JP2002512514A - ウイルスを不活性化するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 例えばワクチンに使用するためのウイルスを不活性化するための方法と、それを用いて治療する方法について開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルスを不活性化するための方法 発明の背景 本発明は、ワクチンに使用するためのウイルスを調製する方法に関する。 ウイルスの不活性化はウイルス抗原を変更し、ワクチンの安全性または有効性 を低下させることがある。理想的には、ウイルス不活性化条件および薬剤は選択 的且つ不可逆的にウイルスゲノムに影響を与えると考えられる。 エチレンイミンモノマー（EI）またはバイナリーエチレンイミン（BEI）は核 酸の主にプリンのN-7、N-3およびN-1、ならびにわずかではあるがピリミジンのN -3を修飾するのに使用されている。アルキル化剤はN-7アルキル化プリン（例え ば、グアニン）のイミダゾール環の開環を促進し、それによって複製を阻止する 。EIはグアノシンをアルキル化して、N-7（アルキルグアノシン）よりイミダゾ ール環の開環速度がより速いN-7（アミノエチル）グアノシンを形成する。EIは また、ウイルスまたは非ウイルスの生物分子の非ゲノム成分も修飾する。 この非特異的反応の1つの望ましくない副作用はウイルス粒子の崩壊で、免疫 原性を低下してしまうことである。1つのアミノ酸だけが化学修飾されてもプロ テイナーゼに対するタンパク質の抵抗性が大きく変化してしまうことがあり、修 飾後のウイルスタンパク質の分解により、保管中のワクチンの安定性が低下する ことがある。防御エピトープの優先的な不活性化により、以降の感染により免疫 応答の不均衡および疾患の増悪が生じることがある。カプシド成分の修飾は、T- 細胞に対するエピトープの提示に必要である、ウイルスタンパク質の細胞内処理 を阻害することがある。第3に、ウイルスタンパク質のアミノ酸残基の修飾はウ イルスの抗原性を低下する。最後に、最初のウイルス含有物品に存在するタンパ ク質の化学修飾はそれらの抗原特異性を変更することがある。これは、不活性化 狂犬病ワクチンの追加投与後にヒトに生じるアレルギー反応の主要な原因である 。エチレンイミンモノマー（EIまたはBEI）は本来、選択性が低いにもかかわら ず、死菌抗ウイルスワクチンを製造するための薬剤として使用されている。 発明の概要 本発明は、ウイルスを不活性化するための方法であって、該ウイルスを、7.0 よ り小さいpHにおいて（例えば、5.5〜7.0のpH、または6.8より小さいpH）、エチ レンイミンを含有する不活性化量の組成物で処理する段階を含む方法を特徴とす る。 好ましくは、処理後のウイルスの免疫原性は、7.0より大きいか、または7.0に 等しいpH（例えば、pH7.5、8.0、または好ましくは7.0）において処理した同じ ウイルスの免疫原性と比較して大きい。免疫原性および不活性化は、本明細書に 記載する方法を含むがそれらに限定されない、当技術分野において公知の方法に よって測定することができる。エチレンイミンは、エチレンイミンのモノマー型 およびオリゴマー型から選択される。エチレンイミンの濃度は重量/容量（w/v） （例えば、0.01%w/v〜1.0%w/v、または0.01%w/v〜0.5%w/v）で求められる。モノ マー体およびオリゴマー体エチレンイミンの混合物、またはオリゴマー体エチレ ンイミンの混合物を使用することができる。オリゴマーは、例えば2量体、3量体 、分岐または直鎖4量体等のように2〜8単位を含む。ウイルスの例にはポリオウ イルス、狂犬病ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウ イルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ロスリバーウイルス、ロタウイルス および風疹ウイルスが挙げられる。 本発明はまた、ウイルスを不活性化するための方法であって、7.0より小さいp Hにおいて該ウイルスに、モノマー体のエチレンイミンを含む組成物を接触させ る段階を含む方法を特徴とする。