JP2002505095A - 喘息及び関連疾患を含むアトピー性アレルギーを治療するための標的としての喘息関連因子 - Google Patents

喘息及び関連疾患を含むアトピー性アレルギーを治療するための標的としての喘息関連因子

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Abstract

(57)【要約】 カルシウムによって活性化されるクロライド・チャネルファミリーの新規な遺伝子であり、ＩＬ−９によって誘導されるものが発見され、それによって、ＩＬ−９に媒介されるアトピー性アレルギー、喘息に関連した疾患、及び嚢胞性繊維症の進行において、治療学的標的を提供することとなる。これらの疾患を治療する、前記遺伝子及びその生産物の小分子阻害剤を同定及び使用するための方法も発見された。さらに、本発明は、前記タンパク質に特異的な抗体を使い、生物学的サンプル中の遺伝子発現レベルを測定することにより、アトピー性アレルギー、喘息に関連した疾患に対する感受性を診断し、治療法を評定する方法を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の相互参照） 本出願は、１９９８年３月３日に出願され、その全体が参考文献として本明細
書に援用されている、米国仮特許出願第６０／０７６，８１５号の利益を主張す
る。本発明は、また、そのいずれもが１９９６年８月２３日に出願され、参考文
献として本明細書に援用されている、米国特許出願第０８／６９７，４１９号、
同第０８／６９７，３６０号、同第０８／６９７,４７３号、同第０８／６９７,
４７２号、同第０８／６９７,４７１号、同第０８／７０２，１０５号、同第０ ８／７０２，１１０号、同第０８／７０２，１６８号、及び同第０８／６９７，
４４０号の主題に関係する。さらに、本出願は、１９９７年１２月１日に出願さ
れ、参考文献として本明細書に援用されている、米国特許出願第０８／８９０，
８７２号にも関係する。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、喘息などのアトピー性アレルギーとその関連疾患を治療するために
ＩＬ−９経路に関係する活性を調節することに関する。
【０００３】
【従来の技術】
炎症は、身体の防御システムが異物に攻戦する複雑な過程である。異物に対す
る攻戦は生体の生存にとって必要とされる一方、一部の防御システムは、異物に
対しては、無害なものにさえ危険なものとして反応してしまい、従って、その後
で起こる攻戦においては、周囲の組織を損傷させてしまう。
【０００４】 アトピー性アレルギーは、遺伝的背景が環境刺激物質に対する反応を指図して
いる、環境遺伝学的疾患である。一般に、この疾患は、どこにでもある抗原に対
してＩｇＥ抗体を産生するリンパ球の能力が増大することによって特徴づけられ
る。これらの抗原による免疫系の活性化は、アレルギー性炎症をもたらし、摂食
後、皮膚を通した浸透、または吸入後に起こり得る。この免疫反応が起こり、そ
れが肺の炎症と気管支反応性亢進を伴う場合、その疾患は、広く、喘息と特徴付
けられる。この炎症反応においては、ある種の細胞が重要であり、それらには、
Ｔ細胞及び抗原提示細胞、ＩｇＥを産生するＢ細胞、ＩｇＥに結合する好塩基球
、及び好酸球が含まれる。これらの炎症性細胞は、アレルギー炎症部に蓄積し、
それらが放出する毒性産物が、これらの疾患に関連する組織破壊に寄与する。
【０００５】 一般に、喘息は気道の炎症性疾患と定義されるが、その臨床症状は、間欠性の
気流障害から生じる。それは、日常生活に支障をきたす慢性の障害で、その罹患
率と酷烈性は、増しつつあると思われる（Ｇｅｒｇｅｎら、１９９２）。人口の
３０〜４０％がアトピー性アレルギーを患い、その人口のうち、小児の１５％及
び成人の５％が喘息を患っていると見積もられている（Ｇｅｒｇｅｎら、１９９
２）。従って、我々の健康医療財源には、大きな負担がかかっている。
【０００６】 興味深いことに、ほとんどの人がよく似た環境にさらされる経験をするのだが
、アトピー性アレルギーと喘息を発症するのは、ある特定の人々に過ぎない。「
アトピー」として知られるこの環境アレルゲンへの過敏症は、多くの場合、アト
ピー患者では非アトピー患者と比較して、血清ＩｇＥレベルが上昇していること
か、アレルゲンに対する皮膚試験反応が異常に強いことかによって示される（Ｍ
ａｒｓｈら、１９８２）。アトピー性アレルギーと喘息の密接な関係を示す有力
な証拠は、ほとんどの喘息患者が、アトピーの臨床学的及び血清学的証拠を有す
るという事実から導かれる（Ｃｌｉｆｆｏｒｄら、１９８７；Ｇｅｒｇｅｎ、１
９９１；Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２；Ｊｏｈａｎｎｓｏｎら、１９７２；Ｓｅ
ａｒｓら、１９９１；Ｈａｌｏｎｅｎら、１９９２）。特に、若い喘息患者ほど
アトピーの発生率が高い（Ｍａｒｓｈら、１９８２）。また、総血清ＩｇＥレベ
ルの増加に関連している免疫学的因子類は、損なわれた肺機能に極めて密接に関
係している（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９８９）。
【０００７】 これらの疾患の診断と治療のどちらにも問題がある（Ｇｅｒｇｅｎら、１９９
２）。炎症を起こした組織を査定することは、困難なことが多く、たいていの場
合、その炎症源を特定できない。肺炎症を制御することの機能不全が、徐々に肺
機能に重大な損傷をもたらすということは、現在では一般に受け入れられている
。
【０００８】 現行の治療法には、それぞれに一連の欠点がある。主な治療薬であるβアゴニ
スト（作用薬）は、症状を軽減することによって肺機能を一時的に改善するが、
根底にある炎症には作用しないので、肺組織は危険な状態のままである。また、
βアゴニストの常用は、脱感作をもたらし、それらの薬効と安全性を低下させる
（Ｍｏｌｉｎｏｆｆら、１９９５）。根底にある炎症を減少させ得る、抗炎症性
ステロイド類のような薬剤は、免疫抑制から骨の損失に及ぶ一連の欠点をそれぞ
れに有している（Ｍｏｌｉｎｏｆｆら、１９９５）。
【０００９】 従来の治療法には種々の問題が伴うので、代替的治療法の評価が行われている
。グリコフォリンＡ（Ｃｈｕら、１９９２）、シクロスポリン（Ａｌｅｘａｎｄ
ｅｒら、１９９２；Ｍｏｒｅｌｙ、１９９２）及びインターロイキン２（ＩＬ−
２）のノナペプチド断片（Ｚａｖｙａｌｏｖら、１９９２）の全てが、ホメオス
タシスに付随する潜在的に重要な免疫機能を阻害する。当該技術分野で必要とさ
れているのは、根底を成す病因と取り組む喘息の治療法である。さらに、これら
の治療法は、この疾患の挿間性及びアレルギーとの密接な関係と取り組み、かつ
、重要な免疫機能からの下流点で介入しなければならない。
【００１０】 上記の関連特許出願において、本出願人等は、インターロイキン９（ＩＬ−９
）、その受容体及びＩＬ−９によって影響を受ける活性が、アトピー性アレルギ
ー、喘息及び関連疾患の治療的介入のために、好適な標的であることを証明して
きた。
【００１１】 アレルゲンによるマスト細胞からのメディエータの放出は、古くから、アレル
ギーにおける決定的な誘発現象であるとみなされてきた。ＩＬ−９は、マスト細
胞成長因子として同定されたものであり、ＩＬ−９が、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２
、ＭＣＰ−４（Ｅｋｌｕｎｄら、１９９３）とグランザイムＢ（Ｌｏｕａｈｅｄ
ら、１９９５）を含むマスト細胞プロテアーゼ類の発現をアップレギュレートす
ることが証明されてきた。このように、ＩＬ−９は、マスト細胞の増殖と分化に
ある役割を果たしているように思われる。さらに、ＩＬ−９は、高親和性ＩｇＥ
受容体のアルファ鎖の発現をアップレギュレートする（Ｄｕｇａｓら、１９９３
）。上昇したＩｇＥレベルは、アトピー性アレルギーの顕著な特徴であり、喘息
の危険因子であるとみなされている。さらに、ＩＬ−９が感作Ｂ細胞からのＩｇ
Ｅの放出を増強することは、インビトロ試験及びインビボ試験の両方で示されて
いる（Ｐｅｔｉｔ−Ｆｒｅｒｅら、１９９３）。
【００１２】 喘息におけるＩＬ−９遺伝子候補の裏付けはかなりある。第一に、ヒトとマウ
スの間の連鎖相同性は、同じ遺伝子が、両方の種で、抗原に反応して生物学的変
異性を生む原因になっていることを示唆している。第二に、マウスＩＬ−９候補
遺伝子の発現量の相違は、気管支反応性の生物学的変異性と相関している。具体
的に述べると、ＩＬ−９の発現量の減少は、Ｂ６マウスにおける気管支反応性の
ベースライン低下と相関している。第三に、ヒトから得られたデータにおける連
鎖不平衡を示す最近の証拠は、両種におけるこの遺伝子の役割と合致して、ＩＬ
−９がアトピー及び気管支反応性亢進と相関し得ることを示唆している（Ｄｏｕ
ｌｌら、１９９２）。さらに、このヒト遺伝子の遺伝子変異が、サイトカイン機
能の損失及び低ＩｇＥレベルと相関するらしい。第四に、アレルギー性免疫反応
におけるこのサイトカインとその受容体の多面的機能は、喘息の複雑な病因にお
けるＩＬ−９経路の役割を強く裏付けるものである。第五に、ヒトでは、ＩＬ−
９受容体の生物学的変異性も、アトピー性アレルギー及び喘息と相関するようで
ある。最後に、ＩＬ−９受容体機能の遺伝的欠損にもかかわらず、これらの個体
はその他の点では、健康であるように見える。このように、自然現象により、ア
トピー性患者において、ＩＬ−９及びＩＬ−９受容体遺伝子、又はＩＬ−９とそ
の受容体によって活性化される遺伝子の治療的ダウンレギュレーションが安全で
あるらしいことが証明されてきた。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
アトピー性アレルギー、喘息及び関連疾患における、ＩＬ−９遺伝子、その受
容体及びそれらの機能の役割が解明されてきたが、当該技術分野には、これらの
疾患の病因において、ＩＬ−９によって調節される遺伝子の役割を解明するとい
う特定的な必要性がある。さらに最も重要なことに、この知識に基づいて、これ
らの疾患を治療するために、これらの遺伝子又はこれらの遺伝子産物の活性を調
節できる薬剤を同定する必要がある。
【００１４】 嚢胞性繊維症は、肺に作用するもう一つの疾患であり、濃い分泌と関連してお
り、気道障害に続き、吸入された病原細菌により集落形成及び感染が起こる（Ｅ
ｎｇｅｔら、１９９６）。嚢胞性繊維症の気道上皮は、正常と異なる一連のイオ
ン輸送特性を示し、それらには、ｃＡＭＰに不完全に媒介されたクロライド分泌
だけでなくナトリウム吸収の増大及びカルシウムにより媒介されたクロライドの
分泌の増大が含まれる（Ｊｏｈｓｏｎら、１９９５）。カルシウムにより媒介さ
れたクロライド分泌の増大は、ｃＡＭＰに媒介されたクロライド分泌の欠陥によ
るクロライド分泌の全体的な低下を埋め合わせるための企てと推定される。しか
しながら、正常なクロライド勾配が維持されるわけではないので、この欠陥は十
分に埋め合わされない。従って、嚢胞性繊維症の可能な治療学上の救済策は、ｃ
ＡＭＰに媒介された不完全なクロライド分泌を埋め合わせるために、気道上皮細
胞のクロライド分泌を増大させるメカニズムによる。このようなメカニズムによ
り、細胞のクロライド勾配を回復することができ、クロライド分泌の減少に関係
したナトリウムの過度の吸収を解消することができる。従って、当該技術分野に
おいて、嚢胞性繊維症の気道上皮細胞のカルシウム依存性クロライド分泌を増強
できる薬剤を同定することに明確な必要性がある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＩＣＡＣＣ（IL-9 Induced Calcium Activated Chloride Channel ）と名付けられたカルシウムにより活性化されるクロライドチャネル遺伝子ファ
ミリーからの新規な遺伝子、特にマウス（配列番号１）とヒト（配列番号３及び
配列番号５）のＩＣＡＣＣ遺伝子を包含する。ＩＣＡＣＣ−１遺伝子類は、ＩＬ
−９によって選択的にアップレギュレートされ、従って、ＩＬ−９の信号経路部
分である。さらに、本発明は、ＩＣＡＣＣ遺伝子類、特にマウス（配列番号２）
とヒト（配列番号４及び配列番号６）のＩＣＡＣＣ遺伝子のタンパク質産物を包
含する。
【００１６】 発明者等は、アトピー性アレルギー、喘息および関連疾患の診断と治療の必要
性を、このような疾患の病因におけるＩＣＡＣＣ−１の役割を立証することによ
って、満足させた。このような疾患の治療法は、ＩＬ−９経路のメンバーとして
のＩＣＡＣＣ−１のダウンレギュレーションによって導かれる。
【００１７】 ＩＣＡＣＣ−１の同定は、その活性をダウンレギュレートすることのできる化
合物の発見をもたらした。本明細書において、活性は、クロライドチャネル機能
かＩＣＡＣＣ−１発現かのどちらかの変化よって定義される。ＩＣＡＣＣ−１を
ダウンレギュレートする分子類は、本発明の一部である。本明細書において、ダ
ウンレギュレーションは、ＩＣＡＣＣ−１、そのリガンド又はアクチベータの、
活性化、機能又は合成の減少として定義される。さらに、それは、ＩＣＡＣＣ−
１遺伝子、そのタンパク質産物、リガンド又はアクチベータの分解の増加をも含
むように定義されている。従って、ダウンレギュレーションは、いろいろな方法
によって達成される。例えば、ＩＣＡＣＣ−１がそのリガンドに結合するのを不
安定化する分子の投与である。このような分子には、ＩＣＡＣＣ−１遺伝子のＤ
ＮＡ配列又は種々の突然変異を含有するＤＮＡ配列によってコードされたものを
含む、ポリペプチド産物が含まれる。このような変異は、ＩＣＡＣＣ−１遺伝子
の点変異、挿入、欠失、又はスプライス変異であってよい。本発明は、また、前
記記載のＤＮＡ分子によってコードされた切断型ポリペプチドを含む。このよう
なポリペプチドは、ＩＣＡＣＣ−１とそのリガンド及び他のタンパク質との相互
作用を干渉することができる。
【００１８】 本発明のさらなる実施の形態として、ＩＣＡＣＣ−１遺伝子の発現を変化させ
ることによるＩＣＡＣＣ−１機能のダウンレギュレーションがあり、アンチセン
ス遺伝子治療の使用がその一例である。ＩＣＡＣＣ−１発現のダウンレギュレー
ションは、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによって達
成される。これらのアンチセンス分子は、ＩＣＡＣＣ−１遺伝子のＤＮＡ配列又
は様々な突然変異、欠失、挿入又はスプライス変異を含む配列から作ることがで
きる。本発明のもう一つの実施の形態は、ＩＣＡＣＣ−１遺伝子から誘導される
単離されたＲＮＡ又はＤＮＡ配列の使用に関する。これらの配列は、ＩＣＡＣＣ
−１遺伝子の点変異、挿入、欠失又はスプライス変異などといった様々な変異を
含有し、遺伝子治療に役立ち得る。
【００１９】 ＩＣＡＣＣ−１タンパク質の分解を増加させる分子類もまた、その機能をダウ
ンレギュレートするために使われてもよく、本発明の範囲内である。ＩＣＡＣＣ
−１のリン酸化も、タンパク質の安定性を変え得るものであり、従って、キナー
ゼ阻害剤も、その機能をダウンレギュレートするために使われてよい。ＩＣＡＣ
Ｃ−１のダウンレギュレーションは、ＩＣＡＣＣ−１タンパク質に対して作られ
たポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体又はそれらの断片を使用すること
によって成し遂げられてもよい。このような分子は、本発明の請求の範囲である
。さらに、本発明は、十分な親和性で、ＩＣＡＣＣ−１とそのリガンドとの相互
作用を遮断するか、クロライドチャネルの機能を遮断するための結合にとって必
要な３次元構造を有する小分子を含む。ＩＣＡＣＣ−１の遮断は、それが発現さ
れている炎症を受ける前の細胞において、カルシウム及びクロライド流入、及び
その他のプロセスの調節解除となり、これらの小分子を、アトピー性アレルギー
、喘息及び関連疾患を治療するための治療薬として役立つものとする。さらなる
実施の形態においては、アトピー性アレルギー及び関連疾患を治療するための有
用性を決定する手段として、ＩＬ−９又は抗原によって誘導されるＩＣＡＣＣ−
１を遮断するアミノステロール化合物の能力を評価する。
【００２０】 上記の薬剤は、アトピー性アレルギー、喘息及び関連したその他の疾患の治療
に有効な種々の治療化合物を代表する。従って、本出願人等は、ＩＣＡＣＣ−１
をダウンレギュレートできるアンタゴニストと、それらアンタゴニストの同定方
法を提供した。本出願人等は、また、切断型タンパク質産物、クロライドチャネ
ル遮断薬、アミノステロール等を投与することによって、ＩＣＡＣＣ−１活性を
ダウンレギュレートする方法を提供する。
【００２１】 また、本出願人等は、ＩＣＡＣＣ−１、その機能又はダウンストリーム活性の
誘導を測定する方法を記述することにより、アトピー性アレルギー、喘息及び関
連疾患への罹り易さを診断する方法を提供する。さらなる実施の形態として、本
出願人らは、アトピー性アレルギー、喘息の治療を追跡する手段として、ＩＣＡ
ＣＣ−１のダウンレギュレーションの効果をモニターするための方法を提供する
