ヒドロゲルマトリックスはテトラエチレングリコールジメタクリレートで架橋したポリ（メタクリル酸−ｇ−エチレングリコール）のコポリマー網目構造、 “Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲル”を含む。この物質は、酸性ペンダント基の存在、並びにグラフト鎖上のエーテル基とプロトン化ペンダント基との間の高分子間錯体（interpolymer complexes）の形成により、ｐＨ依存性膨潤挙動を示す。酸性媒質ではこのような系は高分子間錯体の形成により比較的膨潤しない。塩基性溶液ではペンダント基がイオン化し、錯化合物は解離する。これらのヒドロゲルのｐＨ依存性膨潤とそれらの生体接着性とが、上記ヒドロゲルをタンパク質の経口デリバリーのために理想的なものとする。図の簡単な説明図１は、Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルの可逆的錯体生成を示す。Ｃは閉じ込められた生物活性化合物を示す。図２は、ＭＷ（分子量）１０００のＰＥＧグラフトと、ＭＡＡ：ＥＧモル比１：１（３７℃）とを含むサンプルの、ポリマー体積分率とｐＨとの関係を示す。図３は、ＭＷ１０００のＰＥＧグラフトとＭＡＡ：ＥＧモル比１：１（３７℃ ）を含むサンプルの、平衡メッシュサイズとｐＨとの関係を示す。図４は、３７℃の緩衝食塩溶液中、ｐＨ３．２（●）および７．４（■）の溶液中のプロキシフィリン、およびのｐＨ３．２（□）および７．４（○）溶液中のビタミンＢ₁₂のコントロールされた放出を示す。図５ａは、ｉｎｖｉｔｒｏ、３７℃におけるＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルからのテオフィリンの搏動性放出を示す。図５ｂは、ｉｎｖｉｔｒｏ、３７℃におけるＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルからのバンコマイシンの搏動性放出を示す。図５ｃは、ｉｎｖｉｔｒｏ、３７℃におけるＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルからのインスリンの搏動性放出を示す。図６は、ウシ顎下腺ムチンと接触した場合の１：１ＭＡＡ／ＥＧ比および分子量１０００のグラフトＰＥＧ鎖を含むＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルのｐＨ３．２および７．４における接着挙動を示す。図７は、２５Ｕ／ｋｇ（○）および５０Ｕ／ｋｇ（●）および５０Ｕ／ｋｇインスリン溶液（■）で、インスリン担持Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルの経口投与後のラットの血中グルコース濃度（Ｎ＝５）を示す。図８は、インスリン担持Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルの経口投与後のラットの血中グルコース濃度を示す。アプロチニンを含まない(○)、アプロチニンを含む（●）２５Ｕ／ｋｇインスリン溶液、５０Ｕ／ｋｇインスリン溶液（■） (Ｎ＝５)。図９は、Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）微小球（２５ＩＵ／ｋｇ体重のインスリン量）をゲラチンカプセルを用いて経口投与した後の健康（●）および糖尿病（○）雄ウィスターラットにおける血中グルコース反応を示す。図１０は、オードレイト（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）カプセルを用いてＰ（ＭＡＡ− ｇ−ＥＧ）微小球（ｋｇ体重当たり２５ＩＵ）を経口投与した後の糖尿病雄ラットにおける血中グルコース反応を示す。図１１は、ゲラチンカプセルを用いてＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）微小球（１０ＩＵ／ｋｇ体重のインスリン量）を経口投与した後の健康イヌ（２５ｋｇ）における血中グルコース反応を示す。図１２は、ゲラチンカプセルを用いてＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）微小球（１０ＩＵ／ｋｇ体重のインスリン量）を経口投与した後の糖尿病イヌ（２５ｋｇ）における血中グルコース反応を示す。発明の詳細な説明本発明は生物学的活性タンパク質および医薬品を脊椎動物に経口投与により供給するための組成物に向けられる。本明細書において用いる用語、“生物活性化合物とは、細胞に生化学的効果を誘起する化合物等、生きている細胞に影響を与えるあらゆる化合物を指す。一実施態様によると、上記経口投与される組成物は、膨潤性ヒドロゲルマトリックスと上記膨潤性ヒドロゲルマトリックスに含まれる不安定なタンパク質とを含んでなる。ここに用いられる不安定なタンパク質とは、低ｐＨにさらされたり、温血脊椎動物の消化管に存在する酵素類にさらされたりすると生物学的活性が破壊され、または減少するようなタンパク質を含む。ヒドロゲルは、当業者にはよく知られている水膨潤性、架橋ポリマーマトリックスである。例えば１９８０年９月２日発行のドレスバック（Ｄｒｅｓｂａｃｋ）の米国特許第４，２２０，１５２号を参照されたい。この開示は参考として明白にここに組み込まれる。