pHは、下記の段階を含む方法により決定した： （a）複数の異なるpH値において、複数のウイルス試料をモノマー体のエチレン イミンを含有する不活性化量の組成物で処理する段階と、（b）処理した各々の ウイルス試料について、ウイルスの不活性化および免疫原性から選択される特徴 を測定する段階と、（c）段階（a）の他のpH値と比較して、より大きいウイルス 不活性化もしくはより大きい免疫原性、またはそれらの組み合わせを提供するpH を選択する段階。 本発明の他の特徴および利点は以下の説明および本発明の請求の範囲から明 らかになると思われる。好ましい態様の説明 本発明は、例えばエチレンイミン（EI）のような求電子不活性化剤の作用によ って、7.0より小さいpHにおいてウイルスを不活性化する方法を特徴とする。酸 性pHでの処理は、7.0以上のpHでの処理と比較して、ウイルスの核酸を不活性化 し、驚くべきことに、求電子試薬はウイルスのタンパク質に対する有害反応が比 較的少ない。ウイルスのタンパク質に有害反応が生じると、プロテイナーゼに対 する抵抗性の低下、ウイルス粒子の崩壊、ウイルスの抗原性の変化およびウイル スタンパク質の細胞内処理の阻害が生じることがある。従って、開示されている 方法で処理したウイルスは貯蔵中に比較的安定で、より良い免疫原性および抗原 特性を有する可能性が高い。 6.5〜8.5のpH値では、核酸塩基は全く変化しない。また、求電子試薬の求核性 および修飾率は実質的に同じままである。しかし、pHの変更は、プロトン付加可 能なヘテロ原子を有するアミノ酸残基の求核性に影響を与える。例えば、ヒスチ ジンおよびトリプトファンのイミダゾール環またはチロシンのヒドロキシ基のプ ロトン付加はアミノ酸と求電子試薬との反応をほぼ完全に阻止する。 他の要因により、タンパク質とEIとの非特異的反応に対する低pHの影響を予測 することが困難である。ウイルスのタンパク質間およびウイルスのタンパク質と 培地の他の成分との分子内相互作用が存在することにより、これらのアミノ酸の 接近しやすさおよびpK_aの両者が有意に変化しうる。不活性化条件を変更するこ とにより、ウイルス成分の高次構造（タンパク質および核酸共に）が変更される ことがあり、成分とEIとの反応速度に影響を与えることがある。 不活性化の最適化（例えば、最短処理時間、EIの濃度、イオン強度、温度、お よびpH）は、死菌ワクチンの免疫原性の効力および特異性に影響を与える副反応 の程度を少なくすると思われる。死菌ウイルスワクチンを調製する目的のために 、ウイルスを不活性化するための最適な条件には以下が含まれる：（1）6.5〜8. 0（または、5.5〜7.0もしくは5.0〜7.0）のpHの関数としてウイルス感染性の不 活性化速度定数の測定；（2）異なるpH値でのウイルス感染性不活性化の選択性 の測定（ビリオンタンパク質および非ウイルスタンパク質の修飾の程度）；およ び（3）異なるpH値において不活性化されたワクチンの効力の測定。 他の態様 上記の説明から、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確かめることができ 、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明を種々の用途および条 件に適合させるべく本発明の種々の変更および改良を加えることができる。従っ て、他の態様も本発明の請求の範囲内である。 さらに詳細を加えなくても、当業者は、本明細書の説明に基づいて、本発明を 十分に使用することができると考えられる。従って、以下の具体的な実施例は単 に例示的なものであり、いずれにせよ本発明の開示の残りの部分を限定するもの ではないと考えるべきである。本明細書に記載する文献は参考として本明細書に 組み入れられている。 実施例1 pH6.5〜8.0の関数としてのウイルス感染性不活性化速度定数の測定 ウイルス不活性化速度定数を使用して、生きているウイルスの開始時の力価と 必要な不活性化の程度との関数として、安全なワクチンを製造するために必要な おおよその不活性化条件を求める。一般に、不活性化は、十分に低い力価の生き ているウイルスを与えて、有意義な発現頻度の生きているウイルスの感染を生じ ないように算出された時間の間に進行しなければならない。多数のウイルスでは 、12〜20ログの不活性化により、百万回のワクチン接種ごとに1つより少ない生 きているウイルスが搬送されると算出されるワクチンを製造することができる。 イルス感染性の直接的な測定を実施することはできないが、他の不活性化剤によ るウイルス不活性化の程度を求めるために使用される、PCRなどの間接的な方法 は誤りを導きやすい。 