。また、出願人等は、ＴＨ２関連反応（ＩＬ−９に関連した生物学的反応のよう
なもの）の抑制が共通の分子特性である、炎症性結疾患（ＩＢＤ）のような自己
免疫タイプの疾患を診断する方法を提供する。小腸及び結腸におけるＩＣＡＣＣ
−１の本質的な発現は、ＩＣＡＣＣ−１のダウンレギュレートされた発現が疾患
と関連しているＩＢＤのようなＴＨ１関連疾患の治療をモニターするために、Ｉ
ＣＡＣＣ−１が有用なマーカーであることを提案している。
【００２２】 さらなる実施の形態として、本出願人等は、ＩＣＡＣＣ−１のアップレギュレ
ーションを通して治療できる病理状態を同定する。本出願人等は、さらにＩＣＡ
ＣＣ−１のアップレギュレーションを通して、カルシウム依存性クロライド分泌
を増加させることによって、嚢胞性繊維症気道上皮の、ｃＡＭＰによって媒介さ
れるクロライド分泌の欠陥を治療する方法を提供する。このＩＣＡＣＣ−１のア
ップレギュレーションにより、クロライド分泌が増大し、従って細胞内クロライ
ド勾配の回復により、気道において正常な上皮細胞機能が生じる。出願人等は、
ＴＨ１関連ＩＢＤ自己免疫疾患を抑制にあたってＴＨ２関連反応を向上させるた
めに、遺伝子療法によるＩＣＡＣＣ−１の局所的送達又はＩＣＡＣＣ−１のアッ
プレギュレーションにより、炎症性結腸疾患（ＩＢＤ）の治療方法を提供する。
【００２３】 本明細書に援用され、その一部を成す付随の図面は、本発明の幾つかの実施の
形態を例示し、明細書の記載と共に、本発明の原理についての説明に役立つ。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本出願人等は、喘息及び関連疾患を含むアトピー性アレルギーの診断、予防又
は治療に使用でき得るＩＬ−９経路中の不可欠遺伝子及びその経路に影響する組
成物を解明し、当該技術分野の決定的な要求を満たした。喘息は、可逆的な気流
疾患を伴う気道の炎症性疾患を含む。アトピー性アレルギーとは、アトピーと、
喘息、気管支反応性亢進、鼻炎、じんま疹、腸のアレルギー性炎症性疾患及び様
々な形の湿疹を含む関連疾患とを指す。アトピーは、対照群と比較したときの、
総血清ＩｇＥの上昇又はアレルゲンに対する異常な皮膚試験反応として表される
、環境アレルゲンへの過敏症である。気管支反応性亢進は、様々な刺激に対する
増進した気管支収縮反応である。
【００２５】 Ａ．ＩＣＡＣＣタンパク質 本発明は、単離されたＩＣＡＣＣタンパク質、そのタンパク質のアリール変異
体及びそのタンパク質の保存的なアミノ酸置換物を提供する。本明細書において
、ＩＣＡＣＣタンパク質又はペプチドには、配列番号２のマウス・アミノ酸配列 、又は配列番号４若しくは配列番号６に記載されるヒト・アミノ酸配列を持つタ ンパク質が含まれる。本発明は、自然に起こるアリール変異体及び上記に特定し
て列挙されたものとわずかに異なるアミノ酸配列を持つタンパク質を含む。アリ
ール変異体は、上記に列挙されたものとわずかに異なるアミノ酸配列を有するが
、ＩＣＡＣＣタンパク質に関連する同一又は類似の生物学的機能を持つ。
【００２６】 本明細書においては、ＩＣＡＣＣタンパク質に関連するタンパク質とは、ヒト
及びマウスに加えて、微生物から単離されたタンパク質のことを指す。ヒト及び
／又はマウスのＩＣＡＣＣタンパク質に関係する他のファミリーメンバーのタン
パク質については、下記に記載されている。
【００２７】 本発明のタンパク質は、好ましくは単離された型である。本明細書においては
、物理的、機械的又は化学的方法が、タンパク質に関連する細胞構築物から、そ
のタンパク質を取り除くために使われたときに、タンパク質は単離されたという
。本明細書では、部分的に単離されたタンパク質には、組換えにより発現される
ＩＣＡＣＣタンパク質を包含する細胞膜断片を含んで、膜断片内で単離されたＩ
ＣＡＣＣタンパク質が含まれる。当業者であれば、標準的な精製方法を容易に利
用し、単離されたタンパク質を得ることができる。
【００２８】 本発明のタンパク質には、さらに、本明細書に記載されたタンパク質の保存的
な変異体が含まれる。本明細書において、保存的な変異とは、タンパク質の生物
学的機能に悪影響を与えないアミノ酸配列の変更を言う。置換、挿入又は欠失は
、変化した配列がそのタンパク質に関連する生物学的活性を妨げたり中断させた
りするとき、タンパク質に悪影響を及ぼす。例えば、タンパク質の全体的な電荷
、構造又は疎水性・親水性的性質は、生物学的活性に悪影響することなく、変え
られる。従って、例えば、タンパク質の生物学的活性に不利に影響することなく
、ペプチドが更に疎水性又は親水性になるように、アミノ酸配列を変えることが
できる。
【００２９】 通常、アリール変異体、保存的な置換変異体、及びタンパク質ファミリーのメ
ンバーは、配列番号２で示されるマウス配列又は配列番号４若しくは配列番号６
のヒト配列と、少なくとも約５５％、少なくとも約７５％、さらに好ましくは少
なくとも８０％、尚さらに好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは
少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を持つ。本明細書では、このような配
列に関しての同一性又は相同性は、最大限の相同性率を達成するのにもし必要で
あれば、配列を並べてギャップを導入した後、配列同一性部分としてはいかなる
保存性置換も考慮せずに、周知のペプチドに対し候補配列におけるアミノ酸残基
の同一性の百分率で定義される。ペプチド配列のＮ末端、Ｃ末端又は中間での伸
長、欠失、又はペプチド配列への挿入は、相同性に影響するとされない。
【００３０】 従って、本発明のタンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６におい
て開示されたアミノ酸配列を有する分子、少なくとも約３、４、５、６、１０、
１５、２０、２５、３０、３５又はそれ以上のアミノ酸残基が連続するＩＣＡＣ
Ｃタンパク質の配列を有するそれらの断片、開示された配列内のＮ−又はＣ−末
端にアミノ酸残基が挿入されているアミノ酸配列の変異体、開示された配列のア
ミノ酸配列変異体、又は他の残基によって置換されている上記に定義されたそれ
らの断片を含む。さらに、意図する変異体は、例えば相同的組換え、部位特異的
又はＰＣＲ突然変異誘導のような前もって決定される突然変異、及び他の動物種
の一致するタンパク質（これら他の動物種は、特に制限されるものではないが、
ウサギ、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、及びヒト以外の霊長類を含む）、
タンパク質ファミリーの自然に起こっているその他の変異体又はそのアリール体
、及び置換により共有結合で、化学的に、酵素で、又はその他の適切な手段によ
り自然のアミノ酸ではなく他の置換基（例えば、酵素又は放射性同位元素のよう
な検出できる置換基）により修飾されたタンパク質の誘導体を含む。
【００３１】 下記に記載の通り、このタンパク質ファミリーのメンバーは、（１）少なくと
もタンパク質の活性のうち１つを調節する薬剤を同定するために、（２）前記タ
ンパク質の結合パートナーを同定する方法において、（３）ポリクローナル又は
モノクローナル抗体を作る抗原として、使われ得る。
【００３２】 Ｂ．核酸分子 マウスＩＣＡＣＣ−１遺伝子は、ＩＬ−９によって選択的に誘導される遺伝子
を同定するために行われた、サブトラクティブｃＤＮＡクローニング実験によっ
て同定された。サブトラクティブｃＤＮＡクローニング法の模式図が、図１に提
供されている。マウストランス遺伝子（Ｔｇ５）を過度発現しているトランスジ
ェニックマウスの肺に由来するＲＮＡは、親系統（ＦＶＢ）においては発現され
ていない遺伝子と対照的に、ＩＬ−９に反応して発現される遺伝子を単離するた
めに使われた。図６は、Ｔｇ５マウス（右のレーン）及びＦＶＢマウス（左側）
の肺からのＲＮＡを使ったノーザンブロットを示し、これらの研究の成果を立証
している。ＩＣＡＣＣ−１の発現もまた、ＩＬ−９レベルの上昇したベースライ
ンを肺において発現してきたＤＢＡマウス系統の肺で観察された（図７）。ＩＣ
ＡＣＣ−１の発現は、ＩＬ−９の発現が検出限界以下であったＣ５７Ｂ６系統の
肺では観察されなかった（図７）（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら、１９９７）。ＩＬ
−９がＩＣＡＣＣ−１発現を誘導する直接的効果は、Ｃ５７Ｂ６マウスの気管の
中へ注入されたとき立証された。この実験の結果、無処置又はビヒクルにより処
理されたマウスでなく、ＩＬ−９が注入されたマウスの肺においてＩＣＡＣＣ−
１が発現されるたこと示され（図８）、これによりこの遺伝子はＩＬ−９によっ
て誘導されることが示唆される。この結果は、また、ＩＣＡＣＣ−１遺伝子発現
は、抗原にさらされ喘息様の特徴を現わすマウスの肺で誘導されるということを
示す（ＢＨＲ、肺好酸球増加症）（図１０及び図１２）。抗原により誘導された
ＢＨＲ及び肺好酸球増加症は、抗ＩＬ−９で治療されたマウスにおいて、抑制さ
れることができ（図１２）、これはまた、ＩＣＡＣＣ−１のダウンレギュレーシ
ョンを生じる（図１３）。
【００３３】 マウスＩＣＡＣＣ−１遺伝子は、カルシウムにより活性化されるウシのクロラ
イドチャネルのメンバーとかなりの相同性（〜５０％）を示した（図３）（Ｃｕ
ｎｎｉｎｇｈａｍら、１９９５）。全長ｃＤＮＡは、マウスｃＤＮＡライブラリ
ーからクローニングされた（図２）。マウスＩＣＡＣＣ−１に対し、部分的な相
同性を示す７つのＥＳＴが同定された。これらの、ＥＳＴは、ＩＭＡＧＥ協会（
Lawrence Livermore National Laboratory）から得られ、配列決定された。ライ
ブラリースクリーニング及び５’−と３’ＲＡＣＥクローニング（Ｃｌｏｎｅｔ
ｅｃｈ）によって、完全長のｃＤＮＡ配列が、ヒトＩＣＡＣＣ−１とＩＣＡＣＣ
−２に対して単離された。コード化されたマウスのタンパク質配列の分析により
、多種の形質膜ドメインと幾つかのリン酸化及びグリコシル化部位を含む、幾つ
かの一定に保たれたモティーフが同定された。
【００３４】 マウスＩＣＡＣＣ−１の発現は、市販の標準的な組織ブロットを使っては、検
出できなかったが、ＩＣＡＣＣ−１の上昇した発現が、ＩＬ−９トランスジェニ
ックマウスから得られた肺、リンパ節、結腸、脾臓、胃、子宮及び卵巣で観察さ
れた（図９）。興味深いことに、これらの組織の全てが、種々の上皮細胞タイプ
を含み、従って、この遺伝子は、ＩＬ−９に反応する上皮細胞に制限されると示
唆される。このデータは、ＩＣＡＣＣ−１遺伝子発現は、抗原にさらされたマウ
スにおいて誘導され、この誘導は抗ＩＬ−９治療によって抑制され得るというこ
とを見出したことによって支持されている（図１０、図１２及び図１３）。
【００３５】 出願人等は、どの細胞タイプがＩＣＡＣＣ−１を発現することができるのかを
さらに理解するために、ＩＣＡＣＣ−１により誘導される遺伝子発現を決定する
、ヒト肺上皮細胞のＩＬ−９に対する反応性について試験をした。図１４に示さ
れるように、ＮＨＢＥ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）と名付けられたヒト肺上皮細胞系
は、ＩＬ−９の存在下で増殖させたとき（ＩＬ−９の非存在下でないとき）、Ｉ
ＣＡＣＣ−１ｍＲＮＡを発現した。ヒト肺の初代培養が、組換えＩＬ−９の存在
下で増殖させたとき、培地のみの中で増殖させた細胞培養物と対照して、ＩＣＡ
ＣＣ−１発現が誘導された（図１５）。
【００３６】 本発明の核酸分子には、配列番号２、配列番号４及び配列番号６を有するタン
パク質及び本明細書に記載されている関連タンパク質であり、好ましくは単離さ
れた型のものをコードする核酸分子が含まれる。本明細書において、「核酸」は
、上記に定義されたようにタンパク質又はペプチドをコードするＲＮＡ又はＤＮ
Ａとして定義されるか、或いはこのようなペプチドをコードする核酸配列に相補
的であるか又はこのような核酸にハイブリダイズし、適当にストリンジェントな
条件下でそれに安定に結合しているか、そのペプチドと少なくとも５５％の配列
同一性、７５％の配列同一性、好ましくは８０％の配列同一性、及びさらに好ま
しくは８５％の配列同一性を共有している。特定的に考えられるのは、ゲノムＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＤＮＡ及びアンチセンス分子と、さらに代わりのバックボー
ンに基づく、又は天然源から誘導されるか、合成によって誘導される代わりの塩
基を持つ、核酸分子である。しかしながら、このようなハイブリダイズするか、
相補的な核酸は、従来の核酸分子に対して、新規で明らかでないと定義され、本
発明に従うタンパク質をコードする核酸に相補的であるか、適度にストリンジェ
ンシーな条件下でハイブリダイズするか、コードする核酸分子を含む。
【００３７】 相同性又は配列同一性は、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool)
分析により、配列類似性検索用に作られたプログラムｂｌａｓｔｐ ｂｌａｓｔ
ｎ ｂｌａｓｔｘ ｔｂｌａｓｔｎ ｔｂｌａｓｔｘ（Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：２２６４−２２６８（１９９
０）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−
３００（１９９３），参考文献として完全に援用されている）で使用されている
アルゴリズムを使って決定される。ＢＬＡＳＴプログラムが使用する手法は、ま
ず質問配列とデータベース配列の間の類似区間を考慮し、次に、同定された全て
の一致の統計的有意性を評価し、最後に、前もって前もって選択した有意性の閾
値を満たす一致のみを要約するというものである。配列データベースの類似性検
索に関する基本的問題の議論については、参考文献として本明細書に完全に援用
されているＡｌｔｓｃｈｕｌらの文献（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：
１１９−１２９（１９９４））を参照。ｈｉｓｔｏｇｒａｍ、ｄｅｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎｓ、ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ、ｅｘｐｅｃｔ（すなわち、データベース配列
に対する一致を報告するための統計的有意性閾値）、ｃｕｔｏｆｆ、ｍａｔｒｉ
ｘ、ｆｉｌｔｅｒに関する検索パラメータは、デフォルトの設定通りである。ｂ
ｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、ｔｂｌａｓｔｘで使用されるデフ
ォルトのスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（
Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：
１０９１５−１０９１９（１９９２）；参考文献として完全に本明細書に援用さ
れる）。ｂｌａｓｔｎについては、スコアリングマトリックスが、Ｍ（例えば、
一対の一致残基に対する報奨点）のＮ（例えば、不一致残基に対する罰則点）に
対する比率によって設定され、ＭとＮのデフォルト値はそれぞれ５と−４である
。
【００３８】 「ストリンジェントな条件」とは、（１）洗浄に低イオン強度と高温（例えば
、５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、０
．１％ＳＤＳ緩衝液）を使用するか、（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド
のような変性剤（例えば、４２℃で５０％ホルムアミド、０．１％ウシ血清アル
ブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン
酸ナトリウム）を使用するものである。もう一つの例は、４２℃で５０％ホルム
アミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロ
リン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μ
ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ及び１０％デキストラン硫酸を使用し、洗浄を０．
２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で４２℃で行うことである。当業者は、明瞭で
検出可能なハイブリッド形成シグナルを得るのに適したストリンジェンシー条件
を容易に決定、変更できる。
【００３９】 本明細書においては、核酸分子は、核酸原型由来の他のポリペプチドをコード
する核酸不純物から、十分に分離されているのとき「単離された」と言われる。
【００４０】 さらに、本発明は、コードする核酸分子の断片を提供する。本明細書において