ヒドロゲルはタンパク質類を脊椎動物に経口輸送するために有効なデリバリービヒクルであることが判明した。ヒドロゲルの膨潤性は、先ず第一に、前記組成物が消化管を通過する際、前記ヒドロゲル内容物を胃の苛酷な環境から守るために役立ち、それから、前記ヒドロゲル内容物をＧＩ管のより好ましい領域、特に腸の下部領域に放出するのに役立つ。本発明のヒドロゲル組成物は実質的膨潤をおこさずに胃を通過し、小腸に局所化され、そこで膨潤し、同時にその内容物を放出することが判明した。ヒドロゲルは、医薬品、成長ホルモン類、ワクチン組成物類、ビタミン類、ステロイド類およびペプチド類を含む（但しこれらに制限するものではない）種々の生物活性化合物を含浸させ、または担持することができ、このような生物活性化合物の経口投与のためのデリバリービヒクルとして使用できる。ヒドロゲルに担持された化合物類は、ヒドロゲルが動物の消化器系内で水和するにつれてコントロールされた仕方で放出される。一実施態様において、本発明のヒドロゲルマトリックスはポリメタクリル酸を含むペレット型であり、ポリメタクリル酸ポリマーにはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のイオン性長鎖ポリマーがグラフトされる。ヒドロゲルペレットは好適にはメタクリル酸を架橋剤の存在のもとで重合することによって合成される。上記架橋剤は、テトラエチレングリコールジメタクリレート、エチレンジメタクリレート、ジエチレンジメタクリレート、トリエチレンジメタクリレート、テトラエチレンジメタクリレート、ペンタエチレンジメタクリレート、これらに対応するジアクリレート類、またはメタクリレート、アクリレートまたはメチレンビス−アクリルアミド基を含むスターポリマー等、熟練せる当業者には公知の種々様々の生体適合性架橋剤から選択できる。重合は、熟練せる当業者には公知の有機ペルオキシド類またはＵＶラジカル開始剤を含む熱開始剤のような、遊離ラジカル開始剤で開始する。一実施態様において、ヒドロゲルマトリックスは、生体適合性架橋剤で架橋したメタクリル酸とポリ（アルキレングリコール）モノメタクリレート（またはモノアクリレート）とのコポリマーを含む。ここに用いる“ポリ（アルキレングリコール）モノメタクリレート”は、ポリ（エチレングリコール）モノメタクリレート、ポリ（プロピレングリコール）モノメタクリレートおよびポリ（エチレン／プロピレングリコール）モノメタクリレートを含む。この際ポリ（エチレン／プロピレングリコール）モノメタクリレートはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとの混合物の、ヒドロキシ官能性メタクリレートで開始する重合によって生成するポリマーである。生成したペンダントポリ（アルキレングリコール）基は分子量範囲約２００ないし約４０００、より典型的には約２００ないし約２０００を有し、一実施態様では約２００ないし約１２００である。メタクリル酸とポリ（アルキレングリコール）モノメタクリレート（またはモノアクリレート）モノマーとのモル比は約４：１ないし約１：４である。一好適実施態様において、ヒドロゲルマトリックスは、テトラエチレングリコールジメタクリレートで架橋されたメタクリル酸とポリ（エチレングリコール）モノメタクリレートとのポリマー“Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲル”を含む。上記ポリマーの製造において、分子量約２００ないし約２０００、より典型的には約２００ないし約１２００を有するポリ（エチレングリコール）モノメタクリレートはメタクリル酸およびテトラエチレングリコールジメタクリレートと共重合する。メタクリル酸およびポリ（エチレングリコール）モノメタクリレートモノマー類のモル比は約４：１から約１：４の範囲である。一実施態様では、メタクリル酸およびポリ（エチレングリコール）モノメタクリレートモノマー類のモル比は約１：１である。架橋剤は約０．２５ないし約１０．００モル％、より好適には約０．２５ないし約１．００モル％、そして一実施態様では約０．７５モル％が加えられる。ヒドロゲル類は熟練せる当業者には公知の標準的方法を用いて所望化合物を担持することができる。一実施態様において、Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルは粒子の直径が約５０μｍから約５００μｍまで、より好適には直径約１００ないし２００μｍの範囲の微小粒子として形成される。ヒドロゲル微小粒子は一実施態様により、重合マトリックスを形成し、上記マトリックスを磨砕して所望平均粒度のヒドロゲル粒子を形成するという方法で形成される。ヒドロゲル微小粒子は、熟練せる当業者には公知の標準的方法を用いて、所望化合物を担持し、標準的錠剤またはカプセル形に包装することができる。一実施態様においてヒドロゲル粒子はゲラチンカプセルに包装される。一実施態様により、上記ヒドロゲルに生物活性化合物を平衡分配によって担持させる。より詳細に述べるならば、ヒドロゲルを、担持させる組成物を含むｐＨ＞５．８の溶液中で水和させる。その後上記ヒドロゲルを回収し、ｐＨ＜５．８を有する溶液で洗い、担持（ローディング済みの）ヒドロゲルを乾燥して４℃で保存する。