不活性化速度定数の測定は以下のように実施する：蒸留直後のエチレンイミン （EI）を0.1M NaClおよび0.1M MOPS緩衝液または0.1MトリスHCl緩衝液に溶解し て、EIの最終濃度を0.5%（0.125M）、0.1%（0.025M）および0.02%（0.005M）と する。最終pHは、それぞれ、6.5、7.0、7.5または8.0とする。試薬溶液を20℃ま たは37℃においてインキュベーションし、同じ緩衝液、同じpHおよび同じ温度で 予めインキュベーションしておいた精製ウイルス懸濁液（最初の力価〜10⁵-10⁸P FU./ml）に添加する。反応混合物を0、1.0、2.0、4.0、8.0および16時間インキ ュベーションした後の少量を取り出し、0.1容量の1.0Mチオ硫酸塩（同じpHに中 和したもの）を添加することによって過剰量の試薬を速やかに中和し、同じ温 度で0.5〜1.0時間インキュベーションし、次いで0℃に冷却し、さらに培養培地 で希釈して培養するまで、この温度で保持する。対照はEIを含有しない同じ反応 混合物である。不活性化後、残存する複製能力を有するウイルスの濃度を求める ために使用される標準的な様式でウイルスの力価を求める。不活性化の速度定数 （k、h-1、mM-1）は以下のように算出する： （式中、Aは反応混合物中のmM単位の試薬の終濃度であり、tは時間単位の試薬の インキュベーション時間であり、S_oおよびS_tは不活性化前およびt時間の不活性 化後のウイルスの力価である）。 pHは正確に測定しなければならず（±0.05）、不活性化前および不活性化中は 一定に保たれなければならない。反応混合物の温度は一定でなければならない（ ±1.0℃）。 予測される指数関数的な（半対数的な）動態の不活性化を観察することが必要 である場合には、ウイルスを所定の温度で予備インキュベーションしなければな らない。試薬溶液およびウイルス懸濁液のどちらも測定可能な（>1mM）量のリン 酸塩、クエン酸塩および他のオリゴアニオン源を含有してはいけない。ウイルス 懸濁液は天然または人工オリゴカチオン（スペルミン、スペルミジン等）または ウイルスゲノムもしくは核タンパク質の高次構造他を変化させることができる他 の化合物を含有してはいけない。ゲノム損傷の修復、高多重感染によるゲノムの 組換えまたはゲノム断片を含有するウイルスゲノムの再構築により、非指数関数 的な不活性化動態が生じることがある。これは、ウイルスゲノムに関する知識に 基づいて考えると疑わしいことがある。それは実験的に観察し、さらに実施され る研究中で考慮することができる。実施例2 異なるpHにおけるビリオンタンパク質および非ウイルスタンパク質に関するウ イルス感染性不活性化の選択性の測定 選択性は、反応混合物中の他の成分（ウイルスまたは他のタンパク質、糖タン パク質、多糖等）の修飾速度に対するウイルスゲノムの修飾の比である。ウイル スゲノムの1つのヌクレオシド残基が修飾されるとウイルスの複製が完全に阻止 され、それによってウイルスが複製されない。平均すると、1ゲノムあたり2.3の 修飾残基が出現すると（ゲノム複製を完全に阻止する）、ウイルスの感染性が1 ログ低下する。 最も重要な有害反応がウイルスの崩壊またはゲノム以外の他の生体高分子：タ ンパク質、糖タンパク質および多糖の修飾によって生じることがある。ビリオン が崩壊すると免疫原性が有意に（数次数の大きさ）低下し、それに比例して、適 切な免疫応答を誘発するのに必要なワクチン量を増加させなければならない。他 のより重篤な結果は、反応混合物の他の（ゲノム以外の）成分、主にウイルス並 びに反応混合物中に存在する他のタンパク質および高分子の修飾によって測定さ れる。 幸運なことに、各ゲノムは、他のいかなる分子よりも露出反応残基をはるかに 多く有する（核酸のプリンは求電子試薬の主要な標的である）。さらに、ゲノム だけが、一般に、ウイルス粒子あたり1つのコピーで存在する。全ての他の分子 は多コピー存在し（各高分子のコピーはウイルス粒子あたり過剰である）、従っ て、感染性の不活性化中に多数のコピーが同じ方法で修飾された場合だけそれら の修飾が目視可能となる。さらに、pH範囲6〜8における核塩基の反応性は、本質 的に同じであるが、タンパク質中のアミノ酸残基の反応性はこのpH区間中で劇的 に変化し、プロトン付加されるとかなり低くなる。