は、コードする核酸分子の断片とは、タンパク質全体の小部分をコードする配列
を指す。その断片サイズは、意図する用途により決定される。例えば、そのタン
パク質の活性部位をコードするよう断片が選択させると、その断片は、タンパク
質の機能領域をコードするに十分なくらい大きい必要があるか、又は、図５に見
られるＩＣＡＣＣタンパク質間の相同性領域をコードし得る。その断片が核酸プ
ローブ又はＰＣＲプライマーとして使われる場合、プロービング／プライミング
の際に、比較的少数の偽陽性が得られるように断片長が決定される。
【００４１】 プローブ又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための特定プライマーとして
使われている、或いは本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するた
めに使われている、本発明のタンパク質をコードする核酸分子の断片（例えば、
合成オリゴヌクレオチド）は、化学的方法、例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉらのフォ
スフォトリエステル法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１
９１、１９８１）によって、又は自動化合成法を使って、容易に合成できる。さ
らに、大きなＤＮＡ切片は、遺伝子の種々のモジュラー切片を定義するオリゴヌ
クレオチド群の合成と、それに続いて行われる、修飾された完全遺伝子を造るた
めのリゲーション、のような周知の方法によって容易に調製される。
【００４２】 本発明のコードする核酸分子は、さらに、診断とプローブ目的のための検出可
能なラベルを含むよう、修飾されてもよい。当該技術分野においては、種々のこ
うしたラベルが知られており、ここに記載されたコードする分子と一緒に容易に
利用され得る。適切なラベルとしては、特に限定されず、ビオチン、放射性同位
元素標識ヌクレオチド等がある。当業者ならば、ラベル化されたコードする核酸
分子を得るためには、どんな周知のラベルでも利用できる。
【００４３】 翻訳中に、タンパク質配列へ挿入されたアミノ酸の欠失、添加、または変異に
よって、一次構造そのものを修飾することが、そのタンパク質の活性を壊すこと
なくなされ得る。このような置換又は他の変異により、本発明の意図する範囲に
入る核酸によってコードされたアミノ酸配列を持つタンパク質が結果として得ら
れる。
【００４４】 Ｃ．他の関連核酸分子の単離 上記に記載されたように、配列番号１を有するマウス核酸分子及び配列番号３
又は配列番号５を有するヒト核酸分子を同定することにより、本明細書に記載さ
れているマウス又はヒト配列に加えて、当業者は、ＩＣＡＣＣタンパク質ファミ
リーの他のメンバーをコードする核酸分子を単離することが許容される。
【００４５】 本質的には、当業者は、適当な細胞から調製される発現ライブラリーをスクリ
ーニングするために、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列を
使い、容易に抗体プローブを造ることができる。通常、精製されたタンパク質で
免疫化されたウサギのような哺乳類からのポリクローナル抗血清（下記に記載）
、又はモノクローナル抗体を、そのタンパク質ファミリーの他メンバーの適当な
コード配列を得るために、ラムダｇｔ１１ライブラリーのようなゲノム発現ライ
ブラリー及び哺乳類のｃＤＮＡライブラリーをプローブするために使うことがで
きる。クローニングされたｃＤＮＡ配列は、融合タンパク質として発現でき、そ
の独自の制御配列を使って直接に発現でき、酵素発現に使われる特定の宿主に適
した制御配列を使っている構築物によって発現できる。
【００４６】 他の方法として、本明細書で記載された配列コードの一部分は、合成すること
ができ、いろいろな哺乳類体からのそのタンパク質ファミリーのメンバーをコー
ドするＤＮＡを検索するためのプローブとして使うことができる。約１８−２０
のヌクレオチドを含むオリゴマーを調製し、ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーの
スクリーニングのために使って、擬陽性の不適当なレベルが除かれるようにスト
リンジェントな条件、又は十分なストリンジェンシーでハイブリダイゼーション
を得る。
【００４７】 これに加えて、オリゴヌクレオチドプライマーの対をコードする核酸分子を特
異的にクローニングするために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使う
よう調製した。このようなＰＣＲプライマーを使ったＰＣＲの変性／アニール／
伸長のサイクルは、当該技術分野では周知であり、他のコード化している核酸分
子を単離する使用に対し、容易に適用できる。
【００４８】 Ｄ．核酸分子を含有するｒＤＮＡ分子 本発明は、さらに、ＩＣＡＣＣをコードする配列を含む組換えＤＮＡ分子（ｒ
ＤＮＡ）を提供する。本明細書において、ｒＤＮＡ分子は、インサイチュの分子
操作を受けたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を造るための方法は、当該技術分
野では周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
（１９８８）参照）。この好ましいｒＤＮＡ分子においては、ＤＮＡコード配列
は、発現制御配列及び／又はベクター配列に連接している。
【００４９】 タンパク質ファミリーの１つをコードする本発明の配列が作動的に連結されて
いるベクター及び／又は発現制御配列を選択することは、当該技術分野では周知
であるように、例えば、タンパク質発現及び形質転換を受ける宿主細胞等の望ま
れる機能特性に、直接依存している。本発明によって企図されたベクターは、少
なくとも、ｒＤＮＡ分子に含まれる構造遺伝子の複製又は宿主の染色体への挿入
、及び好ましくは発現をも指示することができる。
【００５０】 作動的に連結されたタンパク質をコードする配列の発現を制御するために使わ
れる発現制御要素は、当該技術分野では周知であり、特に制限されるわけではな
いが、誘導可能なプロモーター、構成性プロモーター、分泌信号、及び他の制御
要素を含む。好ましくは、誘導可能なプロモーターは、宿主細胞の培地中の栄養
物に反応するというように、容易に制御できる。
【００５１】 一つの実施の形態においては、コード核酸分子を含むベクターには、原核生物
のレプリコンが含まれ、例えば、形質転換された原核宿主細胞の染色体外で、組
換えＤＮＡ分子の自律的な複製と維持を指令する能力を有するＤＮＡ配列である
。このようなレプリコンは、当該技術分野においては周知である。さらに、原核
生物レプリコンを含むベクターは、その発現が薬剤抵抗性のような検出可能なマ
ーカーを与える遺伝子を含んでもよい。典型的なバクテリアの薬剤抵抗性遺伝子
は、アンピシリン又はテトラサイクリンに抵抗性を与えるものである。
【００５２】 原核生物レプリコンを含むベクターは、さらに、大腸菌のようなバクテリア宿
主細胞の中で、コード遺伝子配列の発現（転写及び翻訳）を指令することができ
る原核生物又はバクテリオファージのプロモータを含むことができる。プロモー
ターは、ＲＮＡポリメラーゼを結合させ転写を開始させる、ＤＮＡ配列により形
成された発現制御成分である。通常、原核生物宿主に適合できるプロモーター配
列は、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に対して都合のよい制限部位を含むプラ
スミドベクター中に提供されている。このようなベクタープラスミドのうち、典
型的なものとしては、Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（リッチモンド
、カリフォルニア州）から入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐ
ＢＲ３２９とＰｈａｒｍａｃｉａ（ピスカタウェイ、ニュージャーシー州）から
入手可能なｐＰＬ及びｐＫＫ２２３がある。
【００５３】 真核細胞に適合できる発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合できる発
現ベクターも、コード配列を含むｒＤＮＡ分子を形成するために使うことができ
る。真核細胞発現ベクターは、当該技術分野においては周知であり、幾つかの商
業元から入手できる。通常、このようなベクターは、望ましいＤＮＡセグメント
を挿入するために都合のよい制限部位を含んで提供される。このようなベクター
のうち、典型的なものとしては、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ、＃３１２５５）、本明細書
中に記載のベクターｐＣＤＭ８、及びその他同様の真核生物発現ベクターがある
。
【００５４】 本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために使われる真核細胞発現ベクターには、
さらに、真核細胞中で効果的な選択できるマーカー、好ましくは薬剤抵抗性のあ
る選択マーカーが含まれている。好ましい薬剤抵抗性マーカーは、その発現がネ
オマイシン抵抗性である遺伝子、例えばネオマイシンフォスフォトランスフェラ
ーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇ
ｅｎｅｔ．１：３２７−３４１、１９８２）。また、選択できるマーカーは、別
のプラスミド上に存在でき、これら二つのベクターは、宿主細胞への同時トラン
スフェクションによって導入され、選択できるマーカーに対する適当な薬剤中で
培養することにより選択できる。
【００５５】 Ｅ．外因的に供給されたコード核酸分子を含有する宿主細胞 本発明は、さらに、ＩＣＡＣＣタンパク質、好ましくは本発明のＩＣＡＣＣ−
１タンパク質、をコードする核酸分子により形質転換された宿主細胞を提供する
。宿主細胞は、原核細胞であるか、真核細胞であることができる。本発明のタン
パク質を発現するために有用な真核細胞は、細胞系が細胞培養法に適合し、発現
ベクターの増殖と遺伝子産物の発現に適合していれば、特に制限されるわけでは
ない。好ましい真核細胞は、特に制限されるわけではないが、酵母菌、昆虫及び
哺乳類細胞、好ましくは、マウス、ラット、サル、又はヒト細胞系のような脊椎
細胞を含む。好ましい真核宿主細胞系は、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可
能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＫ１６５８
として入手可能なＮＩＨスイスマウス胎児細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、生まれたてのハ
ムスター腎臓細胞（ＢＨＫ），及び同様の真核生物組織培養細胞系を含む。いか
なる原核生物でも、本発明のタンパク質をコードするｒＤＮＡ分子を発現するた
めに使うことができる。好ましい原核宿主は、大腸菌である。
【００５６】 適当な宿主細胞を、本発明のｒＤＮＡ分子で形質転換することは、一般に、使
用されるベクター及び利用される宿主システムのタイプに依存する周知の方法に
よって成し遂げられる。原核宿主細胞の形質転換に関しては、電気的ポレーショ
ン及び塩処理法が、一般的に利用される（例として、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０（１９７２）、及びＭａ
ｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｍｍａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８２）を参照）。
脊椎細胞をｒＤＮＡを含んでいるベクターで形質転換することに関しては、電気
的ポレーション、カチオン性脂質又は塩処理法が一般的に利用される（例として
、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１３７３−７６（１９
７９）を参照）。
【００５７】 選べるマーカーの選択を含む周知の技術によって、うまく形質転換された細胞
（例えば、本発明のｒＤＮＡを含有する細胞）を、同定することができる。例え
ば、本発明のｒＤＮＡの導入により生じた細胞を、単一コロニーを作るようにク
ローニングすることができる。Ｓｏｕｔｈｅｒｎにより記載されているような方
法を使い（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３、１９７５
、又はＢｅｒｎｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：２０８、１９８５）、これらのコロ
ニーからの細胞を、収穫し、溶解し、ｒＤＮＡの存在についてそれらのＤＮＡ含
有物を調べることができ、又は細胞によって生産されたタンパク質を免疫学的方
法によってアッセイすることができる。
【００５８】 Ｆ．ｒＤＮＡ分子を使った組換えタンパク質の生産 本発明は、さらに、本明細書に記載された核酸分子を使って、本発明のＩＣＡ
ＣＣタンパク質を生産する方法を提供する。一般的に言えば、タンパク質の組換
え型の生産には、次のステップが含まれる。
【００５９】 まず、本発明のタンパク質をコードする核酸分子、例えば配列番号１、配列番
号３、配列番号５に記載された核酸分子又はこれらの分子のオープンリーディン
グフレームが得られる。前記のコードする配列が、イントロンによって不断され
ていなければ、それは、どんな宿主においての発現にも直接適している。
【００６０】 その後、好ましくは、核酸分子は、タンパク質のオープンリーディングフレー
ムを含有する発現ユニットを形成するために、上述の適当な制御配列で作動的に
連結に置かれる。発現ユニットは、適当な宿主を形質転換するために使われ、形
質転換された宿主は、組換えタンパク質の生産を許容する条件下で培養される。
組換えタンパク質は、培地又は細胞から、随意に単離される。このタンパク質の
回収と精製は、不純物が許容されるような場合には、必然的ではない。
【００６１】 前記のそれぞれのステップは、様々な方法で行うことができる。例えば、望ま
しいコード配列は、ゲノム断片から得られてよく、適当な宿主の中で直接に使わ
れてもよい。種々の宿主の中で実行可能な発現ベクターの構築は、上記に示され
た適当なレプリコン及び制御配列を使うことによって成し遂げられる。制御配列
、発現ベクター及び形質転換法は、遺伝子を発現させるために使われる宿主細胞
に依存し、その詳細については先に議論された。通常利用できなければ、適当な
制限部位は、摘出可能な遺伝子がこれらのベクターに挿入されるのを提供するた
め、コード配列の末端に加えることができる。当業者であれば、当該技術分野で
周知のいかなる宿主／発現システムを容易に採用し、本発明の核酸分子と共に、
組換えタンパク質を産生するために使用することができる。
【００６２】 Ｇ．結合パートナーを同定するための方法 本発明のもう一つの形態は、本発明のタンパク質の結合パートナーを単離し同
定するのに使用される方法を提供する。詳しくは、本発明のタンパク質を、潜在
的な結合パートナー、又は細胞の抽出物又は断片と、潜在的な結合パートナーが
本発明のタンパク質と結合できる条件下で、混合する。混合後、本発明のタンパ
ク質と結合するようになったペプチド、ポリペプチド、タンパク質又は他の分子
は、混合物から分離される。その後、本発明のタンパク質に結合している結合パ
ートナーは、取り除かれ、さらに分析される。結合パートナーを同定し単離する
ために、タンパク質全体、例えば配列番号２、配列番号４又は配列番号６のＩＣ
ＡＣＣタンパク質が使われる。また、そのタンパク質の断片又はそのタンパク質
を含んでいる膜断片が使われてもよい。
【００６３】 本明細書において、細胞抽出物とは、溶解又は粉砕された細胞から作られる調
製物又は断片を指す。細胞抽出物の好ましい供給源は、ヒト組織又は細胞に由来
する細胞である。
【００６４】 細胞の抽出物を得るためには、種々の方法を使うことができる。物理的又は化
学的粉砕法により、細胞を粉砕することができる。例えば、物理的粉砕法には、
特に制限されるものではないが、超音波及び機械的剪断がある。例えば、化学的
溶解法には、特に制限されるものではないが、洗剤溶解及び酵素溶解がある。当
業者であれば、本発明法に使用するための抽出物を得るため、細胞抽出物を調整
する方法を容易に採用することができる。
【００６５】 細胞の抽出物が調製されると、その調製物は、本発明のタンパク質とその結合
パートナーとが結合できるような条件下で、本発明のタンパク質と混合される。
種々の条件を使うことができるが、最も好ましいのは、ヒト細胞の細胞質で見ら
れるのとよく似た条件である。浸透圧、ｐＨ、温度、及び細胞抽出物の濃度等の
特性を変化させ、タンパク質とその結合パートナーとの結合を最適化することが
できる。
