JP2002505856A - 細胞の分析用迅速制御レーザー溶解 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
単一細胞（４６）またはその細胞成分の迅速溶解が、細胞（４６）またはその細胞成分が静置されている媒体中でショック波を発生させることによって実施される。細胞（４６）またはその細胞成分は、処理操作による外傷を最小限にするために、レーザーピンセットによって静置されているか、または付着細胞またはその細胞成分として培養されている。開示の方法では、細胞（４６）またはその細胞成分は制御可能な態様でミリ秒未満で完全に溶解され、その直後に分析物の分離と検出のために細胞内容物はキャピラリー（２２）にロードされる。細胞（４６）またはその細胞成分は、電気泳動カラム（２２）の吸入口の近傍にあり、電気泳動カラムを通って媒体の重力サイフォン流が維持されている。細胞（４６）またはその細胞成分の溶解内容物は、３３ミリ秒未満で電気泳動カラム（２２）に入り、分離されて蛍光検出装置（４２）によって分析される。本方法は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（１８）から発する高度に集中させたレーザーパルスによって生じるショック波を利用する。ショック波は、細胞（４６）またはその細胞成分の近傍で媒体中で発生する。開示の実施態様では、細胞チェンバーのガラスと緩衝液の境界または境界近くのスライドにレーザーパルスを集中させる。溶解されるべき細胞（４６）またはその細胞成分は細胞チェンバー中で培養されている。
Description
【０００１】 本発明は、細胞の生化学分析および生物医学分析領域における分析化学分野に
関し、具体的にはレーザー顕微手術装置および、単一の細胞または選択した細胞
の制御溶解とそれに続く化学的分析に供する当該細胞成分の全てまたは選択部分
の採集のために１秒未満で実施される方法に関する。
関し、具体的にはレーザー顕微手術装置および、単一の細胞または選択した細胞
の制御溶解とそれに続く化学的分析に供する当該細胞成分の全てまたは選択部分
の採集のために１秒未満で実施される方法に関する。
【０００２】
単一の細胞の研究によって、生物学的プロセスの理解の劇的な進歩が可能にな
った。生物体の個々の細胞を対象とした研究は、最近の光学的および化学的方法
の技術的進歩を利用してきた。単一細胞および細胞内構造物を操作するレーザー
技術は単一細胞における外科的操作の実施を可能にした。今では、超鋭敏化学分
析法が単一細胞の生化学的研究に用いられている。そのような単一細胞の研究か
ら得られた新しい情報が医療および産業に既に用いられている。単一細胞を操作
および分析する技術は、生物医学研究、薬剤の発見、疾病の診断および医療のよ
うな分野で重要な役割を果たすであろう。
った。生物体の個々の細胞を対象とした研究は、最近の光学的および化学的方法
の技術的進歩を利用してきた。単一細胞および細胞内構造物を操作するレーザー
技術は単一細胞における外科的操作の実施を可能にした。今では、超鋭敏化学分
析法が単一細胞の生化学的研究に用いられている。そのような単一細胞の研究か
ら得られた新しい情報が医療および産業に既に用いられている。単一細胞を操作
および分析する技術は、生物医学研究、薬剤の発見、疾病の診断および医療のよ
うな分野で重要な役割を果たすであろう。
【０００３】 過去１０年間は、分析化学者のツールが生細胞の生化学的研究に利用されてい
た。例えば、非哺乳類種の単一ニューロン細胞が、キャピラリー電気泳動を用い
て分析されていた。これらのニューロン神経節細胞のサイズは大きいので、細胞
内容の測定が可能であった。典型的にはこれらの細胞は、直径が約０．１から０
．２ｍｍである。従来技術では、キャピラリーの末端の鉛はエッチングによって
先端が微細となるよう加工され、細胞または破壊された細胞のフラグメントから
細胞質をサンプリングするために用いられる。細胞質の内容物はキャピラリー内
で分離され、さらに測定系に連結したまま、または測定系から切り離して検出が
実施される。
た。例えば、非哺乳類種の単一ニューロン細胞が、キャピラリー電気泳動を用い
て分析されていた。これらのニューロン神経節細胞のサイズは大きいので、細胞
内容の測定が可能であった。典型的にはこれらの細胞は、直径が約０．１から０
．２ｍｍである。従来技術では、キャピラリーの末端の鉛はエッチングによって
先端が微細となるよう加工され、細胞または破壊された細胞のフラグメントから
細胞質をサンプリングするために用いられる。細胞質の内容物はキャピラリー内
で分離され、さらに測定系に連結したまま、または測定系から切り離して検出が
実施される。
【０００４】 直径が１０から１５ミクロンの範囲にある小さな哺乳類の細胞の場合には、１
つの完全な細胞をキャピラリーにロードし、続いて低浸透圧緩衝液または洗剤含
有緩衝液で細胞を溶解させる。細胞内容物はキャピラリー内で分離され、さらに
種々の方法（例えばレーザー誘発蛍光または電気化学的検出）によって検出され
る。しかしながら、細胞の溶解とは、それが発生する時間または持続時間につい
て容易に制御できるものではない。哺乳類の細胞に関する測定の場合、測定技術
の時間的解決および完全な溶解の前に細胞を攪乱することの影響は考慮されるべ
き重要な問題である。本明細書では、溶解は、細胞内容物の少なくとも一部分の
遊離を伴う細胞質膜の少なくとも一部分の破壊と規定される。細胞を溶解する態
様では、進行している生化学的反応を停止させるために必要な時間を制御する。
すなわち溶解の態様は生物学的測定の時間的問題を制御するものである。さらに
また、溶解の態様はサンプリング時に起こっている細胞性プロセスに影響を与え
るであろう。多くの生物学的事象は秒単位またはそれより速く発生する。酵素は
典型的には１秒当たり１千から１万のターンオーバー数を有する。代謝物濃度は
１秒で１０倍以上変化する。そのような細胞特性を正確に分析技術によって測定
するためには、完全な溶解が、被験パラメーターの変化速度に比較して迅速に行
われることが要求される。細胞膜の破壊速度が遅すぎる場合は、当該パラメータ
ーの顕著な変化がまさに細胞の溶解時に発生し、実際の細胞の生理学的状態を不
正確に観察することになる。
つの完全な細胞をキャピラリーにロードし、続いて低浸透圧緩衝液または洗剤含
有緩衝液で細胞を溶解させる。細胞内容物はキャピラリー内で分離され、さらに
種々の方法（例えばレーザー誘発蛍光または電気化学的検出）によって検出され
る。しかしながら、細胞の溶解とは、それが発生する時間または持続時間につい
て容易に制御できるものではない。哺乳類の細胞に関する測定の場合、測定技術
の時間的解決および完全な溶解の前に細胞を攪乱することの影響は考慮されるべ
き重要な問題である。本明細書では、溶解は、細胞内容物の少なくとも一部分の
遊離を伴う細胞質膜の少なくとも一部分の破壊と規定される。細胞を溶解する態
様では、進行している生化学的反応を停止させるために必要な時間を制御する。
すなわち溶解の態様は生物学的測定の時間的問題を制御するものである。さらに
また、溶解の態様はサンプリング時に起こっている細胞性プロセスに影響を与え
るであろう。多くの生物学的事象は秒単位またはそれより速く発生する。酵素は
典型的には１秒当たり１千から１万のターンオーバー数を有する。代謝物濃度は
１秒で１０倍以上変化する。そのような細胞特性を正確に分析技術によって測定
するためには、完全な溶解が、被験パラメーターの変化速度に比較して迅速に行
われることが要求される。細胞膜の破壊速度が遅すぎる場合は、当該パラメータ
ーの顕著な変化がまさに細胞の溶解時に発生し、実際の細胞の生理学的状態を不
正確に観察することになる。
【０００５】 さらに、溶解時の膜の透過性獲得は、細胞外イオン（例えばカルシウム（Ｃａ
２＋))の流入をもたらし、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼおよびヌク
レアーゼを含む多くの酵素を活性化させる。細胞膜破壊後でさえ、生化学的プロ
セスは、反応を停止させるまで、すなわち反応物の分離または分子の変性によっ
て停止させるまで進行を続けるであろう。したがって、多くの細胞学的プロセス
を正確に測定するためには、完全な溶解をミリ秒またはそれより速く実施する必
要がある。従来の化学的溶解はどのようにしても、効果的な細胞分析を可能にす
る制御性を有する速度を提供することは不可能である。
２＋))の流入をもたらし、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼおよびヌク
レアーゼを含む多くの酵素を活性化させる。細胞膜破壊後でさえ、生化学的プロ
セスは、反応を停止させるまで、すなわち反応物の分離または分子の変性によっ
て停止させるまで進行を続けるであろう。したがって、多くの細胞学的プロセス
を正確に測定するためには、完全な溶解をミリ秒またはそれより速く実施する必
要がある。従来の化学的溶解はどのようにしても、効果的な細胞分析を可能にす
る制御性を有する速度を提供することは不可能である。
【０００６】 完全細胞の測定を実施する際に重要な別の問題は、サンプル抽出前に細胞を操
作することによってもたらされる影響である。キャピラリー電気泳動を用いる非
付着性または遊離浮遊細胞の研究では、細胞をキャピラリーの吸入口に細胞を移
動させるために電気浸透圧流を用いる場合は細胞、したがって測定されるべきプ
ロセスに影響を与えるであろう。電場が及ぼす細胞学的影響に関する多くの文献
が存在する。残念ながら、ほとんどの文献は静電場よりもむしろＡＣを強調し、
その結果、細胞生理学に対する低いＤＣ電場強度の影響は十分に特性が調べられ
ていない。しかしながら、何らかの影響があることは疑いの余地がない。
作することによってもたらされる影響である。キャピラリー電気泳動を用いる非
付着性または遊離浮遊細胞の研究では、細胞をキャピラリーの吸入口に細胞を移
動させるために電気浸透圧流を用いる場合は細胞、したがって測定されるべきプ
ロセスに影響を与えるであろう。電場が及ぼす細胞学的影響に関する多くの文献
が存在する。残念ながら、ほとんどの文献は静電場よりもむしろＡＣを強調し、
その結果、細胞生理学に対する低いＤＣ電場強度の影響は十分に特性が調べられ
ていない。しかしながら、何らかの影響があることは疑いの余地がない。
【０００７】 １〜２ｋＶ／ｃｍの規模の勾配を有する電場を適用した場合、細胞膜の透過性
が誘発される（電気穿孔としてしられている現象）。１〜２ｋＶ／ｃｍより低い
、すなわち４００Ｖ／ｃｍの規模の電位勾配（キャピラリー電気泳動で通常用い
られる）は、細胞生理に対して重要な作用を有する。５ミリ秒の持続時間で１６
７Ｖ／ｃｍの電場強度の場合、細胞透過性が局所的に増大し、カルシウムイオン
（Ｃａ２＋）の同時流入が示された。そのようなカルシウムイオン流入は、生化
学的測定に影響を及ぼす多くの細胞プロセスを活性化させる。 細胞をキャピラリー中に移動させるために、研究者らは１０Ｖ／ｃｍから３０
０Ｖ／ｃｍの間の電位勾配を用いて電気浸透圧流を誘発した。１０〜２０Ｖ／ｃ
ｍの範囲の電位勾配はおそらく細胞生理学を攪乱しないであろうが、より高い電
場強度ではおそらく攪乱されるであろう。
が誘発される（電気穿孔としてしられている現象）。１〜２ｋＶ／ｃｍより低い
、すなわち４００Ｖ／ｃｍの規模の電位勾配（キャピラリー電気泳動で通常用い
られる）は、細胞生理に対して重要な作用を有する。５ミリ秒の持続時間で１６
７Ｖ／ｃｍの電場強度の場合、細胞透過性が局所的に増大し、カルシウムイオン
（Ｃａ２＋）の同時流入が示された。そのようなカルシウムイオン流入は、生化
学的測定に影響を及ぼす多くの細胞プロセスを活性化させる。 細胞をキャピラリー中に移動させるために、研究者らは１０Ｖ／ｃｍから３０
０Ｖ／ｃｍの間の電位勾配を用いて電気浸透圧流を誘発した。１０〜２０Ｖ／ｃ
ｍの範囲の電位勾配はおそらく細胞生理学を攪乱しないであろうが、より高い電
場強度ではおそらく攪乱されるであろう。
【０００８】 基礎体（例えばガラススライドまたはピペット）に付着する付着性細胞は、最
初にそれらを結合基礎体から除去せずに電気浸透圧流または水圧流によって操作
することは困難である。しかしながら、そのような除去によって誘発される機械
的ストレスは多様な細胞反応を引き起こすであろう。ほとんど全ての細胞がその
表面に豊富な粘着蛋白質を発現している。フォーカルアドヘッションとして知ら
れる構造は、細胞骨格と細胞外マトリックスとの間に構造的結合を提供する。フ
ォーカルアドヘッションはインテグリンおよび他の蛋白質から成り、これらは多
様な細胞内シグナルトランスダクション経路と連係している。機械的ストレスは