このように、ゲノム修飾の最 大の特異性は可能な最も低いpHによって得ることができ、EIの場合にはpH約6.5 が可能である。EIの場合には（pK_a〜8.1）、これにより、不活性化速度がわずか に増加するが、反応性（プロトン付加されてない）アミノ酸残基の量を有意に低 下させ、従って、不活性化に比較して修飾速度を低下させる。 等電点電気泳動法および免疫学的測定方法を含むいくつかの方法を使用して、 タンパク質の修飾程度を求めることができる。どちらの場合も、標準的なウイル ス製剤を分割して、各pHにおける望ましい程度の不活性化を達成する適当な温度 および時間においてpH6.5、7.0、7.5および8.0で不活性化する。各場合において 、EIを含有させない以外は同じように対照のウイルス製剤を処理する。上記のよ うに不活性化およびチオ硫酸塩による中和後、不活性化および対照ウイルス製剤 の一部に標準的な技法を使用した等電点電気泳動法を実施する。EIによるアミノ 酸残基の修飾によりタンパク質のpK_aは上昇するので、等電点電気泳動法は、タ ンパク質の修飾を検出するための感度のよい方法である。クーマシーブルー染色 、銀染色または標識ウイルスが使用されている場合にはオートラジオグラフ法な どの任意の標準的な技法によってIEFゲルのタンパク質バンドを検出することが できる。結果は、不活性化の異なる条件間でバンドパターンが変わる程度の変動 を示し、条件を選択することによりタンパク質の修飾を最少にすることができる 。不活性化中にウイルスをタンパク質含有培地に懸濁すると、高速遠心分離によ って不活性化混合物からウイルスを除去した後に、培地のタンパク質の修飾もIE Fによって求められるはずである。 不活性化の選択性の別の試験として、不活性化ウイルスおよび対照製剤に、EL ISAまたはビリオンタンパク質とモノクローナル抗体パネルなどの標準的な免疫 学的試薬との反応を測定するように設定されている同様の標準的なアッセイによ って免疫学的な評価を実施することができる。この評価を実施するためには、異 なるpHにおいて調製した不活性化ウイルスおよび対照ウイルス製剤に規定の条件 下においてELISAを実施する。抗原性の低下は、通常、いくつかの不活性化条件 下において見出される。ほとんどの条件下において、これらの条件は、タンパク 質の修飾が増加するIEFによって求められるものとほぼ同じ（好ましくは同一） であるべきである。ウイルスの感染性（理論値）の50ログを越える不活性化を生 ずる条件下でだけタンパク質の検出可能な修飾を見出すことができる場合もある 。この場合でも、ウイルスゲノムの修飾は、1つのポリヌクレオチド分子あたり 数百ヌクレオチド残基と多いが、タンパク質では主に1つの修飾反応（モノ修飾 タンパク質）が検出できるだけである。 実施例3 異なるpHで不活性化したワクチンの効力の測定 タンパク質の修飾程度の測定後、ワクチンの効力について不活性化ウイルス製 剤を試験する。これを実施するためには、種々のpHで不活性化したウイルス製剤 を、効果的な免疫応答が得られるように設定した条件下で適当な動物に投与する 。例えば、適当な間隔で、免疫アジュバントの有無について3〜4回投与。通常、 種々の投与量の各ワクチン製剤を投与することにより、用量応答関係、すなわち 効力の測定が可能となる。ベースライン時およびワクチンの各投与後1週間目に 、ウイルス成分に対する抗体の有無について血液または他の体液を試験する。最 後のワクチン投与後、野生型ウイルスを投与して、ウイルスの感染結果を観察す ることによって、防御効果について動物を試験する。この方法では、各条件にお いて産生されたワクチンの効力を評価することができる。いくつかのウイルスで は、免疫応答または防御効果の評価はヒトにおけるワクチンの有効性を予測する ためのより有用なパラメータとなり得る。