【００６６】 適当な条件で混合した後、結合した複合体は、混合物から分離される。その混
合物を分離するためには、種々の技術を利用することができる。例えば、本発明
のタンパク質に特異的な抗体は、結合パートナー複合体を免疫沈澱させるために
使うことができる。また、クロマトグラフィー及び密度／沈降物遠心分離等の標
準の化学的分離技術を使うこともできる。
【００６７】 抽出物中に見つかった会合しない細胞構築物を取り除いた後、結合パートナー
を、従来法によって、複合体から解離することができる。例えば、混合物の塩濃
度又はｐＨを変えることによって、解離を成し遂げることができる。混合抽出物
から、結合パートナーの結合した対を分離するのを助けるため、本発明のタンパ
ク質を固体支持体に固定することができる。例えば、そのタンパク質をニトロセ
ルロースマトリックス又はアクリルビーズに接合することができる。そのタンパ
ク質の固体支持体への付着は、抽出物の中にある他の構築物から、ペプチド／結
合パートナーの対を分離するのを助ける。同定された結合パートナーは、単一の
タンパク質又は二つ若しくは三つ以上のタンパク質でできた複合物である。また
、結合パートナーは、Ｔｅｒａｙａｍａらの工程（Ｔｅｒａｙａｍａら、（１９
９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．６９：１７１−８４又Ｓａｕｄｅｒら
、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．７７（５）：９９１−６）に従うファー・ウェスタン アッセイを使って同定されても、抗原基によって標識されたタンパク質又はＧＳ
Ｔ融合タンパク質を使用して同定されてもよい。
【００６８】 また、本発明の核酸分子を、酵母菌の２次ハイブリッドシステム、好ましくは
膜タンパク質の結合パートナーをスクリーニングするためのシステム、において
使うことができる。酵母菌の２次ハイブリッドシステムは、他のタンパク質パー
トナー対を同定するために使われてきており、本明細書に記載の核酸分子を使用
するために、容易に適応され得る。
【００６９】 Ｈ．ＩＣＡＣＣタンパク質をコードする核酸分子の発現を調節する薬剤を同定す
る方法 本発明のもう一つの実施の形態は、例えば、配列番号２、又は配列番号６のア
ミノ酸配列を有するタンパク質等の、本発明のタンパク質をコードする核酸分子
の発現を調節する薬剤を同定する方法を提供する。このようなアッセイには、本
発明の核酸の発現レベルの変化をモニターするために利用可能ないかなる手段を
利用してよい。本明細書においては、細胞内での核酸の発現をアップレギュレー
トするか、ダウンレギュレートすることができれば、薬剤は、本発明の核酸（例
えば、配列番号２又は配列番号６の配列を有するタンパク質）をコードする核酸
分子の発現を調節するといわれる。
【００７０】 本発明の薬剤は、アンチセンス又は遺伝子治療に関連してもよい。今では、当
該分野において、アンチセンス又は遺伝子治療として提供されたとき、ある選択
された効果を提供するように、ＤＮＡ分子の変異体を造ることができると知られ
ている。ＩＣＡＣＣ−１をコードする天然のＤＮＡセグメントは、二つの鎖を持
ち、センス鎖とアンチセンス鎖は、水素結合によって結合している。受容体をコ
ードするｍＲＮＡは、予期した通りチミジンのユリジンによる置換を持つ、セン
ス鎖に同一のヌクレオチド配列を持つ。従って、受容体配列の知識に基づいて、
合成ヌクレオチドが合成される。このようなオリゴヌクレオチドは、ＩＣＡＣＣ
−１をコードするＤＮＡ及びＲＮＡに結合することができる。本発明のｍＲＮＡ
及びＤＮＡのコード鎖に相補的な活性断片は、一般には少なくとも約１５ヌクレ
オチド、もっと一般には少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは３０ヌクレオ
チド、さらに好ましくは５０ヌクレオチドかそれ以上である。センス及びアンチ
センス鎖間の結合力は、全体の水素結合に依存する。従って、当業者であれば、
ｍＲＮＡ中の全塩基数に基づいて、オリゴヌクレオチド配列の最適の長さを、容
易に計算することができる。
【００７１】 前記配列は、ｍＲＮＡのどんな部分にも相補的であってよい。例えば、その配
列は、５'末端又はキャッピング部位又はキャッピング部位と開始コドンとの間 であり、未コード領域又はコード領域の全部又は一部分のみをカバーしている、
キャッピング部位から下流に隣接していてもよい。アンチセンス配列が結合する
特定の部位は、望まれる阻害の程度、配列のユニークさ、アンチセンス配列の安
定性等によって変る。
【００７２】 本発明の実施においては、ＩＣＡＣＣ−１の発現は、上述されたアンチセンス
オリゴヌクレオチド配列の有効量を投与することによって、ダウンレギュレート
される。本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、ヒトＩＣＡＣＣ−１をコードす
るｍＲＮＡに結合し、これらのタンパク質の発現（翻訳）を阻害する。点変異、
挿入、ＩＣＡＣＣ−１の欠失又はスプライス変異等の種々の変異を含む単離され
たＤＮＡ配列は、遺伝子治療にも有効である。
【００７３】 薬剤のための一つのアッセイ形態においては、オープンリーディングフレーム
とアッセイできる融合パートナーにレポーター遺伝子の融合物を含む細胞系が調
製されてもよい。数々のアッセイできる融合パートナーが知られており、ホタル
ルシフェラーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを
コードする遺伝子（Ａｌａｍら、（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８
８：２４５−２５４）を含み、容易に入手可能である。レポーター遺伝子融合物
を含んでいる細胞系は、その後、適当な条件と時間で薬剤に曝される。薬剤に曝
されたサンプルとコントロールサンプルの間でレポーター遺伝子の異なる発現は
、ＩＣＡＣＣ−１タンパク質をコードする核酸の発現を調製する薬剤を同定する
。
【００７４】 他のアッセイ形態も、本発明のタンパク質、例えば配列番号２又は配列番号６
を有するタンパク質をコードする核酸の発現を調節する薬剤の能力をモニターす
るために使われてよい。例えば、ｍＲＮＡ発現は、本発明の核酸へのハイブリダ
イゼーションにより、直接にモニターされる。細胞系は、適当な条件と時間にお
いて、試験される薬剤に曝され、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡがＳａｍｂｒｏｏｋらに
おいて開示された標準的な手順によって単離される（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ．Ｅｄ．Ｃｌｏ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８
９）。
【００７５】 薬剤に曝された細胞とコントロール細胞との間で、ＲＮＡ発現レベルの違いを
検出するためのプローブは、本発明の核酸から調製されてもよい。高ストリンジ
ェンシーの条件下、標的の核酸分子とのみハイブリダイズするプローブをデザイ
ンすることは、必然的ではないが好ましい。高ストリンジェンシーの条件下では
、高度に相補性のある核酸分子ハイブリッドのみが形成される。従って、アッセ
イ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成するために存在すべきであ
る、二つの核酸鎖間の相補性量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブ：
ターゲットハイブリッドと潜在的なプローブ：無ターゲットハイブリッド間の安
定性の違いが最大限になるように選択されるべきである。
【００７６】 プローブは、当該技術分野における周知の技術により、本発明の核酸分子から
デザインされてもよい。例えば、プローブのＧ＋Ｃ含有量及びプローブの長さは
、プローブがその標的配列に結合するのに影響する。プローブの特異性を最適化
する方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９）又はＡｕｓｕｂｅｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ
ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、ＮＹ、１９９５）による著書の中で一般に入手可
能である。
【００７７】 ハイブリダイゼーション条件は、それぞれのプローブによって必要とされるの
で、Ｓａｍｂｒｏｏｋら及びＡｕｓｕｂｅｌらによって記載されたような周知の
技術によって修正される。全細胞ＲＮＡ又はポリＡ ＲＮＡに富むＲＮＡのハイ
ブリダイゼーションは、利用可能な形態において達成することができる。例えば
、全細胞ＲＮＡ又はポリＡ ＲＮＡに富むＲＮＡを、固体支持体に固定し、この 固体支持体を、本発明の配列の少なくとも一部又はその部分的な部位を含む少な
くとも一つのプローブに、プローブが特異的にハイブリダイズする条件下で、曝
すことができる。また、本発明の配列の一つ又はその部分的な部位を、多孔性ガ
ラスウエハのような固体支持体に固定することもできる。ガラスウエハを、その
後、サンプルからの全細胞ＲＮＡ又はポリＡ ＲＮＡに富むＲＮＡに、固定され た配列が特異的にハイブリダイズするような条件下で曝すことができる。このよ
うなガラスウエハ及びハイブリダイゼーション法は、広く利用されており、例え
ば、Ｂｅａｔｔｉｅによって記載されている（ＷＯ ９５／１１７５５）。未処
理細胞集団及び薬剤に曝された細胞集団からのＲＮＡサンプルに特異的にハイブ
リダイズする与えられたプローブの性能を調べることにより、ＩＣＡＣＣタンパ
ク質、好ましくはＩＣＡＣＣ−１タンパク質、をコードする核酸の発現をアップ
又はダウンレギュレートする薬剤が同定される。
【００７８】 ｍＲＮＡの質的及び量的分析のためのハイブリダイゼーションは、ＲＮａｓｅ
プロテクションアッセイを使って行うことができる（例えば、ＲＰＡ、Ｍａら、
（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：２７３−２３８を参照）。簡単には、遺伝
子産物及びファージに特異的でＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（
例えば、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）をコードするｃＤＮＡを
含有する発現ベクターは、ｃＤＮＡ分子の３'末端でありファージプロモーター から下流で、線状化される。このような線状化された分子は、引き続き、インビ
トロ転写によりｃＤＮＡのラベル化されたアンチセンス転写物の合成のためのテ
ンプレートとして使われる。ラベル化された転写物は、その後、８０％フォルム
アミド、４０ｍＭピペス、ｐＨ６．４、０．４Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴ
Ａを含むバッファー中において、４５℃で培養することにより、単離されたＲＮ
Ａの混合物にハイブリダイズされる。その結果生じるハイブリッドは、その後、
４０μｇ／ｍｌ リボヌクレアーゼＡ、及び２μｇ／ｍｌ リボヌクレアーゼを
含むバッファー中で消化される。本質部分を形成していないタンパク質を不活性
化し抽出した後、分析のためにサンプルを、ウレア／ポリアクリルアミドゲルに
かける。
【００７９】 本遺伝子産物の発現に影響する薬剤のための他のアッセイ形態においては、前
記の遺伝子産物を生理学的に発現する細胞又は細胞系が、最初に同定される（組
織分布の図を参照）。このようにして同定された細胞及び／又は細胞系は、転写
アパレイタスの調節の忠実度が、薬剤の適当な表面形質導入メカニズム及び／又
は細胞質カスケードとの外因的な接触に関連しては、維持されるよう必然的な細
胞マシーナリーを含むと期待される。さらに、このような細胞又は細胞系は、一
つかそれ以上の、本遺伝子産物に対して特有の抗原基断片に融合した本遺伝子産
物をコードする構造遺伝子の末端を含んでいる、実施可能な未翻訳の５'プロモ ーターを含有する発現ビヒクル（例えばプラスミド又はウイルスベクター）構築
物で形質導入又はトランスフェクトされる。前記断片は、前記プロモーターの転
写制御下にあり、自然に現存するポリペプチドと分子量が異なるポリペプチドと
して表現され、又は免疫学的に区別されるタグをさらに含んでもよい。このよう
なプロセスは、当該技術分野において周知である（Ｍａｎｉａｔｉｓ参照）。細
胞は、ＩＬ−９に曝されてもよい。
【００８０】 上記で略述されたように、形質導入又はトランスフェクトを受けた細胞又は細
胞系は、その後、適当な条件下、薬剤と接触する。例えば、薬剤は、薬学的に許
容される賦形薬を含み、水溶性の生理学的バッファー（例えば、生理学的ｐＨの
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、生理学的ｐＨのイーグルバランス塩溶液（ＢＳＳ）、
血清を含むＰＢＳ又はＢＳＳ、或いはＰＢＳ又はＢＳＳ及び／又は血清を含む調
製された培地で３７℃で培養される）中にある細胞と接触される。前記の条件は
、当業者によって必要とされれば、修正されてもよい。細胞が薬剤と接触したの
に引き続き、前記細胞は粉砕され、粉砕物中のポリペプチドは断片化される。そ
れによって、ポリペプチド断片が集められ、免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩ
ＳＡ、免疫学的沈降法、又はウエスタンブロット）によりさらに処理されるよう
抗体と接触する。「接触された薬剤」サンプルから単離されたタンパク質のプー
ルは、賦形薬のみが細胞と接触したコントロールサンプルと比較され、「接触さ
れた薬剤」サンプルから免疫学的に得られた信号の、コントロールに比較しての
増加又は減少は、薬剤の効果を見分けるために使われる。
【００８１】 Ｉ．ＩＣＡＣＣタンパク質の少なくとも一つの活性を調節する薬剤を同定する方
法 本発明のもう一つの実施の形態は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６の
アミノ酸配列を有するタンパク質で好ましくはＩＣＡＣＣ−１タンパク質のよう
な、本発明のタンパク質の少なくとも一つの活性を調節する薬剤を同定するため
の方法を提供する。このような方法又はアッセイは、望まれる活性をモニター又
は検出するためのいかなる手段を利用してもよい。
【００８２】 特定のアッセイは、ＩＣＡＣＣ−１の細胞機能をモニターすることに基づいた
ものであってよい。本発明のアンタゴニストには、ＩＣＡＣＣ−１と相互作用又
は結合してその受容体を不活性化させる分子が含まれる。本発明のアロステリッ
クな、倒置の、又は弱いその他のアンタゴニストを同定するためには、ＩＣＡＣ
Ｃ−１への結合について試験するとよい。本発明には、その受容体の活性を妨げ
るＩＣＡＣＣ−１のアンタゴニストが含まれる。アンタゴニストは、それ自身で
は、薬学的活性はないが、アゴニストの作用を妨げることによって、効果を及ぼ
す化合物である。本発明のアンタゴニストを同定するために、ＩＣＡＣＣ−１の
自然のリガンドとの競合的結合について試験するとよい。アンタゴニストの結合
と活性のアッセイは、本明細書及び引用された文献に記載されるように、ＩＣＡ
ＣＣ−１のダウンレギュレーションに対する機能をモニターすることから導かれ
る。アンタゴニストの結合には、イオン結合力、水素結合、疎水性相互作用、フ
ァンデルワールス力及び共有結合を含む、周知の全ての相互作用タイプが含まれ
る。多くの場合、複数のタイプの結合がアゴニスト又はアンタゴニストとＩＣＡ
ＣＣ−１のような分子との相互作用において重要である。
【００８３】 さらなる実施の形態においては、これらの化合物は、ＩＣＡＣＣ−１又はその
リガンドの類似体であってよい。ＩＣＡＣＣ−１の類似体は、単離されたＤＮＡ
配列におけるその遺伝子のための点変異、ヌクレオチド置換及び／又は欠失によ
って生産されてもよく、当該技術分野（Ｓｉｍｏｎｓｃｉｔｓら、１９９４）に
おいてその全てが詳しく記載されている方法によって造られる。本発明は、また
、ＩＣＡＣＣ−１のスプライス変異体を含み、ＩＣＡＣＣ−１の単離された核酸
配列を開示する。この配列は、一つ又はそれ以上のエクソンの欠失を含んでいる
。本明細書で使用する「スプライス変異体」という用語は、少なくとも一つのエ
クソンを含有しているヒトＩＣＡＣＣ−１をコードする単離され精製されたＤＮ
Ａ分子を示す。当該技術分野においては、自然に発現されたスプライス変異体の
証拠はない。このようなエクソンには、種々の点変異が含まれると理解すべきで
ある。
【００８４】 構造と活性の関係が、本発明のアンタゴニストを修飾するために使われてもよ
い。例えば、Ｘ線結晶解析及びＮＭＲの技術が、本発明を修飾するために使われ
てもよい。例えば、分子グラフィックスを使って、欠失変異体の構造モデルを建
設するためのテンプレートとして使うことができる、ヒトＩＣＡＣＣ−１の三次