これらの膜成分を介して作用して、チロシンキナーゼ、セリン／スレオニンキナ
ーゼ、Ｇ−蛋白質、プロテアーゼおよび他の酵素を含む多数の酵素を活性化させ
る。これらの経路の活性化は、細胞生理学の即時変化および長期の変化の引き金
となる。このような理由で、サンプル抽出時前の機械的操作（特に付着細胞の場
合）は細胞の生化学的測定を妨げる。
初にそれらを結合基礎体から除去せずに電気浸透圧流または水圧流によって操作
することは困難である。しかしながら、そのような除去によって誘発される機械
的ストレスは多様な細胞反応を引き起こすであろう。ほとんど全ての細胞がその
表面に豊富な粘着蛋白質を発現している。フォーカルアドヘッションとして知ら
れる構造は、細胞骨格と細胞外マトリックスとの間に構造的結合を提供する。フ
ォーカルアドヘッションはインテグリンおよび他の蛋白質から成り、これらは多
様な細胞内シグナルトランスダクション経路と連係している。機械的ストレスは
これらの膜成分を介して作用して、チロシンキナーゼ、セリン／スレオニンキナ
ーゼ、Ｇ−蛋白質、プロテアーゼおよび他の酵素を含む多数の酵素を活性化させ
る。これらの経路の活性化は、細胞生理学の即時変化および長期の変化の引き金
となる。このような理由で、サンプル抽出時前の機械的操作（特に付着細胞の場
合）は細胞の生化学的測定を妨げる。
【０００９】 必要とされているものは、時間と場所の両方に関して制御可能で、さらに溶解
およびそれに続く細胞内容物の分析装置（例えば分析物の分離と検出のためのキ
ャピラリー）へのローディングの前に当該細胞の生理に影響を及ぼさない態様で
あって、ミリ秒またはそれより短時間で単一細胞を完全に、または少なくとも部
分的に溶解させる方法である。
およびそれに続く細胞内容物の分析装置（例えば分析物の分離と検出のためのキ
ャピラリー）へのローディングの前に当該細胞の生理に影響を及ぼさない態様で
あって、ミリ秒またはそれより短時間で単一細胞を完全に、または少なくとも部
分的に溶解させる方法である。
【００１０】
本発明は、複数の細胞またはその細胞成分の少なくとも１つを媒体中で制御選
択する工程を含む、選択した細胞またはその細胞成分の内容物を溶解および分析
する方法である。選択した細胞または細胞成分は、媒体中または細胞から少し離
れた基礎体もしくはガラス表面でレーザーによって発生したショック波により破
壊または溶解される。この細胞または細胞成分の内容物の少なくとも一部分を採
集する。続いて採集した内容物を分析する。開示の実施態様では、細胞または細
胞成分の内容物は細胞溶解から１秒以内またはそれより短い時間で採集される。
これは細胞が生きているときは非常に有用で、その結果、溶解のまさにその時の
細胞の状態で生物学的反応物を分析できる。実際、細胞溶解から３３ミリ秒以内
またはそれより短い時間で内容物が採集され、しかも採集は細胞または細胞成分
に穴を開けるかまたは開口させる時間分だけ遅くなるだけであると考えられ、こ
の時間は、数マイクロ秒または細胞溶解から１〜１０マイクロ秒の範囲であると
考えられる。結果として、細胞の生化学的活性の破壊と細胞内容物の反応停止と
の間の時間は最小限にとどめられ、溶解直前の細胞内容物の非常に正確な像が得
られる。しかしながら、本発明は、死細胞の溶解または破壊のような他の用途に
も同様に適用できる。この場合は溶解と反応の停止との間の時間は重要ではない
。
択する工程を含む、選択した細胞またはその細胞成分の内容物を溶解および分析
する方法である。選択した細胞または細胞成分は、媒体中または細胞から少し離
れた基礎体もしくはガラス表面でレーザーによって発生したショック波により破
壊または溶解される。この細胞または細胞成分の内容物の少なくとも一部分を採
集する。続いて採集した内容物を分析する。開示の実施態様では、細胞または細
胞成分の内容物は細胞溶解から１秒以内またはそれより短い時間で採集される。
これは細胞が生きているときは非常に有用で、その結果、溶解のまさにその時の
細胞の状態で生物学的反応物を分析できる。実際、細胞溶解から３３ミリ秒以内
またはそれより短い時間で内容物が採集され、しかも採集は細胞または細胞成分
に穴を開けるかまたは開口させる時間分だけ遅くなるだけであると考えられ、こ
の時間は、数マイクロ秒または細胞溶解から１〜１０マイクロ秒の範囲であると
考えられる。結果として、細胞の生化学的活性の破壊と細胞内容物の反応停止と
の間の時間は最小限にとどめられ、溶解直前の細胞内容物の非常に正確な像が得
られる。しかしながら、本発明は、死細胞の溶解または破壊のような他の用途に
も同様に適用できる。この場合は溶解と反応の停止との間の時間は重要ではない
。
【００１１】 複数の細胞または細胞成分の少なくとも１つを制御選択する工程は、選択され
る細胞または細胞成分の位置を特定し決定する工程を含む。特定した細胞または
細胞成分を、レーザービームの焦点および採集吸入口近くの場所に移動させるか
、または、レーザービームの焦点および採集吸入口の位置を特定した細胞または
成分の近くに移動させる。媒体中の選択細胞またはその細胞成分を制御配置する
方法の１つは、媒体の少なくとも近傍に配置した基礎体に細胞またはその細胞成
分を付着させる工程を含む。
る細胞または細胞成分の位置を特定し決定する工程を含む。特定した細胞または
細胞成分を、レーザービームの焦点および採集吸入口近くの場所に移動させるか
、または、レーザービームの焦点および採集吸入口の位置を特定した細胞または
成分の近くに移動させる。媒体中の選択細胞またはその細胞成分を制御配置する
方法の１つは、媒体の少なくとも近傍に配置した基礎体に細胞またはその細胞成
分を付着させる工程を含む。
【００１２】 細胞または細胞成分が自由に浮遊している場合に別の実施態様で述べる媒体中
で選択細胞または細胞成分を制御配置する工程は、媒体中のある位置に存在する
細胞または細胞成分をレーザーマイクロビーム光学ピンセットによって一時的に
保持するか、または媒体中のある位置の細胞または細胞成分に機械的極微マニピ
ュレーターを接着させることによって当該細胞または細胞成分を一時的に保持す
る工程を含む。細胞または細胞成分は、吸引によってまたは電気的もしくは化学
的接着の手段によって、ピペットもしくはマイクロピペットに付着させることが
できる。
で選択細胞または細胞成分を制御配置する工程は、媒体中のある位置に存在する
細胞または細胞成分をレーザーマイクロビーム光学ピンセットによって一時的に
保持するか、または媒体中のある位置の細胞または細胞成分に機械的極微マニピ
ュレーターを接着させることによって当該細胞または細胞成分を一時的に保持す
る工程を含む。細胞または細胞成分は、吸引によってまたは電気的もしくは化学
的接着の手段によって、ピペットもしくはマイクロピペットに付着させることが
できる。
【００１３】 この工程は人的制御下でまたは自動化ソフトウェア制御によって実施できる。
例えば、パターン認識ソフトを備えたコンピュータに連結したビデオシステムに
よって、または操作者によって、分析装置の吸入口に隣接する標的ゾーン内の視
野を視覚的にモニターする。標的細胞が標的ゾーン内に適切に配置され、所望の
標的として特定されたとき、ショック波を生じるレーザーパルスを発生させる。
このショック波によって細胞は溶解され、続いて直ちに分析装置に採集される。 さらにまた、自由に浮遊する細胞または細胞成分は、例えば分析装置への吸入
口のような限定区画内に細胞または細胞成分を配置することによって、または細
胞が配置される区画枠を保持することによって、媒体中に制御配置することがで
きる。
例えば、パターン認識ソフトを備えたコンピュータに連結したビデオシステムに
よって、または操作者によって、分析装置の吸入口に隣接する標的ゾーン内の視
野を視覚的にモニターする。標的細胞が標的ゾーン内に適切に配置され、所望の
標的として特定されたとき、ショック波を生じるレーザーパルスを発生させる。
このショック波によって細胞は溶解され、続いて直ちに分析装置に採集される。 さらにまた、自由に浮遊する細胞または細胞成分は、例えば分析装置への吸入
口のような限定区画内に細胞または細胞成分を配置することによって、または細
胞が配置される区画枠を保持することによって、媒体中に制御配置することがで
きる。
【００１４】 さらに細胞またはその細胞成分の内容物の少なくとも一部分を採集する工程は
、破壊された選択細胞またはその細胞成分の生化学的反応物の反応を停止させて
、ほぼ破壊時に存在していた状態で生化学的反応物のその後の分析を可能にする
工程を含む。開示の実施態様では、破壊細胞または細胞成分の内容物を分析装置
中で採集する工程は、電気泳動カラムで細胞または細胞成分を採集する工程を含
む。採集された内容物は電気泳動によって分離され、レーザー誘発蛍光を用いて
分析される。
、破壊された選択細胞またはその細胞成分の生化学的反応物の反応を停止させて
、ほぼ破壊時に存在していた状態で生化学的反応物のその後の分析を可能にする
工程を含む。開示の実施態様では、破壊細胞または細胞成分の内容物を分析装置
中で採集する工程は、電気泳動カラムで細胞または細胞成分を採集する工程を含
む。採集された内容物は電気泳動によって分離され、レーザー誘発蛍光を用いて
分析される。
【００１５】 実施態様の１つでは、選択細胞または細胞成分をレーザー発生ショック波によ
って媒体中で破壊する工程は、パルスレーザービームを細胞または細胞成分に近
接する位置に集中させ（しかし細胞および細胞成分に集中させない）、続いてシ
ョック波を発生させる工程を含む。
って媒体中で破壊する工程は、パルスレーザービームを細胞または細胞成分に近
接する位置に集中させ（しかし細胞および細胞成分に集中させない）、続いてシ
ョック波を発生させる工程を含む。
【００１６】 また別の実施態様では、細胞または細胞成分内またはそれらの上に直接パルス
レーザービームを集中させる。パルスレーザービームは細胞または細胞成分内の
開口部を限定し、それらから細胞質の内容物のみを入手する。開示の実施態様で
は、破壊細胞またはその細胞成分の内容物の少なくとも一部分を分析装置で採集
する工程は、媒体の流動流手段、特に媒体のサイフォン流動流手段による。採集
はまた、媒体中での電気泳動手段、内容物に衝突したショック波から生じる力、
および電気的浸透力の手段によって実施できる。
レーザービームを集中させる。パルスレーザービームは細胞または細胞成分内の
開口部を限定し、それらから細胞質の内容物のみを入手する。開示の実施態様で
は、破壊細胞またはその細胞成分の内容物の少なくとも一部分を分析装置で採集
する工程は、媒体の流動流手段、特に媒体のサイフォン流動流手段による。採集
はまた、媒体中での電気泳動手段、内容物に衝突したショック波から生じる力、
および電気的浸透力の手段によって実施できる。
【００１７】 また別には本発明は、複数の細胞またはその細胞成分の１つの内容物の溶解お
よび分析のための装置を規定し、本装置は、細胞またはその細胞成分の少なくと
も１つを制御選択する細胞選択装置を含む。レーザーはパルスを発生して、選択
細胞または細胞成分を溶解または破壊する。分析装置は内容物を分析するために
提供される。採集装置は、溶解細胞または細胞成分の内容物の少なくとも一部分
を捕捉するかまたは分析装置に送る。採集装置は、溶解細胞または細胞成分の内
容物の少なくとも一部分を、細胞または細胞成分が溶解してから１秒以内に分析
装置に送る。生細胞に用いられる場合は、溶解細胞または細胞成分の内容物は、
細胞または細胞成分の溶解から３３ミリ秒以内、おそらくは細胞または細胞成分
の溶解から１〜１０マイクロ秒以内に分析装置に送られる。
よび分析のための装置を規定し、本装置は、細胞またはその細胞成分の少なくと
も１つを制御選択する細胞選択装置を含む。レーザーはパルスを発生して、選択
細胞または細胞成分を溶解または破壊する。分析装置は内容物を分析するために
提供される。採集装置は、溶解細胞または細胞成分の内容物の少なくとも一部分
を捕捉するかまたは分析装置に送る。採集装置は、溶解細胞または細胞成分の内
容物の少なくとも一部分を、細胞または細胞成分が溶解してから１秒以内に分析
装置に送る。生細胞に用いられる場合は、溶解細胞または細胞成分の内容物は、
細胞または細胞成分の溶解から３３ミリ秒以内、おそらくは細胞または細胞成分
の溶解から１〜１０マイクロ秒以内に分析装置に送られる。
【００１８】 分析装置は、いずれの化学的、電気的または電気化学的微量分析装置または手
法でもよく、例えば内容物についてポリメラーゼ連鎖反応を実施する手段、ゲル
もしくはキャピラリー電気泳動カラムのような分析分子の分離手段、およびゲル
読み取り装置もしくはレーザー誘発蛍光検出装置のような分離分析物の検出用手
段でもよい。
法でもよく、例えば内容物についてポリメラーゼ連鎖反応を実施する手段、ゲル
