JP2002512199A - 心血管疾患の予防及び治療用オステオプロテゲリン含有組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 心血管疾患の予防及び治療用方法及び組成物を開示する。医薬組成物の形態でオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）を投与すると、アテローム性動脈硬化症及び関連する心血管疾患が予防及び治療される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、心血管疾患の治療に関する。より具体的には、本発明は、血管の閉
塞及び石灰化を伴う心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症の治療及び予防
のためのオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）の使用を含む。

【０００２】 （背景技術） 哺乳動物の骨格の発生及び維持は、その成分細胞型の調節及び相互作用を必要
とする（Ｅｒｌｅｂａｃｈｅｒら，Ｃｅｌｌ，８０，３７１−３８０（１９９５
）；Ｍａｒｋｓ，Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｄｅｎｔ．Ｈｅｌｖ．，２，１４１−１５
７（１９９７））。骨格構造の主要因子には、軟骨を形成する軟骨細胞、骨マト
リックスを合成し、沈着する骨芽細胞、及び骨を吸収する破骨細胞が含まれる。
軟骨細胞は、間葉細胞から誘導され、軟骨内骨形成のために必要な初期軟骨テン
プレートを生成するように働く。骨芽細胞は、間葉骨先祖細胞から誘導され、骨
表面上に位置し、ここでマトリックスタンパク質を合成し、輸送し、配置する。
破骨細胞は、造血骨髄中に存在する顆粒球−単球前駆体から誘導される（Ｒｏｏ
ｄｍａｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．，１７，３０８−３３２（１９９６）
；Ｍｕｎｄｙ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．，８，Ｓ５０５−Ｓ５１０（１
９９３）；Ｍａｎｏｌｏｇａｓ及びＪｉｌｋａ，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．
，３３２，３０５−３１１（１９９５））。骨表面に対してしっかり結合したら
、破骨細胞は波打ち稜として公知の特殊構造により酸性化される吸収ゾーンを形
成する。前記波打ち稜は、骨マトリックスを脱灰した後消化するプロトン及び酸
プロテアーゼを分泌する分布導管として機能する。破骨細胞が媒介する吸収過程
の間、骨芽細胞による骨再生を開始するためのシグナル分子として作用するタン
パク質因子が形成されると考えられる。また、骨芽細胞は、可溶性または膜結合
調節因子の発現を介して破骨細胞の機能に影響を与え得る（Ｔａｋａｈａｓｈｉ
ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２３，２６００−２６０２（１９８８））
。骨芽細胞機能と破骨細胞機能を結びつけることが骨格のモデリング、改造作用
及び修復のために重要である（Ｍｕｎｄｙ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５３ ，２９６−３００（１９９３）；Ｍｕｎｄｙら，Ｂｏｎｅ，１７，７１Ｓ−
７５Ｓ Ｆ（１９９５））。

【０００３】 先進国において最も一般的な骨疾患である閉経後骨粗しょう症の原因はエスト
ロゲンの減少にある（参考のために、Ｐａｃｉｆｉｃｉ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ
．Ｒｅｓ．，１１，１０４３−１０５１（１９９６）参照）。閉経後骨量減少は
、サイトカインの産生に対してエストロゲンが発揮する調節コントロールの損失
及び破骨細胞の発生を調節する他の因子に起因し得る。破骨細胞と骨芽細胞の活
性のバランスが変化すると、骨量の正味減少がもたらされ、最終的に骨粗しょう
症が生ずる。

【０００４】 ヒトにおける骨粗しょう症は、多くのアテローム性動脈硬化性病巣の特徴であ
る動脈石灰化を高頻度で示す（Ｐａｒｈａｍｉ及びＤｅｍｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌｏｇｙ，８，３１２−３１４（１９９７）；Ｂａｎｋｓら
，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２４，８１３−８１７（１９９４）
；Ｐａｒｈａｍｉら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ，Ｖａｓｃ．Ｂ
ｉｏｌ．，１７，６８０−６８７（１９９７））。これら２つの疾患には共通す
る病因がある。実際、幾つかの動脈カルシウム無機沈着物は、骨髄の柱、小腔及
び島を含めた完全に形成された層状骨と同一と見られる（Ｈａｕｓｔ及びＧｅｅ
ｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，６０，３２９−３４６（１９７０）；Ｂｕｎｔ
ｉｎｇ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，８，３６５−３７６（１９０６））。更に、石
灰化した動脈がコラーゲンタイプＩ、マトリックスＧＬＡタンパク質、オステン
カルシン、オステオネクチン及び骨形成因子タイプ２を含めた数種の骨マトリッ
クスタンパク質を発現することが判明している（Ｂｏｓｔｒｏｍら，Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｒｔ．，９１，１８００−１８０９（１９９３）；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ
ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９２，２１６３−２１６８（１９９５）；Ｇｉａ
ｃｈｅｌｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９２，１６８６−１６９６（
１９９３）；Ｂｏｓｔｒｏｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，７５，８８Ｂ−
９１Ｂ（１９９５））。これらの知見から、動脈石灰化は組織化された骨形成と
同様の細胞及び分子メカニズムを有する組織化・調節された過程であると推測さ
れる（Ｄｅｍｅｒ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９２，２０２９−２０３２（１９
９５）；Ｐａｒｈａｍｉら，Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．，３ ，９０−９４（１９９６））。

【０００５】 腫瘍壊死因子受容体遺伝子スーパーファミリーの一員であると最近同定された
オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）は、インビトロ及びインビボで破骨細胞の発生
を抑制する分泌因子である（いずれも援用により本明細書に含まれるとする、Ｓ
ｉｍｏｎｅｔら，Ｃｅｌｌ，８９，３０９−３１９（１９９７）；国際特許出願
第ＵＳ９６／２０６２１号（国際特許出願公開第９７／２３６１４号パンフレッ
ト））。肝臓でＯＰＧを過剰発現するトランスジェニックマウスは、その体循環
中に高レベルのＯＰＧタンパク質を有し、顕著に上昇した骨密度（骨化石症）を
示す。正常のマウス胚では、ＯＰＧは発育中の骨の軟骨痕跡内、小腸及び大動脈
や幾つかの主要動脈の筋肉質壁内に局在化していた。

【０００６】 骨粗しょう症の発症と心血管疾患、特に動脈の石灰化により特徴づけられる疾
患につながる症状の発現との間に強い相関関係があり、骨及び動脈壁の内部にカ
ルシウムが沈着する過程が類似していると仮定して、本発明の目的は骨粗しょう
症及び心血管疾患を同時に予防及び治療するための医薬組成物及び方法を開発す
ることである。両方の症状の予防及び治療のために単一の治療薬が開発されると
、ひどく損傷し、場合により死に至る骨折の危険性を減らすと同時に高血圧症、
虚血、心臓発作及び卒中に至る可能性のある状態を予防または緩和することによ
り、罹患患者の寿命が大きく延ばされ、生活の質が大きく改善される。

