JP2008527312A - たとえば細胞溶解のための脈動圧力波の生成 - Google Patents

Abstract

本発明は、制御された熱源（好ましくはレーザ３）が封入された液体内に脈動蒸気泡４を生成する方法に関する。脈動率（周波数）は好ましくは超音波領域内であり、それによって液体内にキャビテーションが生じる。キャビテーション効果によって細胞または細菌芽胞など懸濁成分の破壊が起こる。細胞成分の超音波破壊は音波破壊による溶解として周知である。

Description

（発明の分野）
本発明は、制御された熱源（好ましくはレーザ）によって液体中に脈動蒸気泡を生成する方法に関する。脈動率（周波数）は好ましくは超音波領域内であり、かなりの圧力を有し、それによって液体内にキャビテーションが生じる。キャビテーション効果によって細胞または細菌芽胞など懸濁成分の破壊が起こる。細胞成分の超音波破壊は音波破壊による溶解として周知である。

（背景）
細胞または細菌芽胞など生化学的成分を試験する際は、対象の物質（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘモグロビン、タンパク質など）をそれらが含まれている前記細胞または芽胞から抽出し、化学薬品、酵素の直接の接近または直接測定から遮蔽しなければならない。細胞膜または細菌芽胞壁を破壊する方法は、溶解として周知である。溶解の一方法は、前記膜または壁を化学的に破壊して開放するまたは溶解することができる溶解剤を使用することである。他の方法は、粉砕（たとえば「フレンチプレス」）のような機械的方法、または凍結と解凍のステップを繰り返して結晶化によって細胞壁を物理的に破裂させることである。

一般的な溶解方法の一つは音波破壊による方法である。音波破壊は、懸濁細胞または芽胞を超音波に曝露することである。細胞または芽胞が懸濁した液体媒体（ほとんどの場合は水）は、超音波エネルギの担体の働きをする。加えられる圧力がかなり大きいと、液体中にキャビテーションが生じる。キャビテーションにより高圧マイクロ気泡が形成され、それぞれ崩壊する。マイクロ気泡の形成およびその後の崩壊によって、液体媒体に、したがってその中に含まれる細胞または芽胞の周囲に、破壊剪断力が生じ、最終的に膜および壁が破壊されて開放され、内容物が放出される。

（発明の概要）
本発明の目的は、液体中に脈動圧力波（ＰＰＷ）を生成する方法を提供することであり、液体は、内部に作製されるトランスデューサ、すなわち外部の超音波ホーンまたは圧電トランスデューサなどの、外部のＰＰＷトランスデューサとの機械的インターフェースを持たずに、マイクロチャネルまたはマイクロチャンバ内に含まれることができる。

本発明の他の目的は、液体中にＰＰＷを生成する方法を提供することであり、液体はマイクロチャネルまたはマイクロチャンバに含まれることができ、ＰＰＷが液体中にキャビテーションを起こす。

本発明の他の目的は、１つまたは複数の細胞を液体に溶解する方法を提供することであり、液体はマイクロチャネルまたはマイクロチャンバに含まれることができる。

本発明の他の目的は、１つまたは複数の細胞を液体に分散する方法を提供することであり、液体はマイクロチャネルまたはマイクロチャンバに含まれることができる。

本発明の他の目的は、細胞を溶解する簡単な方法、好ましくは、溶解した細胞の成分を分析するさらなるステップに適合する、または貢献する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、局所の、すなわち空間的に限定されたＰＰＷを液体中に生成して、たとえば局所のキャビテーションおよび／または局所の細胞溶解を生じ、あるいは局所の粒子分散を生じる方法を提供することである。

本発明の他の目的は、説明および実施例を読めば明らかになるであろう。

したがって、本発明の一態様は、液体中に脈動圧力波（ＰＰＷ）を生成する方法に関し、この方法は、
ａ）加熱手段を提供するステップ、
ｂ）前記加熱手段で液体の一部分を加熱して、液体のその部分を蒸発させることによって、蒸気泡を形成するステップ、
ｃ）蒸気泡を部分的にまたは完全に凝縮するステップ、および
ｄ）ステップｂ）とｃ）を繰り返すステップを含む。

好ましくは、ＰＰＷは超音波である。

本発明の他の態様は、生物細胞を液体に溶解する方法に関し、この方法は液体中にＰＰＷを生成することを含む。

本発明の他の態様は、粒子を液体中に分散する方法に関し、この方法は液体中にＰＰＷを生成することを含む。

以下に本発明の幾つかの実施形態を図面を参照して記載する。

（発明の詳細な説明）
本発明の一態様は、液体中に脈動圧力波（ＰＰＷ）を生成する方法に関し、この方法は、
ａ）加熱手段を提供するステップ、
ｂ）前記加熱手段で液体の一部分を加熱して、液体のその部分を蒸発させることによって、蒸気泡を形成するステップ、
ｃ）蒸気泡を凝縮するステップ、および
ｄ）ステップｂ）とｃ）を繰り返すステップを含む。

本発明の好ましい一実施形態では、ＰＰＷは超音波である。

ＰＰＷを液体の幅広のアレイで生成することができる。たとえば液体は、水、ＤＭＳＯ、アセトン、およびアルコールのグループから選択される溶媒を含むことができる。

さらに、または別法として、液体は、たとえばベンゼン、トルエン、キシレン、ヘプタン、オクタン、およびそれらの混合物などの非極性溶媒でもよい。

アルコールは、たとえばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールからなるグループから選択することができる。

本発明の好ましい一実施形態では、液体は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）または７５％（ｗ／ｗ）など少なくとも１０％（ｗ／ｗ）の水を含み、より好ましくは少なくとも９０％（ｗ／ｗ）の水を含む。