もしくはキャピラリー電気泳動カラムのような分析分子の分離手段、およびゲル
読み取り装置もしくはレーザー誘発蛍光検出装置のような分離分析物の検出用手
段でもよい。
【００１９】 本発明はまた、複数の細胞のまたはその細胞成分の１つの内容物の迅速な溶解
および分析方法を規定する。本方法は、複数細胞またはその細胞成分の少なくと
も１つをピペットの吸入口の近くに相対配置することによって、複数細胞または
その細胞成分の少なくとも１つを制御選択する工程を含む。選択細胞またその細
胞成分はレーザーによって発生するパルスにより溶解される。溶解細胞または細
胞成分の内容物の少なくとも一部分は、溶解から１秒以内にその後の分析のため
にピペットに採集される。溶解後の内容物中の更なる実質的な生物学的反応は一
切停止される。 これまで要約してきた本発明およびその多様な実施態様は図面によってより一
層理解できるであろう。図面では同様な要素は同様な数字によって引用されてい
る。
および分析方法を規定する。本方法は、複数細胞またはその細胞成分の少なくと
も１つをピペットの吸入口の近くに相対配置することによって、複数細胞または
その細胞成分の少なくとも１つを制御選択する工程を含む。選択細胞またその細
胞成分はレーザーによって発生するパルスにより溶解される。溶解細胞または細
胞成分の内容物の少なくとも一部分は、溶解から１秒以内にその後の分析のため
にピペットに採集される。溶解後の内容物中の更なる実質的な生物学的反応は一
切停止される。 これまで要約してきた本発明およびその多様な実施態様は図面によってより一
層理解できるであろう。図面では同様な要素は同様な数字によって引用されてい
る。
【００２０】
本発明およびその多様な実施態様は、以下の好ましい実施態様の詳細な説明に
よって理解されるであろう。 本方法は、ただ１つの細胞を制御的態様でミリ秒またはそれより短い時間で完
全に溶解し、その直後に分析物の分離および検出のためにキャピラリーにロード
する。この方法は、細胞の近傍の媒体中で発生させた高度に集中的なレーザーパ
ルスによって生じたショック波を利用する。レーザーはまた、（ａ）細胞近傍の
ガラススライドに、（ｂ）ガラススライド上に置いた基礎体に、（ｃ）ガラスス
ライドもしくは基礎体の境界面の液体に、または（ｄ）細胞が自由に浮遊してい
るかまたは光学ピンセットで保持されている場合には標的細胞の近傍の液体に集
中させることができる。開示の実施態様では、レーザーパルスは、溶解されるべ
き細胞を培養または付着させた細胞チェンバーのガラスと緩衝液の境界または境
界近くのガラス基礎体に集中される。例えば細胞内容物のほんの一部分を取り出
すために細胞質に穴を開けたい場合には、レーザーパルスは他の場所、例えば細
胞壁または細胞膜上に集中させるか、または細胞チェンバー中の細胞周辺の液体
の任意の場所に集中させることができる。
よって理解されるであろう。 本方法は、ただ１つの細胞を制御的態様でミリ秒またはそれより短い時間で完
全に溶解し、その直後に分析物の分離および検出のためにキャピラリーにロード
する。この方法は、細胞の近傍の媒体中で発生させた高度に集中的なレーザーパ
ルスによって生じたショック波を利用する。レーザーはまた、（ａ）細胞近傍の
ガラススライドに、（ｂ）ガラススライド上に置いた基礎体に、（ｃ）ガラスス
ライドもしくは基礎体の境界面の液体に、または（ｄ）細胞が自由に浮遊してい
るかまたは光学ピンセットで保持されている場合には標的細胞の近傍の液体に集
中させることができる。開示の実施態様では、レーザーパルスは、溶解されるべ
き細胞を培養または付着させた細胞チェンバーのガラスと緩衝液の境界または境
界近くのガラス基礎体に集中される。例えば細胞内容物のほんの一部分を取り出
すために細胞質に穴を開けたい場合には、レーザーパルスは他の場所、例えば細
胞壁または細胞膜上に集中させるか、または細胞チェンバー中の細胞周辺の液体
の任意の場所に集中させることができる。
【００２１】 開示の実施態様では、局所的プラズマ発生のために５ナノ秒のレーザーパルス
が用いられる。焦点でのプラズマ発生は、近くの流動媒体中にキャビテーション
気泡を生じると考えられている。このキャビテーション気泡の拡散と崩壊が、２
０００ｍ／秒に達する速度の超音波または近超音波ショック波を発生させる。直
径が２０ミクロンの細胞の場合、そのようなショック波は細胞を１０ナノ秒で通
過する。したがって、焦点から２０ミクロン離れた細胞の場合、溶解に必要な全
エネルギーは、レーザーパルスによるショック波の開始後、約２５ナノ秒以内で
細胞に送られるかまたは突き当たる。細胞は、数マイクロ秒、すなわち１〜１０
マイクロ秒と考えられる時間の反応で破裂または溶解する。ショック波と細胞と
の相互反応は急速に細胞膜を破壊し、それによって迅速に細胞内容物を遊離させ
る。プラズマおよびそのキャビテーション気泡発生の物理学は明瞭には理解され
ていないが、キャビテーション気泡を生じる局所的プラズマの発生に固有の電子
の雪崩が存在すると考えられている。開示の実施態様にはまた、集中レーザービ
ームによって発生する他の機械的ストレスおよび光学的に誘発される損傷が含ま
れる（これらはプラズマに付随しないかもしれない）。
が用いられる。焦点でのプラズマ発生は、近くの流動媒体中にキャビテーション
気泡を生じると考えられている。このキャビテーション気泡の拡散と崩壊が、２
０００ｍ／秒に達する速度の超音波または近超音波ショック波を発生させる。直
径が２０ミクロンの細胞の場合、そのようなショック波は細胞を１０ナノ秒で通
過する。したがって、焦点から２０ミクロン離れた細胞の場合、溶解に必要な全
エネルギーは、レーザーパルスによるショック波の開始後、約２５ナノ秒以内で
細胞に送られるかまたは突き当たる。細胞は、数マイクロ秒、すなわち１〜１０
マイクロ秒と考えられる時間の反応で破裂または溶解する。ショック波と細胞と
の相互反応は急速に細胞膜を破壊し、それによって迅速に細胞内容物を遊離させ
る。プラズマおよびそのキャビテーション気泡発生の物理学は明瞭には理解され
ていないが、キャビテーション気泡を生じる局所的プラズマの発生に固有の電子
の雪崩が存在すると考えられている。開示の実施態様にはまた、集中レーザービ
ームによって発生する他の機械的ストレスおよび光学的に誘発される損傷が含ま
れる（これらはプラズマに付随しないかもしれない）。
【００２２】 図１Ａは、キャピラリー電気泳動による分析と組み合わせて、細胞の迅速制御
溶解を実施するシステムの実施態様の模式図である。同等の機能を実施するため
に、現在知られている多くの成分または将来考案される多くの成分によって図１
Ａのシステムを代替できることは理解されるところである。例えば、開示の実施
態様は電気泳動カラムでの分析物のレーザー誘発蛍光による検出を意図するが、
分析物を検出または分析できるいずれの測定装置または検出メカニズムも使用で
きる。
溶解を実施するシステムの実施態様の模式図である。同等の機能を実施するため
に、現在知られている多くの成分または将来考案される多くの成分によって図１
Ａのシステムを代替できることは理解されるところである。例えば、開示の実施
態様は電気泳動カラムでの分析物のレーザー誘発蛍光による検出を意図するが、
分析物を検出または分析できるいずれの測定装置または検出メカニズムも使用で
きる。
【００２３】 一般に参照番号１０で示されるシステムは顕微鏡１２を含み、これはＣＲＴス
クリーン１６に表示されるか、またはビデオテープレコーダーもしくはデジタル
レコーダー（図には示されていない）に記録されるビデオ映像読み出し装置１４
を含む。特に下記で詳述するように、自動化細胞処理および分析のためのコンピ
ュータシステムにおける画像およびパターンのプロセッシングのデジタル保存は
、本発明の範囲内に包含されるものとして特に意図される。ＣＣＤビデオカメラ
システム１４、１６は、細胞４６の明視野画像を３３ミリ秒毎にリアルタイムで
記録した。溶解はレーザーパルス後の細胞の外観で判定された。ほとんどの場合
、細胞膜は完全に破壊され、図２Ｃに示すようにカバースリップ３６に付着した
膜の残骸のみが後に残され、細胞の内容物は細胞の直ぐ近傍に浮遊していた。
クリーン１６に表示されるか、またはビデオテープレコーダーもしくはデジタル
レコーダー（図には示されていない）に記録されるビデオ映像読み出し装置１４
を含む。特に下記で詳述するように、自動化細胞処理および分析のためのコンピ
ュータシステムにおける画像およびパターンのプロセッシングのデジタル保存は
、本発明の範囲内に包含されるものとして特に意図される。ＣＣＤビデオカメラ
システム１４、１６は、細胞４６の明視野画像を３３ミリ秒毎にリアルタイムで
記録した。溶解はレーザーパルス後の細胞の外観で判定された。ほとんどの場合
、細胞膜は完全に破壊され、図２Ｃに示すようにカバースリップ３６に付着した
膜の残骸のみが後に残され、細胞の内容物は細胞の直ぐ近傍に浮遊していた。
【００２４】 開示の実施態様では、電気泳動は、細胞溶解が見えたときに操作者によって開
始され、これは概算で３００ミリ秒の反応時間であった。より迅速な反応時間の
ためにコンピュータ制御によるパターン認識を代用することができるし、また電
気泳動はレーザーパルスで直接始動することができる。 パルスＮｄ：ＹＡＧレーザー１８は顕微鏡１２の対物レンズ２０に送られる。
細胞溶解実験で用いられるレーザーシステムには、周波数倍化Ｑ−スイッチ切り
換え（frequency doubled Q-switched）Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（例えばコンティ
ナム(Continuum)(カリフォルニア州、サンタクララ）がシュアライト（Surelite
）Ｉとして製造）が含まれる。レーザーを用いて１０から１００（Ｊのシングル
レーザーパルス（波長５３２ｎｍ、５ナノ秒パルス）を発生させた。レーザー１
８のレーザービームは顕微鏡１２（ツァイス（ニューヨーク州、ソーンウッド）
製のアキシオバート（Axiovert）１３５）に誘導された。
始され、これは概算で３００ミリ秒の反応時間であった。より迅速な反応時間の
ためにコンピュータ制御によるパターン認識を代用することができるし、また電
気泳動はレーザーパルスで直接始動することができる。 パルスＮｄ：ＹＡＧレーザー１８は顕微鏡１２の対物レンズ２０に送られる。
細胞溶解実験で用いられるレーザーシステムには、周波数倍化Ｑ−スイッチ切り
換え（frequency doubled Q-switched）Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（例えばコンティ
ナム(Continuum)(カリフォルニア州、サンタクララ）がシュアライト（Surelite
）Ｉとして製造）が含まれる。レーザーを用いて１０から１００（Ｊのシングル
レーザーパルス（波長５３２ｎｍ、５ナノ秒パルス）を発生させた。レーザー１
８のレーザービームは顕微鏡１２（ツァイス（ニューヨーク州、ソーンウッド）
製のアキシオバート（Axiovert）１３５）に誘導された。
【００２５】 図１Ｂに示すように、レーザーパルスは、細胞チェンバーのカバースリップ３
６と緩衝溶液５４の境界面の顕微鏡の対物レンズ２０（６３ｘ、１．２５ｎ．ａ
．ツァイス）を用いてそのくびれ部分５０から約０．３から０．４ミクロンの位
置に集中させた。溶解させるべき細胞４６は、レーザーパルスの焦点５０に対し
て側方に２０／３０ミクロンの位置に配置した。しかしながら、別の実施態様で
は直接的作用が設定され、それによってレーザーパラメーターが細胞質内容物を
放出させ、核物質を細胞質内に残すように細胞膜を開口するためにのみ調節でき
ることも理解されよう。本明細書に記載するもの以外の他のタイプのレーザーも
、ショック波発生のために用いることができることは理解されるところである。
細胞溶解の他に、細胞から単離または取り出された細胞の核も、ＤＮＡまたは他
の核物質を回収するために操作できる。
６と緩衝溶液５４の境界面の顕微鏡の対物レンズ２０（６３ｘ、１．２５ｎ．ａ
．ツァイス）を用いてそのくびれ部分５０から約０．３から０．４ミクロンの位
置に集中させた。溶解させるべき細胞４６は、レーザーパルスの焦点５０に対し
て側方に２０／３０ミクロンの位置に配置した。しかしながら、別の実施態様で
は直接的作用が設定され、それによってレーザーパラメーターが細胞質内容物を
放出させ、核物質を細胞質内に残すように細胞膜を開口するためにのみ調節でき
ることも理解されよう。本明細書に記載するもの以外の他のタイプのレーザーも
、ショック波発生のために用いることができることは理解されるところである。
細胞溶解の他に、細胞から単離または取り出された細胞の核も、ＤＮＡまたは他