本発明のヒドロゲルに担持させる別の方法は、所望化合物の水溶液をモノマー類と架橋剤との溶液に加える段階、およびその混合物の重合を開始する段階を含む。ある化合物が架橋ポリマー網目構造全体に拡散する能力は、ゲルの膨潤程度および化合物の大きさに依存する。ヒドロゲルが膨潤するにつれて架橋点間のポリマー鎖は伸び、網目構造メッシュサイズまたは相関長さ、ξ、は増加し、より大きい溶質が材料中へ浸透できるようになる(図１参照)。平衡した膨潤錯体生成網目構造において、網目構造膨潤程度はその系に存在する化学的および物理的架橋に依存する。Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）網目構造において、平衡膨潤率は周囲環境のｐＨに強く依存する。本発明のＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲル類は、酸性条件（典型的にはｐＨ＜５．８）にさらされる際、ポリメタクリレート基とペンダントポリ（アルキレングリコール）基との間の水素結合により、一時的物理的架橋を形成する。これらの物理的架橋は本来可逆的であり、環境のｐＨおよびイオン強度に依存する。こうして、架橋度および、網目構造メッシュサイズξ、の両方が、周囲環境のｐＨおよびイオン強度に強く依存する。酸性媒質ではこのような系は、高分子間錯化合物の形成により、比較的非膨潤性である。塩基性溶液では、ペンダント基はイオン化し、錯化合物が解離する。Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルの平衡膨潤を図２に示す。データは、ヒドロゲル（１０００ＭＷのＰＥＧグラフトおよびＭＡＡ：ＥＧモル比１：１）のポリマー体積分率をｐＨの関数として示す。低ｐＨ値でＭＡＡとＥＧが等量である場合、錯体生成程度は高く、膨潤状態のゲル中のポリマー体積分率、ｖ、はほぼ０．７０であった。しかし膨潤溶液のｐＨがｐＨ＝４．６より高くなると、錯化合物は解離し始め、主鎖は延び、ゲル中の平衡ポリマー体積分率の顕著な減少をおこした。高度に膨潤した非錯体生成ヒドロゲルは、より多くの水が上記構造に取り込まれたため、５％未満のポリマー含有率となっていた。Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ゲルにおける錯体生成／錯体分解現象のため、網目構造のメッシュサイズは関心とするｐＨ範囲にわたって著しく変動する。その上、種々のｐＨの溶液中でヒドロゲルの小さい変形率（１０％未満）が得られた。これらのデータを用いて、共有および物理的両方の架橋間のポリマー鎖の末端−末端距離を決定することによって、メッシュサイズをｐＨの関数として計算した。平均網目構造メッシュサイズまたは相関長さは膨潤溶液のｐＨによって劇的に影響を受けた(図３)。錯体生成が起きる低ｐＨ溶液では、Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルの網目構造メッシュサイズは７０Åと小さかった。しかしｐＨが高まると物理的架橋は解離し、ポリマー鎖は伸び、網目構造メッシュサイズの増大が、ほとんど２１０Å、即ち３倍、に達した。より重要なことに、理想的網目構造を仮定すると拡散のために使用できる面積はメッシュサイズの二乗に等しい。こうして非錯体生成ヒドロゲル（ｐＨは５．２より高い）のための拡散面積は錯体生成ヒドロゲル（ｐＨは５．２未満）の場合に比し９倍になる。錯体生成現象の可逆的性質のために、Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルは薬剤の搏動性放出には理想的である。その上、小さいｐＨ変化で網目構造は大きく変化するから、これらの物質はペプチドおよびタンパク質の担体としても機能する。特に、本発明のＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルは分子量範囲が約１，０００ないし約１００，０００、より好適には約１，０００ないし約２０，０００の化合物類のデリバリービヒクルとして役立ち得る。あるゲルの、特定薬剤の担体として役立つポテンシャルを評価する重要なパラメーターは、有効分子サイズ（流体力学的直径、ｄ_h）の網目構造メッシュサイズに対する比である。これら網目構造のサイズ排除特性を研究するために、異なる分子サイズを有する２種類の溶質、プロキシフィリン（分子量２３８、ｄ_h ＝４．３Å）およびビタミンＢ₁₂（分子量１３５５、ｄ_h＝１７Å）の錯化および非錯化ヒドロゲルからの放出を研究した(図４)。ｐＨ＝３．２の溶液では、ヒドロゲルポリマーは高度に錯化し、薬剤輸送は著しく阻害された。２時間でビタミンＢ₁₂の１０％未満がその網目構造から拡散した。しカルプロキシフィリンは、サイズがより小さいために、同じ時間にほぼ３０％がゲルから遊離した。ヒドロゲルをｐＨ＝７．４の溶液と接触させた際、ヒドロゲルの鎖間錯化合物はペンダント酸基のイオン化により解離した。その結果ヒドロゲルは高度に膨潤し、ビタミンＢ₁₂およびプロキシフィリンのポリマーからの実質的拡散を可能にした。放出データを、平面系のための古典的フィックの表式（Fickian expression）の溶液の短時間近似にフィットさせ、プロキシフィリンおよびビタミンＢ₁₂の錯化および非錯化Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲル拡散について拡散係数を計算した(表１)。