【０００７】 驚くことに、ＯＰＧノックアウト動物中のＯＰＧが減少すると、正常動物にお
ける内因性ＯＰＧ発現部位である大動脈及び腎動脈が石灰化することが知見され
た。これらの知見は、循環ＯＰＧが存在しないかまたは低レベルでしか存在しな
いときには動脈壁上のカルシウム沈着物の蓄積が大きく促進されるようにＯＰＧ
が動脈の病理学的石灰化を調節することを暗示する。（例えば、ＯＰＧを発現す
るトランスジェニックマウスの場合のように）正常またはそれより高いレベルの
ＯＰＧが存在すると、血管の石灰化を伴わない。

【０００８】 （発明の要旨） 本発明は、心血管疾患の治療または予防のための方法及び組成物に関する。前
記方法は、心血管疾患を治療または予防するのに十分な量である治療有効量のＯ
ＰＧを投与することを含む。

【０００９】 また、本発明は、心血管疾患を治療または予防するのに有用なＯＰＧ組成物に
関する。前記ＯＰＧ組成物は、通常各種投与経路に対して適した医薬的に許容さ
れ得る混合物である。

【００１０】 （図面の説明） 図１は、Ｅ１７ラット胚心臓（パネルＡ及びＢ）及び成体ラット腎動脈（パネ
ルＣ及びＤ）の凍結切片に対するＯＰＧ発現のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ション分析を示す。光学顕微鏡の下で、ＯＰＧ ｍＲＮＡの存在は大動脈で暗い
粒子として見られ、バックグラウンドはメチルグリーンで染色されている（Ａ）
。同一標本の暗視野顕微鏡で、肋骨及び大動脈で強いＯＰＧ ｍＲＮＡ発現が見
られる（Ｂ）。明視野及び暗視野顕微鏡で、やや弱いシグナルが成体ラットの腎
動脈に存在する（それぞれ、Ｃ及びＤ）。

【００１１】 図２は、Ｅ２０．５ラット胚のホルマリン固定切片に対するＯＰＧ発現のｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を示す。明視野顕微鏡で、ＯＰＧ ＲＮ
Ａの存在が大動脈に暗い粒子として見られ、バックグラウンドはヘマラムで染色
されている（パネルＡ、Ｂ及びＤ）。同一標本の暗視野顕微鏡で、強いＯＰＧ
ｍＲＮＡの発現が大動脈で見られる（パネルＣ及びＥ）。Ｅ２０．５ラット胚、
倍率１／２×、ヘマトキシリン及びエンジンで染色した切片（Ａ）；４×、Ｈ及
びＥ（Ｂ）；４×（Ｃ）；１０×、Ｈ及びＥ（Ｄ）；１０×（Ｅ）。

【００１２】 図３は、雄ＯＰＧ^−／−マウスにおける動脈石灰化を示す。ＯＰＧ^−／−マウ
ス＃２６は下行大動脈（パネルＡ）及び腎動脈（パネルＢ）に石灰化及び血管内
膜増殖を有する。ＯＰＧ^−／−マウス＃３８は大動脈球に顕著な石灰化を有する
（パネルＣ）。大きな内膜下増殖が、大動脈壁の解離及びその後の大動脈壁の層
間の空間への出血の結果である。動脈瘤の形成及び大動脈壁の解離が重篤な動脈
硬化症の一般的な合併症である。ひどい石灰化、並びに腎動脈で内膜及び内側増
殖が見られる（パネルＤ）。

【００１３】 図４は、雌ＯＰＧ^−／−マウスにおける動脈石灰化を示す。野生型マウス＃８
２の大動脈をネガティブコントロールとして示す（パネルＡ）。ＯＰＧ^−／−＃
８６マウスは腹部大動脈中に幾つかの石灰化病巣を有する（パネルＢ）。ＯＰＧ ^−／− ＃７７マウスは腹部大動脈（パネルＤ）及び複数の小さな枝（パネルＣ）
中に幾つかの石灰化病巣を有する。

【００１４】 （発明の実施の形態） ホモ接合型ＯＰＧ^−／−ノックアウトマウスは、全身Ｘ線及び組織学により分
析したとき重篤な骨粗しょう症を呈していた。ＯＰＧノックアウトマウスの骨構
造の特徴は、援用により本明細書に含まれるとする本出願人の係属中の米国特許
出願第０８／９４３，６８７号明細書に記載されている。予期せぬことに、ホモ
接合型ＯＰＧノックアウトマウスは雄も雌も大動脈及び腎動脈に著しい石灰化及
び血管内膜増殖を示すことを知見した。こうした動脈変化は、ヘテロ接合型ＯＰ
Ｇ^−／＋ノックアウトマウス、正常ＯＰＧ^＋／＋マウス、または高いＯＰＧ循環
レベルを示すトランスジェニックマウスでは見られなかった。ＯＰＧ^＋／−マウ
スは、６ヶ月令までに骨量損失を示す。これらの知見を総合的に勘案すると、Ｏ
ＰＧが動脈石灰化を予防または低下させ、アテローム性動脈硬化症の危険を少な
くする役割を有することが示された。

【００１５】 ＯＰＧポリペプチド 本発明のＯＰＧポリペプチドには、ヒトＯＰＧ、並びにＯＰＧの生物学的活性
の少なくとも１つを有するその誘導体、切形体または化学修飾体が含まれる。ヒ
トＯＰＧのアミノ酸配列は配列番号１及び配列番号２に示す通りである。ＯＰＧ
誘導体は、生じたポリペプチドがＯＰＧの生物学的活性の少なくとも１つを有す
るように１つ以上のアミノ酸が付加、欠失、挿入または置換されたポリペプチド
を指す。ＯＰＧの生物学的活性は骨代謝を含めた諸活性であるが、これらに限定
されない。１つの実施態様では、ＯＰＧポリペプチドは骨吸収防止活性を有する
。別の実施態様では、ＯＰＧポリペプチドは動脈壁の石灰化を低下または解消す
る活性を有する。

【００１６】 ＯＰＧポリペプチドは、２１アミノ酸を除去したアミノ末端リーダー配列を有
する成熟ＯＰＧポリペプチドである。ポリペプチドは配列番号１に示す残基２２
−４０１を含み、その誘導体はＯＰＧのアミノ酸残基１８０−４０１の一部もし
くは全部の欠失またはカルボキシ末端切形；残基１８０−４０１における１個以
上のアミノ酸の変化；ＯＰＧの富システインドメインの一部もしくは全部の欠失
、特に遠位（カルボキシ末端）富システインドメインの欠失；及び富システイン
ドメイン、特に遠位（カルボキシ末端）富システインドメインにおける１個以上
のアミノ酸の変化を有する。１つの実施態様では、ＯＰＧはカルボキシ末端から
最高約２１６アミノ酸を欠失したものである。別の実施態様では、ＯＰＧは成熟
アミノ末端（ここで、成熟アミノ末端は残基２２にある）から最高約１０アミノ
酸を欠失し、任意にカルボキシ末端から最高約２１６アミノ酸を欠失したもので
ある。