液体は、たとえば全血、血清、血漿、唾液、尿、それらの組織または成分を含むことができる。

本発明の一実施形態では、液体は水性液体で希釈された全血である。

本発明の好ましい一実施形態では、たとえば液体は脱気水など脱気液体である。脱気液体は、たとえば液体１ｋｇあたりに、多くても１０ｍｇ、５ｍｇ、３ｍｇ、２ｍｇ、１ｍｇ、０．５ｍｇ、０．１ｍｇ、または０．０５ｍｇなど、多くても０．０１ｍｇなど、多くても１５ｍｇの気体が溶解された液体を含むことができる。たとえば脱気水性液体は、水性液体１ｋｇあたりに、多くても１０ｍｇ、５ｍｇ、３ｍｇ、２ｍｇ、１ｍｇ、０．５ｍｇ、０．１ｍｇ、または０．０５ｍｇなど、多くても０．０１ｍｇなどの、多くても１５ｍｇの気体が溶解されたものでもよい。

液体は１つまたは複数の添加物を含むことができる。１つまたは複数の添加物は、たとえば、界面活性剤、保存薬、ｐＨ緩衝液、塩、および水溶性ポリマーからなるグループから選択することができる。

界面活性剤は、たとえば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＮＰ４０、オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、および硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）からなるグループから選択することができる。

保存薬はたとえばアジ化ナトリウムでもよい。

ｐＨ緩衝剤は、たとえば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ、Ｍｏｐｓ、およびＨＥＰＥＳ緩衝液からなるグループから選択することができる。

塩は、たとえばＭｇＣｌ_２、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ−グルタマート、およびＫ−グルタマートからなるグループから選択することができる。

水溶性ポリマーは、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／またはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）でもよい。

関連する添加物についてのさらなる情報および例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他の教本または当業者に周知の他の一般の教本で見つかるであろう。

前後関係「Ｘおよび／またはＹ」で使用される用語「および／または」は「Ｘ」または「Ｙ」、あるいは「Ｘ」および「Ｙ」と解釈されるべきである。

本発明の好ましい一実施形態では、ＰＰＷ生成中のたとえば水性液体など液体の平均温度は、０℃〜１００℃、１０℃〜８０℃、および２０℃〜６０℃などの、−１０℃〜１２０℃である。好ましい一実施形態では液体の温度は６０℃〜８０℃であり、より好ましくは６５℃〜７５℃、たとえば７１℃などである。通常の液体の平均温度は−１０℃〜１２０℃であるが、たとえば加熱手段によって加熱されるため、および／またはＰＰＷによって生じるキャビテーションのために、比較的高温の液体の一部分が存在することがあることを留意されたい。

本発明の一実施形態では、ステップｂ）およびｃ）で蒸発されて部分的にまたは完全に凝縮される液体の部分は、それぞれ液体の全質量のうちの僅かな割合を示す。液体のその部分は液体の全質量の、たとえば多くても０．５％、０．１％、または０．０５％などの、多くても１％、または好ましくは液体の全質量の多くても０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、または０．００００１％など、多くても０．０００００５％などの、多くても０．０１％でもよい。

本発明の好ましい一実施形態では、液体の一部分が膜沸騰によって蒸発される。膜沸騰は、液体の一部分を十分高速で加熱して、液体の一部分の蒸発が、たとえば長くても５００μｓ間、または好ましくは長くても１００μｓ間、５０μｓ間、１０μｓ間、あるいは５μｓ間、より好ましくは長くても１μｓ間、０．１μｓ間、もしくは０．０１μｓ間など、ほぼ瞬間に行われることによって生じる。速い蒸発によって、通常、液体の残りの部分が加熱されないように保護する働きをする保護蒸気層が形成される。液体の一部分の蒸発は約０．１μｓ〜１００μｓ間で行われるのが好ましい。

本発明の好ましい一実施形態では、液体は壁の壁表面と接触している。壁は、たとえば液体を含む容器の一部分を形成する。容器は、たとえばマイクロチャンバまたはマイクロチャネルでもよい。

マイクロチャンバの体積は通常、最大５０μＬ、１０μＬ、５μＬ、１μＬ、１００ｎＬ、または１０ｎＬなど、最大１ｎＬなどの、最大１００μＬである。さらに小さいマイクロチャンバの体積も想定される。たとえば、マイクロチャンバの体積は、最大５０ｐＬ、１０ｐＬ、５ｐＬ、または１ｐＬなど、最大体積が０．１ｐＬなどの、最大１００ｐＬである。好ましくはマイクロチャンバの体積は最大１０ｎＬであり、より好ましくはマイクロチャンバの通常の体積は最大１ｎＬである。

ペピ（ｐｅｐｉ）では、マイクロチャンバの体積は、０．１ｐＬ〜１００μＬであり、好ましくは１０ｐＬ〜１μＬ、より好ましくは０．５ｎＬ、１ｎＬ、または５ｎＬなどの、１００ｐＬ〜１０ｎＬである。

マイクロチャンバは１つまたは複数の開口を含むことができ、たとえばその開口を１つまたは複数のマイクロチャネルに連結することができる。

マイクロチャネルは通常の断面寸法が、最大２５０μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、７５μｍ、５０μｍ、２５μｍ、または１５μｍなど、最大５μｍなどの、最大５００μｍである。好ましくは、マイクロチャネルの断面寸法は最大１００μｍであり、より好ましくはマイクロチャネルの断面寸法は最大５０μｍである。マイクロチャネルは、たとえば幅１００μｍかつ深さ５０μｍなど非対称の寸法を有することができる。

多くのタイプの加熱手段を使用して液体の一部分を加熱することができる。たとえば加熱手段は、加熱要素および電磁放射からなるグループから選択することができる。

加熱要素は、たとえば抵抗器などオーム加熱要素でもよく、またはたとえば導電特性を有する液体など液体の一部分でもよい。

加熱要素を、たとえば液体に接触する壁表面上に配置することができ、または壁の中に配置することができる。

好ましい一実施形態では、加熱要素はマイクロサイズである。たとえば、加熱要素の最大寸法は、最大１０００μｍ、５００μｍ、２５０μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、または５０μｍなど、最大２５μｍなどの、最大１０００μｍであることが好ましい。