の核物質を回収するために操作できる。
【００２６】 融合させたシリカキャピラリーカラム２２をマイクロマニピュレーター２４の
手段によって配置した。マイクロマニピュレーター２４は、顕微鏡のステージ３
０上に配置されたカバースリップまたはスライド２８の上部のキャピラリー２２
の吸入口２６に近接して配置されている。細胞周囲およびカバースリップ上部の
緩衝溶液はアースさている。キャピラリー２２の遠位端３２は、基部末端２６で
キャピラリー２２の中に重力サイフォン圧を発生させるために、電解液または緩
衝液槽３４に配置されている。高電圧供給源、モデルＣＺＥ１０００Ｒ（スペル
マン製（Spellman、ニューヨーク州、プレーンビュー))を用いてカラムまたはキ
ャピラリー２２での電気泳動を駆動させた。融合シリカキャピラリー２２は内径
が５０ミクロンで、外形が３６０ミクロンであった。管腔壁は、スペルコ(Supel
co, アリゾナ州、フェニックス）が独占的に製造する中性コーティングで被覆し
た。
手段によって配置した。マイクロマニピュレーター２４は、顕微鏡のステージ３
０上に配置されたカバースリップまたはスライド２８の上部のキャピラリー２２
の吸入口２６に近接して配置されている。細胞周囲およびカバースリップ上部の
緩衝溶液はアースさている。キャピラリー２２の遠位端３２は、基部末端２６で
キャピラリー２２の中に重力サイフォン圧を発生させるために、電解液または緩
衝液槽３４に配置されている。高電圧供給源、モデルＣＺＥ１０００Ｒ（スペル
マン製（Spellman、ニューヨーク州、プレーンビュー))を用いてカラムまたはキ
ャピラリー２２での電気泳動を駆動させた。融合シリカキャピラリー２２は内径
が５０ミクロンで、外形が３６０ミクロンであった。管腔壁は、スペルコ(Supel
co, アリゾナ州、フェニックス）が独占的に製造する中性コーティングで被覆し
た。
【００２７】 コーティングは電気的浸透圧流を最小限にし、したがって、これらの実験で使
用される陰性荷電の発蛍光団の泳動時間を短くするために用いた。キャピラリー
の全長は９０から１００ｃｍであった。検出窓は吸入口４８から約７５ｃｍであ
った。電気泳動は生物学的に適合する緩衝液中で実施した。細胞チェンバーは吸
入口貯水容器として機能し、アース電位で保持された。排出口貯水容器は１５か
ら１８ｋＶで保持された。キャピラリー２２の遠位排出口３２は吸入口４８の下
方５ｃｍに配置された。キャピラリー２２の吸入口４８は、細胞溶解後に細胞内
容物をキャピラリー２２に導入するためのマイクロピペットとして用いられた。
用される陰性荷電の発蛍光団の泳動時間を短くするために用いた。キャピラリー
の全長は９０から１００ｃｍであった。検出窓は吸入口４８から約７５ｃｍであ
った。電気泳動は生物学的に適合する緩衝液中で実施した。細胞チェンバーは吸
入口貯水容器として機能し、アース電位で保持された。排出口貯水容器は１５か
ら１８ｋＶで保持された。キャピラリー２２の遠位排出口３２は吸入口４８の下
方５ｃｍに配置された。キャピラリー２２の吸入口４８は、細胞溶解後に細胞内
容物をキャピラリー２２に導入するためのマイクロピペットとして用いられた。
【００２８】 吸入口４８の上部のキャピラリー２２からポリイミドコーティング５ｍｍを除
去した後、吸入口４８をマイクロマニピュレーター２４のカバースリップ３６に
垂直にマウントした。マイクロマニピュレーター２４は、溶解されてキャピラリ
ー２２にロードされるべき細胞４６に対してキャピラリー管腔５２の正確な配置
を可能にした。キャピラリー２２は毎泳動後に新しい緩衝液Ａで１〜２分洗浄し
た。重力によるサイフォン流動流を用いてフルオレセイン／オレゴングリーン遊
離酸スタンダードとともにキャピラリー２２にロードした。ローディング容積は
ポアズイユの等式から計算した。
去した後、吸入口４８をマイクロマニピュレーター２４のカバースリップ３６に
垂直にマウントした。マイクロマニピュレーター２４は、溶解されてキャピラリ
ー２２にロードされるべき細胞４６に対してキャピラリー管腔５２の正確な配置
を可能にした。キャピラリー２２は毎泳動後に新しい緩衝液Ａで１〜２分洗浄し
た。重力によるサイフォン流動流を用いてフルオレセイン／オレゴングリーン遊
離酸スタンダードとともにキャピラリー２２にロードした。ローディング容積は
ポアズイユの等式から計算した。
【００２９】 キャピラリー２２は、アルゴンレーザー４０から励起ビームが暴露される検査
窓３８を含む。キャピラリー２２のポリイミドコーティングの視覚窓３８は吸入
口４８から７５〜８５ｃｍのところに作られた。キャピラリー管腔５２は、アル
ゴンイオンレーザー４０から出る集中レーザービームによって精査された。蛍光
データをキャピラリー２２およびレーザー４０のレーザービームに対して正しい
角度で顕微鏡の対物レンズ（４０ｘ、０．７５ｎ．ａ．Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ、
ニコン製（ニューヨーク州、メルビル))を用いて採集した。４８８ノッチフィル
ター（カイザー・オプティカル・システム（Kaiser Optical Systems）製、ミシ
ガン州、アンアーバー）を用いてスペクトルフィルタリングし、バンドパスフィ
ルター５３５ＤＦ５５（オメガ・オプティカル製、バーモント州、ブラットロボ
ロ）を用いてフィルタリングした後で、光を光電子増倍管ＰＭＴ Ｒ９２８（ハ
ママツ製、ニュージャーを用いて測定した。光電子増倍管電流を増幅し、プレア
ンプリファイアーで電圧に変換してから、パーソナルコンピュータ４４のデータ
アクィジションボードによってデジタル化した。このデータで作図し、ピーク面
積をマイクロカル（マサチューセッツ州、ハンプトン）が記載したオリジンを用
いて計算した。 誘発蛍光は蛍光検出装置４２によって検出し、パーソナルコンピュータ４４を
用いて図４Ａ〜Ｄの電気泳動図を作製した。槽３４は高電圧供給源３６と連結さ
れ、分析物をキャピラリー２２で分離させるための電気泳動力を提供する。
窓３８を含む。キャピラリー２２のポリイミドコーティングの視覚窓３８は吸入
口４８から７５〜８５ｃｍのところに作られた。キャピラリー管腔５２は、アル
ゴンイオンレーザー４０から出る集中レーザービームによって精査された。蛍光
データをキャピラリー２２およびレーザー４０のレーザービームに対して正しい
角度で顕微鏡の対物レンズ（４０ｘ、０．７５ｎ．ａ．Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ、
ニコン製（ニューヨーク州、メルビル))を用いて採集した。４８８ノッチフィル
ター（カイザー・オプティカル・システム（Kaiser Optical Systems）製、ミシ
ガン州、アンアーバー）を用いてスペクトルフィルタリングし、バンドパスフィ
ルター５３５ＤＦ５５（オメガ・オプティカル製、バーモント州、ブラットロボ
ロ）を用いてフィルタリングした後で、光を光電子増倍管ＰＭＴ Ｒ９２８（ハ
ママツ製、ニュージャーを用いて測定した。光電子増倍管電流を増幅し、プレア
ンプリファイアーで電圧に変換してから、パーソナルコンピュータ４４のデータ
アクィジションボードによってデジタル化した。このデータで作図し、ピーク面
積をマイクロカル（マサチューセッツ州、ハンプトン）が記載したオリジンを用
いて計算した。 誘発蛍光は蛍光検出装置４２によって検出し、パーソナルコンピュータ４４を
用いて図４Ａ〜Ｄの電気泳動図を作製した。槽３４は高電圧供給源３６と連結さ
れ、分析物をキャピラリー２２で分離させるための電気泳動力を提供する。
【００３０】 図１Ｂはキャピラリー２２の近位端２６の拡大側面図で、カバースリップ３６
の上に置かれただ１つの細胞４６および近接して配置されたキャピラリー２２の
近位端２６の吸入口４８を示している。レーザー１８は焦点領域に集中する。焦
点領域は、カバースリップ３６内の焦点領域５０またはその上方面の液体とカバ
ースリップの境界として模式的に表されている。図１Ｃは図１Ｂの拡大図の底面
で、同じ要素の平面関係、特に吸入口４８に対する細胞４６の空間的重なり合い
およびレーザー焦点５０の近接性を示している。
の上に置かれただ１つの細胞４６および近接して配置されたキャピラリー２２の
近位端２６の吸入口４８を示している。レーザー１８は焦点領域に集中する。焦
点領域は、カバースリップ３６内の焦点領域５０またはその上方面の液体とカバ
ースリップの境界として模式的に表されている。図１Ｃは図１Ｂの拡大図の底面
で、同じ要素の平面関係、特に吸入口４８に対する細胞４６の空間的重なり合い
およびレーザー焦点５０の近接性を示している。
【００３１】 図１Ｃに示すように、溶解の前にキャピラリー２２の吸入口４８を細胞４６の
上に直接配置することによって、溶解細胞の内容物は、重力サイフォンおよび電
気泳動の組合せにより溶解時にキャピラリー２２の管腔５２内にロードされる。
ショック波の力はまた細胞フラグメントに運動量を伝え、この運動量によって細
胞フラグメントはキャピラリーの管腔内に運搬される。溶解の開始の瞬間から管
腔５２内へのローディングとの間で必要な時間は、下記で示すように３３ミリ秒
よりもはるかに短い。溶解前に細胞４６を一切操作することがなく、さらに溶解
自体が極めて迅速であるために、サンプリングまでの時間が最小限になる。細胞
４６が溶解されるやいなや、細胞の反応は、反応物の拡散、激しい混合または電
気泳動による分離によって停止し、したがって細胞内組成物のより正確なスナッ
プショットを可能にする。開示の実施態様の技術は付着細胞についての記載であ
るが、非付着細胞にも応用可能であり、これら非付着細胞は物理的に吸入口４８
にロードされるか、またはマイクロビーム光学ピンセット（図には示されていな
い）によって保持される。 本技術による迅速性の改善、溶解前の細胞に外傷を与えないこと、および付着
性と非付着性単一細胞の両方への適用性は、単一細胞の極微分析測定の役割を拡
大するであろう。本発明の利用は下記で詳細に説明する。
上に直接配置することによって、溶解細胞の内容物は、重力サイフォンおよび電
気泳動の組合せにより溶解時にキャピラリー２２の管腔５２内にロードされる。
ショック波の力はまた細胞フラグメントに運動量を伝え、この運動量によって細
胞フラグメントはキャピラリーの管腔内に運搬される。溶解の開始の瞬間から管
腔５２内へのローディングとの間で必要な時間は、下記で示すように３３ミリ秒
よりもはるかに短い。溶解前に細胞４６を一切操作することがなく、さらに溶解
自体が極めて迅速であるために、サンプリングまでの時間が最小限になる。細胞
４６が溶解されるやいなや、細胞の反応は、反応物の拡散、激しい混合または電
気泳動による分離によって停止し、したがって細胞内組成物のより正確なスナッ
プショットを可能にする。開示の実施態様の技術は付着細胞についての記載であ
るが、非付着細胞にも応用可能であり、これら非付着細胞は物理的に吸入口４８
にロードされるか、またはマイクロビーム光学ピンセット（図には示されていな
い）によって保持される。 本技術による迅速性の改善、溶解前の細胞に外傷を与えないこと、および付着
性と非付着性単一細胞の両方への適用性は、単一細胞の極微分析測定の役割を拡
大するであろう。本発明の利用は下記で詳細に説明する。
【００３２】
次に使用した試薬について述べながら、具体的な実施例を考察する。フルオレ
セインジアセテート（混合異性体）、フルオレセイン（フルオレセイン遊離酸）
、オレゴングリーン４８８カルボン酸ジアセテート６−異性体（オレゴングリ ーンジアセテート）およびオレゴングリーン４８８カルボン酸６−異性体（オレ
ゴングリーン遊離酸）はモレキュラー・プローブ（Molecular Probes, オレゴン
州、ユージーン）の製造および販売による。緩衝溶液（本明細書では緩衝液Ａと
称する）は生理学的な細胞外緩衝液で、キャピラリー２２で近位端２６とカバー
スリップ３６との間で電解液として使用した。緩衝液Ａは、１３５ｍＭのＮａＣ
ｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭヘペス、２ｍＭのＭｇＣｌ２で構成され、ＮａＯ
ＨでｐＨ７．４に調節されている。これらの試薬はフィッシャー・サイエンティ
フィック(Fisher Scientific, ペンシルバニア州、ピッツバーグ）から購入され
た。
セインジアセテート（混合異性体）、フルオレセイン（フルオレセイン遊離酸）
、オレゴングリーン４８８カルボン酸ジアセテート６−異性体（オレゴングリ ーンジアセテート）およびオレゴングリーン４８８カルボン酸６−異性体（オレ
ゴングリーン遊離酸）はモレキュラー・プローブ（Molecular Probes, オレゴン