より大きい分子量を有する溶質、ビタミンＢ₁₂、の輸送は、網目構造メッシュサイズに対して溶質直径の比が大きいため、錯体生成によりプロキシフィリンより顕著な影響を受けた。非錯体生成ヒドロゲルからのビタミンＢ₁₂の拡散係数は錯体生成ヒドロゲルの場合より２桁大きかった、一方、プロキシフィリン拡散係数は錯体生成ヒドロゲルに比して非錯体生成では１桁だけ大きかった。表１錯体生成および非錯体生成Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルにおけるプロキシフィリンおよびビタミンＢ₁₂の拡散係数Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルがビタミン類、医薬品およびその他の生物活性化合物類の経口デリバリービヒクルとして機能する能力をさらに研究するために、種々の化合物の搏動性放出を模擬胃腸条件のもとで測定した。Ｉｎｖｉｔｒｏ放出実験をテオフィリン(ＭＷ＝１８０．２)、バンコマイシン（ＭＷ＝１４８５．７）およびインスリン（ＭＷ＝５７３３．２）を用いて実施した。例１を参照されたい。各化合物を平衡分配によってＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルに担持させ、それから担持ヒドロゲルをｐＨ＝１．２の模擬胃液２００ｍｌに２時間浸した。それからポリマー微粒子をｐＨ＝６．８の燐酸緩衝溶液に移した。周囲溶液に放出されるインスリン濃度をＨＰＬＣを用いてモニターした。テオフィリン、バンコマイシンおよびインスリンの結果は図５ａ−図５ｃにそれぞれ示される。各化合物のヒドロゲルマトリックスからの放出は酸性溶液では減少する(図２参照、暴露の最初の２時間)。しかしｐＨ６．８緩衝溶液では上記化合物の速やかな放出が認められる。この傾向は薬剤分子量の増加につれて顕著になった。例えばＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルはインスリン（ＭＷ＝５７３３．２）では有効なデリバリービヒクルである：実験の第一期間中に、模擬胃液中（ｐＨ＝１．３）でインスリンの１０％未満がポリマーから放出された。しかし粒子をｐＨ＝７．４緩衝溶液に入れた後、ヒドロゲルは速やかに膨潤し、インスリンを速やかに放出させた。これらの結果は、グラフトコポリマーＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）が経口インスリンデリバリーシステムの開発に有用であることを示している。ここに用いる用語インスリンは、精製したヒト−および動物天然インスリンも、インスリン・リスプロ等のインスリン誘導体、インスリンの組み換え型、およびインスリンまたはインスリン誘導体の一価または二価塩も含むものとする。さらに、Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルは、付着プロモーターとして役立つグラフトＰＥＧ鎖の存在によって強い粘膜付着特性を示す。さらに、Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルの粘膜付着特性は環境流体のｐＨに強く依存する(図６参照)。ゲルと粘膜との付着性は、胃の環境を模した条件下に比し、腸ｐＨ（ｐＨ＝７．４）を模した条件において著しく大きい。しかし、ゲルの粘膜付着特性を真に比較するために、付着の仕事を標準化して、ポリマーゲルフラクションを評価した。標準化した付着の仕事は、非錯化状態におけるヒドロゲルの場合に２桁大きい付着を示した。よって、Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルの粘膜付着特性は、それらが胃を通過中、錯化状態のままでいる場合には比較的低い。腸に達した後、鎖間錯化合物は解離し、それによってヒドロゲルの腸粘膜への付着性は胃粘膜への付着性より高まる。そこで脊椎動物に経口投与された後のインスリン担体の滞留時間は、インスリンが吸収される領域（すなわち腸）において（他の領域よりも）遥かに長い。異なるｐＨ値におけるヒドロゲルの付着特性の差は、各物質におけるＰＥＧ鎖の移動性による。高度に膨潤した、非錯体生成状態では、ペンダントＰＥＧ鎖は遊離しており、容易に粘膜に侵入し、付着のための錨として役立つ。錯体生成状態においてはＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）形におけるペンダントＰＥＧ鎖は主鎖と錯化し、粘膜表面との相互作用には役立たない。本発明によると、ヒドロゲル組成物を利用して治療的有効量のタンパク質を脊椎動物に投与できる。この方法はヒドロゲル担体内にタンパク質を含んでなる組成物を脊椎動物に経口投与する段階を含む。ヒドロゲルマトリックス内に含まれる組成物はさらにプロテアーゼインヒビター、薬物学的に容認される担体、安定剤および熟練せる当業者には公知の生体適合性フィラーも含むことができる。一好適ヒドロゲル担体はＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）であり、一実施態様においてＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルマトリックスはインスリンを含む薬物学的に容認される組成物を含む。