本発明の好ましい一実施形態では、電磁放射は電磁放射のビームであり、たとえば集束レーザビームなど集束ビームである。

電磁放射は通常、電磁放射源によって供給される。電磁放射源は、気体レーザ、レーザダイオード（ＬＤ）など固体レーザでもよく、または光源は発光ダイオード（ＬＥＤ）、キセノンランプ、または任意の適切な強度のフィラメント電球でもよい。レーザまたはＬＥＤをパルスモードまたは連続モードで作動することができ、キセノンランプまたはフィラメント電球を機械的遮断または偏向手段を使用して変調することができる。

電磁放射は、たとえば液体によって吸収することができ、または液体と接触状態の壁表面を含む壁によって吸収することができる。

本発明の特に好ましい一実施形態では、電磁放射は液体と接触している壁表面に吸収される。壁表面は、たとえば光吸収材料の層を含み、その場合、壁の残りの部分が電磁放射の非光吸収担体として働く。

一実施形態では、たとえばマイクロチャネルおよび／またはマイクロチャンバなどの容器は、電磁放射の１つまたは複数の波長に透明な透明窓を含む。波長７００ｎｍから３０００ｎｍを含む電磁放射を使用する場合、たとえば赤外線レーザによって供給される場合、透明窓はたとえばシリコンを含むことができる。透明窓は、たとえば可視波長に透明なガラスまたはプラスチックを含むことができる。たとえば、中心波長がたとえば６３２ｎｍ、６３５ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、または７２０ｎｍの赤色発光ダイオードレーザを使用することができる。

光吸収材料は、光源から出る光エネルギを簡単に吸収し、吸収した光をジュール熱に変換する任意の材料でもよい。こうした材料の１つは窒化アルミニウムでもよく、または特にシリコンが基板材料として使用される場合は、ホウ素でドープされたシリコンあるいはリンでドープされたシリコンなどドープされたシリコンでもよく、または好ましい一実施形態では特定のもしくは複数の波長の吸収を向上させる添加物を含むポリマー（たとえばＡｖｅｃｉａ、ＵＫ（ＰＲＯ−ＪＥＴ８３０ＮＰ）、Ｅｐｏｌｉｎ、ＵＳ（ＥｐｏＬｉｇｈｔ（商標）４１２１）、Ｃｌｅａｒｗｅｌｄ、ＵＳ（ＬＤ１２０）、またはＴｒｅｆｆｅｒｔ、ＦＲから市販されている製品）でもよい。

光吸収材料はマイクロチャネル壁またはマイクロチャンバ壁の一体化部分を形成し、壁の熱抵抗を十分に低くして、かなりの熱量をマイクロチャネルまたはマイクロチャンバに伝達することができるようにする。したがって光吸収材料は、たとえばマイクロチャネル内の液体を加熱するホットプレートの働きをすることができる。光吸収材料は、光スペクトルの狭い領域の吸収剤でもよく、またはＵＶから中赤外線（ＭＩＲ）の波長全てに対して完全に不透過性および吸収性でもよい。

光吸収材料を壁に塗布、噴き付け、メッキ、または斑点付けし、光吸収材料がチャネル壁上の次の層を形成することができ、またはチャネル壁に吸収されてもよい。マイクロチャネルおよび／またはマイクロチャンバを第１および第２の基板で形成することができ、前記第１の基板は透明窓を含み、前記第２の基板は光吸収材料を含む。

光吸収材料は、壁表面を照射する電磁放射の強度の少なくとも２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％など、電磁放射の強度の少なくとも９９．９９％などの、少なくとも１％が光吸収材料に吸収されるように選択されることが好ましい。

加熱手段によって加熱される液体の一部分によって形成される蒸気泡は、通常は最高の高さが１μｍ〜２００μｍ、好ましくは５μｍ〜５０μｍ、より好ましくは約２５μｍまたは約３０μｍなど１０μｍ〜４０μｍに達する。

本発明の一実施形態では、ステップｂ）ごとに新しい蒸気泡が形成される。あるいは、前のステップｃ）からの蒸気泡は新しいステップｂ）が開始されたときにはまだ十分に凝縮されておらず、新しいステップｂ）からのエネルギが、存在している蒸気泡に新しい蒸気を加える。

ステップｂ）の加熱手段による加熱期間は、通常は０．１〜１００μｓ間、好ましくは０．５〜５０μｓ間、より好ましくは１〜１０μｓ間である。

ステップｃ）で蒸気泡が冷却され、それによって蒸気泡が凝縮される。蒸気泡はたとえばステップｃ）中で完全に凝縮され、すなわち蒸気泡の全ての蒸気が液体の形態に戻る。

蒸気泡を受動的に冷却することができる。すなわち加熱手段のエネルギが周囲の液体内に放散され、マイクロチャンバまたはマイクロチャネルの壁にも放散される。蒸気泡の受動的冷却を、様々な金属および半導体など熱伝導率の高い材料を使用することによって促進することができる。一実施形態では、シリコンが好ましい壁材料である。

ステップｂ）の期間は、通常は１〜１００μｓ間、好ましくは５〜５０μｓ間、より好ましくは、１５μｓ間、２０μｓ間、２５μｓ間、３０μｓ間、または３５μｓ間などの、１０〜４０μｓ間である。

本発明の一実施形態では、ステップｂ）とステップｃ）が固定周波数で繰り返される。

同様に、ステップｂ）とステップｃ）は変化する周波数で繰り返すこともできる。

本発明の好ましい一実施形態では、ステップｂ）とステップｃ）は、周波数１０〜５００ｋＨｚなど０．５〜１０００ｋＨｚで繰り返され、好ましくは１５〜１５０ｋＨｚ、より好ましくは２０〜１００ｋＨｚまたは１５〜５０ｋＨｚで繰り返される。