州、ユージーン）の製造および販売による。緩衝溶液（本明細書では緩衝液Ａと
称する）は生理学的な細胞外緩衝液で、キャピラリー２２で近位端２６とカバー
スリップ３６との間で電解液として使用した。緩衝液Ａは、１３５ｍＭのＮａＣ
ｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭヘペス、２ｍＭのＭｇＣｌ２で構成され、ＮａＯ
ＨでｐＨ７．４に調節されている。これらの試薬はフィッシャー・サイエンティ
フィック(Fisher Scientific, ペンシルバニア州、ピッツバーグ）から購入され
た。
【００３３】 ラットの好塩基性白血球（ＲＢＬ）細胞、腫瘍マスト細胞株は開示の実施態様
でモデル系として用いた。細胞は、ダルベッコー改変イーグル培地（Dulbecco's
modified eagle medium, ＤＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清およびＬ−グルタミ
ン（５８４ｍｇ／Ｌ）を補充して３７℃で５％のＣＯ２で増殖させた。ペニシリ
ン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００（ｇ／ｍｌ）を培養
液に添加し、細菌の増殖を抑制した。細胞培養材料はギブコＢＲＬ(Gibco BRL,
メリーランド州、ガイザースバーグ）から入手した。細胞は細胞チェンバー中で
増殖させた。細胞チェンバーは、ダウ・コーニング（ミシガン州、ミドランド）
のシルガード（Sylgard)を用い、外径１５／１６インチのテフロンＯリングを直
径２５ｍｍの円形の＃１ガラス製カバースリップに接着させて作製した。ガラス
表面への細胞の付着は、細胞チェンバーに細胞を加える前にカバースリップをベ
クトン・ディキンソン（Becton Dickinson、マサチューセッツ州、ベッドフォー
ド）製造のセルタック（Cell-Tac）で被覆して強化した。 使用前に細胞は、細胞チェンバーに播種後１２から２４時間、補充培地で増殖
させた。細胞は、レーザー暴露実施時に６３ｘの視野にほぼ１細胞が生じるよう
に経験的に決定した濃度で播種した。
でモデル系として用いた。細胞は、ダルベッコー改変イーグル培地（Dulbecco's
modified eagle medium, ＤＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清およびＬ−グルタミ
ン（５８４ｍｇ／Ｌ）を補充して３７℃で５％のＣＯ２で増殖させた。ペニシリ
ン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００（ｇ／ｍｌ）を培養
液に添加し、細菌の増殖を抑制した。細胞培養材料はギブコＢＲＬ(Gibco BRL,
メリーランド州、ガイザースバーグ）から入手した。細胞は細胞チェンバー中で
増殖させた。細胞チェンバーは、ダウ・コーニング（ミシガン州、ミドランド）
のシルガード（Sylgard)を用い、外径１５／１６インチのテフロンＯリングを直
径２５ｍｍの円形の＃１ガラス製カバースリップに接着させて作製した。ガラス
表面への細胞の付着は、細胞チェンバーに細胞を加える前にカバースリップをベ
クトン・ディキンソン（Becton Dickinson、マサチューセッツ州、ベッドフォー
ド）製造のセルタック（Cell-Tac）で被覆して強化した。 使用前に細胞は、細胞チェンバーに播種後１２から２４時間、補充培地で増殖
させた。細胞は、レーザー暴露実施時に６３ｘの視野にほぼ１細胞が生じるよう
に経験的に決定した濃度で播種した。
【００３４】 細胞はフルオレセインジアセテートおよび／またはオレゴングリーンジアセテ
ートとともにロードした。これら細胞透過性化合物は、当該化合物が細胞内に侵
入した後、固有の細胞内エステラーゼによって加水分解されるまでは蛍光性では
ない。蛍光性遊離酸がいったん形成されると、それはもはや細胞透過性ではなく
細胞内に捕捉されたままであるが、ただし細胞は陰イオン性輸送を介して時間の
経過にしたがい当該染料を外に排出する。単一細胞実験の場合、細胞チェンバー
でＤＭＥＭで増殖させた細胞は緩衝液Ａで１回洗浄した。
ートとともにロードした。これら細胞透過性化合物は、当該化合物が細胞内に侵
入した後、固有の細胞内エステラーゼによって加水分解されるまでは蛍光性では
ない。蛍光性遊離酸がいったん形成されると、それはもはや細胞透過性ではなく
細胞内に捕捉されたままであるが、ただし細胞は陰イオン性輸送を介して時間の
経過にしたがい当該染料を外に排出する。単一細胞実験の場合、細胞チェンバー
でＤＭＥＭで増殖させた細胞は緩衝液Ａで１回洗浄した。
【００３５】 フルオレセイン（２０ｎＭ）および／またはオレゴングリーン（５００ｎＭ）
ジアセテートの溶液は、使用直前に４００（ｌの緩衝液Ａプラス１０ｍＭのグル
コースで製造し、洗浄緩衝液を除去した後で細胞チェンバーに添加した。細胞を
暗所で３０分室温でインキュベートし、蛍光化合物を細胞にロードした。続いて
細胞を緩衝液Ａで５回洗浄し、その後１０から１５分以内に使用した。ジアセテ
ートの加水分解における細胞間の相違のため、また細胞内空隙から遊離酸が失わ
れるために、この方法によって各細胞にロードされる染料の量はある程度異なる
。
ジアセテートの溶液は、使用直前に４００（ｌの緩衝液Ａプラス１０ｍＭのグル
コースで製造し、洗浄緩衝液を除去した後で細胞チェンバーに添加した。細胞を
暗所で３０分室温でインキュベートし、蛍光化合物を細胞にロードした。続いて
細胞を緩衝液Ａで５回洗浄し、その後１０から１５分以内に使用した。ジアセテ
ートの加水分解における細胞間の相違のため、また細胞内空隙から遊離酸が失わ
れるために、この方法によって各細胞にロードされる染料の量はある程度異なる
。
【００３６】 各細胞から得られた蛍光マーカーのモル数の概算は、電気泳動図で蛍光のピー
ク面積をスタンダードと比較して得られた。周囲の緩衝液中に細胞から放出され
た染料を除去するために、新しい緩衝液Ａ（１０ｍｌ／分）を実験中に細胞チェ
ンバーで交換し続けた。流動系が存在しない場合には、時間の経過にしたがい染
料は細胞外緩衝液中に蓄積し、蛍光のベースラインを増加させる。
ク面積をスタンダードと比較して得られた。周囲の緩衝液中に細胞から放出され
た染料を除去するために、新しい緩衝液Ａ（１０ｍｌ／分）を実験中に細胞チェ
ンバーで交換し続けた。流動系が存在しない場合には、時間の経過にしたがい染
料は細胞外緩衝液中に蓄積し、蛍光のベースラインを増加させる。
【００３７】 単一細胞分析に用いられる生物学的測定の時間的問題の解決は、サンプル抽出
過程の開始と対象の分子を含む生物学的反応の停止との間の時間によって決定さ
れる。これらの反応の停止は、反応物の分離（通常は混合、拡散および／または
電気泳動）によって、または反応物の不活化（典型的にはタンパク質の変性）に
よって、達成される。細胞溶解および分析の開始のために必要な時間を最小にす
ることによって（例えばキャピラリー電気泳動によって）、単一細胞の生化学的
分析の時間的問題の解決が促進される。下記で考察するように、ミリ秒の時間的
規模での細胞溶解およびそれに続く分離検出のための細胞内容物のキャピラリー
へのローディングは、キャピラリー電気泳動による単一細胞の化学的測定の時間
的問題の解決を劇的に改善する。
過程の開始と対象の分子を含む生物学的反応の停止との間の時間によって決定さ
れる。これらの反応の停止は、反応物の分離（通常は混合、拡散および／または
電気泳動）によって、または反応物の不活化（典型的にはタンパク質の変性）に
よって、達成される。細胞溶解および分析の開始のために必要な時間を最小にす
ることによって（例えばキャピラリー電気泳動によって）、単一細胞の生化学的
分析の時間的問題の解決が促進される。下記で考察するように、ミリ秒の時間的
規模での細胞溶解およびそれに続く分離検出のための細胞内容物のキャピラリー
へのローディングは、キャピラリー電気泳動による単一細胞の化学的測定の時間
的問題の解決を劇的に改善する。
【００３８】 ショック波の発生による細胞溶解の特性を決定するために、２０〜１００（ Ｊの範囲のエネルギー内容をもつシングルパルスのレーザーマイクロビームを上
記のように用いてＲＢＬ細胞を溶解し、一方、図２Ａ〜Ｂの一連の表示のように
３３ミリ秒毎にビデオカメラで明視野画像を記録した。図２Ａは、ＲＢＬ細胞の
溶解前の写真で、図２Ｂは溶解の瞬間で、溶解されるべき細胞のすぐ右側にレー
ザービームの反射が示されている。その３３ミリ秒後は図２Ｃに示されていると
おりで、細胞は完全に破壊され細胞膜断片のみが残されている。実質的に全ての
細胞内容物が溶解後３３ミリ秒以内に遊離され、２Ｃと５秒後の図２Ｄに示され
たものと視野の状態に実質的な相違はない。
記のように用いてＲＢＬ細胞を溶解し、一方、図２Ａ〜Ｂの一連の表示のように
３３ミリ秒毎にビデオカメラで明視野画像を記録した。図２Ａは、ＲＢＬ細胞の
溶解前の写真で、図２Ｂは溶解の瞬間で、溶解されるべき細胞のすぐ右側にレー
ザービームの反射が示されている。その３３ミリ秒後は図２Ｃに示されていると
おりで、細胞は完全に破壊され細胞膜断片のみが残されている。実質的に全ての
細胞内容物が溶解後３３ミリ秒以内に遊離され、２Ｃと５秒後の図２Ｄに示され
たものと視野の状態に実質的な相違はない。
【００３９】 形質膜の一部分の直接的局所的希薄化は、低エネルギー密度のレーザーパルス
を細胞膜に直接集中させることによって実施できる。本明細書で述べる実験では
、完全な溶解は細胞をレーザービームに直接暴露せずに達成される。この態様で
は、細胞内物質種の光分解も光褪色も生じない。細胞の溶解では、図２Ｂに示し
たように、ビームは細胞４６の一方の側から２０〜３０ミクロンの位置に向けら
れる。ショック波は、０．３から０．５ミクロンの径をもつパルスレーザービー
ムを、カバースリップと緩衝液の境界面の直下のカバースリップ３６内のくびれ
部分５０に集中させることによって発生させた。同じショック波作用はまた、４
０ｘから１００ｘの拡大範囲の他の顕微鏡対物レンズを用いて得られた。
を細胞膜に直接集中させることによって実施できる。本明細書で述べる実験では
、完全な溶解は細胞をレーザービームに直接暴露せずに達成される。この態様で
は、細胞内物質種の光分解も光褪色も生じない。細胞の溶解では、図２Ｂに示し
たように、ビームは細胞４６の一方の側から２０〜３０ミクロンの位置に向けら
れる。ショック波は、０．３から０．５ミクロンの径をもつパルスレーザービー
ムを、カバースリップと緩衝液の境界面の直下のカバースリップ３６内のくびれ
部分５０に集中させることによって発生させた。同じショック波作用はまた、４
０ｘから１００ｘの拡大範囲の他の顕微鏡対物レンズを用いて得られた。
【００４０】 ＲＢＬ細胞は分泌顆粒内にヒスタミンおよびセロトニンを含む。これらの顆粒
は、細胞溶解時に遊離されるブラウン運動によって移動する小粒子として出現す
る。ショック波を発生させるために低エネルギー、１０〜２０（Ｊを用いた場合
、細胞膜はショック波によって透過性になるようである。これらの細胞はショッ
ク波が細胞を貫通した後球状になり、細胞内容物（すなわち顆粒）はビデオの２
０〜３０こまにわたって細胞から漏出した。約２０（Ｊを越えるより高いエネル
ギーでは、ショック波の衝突後に膜は完全に破壊され、図２Ｃに示すように最初
のビデオの１こまにあるとおり膜の残骸のみが残される。
は、細胞溶解時に遊離されるブラウン運動によって移動する小粒子として出現す
る。ショック波を発生させるために低エネルギー、１０〜２０（Ｊを用いた場合
、細胞膜はショック波によって透過性になるようである。これらの細胞はショッ
ク波が細胞を貫通した後球状になり、細胞内容物（すなわち顆粒）はビデオの２
０〜３０こまにわたって細胞から漏出した。約２０（Ｊを越えるより高いエネル
ギーでは、ショック波の衝突後に膜は完全に破壊され、図２Ｃに示すように最初
のビデオの１こまにあるとおり膜の残骸のみが残される。
【００４１】 溶解が発生する実際の時間は３３ミリ秒よりはるかに短く、おそらく２５〜３
０ナノ秒の短さであろう。ビデオ分析解析の最短時間がビデオ速度１秒当たり３
０こまによって制限されたので、本明細書では３３ミリ秒を選んだ。このような
より高いエネルギーでは、再び分泌顆粒は直ぐ近傍（すなわち形質膜の残骸から
約１０ミクロン以内）に認められる。分泌顆粒が局部的に留まるという事実は、
溶解時には細胞内容物の希釈の発生に限りがあることを示唆している。ビームエ
ネルギーを２０〜１００（Ｊの範囲を越えて高めることによって、細胞をその焦
点からより遠く離れて溶解させることができた。 このレーザーによる細胞溶解方法は、細胞溶解の程度および領域を選択的に制
御できる態様で、細胞膜の局所的希薄化を可能にする。この制御性は、細胞の一