元構造を造ることができる。これらのモデルは、その後、正常なクロライドチャ
ネルの機能を変化させる、ＩＣＡＣＣ−１に対するリガンドを同定し構築するた
めに使われる。さらに、もう一つの実施の形態においては、このような化合物は
、ＩＣＡＣＣ−１構造に対するダイナミックなプローブとして使われてもよく、
且つ、細胞系又はＩＣＡＣＣ−１活性をアッセイするための他の適当な手段を使
って、ＩＣＡＣＣ−１アンタゴニストを開発するために使われてもよい。
【００８５】 さらに、本発明は、ＩＣＡＣＣ−１の生物学的安定性を減少させるか又は合成
を妨げる化合物をも提供する。生物学的安定性は、分子の合成とその分解の間の
時間の尺度である。例えば、タンパク質、ペプチド又は治療学上の擬似ペプチド
（ペプチドミメティクス）（Ｋａｕｖａｒ、１９９６）の安定性は、Ｄ−アミノ
酸を使うことによって延長され、その配列を変化させ酵素分解をもっと受け易く
することによって短縮される。
【００８６】 もう一つの実施の形態においては、本発明のアンタゴニストはＩＣＡＣＣ−１
に対する抗体である。ＩＣＡＣＣ−１抗体は、当該分野において周知の標準技術
（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒｖＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８を参照）を使って作られたモノクローナルであるか
ポリクローナルであってよい。これらの抗体は、リガンドの結合又は活性化に対
して必要とされる、タンパク質の細胞外部位に結合することにより、ＩＣＡＣＣ
−１活性化を妨げるために使うことができる。ある一つの形態においては、前記
抗体は、ＩＣＡＣＣ−１と相互作用し、他の実施の形態においては、ＩＣＡＣＣ
−１に対するリガンドと相互作用する。このような抗体を顕在化させるために使
われるＩＣＡＣＣ−１は、上記で議論されたＩＣＡＣＣ−１の変異体又は断片の
いかなるものであってもよい。抗体は、当該技術分野における標準的手法を使う
ことによって、ＩＣＡＣＣ−１のペプチド配列からも生産される（Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、
１９９４参照）。
【００８７】 一つのアッセイ形態においては、試験される薬剤に曝された細胞集団と、薬剤
に曝されていないコントロール細胞集団とを比較したときの、本発明のＩＣＡＣ
Ｃ−１タンパク質の相対量が、アッセイされる。この形態においては、特異的抗
体のようなプローブが、異なった細胞集団において、タンパク質の差異的な発現
をモニターするために使われる。細胞系又は集団は、適当な条件と時間で、試験
される薬剤に曝される。細胞溶解物は、曝された細胞系又は集団、又は、コント
ロールである曝されていない細胞系又は集団から調製されてもよい。前記細胞溶
解物は、その後、プローブで分析される。
【００８８】 抗体プローブは、もしそれらが十分な長さであれば本発明のタンパク質、ポリ
ペプチド又はペプチドを使って、もし望まれるか免疫性を増すために必要とされ
るなら、適当なキャリアとコンジュゲ―トさせることにより、適当な哺乳類宿主
を、適当な免疫プロトコールで免疫化することにより、調製される。ＢＳＡ、Ｋ
ＬＨ又は他のキャリアタンパク質のようなキャリアとの免疫原性接合体を調製す
る方法は、当該技術分野においては周知である。ハプテンとの接触性を提供する
ためには、ある状況においては、例えばカルボジイミド試薬を使った直接のコン
ジュゲーションが効果的であり、他の場合には、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ社（ロックフォード、イリノイ州）によって供給されるような結合試薬が望ま
しい。ハプテンペプチドは、例えばキャリアへの結合を容易にするために、アミ
ノ末端又はカルボキシル末端でシステイン残基により伸長することができ、又は
、システイン残基により散在させることができる。一般に当該分野で理解されて
いるように、免疫原の投与は、一般に、適当なアジュバントの使用及び適当な時
間に渡っての注射によって投与される。免疫化のスケジュール中、抗体の力価に
より抗体形成が十分かどうかを決定する。
【００８９】 このようにして生産されたポリクローナル血清は幾つかの利用においては満足
の行くものであろうが、薬学的組成物においては、モノクローナル調製物の使用
が好ましい。一般に知られているように、望ましいモノクローナル抗体を分泌す
る不死化された細胞系は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的な方法、
又はリンパ球又は脾臓細胞の不死化に効果がある修飾された方法を使うことによ
り調製されてもよい。望ましい抗体を分泌している不死化された細胞系は、抗原
がペプチドハプテン、ポリペプチド又はタンパク質である、免疫アッセイによっ
てスクリーニングされる。望ましい抗体を分泌している不死化された細胞培養物
が同定された時、インビトロで又は腹水中における生産によって、細胞を培養す
ることができる。
【００９０】 望ましいモノクローナル抗体は、その後、培養上澄み液から又は覆水上澄み液
から回収される。免疫学的に重要な部分を含むモノクローナル抗体又はポリクロ
ーナル抗血清からの断片は、無傷の抗体と同様アンタゴニストとして使うことが
できる。Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）2のＦａｂ'断片の免疫学的に反応性のある断片を 使用することは、一般にこのような断片が免疫グロブリンよりも抗原性が少ない
ため、特に治療学上との関連においてよく好まれる。
【００９１】 抗体又は断片は、組換え手段による現在の技術を使い、生産されてもよい。タ
ンパク質の望ましい領域に特異的に結合する抗体の領域は、多種源を持つキメラ
と関連しても生産できる。上記の方法においてアッセイされる薬剤は、無作為に
、又は合理的に選択することができ、又はデザインすることができる。 本明細書で使われるように、特異的な配列が、本発明のタンパク質のみ、又はそ
れに会合する基質、結合パートナー等とともに会合に係わる特異的な配列を考慮
すること無しに選ばれる時、薬剤が無作為に選択されるといわれる。無作為に選
択された薬剤の例としては、化学ライブラリー又はペプチドコンビネーションラ
イブラリーの使用、又は生物体の培養ブロスがある。
【００９２】 本明細書では、標的の配列及び／又は薬剤の作用に関連したそのコンフォメー
ションを考慮して、無作為的にでなく薬剤が選択された時、薬剤は合理的に選択
されたか又はデザインされたと言う。
【００９３】 本発明の薬剤は、例えばペプチド、小分子、ビタミン誘導体と同様に炭水化物
であり得る。当業者であれば、本発明の薬剤の構造的性質に関して制限がないこ
とは容易に認識できる。本発明のペプチド薬剤は、当該技術分野では周知の、標
準的な固相（又は液相）ペプチド合成法を使って調製できる。さらに、これらの
ペプチドをコードするＤＮＡは、商用的に入手できるオリゴヌクレオチド合成機
器を使って合成されてもよく、且つ標準的な組換え生産システムを使って組換え
により生産されてもよい。もし、アミノ酸をコードしていない遺伝子が含まれる
のであれば、固相ペプチド合成を使っての生産が必然的である。
【００９４】 本発明の薬剤のもうとつのクラスは、本発明のタンパク質の重要な部位と免疫
反応性がある抗体である。抗体薬剤は、適当な哺乳類被検体を、抗体によって標
的とされるタンパク質の部分である、抗原部位を含むペプチドで、免疫化するこ
とによって得られる。
【００９５】 Ｊ．ＩＣＡＣＣタンパク質の少なくとも一つの活性を調節する薬剤の使用 アトピー性アレルギー、気管支反応性亢進、喘息及び関連疾患の病因における
ＩＣＡＣＣ−１の役割を定義する更なる証拠は、ＩＬ−９がＩＣＡＣＣ−１を特
異的に誘導するという本出願人等の観察から、直接導かれる。従って、ＩＬ−９
に対する多面発現性の役割は、抗原により誘導される数々の反応に重要であり、
アトピー性アレルギーに重要な細胞のＩＣＡＣＣ−１のアップレギュレーション
に部分的に依存している。抗原でのエアゾール攻撃の前に、抗体による前処置に
よってＩＬ−９の機能がダウンレギュレートされると、動物は、抗原により誘導
された反応から完全に保護される。このような反応は、気管支反応性亢進、気管
支洗浄における増加した細胞数及び好酸球増加症、炎症及び上昇した血清ＩｇＥ
に関連する肺の組織的変化を含む。ＩＬ−９及び喘息様の反応の抑制は、ダウン
レギュレートされたＩＣＡＣＣ−１の発現と関連している（図１３）。従って、
ＩＣＡＣＣ−１をダウンレギュレートすることにより、このようなアトピー性ア
レルギーの病因の根拠となり、且つこの疾患と関連するアレルギー性炎症を特徴
づける反応の治療は、この発明の範囲である。
【００９６】 クロライドチャネルのＩＬ−９生物的反応への関与は、ＩＬ−９刺激により、
分泌されたエオタキシンタンパク質を生産する、インビトロ初代肺培養によって
解明される（図１７）。このような培養物を周知のクロライドチャネル阻害剤で
処理することにより、ＩＬ−９により誘導されたエオタキシン反応が抑制がされ
るようになり（図１８）、従って、ＩＣＡＣＣ−１阻害剤のスクリーニングアッ
セイを提供する。もう一つの実施の形態においては、ＩＣＡＣＣ−１発現ベクタ
ーが導入された細胞系を、特異的なクロライドチャネル阻害剤をスクリーニング
するために使うことができる。
【００９７】 出願人等は、また、ＩＣＡＣＣ−１のアンタゴニストを投与することによって
、ＩＣＡＣＣ−１のダウンレギュレーションを教授する。当業者であれば、ＩＣ
ＡＣＣ−１の活性化とリガンドの結合に重要な、必須の３次元構造コンフォメー
ションを含んでいる全ての分子は、本発明の範囲であると認識できる。
【００９８】 喘息様の表現型に関連したＩＬ−９配列及び喘息様の表現型の欠乏に関連した
ＩＬ−９配列の立証は、抗原に対する炎症性反応がＩＬ−９に依存すると示唆す
る。従って、ＩＬ−９経路のダウンストリームで特異的に誘導されたＩＣＡＣＣ
−１をダウンレギュレートすることは、この抗原により誘導された反応を保護す
る。
【００９９】 ＩＣＡＣＣ−１遺伝子の直接的な制御に加えて、本発明は、また、ＩＣＡＣＣ
−１によって細胞内シグナリングを阻害する方法を包含する。高く発エルゴン性
のリン酸転移反応は、キナーゼとして知られる種々の酵素によって触媒されると
いうことが当該分野において周知である。換言すれば、キナーゼは、ＡＴＰと代
謝産物の間で、リン酸基を転移する。本発明の範囲に含まれているのは、タンパ
ク質キナーゼの特異的阻害剤である。従って、これらのキナーゼの阻害剤は、Ｉ
ＣＡＣＣ−１のダウンレギュレーションに有用であり、そのためアトピー性アレ
ルギー及び喘息の治療において有用である。
【０１００】 さらに、本発明のその他の一面では、驚くことに、アミノステロール化合物が
、ＩＬ−９によってのＩＣＡＣＣ−１誘導の阻害に有用であるとわかった。本発
明において有用なアミノステロール化合物は、米国特許出願第０８／２９０８２
６号及びその関連出願第０８／４１６８８３号及び第０８／４７８７６３号、第
０８／４８３０５９号及びその関連出願である第０８／４８３０５７号、第０８
／４７９４５５号、第０８／４７９４５７号、第０８／４７５５７２号、第０８
／４７６８５５号、第０８／４７４７９９号及び第０８／４８７４４３号に記載
されており、その全てが、参考文献として本明細書に明示的に援用されている。
【０１０１】 ＩＣＡＣＣ−１ダウンレギュレーションの治療学上の可能性が同定されてきた
一方、出願人等は、また、ＩＣＡＣＣ−１のアップレギュレーションに対する治
療学上の可能性についても認識してきた。嚢胞性繊維症患者は、濃い分泌によっ
て気管障害及びそれに続く病原性微生物による集落形成と感染を生じ、（Ｅｎｇ
ら、１９９６）、それによって特徴づけられる肺疾患によって障害を受ける。嚢
胞性繊維症患者からの気管上皮は、欠失ｃＡＭＰ媒介によるクロライドの分泌の
みでなく増加したナトリウム吸収とカルシウムにより媒介される増加したクロラ
イド分泌（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５）を含む正常とは異なる、広範に渡るイ
オン輸送特性を示す。嚢胞性繊維症気道初代上皮細胞における全体的なクロライ
ド分泌を回復することは、ナトリウムの過吸収及び正常な気道上皮細胞機能の補
正につながる（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５）。従って、出願人等は、気道上皮
におけるＩＣＡＣＣ−１活性をアップレギュレートすることを通し、このような
細胞中でカルシウム依存性クロライド分泌をさらに増加させることによって、嚢
胞性繊維症を治療するための方法を提供する。この意味で、ｃＡＭＰによって媒
介されるクロライド分泌の欠陥によるクロライド分泌の減少は、ＩＣＡＣＣ−１
のアップレギュレーションにより埋め合わされる。この結果は、細胞内クロライ
ド勾配及び正常な気道上皮細胞機能の回復になる。もう一つの適応症では、ＩＣ
ＡＣＣ−１のアップレギュレーションは、ＩＢＤのような自己免疫関連疾患のた
めの治療に有用である。
【０１０２】 実施例において提示されているように、例えば配列番号２又は配列番号６のア
ミノ酸配列を有するＩＣＡＣＣ−１タンパク質のような本発明のタンパク質と核
酸は、ＩＬ−９によって誘導される。前記タンパク質の発現をダウンレギュレー
トするか又は調節する薬剤、或いは、前記タンパク質の少なくとも一つの活性の
アゴニスト又はアンタゴニストのような薬剤は、前記タンパク質の機能と活性に
関連する生物学的及び病理学的プロセスを調製するために使われてもよい。
【０１０３】 本明細書においては、被検体は、哺乳動物が、本発明のタンパク質によって媒
介される病理学的又は生物学的プロセスの調節を必要とするのであれば、どんな
哺乳動物であってもよい。
【０１０４】 「哺乳動物」は、哺乳類に属する個体を意味する。本発明は、ヒト被検体の治
療に特に有用である。
【０１０５】 病理学上のプロセスとは、心身に有害な効果を産む生物学上のプロセスのカテ
ゴリーを指す。例えば、本発明のタンパク質の発現は、アトピー性アレルギー、
喘息及び／又は嚢胞性繊維症と関連しているだろう。本明細書においては、薬剤
がプロセスの程度又は酷烈さを減少させる時に、薬剤は病理学上のプロセスを調
節するという。例えば、アトピー性アレルギー、喘息及び／又は嚢胞性繊維症は
予防でき、又は、病気の進行は、何らかの方法で、本発明のタンパク質の発現又
は少なくとも一つの活性を減少させるか調節する薬剤の投与によって調節される
。
【０１０６】 本発明の薬剤は、それのみ又は特定の病理学上のプロセスを調節する他の薬剤
との組み合わせでも提供され得る。例えば、本発明の薬剤を、抗喘息薬と一緒に
投与することができる。本明細書においては、二つの薬剤が同時に投与される時
又はこれらの薬剤が同時に作用するという様式で独立して投与される時に、二つ
の薬剤が組み合わせで投与されると言われる。
【０１０７】 本発明の薬剤は、非経口的に、皮下内の、静脈内の、筋肉内の、腹腔内の、経
皮の又は頬側のルートで投与され得る。これに代わって又は共に、投与は、経口
ルートであるか、直接的に肺にされてもよい。投与量は、受容者の歳、健康状態
及び体重、同時にされる治療の種類に依存し、例えあるとすれば、治療の頻度及
び望まれる効果の性質に依存する。
【０１０８】 本発明の治療法に使われる化合物は、治療される症状、部位に特定的な治療の
必要、投与される薬の量及び類似の考慮すべき事柄に依存し、全身的に又は局所
的に投与されてもよい。
【０１０９】 局所的な投与が使われてもよい。溶液、懸濁液、ゲル、軟膏又は膏薬、及び同
様のものといったどんな一般の局所的組成物でも利用してよい。このような局所
的処方の調製については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅ ｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに例示されるように薬学的処方の技術分野にお
いて詳しく記載されている。局所的な使用については、このような化合物は、粉
末又はスプレー、特にエアゾールの形状で、投与することができる。有効成分は
、全身的投与に適合した薬学的組成物中で投与されてもよい。周知のように、も
し薬が全身的に投与されるのであれば、それは、経口投与用として、粉末、丸薬
、錠剤又は同様の物として、又はシロップ又はエリキシールとして調剤されてよ
い。静脈内、腹腔内、又は外傷内投与としては、化合物は、注射によって投与で
きるよう溶液又は懸濁液として調製される。特定の場合には、このような化合物
を、坐薬形状又は皮膚下に挿入した長期に渡る放出製剤として調剤することが有
用である。一つの好ましい実施の形態においては、本発明の化合物は、吸入法に
よって投与されてもよい。吸入治療では、前記化合物は、計量された服用量吸入
器によっての投与に有効な溶液中であってよいか、又は、乾燥粉末物吸入器に適
した形状であってよい。