新しいステップｂ）では、前のステップｂ）中で前の蒸気泡が形成されたマイクロチャネルまたはマイクロチャンバの同じ場所で、蒸気胞を形成することができる。同様に、新しいステップｂ）では、前のステップｂ）中で前の蒸気泡が形成されたマイクロチャネルまたはマイクロチャンバとは異なる場所で、新しい蒸気胞を形成することができる。

新しいステップｂ）の新しい蒸気泡は、前のステップｂ）の前の蒸気泡が構成されたのとほぼ同じ液体の部分で構成されることができる。あるいは、蒸気泡は、前のステップｂ）で蒸発されたのとは異なる液体の部分で構成されることもできる。

本発明の一実施形態では、液体はマイクロチャネルおよび／またはマイクロチャンバを通って流れる。通常の流量は１ｐＬ〜１００μＬ／分、好ましくは１ｎＬ−１０μＬ／分、より好ましくは１０ｎＬ〜１μＬ／分である。別法では、液体はマイクロチャネルおよび／またはマイクロチャンバを通って流れない。

ステップｂ）とステップｃ）の繰り返しの全期間は、通常は１μＳ〜２ｍＳ間、好ましくは２μＳ〜１００μＳ間、より好ましくは１０μＳ〜５０μＳ間、または５μＳ〜２０μＳ間である。

本発明の重要な一実施形態では、ＰＰＷによって液体中にキャビテーションが生じる。

液体に加えられるＰＰＷのエネルギの強度が液体の分子を共に保持する引力を上回ると、キャビテーションと呼ばれる現象が起こる。キャビテーションは、マイクロ気泡の形成、成長、内破による崩壊であり、蒸気泡と混同すべきではない。こうしたマイクロ気泡の内破によって液体中に短命の「ホットスポット」が生成され、それが多様な化学反応を起こすための十分なエネルギを放出する。

キャビテーションの効果は、液体の温度、ＰＰＷの強度、キャビテーションの持続期間、およびＰＰＷの周波数など幾つかの要因の影響を受ける。

液体中にキャビテーションを生成する鍵は、「キャビテーション閾値」を超えることである。「キャビテーション閾値」は、液体中に導入されるエネルギの強度によってマイクロ気泡の形成、成長、および崩壊が開始する点である。様々な流体または液体が多様なキャビテーション閾値を有するが、キャビテーション閾値を超えるエネルギが加えられた場合のみ、キャビテーションが形成される。

したがって、本発明の好ましい一実施形態では、蒸気泡のサイズおよび／または液体変位、ならびに蒸気泡の形成と凝縮の割合が、すなわち１つまたは複数の蒸気泡が膨張しそれぞれ収縮する時に液体に加える圧力が、液体中にキャビテーションが生じるために十分である。

たとえば、加熱手段が電磁放射のビームの場合、スポット領域、ビームの効果、加熱期間、凝縮期間、および繰り返しの回数が、液体中にキャビテーションを生成するために十分でなければならない。

あるいは、加熱手段が加熱要素の場合、加熱要素の電圧、加熱期間、凝縮期間、および繰り返しの回数が液体中にキャビテーションを生成するために十分でなければならない。

キャビテーションは、通常、蒸発される液体の部分の付近で生じる。本発明の一実施形態では、キャビテーションが、蒸気泡の周囲からの最長距離２５００μｍ、１０００μｍ、７５０μｍ、５００μｍ、４００μｍ、３００μｍ、２００μｍ、１５０μｍ、または１００μｍなど、蒸気泡の周囲からの最長距離５０μｍ以内などの、最長距離５０００μｍ以内で生じることが好ましい。

本発明の他の実施形態では、キャビテーションは、蒸気泡の周囲からの距離が少なくとも１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１０００μｍ、２０００μｍ、または３０００μｍ以内など、蒸気泡の周囲からの距離が少なくとも５０００μｍ以内など、少なくとも５０μｍ以内で生じる。

蒸気泡の最大サイズは距離の計算に使用される。

本発明のさらなる実施形態では、キャビテーションは壁表面上への電磁放射のビームのスポットの中心からの最長距離が２５００μｍ、１０００μｍ、７５０μｍ、５００μｍ、４００μｍ、３００μｍ、または１００μｍなど、壁表面上への電磁放射のビームのスポットの中心からの最長距離が５０μｍ以内など、最長距離が５０００μｍ以内で生じる。

通常、キャビテーションは、壁表面上への電磁放射のビームのスポットの中心からの距離が１μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜２５０μｍ、２５０μｍ〜５００μｍ、５００μｍ〜１０００μｍ、および１０００μｍ〜５０００μｍなどの、１μｍ〜５０００μｍ以内で生じる。キャビテーションが少なくとも壁表面への電磁放射のビームのスポットの中心から１μｍ〜１００μｍなど、１μｍ〜２５０μｍ以内で生じることが好ましい。

本発明の他の実施形態では、キャビテーションは、壁表面上への電磁放射のビームのスポットの中心から少なくとも距離１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１０００μｍ、２０００μｍ、または３０００μｍなど、壁表面上への電磁放射のビームのスポットの中心から少なくとも距離５０００μｍ以内など、少なくとも距離５０μｍ以内で生じる。

本発明の他の実施形態では、キャビテーションは、加熱要素の中心からの最長距離が２５００μｍ、１０００μｍ、７５０μｍ、５００μｍ、４００μｍ、３００μｍ、または１００μｍなど、加熱要素の中心からの最長距離が５０μｍ以内などの、最長距離５０００μｍ以内で生じる。

キャビテーションの存在を幾つかの方法で検出することができる。キャビテーションは、たとえば感応マイクロフォンを使用して検出することができる。あるいは、キャビテーションは、水またはグリセロールに溶解したルミノールなどキャビテーショントレーサを使用して検出することができる。キャビテーショントレーサはキャビテーションに曝露させると光を出し、その光を光電子増倍管、冷却ＣＣＤアレイ、またはアバランシェダイオードなどの感応光学検出器で検出することができる。加熱手段が電磁放射の場合、キャビテーショントレーサによって出された光を検出するためには、電磁放射の波長をフィルターで除去する必要がある。