【００１７】 本発明に包含される別のＯＰＧポリペプチドには、ヒト［２２−１８０］−Ｆ
ｃ融合物、ヒト［２２−２０１］−Ｆｃ融合物、ヒト［２２−４０１］−Ｆｃ融
合物、ヒト［２２−１８５］−Ｆｃ融合物及びヒト［２２−１９４］−Ｆｃ融合
物が含まれる。これらのポリペプチドは哺乳動物宿主細胞、例えばＣＨＯまたは
２９３細胞において産生される。本発明に包含される、原核宿主細胞において発
現される別のＯＰＧポリペプチドには、ヒトｍｅｔ［２２−４０１］、ｍｅｔ−
Ｆｃ−ヒト［２２−４０１］融合物（Ｆｃ領域は完全長ＯＰＧコーディング配列
のアミノ末端で融合している）、ヒトｍｅｔ［２２−４０１］−Ｆｃ融合物（Ｆ
ｃ領域は完全長ＯＰＧ配列のカルボキシ末端で融合している）、ｍｅｔ−Ｆｃ−
ヒト［２２−２０１］融合物、ヒトｍｅｔ［２２−２０１］−Ｆｃ融合物、ｍｅ
ｔ−Ｆｃ−ヒト［２２−１９４］、ヒトｍｅｔ［２２−１９４］−Ｆｃ、ヒトｍ
ｅｔ［２７−４０１］、ヒトｍｅｔ［２２−１８５］、ヒトｍｅｔ［２２−１８
９］、ヒトｍｅｔ［２２−１９４］、ヒトｍｅｔ［２２−１９４］（Ｐ２５Ａ）
、ヒトｍｅｔ［２２−１９４］（Ｐ２６Ａ）、ヒトｍｅｔ［２７−１８５］、ヒ
トｍｅｔ［２７−１８９］、ヒトｍｅｔ［２７−１９４］、ヒトｍｅｔ−ａｒｇ
−ｇｌｙ−ｓｅｒ−（ｈｉｓ）_６［２２−４０１］、ヒトｍｅｔ−ｌｙｓ［２２
−４０１］、ヒトｍｅｔ−（ｌｙｓ）_３−［２２−４０１］、ヒトｍｅｔ［２２
−４０１］−Ｆｃ（Ｐ２５Ａ）、ヒトｍｅｔ［２２−４０１］（Ｐ２５Ａ）、ヒ
トｍｅｔ［２２−４０１］（Ｐ２６Ａ）、ヒトｍｅｔ［２２−４０１］（Ｐ２６
Ｄ）が含まれる。原核宿主細胞において産生される上記ＯＰＧポリペプチドは、
アミノ末端残基が示されていない場合にはメチオニン残基を有すると理解される
。特定実施例では、ＯＰＧ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｅｌｌｉｓｏｎら（Ｎｕ
ｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０，４０７１−４０７９（１９８２））に記載さ
れている配列を有するヒトＩｇＧ_１−γ１の２２７アミノ酸領域を用いて産生さ
れた。しかしながら、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の変異体も使用され得る。

【００１８】 ヒトＩｇＧ_１のＦｃ領域に融合したカルボキシ末端ＯＰＧ切形体の生物学的活
性の分析から、約１６４アミノ酸のＯＰＧの一部が活性に必要であることが示さ
れる。この領域には、（好ましくは、配列番号１中の）アミノ酸２２−１８５を
含み、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）細胞外ドメインの富システインドメイン
に特徴的な４つの富システインドメインを有する。

【００１９】 ＯＰＧ及びＴＮＦＲファミリーのメンバーの富システインドメイン間のホモロ
ジーを用いて、ＯＰＧの三次元モデルをＴＮＦＲ−Ｉの細胞外ドメインの公知の
結晶構造に基づいて作成した（国際特許出願公開第９７／２３６１４号パンフレ
ット参照）。このモデルを使用して、生物学的活性にとって重要であり得るＯＰ
Ｇ内のシステイン残基を同定した。４つの富システインドメインの構造の維持に
関与するシステイン残基が同定された。上記モデルにおいて次のジスルフィド結
合が同定された。ドメイン１：ｃｙｓ４１−ｃｙｓ５４、ｃｙｓ４４−ｃｙｓ６
２、ｔｙｒ２３及びｈｉｓ６６はこのドメインの構造を安定化するように作用し
得る。ドメイン２：ｃｙｓ６５−ｃｙｓ８０、ｃｙｓ８３−ｃｙｓ９８、ｃｙｓ
８７−ｃｙｓ１０５。ドメイン３：ｃｙｓ１０７−ｃｙｓ１１８、ｃｙｓ１２４
−ｃｙｓ１４２。ドメイン４：ｃｙｓ１４５−ｃｙｓ１６０、ｃｙｓ１６６−ｃ
ｙｓ１８５。国際特許出願公開第９７／２３６１４号パンフレットの図１１及び
図１２Ａ〜１２Ｂに示されているＴＮＦβに近接している残基も同定された。こ
のモデルでは、ＯＰＧが対応リガンドに結合することが推定される。ＴＮＦβを
、ＯＰＧとそのリガンドとの相互作用を刺激するためのモデルリガンドとして使
用した。このモデルに基づいて、ＯＰＧ中のｇｌｕ３４、ｌｙｓ４３、ｐｒｏ６
６−ｇｌｎ９１（特に、ｐｒｏ６６、ｈｉｓ６８、ｔｙｒ６９、ｔｙｒ７０、ｔ
ｈｒ７１、ａｓｐ７２、ｓｅｒ７３、ｈｉｓ７６、ｓｅｒ７７、ａｓｐ７８、ｇ
ｌｕ７９、ｌｅｕ８１、ｔｙｒ８２、ｐｒｏ８５、ｖａｌ８６、ｌｙｓ８８、ｇ
ｌｕ９０及びｇｌｎ９１）、ｇｌｕ１５３及びｓｅｒ１５５がリガンド結合のた
めに重要であり得る。

【００２０】 上記したアミノ酸残基を単独でまた組合せて変化させると、ＯＰＧの生物学的
活性を変更することができる。例えば、特定のシステイン残基が変化すると個々
の富システインドメインの構造が変更され得、リガンド結合のために重要な残基
を変化させるとＯＰＧとリガンドの物理的相互作用が影響され得る。構造モデル
は、より望ましい特性、例えば高い生物学的活性、高い安定性または製剤化の高
い容易性を有するアナログを同定するのを助け得る。

【００２１】 ＯＰＧポリペプチドの修飾も本発明に包含され、この中には翻訳後修飾（例え
ば、Ｎ−結合またはＯ−結合炭水化物鎖、Ｎ−末端またはＣ−末端のプロセシン
グ）、アミノ酸骨格に対する化学物質の結合、Ｎ−結合またはＯ−結合炭水化物
鎖の化学的修飾、及び原核宿主細胞の発現の結果としてのＮ−末端メチオニン残
基の付加が含まれる。前記ポリペプチドをタンパク質を検出及び単離できるよう
に検出可能な標識、例えば酵素標識、蛍光標識、放射標識またはアフィニフィー
標識で修飾してもよい。