【０１１０】 有効量は、ＩＣＡＣＣ−１をダウンレギュレートする量である。与えられた有
効量は、状態によって変わり、特定の場合には、治療される状態の酷烈さと患者
の治療に対する感度によって変わる。従って、与えられた有効量は、日常的な実
験法により、時間と場所で、最適に決定される。しかしながら、本発明に関連す
る、アトピー性のアレルギー及び喘息に関連した疾患の治療は、０．００１〜５
重量％、好ましくは、約０．００１〜１％、を含む処方が、普通、治療学的な有
効量を構成する。全身的に投与された時、一日当たり、キログラム体重当たり、
０．０１〜１００ｍｇの間の量が、好ましくは約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇが、多
くの場合の治療学上の結果をもたらす。
【０１１１】 本発明は、また、薬学的に許容されるキャリアーと、共に本発明の前記化合物
を含有する薬学的組成物を含む。薬学的に許容されるキャリアーは、石油、動物
、野菜又は合成起源のものを含む、ピーナツ油、大豆油、ミネラル油、セサミオ
イル等の、水又は油のような、滅菌された液体であり得る。薬学的組成物が静脈
から投与される時は、水が好ましいキャリアーである。 生理食塩水、及びブドウ糖水溶液及びグリセロール溶液は、特に注射溶液として
は、溶液キャリアーとして利用され得る。適した薬学的キャリアーについては、
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）に記載されてい
る。薬理学的に有効な薬剤に加えて、本発明の組成物は、有効化合物の調剤への
プロセッシングを容易にし、作用部位へ送達されるよう薬学的に使用される、賦
形剤及び補助剤を含んでいる、薬学的に許容される適当なキャリアーを含んでよ
い。非経口投与に適した処方は、例えば水に溶解する塩のような水に溶解する形
状の有効化合物の水溶液含む。さらに、適当な油性の注射懸濁液として有効な化
合物が投与されてもよい。適当な脂肪親和性の溶媒又はビヒクルは、脂肪油（例
えばセサミオイル）、又は合成脂肪酸エステル（例えばエチルオリエート又トリ
グリセリド）を含む。水溶性の注射懸濁液は、懸濁液の粘性を上げる物質を含ん
でよく、それには、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム塩、ソルビト
ール、及び／又はデキストランが含まれる。前記懸濁液には、随意に、安定剤が
含まれてもよい。また、薬剤を包んで細胞へ運ぶために、リポソームが使われて
もよい。
【０１１２】 本発明に従う全身的投与のための薬学的処方は、腸内、非経口的又は局所的投
与のために処方されてもよい。これら３っつの全てのタイプが、有効成分の全身
的投与を達成するために、同時に使われてもよい。
【０１１３】 経口投与のために適した処方は、硬性又は軟性のゼラチンカプセル、丸薬、被
覆された錠剤を含む錠剤、エリキシル、懸濁液、シロップ又は吸入及びこれらの
制御された放出形態、を含む。
【０１１４】 本発明の方法を実施するにおいて、本発明の化合物は、単独で使用されても、
他の薬学的又は診断的な薬剤との組み合わせで使用されてもよい。ある好ましい
実施の形態においては、本発明の化合物は、一般に受け入れられる医学上の業務
に従うこれらの条件のために、通常に処方されたその他の化合物と同時に投与さ
れてもよい。本発明の化合物は、通常は哺乳動物で、好ましくはヒトにおいて、
インビボで利用されてもよい。
【０１１５】 さらに、もうひとつの実施の形態においては、本発明の化合物は、アトピー性
アレルギー及び喘息において、治療学上の利益のために、ＩＣＡＣＣ−１の機能
又は制御を変化させるタンパク質を含む、化学的残基に結合されてもよい（Ｋｒ
ｅｉｔｍａｎら、１９９４）。これらのタンパク質は、サイトカインの他の阻害
剤、及びアトピー性アレルギー及び喘息にさらに治療学上の利益を提供する、抗
ＩＬ−４、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−３、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ−１３、抗ＩＬ−１１
及び抗ＩＬ−１０を含む成長因子を組み合わせて含んでいてもよい。さらに、本
発明の分子は、リン酸化を介して、当該技術分野で周知の架橋剤を使ってコンジ
ュゲートし、ビオチル化、チオニル化、アセチル化、ヨード化していてもよい。
【０１１６】 Ｋ．診断 本発明は、また、アトピー性アレルギー及び関連疾患への罹り易さを診断する
方法と、ＩＬ−９，その受容体及びＩＣＡＣＣ−１との間の関連に基づいて、こ
のような疾患を治療するための方法を含む。
【０１１７】 このような疾患は、また、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のような腸の自己免疫性疾
患の診断のため、ＩＣＡＣＣ−１遺伝子発現をモニターすることを含む。ＩＢＤ
の場合には、ＩＣＡＣＣ−１遺伝子発現の抑制及び欠乏は、その疾患の診断上の
マーカーになり、ＩＣＡＣＣ−１レベルを追跡する能力は、治療をモニターする
のに役立つ。
【０１１８】 診断の実施の形態の一つには、ＩＣＡＣＣ−１のＤＮＡ配列の変化を認識する
ことが含まれる。一つの方法としては、当該技術分野の者には理解されるように
、十分にハイブリダイズする条件下で、本発明のＩＣＡＣＣ−１に相補的な配列
を有する核酸分子（プローブとしても知られる）を導入することを含む。その配
列は、一つの実施の形態においては、ＩＣＡＣＣ−１の一つのアリール体又はそ
の断片に特異的に結合し、その他の実施の形態においては、両方のアリール体に
結合する。これらの疾患と関連するＤＮＡ配列変化を認識するその他の方法は、
当該技術分野において周知の多数の方法を使う（Ｏｔｔ、１９９１）、ＤＮＡ配
列の直接分析である。その他の実施の形態は、これらの疾患に関連する、ＩＣＡ
ＣＣ−１遺伝子のＤＮＡ配列変化を、検出することを含む（Ｓｃｈｗｅｎｇｅｌ
ら、１９９３；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら、１９９３；Ｏｒｉｔａら、１９８９；Ｓ
ａｒｋａｒら、１９９２；Ｃｏｔｔｏｎ、１９８９）。これらには、ポリメラー
ゼ連鎖反応、制限断片長ポリモルフィズム分析及びシングル鎖コンフォメーショ
ン分析が含まれる。
【０１１９】 本発明の実施においては、当業者の通常の技術範囲内である、分子生物学、薬
学、免疫学及び生化学における従来の用語及び手法が用いられる（例としては、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８５を参照）。
【０１２０】 当業者であれば、さらに記載すること無しに、前記の記載と次の例示を使うこ
とにより、本発明の化合物を作製し利用することができ、且つ請求項の方法を実
施することができる。従って、次の実施例は、本発明の好ましい実施の形態を特
定的に指摘するものであって、いかなる場合にも開示の残部を制限するものとは
解釈されるべきではない。
【０１２１】
【実施例】
（実施例１） IL-9発現遺伝子のcDNA差分化解析 ＩＬ−９に誘導される遺伝子を単離するため、ＩＬ−９トランスジェニッック
マウス（Ｔｇ５）から取り出した肺を用いた。Ｔｇ５とは、前述のようにＩＬ−
９を過剰発現するＦＶＢ系マウスである（Ｒｅｎａｕｌｄら、１９９４）。本系
統のマウスでは、大部分の組織でＩＬ−９が過剰発現していることが示されてい
る。ＩＬ−９によって誘導される特定の遺伝子を同定するため、市販のＰＣＲセ
レクト式ｃＤＮＡサブトラクション法キット（クローンテック社）を用い、Ｔｇ
５マウスおよび親のＦＶＢマウスの肺からのｍＲＮＡについて抑制型ＰＣＲ・差
分化ｃＤＮＡ解析法を行った。
【０１２２】 ｃＤＮＡ解析。ＦＶＢおよびＴｇ５マウスの肺から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用い
製造元（ギブコ・ＢＲＬ）の説明書に従ってトータルＲＮＡを調製した。安楽死
させたマウスから肺を切除し、液体窒素中で凍結した。次に、凍結肺をＴｒｉｚ
ｏｌ試薬中に置き、組織用グラインダーを用いて粉砕した。トータルＲＮＡから
オリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（ファルマシア社）によりポリＡＲＮＡを精製
した。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII逆転写酵素およびオリゴ（ｄＴ）プライマー（
クローンテック社）を用い、製造元の推奨する条件で二重鎖ｃＤＮＡを調製した
。次に、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりｃＤＮＡを
調製した。産生物を、ヌクレアーゼを含まない水に再懸濁し、産生物の品質を定
量するため、下記のようにアガロース・ゲル上で分析した。
【０１２３】 差分化ｃＤＮＡ分析法プロトコル。 図１に示すように、製造元（クローンテ
ック社）のプロトコルに従い、Ｔｇ５およびＦＶＢの肺の差分化ｃＤＮＡ分析を
行った。これら肺ｃＤＮＡ間のサブトラクションの結果、１２００個の組換えク
ローンが生成された。これらのクローンの分析により、それぞれがライブラリー
の２〜５％の割合を占める種類を複数含むことが明らかになった。ライブラリー
中で最も卓越した転写産物はＩＬ−９ｃＤＮＡであって、ＩＬ−９を構成的に発
現するマウス（Ｔｇ５）と、対照とするその親との差分であるため、これをサブ
トラクション効率の対照標準とした。複数のコピーが発見された、もう一方のｃ
ＤＮＡ（ライブラリーの３％に相当）は、下記のように、新規のカルシウム作動
性クロライド・チャンネルであった。
【０１２４】 （実施例２） ＩＬ−９トランスジェニックマウス肺中のマウスＩＣＡＣＣ−１
ｃＤＮＡの同定 実施例１に記載したＩＣＡＣＣ−１プローブを用い、マウス肺ｃＤＮＡライブ
ラリー（クローンテック社）を製造元の推奨する条件で探索した。百万個の組換
えクローンをスクリーニングして、数個の重複するファージを同定した。引き続
きスクリーニングを行うことにより、ファージミドを含むシングル・プラークが
得られ、これを製造元のプロトコルに従って二重鎖プラスミドに形質転換した。
組換えクローンを調製し、プラスミド・ベクターだけでなく部分的サブトラクシ
ョンプローブから同定された内部の配列に対応するプライマーを用いて、シーク
エンシングを行った。次いでクローンを直線上に並べ、隣接部を結合して全長配
列を生成した。
【０１２５】 単離された２９３１ｂｐのｃＤＮＡは、９２５アミノ酸からなる蛋白をコード
するオープンリーディングフレームを含んでいた。図２にマウスＩＣＡＣＣ−１
ｃＤＮＡのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。全長ｃＤＮＡを用いたＧ ｅｎＢａｎｋのヌクレオチドＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）デー
タベース検索により、ウシ・クロライド・チャンネルｃＤＮＡと類似することが
明らかとなった。図３にウシ・カルシウム作動性（カルシウム活性化）クロライ
ド・チャンネル ｃＤＮＡへの整列（アラインメント）を示す。コードされるポ リペプチドのモチーフ解析により、複数の膜貫通領域および糖付加部位などが明
らかになった。マウスＩＣＡＣＣ−１の一次配列を用いてＥＳＴデータベース検
索を行い、数個の未定義ヒトＥＳＴが本新規ｃＤＮＡの一部分と相同であること
が見出された。図４Ａおよび４ＢにヒトＩＣＡＣＣ−１およびＩＣＡＣＣ−２遺
伝子の配列を示す。これら２つの全長ヒトＩＣＡＣＣ配列は、両方ともヒトｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングして得られた。
【０１２６】 （実施例３） ＩＬ−９によりマウス細胞中、インビボでＩＣＡＣＣ−１が誘導
される 肺においてＩＬ−９によりＩＣＡＣＣ−１が誘導されることを確認するため、
実施例１に記載したようにＴｇ５およびＦＶＢマウスの肺からＲＮＡを単離した
。ランダム・ヘキサマー（ファルマシア社）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII（
ギブコ／ＢＲＬ）を用い、製造元の推奨する条件でｃＤＮＡを生成した。メッセ
ージをＮｉｃｏｌａｉｄｅｓら（１９９５）の方法によるＰＣＲおよびノザン・
ブロット法により分析した。マウスＩＣＡＣＣ−１メッセージを生成するのにプ
ライマーとして、３７６ｂｐの遺伝子産物を生ずる、センス側 ５’−ＣＣＡＧ
ＡＴＣＣＡＣＡＣＣＡＡＡＡＣＧＡＧＡＡＧ−３’（配列番号７）（ヌクレオチ
ド６８９−７１２番）およびアンチセンス側 ５’−ＣＡＣＴＧＴＣＡＡＡＧＧ
ＴＣＡＣＣＡＴＣＣＣＧＡ−３’（配列番号８）（ヌクレオチド１０４１−１０
６４番）を用いた。前述のプライマー（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら、１９９１）を
用いｃＤＮＡの完全性の内部対照としてＤＨＦＲを用いた。用いた増幅条件は、
９５℃ ３０秒間、５８℃ １．５分間、および７２℃ １．５分間で３５サイ
クルとした。ノザン・ブロット解析については、Ｔｇ５またはＦＶＢ肺に由来す
るトータルＲＮＡを１．５％フォルムアルデヒド・ゲル上で泳動し、ナイロン・
メンブレンに乗せ換え、マウスＩＣＡＣＣ−１ｃＤＮＡの一部からなるＤＮＡ断
片でプローブした。
【０１２７】 発現実験の結果からＩＣＡＣＣ−１は、ＩＬ−９トランスジェニックマウスの
肺で特異的に発現し、親の系統では発現しないことが実証された（図６）。この
データからＩＬ−９が肺におけるＩＣＡＣＣ−１の発現に直接作用し、肺に含ま
れるＩＬ−９反応性細胞がＩＣＡＣＣ−１を発現することが証明された。
【０１２８】 （実施例４） ＩＬ−９によりマウス肺におけるＩＣＡＣＣ−１の発現を誘導す
ることができる。
【０１２９】 検出可能なレベルのＩＬ−９を発現しない（気管支反応性不全の）Ｃ５７Ｂ６
マウス、および高レベルのＩＬ−９を発現する（気管支反応性亢進の）ＤＢＡマ
ウス（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら、１９９７）を用いて、ＩＣＡＣＣ−１の遺伝子
発現をインビボで評価した。これらの肺からのＩＣＡＣＣ−１についてのＲＴ−
ＰＣＲおよびノザンブロット解析により、天然に高レベルのＩＬ−９を発現する
マウス（ＤＢＡ）の肺ではＩＣＡＣＣ−１が発現されるが、ＩＬ−９の発現が低
レベルであるマウス（Ｃ５７Ｂ６）では発現しないことが証明された（図７）。
【０１３０】 ＩＬ−９の発現がＩＣＡＣＣ−１の発現に決定的に関係すること、および遺伝
的背景を特異的に制御するのに関係することを確認するため、組換えマウスＩＬ
−９をＣ５７Ｂ６系マウス肺に導入した。麻酔したマウスの気管に０．１ｍｇ／
ｍｌのＩＬ−９溶液、またはビヒクルのみ（０．１％ウシ血清アルブミン）５０
μｌを毎日、１０日間点滴した。１０日後、点滴したＩＬ−９のレベルを定量す
るため、マウスを安楽死させ、切除した肺について、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いて
製造元（ギブコ／ＢＲＬ）の説明書に従って、ＲＮＡ発現解析を行うか、または
ウェスタン・ブロット解析を行った。ＩＬ−９のウェスタン・ブロット解析によ
り、ＩＬ−９を肺へ直接投与した結果、肺におけるＩＬ−９量の総量の増加がも
たらされ、一方、ビヒクルのみを点滴したマウスでは増加は観察されなかった。
【０１３１】 実施例３に記載するようにＩＣＡＣＣ−１ＲＮＡの発現を測定した。ＩＣＡＣ
Ｃ−１ＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析により、組換えＩＬ−９をＣ５７Ｂ６マウ
スの肺に投与したとき、発現が増加し、ビヒクルのみで処置したマウス肺では発
現が観察されなかった（図８）。このデータにより、肺におけるＩＣＡＣＣ−１
の発現にＩＬ−９が直接の役割を演ずることが証明される。
【０１３２】 （実施例５） マウスにおけるＩＣＡＣＣ−１の組織分布 ＩＣＡＣＣ−１の発現がＩＬ−９発現の存在下のみで起こる、という可能性を
検証するために、Ｔｇ５マウスから種々の臓器を採取しノザンブロットブロット
によりＲＮＡの発現を解析した。Ｔｇ５マウスと比較して、肺におけるＩＬ−９
発現レベルが低いことから、対照としてＢＡＬＢｃマウスを用いた。ＢＡＬＢｃ
マウス臓器に由来する組織ブロットは市販品（クローンテック社）から入手し、
Ｔｇ５マウス臓器の組織ブロットは臓器を採取後、液体窒素中で凍結して調製し
た。これらの臓器のそれぞれからＴｒｉｚｏｌ試薬を用い、製造元（ギブコ／Ｂ
ＲＬ）の説明書に従ってトータルＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、実施例４に記載
するように、ゲル電気泳動し、そして分析した。レーンは、β−アクチンを内部
対照プローブとして用いて標準化した。