有用なルミノール溶液は、ルミノール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）をジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）に濃度１０^−２Ｍになるように溶解し、使用直前に、その溶液をリン酸ナトリウム０．０１Ｍおよび塩化ナトリウム０．１５Ｍを含むｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水で濃度１ｘ１０^−５Ｍに希釈することによって調製することができる。より高濃度のルミノールを使用することもできる。

キャビテーションの他のインジケータは、液体と接触するプラスチックの表面の物理的劣化である。こうした劣化は、顕微鏡またはＳＥＭ検査によって視覚的に検出することができる。

キャビテーション検出の他の方法は、径が約５μｍのラテックス粒子または赤血球など粒子の懸濁液をＰＰＷに曝露して、得られた懸濁液を顕微鏡で調べることである。キャビテーションが懸濁液中に生じた場合、破壊された懸濁粒子からのサブマイクロメートルの破片が懸濁液中に発見される。

本発明の重要な一実施形態では、液体は粒子を含む。たとえば液体は、少なくとも２個の粒子、１０個の粒子、１０^２個の粒子、１０^３個の粒子、１０^４個の粒子、１０^６個の粒子、または１０^８個の粒子など、少なくとも１０^１０個の粒子などの、幾つかの粒子を含むことができる。液体はたとえば粒子の懸濁液でもよい。

粒子は、有機ポリマー、金属、金属酸化物、合金、磁気材料、およびこれらの材料の組合せからなるグループから選択される材料を含むことができる。金属酸化物は石英またはガラスなど酸化シリコンでもよい。有機ポリマーは、ポリエチレングリコールポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリペプチド、ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリメタメタクリル酸、およびそれらの材料の組合せからなるグループから選択することができる。同様に、粒子は上記の材料を有する１つまたは複数のセグメントを有する複合材料を含むことができる。

粒子は、たとえば、生物細胞、マイクロ粒子、およびナノ粒子からなるグループから選択することができる。

粒子は、たとえば最長の断面寸法が１ｎｍ〜５００μｍである。粒子は、最長の断面寸法が、たとえば２５ｎｍ〜１０００ｎｍなど、１ｎｍ〜１０００ｎｍのナノ粒子でもよく、またはマイクロ粒子、すなわち最長の断面寸法が１μｍ〜５００μｍでもよい。

本発明の好ましい一実施形態では、粒子は生物細胞である。すなわち、液体は生物細胞または生物細胞の懸濁液を含むことができる。

生物細胞は、たとえば細菌、赤血球もしくは白血球または癌細胞など哺乳動物細胞でもよい。生物細胞は細菌芽胞でもよい。

キャビテーションに過剰に曝露されると、生物細胞の成分、すなわち受容体、細胞器官、タンパク質、および遺伝物質が損傷されることがある。本発明の一実施形態では、生物細胞を含む液体は、脈動圧力波に、最長で５００秒間、４００秒間、３００秒間、２００秒間、１００秒間、５０秒間、２５秒間、１５秒間、１０秒間、５秒間、４秒間、３秒間、２秒間、１秒間、０．１秒間、または０．０１秒間など、最長で０．００１秒間などの、最長で６００秒間曝露される。

本発明の重要な実施形態では、電磁放射はレーザビームである。

本発明の一実施形態では、電磁放射のビームのスポットの最大寸法は、ビームが、液体と接触している壁または壁表面と、接触するところであり、最大１０００μｍである。好ましくは、電磁放射のビームのスポットの最大寸法は、ビームが、液体と接触している壁または壁表面と、接触するところであるが、最大５００μｍであり、より好ましくは、最大２００μｍ、１００μｍ、７５μｍ、５０μｍ、２５μｍ、１５μｍ、１０μｍ、または５μｍなど、最大１μｍなどの、最大３００μｍである。

通常、たとえばレーザビームなど電磁放射のビームの効果は、１ｍＷ〜１００ｍＷ、１００ｍＷ〜５００ｍＷ、５００ｍＷ〜１Ｗ、１Ｗ〜２０Ｗ、および２０Ｗ〜２００Ｗなどの、１ｍＷ〜２００Ｗである。

ステップｂ）の加熱は、ステップｂ）中で電磁放射の単一のパルスを供給することによって、または蓄積されて単一パルスと同じエネルギを含む複数の比較的短いパルスを与えることによって実行される。

電磁放射は、気体レーザ、またはレーザダイオード等の固体レーザなど、レーザで供給することができる。電磁放射は、発光ダイオード（ＬＥＤ）、キセノンランプ、または任意の適切な強度のフィラメント電球によって提供することができる。レーザまたはＬＥＤは、パルスモードまたは連続モードで作動することができ、キセノンランプまたはフィラメント電球は、機械的遮断または偏向手段を使用して変調することができる。

電磁放射は、１９０ｎｍ〜４００ｎｍ、４００ｎｍ〜７００ｎｍ、７００ｎｍ〜１５００ｎｍ、および１５００ｎｍ〜５０００ｎｍなどの、１９０ｎｍ〜５０００ｎｍの波長を含むことができる。ペピでは、電磁放射は６３１〜６３３ｎｍ、６３４〜６３６ｎｍ、６６９〜６７１ｎｍ、６７９〜８１、７１９〜７２１ｎｍ、または８０６〜８０９ｎｍなど、および６３２ｎｍ、６３５ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、７２０ｎｍ、または８０８ｎｍなどの、６００ｎｍ〜８００ｎｍの波長を含む。