【００２２】 ＯＰＧの更なる修飾物には、ＯＰＧが異種アミノ酸配列に融合しているＯＰＧ
キメラまたは融合タンパク質が含まれる。異種配列は、生じた融合タンパク質が
ＯＰＧの活性を保持し得る任意の配列であり得る。異種配列には、例えばタンパ
ク質の精製を助け得る免疫グロブリン融合物（例えば、Ｆｃ融合物）が含まれる
。ＯＰＧモノマーが結合してダイマー、トリマーまたは他の高次マルチマーが形
成されるのを促進する異種配列が好ましい。

【００２３】 １つの実施態様では、ＯＰＧキメラタンパク質は、切形ＯＰＧポリペプチドと
ヒトＩｇＧのＦｃ領域との融合を含む。ＯＰＧの切形はアミノ及び／またはカル
ボキシ末端で起こり得、好ましくは残基４０１のカルボキシ末端から最高約２１
６アミノ酸が切形されることが好ましい。Ｆｃ領域に対する融合は、Ｆｃのカル
ボキシ末端とＯＰＧ切形ポリペプチドのアミノ末端の間で起こり得るか、または
Ｆｃ領域のアミノ末端とＯＰＧ切形ポリペプチドのカルボキシ末端の間で起こり
得る。Ｆｃ領域に融合した切形ＯＰＧポリペプチドの例には、配列番号１に示し
たような残基２２−１８５、２２−１８９、２２−１９４または２２−２０１、
或いはその変異体が含まれる。

【００２４】 本発明のポリペプチドは、ＯＰＧを発現する組織、細胞系、または形質転換宿
主細胞中に存在する他のポリペプチドから単離、精製され、または分泌タンパク
質を含む細胞培養物中の成分から精製される。１つの実施態様で、ポリペプチド
は他のヒトタンパク質との結合物、例えば細菌宿主細胞の発現産物を含まない。

【００２５】 また、本発明により、ポリペプチドの安定性及び循環時間の増加または免疫原
性の低下のような追加利点を与え得るＯＰＧの化学修飾した誘導体も提供される
（米国特許第４，１７９，３３７号明細書参照）。誘導化のための化学物質は、
ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマ
ー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等のよ
うな水溶性ポリマーから選択され得る。前記ポリペプチドは、分子内の無作為位
置または分子内の所定位置で修飾され得、１、２、３またはそれ以上の結合した
化学物質を含み得る。

【００２６】 前記ポリマーは、任意の分子量を有し得、分枝もしくは直鎖であり得る。ポリ
エチレングリコールの場合、取扱い及び製造の容易さの点で好ましい分子量は約
１〜約１００ｋＤａ（用語「約」は、ポリエチレングリコールの製造時に数個の
分子は指定の分子量よりも多いかもしくは少ない重量を有することを指す）であ
る。所望の治療プロフィール（例えば、所望の徐放期間、ある場合には生物学的
活性に対する影響、取扱いの容易さ、抗原性の程度または有無、ポリエチレング
リコールの治療タンパク質またはアナログに対する他の公知の影響）に依存して
、他のサイズを使用してもよい。

【００２７】 ポリエチレングリコール分子（または、他の化学物質）は、タンパク質の機能
性または抗原性ドメインに対する影響を考慮してタンパク質に結合させなければ
ならない。当業者が利用し得る結合方法は多数あり、例えば援用により本明細書
に含まれるとする欧州特許出願公開第４０１ ３８４号明細書（ＰＥＧのＧ−Ｃ
ＳＦへのカップリング）を参照されたい。また、（塩化トレシルを用いるＧＭ−
ＣＳＦのペグ化を報告している）Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２ ０ ，１０２８−１０３５（１９９２）も参照されたい。例えば、ポリエチレング
リコールは、反応性基、例えば遊離アミノまたはカルボキシル基を介してアミノ
酸残基に共有結合させ得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子が
結合し得る基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リシン残基及び
Ｎ−末端アミノ酸残基が含まれ得る。遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基
には、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基及びＣ−末端アミノ酸残基が含ま
れ得る。スルフヒドリル基も、ポリエチレングリコール分子を結合するための反
応性基として使用され得る。治療目的では、アミノ基での結合、例えばＮ−末端
またはリシン基での結合が好ましい。

【００２８】 本発明はまた、アミノ末端で選択的に化学修飾したＯＰＧも提供する。本発明
の組成物の例としてポリエチレングリコールを使用する場合、各種ポリエチレン
グリコール分子（分子量、分枝等により）、反応混合物中のポリエチレングリコ
ール分子対タンパク質（または、ペプチド）分子の比率、実施するペグ化反応の
種類、及び特定のＮ−末端ペグ化タンパク質の入手方法から選択され得る。Ｎ−
末端ペグ化物の入手方法（すなわち、所要により、この部分を他のモノペグ化物
質から分離する方法）は、ペグ化タンパク質分子の集団からのＮ−末端ペグ化物
質の精製による。選択的Ｎ−末端化学的修飾は、特定タンパク質における誘導化
のために利用可能な各種１級アミノ基（リシン対Ｎ−末端）の異なる反応性を利
用する還元アルキル化により実施され得る。適当な反応条件の下で、Ｎ−末端で
タンパク質のカルボニル含有ポリマーによる実質的に選択的な誘導化が達成され
る。

【００２９】 本発明はまた、ＯＰＧモノマーからなるＯＰＧマルチマーをも提供する。ＯＰ
Ｇは、マルチマー（例えば、ダイマー、トリマー、または高次マルチマー）とし
て活性であると見られる。好ましくは、ＯＰＧマルチマーはダイマーまたはトリ
マーである。ＯＰＧマルチマーは、マルチマーの形成を促進するのに十分なＯＰ
Ｇのアミノ酸配列を有するモノマーからなり得るか、または抗体Ｆｃ領域のよう
な異種配列を有するモノマーからなり得る。ＯＰＧのカルボキシ末端欠失の分析
から、領域１８６−４０１の少なくとも一部がＯＰＧポリペプチドの結合に関与
することが示唆される。ＯＰＧアミノ酸１８６−４０１の領域の一部または全部
の自己結合し得るアミノ酸配列による置換も本発明に包含される。或いは、ＯＰ
Ｇポリペプチドまたはその誘導体を、鎖間ジスルフィド結合を形成すべく不対シ
ステイン残基を作製するための部位特異的突然変異誘発により、紫外光に曝すよ
うな光化学架橋により、または二官能性ポリエチレングリコール等のような二官
能性リンカー分子を用いて化学的に架橋することにより修飾して、ダイマーまた
はマルチマーを形成し得る。１つの実施態様で、ＯＰＧマルチマーは、ＯＰＧモ
ノマーの結合の大部分が結合基での修飾を介して生ずるように領域１８６−４０
１の一部または全部を欠くＯＰＧモノマーを共有結合することにより形成される
。

【００３０】 ＯＰＧマルチマーは、各種の化学架橋方法により作製され得る。ＯＰＧモノマ
ーは、ＯＰＧの生物学的活性を保持または高める任意の方法で化学的に結合され
得る。タンパク質ダイマーの所望する特性に応じて各種化学架橋剤を使用するこ
とができる。例えば、架橋剤は短くて比較的剛性であっても、または長くて可撓
性であってもよく、生物学的に可逆性でもよく、より低い免疫原性またはより長
い薬物動態的半減期を付与し得る。