部分を溶解させることによって（すなわち細胞伸長部の溶解または遺伝物質が存
在する核の破壊）、小細胞の細胞内測定を可能にする。
０ナノ秒の短さであろう。ビデオ分析解析の最短時間がビデオ速度１秒当たり３
０こまによって制限されたので、本明細書では３３ミリ秒を選んだ。このような
より高いエネルギーでは、再び分泌顆粒は直ぐ近傍（すなわち形質膜の残骸から
約１０ミクロン以内）に認められる。分泌顆粒が局部的に留まるという事実は、
溶解時には細胞内容物の希釈の発生に限りがあることを示唆している。ビームエ
ネルギーを２０〜１００（Ｊの範囲を越えて高めることによって、細胞をその焦
点からより遠く離れて溶解させることができた。 このレーザーによる細胞溶解方法は、細胞溶解の程度および領域を選択的に制
御できる態様で、細胞膜の局所的希薄化を可能にする。この制御性は、細胞の一
部分を溶解させることによって（すなわち細胞伸長部の溶解または遺伝物質が存
在する核の破壊）、小細胞の細胞内測定を可能にする。
【００４２】 細胞溶解の各事例で、小さなディボットが、レーザービームが集中した点のカ
バースリップに出現する。いくつかの例では、レーザービームとガラス緩衝液境
界との交差部分に５〜１０ミクロン未満の直径をもつ気泡がレーザーパルスに続
く最初のこまで出現した。この気泡はその後のこまには存在しなかった。他の実
験では、環状波がレーザービームの位置から発生するのがパルスと同時のビデオ
の１こまで認めることができた。図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに示した一連の画像こ
まに表示されたように３３ミリ秒後に細胞が消失し、さらに波が消えた。ディボ
ット、気泡および波は、プラズマがカバースリップ３６上に形成され、それによ
ってキャビテーションおよびショック波を発生させたという論旨を支持する。
バースリップに出現する。いくつかの例では、レーザービームとガラス緩衝液境
界との交差部分に５〜１０ミクロン未満の直径をもつ気泡がレーザーパルスに続
く最初のこまで出現した。この気泡はその後のこまには存在しなかった。他の実
験では、環状波がレーザービームの位置から発生するのがパルスと同時のビデオ
の１こまで認めることができた。図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに示した一連の画像こ
まに表示されたように３３ミリ秒後に細胞が消失し、さらに波が消えた。ディボ
ット、気泡および波は、プラズマがカバースリップ３６上に形成され、それによ
ってキャビテーションおよびショック波を発生させたという論旨を支持する。
【００４３】 溶解後に付着性ＲＢＬ細胞の内容物が続いてキャピラリー２２にロードされる
ことを示すために、フルオレセインを含むただ１つのＲＢＬ細胞４６をキャピラ
リー２２の管腔５２の近位吸入口４８の下に配置した。キャピラリー２２の吸引
口４８は細胞４６の上部約１５〜２５ミクロンにあったが、ただし所望の場合は
、実際には管腔５２の入口内部に細胞が静置しているよう、キャピラリー２２を
カバースリップ３６と同じ高さに配置することができる。細胞４６を上記のよう
に溶解させ、細胞溶解時に電気泳動を開始させた。ビデオ画像の分析は、細胞内
容物は溶解パルス後３３ミリ秒以内に消失したことを示している。細胞内容物は
、したがって３３ミリ秒以内でキャピラリー２２内にロードされた。
ことを示すために、フルオレセインを含むただ１つのＲＢＬ細胞４６をキャピラ
リー２２の管腔５２の近位吸入口４８の下に配置した。キャピラリー２２の吸引
口４８は細胞４６の上部約１５〜２５ミクロンにあったが、ただし所望の場合は
、実際には管腔５２の入口内部に細胞が静置しているよう、キャピラリー２２を
カバースリップ３６と同じ高さに配置することができる。細胞４６を上記のよう
に溶解させ、細胞溶解時に電気泳動を開始させた。ビデオ画像の分析は、細胞内
容物は溶解パルス後３３ミリ秒以内に消失したことを示している。細胞内容物は
、したがって３３ミリ秒以内でキャピラリー２２内にロードされた。
【００４４】 いくつかの実験では、形質膜の残骸はガラスのカバースリップに付着したまま
であるが、他の実験では残骸もまたキャピラリー２２にロードされた。電流と細
胞の発蛍光団の移動時間は両方の事例で同じであった。これらの実験では、細胞
の内容物は、電気泳動のその後のなんらかの寄与とともに重力サイフォン流動に
よってキャピラリーにロードされた。これらの実験では利用されなかったが、レ
ーザーのトリガーパルスとともにキャピラリー電気泳動の動力源を引金とするこ
とによって、電気泳動は溶解パルスと同時に開始させることができる。荷電管腔
壁と合わせてキャピラリーを使用することによって、電気的浸透圧流の使用が可
能になり、所望の場合は重力サイフォン流による細胞内容物のローディングを排
除できる。レーザー誘発ショック波のためにある程度のローディングもまた生じ
る。
であるが、他の実験では残骸もまたキャピラリー２２にロードされた。電流と細
胞の発蛍光団の移動時間は両方の事例で同じであった。これらの実験では、細胞
の内容物は、電気泳動のその後のなんらかの寄与とともに重力サイフォン流動に
よってキャピラリーにロードされた。これらの実験では利用されなかったが、レ
ーザーのトリガーパルスとともにキャピラリー電気泳動の動力源を引金とするこ
とによって、電気泳動は溶解パルスと同時に開始させることができる。荷電管腔
壁と合わせてキャピラリーを使用することによって、電気的浸透圧流の使用が可
能になり、所望の場合は重力サイフォン流による細胞内容物のローディングを排
除できる。レーザー誘発ショック波のためにある程度のローディングもまた生じ
る。
【００４５】 図４に示した電気泳動トレースに戻ってこれを考察しよう。電気泳動は、同じ
日に同じキャピラリー（すなわち１００ｃｍ長、５０ミクロンの内径、３６０ミ
クロンの外径、吸引口から８５ｃｍ離れた検出窓をもつ）を用い１５ｋＶの電圧
で６０マイクロアンペアで実施した。発蛍光団の量はスタンダードと比較して決
定した。図４のトレースＡは、細胞にロードされ、細胞溶解及び電気泳動後に検
出されたフルオレセインを示す。フルオレセインを含む単一ピークが示されてい
る。図４のトレースＢは、オレゴングリーンをロードした単一細胞の電気泳動ト
レースである。４つの再現性をもつオレゴングリーンジアセテートのピークが明
瞭に図示されている。最大ピークの発蛍光団は遊離酸に一致する。図４のトレー
スＣはフルオレセインとオレゴングリーンの両方をロードされた単一細胞のトレ
ースで、重ね合わされたトレースＡとトレースＢを示している。図４のトレース
Ｄは、遊離酸でのオレゴングリーンとフルオレセインの検出を示す。
日に同じキャピラリー（すなわち１００ｃｍ長、５０ミクロンの内径、３６０ミ
クロンの外径、吸引口から８５ｃｍ離れた検出窓をもつ）を用い１５ｋＶの電圧
で６０マイクロアンペアで実施した。発蛍光団の量はスタンダードと比較して決
定した。図４のトレースＡは、細胞にロードされ、細胞溶解及び電気泳動後に検
出されたフルオレセインを示す。フルオレセインを含む単一ピークが示されてい
る。図４のトレースＢは、オレゴングリーンをロードした単一細胞の電気泳動ト
レースである。４つの再現性をもつオレゴングリーンジアセテートのピークが明
瞭に図示されている。最大ピークの発蛍光団は遊離酸に一致する。図４のトレー
スＣはフルオレセインとオレゴングリーンの両方をロードされた単一細胞のトレ
ースで、重ね合わされたトレースＡとトレースＢを示している。図４のトレース
Ｄは、遊離酸でのオレゴングリーンとフルオレセインの検出を示す。
【００４６】 図４のトレースＡは、トレースＤの電気泳動図の緩衝液中でのフルオレセイン
の移動時間と同じ移動時間をもつ単一ピークを示し、したがって細胞の内容物は
キャピラリー２２に実際にロードされたことが確認された。蛍光マーカーを含ま
ない細胞の電気泳動トレース（図には示されていない）はピークを示さなかった
。同様に、キャピラリー２２の吸入口４８が蛍光含有細胞の視野から離れて置か
れている場合、電気泳動図の蛍光ベースライン（図には示されていない）は細胞
溶解後平坦で、キャピラリー２２に細胞内容物がロードされなかったことを示し
ている。
の移動時間と同じ移動時間をもつ単一ピークを示し、したがって細胞の内容物は
キャピラリー２２に実際にロードされたことが確認された。蛍光マーカーを含ま
ない細胞の電気泳動トレース（図には示されていない）はピークを示さなかった
。同様に、キャピラリー２２の吸入口４８が蛍光含有細胞の視野から離れて置か
れている場合、電気泳動図の蛍光ベースライン（図には示されていない）は細胞
溶解後平坦で、キャピラリー２２に細胞内容物がロードされなかったことを示し
ている。
【００４７】 いくつかの実験では２つ以上の細胞が吸入口４８の近傍にあった。吸入口４８
の直下の細胞を溶解するためにより高いレーザーエネルギーを用いることによっ
て、多数の細胞を溶解した。これら隣接細胞に対応するピークは電気泳動で別々
に認められた。したがって、ほとんどの場合に細胞溶解は制御でき、また細胞集
団の密度は単一細胞の内容物がロードされるように維持できることは想像に難く
ない。しかしながら、同じレーザーパルスで多数の細胞の溶解が何らかの理由で
所望される場合、これは必ずしも排除される使用法ではない。
の直下の細胞を溶解するためにより高いレーザーエネルギーを用いることによっ
て、多数の細胞を溶解した。これら隣接細胞に対応するピークは電気泳動で別々
に認められた。したがって、ほとんどの場合に細胞溶解は制御でき、また細胞集
団の密度は単一細胞の内容物がロードされるように維持できることは想像に難く
ない。しかしながら、同じレーザーパルスで多数の細胞の溶解が何らかの理由で
所望される場合、これは必ずしも排除される使用法ではない。
【００４８】 ＲＢＬ細胞にフルオレセインもしくはオレゴングリーンを単独または併用して
ロードする一連の実験を実施した。発蛍光団を含む単一細胞を続いて溶解し、そ
の内容物をキャピラリー２２にロードして電気泳動を上記のように実施した。図
４のトレースＡ〜Ｃは、これらの実験のそれぞれのトレースを示す。興味深いこ
とには、フルオレセインジアセテートのみをロードされた細胞の電気泳動トレー
スは単一ピークを示し、オレゴングリーンジアセテートのみをロードされた細胞
は、ほぼ等しい規模の３つの別個のピークおよびより小さな４番目のピークを常
に示した。最初のオレゴングリーンピークの移動時間は、緩衝液中でのオレゴン
グリーン遊離酸の移動時間と同じであった。その後のピークはオレゴングリーン
遊離酸スタンダードの電気泳動トレースでは見られなかった。オレゴングリーン
ジアセテート（３．８ｘ１０−１５モル）を緩衝液中で電気泳動したとき蛍光ピ
ークは特定されなかった。オレゴングリーンのトレースでの別の２つの主要ピー
クは部分的に加水分解された形態のオレゴングリーンジアセテートであるかもし
れないし、またこれら別のピークは細胞内で濃縮される不純物かもしれない。オ
レゴングリーンシグナルにおけるこれら３つの付加ピークの発生の結果として、
図４のトレースＣに示したように単一細胞から５つの別個の種の分離を示すこと
ができた。
ロードする一連の実験を実施した。発蛍光団を含む単一細胞を続いて溶解し、そ
の内容物をキャピラリー２２にロードして電気泳動を上記のように実施した。図
４のトレースＡ〜Ｃは、これらの実験のそれぞれのトレースを示す。興味深いこ
とには、フルオレセインジアセテートのみをロードされた細胞の電気泳動トレー
スは単一ピークを示し、オレゴングリーンジアセテートのみをロードされた細胞
は、ほぼ等しい規模の３つの別個のピークおよびより小さな４番目のピークを常
に示した。最初のオレゴングリーンピークの移動時間は、緩衝液中でのオレゴン
グリーン遊離酸の移動時間と同じであった。その後のピークはオレゴングリーン
遊離酸スタンダードの電気泳動トレースでは見られなかった。オレゴングリーン
ジアセテート（３．８ｘ１０−１５モル）を緩衝液中で電気泳動したとき蛍光ピ
ークは特定されなかった。オレゴングリーンのトレースでの別の２つの主要ピー
クは部分的に加水分解された形態のオレゴングリーンジアセテートであるかもし
れないし、またこれら別のピークは細胞内で濃縮される不純物かもしれない。オ
レゴングリーンシグナルにおけるこれら３つの付加ピークの発生の結果として、
図４のトレースＣに示したように単一細胞から５つの別個の種の分離を示すこと
ができた。
【００４９】 本発明の技術を用いて２つの細胞の内容物の連続分析の実現可能性を示すもの
として、キャピラリー２２に連続して溶解させた２つの細胞をロードした。２つ
の細胞は同じ細胞チェンバーに含まれており、フルオレセインとオレゴングリー