ペピでは、電磁放射のエネルギの少なくとも９５％または９９％など少なくとも９０％が、１９０ｎｍ〜４００ｎｍ、４００ｎｍ〜７００ｎｍ、７００ｎｍ〜１５００ｎｍ、および１５００ｎｍ〜５０００ｎｍなどの、１９０ｎｍ〜５０００ｎｍの波長によって供給される。ペピでは、電磁放射のエネルギの少なくとも９５％または９９％などの少なくとも９０％が、６３１〜６３３ｎｍ、６３４〜６３６ｎｍ、６６９〜６７１ｎｍ、６７９ｎｍ〜８１ｎｍ、７１９〜７２１ｎｍ、または８０６〜８０９ｎｍ、および６３２ｎｍ、６３５ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、７２０ｎｍ、または８０８ｎｍなどの、６００ｎｍ〜８００ｎｍの波長によって供給される。

本発明の他の態様は、生物細胞を液体に溶解する方法に関し、この方法は本明細書に記載した方法によって液体中にＰＰＷを生成することを含む。

したがって本発明は、生物細胞を液体に溶解する方法に関し、この方法は、
ａ）加熱手段を提供するステップ、
ｂ）前記加熱手段で液体の一部分を加熱して、液体のその部分を蒸発させることによって、蒸気泡を形成するステップ、
ｃ）蒸気泡を凝縮するステップ、および
ｄ）ステップｂ）とｃ）を繰り返すステップを含み、
液体中にＰＰＷを形成し、前記ＰＰＷが生物細胞を溶解する。

本発明の好ましい一実施形態では、ＰＰＷは本明細書に記載したように液体中にキャビテーションを形成するように制御される。

生物細胞を溶解する方法、およびＰＰＷを生成する方法は、さらに、
ｅ）溶解された生物細胞の成分を分析するステップ、を含む。

溶解された生物細胞の成分を、たとえば、参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ出願第ＷＯ２００４／０１６９４８号に記載されたシステムおよび方法によって分析することができる。

溶解された生物細胞の成分の分析は、たとえば細管電気泳動（ＣＥ）など電気泳動技法、ＰＣＲなど核酸増幅技法、イムノアッセイを含むことができる。上記その他の関連分析技法はＳａｍｂｒｏｏｋ他によりさらに詳細に記載されている。

溶解された生物細胞の成分の分析は、たとえば、ＵＶ分光法、ＶＩＳ分光法、ＮＩＲ分光法、ＩＲ分光法、および蛍光検出からなるグループから選択される方法など、光学分析の１つまたは複数の方法を含むことができる。

本発明の一態様は、粒子を液体中に分散する方法に関し、この方法は本明細書に記載した方法によって液体中にＰＰＷを生成することを含む。

用語「粒子の分散」とは、集塊された粒子を単一粒子または粒子の比較的小さい集塊に崩壊および／または再分散することを指す。

したがって、本発明は、粒子を液体中に分散する方法に関し、この方法は、
ａ）加熱手段を提供するステップ、
ｂ）前記加熱手段で液体の一部分を加熱して、液体のその部分を蒸発させることによって、蒸気泡を形成するステップ、
ｃ）部分的にまたは完全に蒸気泡を凝縮するステップ、および
ｄ）ステップｂ）とｃ）を繰り返すステップを含み、
液体中にＰＰＷを形成し、前記ＰＰＷが粒子を分散する。

本発明の特別の一態様は、液体中に脈動圧力波を生成する方法に関し、この方法は以下のステップを含む。
ｉ）前記液体の一部分の局所的加熱を行い、前記液体のその部分を蒸発状態にして、前記蒸気が膨張する時に残りの液体の体積を変位させるステップ、
ｉｉ）熱源を除去／熱源をスイッチオフにして、生成された蒸気を冷却し、凝縮し、収縮できるようにするステップ、
ｉｉｉ）ステップｉ）とｉｉ）を固定周波数で繰り返すステップ。
したがって、蒸気泡が繰り返し生成され、前記蒸気泡がそれぞれ崩壊することによって、液体媒体に対して振動する機械的トランスデューサとして働く。振動の周波数が（１２〜１５ｋＨｚより高い）超音波領域の場合、キャビテーションが液体中に生じ、内圧が非常に高いマイクロ気泡が形成される。マイクロ気泡の高圧によって液体中に懸濁した固体成分の破裂が起こる。懸濁成分は体細胞または細菌芽胞でもよく、それぞれ細胞膜、細菌の殻が、キャビテーション効果に曝露されると破壊され、最終的にたとえばＤＮＡ物質など細胞間または芽胞間の内容物が放出される。

局所加熱を送出して蒸気泡を生成するには幾つかの方法を適用することができる。一実施形態では、オーム加熱要素（抵抗器）を液体媒体と直接接触するように配置することができる。電子装置の制御によって加熱要素が駆動される。好ましい一実施形態では、熱が外部源によって加えられ、外部源から熱が気泡の形成が意図される位置に向けられる。任意の形態の電磁エネルギをその位置に向けることができる。

好ましい一実施形態では、液体媒体が封入された本体の一部分にレーザビームが向けられ、それによって集中エネルギが所望の位置に供給される。レーザエネルギを特別のインターフェース層内で吸収し、ジュール熱に変換することができる。レーザエネルギは、たとえば液体媒体内で高吸収率を示す適切なレーザ波長を使用して、液体自体の中でジュール熱に変換することもできる。集中エネルギはその場所に接触する液体を加熱し、即時に蒸気に移行させる。レーザビームを停止すると、加熱場所が迅速に冷却され、続いて、形成された蒸気泡が凝縮し崩壊する。レーザ照射源を一般の電子制御システムを使用して正確に制御することができる。前記制御システムは、加熱パルス期間ならびに断続的な停止期間を制御することができる。電子制御装置によって、有効に様々な周波数ならびにパルス動作を実行することができる。

体細胞の溶解のための動作の好ましい周波数は１５〜４０ｋＨｚ（たとえば２０ｋＨｚ）であるが、それよりも低い周波数（たとえば可聴周波数１〜１５ｋＨｚ）、ならびにそれよいも高い周波数を生成することができる。