【００３１】 ＯＰＧ分子は、該ＯＰＧをアミノ末端で化学的に修飾して保護チオールを導入
し、この保護チオールを精製後脱保護して、各種架橋剤を用いる第２ＯＰＧ分子
との部位特異的結合のための結合点として使用する２段階方法によりアミノ末端
を介して結合される。アミノ末端架橋には、ジスルフィド結合、短鎖二官能性脂
肪族架橋剤を用いるチオエーテル結合、及び異なる長さの二官能性ポリエチレン
グリコール架橋剤（ＰＥＧ「ダンベル」）に対するチオエーテル結合が含まれる
が、これらに限定されない。ＯＰＧダイマーのＰＥＧダンベル合成には、「モノ
ベル」と称される前記合成の副生成物も包含される。ＯＰＧモノベルは、遊離ポ
リマー末端を有する線状二官能性ＰＥＧにカップリングしたモノマーから構成さ
れる。或いは、ＯＰＧは、ジエチレントリアミンペンタ酢酸二無水物（ＤＴＰＡ
）、ｐ−ベンゾキノン（ｐＢＱ）またはビス（スルホスクシンイミジル）スベレ
ート（ＢＳ^３）等の試薬や当業界で公知の他の物質を含む各種のアミン特異的ホ
モ二官能性架橋方法により直接架橋され得る。１段階方法で、各種の二官能性チ
オール特異的架橋剤（例えば、ＰＥＧビスマレイミド）の存在下でイミノチオラ
ンのような試薬を用いてＯＰＧを直接チオール化し、ダイマー化及び／またはダ
ンベルを達成することが可能である。

【００３２】 ＯＰＧマルチマーは、長さの異なるペプチドを用いてＯＰＧモノマーを結合す
ることにより形成され得る。前記ペプチドは、ＯＰＧモノマー間の可変性リンカ
ーとして働くようにアミノ酸配列及び組成を有するように選択される。ペプチド
リンカーは、頭−頭様式（Ｎ−末端に対してＮ−末端、またはＣ−末端に対して
Ｃ−末端）または頭−尾様式（Ｎ−末端に対してＣ−末端）でモノマーを連結し
得る。ペプチドリンカーは、好ましくは約１５−６０アミノ酸の長さを有する。

【００３３】 天然ソースまたはトランスフェクトした宿主細胞からＯＰＧを精製する方法も
包含される。前記精製方法は、精製タンパク質を得るために１つ以上の標準タン
パク質精製ステップを適当な順序で使用し得る。クロマトグラフィーステップに
は、イオン交換、ゲル濾過、疎水性相互作用、逆相、クロマトフォーカシング、
抗−ＯＰＧ抗体またはビオチン−ストレプトアビジンアフィニティー複合体等を
用いるアフィニティークロマトグラフィーが含まれ得る。

【００３４】 核酸 本発明のＯＰＧポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。前記核酸分
子は、 ａ）配列番号１に示す核酸配列またはその相補鎖、 ｂ）緊縮条件下で配列番号１中のポリペプチドコーディング領域とハイブリダイ
ズする核酸、及び ｃ）上記ａ）及びｂ）の配列に縮重される核酸配列 から選択される。

【００３５】 ハイブリダイゼーションのための条件は、通常、５×ＳＳＣ、５０％ホルムア
ミド及び４２℃のような高緊縮であるか、または塩濃度、有機溶媒濃度及び温度
を調節することにより容易に得ることができる均等の条件である。例えば、均等
緊縮条件は、有機溶媒を省略し、ハイブリダイゼーションまたは洗浄ステップの
温度を（５０〜６５℃の範囲に）上昇させ、塩濃度を（１〜０．２×ＳＳＣの範
囲に）低下させることにより使用することができる。核酸に対するハイブリダイ
ゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュア
ル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、第２版、ニューヨーク州コー
ルドスプリングハーバーに所在のＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）発行に詳細に記載されている。

【００３６】 本発明のハイブリッド核酸の長さは、ハイブリダイゼーションが配列番号１に
示すポリペプチドコーディング領域の一部または全部において起こり得、隣接す
る非コーディング領域でも起こり得るので異なり得る。ハイブリッド核酸の長さ
は、配列番号１に示す相補配列に比して短かったり長かったりする。配列番号１
にハイブリダイズする切形または延長核酸は、骨吸収防止活性や動脈石灰化に対
する保護のようなＯＰＧの生物学的性質の１つ以上を保持し得る。ハイブリッド
核酸は、ＯＰＧコーディング領域に対して５’及び／または３’にある隣接する
非コーディング領域をも含み得る。前記非コーディング領域は、ＯＰＧ発現に関
与する調節領域、例えばプロモーター、エンハンサー、翻訳開始部位、転写停止
部位等を含む。

【００３７】 本発明により、配列番号１に示す核酸配列を有する誘導体も提供される。本明
細書中、誘導体は、生じた配列が付加、欠失、挿入または置換された１つ以上の
アミノ酸残基を有するポリペプチドをコードし、生じたポリペプチドが骨吸収活
性または動脈石灰化に対する保護のようなＯＰＧ活性を有するように１つ以上の
残基が付加、置換、挿入または欠失を有する核酸配列を含む。核酸誘導体は、ス
プライス変異または多形性によるように天然に存在し得、または当業者が利用し
得る部位特異的突然変異誘発技術を用いて構築され得る。ＯＰＧの天然に存在す
る変異体の１例が、リーダー配列内の残基３におけるｌｙｓのａｓｎへの置換を
コードする核酸である（国際特許出願公開第９７／２３６１４号パンフレット）
。核酸誘導体が生物学的活性を破壊しそうにない分子の領域におけるアミノ酸変
化をコードすることが考えられる。

【００３８】 １つの実施態様において、ＯＰＧ誘導体には、カルボキシ末端から１個以上の
アミノ酸を欠失させた完全長ＯＰＧ（完全長ＯＰＧは配列番号１の残基２２−４
０１を含む）の切形体をコードする核酸が含まれる。ＯＰＧをコードする核酸は
、カルボキシ末端から最高約２１６アミノ酸を欠失させたものであり得る。場合
により、抗体Ｆｃ領域が生物学的に活性なＯＰＧ−Ｆｃ融合ポリペプチドを生ず
るように新しいカルボキシ末端から延びていても、またはＦｃ領域が切形ＯＰＧ
のアミノ末端から延びていてもよい。好ましい実施態様では、核酸は、残基２２
−１８５、２２−１８９、２２−１９４または２２−２０１（配列番号１のナン
バリングを用いて）からのアミノ酸配列を有するＯＰＧをコードし、任意にヒト
ＩｇＧのＦｃ領域をコードする。

【００３９】 １個以上のアミノ酸をアミノ末端から欠失させたＯＰＧの切形体をコードする
核酸も包含される。切形体には、リーダー配列を含む２１アミノ酸の一部または
全部を欠くものが含まれる。成熟ＯＰＧは、２１アミノ酸リーダー配列の全部を
欠く。更に、本発明は、（残基２２における）成熟アミノ末端から１−１０アミ
ノ酸を欠失させ、任意に（残基４０１における）カルボキシ末端から１−２１６
アミノ酸を欠失させたＯＰＧをコードする核酸を提供する。場合により、核酸は
アミノ末端のメチオニン残基をコードし得る。