ンジアセテートを同様な態様でロードされていた。キャピラリー２２の近位吸入
口４８の下にあるただ１種でロードされた１つの細胞を溶解し、その内容物を重
力サイフォン流によってキャピラリー２２に導入した。続いて、第二の細胞を中
央の吸入口４８の下に移動させ、その間緩衝液を重力によってキャピラリーに流
入させ続けた。第二の細胞を溶解し、溶解直後に電気泳動を実施した。したがっ
て、第二の細胞の内容物は、重力、電気泳動、およびおそらくレーザー誘導ショ
ック波によって発生した運動量が合わされてロードされた。図５の電気泳動図は
、各細胞の分析物を明瞭に区別されるピークとして示している。添字“１”で示
される第一の細胞の蛍光シグナルは、添字”２”で示される第二の文字のシグナ
ルより低い。シグナルの強度におけるこの相違は、おそらく細胞の取り込みの生
物学的多様性および２つの細胞の代謝における相違によるものであろう。
として、キャピラリー２２に連続して溶解させた２つの細胞をロードした。２つ
の細胞は同じ細胞チェンバーに含まれており、フルオレセインとオレゴングリー
ンジアセテートを同様な態様でロードされていた。キャピラリー２２の近位吸入
口４８の下にあるただ１種でロードされた１つの細胞を溶解し、その内容物を重
力サイフォン流によってキャピラリー２２に導入した。続いて、第二の細胞を中
央の吸入口４８の下に移動させ、その間緩衝液を重力によってキャピラリーに流
入させ続けた。第二の細胞を溶解し、溶解直後に電気泳動を実施した。したがっ
て、第二の細胞の内容物は、重力、電気泳動、およびおそらくレーザー誘導ショ
ック波によって発生した運動量が合わされてロードされた。図５の電気泳動図は
、各細胞の分析物を明瞭に区別されるピークとして示している。添字“１”で示
される第一の細胞の蛍光シグナルは、添字”２”で示される第二の文字のシグナ
ルより低い。シグナルの強度におけるこの相違は、おそらく細胞の取り込みの生
物学的多様性および２つの細胞の代謝における相違によるものであろう。
【００５０】 本発明の範囲を外れることなく、多くの変更および改変が当業者によって実施
されるであろう。したがって、開示した実施態様は例示として詳述されたのであ
り、請求の範囲によって規定されるように本発明を限定するものと解されるべき
ではない。本発明を用いることができる用途に意図的な限定は存在しないが、診
断的生検（ポリメラーゼ連鎖反応を用いるＤＮＡ分析または人間および動物の医
療で用いられる他の生化学的方法を含む）で本発明を使用するために必要とされ
るような当技術分野の範囲内の改変は本発明の範囲内に含まれることは明らかに
意図されている。病状の病理学的特定の確認または自動化のために通常の病理学
的技術とともに本発明を使用することも包含される。ハイブリドーマ細胞の選別
および分析での本発明の使用は特に意図されている。本技術は、インビトロおよ
びインビボの両方での薬剤の効能検査、および遺伝子の配列決定と遺伝子治療に
明瞭な用途をもつ。 ヒトゲノムのマッピングが進行しているので、本発明は、遺伝子発現、ＲＮＡ
およびタンパク質の機能における変化の検出および診断に、さらにこれらの欠損
の修正および緩和に有用なツールであろう。本発明は、他の種およびゲノムにも
同様に広く利用できるであろう。
されるであろう。したがって、開示した実施態様は例示として詳述されたのであ
り、請求の範囲によって規定されるように本発明を限定するものと解されるべき
ではない。本発明を用いることができる用途に意図的な限定は存在しないが、診
断的生検（ポリメラーゼ連鎖反応を用いるＤＮＡ分析または人間および動物の医
療で用いられる他の生化学的方法を含む）で本発明を使用するために必要とされ
るような当技術分野の範囲内の改変は本発明の範囲内に含まれることは明らかに
意図されている。病状の病理学的特定の確認または自動化のために通常の病理学
的技術とともに本発明を使用することも包含される。ハイブリドーマ細胞の選別
および分析での本発明の使用は特に意図されている。本技術は、インビトロおよ
びインビボの両方での薬剤の効能検査、および遺伝子の配列決定と遺伝子治療に
明瞭な用途をもつ。 ヒトゲノムのマッピングが進行しているので、本発明は、遺伝子発現、ＲＮＡ
およびタンパク質の機能における変化の検出および診断に、さらにこれらの欠損
の修正および緩和に有用なツールであろう。本発明は、他の種およびゲノムにも
同様に広く利用できるであろう。
【００５１】 ピペットに細胞内容物を採集するためにサイフォン、電気泳動力、電気的浸透
圧力、およびショック波による力のいずれのタイプのメカニズムも使用でき、本
発明の範囲内に含まれる。ポリメラーゼ連鎖反応または現在知られているか将来
考案される他のいずれの微量分析技術による分析も、開示した電気泳動レーザー
誘発蛍光と同様に利用できることが意図されている。細胞選択の制御性は、化学
的にまたは他の技術によって指標を付された細胞の分析を実施する場合に新規な
用途を可能にする。開示した実施態様では、細胞が培養され溶解され、続いてそ
の内容物が抽出される液体緩衝液を詳述しているが、固体、半固体マトリックス
または組織を含むいずれのタイプの媒体（その中に採集物および光ファイバーを
挿入できる）も含むことができるように改変できることは明らかに意図されてい
る。例えば、シリコンまたは固体基礎体にマウントした生物学的マトリックスを
本発明の技術と組み合わせて、組織片の細胞および細胞内容物の電気泳動による
測定と併用して部分的または完全に溶解した細胞を分析することができる。内因
性細胞成分（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小さな有機分子（例えば第二
メッセンジャーおよび他のもの））とともに細胞内に導入された外因性または人
工的成分（例えば酵素基質、ブロモデオキシウリジンまたは他の分子の識別に用
いられる化学的マーカーを含む分子）の分析も予想されている。
圧力、およびショック波による力のいずれのタイプのメカニズムも使用でき、本
発明の範囲内に含まれる。ポリメラーゼ連鎖反応または現在知られているか将来
考案される他のいずれの微量分析技術による分析も、開示した電気泳動レーザー
誘発蛍光と同様に利用できることが意図されている。細胞選択の制御性は、化学
的にまたは他の技術によって指標を付された細胞の分析を実施する場合に新規な
用途を可能にする。開示した実施態様では、細胞が培養され溶解され、続いてそ
の内容物が抽出される液体緩衝液を詳述しているが、固体、半固体マトリックス
または組織を含むいずれのタイプの媒体（その中に採集物および光ファイバーを
挿入できる）も含むことができるように改変できることは明らかに意図されてい
る。例えば、シリコンまたは固体基礎体にマウントした生物学的マトリックスを
本発明の技術と組み合わせて、組織片の細胞および細胞内容物の電気泳動による
測定と併用して部分的または完全に溶解した細胞を分析することができる。内因
性細胞成分（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小さな有機分子（例えば第二
メッセンジャーおよび他のもの））とともに細胞内に導入された外因性または人
工的成分（例えば酵素基質、ブロモデオキシウリジンまたは他の分子の識別に用
いられる化学的マーカーを含む分子）の分析も予想されている。
【００５２】 本発明および多様な実施態様を説明するために本明細書で用いた用語は、それ
らが一般的に規定されている意味を指すだけでなく、一般的に規定されるそれら
の意味を越えて本明細書での構造、材料および作用における特別な規定も含まれ
ることは理解されるべきである。したがって、ある要素が本明細書の流れから２
つ以上のものを含むと理解される場合は、請求の範囲内でのその使用は、本明細
書が意味するものおよびその用語自体が意味するものの可能な全てを包括すると
理解されねばならない。
らが一般的に規定されている意味を指すだけでなく、一般的に規定されるそれら
の意味を越えて本明細書での構造、材料および作用における特別な規定も含まれ
ることは理解されるべきである。したがって、ある要素が本明細書の流れから２
つ以上のものを含むと理解される場合は、請求の範囲内でのその使用は、本明細
書が意味するものおよびその用語自体が意味するものの可能な全てを包括すると
理解されねばならない。
【００５３】 前記請求項における用語および要素の定義は、従って本明細書においては、前
記記載に定義された要素の組み合わせのみならず、同等の構造、物質および、実
施的に同じ結果を得られる実質的に同じ方法における実質的に同じ機能を奏する
活動をも含むものである。この意味において発明では、前記請求項における任意
の一つの要素を２以上の要素に同等置換することは、前記請求項における任意の
２以上の要素を一つの要素に同等置換することと同様に意図に含まれる。
記記載に定義された要素の組み合わせのみならず、同等の構造、物質および、実
施的に同じ結果を得られる実質的に同じ方法における実質的に同じ機能を奏する
活動をも含むものである。この意味において発明では、前記請求項における任意
の一つの要素を２以上の要素に同等置換することは、前記請求項における任意の
２以上の要素を一つの要素に同等置換することと同様に意図に含まれる。
【００５４】 当業者から見て請求の範囲の事柄とは本質的に変わらないものは、現在知られ
ているか将来考案されるかにかかわらず、請求の範囲内と解される。したがって
、当業者に現在知られているかまたは将来考案される明白な代替物は請求の範囲
の成分に含まれる。 したがって請求の範囲には、上記で具体的に詳述されたもの、概念的に同等な
もの、明白に代替できるもの、および本発明の本質的思想に本質的に含まれるも
のを包含すると理解されるべきである。
ているか将来考案されるかにかかわらず、請求の範囲内と解される。したがって
、当業者に現在知られているかまたは将来考案される明白な代替物は請求の範囲
の成分に含まれる。 したがって請求の範囲には、上記で具体的に詳述されたもの、概念的に同等な
もの、明白に代替できるもの、および本発明の本質的思想に本質的に含まれるも
のを包含すると理解されるべきである。
【図１Ａ】 本発明の細胞の迅速制御溶解に用いられるシステムの模式図であ
る。
る。
【図１Ｂ】 図１Ａで用いられるキャピラリー吸入口の近傍領域の拡大側面模
式図で、ただ１つの細胞および集中レーザーパルスの位置に対するキャピラリー
吸入口の位置を示している。
式図で、ただ１つの細胞および集中レーザーパルスの位置に対するキャピラリー
吸入口の位置を示している。
【図１Ｃ】 図１ＡおよびＢで用いられるキャピラリー吸入口の近傍領域の拡
大底面模式図で、ただ１つの細胞および集中レーザーパルスの位置に対するキャ
ピラリー吸入口の位置を示している。
大底面模式図で、ただ１つの細胞および集中レーザーパルスの位置に対するキャ
ピラリー吸入口の位置を示している。
【図２】 溶解前後に撮影したビデオ静止画像である。
【図２Ａ】 細胞溶解直前に撮影した細胞の顕微鏡写真である。
【図２Ｂ】 本発明の適用された溶解開始の瞬間のビデオの１こまである。レ
ーザーの焦点はカバースリップの表面の直ぐ下で、したがって細胞は焦点からわ
ずかに外れている。矢印で示した明るい像は反射像で、実際のレーザーパルスで
はない。
ーザーの焦点はカバースリップの表面の直ぐ下で、したがって細胞は焦点からわ
ずかに外れている。矢印で示した明るい像は反射像で、実際のレーザーパルスで
はない。
【図２Ｃ】 溶解後３３ミリ秒での細胞のビデオの１こまである。細胞の残 骸および分泌顆粒が認められる。レーザーとガラスの基礎体との相互作用によっ
て生じたガラス内のディボットも見える。
て生じたガラス内のディボットも見える。
【図２Ｄ】 図２Ｃで示したものと同じビデオの１こまであるが、画像中の細
胞の残骸の解像を向上するために、図２Ａで示した像と適合させるために焦点面
が調節されている。
胞の残骸の解像を向上するために、図２Ａで示した像と適合させるために焦点面
が調節されている。
【図３】 キャピラリーの吸入口に位置するただ１つの細胞を３３ミリ秒毎
に撮影した一連のビデオ静止画像である。
に撮影した一連のビデオ静止画像である。
【図３Ａ】 レーザーパルス適用直前の細胞を示す。
【図３Ｂ】 未だ細胞と反応していない、レーザーパルス点から生じた環状 波を示す。
【図３Ｃ】 溶解後の細胞を示す。細胞残骸および内容物はキャピラリーに ロードされ、もはや画像中に見ることはできない。カバースリップ内にレーザー
によって誘発された傷が見える。
によって誘発された傷が見える。
【図４】 発蛍光団、フルオレセインおよび／またはオレゴングリーンを含
有する単一細胞および遊離酸スタンダードの４連の電気泳動図を示す。