【手続補正書】特許法第１８４条の４第４項 【提出日】平成１０年１０月７日（１９９８．１０．７） 【補正内容】 請求の範囲 1. ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ 媒介性脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ロスリバーウイルス、 ロタウイルスおよび風疹ウイルスからなる群より選択されるウイルスを不活性化 するための方法であって、7.0より小さいpHにおいて該ウイルスを、エチレンイ ミンを含有する不活性化量の組成物で処理する段階を含む方法。 2. pHが5.5〜7.0である、請求項1記載の方法。 3. pHが6.8より小さい、請求項1記載の方法。 4. 組成物中のエチレンイミンの濃度が0.01%w/v〜0.5%w/vである、請求項1記載 の方法。 5. エチレンイミンがモノマーである、請求項1記載の方法。 6. エチレンイミンがオリゴマーである、請求項1記載の方法。 7. 処理後のウイルスの免疫原性が、pH7.0で処理した同ウイルスの免疫原性と 比較して増強されている、請求項1記載の方法。 8. 請求項1または2記載の方法によって得られる不活性化ウイルスを含むワクチ ン。 9. 脊椎動物におけるウイルス感染を予防または治療するための方法であって、 脊椎動物に、7.0より小さいpHにおいてエチレンイミンで処理された、ポリオウ イルス、狂犬病ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウ イルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ロスリバーウイルス、ロタウイルス および風疹ウイルスからなる群より選択される実質的に不活性化されたウイルス を投与する段階を含む方法。 10．ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ 媒介性脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ロスリバーウイルス、 ロタウイルス、および風疹ウイルスからなる群より選択されるウイルスを不活性 化するための方法であって、 （a）複数の異なるpH値において、複数の該ウイルス試料を不活性化量のモ ノマー体エチレンイミンで処理する段階と、 （b）処理した各ウイルス試料について、ウイルスの不活性化および免疫原 性から選択される特徴を測定する段階と、 （c）段階（a）の他のpH値と比較して、より大きいウイルス不活性化もしく はより大きい免疫原性またはそれらの組み合わせを与えるpHを選択する段階とに よって測定された、7.0より小さいpHにおいて該ウイルスに該モノマー体エチレ ンイミンを接触させる段階を含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. ウイルスを不活性化するための方法であって、7.0より小さいpHにおいてウ イルスを、エチレンイミンを含有する不活性化量の組成物で処理する段階を含む 方法。 2. pHが5.5〜7.0である、請求項1記載の方法。 3. pHが6.8より小さい、請求項1記載の方法。 4. 組成物中のエチレンイミンの濃度が0.01%w/v〜0.5%w/vである、請求項1記載 の方法。 5. エチレンイミンがモノマーである、請求項1記載の方法。 6. エチレンイミンがオリゴマーである、請求項1記載の方法。 7. ウイルスが、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウ イルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ロスリバ ーウイルス、ロタウイルスおよび風疹ウイルスから選択される、請求項1記載の 方法。 8. 処理後のウイルスの免疫原性が、pH7.0で処理した同ウイルスの免疫原性と 比較して増強されている、請求項1記載の方法。 9. 請求項1または2記載の方法によって得られる不活性化ウイルスを含むワクチ ン。 10. 脊椎動物においてウイルス感染を予防または治療するための方法であって 、脊椎動物に、7.0より小さいpHにおいてエチレンイミンで処理した実質的に不 活性化されたウイルスを投与する段階を含む方法。 11. ウイルスを不活性化するための方法であって、 （a）複数の異なるpH値において、複数の該ウイルス試料を不活性化量のモ ノマー体エチレンイミンで処理する段階と、 （b）処理した各ウイルス試料について、ウイルスの不活性化および免疫原 性から選択される特徴を測定する段階と、 （c）段階（a）の他のpH値と比較して、より大きいウイルス不活性化もしく はより大きい免疫原性またはそれらの組み合わせを与えるpHを選択する段階とに よって測定された、7.0より小さいpHにおいて該ウイルスに該モノマー体エチレ ンイミンを接触させる段階を含む方法。