【００４０】 本発明の核酸の例には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びＲＮＡが含
まれる。ｃＤＮＡは、ＯＰＧを発現する各種組織から単離したｍＲＮＡから作製
したライブラリーから得られる。ヒトにおいて、ＯＰＧのための組織ソースには
腎臓、肝臓、胎盤及び心臓が含まれる。ＯＰＧをコードするゲノムＤＮＡは、各
種業者から市販されているゲノムライブラリーから得られる。合成ＤＮＡは、重
複オリゴヌクレオチド断片を化学的に合成し、その後断片を組立ててコーディン
グ領域及びフランキング配列の一部または全部を再構築することにより得られる
（インターフェロン遺伝子の化学合成を記載している米国特許第４，６９５，６
２３号明細書参照）。ＲＮＡは、ｍＲＮＡの高レベル合成を指向する原核発現ベ
クター、例えばＴ７プロモーター及びＲＮＡポリメラーゼを用いるベクターによ
り最も簡単に得られる。

【００４１】 ベクター及び宿主細胞 ＯＰＧをコードする核酸配列を含む発現ベクター、前記ベクターで形質転換し
た宿主細胞、及びＯＰＧの産生方法も本発明により提供される。組換えタンパク
質の発現は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）発行に概説
されている。

【００４２】 ＯＰＧ産生のための宿主細胞には、原核宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、植物
、昆虫及び哺乳動物宿主細胞が含まれる。ＨＢ１０１またはＪＭ１０１のような
大腸菌株が発現に適している。好ましい哺乳動物宿主細胞には、ＣＯＳ、ＣＨＯ
ｄ−、２９３、ＣＶ−１、３Ｔ３、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞等が含ま
れる。ＯＰＧ活性のために翻訳後修飾、例えばグリコシル化やポリペプチドプロ
セシングが重要であるときには哺乳動物宿主細胞が好ましい。哺乳動物発現によ
り分泌ポリペプチドが産生され、該ポリペプチドは増殖培地から回収され得る。

【００４３】 ＯＰＧ発現用ベクターは、少なくともベクターの増殖及びクローン化挿入物の
発現に必要な配列を含む。これらの配列は、複製起源、選択マーカー、プロモー
ター、リボソーム結合部位、エンハンサー配列、ＲＮＡスプライス部位及び転写
停止部位を含む。上記した宿主細胞における発現に好適なベクターは容易に入手
可能であり、本発明の核酸は標準の組換えＤＮＡ技術を用いてベクターに挿入さ
れる。ＯＰＧの組織特異的発現のためのベクターも含まれる。前記ベクターには
、マウスにおける産生のために肝臓、腎臓または他の臓器において特異的に機能
するプロモーター及び標的ヒト細胞におけるＯＰＧ発現のためのウイルスベクタ
ーが含まれる。

【００４４】 適当な宿主−ベクター系を用いて、ＯＰＧは、ＯＰＧが産生する条件下でＯＰ
Ｇをコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞を培
養し、発現産物を単離することにより組換え的に産生される。ＯＰＧはトランス
フェクトした哺乳動物細胞の上清中または形質転換した細菌宿主細胞の封入体中
に産生される。こうして産生されたＯＰＧは、以下に記載するような当業界で公
知の手順により精製され得る。哺乳動物または細菌宿主系におけるＯＰＧの発現
は、国際特許出願公開第９７／２３６１４号パンフレットに記載されている。哺
乳動物宿主に対する発現ベクターとして、国際特許出願公開第９０／１４３６３
号パンフレットに記載されているｐＤＳＲαのようなプラスミドが例示される。
細菌宿主細胞に対する発現ベクターとして、国際特許出願公開第９７／２３６１
４号パンフレットに記載されているプラスミドｐＡＭＧ２１及びｐＡＭＧ２２−
Ｈｉｓが例示される。特定プラスミド及び宿主細胞は例示にすぎず、他の入手可
能なプラスミド及び宿主細胞もポリペプチドを発現するために使用され得る。

【００４５】 本発明は、生体内または生体外組換え技術による内因性核酸からのＯＰＧの発
現をも提供する。１つの方法は、内因性遺伝子からまたは宿主ゲノム中に存在す
るかまたは外因性配列を導入して作製されるその変異体遺伝子からＯＰＧを発現
させ得る外因性調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）を導入す
ることにより通常サイレントな内因性ＯＰＧ遺伝子を活性化することを含む。典
型的には、外因性配列は宿主ゲノムと相同的組換えし得るベクター上に有する。
更に、ＯＰＧを産生し得る内因性または外因性調節配列は、転写及び／または翻
訳のための特定の活性化または刺激因子に接触したときにＯＰＧを発現するよう
に活性化または刺激され得る。

【００４６】 ＯＰＧ医薬組成物 ＯＰＧ医薬組成物は、通常、治療有効量のＯＰＧタンパク質産物を１つ以上の
医薬的且つ生理学的に許容され得る製剤化成分と混合して含む。好適な製剤化成
分には、抗酸化剤、保存剤、着色剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、懸濁剤、溶
媒、充填剤、増量剤、緩衝液、デリバリービヒクル、希釈剤、賦形剤及び／また
は医薬助剤が含まれるが、これらに限定されない。例えば、好適なビヒクルは、
注射用水、生理食塩液、または非経口投与用組成物中に通常含まれる他の物質で
あり得る。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水も別のビヒク
ルとして例示される。

【００４７】 ビヒクル中の主要溶媒は水でも水以外でもよい。更に、前記ビヒクルは、ｐＨ
、オスモル濃度、粘度、透明性、色、無菌性、安定性、溶解速度または製剤の臭
いを調節または維持するために他の医薬的に許容され得る賦形剤を含み得る。ま
た、前記ビヒクルは、ＯＰＧの安定性、溶解速度、または放出速度を調節または
維持するために更に別の医薬的に許容され得る賦形剤を含み得る。こうした賦形
剤は、１回投与剤型または複数回投与剤型で非経口投与するための剤型を製剤化
するために慣用されている物質である。

【００４８】 治療用組成物は、製剤化されたなら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固
体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保存され得る。前
記製剤は、直ぐに使用できる形態かまたは投与前に再構成する必要のある形態、
例えば凍結乾燥した形態で保存され得る。

【００４９】 最適の医薬製剤は、投与経路及び所望用量に応じて当業者により容易に決定さ
れ得る。例えば、援用により本明細書に含まれるとするペンシルバニア州イース
トンに所在のＭａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０）発行のＲｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１
８版、１４３５〜１７１２頁参照。

【００５０】 他の有効な投与剤型、例えば非経口徐放製剤、吸入ミスト、経口的に活性な製
剤または座剤も考えられる。１つの実施態様で、ＯＰＧ医薬組成物は、非経口投
与用に製剤化される。この非経口投与される治療用組成物は、通常、医薬的に許
容され得るビヒクル中にＯＰＧを含む発熱物質非含有の非経口的に許容され得る
水溶液の形態である。１つの好ましいビヒクルは生理食塩液である。