さらに一実施態様によると、インスリン組成物はさらにプロテアーゼインヒビターまたは吸収促進剤を含む。Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲル内にインスリンを含んでなる組成物類は、驚くべきことに、インスリンを動物の血流中に効果的に運搬することが示された(例３および４を参照されたい)。ヒドロゲルマトリックスは普通は特定の形に作られ、熟練せる当業者には公知の方法を用いて適切な経口デリバリービヒクル（すなわち錠剤、カプセル等）内に包装される。一実施態様において、デリバリーシステムはポリ（メタクリル酸）およびポリ（エチレングリコール）の架橋コポリマー類の微小粒子からなり、インスリンを含む。このシステムは特に有効である。それは、上記コポリマー類の構造がｐＨ感受性膨潤挙動を示し、その結果上記組成物が胃の苛酷な環境を通過する間、インスリンが保護されるからである。ペンダントＰＥＧ鎖も付着プロモーターとして役立ち、ヒドロゲル担体の所望デリバリー部位における滞在時間を延長する。例２に認められるように、ヒドロゲルの粘膜付着特性はｐＨによって強く影響され、胃表面よりも腸表面に好んで付着する。その上、ペンダントＰＥＧポリマー類の存在はペプチド安定剤として役立ち、インスリン等の生物活性化合物の生物学的活性の維持を助ける。ヒドロゲルコポリマーにおける鎖間錯体生成は周囲液の性質およびｐＨ、並びにコポリマー組成物およびグラフト鎖の長さに感受性を有する。胃の酸性環境においてヒドロゲルは、カルボン酸プロトンとグラフト鎖上のエーテル基との間の水素結合によって安定化されたポリマー間錯化合物の形成によって、錯体生成状態にある。これらの条件では、分子量が最低１０００の大きさを有する化合物類（インスリン等）は小さい孔サイズ、ξ、のために、膜を通過して拡散することは容易でない。したがってこれらの化合物は胃の苛酷な環境から保護される。粒子が胃を通過し、腸に入る際、環境のｐＨはゲルの転移ｐＨより高くなる。錯化合物は直ちに解離し、網目構造の孔のサイズは急速に増大し、１００，０００未満の分子量を有する化合物を放出する。よって、Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルを分子量が約１０００から約１０００００までの範囲の化合物類の効果的経口デリバリービヒクルとして用いることができる。例１Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲル内容物のｐＨ依存性放出Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルのデリバリービヒクルとして機能する能力を異なるサイズの３種類の化合物：テオフィリン(ＭＷ１８０．２)、バンコマイシン（ＭＷ１４８５．７）およびインスリン（ＭＷ５７３３．２）で研究した。Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルを３７℃でメタクリル酸とポリ（エチレングリコール）モノメタクリレートとの遊離ラジカル溶液重合によって製造し、オリゴマー鎖をテトラエチレングリコールジメタクリレートで架橋した。生成したヒドロゲルを一週間、脱イオン水で洗って、未反応のモノマーおよび未架橋オリゴマー鎖を除去し、真空下で乾燥し、磨砕して平均粒子直径１００−１５０μ ｍの粉末にした。薬剤挿入実験をテオフィリン、(ＭＷ１８０．２)、バンコマイシン（ＭＷ１４８５．７）およびインスリン（ＭＷ５７３３．２）を用いて実施した。各薬剤をｐＨ７．４燐酸緩衝溶液に溶解し、Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルをその薬剤溶液に加え、平衡分配によって上記ヒドロゲルに担持させた。それからヒドロゲルマトリックスを酸性溶液と接触させ、ポリマー間錯化合物の生成を誘起し、ヒドロゲルマトリックスの孔サイズを小さくした。ヒドロゲル微小粒を濾過して集め、真空下で乾燥した。挿入効率は最初の溶液の濃度から残っている薬剤量、および分離ヒドロゲルの洗浄時に得られた濾液から、ＨＰＬＣ分析で測定して計算した。薬剤放出実験は日本薬局方（ＪＰ）のパドル法にしたがって行った。組成物をＪＰの第一（ｐＨ１．２）および第二（ｐＨ６．８）液中でパドルと共に３７℃ で１００ｒｐｍで撹拌した。第一液で２時間処理した後、ポリマー試料を濾過によって集め、ｐＨ６．８の第二液に移した。薬剤濃度をＨＰＬＣによってモニターした。ヒドロゲルマトリックスへの平均インスリン挿入効率は実験開始３０分後に９４％に達し、したがって上記ポリマーはインスリンに適した担体であると考えられる。テオフィリン、バンコマイシンおよびインスリンのＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルからの放出実験の結果は、図５ａ、５ｂおよび５ｃにそれぞれ示した。ヒドロゲルマトリックスからの化合物の放出は酸性溶液では減少した(実験の最初の２時間を参照)。しかしｐＨ６．８緩衝溶液では化合物の速やかな放出が認められる。この傾向は薬剤の分子量が増加するにつれてより顕著になった；実験の第一相では模擬胃液（ｐＨ−１．３）中のポリマーからインスリンの１０％未満が放出された。