有する単一細胞および遊離酸スタンダードの４連の電気泳動図を示す。
【図５】 フルオレセインおよびオレゴングリーンの両方と一緒にロードさ
れた２つの細胞の電気泳動図である。これらの細胞は連続的に溶解され、続いて
連続的にキャピラリーにロードされた。添字“１”は時間的に最初に溶解された
細胞のピークを示し、添字“２”は２番目に溶解された細胞のピークを示す。
れた２つの細胞の電気泳動図である。これらの細胞は連続的に溶解され、続いて
連続的にキャピラリーにロードされた。添字“１”は時間的に最初に溶解された
細胞のピークを示し、添字“２”は２番目に溶解された細胞のピークを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 シムズ、 クリストファー、 イー． アメリカ合衆国 92612 カリフォルニア 州 アーヴァイン ヴァージル コート 22 (72)発明者 バーンズ、 マイケル、 ダブリュー． アメリカ合衆国 92679 カリフォルニア 州 コート デ カザ ヴィア コリナス 31132 (72)発明者 メレディス、 ギャヴィン、 ディー． アメリカ合衆国 92007−1221 カリフォ ルニア州 カーディフ−バイ−ザ−シー シー ヴィレッジ サークル 2160 (72)発明者 クラシーヴァ、 タチアナ、 ビー． アメリカ合衆国 92612 カリフォルニア 州 アーヴァイン ニュートン コート 22 (72)発明者 トロンバーグ、 ブルース、 ジェイ． アメリカ合衆国 92612 カリフォルニア 州 アーヴァイン ゾラ コート 17 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BA14 BB02 BB17 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FA12 FA16 FB01 FB05 GC15 HA06 JA07 4B033 NG05 NH05 NH06 NJ04 【要約の続き】 中で発生する。開示の実施態様では、細胞チェンバーの ガラスと緩衝液の境界または境界近くのスライドにレー ザーパルスを集中させる。溶解されるべき細胞（４６） またはその細胞成分は細胞チェンバー中で培養されてい る。
Claims (33)
- 【請求項１】 選択された細胞またはその細胞成分の内容物を溶解および分
析する方法であって、 複数の細胞またはその細胞成分の少なくとも１つを媒体中で制御的に選択する
工程； 前記少なくとも１つの選択された細胞またはその細胞成分を、レーザーによっ
て発生させたショック波で前記媒体中で破壊する工程； 前記細胞またはその細胞成分の前記内容物の少なくとも一部を分析装置に採集
する工程；および 前記採集内容物を分析する工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記細胞またはその細胞成分の前記内容物の一部が前記細胞
の溶解から１秒未満で採集される請求項１の方法。 - 【請求項３】 前記細胞またはその細胞成分の前記内容物の一部が前記細胞
の溶解から３３ミリ秒未満で採集される請求項１の方法。 - 【請求項４】 前記細胞またはその細胞成分の前記内容物の一部が前記細胞
の溶解から１〜１０マイクロ秒で採集される請求項１の方法。 - 【請求項５】 複数の細胞またはその細胞成分の少なくとも１つを制御的に
選択する工程が、前記選択細胞またはその細胞成分を特定し、さらに相対配置さ
せることを含む請求項１の方法。 - 【請求項６】 前記細胞またはその細胞成分の前記内容物の少なくとも一部
を採集する工程が、前記選択された細胞またはその細胞成分から破壊分離された
生化学的反応物の反応を停止し、ほぼ破壊分離時に存在していた状態で生化学的
反応物のその後の分析を可能にすることを含む請求項１の方法。 - 【請求項７】 前記媒体中の前記選択された細胞またはその細胞成分を制御
配置する工程が、前記細胞またはその細胞成分を前記媒体に少なくとも近接して
配置された基礎体に付着させることを含む請求項５の方法。 - 【請求項８】 前記細胞またはその細胞成分が自由に浮遊し、さらに前記選
択された細胞またはその細胞成分を前記媒体中に制御配置する工程が、前記細胞
またはその細胞成分を前記媒体中のある位置にレーザーマイクロビーム光学ピン
セットによって一時的に保持することを含む請求項５の方法。 - 【請求項９】 前記細胞またはその細胞成分が自由に浮遊し、さらに前記選
択された細胞またはその細胞成分を前記媒体中に制御配置する工程が、機械的マ
イクロマニピュレーターで保持されたピペットまたは他の装置を前記細胞または
その細胞成分に付着させることによって、前記細胞またはその細胞成分を前記媒
体中のある位置に一時的に保持することを含む請求項５の方法。 - 【請求項１０】 前記細胞またはその細胞成分が自由に浮遊し、さらに前記
選択された細胞またはその細胞成分を前記媒体中に制御配置する工程が、前記細
胞またはその細胞成分を制限区画内に配置することを含む請求項５の方法。 - 【請求項１１】 前記細胞またはその細胞成分が自由に浮遊し、さらに前記
選択細胞またはその細胞成分を前記制限区画内に制御配置する工程が、前記細胞
またはその細胞成分を前記分析装置の吸入口に配置することを含む請求項１０の
方法。 - 【請求項１２】 前記破壊された細胞またはその細胞成分の前記内容物の少
なくとも一部を前記分析装置に採集する工程が、電気泳動カラムに前記細胞また
はその細胞成分を採集することを含む請求項１の方法。 - 【請求項１３】 前記破壊された細胞またはその細胞成分の前記内容物の少
なくとも一部を前記分析装置に採集する工程が、電気泳動カラムに前記細胞また
はその細胞成分を採集することを含む請求項２の方法。 - 【請求項１４】 前記採集内容物を分析する工程が、レーザー誘発蛍光を用
いて前記内容物を電気泳動により分析することを含む請求項１３の方法。 - 【請求項１５】 前記選択された細胞または細胞成分をレーザー発生ショッ
ク波で前記媒体中で破壊する工程が、パルスレーザービームを前記細胞またはそ
の細胞成分には集中させずに、前記細胞またはその細胞成分に近接した位置に集
中させてショック波を発生させることを含む請求項１の方法。 - 【請求項１６】 前記選択された細胞または細胞成分をレーザー発生ショッ
ク波で前記媒体中で破壊する工程が、前記細胞内またはその細胞成分内、または
前記細胞上またはその細胞成分上に、直接パルスレーザービームを集中させてシ
ョック波を発生させることを含む請求項１の方法。 - 【請求項１７】 パルスレーザービームを前記選択された細胞またはその細
胞成分内にまたはそれらの上に直接集中させることによって前記細胞またはその
細胞成分を破壊する工程が、前記細胞またはその細胞成分内に開口部を限定して
、細胞質の内容物のみをそこから溶解させることを含む請求項１６の方法。 - 【請求項１８】 前記破壊細胞またはその細胞成分の前記内容物の少なくと
も一部を前記分析装置で採集する工程が、前記媒体の流動流の手段による請求項
１の方法。 - 【請求項１９】 前記破壊細胞またはその細胞成分の前記内容物の少なくと
も一部を前記分析装置で採集する工程が、前記媒体のサイフォン流動流の手段に
よる請求項１８の方法。 - 【請求項２０】 前記破壊細胞またはその細胞成分の前記内容物の少なくと
も一部を前記分析装置で採集する工程が、前記媒体を介した電気泳動の手段によ
る請求項１の方法。 - 【請求項２１】 前記破壊細胞またはその細胞成分の前記内容物の少なくと
も一部を前記分析装置で採集する工程が、前記内容物に衝突した前記ショック波
に由来する力による請求項１８の方法。 - 【請求項２２】 前記破壊細胞またはその細胞成分の前記内容物の少なくと
も一部を前記分析装置で採集する工程が、電気的浸透圧による流動流による請求
項１８の方法。 - 【請求項２３】 複数の細胞またはその細胞成分の１つの内容物を溶解およ
び分析する装置であって、 前記細胞またはその細胞成分の少なくとも１つを制御的に選択する細胞選択装
置； パルスを発生させて前記少なくとも１つの選択された細胞またはその細胞成分
を溶解させるレーザー； 前記内容物を分析する分析装置；および 前記溶解細胞またはその細胞成分の前記内容物の少なくとも一部を前記分析装
置に捕捉する採集装置 を含むことを特徴とする装置。 - 【請求項２４】 前記採集装置が、前記溶解細胞または細胞成分の前記内容
物の少なくとも前記部分を、前記細胞またはその細胞成分の溶解から１秒以内に
前記分析装置に送る請求項２３の装置。 - 【請求項２５】 前記採集装置が、前記溶解細胞または細胞成分の前記内容
物の少なくとも前記部分を、前記細胞またはその細胞成分の溶解から３３ミリ秒
以内に前記分析装置に送る請求項２３の装置。 - 【請求項２６】 前記採集装置が、前記溶解細胞または細胞成分の前記内容
物の少なくとも前記部分を、前記細胞またはその細胞成分の溶解から１〜１０マ
イクロ秒以内に前記分析装置に送る請求項２３の装置。 - 【請求項２７】 前記分析装置が、前記内容物についてポリメラーゼ連鎖反
応を実施する手段、前記ポリメラーゼ連鎖反応の生成物を分離する手段、および
分離された分子を検出する手段を含む請求項２３の装置。 - 【請求項２８】 前記細胞またはその細胞成分が前記選択装置によって特定
され、さらに前記レーザーが前記特定された細胞または細胞成分に近接して媒体
中でショック波を発生させる請求項２３の装置。 - 【請求項２９】 前記採集装置が、溶解時に前記細胞またはその細胞成分を
通過して前記分析装置に媒体を流れ込ませることによって前記一部を配送する請
求項２３の装置。 - 【請求項３０】 前記採集装置が、溶解時に前記分析装置と前記細胞または
その細胞成分との間の媒体中に電気泳動を提供することによって前記一部を配送
する請求項２３の装置。 - 【請求項３１】 前記採集装置が、溶解時に前記分析装置と前記細胞または
その細胞成分との間の媒体中に電気的浸透圧流を提供することによって前記一部
を配送する請求項２３の装置。 - 【請求項３２】 前記採集装置が、前記細胞または細胞成分の溶解時に、媒
体中のショック波に由来する、前記細胞または細胞成分を前記分析装置に移動さ
せる力を提供して、前記一部を配達する請求項２３の装置。 - 【請求項３３】 複数の細胞またはその細胞成分の１つの内容物を迅速に溶
解し分析する方法であって、 ピペットの吸入口に近接して前記選択された細胞または成分を相対配置するこ
とによって、前記複数の細胞または細胞成分の少なくとも１つを制御的に選択す
ること； 前記選択された細胞またはその細胞成分をレーザーによって発生させたパルス
で溶解すること； 前記溶解細胞またはその細胞成分の前記内容物の少なくとも一部をその後の分
析のために溶解から１秒以内に前記ピペット内に採集すること；さらに 前記内容物における溶解後の更なる実質的な生物学的反応を停止させることを
含むことを特徴とする方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/036,706 US6156576A (en) | 1998-03-06 | 1998-03-06 | Fast controllable laser lysis of cells for analysis |
| US09/036,706 | 1998-03-06 | ||
| PCT/US1999/004595 WO1999045372A1 (en) | 1998-03-06 | 1999-03-03 | Fast controllable laser lysis of cells for analysis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=21890154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000534860A Withdrawn JP2002505856A (ja) | 1998-03-06 | 1999-03-03 | 細胞の分析用迅速制御レーザー溶解 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1060387A1 (ja) |
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| AU (1) | AU2889199A (ja) |
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| IS (1) | IS5608A (ja) |
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