【００５１】 ＯＰＧを徐放及び／またはデリバリーするための組成物は、溶解性または安定
性を改善するために上記した水溶性ポリマーで修飾したＯＰＧポリペプチドを含
む。組成物は、長期間に亘り制御的にデリバリーするためにリポソーム、マイク
ロエマルション、ミセルまたは小胞にＯＰＧを配合したものであり得る。具体的
には、ＯＰＧ組成物は、ＯＰＧをヒドロゲル、シリコーン、ポリエチレン、エチ
レン−酢酸ビニルコポリマーまたは生分解性ポリマーのようなポリマーマトリッ
クスに配合したものであり得る。ヒドロゲルの例には、ポリヒドロキシアルキル
メタクリレート（ｐ−ＨＥＭＡ）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド
、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール及び各種高分子電解質複合体が
含まれる。生分解性ポリマーの例には、ポリ酢酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸
（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡのコポリマー、ポリアミド、及びポリアミドとポリ
エステルのコポリマーが含まれる。他の制御放出組成物には、注射により投与さ
れ得るマイクロカプセル、ミクロスフィア、高分子複合体及びポリマービーズが
含まれる。ヒアルロン酸も使用可能であり、これは循環中徐放期間を延長する効
果を有し得る。前記組成物は、本発明タンパク質及び誘導体の物理的状態、安定
性、インビボでの放出速度及びインビボでのクリアランス速度に影響を与え得る
。

【００５２】 ＯＰＧを含有する特定組成物を経口投与することも意図される。経口投与され
るＯＰＧはカプセルに封入され得、固体剤型を作製する際に通常使用される担体
を任意に使用して製剤化され得る。前記カプセルは、バイオアベイラビリティー
が最大になり、前全身(pre-systemic)分解が最小になったときに胃腸管のある場
所に製剤の活性部分が放出されるように設計され得る。吸収を促進するために別
の賦形剤を配合してもよい。希釈剤、矯臭矯味剤、低融点ワックス、植物油、滑
剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤及び結合剤を使用することもできる。

【００５３】 ＯＰＧの投与 ＯＰＧポリペプチドは、皮下、筋肉内、静脈内、経肺または経皮ルートにより
非経口的に投与され得る。所望量のＯＰＧを投与するために、１日に数回投与す
るかまたはより低頻度で投与され得る。投与頻度は、製剤化したときのＯＰＧポ
リペプチドの薬物動態学的パラメーター及び投与ルートに依存する。

【００５４】 投与方法に関係なく、特定用量は通常体重または体表面積に基づいて計算され
る。上記した各製剤を用いる治療のために適切な用量を決定するために必要な更
に細かい計算は、当業者により日常的に、特に本明細書に記載されている用量の
情報及びアッセイを参照して実施されている。適切な用量は、使用する用量を決
定するための確立されたアッセイ及び適切な用量−応答データを用いて確定され
得る。特定状態の治療方法に関与する最終投与レジメは、薬物の作用を変更する
各種要因、例えば患者の年令，状態，体重，性別及び食事、病気の重篤度、投与
時間及び他の臨床要因を考慮して担当医により決定され得る。１つの実施態様で
は、Ｆｃ領域のカルボキシ末端が切形ＯＰＧポリペプチドのアミノ末端残基に結
合しているＦｃ−ＯＰＧ融合タンパク質（例えば、Fｃ−ＯＰＧ［２２−１９４
］）の用量は、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。

【００５５】 ＯＰＧをコードする核酸配列、その誘導体またはＯＰＧキメラタンパク質を患
者に直接導入するインビボのＯＰＧ遺伝子治療も考えられる。例えば、ＯＰＧポ
リペプチドをコードする核酸配列を、任意に適当なデリバリービヒクル（例えば
、アデノ関連ウィルスベクター）を含む核酸構築物を局所投与することにより標
的細胞に導入する。他のウィルスベクターには、レトロウィルス、アデノウィル
ス、単純ヘルペスウィルス及びパピローマウィルスベクターが含まれるが、これ
らに限定されない。所望の核酸構築物または所望の核酸配列を含む他の適当なデ
リバリービヒクルの局所注入、リポソーム媒介導入、直接注入（裸のＤＮＡ）、
受容体媒介導入（リガンド−ＤＮＡ複合体）または微粒子衝撃（遺伝子銃）によ
りインビボで物理的に導入され得る。

【００５６】 アテローム性動脈硬化症は多くの変性動脈疾患を引き起こし、動脈壁の石灰化
は通常臨床的に明らかな病巣で生ずる。動脈の狭窄及び閉塞が前記疾患の最も一
般的な特徴であるが、動脈壁の強度はエラスチン及びコラーゲンの損失からも弱
められ得る。動脈が閉塞されると、解離、動脈瘤、虚血、血栓症、及び急性及び
慢性心疾患などが生じる。多くの場合、外科手術または血管形成術が必要であり
、前記手術は有効であるが、必ず侵襲性であり、他の動脈部位の閉塞を防止せず
、場合により元の部位を再び処置しなければならないことがある（例えば、再狭
窄の場合）。

【００５７】 ＯＰＧは、アテローム性動脈硬化症やメンケベルク動脈硬化症（内側石灰性硬
化症）、及び動脈石灰化により特徴づけられる他の症状を予防または治療するた
めに使用され得る。ＯＰＧは、単独でまたはアテローム性動脈硬化症を治療する
ための他の薬物、例えば降圧薬及びコレステロール低下薬と一緒に投与され得る
。降圧薬には、利尿剤、α−アドレナリン遮断薬、β−アドレナリン遮断薬、カ
ルシウム遮断薬、アンギオテンシン変換酵素阻害剤及び血管拡張剤が含まれる。
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールのレベルを低下させるコレステ
ロール低下薬には、胆汁酸封鎖剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、フィブ
リン酸誘導体及びニコチン酸が含まれる。ＯＰＧを心血管効果を発揮し得る吸収
防止剤、例えばホルモン（エストロゲン）、ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体、
並びに選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）（例えば、ラロキ
シフェン（ＥＶＩＳＴＡ））と一緒に投与してもよい。更に、ＯＰＧを外科手術
及び血管形成術、例えば動脈プロテアーゼ及びバルーン血管形成術と一緒に投与
してもよい。

【００５８】 本発明は、下記実施例を参照することにより更に深く理解されるであろう。こ
れらの実施例は決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。

【００５９】 実施例１ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより分析したＯＰＧ発現 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験のための胚及び組織の作製及びＯ
ＰＧ ｍＲＮＡレベルを検出するための放射能標識したオリゴヌクレオチドプロ
ーブの作製は、上掲したＳｉｍｏｎｅｔらに既に記載されている。１８．５日令
マウス胚の大動脈の初期部分における高レベルのＯＰＧ ｍＲＮＡの局在化を図
１Ａ〜１Ｄに示す。生体ラットにおけるＯＰＧ発現は、図２Ａ〜２Ｅに示すよう
に腎動脈の平滑筋壁でも見られる。