しかし上記粒子をｐＨ＝７．４緩衝溶液に入れた時、ヒドロゲルは速やかに膨潤し、インスリンの速やかな放出を可能にした。これらの結果は、グラフトコポリマー類Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）が経口インスリンデリバリーシステムの開発に有用であることを示唆する。例２Ｉｎｖｉｔｒｏ粘膜付着の仕事Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルを溶液重合法によって薄いフィルム状に製造した。そのヒドロゲルをｐＨ＝３．２および７．４のＤＭＧＡ緩衝食塩溶液中で平衡に達するまで膨潤させた。膨潤したヒドロゲルを直径２０ｃｍのディスクに切り、２５℃および９０％ＲＨで引張試験機に置いた。ポリマー試料をシアンアクリレート医用接着剤を用いて試験機の上部ホールダーに付着させた。一方ゲル化ウシ顎下腺ムチンの試料を上記接着剤を用いて下方ジョーに取り付けた。２つのジョーを１５分間一つにし、それから１ｍｍ／分の速度で離した。剥離力を転位（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の関数として測定した。生体付着の仕事に匹敵する破断の仕事を曲線下面積として計算した。Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルは経口インスリンデバイスとしても機能する。なぜならばそれらはプロテアーゼインヒビターの作用を遅らせることができ、または腸壁の粘膜に付着して緻密な接触を可能にし、薬剤の吸収を助けるからである。インスリン含有ヒドロゲルを腸液内に置いたとき、ヒドロゲルは速やかに膨潤し、インスリンを放出した。インスリン含有Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）微小粒子を１時間燐酸緩衝食塩溶液中で膨潤させ、それから腸液に移した。腸液中のインスリンのタンパク分解をインスリンＥＩＡキットを用いてモニターした。インスリンの生物学的活性の５０％以上がタンパク分解酵素の存在下で１時間以上保持された。それに比し、インスリンを腸液に溶解する場合は生物学的活性は速やかに失われる。Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルがインスリンを保護する働きを示すのは、カルシウムがイオン化ペンダント基に結合し、それがタンパク分解酵素類の作用を遅らせるからである。さらに、Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルは、付着プロモーターとして役立つグラフトＰＥＧ鎖の存在により、粘膜付着特性をあらわす。Ｐ（ＭＡＡ−ｇ− ＥＧ）ヒドロゲルの粘膜付着特性は環境液体のｐＨに強く依存した(図６)。図６の曲線下面積はゲルと粘膜との接着力に等価である。腸ｐＨ（ｐＨ＝７．４）を模する条件のもとで、ゲルと粘膜との間の付着は有意により大きかった。しかし、ヒドロゲルの粘膜付着特性を真に比較するために、付着の仕事を標準化してポリマーゲルフラクションを評価した(表２参照)。標準化した付着の仕事は、非錯体生成状態のヒドロゲルでは錯体生成ヒドロゲル類に比べて２桁大きかった。よって、ヒドロゲルは腸の粘膜に、胃粘膜より遥かに高程度に付着する。そこでインスリン担体の滞留時間はインスリンを吸着できる領域において遥かにより長くなる。表２１：１ＭＡＡ／ＥＧ比および分子量１０００のグラフトＰＥＧ鎖を含むＰ（ＭＡＡ／ＥＧ）ヒドロゲルの付着の仕事異なるｐＨ値におけるヒドロゲルの付着特性の差は、各材料のＰＥＧ鎖の移動性によるものであった。高度に膨潤した非錯体生成状態ではグラフトＰＥＧ鎖は遊離し、粘膜に容易に侵入して付着のための錨として役立った。錯体生成状態ではＰ（ＭＡＡ／ＥＧ）中のグラフトＰＥＧ鎖は主鎖と錯化合物を形成し、ゲル／粘膜界面に浸透して一時的錨を形成することができなかった。例３ラットにおけるインスリンのｉｎｖｉｖｏ投与グラフトコポリマーをメタクリル酸とポリ（エチレングリコール）モノメタクリレートとの遊離ラジカル溶液重合によって製造した。生成ヒドロゲルを７日間脱イオン水ですすいで未反応モノマーおよび未架橋オリゴマー鎖を除去した。ヒドロゲルを真空下で乾燥し、磨砕して粉末にした。粉末を濾過し、直径１００− １５０μｍの粒子を得た。結晶ブタインスリン（２６．９Ｕ／ｍｇ）を平衡分配によって担持させた。薬剤担持粒子を濾過し、洗って表面薬剤を除去し、真空下で乾燥した。雄ウィスターラット（２００ｇ）を２４時間絶食させた。それらラットを仰向きに拘束し、インスリン担持ポリマー微小粒子をゲラチンカプセルを用いて投与した。それは胃内で瞬時に溶解する。実験前と、投与後０．２５、０．５、１、２、４、６、８時間目に頚静脈から０．２ｍｌ部分の血液試料を採取することによって血清グルコースをモニターした。血清は３分間３０００ｒｐｍで遠心分離し、分析まで凍結した。血清インスリン濃度をグルコースＢ−試験キットを用いるグルコースオキシダーゼ法によって測定した。図７は、Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）微粒子に含まれるインスリンを摂取したラットの血糖反応をまとめたものである。ポリマー投与型を摂取して２時間以内に、強い血糖低下効果（血糖値の低下）が認められた。