本発明の他の実施形態では、超音波周波数が短期間だけ与えられ、それに超音波活動がない期間が後続する。短期間の動作によって液体中にキャビテーションが生じるが、その後の非活動期間によって懸濁した成分（たとえば細胞および／または細胞壁）は永久には破壊されない。しかし、活動によって細胞は非凝固化され、または分散される。特にサブマイクロメートルサイズの粉末（たとえばナノ粉末）は液体懸濁液中では凝固／集塊する傾向があるが、超音波バーストの影響で粉末が分散される。

好ましい一実施形態では、液体媒体はマイクロ流体システムに含まれ、懸濁成分を有する液体の一部分がサブミリメートルの寸法のマイクロチャネルまたはマイクロチャンバの一部分内で超音波効果を受けることができる。オーム加熱要素を上記のようにマイクロ流体システムに実装することができる。好ましい一実施形態では、ソフトウェア制御レーザビームがマイクロチャネルまたはマイクロチャンバの個々の場所に向けられ、それぞれ超音波の生成による気泡の形成と崩壊が、封入された液体の小さい選択部分だけに作用する。レーザビームは、マイクロ流体システム（またはチップ）の任意の部分に選択的にレーザビームの影響を与えるように、ＸまたはＸ−Ｙ走査デバイス（たとえば検流計）から方向付けることができる。一実施形態では、記載したように超音波を連続的に生成しながら、レーザビームでチャネルの一定の領域または長さを繰り返し走査し、それによって液体のより大きい領域または体積が音波破壊効果を受けるようにすることができる。

図１は、レーザエネルギが液体媒体を含む閉込め部に向けられている、本発明の好ましい実施形態を示す図である。閉込め本体（１）は閉込め部またはチャンバもしくはチャネルの断面（２）を保持する。レーザビーム（３）は半透明の本体材料を通してチャンバに向けられる。レーザエネルギは本体材料と液体媒体の間のインターフェースに吸収され、そこで熱に変換され、その結果、膨張する蒸気泡（４）が形成される。膨張する気泡は封入された液体媒体にかなりの圧力を加える。隣接する図（５）は、レーザパルス（６）−レーザ「オンタイム」、後続の断続的中断（７）−レーザ「オフタイム」を示す。レーザ「オフタイム」中は蒸気泡が冷却され、凝縮され、収縮され、したがって液体に負圧が加えられる。記載に従ってサイクルが繰り返され、その結果、それぞれスイッチオンされ、スイッチオフされるレーザパルスの周波数と同一の周波数を有する脈圧が液体媒体中に生じる。

図２は、容器に入れた加熱要素が使用されている実施形態を示す図である。閉込め本体（１）は、閉込め部またはチャンバもしくはチャネルの断面（２）を保持する。加熱要素（３）は、リード（５）を通してパルス生成制御電子装置に電気的に接続される。加熱要素は、タイミング図（６）に従ってそれぞれターンオンされ、ターンオフされる。（図１で詳細に記載したように）上記の説明に従って気泡が生成され崩壊する。

図３は、２０ｋＨｚの超音波を生成する動作モードの例における、加熱器／レーザのサイクルおよびその結果得られる気泡の形成および消滅を示すタイミング図である。図で示したように、レーザまたは加熱要素は期間５０μｓ間中に３μｓ間活動化される（「オフタイム」は４７μｓ間である）。破線は気泡の成長を示す。気泡は熱源の停止後の期間に成長し、最大のサイズに達し、その後崩壊して元の液体状態に戻る。５０μｓ間で得られる超音波周波数は２０ｋＨｚである。

特別の実施形態１は液体中に脈動圧力波を生成する方法であって、
ｉ）前記液体の一部分の局所的加熱を行い、前記液体のその部分が蒸発状態になるようにし、前記蒸気が膨張する時に残りの液体の体積を変位させること、
ｉｉ）熱源を除去／熱源をスイッチオフにして、生成された蒸気を冷却し、凝縮し、収縮できるようにすること、
ｉｉｉ）ステップｉ）およびｉｉ）を固定周波数で繰り返すことを含む。

特別の実施形態２は特別の実施形態１による方法であり、局所加熱が液体との機械的連結を持たない源から行われる。

特別の実施形態３は特別の実施形態２による方法であり、局所加熱源は光ビームである。

特別の実施形態４は特別の実施形態３による方法であり、光ビームはレーザである。

特別の実施形態５は特別の実施形態１による方法であり、局所加熱源は電気的に駆動される加熱要素である。

特別の実施形態６は特別の実施形態１による方法であり、繰り返し周波数は超音波周波数である。

特別の実施形態７は特別の実施形態５による方法であり、超音波周波数によって液体中にキャビテーションが生じる。

特別の実施形態８は特別の実施形態１による方法であり、液体は懸濁成分、たとえば血球または細菌芽胞など細胞成分を含む。

特別の実施形態９は特別の実施形態７および８による方法であり、脈動圧力波によって前記懸濁成分またはその一部分の破壊、たとえば細胞壁の破壊が生じる。

特別の実施形態１０は特別の実施形態８による方法であり、脈動圧力波が断続的停止を伴う幾つかの短い期間にわたって加えられ、（たとえば細胞、ビーズ、またはペレットなど）凝集懸濁成分が分散するようにその期間の長さが調整される。

特別の実施形態１１は特別の実施形態１０による方法であり、懸濁成分はナノ粉末である。

特別の実施形態１２は特別の実施形態１による方法であり、液体は、たとえばサブミリメートルの寸法のマイクロチャネルまたはマイクロチャンバなど、マイクロチャネルまたはマイクロチャンバ内に含まれる。