【００６０】 実施例２ ＯＰＧノックアウトマウスの作製 マウスゲノムに対してＯＰＧ配列を標的するためのベクターの構築及び前記ベ
クターのマウス胚への導入を含めたＯＰＧノックアウトマウスの作製方法は、援
用により本明細書に含まれるとする本出願人の係属中の米国特許出願第０８／９
４３，６８７号明細書に記載されている。

【００６１】 実施例３ ＯＰＧノックアウトマウスの表現型分析 ホモ接合型ＯＰＧノックアウトマウス（ＯＰＧ^−／−）、ヘテロ接合型ノック
アウトマウス（ＯＰＧ^−／＋）及び対照マウス（ＯＰＧ^＋／＋）の群を、ｅ１８
、並びに生後７日、１４日、６０日及び１８０日に剖検した。おおまかに切開す
る前に、Ｘ線撮影を実施した。マウスからの血清を臨床化学的及び血清学的に分
析した。全身及び腫瘍臓器の重量を測定し、ホルマリンに固定した。

【００６２】 剖検を受けたマウスを表１に要約する。

【００６３】

【表１】

【００６４】 （黒四角） ＯＰＧ^−／−マウス１−２６は、同腹仔の中で最も小さいもので
あり、正常マウスの約半分のサイズしか有していなかった。計画通り屠殺する直
ぐ前に瀕死状態になり、死亡した。死亡する直前に呼吸不全の兆候を示した。血
清学及び血清化学分析用血液を死亡直後に心臓穿刺により採取し、定期的に剖検
を実施した。

【００６５】 （黒三角） ＯＰＧ^−／−マウス１−３８は、手順用作成においてＯＰＧ^{−／ −} マウス１−２７と１つのケージに入れ、屠殺前の１時間以内に死亡した。試験
のために血液を採取しなかった。剖検の残りを通常通り実施し、臓器を組織学の
ために摘出した。

【００６６】 ＯＰＧノックアウトマウスにおける骨形態、組織及び密度並びに組織学的及び
血清化学的パラメータの分析及び結果は、本出願人の係属中の米国特許第０８／
９４３，６８７号明細書に報告されている。

【００６７】 ３匹の雄ＯＰＧ^−／−マウスのうち２匹は動脈変化を有していた。マウス＃２
６の心臓では、広範囲に重大な心内膜下石灰症が存在していた。大動脈（図３Ａ
）及び腎動脈（図３Ｂ）で血管内膜増殖及び石灰化が検出され得た。ＯＰＧ^{＋／ ＋} 群で血清カルシウムが１１対８．８±０．１７に上昇した。ＯＰＧ^−／−マウ
ス＃３８は、大動脈（図３Ｃ）の初期部分及び腎動脈（図３Ｄ）で血管内膜の増
殖及び内膜下慢性肉芽組織を有していた。血清カルシウム値は利用され得なかっ
た。

【００６８】 ３匹の雌ＯＰＧ^−／−マウスのうち２匹は、大動脈及び腎動脈（図４Ｂ、４Ｃ
及び４Ｄ）で石灰化及び血管内膜増殖を有していた。血清カルシウム値は正常範
囲内であった。骨粗しょう症を示した第３の雌ＯＰＧ^−／−マウスは、正常カル
シウムレベルを有しており、動脈変化を有していなかった。

【００６９】 本発明を好ましい実施態様に基づいて説明してきたが、当業者は変更及び修飾
を加えることを理解される。従って、添付した請求の範囲は本発明の範囲内の均
等な変更のすべてを包含すると考えられる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｅ１７ラット胚心臓及び成体ラット腎動脈の凍結切片に対するＯＰＧ発現のｉ
ｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を示す。

【図２】 Ｅ２０．５ラット胚のホルマリン固定切片に対するＯＰＧ発現のｉｎ ｓｉｔ
ｕハイブリダイゼーション分析を示す。

【図３】 雄ＯＰＧ^−／−マウスにおける動脈石灰化を示す。

【図４】 雌ＯＰＧ^−１−マウスにおける動脈石灰化を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/51 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 サロシ，イルデコ アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、 ニユーバリイ・パーク、ノース・ベンツ・ パーク・ロード・ナンバー・139・587・エ フ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA13 BA36 DB01 DC50 NA14 ZA361 ZA421 ZA451 ZC031 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 MA02 NA14 ZA36 ZA42 ZA45 ZC03 4H045 AA10 AA30 BA41 CA40 DA50 DA75 EA24

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 心血管疾患の治療または予防方法であって、その治療を要す
   る患者に対して治療有効量のオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）を医薬組成物の形
   態で投与することを特徴とする前記方法。
2. 【請求項２】 心血管疾患がアテローム性動脈硬化症またはメンケベルク動
   脈硬化症に関連することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
3. 【請求項３】 更に、治療有効量の降圧薬を投与することを特徴とする請求
   の範囲第１項に記載の方法。
4. 【請求項４】 更に、治療有効量のコレステロール低下薬を投与することを
   特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 オステオプロテゲリンを、心血管疾患の発症前、それと同時
   またはその後に投与することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
6. 【請求項６】 オステオプロテゲリンを、外科手術または血管形成術と一緒
   に投与することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 更に、エストロゲン、ビタミンＤ化合物及び選択的エストロ
   ゲン受容体モジュレーターからなる群から選択される吸収防止剤を投与すること
   を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
8. 【請求項８】 オステオプロテゲリンが切形ＯＰＧポリペプチドであること
   を特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
9. 【請求項９】 切形ポリペプチドが配列番号２に示すカルボキシ末端から最
   高約２１６アミノ酸を欠失させたものであることを特徴とする請求の範囲第８項
   に記載の方法。
10. 【請求項１０】 オステオプロテゲリンが、切形ＯＰＧポリペプチドをヒト
    ＩｇＧ由来のＦｃ領域に融合してなるキメラポリペプチドからなることを特徴と
    する請求の範囲第１項に記載の方法。
11. 【請求項１１】 Ｆｃ領域のカルボキシ末端が切形ＯＰＧポリペプチドのア
    ミノ末端に融合していることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の方法。
12. 【請求項１２】 Ｆｃ領域のアミノ末端が切形ＯＰＧポリペプチドのカルボ
    キシ末端に融合していることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
13. 【請求項１３】 切形ＯＰＧポリペプチドが共有結合マルチマーであること
    を特徴とする請求の範囲第９項に記載の方法。
14. 【請求項１４】 切形ＯＰＧポリペプチドが配列番号２に示す残基２２−１
    ８５、２２−１８９、２２−１９４または２２−２０１を含むことを特徴とする
    請求の範囲第１１項または第１２項に記載の方法。
15. 【請求項１５】 オステオプロテゲリンが配列番号２に示す残基２２−４０
    １を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
16. 【請求項１６】 治療有効量のオステオプロテゲリンをコードする核酸を医
    薬組成物の形態で治療を要する患者に対して投与することを特徴とする請求の範
    囲第１項に記載の方法。