【０１３３】 組織ブロットは、ＩＣＡＣＣ−１ｃＤＮＡからなるＤＮＡ断片を用いてプロー
ブした。図９（下図）に示すように、正常マウスからのブロット上ではどの組織
中でも信号は観察されなかった。Ｔｇ５の臓器についてＩＣＡＣＣ−１の発現を
分析したところ、肺、リンパ節、結腸、脾臓、胃、卵巣および子宮での発現が明
かとなった（図９、上図）。このデータによりＩＣＡＣＣ−１がＩＬ−９を過剰
に発現しているマウスでは数カ所の組織で発現しているが、低ＩＬ−９レベルの
マウスでは発現しないことが証明された。このデータから、ＩＣＡＣＣ−１は、
これらの臓器において、ＩＬ−９に対する生理的反応の一部を担っていることが
示唆される。
【０１３４】 （実施例５Ａ） 抗原暴露による肺中でのＩＣＡＣＣ−１の誘導 既に報告された（ＭｃＬａｎｅ，ＭＰら、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1
9:713-720, １９９８）ように動物の抗原感作および表現型分類を行った。簡潔 に言うと、Ｂａｌｂ／ｃマウス鼻腔内をAspergillus fumagatusに３〜４週間、 暴露した。最終暴露日の一日後、抗原暴露マウスおよび未処置（対照）マウスを
、気管支過剰反応性（ＢＨＲ）および気道の細胞充実性について表現型を分類し
た。表現型分類の後、臓器を切除し、トータルＲＮＡを実施例５に記載するよう
に調製し、ＩＣＡＣＣ−１の発現を未処置および抗原処置した組織について調べ
た。図１０に示すように、抗原に暴露したＢａｌｂ／ｃマウスでは、対照群（図
１０Ｂ）と比較して、ＢＨＲの顕著な増強（図１０Ａ）、炎症性細胞浸潤（主と
して好酸球）があった。これらはヒトの喘息の臨床的特徴と非常によく似ており
、分子生物学的機構の研究、および喘息薬の開発のための薬学的な標的の発見に
適切なモデルである。ＩＣＡＣＣ−１遺伝子の発現は、喘息様の肺と密接に関係
しており、抗原処置肺においては旺盛な発現が見られる（図１１、下のパネル）
一方、未処置「正常」肺においては発現が見られない（図１１、上のパネル）。
これらのデータから、１）ＩＣＡＣＣ−１は喘息治療の有望な治療標的である、
２）ＩＣＡＣＣ−１の発現または機能を抑制しても肺に対して有害な影響は起こ
らないことが示唆される。
【０１３５】 （実施例５Ｂ） 肺における抗原により誘導されたＩＣＡＣＣ−１誘導を抗ＩＬ
−９で阻害 ＩＬ−９はヒトおよび喘息モデル・マウスにおける喘息性反応の主要な媒介因
子である（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら、Proc. Natl. Acad. Sci. 94:13175−13180
, １９９７；ＭｃＬａｎｅ，ＭＰら、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19:713 −720, １９９８；Ｔｅｍａｎｎら、J. Exp. Med. 188:1307−1320, １９９８；
ＬｅｖｉｔｔおよびＮｉｃｏｌａｉｄｅｓ、Emerg. Thera. Targets 3:1−11, １９９９）。ＩＬ−９阻止抗体を抗原暴露したマウスに適用すると喘息様表現型
（気管支過剰反応性および好中球などの炎症性細胞浸潤）を抑制する。実施例５
Ａに記載したように（Ｂ６Ｄ２）Ｆ１マウスを第０、７、１４、２１および２２
日目にAspergillus fumagatus抗原に暴露した。このうちのサブセットのマウス については、第０、７、１４、２１日目において、鼻腔内に抗ｍＩＬ９（ハムス
ター抗マウスＩＬ−９抗体、ファーミンゲン社）２００μｇ、またはアイソタイ
プ対照Ｉｇ、または生理食塩水のみ、を投与した。実施例５Ａに記載したように
、全てのマウスおよび未処置対照群についてＢＨＲおよびＢＡＬ分析により表現
型分類を行った。図１２Ａに示すように、抗ＩＬ−９処置（Ａｓｐ＋ α−ｍＩ
Ｌ９）により、ほぼ無処置群のそれと近いレベルにまでＢＨＲを顕著に抑制する
ことができたのに対し、アイソタイプ対照Ｉｇ（Ａｓｐ ＋Ｉｇ）はＢＨＲ軽減
には無効であった。気道の好酸球増加症についても同様の結果が得られ、抗原処
置（Ａｓｐ−）の結果、引き起こされた顕著な好酸球増加症が抗ｍＩＬ９処置（
Ａｓｐ＋ α−ｍＩＬ９）により抑制された。これらマウスの全肺組織のノザン
ブロット解析により、抗原暴露マウスの肺で観察されるＩＣＡＣＣ−１の発現も
また、抗ｍＩＬ９により抑制されることが示された（図１３）。遺伝子発現量全
体およびＲＮＡサンプルのロード量が均等であることを確認するための対照とし
て、遍在的に発現するハウスキーピング型遺伝子であるＧＡＤＰＨを用いた。こ
れらのデータを一括すると、喘息反応とＩＣＡＣＣ−１遺伝子の発現との間に緊
密な関係があることが証明される。これらのデータは、ＩＣＡＣＣ−１の発現ま
たは機能の阻止により喘息反応が抑制されることを示唆する。
【０１３６】 （実施例６） ヒト肺上皮細胞におけるＩＬ−９のＩＣＡＣＣ−１誘導能 上皮細胞においてＩＬ−９でＩＣＡＣＣ−１が誘導されうる能力を評価するた
め、ＩＬ−９存在下で、ヒトの初代培養肺上皮細胞株ＮＨＢＥをＩＣＡＣＣ−１
発現レベルについてアッセイした。１ｘ１０7個の細胞を収穫し、リン酸バッフ ァー食塩水で三回洗った後、培養液中にプレーティングし、５０ｎｇ／ｍｌＩＬ
−９存在下、および非存在下で７２時間培養した。その後、細胞を収穫し、Ｔｒ
ｉｚｏｌ試薬を用い製造元（ギブコ・ＢＲＬ）の説明書に従ってトータルＲＮＡ
を抽出した。実施例３に記載したようにＲＮＡを処理しｃＤＮＡに逆転写した。
ヒトＩＣＡＣＣ−１メッセージを生成するプライマーとして、７２２ｂｐの遺伝
子産物を生ずる、センス側 ５’−ＧＡＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＴＡＡＧＣ
−３’（配列番号９）およびアンチセンス側 ５’−ＴＡＴＴＴＣＡＴＡＧＣＴ
ＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１０）を用いた。既報のプライマー（Ｎ
ｉｃｏｌａｉｄｅｓら、１９９１）を用い、ｃＤＮＡの完全性を測定するための
内部対照としてγ−アクチンをアッセイした。ヒト肺上皮細胞に由来するＲＴ−
ＰＣＲデータにより、ＩＬ−９で処理した細胞でＩＣＡＣＣ−１が誘導され、未
処理細胞では発現が観察されないことが示され、ＩＣＡＣＣ−１発現細胞がＩＬ
−９に直接応答することが示唆される（図１４）。
【０１３７】 これに加えて、ヒト肺の生検サンプルから確立されたヒト肺初代培養において
ＩＬ−９により誘導されたＩＣＡＣＣ−１の発現を調べた。まず、肺組織を鋏で
ミンチ状に切り刻み金網を通した。組織を１７５ｉＵ／ｍｌのコラゲナーゼ（シ
グマ社）により３７℃で１時間消化した。組織を４５μｍおよび１５μｍのフィ
ルターに通した後、Ｄｕｂｅｌｃｏ Ｉｓｃｏｖｅ培地に再懸濁し、１０ｃｍ組
織培養用プレートにプレーティングした。プレートを３７℃で１時間保温して、
マクロファージをプレート面に接着させ、次いで非接着性細胞を収穫し、抗生物
質を加えた１０％ＦＢＳ添加Ｄｕｂｅｌｃｏ Ｉｓｃｏｖｅ培地に２ｘ１０5細 胞／ｍｌで再懸濁し、５％ＣＯ2中、３７℃で４〜５日間培養した。ＩＬ−９に よるＩＣＡＣＣ−１誘導の実験のため、細胞を２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−
９存在下、または非存在下で４〜５日間培養した。その後、細胞を収穫し、上記
のようにＴｒｉｚｏｌ試薬によりトータルＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを逆転写し
、ＩＣＡＣＣ−１について５’プライマー ５’−ＣＣＣＡＡＡＧＧＡＡＧＣＣ
ＡＡＣＴＣＴＧＡ−３’および３’プライマー ５’−ＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡＧ
ＧＡＡＴＧＧＴＧＣＴ−３’を用いてＰＣＲを行った結果、２５３ｂｐの産物を
得た。内部対照としては遍在的に発現するハウスキーピング型遺伝子であるＰＭ
Ｓ２を用いた（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら、Genomics 29:329−334, １９９５）。
産物を２％アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウム・ブロミド染色で可視化
した。図１５に示すように、ＩＬ−９はヒト初代肺培養中でＩＣＡＣＣ−１を誘
導した。また一方、ＩＬ−９非存在下での培養物は、検出できる量のＩＣＡＣＣ
−１を有しなかった。
【０１３８】 （実施例６Ａ） 抗ＩＣＡＣＣ−１血清 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第９章（
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載された方法を用いて、
ｍＩＣＡＣＣ−１配列のうちから選んだペプチドでウサギを免疫することによっ
てｍＩＣＡＣＣ−１に対する抗血清を調製した。免疫に用いたペプチドは、第３
０９−３３０残基、ＣＬＶＬＤＫＳＧＳＭＬＮＤＤＲＬＮＲＭＮＱＡ（配列番号
１１）、第３５７−３７５残基、ＱＳＥＬＫＱＬＮＳＧＡＤＲＤＬＬＩＫＨＣ（
配列番号１２）、第３９８−４２２残基，ＫＫＫＹＰＴＤＧＳＥＩＶＬＬＴＤＧ
ＥＤＮＴＩＳＳＣ（配列番号１３）、第５２４−５４６残基、ＴＴＨＰＰＴＩＦ
ＩＷＤＰＳＧＶＥＱＮＧＦＩＬＤＣ（配列番号１４）、第５９０−６１０残基、
ＣＰＰＩＴＶＴＰＶＶＮＫＮＴＧＫＦＰＳＰＶＴ（配列番号１５）であった。前
記ペプチドは自動化ペプチド合成の標準的手法により、八価の多価抗原ペプチド
（ＭＡＰ）または単鎖ペプチドとして合成した。単鎖ペプチドは免疫用にＫＬＨ
と結合し、ＭＡＰ抗原は共役せずに使用した。５個のペプチド全部の混合物をＫ
ＬＨコンジュゲート、またはＭＡＰのいずれかでウサギに免疫した。ｍＩＣＡＣ
Ｃ−１を免疫沈降する能力で示されるように、どちらの免疫原も有効な抗血清を
生成した。
【０１３９】 これら抗体の活性を調べるため、インビボで翻訳したＩＣＡＣＣ−１の免疫沈
降を実施した。35Ｓ標識ＩＣＡＣＣ−１断片（全長ＩＣＡＣＣ−１の第２８９−
６１８番アミノ酸に相当する４２９個のアミノ酸）をＴＮＴ結合網状赤血球ライ
セート・システム（プロメガ社）を用いてインビトロ翻訳した。放射標識したＩ
ＣＡＣＣ−１は、ＩＣＡＣＣ−１抗血清５μｌ、またはプロテインＡで精製した
ポリクローナル抗体１μｇで免疫沈降することができた。ＩＣＡＣＣ−１抗血清
の特異性を検定するため、35Ｓ標識ｍＩＬ−９リセプター断片（６０ＫＤ ｍＩ Ｌ−９Ｒ）を陰性対照として用いた。同一の沈降条件下で、ＩＣＡＣＣ−１抗血
清によりｍＩＬ−９Ｒ蛋白が沈降することはなかった（図１６）。これらの結果
から、ＩＣＡＣＣ−１に対して調製された、抗血清およびプロテインＡで精製し
たポリクローナル抗体はＩＣＡＣＣ−１を認識することができ、したがってＩＣ
ＡＣＣ−１の機能を阻止する医薬品として利用できる可能性があることが示唆さ
れた。
【０１４０】 （実施例６Ｂ） クロライド・チャンネル・ブロッカーを用いる肺におけるＩＬ
−９に誘導されるエオタキシン発現の抑制 ＩＬ−９が肺の上皮細胞においてエオタキシンを誘導することが知られている
（Ｄｏｎｇら、Eur. J. Immunol. 投稿中）。ＩＬ−９トランスジェニックマウ スのインサイチュ発現解析により気道上皮細胞においてはＩＣＡＣＣ−１発現が
最も優勢であることが見出された。これらの上皮細胞は、エオタキシンをも産生
し、そして種々のマウス系統からの肺の初代培養細胞と同様に、これらの細胞に
おいてＩＬ−９はエオタキシンを誘導しうる。肺上皮細胞において、エオタキシ
ンおよびＩＣＡＣＣ−１の両者はともにＩＬ−９により誘導されるため、ＩＣＡ
ＣＣ−１を阻害することにより、エオタキシンまたはＩＬ−４またはＩＬ−１３
など（Ｄｏｕｃｅｔら、J. Clin. Invest. 101:2129-2139,１９９８）、肺上皮 細胞でのエオタキシン産生を誘導する他のサイトカインも阻害される可能性があ
る。この仮説を検証するため、マウスの初代肺培養アッセイを採用し、実施例５
Ａに記載したようにＦＶＢ／ＮＪマウスから肺細胞を収穫し、実施例６でヒト初
代肺培養について記載したように、インビトロ分析のために処理した。２０ｎｇ
／ｍｌの組換えｍＩＬ−９とともに、またはなしで４８時間、細胞を培養した。
４８時間後、調製した上清を採取し、エオタキシンＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシ
ステムズ社）を用いてマウス・エオタキシンの産生を分析した。標準曲線は組換
えマウス・エオタキシンを用いて作成した。図１７に示すように、ＩＬ−９とと
もに培養したＦＶＢ初代培養細胞は、２ｎｇ／ｍｌに上るエオタキシンを産生し
たのに対し、培地のみで生育したＦＢＶ培養では、エオタキシンはほとんど検出
不能なレベルであった。陽性対照としてはＩＬ−９トランスジェニッックマウス
肺（ＴＧ５レーン）を用いた。このアッセイを用いて、クロライド・チャンネル
阻害剤であるＤＩＤＳおよびＳＩＴＳを用いて、ＩＬ−９によって誘導されるエ
オタキシン産生を抑制する能力を評価した。ｍＩＬ−９存在下または非存在下で
、０、３０および１００μＭのチャンネル・ブロッカーとともに培養物をプレー
トした。図１８に示すように、１００μＭのＤＩＤＳまたはＳＩＴＳにより、エ
オタキシン産生は、それぞれ３３％および４１％阻害された。これらのデータに
より、ＩＬ−９の上皮細胞に対する生物学的作用がクロライド・チャンネル機能
を阻害することにより抑制する能力が証明される。さらに、これらのデータによ
り、喘息に関連するＩＣＡＣＣ−１などのクロライド・チャンネルを抑制するこ
とにより、抗原に起因する喘息の反応に対して治療的効果をもたらすことが示唆
される。本スクリーニング・アッセイ法およびｄ手法は、ＩＬ−９によって誘導
され、その産生物が分泌型蛋白である他の遺伝子の評価に用いることもでき、唯
一のマーカーとしてエオタキシンを用いることに限定されるものではない。ヒト
ＩＣＡＣＣ−１およびヒトの作用機序分析法を利用して、１）遺伝子の新規発現
などのＩＬ−９の誘導効果、および２）ＩＣＡＣＣ−１の生物学的機能を抑制す
る「特異的」クロライド・チャンネル阻害剤の同定を行うのに同様のアプローチ
がとられる。
【０１４１】 （実施例７） 小分子阻害剤によるＩＣＡＣＣ−１信号伝達のインビボでの特異
的阻止 ＩＬ−９により誘導されるＩＣＡＣＣ−１の信号伝達の特異性を証明するため
、構成的に活性なＩＣＡＣＣ−１を発現する形質移入細胞をクロライド・チャン
ネル阻止物質で処理し、ＩＣＡＣＣ−１の阻害がクロライド・チャンネル活性を
阻止するか否かを調べる。ＩＬ−９および阻止物質の存在下、または非存在下で
、構成的に活性化されたＩＣＡＣＣ−１遺伝子を遺伝子移入した細胞を３０００
細胞／ウェルでプレートし、クロライド・チャンネル活性を蛍光クロライドプロ
ーブを用いて評価する。野生型細胞が構成的に活性化されたＩＣＡＣＣ−１発現
細胞と同程度にクロライド・チャンネル活性を示すことはない。野生型細胞と構
成的に活性化されたＩＣＡＣＣ−１を発現する細胞と間で、クロライド・チャン
ネル活性への阻止物質の添加について比較する。
【０１４２】 （実施例８） マウス肺における、アミノステロールによるＩＣＡＣＣ−１誘導
の阻止 ＤＢＡ気管支過剰反応マウスからの肺をアミノステロール化合物で処理し、Ｉ
ＣＡＣＣ−１発現を阻止する能力について試験する。この一群のアミノステロー
ルは、各種のサメ（ツノザメ科・メジロザメ科・トラザメ科）の肝臓から、増殖抑
制活性をもつとみられる分子クラスとして同定された。このような化合物の例は
、関連する米国特許出願第08/290,826号に引用されている。このような一連のア
ミノステロールをＩＣＡＣＣ−１発現の阻害能および下記のようにＤＢＡマウス
からのＴＨ２活性についてアッセイする。
【０１４３】 ＤＢＡマウスに１０ｍｇ／ｋｇで各種アミノステロールを１５日間、毎日腹腔
内注射する。第１５日目にマウスを表現型分類し（実施例９参照）、実施例１に
記載したように、安楽死させ肺を採取する。ＲＮＡを単離し、ＩＣＡＣＣ−１ｃ
ＤＮＡプローブを用いるノザンブロット解析用に処理する。プローブにより検出
されるＩＣＡＣＣ−１ ＲＮＡのレベルは、対照と比較して、アミノステロール
の阻害効果の程度を示す。１４５９、１４０９、１４３６および１５６９などの
特定のアミノステロールのＩＣＡＣＣ−１発現をインビボで阻止する能力を評価
する。
【０１４４】 （実施例９） 喘息モデルマウスにおけるＩＣＡＣＣ−１の役割：脱感作動物に
おける気道の反応性 ＤＢＡ、Ｃ５７Ｂ６およびＢ６Ｄ２Ｆ１の各系統の、ウイルス・フリーである
ことが証明されたオスおよびメスのマウスを米国・国立癌研究所またはジャクソ
ン・ラボラトリーズ（メイン州バーハーバー）から購入する。ＩＬ−９トランス
ジェニックマウス（Ｔｇ５）およびその親系統（ＦＶＢ）はルートビッヒ研究所
（ベルギー、ブリュッセル）から入手する。動物はウイルスおよび抗原の無い施