特別の実施形態１３は特別の実施形態３による方法であり、光エネルギは１次元または２次元の光走査デバイス（たとえば検流計）を使用して送出される。

特別の実施形態１４は特別の実施形態３による方法であり、吸収部分は液体媒体との直接接触部に含まれ、そこで光エネルギを吸収し、ジュール熱に変換する。

本発明によれば、本発明の態様の１つの文脈で記載した本発明の実施形態および特徴を本発明の他の態様にも適用することができることを留意されたい。

（実施例）
本発明をこの実施例で記載したように実験的に試験し検証した。

２ｍｍのポリエチレン（ＰＥ）基板をエキシマレーザを使用してマイクロ加工した。幅１００μｍかつ深さ２５μｍの寸法のチャネル構造を加工した。赤外線吸収色素（ＰＲＯ−ＪＥＴ８３０ＮＰ、Ａｖｅｃｉａ、ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を有する２ｍｍのＰＥのふたを用意し、前記ふたの一面が赤外放射の強い吸収性を示し、最終的に赤外光を前記表面部分内でジュール熱に変換するようにした。ふたは前述のチャネル構造上に溶接され、赤外線吸収側がチャネル構造の第４の壁を形成するようにした。

（高出力の市販のレーザダイオード（ＬＤ）、５００ｍＷ、８０８ｎｍから生じる）集束レーザビームが、カメラ−顕微鏡の設置部の反対側から基板に向けられた。ＬＤは電子的に制御されて、パルスおよび期間の長さを調整し制御できるようになされた。

チャネル構造は、食塩水８０％につき全血２０％（体積百分率）の等張食塩水液の血液凝固阻止されたヒト血液で充填された。

集束レーザビームは、パルス幅３μｓで稼動され、続いて４７μｓ間非活動化されるように調整され、それによって繰り返し周波数２０ｋＨｚが生成された。レーザサイクルのタイミング図が図３に示されている。レーザサイクルはソフトウェアの制御から開始され、液体中の物理的動揺が即時に認定された。液体の動揺は照明された赤血球の動きからはっきり確認された。１秒間未満で懸濁血球がレーザビームのすぐ周囲の領域で溶解された。その後の３秒間に約１５０μｍのチャネルの領域内の全ての細胞が溶解され、さらに２秒間レーザパルスを送ったがチャネルの両方向にさらに伝播させる効果が生じなかった。

レーザ活動の停止後、以下が観察された。材料の「集合体（ｃｌｏｕｄ）」が、超音波活動が行われた領域の周囲で観察された。さらに、活動が生じた場所の周囲の領域のポリマーの永久的な劣化または変化がはっきり確認された。それは、その領域が乳白色で半透明の外観を示したためである。このポリマーの表面の永久的劣化は高出力超音波活動を一般に示すものである。

高倍率顕微鏡で静かな液体が充填されたチャネル構造を観察すると、サブミクロンの破片の小さいクラスタがレーザ活動を受けたチャネル内の場所だけに存在することが明らかになった。破片は「ブラウン運動」によって変動しており、サブマイクロメートルのサイズを提示した。さらに、この処理を受けた後の溶液には「中空」の細胞が存在しないことが観察された。はっきり認識されるヘモグロビン内容物を持たない中空細胞（赤血球）は、温度の上昇または溶液の特性（たとえばｐＨ、食塩水濃度など）の変化による溶血を示すものであろう。これは超音波溶解によって懸濁細胞が溶解されたことを明確に提示するものである。

（リファレンス）
Ｓａｍｂｒｏｏｋ他：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：第３版、第１巻および２巻、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、２００１年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
国際公開第ＷＯ２００４／０１６ ９４８号

レーザエネルギが液体媒体を含む閉込め部に向けられている、本発明の好ましい実施形態を示す図である。 容器に入れた加熱要素が使用されている実施形態を示す図である。 ２０ｋＨｚの超音波を生成する動作モードの例における、加熱器／レーザのサイクル、およびその結果生じる気泡の形成および消滅を示すタイミング図である。

Claims (20)

1. 液体中に脈動圧力波（ＰＰＷ）を生成する方法であって、
   ａ）加熱手段を提供するステップ、
   ｂ）前記加熱手段で前記液体の一部分を加熱して、前記液体のその部分を蒸発させることによって、蒸気泡を形成するステップ、
   ｃ）前記蒸気泡を凝縮するステップ、および
   ｄ）ステップｂ）とｃ）を繰り返すステップを含む方法。
2. 前記ＰＰＷが超音波である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
3. 前記液体が、水、ＤＭＳＯ、アセトン、アルコール、および／または非極性溶媒のグループから選択される溶媒を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
4. 前記加熱手段が加熱要素および電磁放射からなるグループから選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
5. 前記電磁放射が前記液体に吸収される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
6. 前記電磁放射が前記液体に接触する壁に吸収される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
7. 前記ステップｂ）とステップｃ）が固定周波数で繰り返される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
8. 前記ステップｂ）とステップｃ）が変化する周波数で繰り返される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
9. ステップｂ）およびステップｃ）が、周波数１０〜５００ｋＨｚ、１５〜１５０ｋＨｚおよび２０〜１００ｋＨｚなどの、０．５〜１０００ｋＨｚで繰り返される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
10. 前記液体がマイクロチャネルまたはマイクロチャンバに含まれる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
11. 前記蒸気泡のサイズおよび前記蒸気泡の形成と凝縮の割合が、液体中にキャビテーションが生じるために十分である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
12. 前記液体が粒子を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
13. 前記粒子が、生物細胞、マイクロ粒子、およびナノ粒子からなるグループから選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
14. 前記液体が生物細胞を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
15. 前記電磁放射のビームがレーザビームである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
16. スポットの最大寸法が最大５００μｍである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
17. 前記レーザビームの効果が１ｍＷ〜２００Ｗである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
18. 生物細胞を液体に溶解するための、前記請求項のいずれかに記載の方法。
19. ｅ）溶解された生物細胞の成分を分析するステップ、をさらに含む請求項１８に記載の方法。
20. 粒子を分散するための、前記請求項のいずれかに記載の方法。

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