血糖値の減少はインスリン用量に強く依存する。インスリン溶液を受けたラットでは反応は認められなかった。インスリン含有Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルとプロテアーゼインヒビター、アプロチニン、を含む組成物を投与した結果を図８に示す。対照群ラットにはプロテアーゼを含まないインスリン含有ヒドロゲルを投与し(比較のため)、１群には５０Ｕ／ｋｇインスリン溶液を投与した(対照とした)。インスリンのポリマー投与型を投与した２群には投与２時間以内に血糖濃度の著しい減少がおきた。インスリンとプロテアーゼインヒビター、アプロチニン、との組み合わせを投与したラットは血糖値の最大の減少を示した。アプロチニンは腸における分解酵素の活性を遅らせ、局所的に放出されるインスリンをより長く活性のまま留めることができる。こうして、血流に輸送されたインスリンの量はヒドロゲルインスリンとプロテアーゼインヒビターとの組成物（Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲル内に封入されている）を受けたラットで最高で、血糖濃度のより大きい減少をおこす。例４糖尿病ラットおよびイヌにおけるｉｎｖｉｖｏ研究健康な雄ウィスターラットにストレプトゾシン投与によって糖尿病を誘起した。健康なイヌをアロキサン投与によって糖尿病にした。Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）微小球は、メタクリル酸およびポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート（ＰＥＧＭＷ＝１０００）の遊離ラジカルバルク、懸濁重合によって製造した。テトラエチレングリコールジメタクリレートを架橋剤として加えた。２，２’ −アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を熱反応開始剤として総モノマーの０．５％加えた。薬剤担持は上記Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）微小球にインスリンを平衡分配することによって実現した。ウシ膵インスリンを１ＮＮａＯＨ２００μｌに溶解した。インスリン溶液を燐酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）２０ｍｌで希釈し、０．１ＮＮａＯＨ２００μｌで標準化した。担持させるために先ず最初に乾燥Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）をインスリン溶液中で２４時間膨潤させた。上記粒子を濾過し、０．１ＮＨＣｌ溶液１００ｍｌで洗って微小粒子を崩壊させ、残っている緩衝溶液を“しぼり出す”。薬剤担持微小球を真空下で乾燥し、４℃で保存した。最初の溶液および洗浄により生じた濾液のインスリン濃度のＨＰＬＣ分析から担持程度を決定した。インスリン担持Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルの投与前に、上記雄ウィスターラット（２５０ｇ）を２４時間絶食させた。ラットを仰向けにして拘束し、インスリン担持Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）微小球および対照溶液を口からゲラチンカプセルおよびオードレイトＬ１００を用いて調製したカプセルによって与えた。ゲラチンカプセルは胃に容易に溶解した、一方、オードレイトＬ１００カプセルは著しく遅い速度で溶解した。実験中、ラットを分け(１ケージに４匹づつ)、水は自由に飲ませた。投与０．２５、０．５、１、２、４、６および８時間後に血液０．２ｍｌ部分を頸静脈から集めた。血清を３０００ｒｐｍ、３分間の遠心分離によって分離した。血清グルコース濃度をグルコースＢ−試験キットを用いるグルコースオキシダーゼ法によって測定した。糖尿病イヌ（２５ｋｇ）は組成物投与前２４時間は絶食させた。ポリマー投与型をゲラチンカプセルにより経口投与した。イヌには投与時に食事を与えた。実験中、イヌはケージに入れられ、水は自由に飲むことができた。血液試料を内在カテーテルから採取した。血清グルコース濃度をポータブルグルコース分析器によって測定した。多くのシステムが、インスリン含有ポリマー担体の経口投与後の健康動物の血糖濃度の低下には有効であったが、糖尿病動物では同様な結果は認められていない。ゲラチンカプセルを用いるインスリン含有Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）微小球の経口投与後（２５ＩＵ／ｋｇ量）の糖尿病および健康ラットの血糖反応を図９に示す。糖尿病ラットの血糖値は最初の濃度の４０％低下した。血糖値の低下は８時間以上続き、糖濃度の抑制程度は健康動物よりも糖尿病動物の方が実際大きかった。その上、糖尿病動物ではより長く続く強い血糖低下効果が認められた。インスリン担持Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）微小球を含むオードレイトカプセルの経口投与後の糖尿病ラットの血糖反応を図１０に示す。これらの投与を受けたラットのグルコース濃度は単回投与後最低８時間は５０％より多く減少した。オードレイトに封入された微小粒子はゲラチンカプセルより効果的であった、これは多分、オードレイトカプセルに含まれる微小球が、オードレイトカプセルの遅い溶解により、上部ＧＩ管の苛酷な環境にさらされる時間がより短かかったためである。健康イヌの血糖は単一ポリマー投与型（１０ＩＵ／ｋｇ）の経口投与後有意に低下した。ゼロ時にイヌに食事を与え、からだの正常反応は基礎レベルに維持されたはずである。しかし食事後、血糖値は投与２時間以内に増加し、上部小腸におけるインスリン取り込みによって血糖値は２０％以上減少した。さらに、８時間時点で第二の減少が起きた。これは前にラットで見られたものと一致し、多分結脱のインスリン吸収によるものである。さらに、８時間後も血糖値は確実に減少した。これは多分、インスリンの結腸吸収によるものである。糖尿病イヌのグルコース反応も経口投与後のインスリン取り込みを証明している。糖尿病イヌの血糖値はゲラチンカプセルを用いるインスリン含有Ｐ（ＭＡＡ −ｇ−ＥＧ）微小球の経口投与（１０ＩＵ／ｋｇ量）によってコントロールされた。食事およびポリマー投与型の投与に続き、上記イヌの糖濃度は最初は急速に上昇した。しかし１時間後、インスリンが吸収される次の３時間は糖濃度は安定し始めた。ポリマー投与型を受けた糖尿病イヌの血糖値はインスリンを何ら摂取しなかったイヌより４０％少なかった。経口インスリンデリバリーシステムは、この薬剤を胃の苛酷な環境から防護し、インスリンを長時間生物学的活性な形で、上部小腸等のＧＩ管に沿った吸収のためにより好ましい領域に運搬しなければならない。錯体生成Ｐ（ＭＡＡ−ｇ− ＥＧ）ヒドロゲルは、その性質上、この用途のために理想的である。Ｐ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲルは生物学的活性インスリンを経口的経路を経て効果的に運搬できる。これらの物質は糖尿病ラットおよびイヌの血糖値を低下させ、血糖を近正常値に８時間より長く維持することが示された。これらの物質がよく機能するのは、ヒドロゲルに含まれるインスリンの大部分がこれらの物質が上部小腸に達するまで放出されないためである。腸にある間、ヒドロゲルは腸粘膜に強固に付着し、担体と吸収部位との緊密な接触を可能にする。その上、上記ポリマー類は腸のタンパク分解酵素の活性を遅らせ、インスリンを吸収までのより長時間活性のままに保つ働きをする。酵素機能に与える上記ポリマー類の阻止的効果は、上記ポリマー類の、酵素機能のために必要なカルシウム等のカチオン類との錯化合物形成能力に由来すると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ローマン，アンソニー，エム. アメリカ合衆国・ペンシルバニア州 19086・ウォリングフォード・ウォーターフォードウェイ 12 (72)発明者永井恒司東京都文京区本駒込１―23―10―103 (72)発明者森下まり子東京都中野区松が丘１―６―７

Claims

【特許請求の範囲】１．膨潤性ヒドロゲルマトリックスとそのなかに含まれる不安定なタンパク質を含む経口投与のための医薬組成物であって、前記ヒドロゲルマトリックスはメタクリル酸とポリ（アルキレングリコール）モノメタクリレートとの架橋コポリマーを含んでなる医薬組成物。２．ポリ（アルキレングリコール）モノメタクリレートがポリ（エチレングリコール）モノメタクリレートである請求項１記載の組成物。３．前記ヒドロゲルマトリックスがテトラエチレングリコールジメタクリレートで架橋されている請求項１記載の組成物。４．メタクリル酸とポリ（エチレングリコール）モノメタクリレートとのモル比が約１：１である請求項２記載の組成物。５．前記タンパク質が約１，０００ないし約２０，０００の分子量を有する請求項４記載の組成物。６．前記タンパク質がインスリンである請求項４記載の組成物。７．ポリ（エチレングリコール）モノメタクリレートが約２００ないし約４０００の分子量を有する請求項４記載の組成物。８．ヒドロゲルが粒状で、カプセルに含まれている請求項４記載の組成物。９．カプセルがゲラチンカプセルである請求項８記載の組成物。１０．さらにプロテアーゼインヒビターを含んでなる請求項４記載の組成物。１１．脊椎動物にインスリンを経口投与するための組成物であって、前記組成物がＰ（ＭＡＡ−ｇ−ＥＧ）ヒドロゲル内に含まれたインスリンを含んでなる組成物。１２．さらにプロテアーゼインヒビターを含んでなる請求項１１記載の組成物。１３．ヒドロゲルが粒状で、カプセル内に含まれる請求項１１記載の組成物。１４．カプセルがゲラチンカプセルである請求項１３記載の組成物。１５．治療的有効量のタンパク質を脊椎動物に投与する方法であって、前記脊椎動物に請求項１記載の組成物を経口投与する段階を含んでなる方法。１６．請求項１記載の組成物の生成法であって、メタクリル酸とポリ（アルキレングリコール）ジメタクリレートと架橋剤を重合させてヒドロゲルマトリックスを形成し；前記ヒドロゲルマトリックスを前記タンパク質の水溶液と接触させ、その際前記溶液は約５．４より大きいｐＨを有し；前記溶液のｐＨを約５．４未満に調節し；前記タンパク質含有ヒドロゲルマトリックスを分離する諸段階を含んでなる方法。１７．前記ポリ（アルキレングリコール）モノメタクリレートがポリ（エチレングリコール）モノメタクリレートである請求項１６記載の方法。