設内で、高効率微粒子フィルターで空気浄化した層流フード内で飼育し、実験操
作に供する３ないし７日前から自由給餌・給水条件に置く。動物施設は２２℃に
維持し、明暗周期は自動制御する（明期１０時間、暗期１４時間）。
【０１４５】 表現型分類および前処置の効力：気管支収縮反応を定量するため、薬物への暴
露前から暴露中、呼吸器系圧を気管で測定し記録する。前述のようにマウスを麻
酔し装置を取り付ける（Ｌｅｖｉｔｔら、１９８８；Ｌｅｖｉｔｔら、１９８９
；Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒら、１９９０；Ｌｅｖｉｔｔら、１９９１；Ｌｅｖｉｔ
ｔら、１９９５；Ｅｗａｒｔら、１９９５）。５−ヒドロキシトリプタミン、ア
セチルコリン、アトラキュリウム、サブスタンス−Ｐ類縁体のうち１つまたは複
数について気道反応性を測定する。気管支収縮薬投与後の呼吸気圧ピーク値の変
動を簡便かつ再現性のよく測定する、「気道圧時間指標」（ＡＰＴＩ）と呼ばれ
る（Ｌｅｖｉｔｔら、１９８８；Ｌｅｖｉｔｔら、１９８９）測定法を用いる。
ＡＰＴＩは、注射の時点からピーク圧がベースラインまたはプラトーに戻るまで
の間の呼吸圧ピーク値の変動を積分値として評価する。ＡＰＴＩは呼吸抵抗に相
当するが、ＡＰＴＩでは気管支収縮からの回復に関連する要素を包含する。
【０１４６】 血清ＩｇＥ値の測定のため、動物を犠牲にする前に麻酔下で大静脈穿刺により
全血を採取する。サンプルを遠心し、細胞を分離し、血清を採取しトータルＩｇ
Ｅレベルを測定するのに用いる。直ちに測定を行わないサンプルは、−２０℃で
凍結する。
【０１４７】 ＩｇＥ血清サンプルは全てサンドイッチ抗体ＥＬＩＳＡ法で測定する。マイ
クロタイタープレートに、アジ化ナトリウムと２．５μｇ／ｍｌの濃度のラット
抗マウスＩｇＥ抗体（サザンバイオテクノロジー社）を含む炭酸ナトリウム／重
炭酸ナトリウムのコーティングバッファーを各ウェルあたり５０μｌづつ加えて
コートする。プレートをプラスティック製ラップで覆い、４℃で１６時間保温す
る。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０をリン酸バッファー生理食塩水に含むウオッシ
ュバッファーで、５分間づつ三回洗う。非特異的結合をブロックするため、５％
ウシ血清アルブミンを含むリン酸バッファー生理食塩水を各ウェルあたり２００
μｌづつ加え、プラスティック製ラップで覆い、３７℃で２時間保温する。ウォ
ッシュバッファーで三回洗った後、テストサンプルをデュープリケートで各ウェ
ルに５０μｌづつ加える。テストサンプルを、５％ウシ血清アルブミンを含むウ
ォッシュバッファーで１：１０、１：５０および１：１００に希釈してからアッ
セイする。テストサンプルに加え、５％ウシ血清アルブミンを含むウォッシュバ
ッファー中にＩｇＥスタンダードを０．８ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの濃
度で含むセット（ファーミンゲン社）を検量して標準曲線を生成する。スタンダ
ードおよびサンプル無しのブランクを用いてプレートリーダーのゼロ点（バック
グラウンド）を較正する。プレートにサンプルとスタンダードを加えた後、プラ
スティック製ラップで覆い、室温で２時間保温する。ウォッシュバッファーで三
回洗った後、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼを結合したラット抗マウスＩｇ
Ｅ二次抗体を５０μｌ、５％ウシ血清アルブミンを含むウォッシュバッファー中
、２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で加える。プレートをプラスティック製ラップで覆い
、２時間室温で保温する。ウォッシュバッファーで三回洗った後、基質ｏ−フェ
ニレンジアミンを０．５ｍｇ／ｍｌ含む０．１Ｍクエン酸バッファーを１００μ
ｌづつ全ウェルに加える。５〜１０分後に１２．５％硫酸５０μｌを加えて反応
を停止し、ＭＲ５０００型プレートリーダー（ダイナテック社）で４９０ｎｍの
吸光度を測定する。スタンダードＩｇＥの濃度溶液を用いて抗原濃度をＸ軸（対
数スケール）に、吸光度をＹ軸（リニアスケール）に取り、標準曲線を作成する
。サンプル中のＩｇＥ濃度を標準曲線に内挿して求める。
【０１４８】 気管支肺胞洗浄および細胞診を既報の通り行う（Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒら、１
９９０）。肺摘出後、組織学的分析を行う。検査前の機器装着によるアーティフ
ァクトの可能性を考慮し、別個の複数の動物を用いて分析を行う。このため、気
管反応性試験の他には、他の試験に使用しないことを除き、種々の前処置を受け
るコーホート群と完全に同一に並行して、少数の群の動物を処置する。気管反応
性試験の後、肺を切除し、液体窒素中に浸漬する。当業者に自明の手法により凍
結切片を作製し、組織学的検査を行う。
【０１４９】 マウスＩＣＡＣＣ−１の代謝経路を遮断するポリクローナル抗体を治療的に用
い、感作、未感作マウスにおいて、本代謝経路の機能をダウンレギュレートし、
気管支反応性に対する本代謝経路、血清ＩｇＥ、気管支肺胞洗浄の重要性を評価
する。抗体の前処置の後、ベースライン気管支反応性亢進、気管支肺胞洗浄およ
びＩｇマッチ対照に比較してのＩｇＥレベルを測定する。
【０１５０】 （実施例１０） マウス喘息モデルにおけるＩＣＡＣＣ−１の役割：感作動物の
気道反応性 実施例６ａのデータから、免疫沈降実験において本蛋白を認識することができ
る能力によって決定される天然の蛋白構造を認識するＩＣＡＣＣ−１に対して抗
血清が調製できることを証明している（図１６）。ＩＣＡＣＣ−１阻止抗体は、
ＩＣＡＣＣ−１の機能を抑制するのに潜在的に治療剤となりうる。実施例５Ａ、
５Ｂおよび１０に記載したプロトコルに従い、抗原感作動物を用いた研究が行わ
れている。実施例５Ｂに記載したように、動物の鼻腔にＩＣＡＣＣ−１阻止抗体
を投与し、２３日目にＢＨＲ、ＢＡＬおよびイムノグロブリンレベルに関して表
現型分類する。ＩＣＡＣＣ−１抗体による前処置の効果を調べ、喘息表現型にお
いてＩＣＡＣＣ−１をダウンレギュレートすることの効果を評価する。
【０１５１】 本発明は、種々の特定の材料、手順および実例を参照して、ここに記載され、
そして例証されてきたが、その目的のために選択された材料および手順の特定の
組み合わせに限定されないことが理解される。このような詳細の無数の変更が意
味されうることは、当業者に認識されるところである。
【０１５２】 引用文献 以下の参考文献が、本明細書にその全体が引用文献として援用され、それらす
べては本願で参照される参考文献、特許または特許出願である。 Alexander AG, Barnes NCおよびKay AB. コルチコステロイド依存性、重症、慢
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介クロライド分泌の正常化 J Clin Invest. 95, 1377−1382, 1995。 Kauvar LM. ペプチドミメティク医薬品、その進歩と展望についての考察 Natu
re Biotechnology 14, 709, 1996。 Kleeberger SR, Bassett DJ, Jakab GJおよびLevitt RC. オゾン誘起された炎 症に対する感受性を評価するための遺伝モデル Am. J. Physiol. 258, L313−3
20, 1990。 Kreitman RJ, Puri RK, Leland Pら 変異したシステイン残基を含むインターロ
イキン４に位置特異的共役をほどこすと、改善された結合および活性を有するイ
ンターロイキン４トキシンコンジュゲートを産生する Biochemistry 33, 11637
−11644, 1994。 Levitt RCおよびEwart SL. アトラクリウムで誘導された気管支収縮に対する遺
伝的感受性 Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 151, 1537−1542, 1995。 Levitt RC. 呼吸器病に対する感受性における生物学的変化の理解 Pharmacoge
netics 1, 94−97, 1991。 Levitt RCおよびMitzner W. ５−ヒドロキシトリプタミンに対する気道過反応 性の常染色体劣性遺伝 J. Appl. Physiol. 67, 1125−1132, 1989。 Levitt RC, Mitzner Wら マウスにおける常染色体劣性遺伝傾向としてのアセチ
ルコリンに対する気道過反応性の発現 FASEB J. 2, 2605−2608, 1988。 Louahed J, Kermouni A, Van Snick JおよびRenauld JC. マウスＴヘルパーク ローンでグランザイムおよび高親和性ＩｇＥレセプターの発現をＩＬ−９が誘導
する J. Immunol. 154, 5061−5070, 1995。 Marsh DG, Meyers DAおよびBias WB. アトピー性アレルギーの疫学および遺伝 学 New Eng. J. Med. 305, 1551−1559, 1982。 Molinoff PらGoodman and Gilman's The Pharmacologic Basis of Therapeutics
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SA 94, 13175-13180, 1997。 Nicolaides NC, Carter KC, Shell BK, Papadopoulos N, Vogelstein BおよびKi
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95。 Nicolaides NC, Gualdi R, Casadevall C, Manzella L, Calabretta Bら ヒト ｃ−ｍｙｂ遺伝子の５’フランキング領域内のＭｙｂ結合部位を介するｃ−ｍｙ
ｂ発現の正の自己調節 Mol. Cell. Biol. 11, 6166−6176, 1991。 Orita M, Suzuki Y, Sekiya TおよびHayashi K. ポリメラーゼ連鎖反応を用い る点突然変異とＤＮＡ多形の迅速、高感度検出 Genomics 5, 874−879, 1989。 Ott J. Analysis of human genetic linkage. John Hopkins University Pres
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Merz H, Feller A, Berns AおよびVan Snick J. インターロイキン９トランス ジェニックマウスの胸腺リンパ腫 Oncogene 9, 1327−1332, 1994。 Sarkar G, Yoon H-SおよびSommer SS. ディデオキシ指紋（ｄｄｆ）、変異の存
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９番染色体ｐ１３．３の連鎖地図化 Genomics 18, 212−215, 1993。 Sears MR, Burrows B, Flannery EM, Herbison GP, Hewitt CJおよびHoldaway M
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Ｅとの関係 New Engl. J. Med. 325(15), 1067−1071, 1991。 Sheffield VC, Beck JS, Kwitek AE, Sandstrom DWおよびStone EM. 単一塩基 置換の検出のための一本鎖コンホメーション多形分析の感度 Genomics 16, 325
−332, 1993。 Simoncsits A, Bristulf J, Tjornhammar MLら ヒトインターロイキン１βの欠
失変異体は、アゴニスト性を顕著に減少させる。ヒトインターロイキン１レセプ
ターへのリガンドでのアゴニスト／アンタゴニスト切り替えの探索 Cytokine 6
, 206−214, 1994。 Zavyalov VP, Navolotskaya EV, Isaev ISら 成熟ヒトＩＬ−２の配列２７−３
５に相当するノナペプチドは、胸腺細胞レセプターへの結合でｒＩＬ−２と効率
よく競合する Immunol. Lett. 31, 285−288, 1992。
【図面の簡単な説明】
【図１】 抑制ＰＣＲｃＤＮＡサブトラクション手法の模式図である。
【図２】 マウスＩＣＡＣＣ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）及びアミノ
酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】 マウスＩＣＡＣＣ−１タンパク質とカルシウムにより活性化されたウシクロラ
イドチャネルとの整列を示す図である。
【図４Ａ】 ヒトＩＣＡＣＣ−２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）及びアミノ酸
配列（配列番号４）を示す図である。
【図４Ｂ】 ヒトＩＣＡＣＣ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）及びアミノ酸
配列（配列番号４）を示す図である。
【図５】 マウスＩＣＡＣＣ−１タンパク質と、ヒトＩＣＡＣＣ−１及びＩＣＡＣＣ−２
タンパク質との整列を示す図である。
【図６】 ＩＬ−９遺伝子（Ｔｇ５）を過度発現しているトランスジェニックマウスと比
較した、正常なマウス（ＦＶＢ）の肺におけるＩＣＡＣＣ−１発現を示す図であ
る。
【図７】 ＤＢＡ及びＣ５７Ｂ６マウスの肺におけるＩＣＡＣＣ−１発現を示す図である
。
【図８】 ＩＬ−９の気管内投与有りと、無しの場合の、Ｃ５７Ｂ６マウスの肺における
ＩＣＡＣＣ−１発現を示す図である。
【図９】 正常（Ｂａｌｂ／Ｃ）及びＩＬ−９を過度発現している（Ｔｇ５）マウス由来
の組織における、ＩＣＡＣＣ−１発現を示す図である。
【図１０】 Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける、アスペルギルス属フマガタス抗原により誘導さ
れた、ＢＨＲ及び好酸球増加症を示す図である。
【図１１】 未処置及び抗原に曝されたマウスにおける、ＩＣＡＣＣ−１の組織分布を示す
図である。
【図１２】 アスペルギルス属フマガタスに曝されたマウスにおける、ＢＨＲ及び肺好酸球
増加症の抗−ＩＬ９による抑制を示す図である。
【図１３】 抗−ＩＬ９により処理された、抗原に曝された動物におけるＩＣＡＣＣ−１の
抑制を示す図である。
【図１４】 ヒト初代肺上皮細胞（ＮＨＢＥ）における、ＩＬ−９によるＩＣＡＣＣ−１誘
導を示す図である。
【図１５】 ヒト初代肺培養物における、ＩＬ−９によるＩＣＡＣＣ−１誘導を示す図であ
る。
【図１６】 ＩＣＡＣＣ−１ペプチドに対して生産される抗血清が、天然のＩＣＡＣＣ−１
を認識できることを示す図である。
【図１７】 初代肺培養物における上皮細胞から、ＩＬ−９がエオタキシン生産を誘導する
ことを示す図である。
【図１８】 クロライドチャネル遮断薬による、ＩＬ−９により誘導されたエオタキシンの
抑制を示す図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１０月１日（１９９９．１０．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３７】 これに加えて、ヒト肺の生検サンプルから確立されたヒト肺初代培養において
ＩＬ−９により誘導されたＩＣＡＣＣ−１の発現を調べた。まず、肺組織を鋏で
ミンチ状に切り刻み金網を通した。組織を１７５ｉＵ／ｍｌのコラゲナーゼ（シ
グマ社）により３７℃で１時間消化した。組織を４５μｍおよび１５μｍのフィ
ルターに通した後、Ｄｕｂｅｌｃｏ Ｉｓｃｏｖｅ培地に再懸濁し、１０ｃｍ組
織培養用プレートにプレーティングした。プレートを３７℃で１時間保温して、
マクロファージをプレート面に接着させ、次いで非接着性細胞を収穫し、抗生物
質を加えた１０％ＦＢＳ添加Ｄｕｂｅｌｃｏ Ｉｓｃｏｖｅ培地に２ｘ１０5細 胞／ｍｌで再懸濁し、５％ＣＯ2中、３７℃で４〜５日間培養した。ＩＬ−９に よるＩＣＡＣＣ−１誘導の実験のため、細胞を２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−
９存在下、または非存在下で４〜５日間培養した。その後、細胞を収穫し、上記
のようにＴｒｉｚｏｌ試薬によりトータルＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを逆転写し
、ＩＣＡＣＣ−１について５’プライマー ５’−ＣＣＣＡＡＡＧＧＡＡＧＣＣ
ＡＡＣＴＣＴＧＡ−３’（配列番号１１）および３’プライマー ５’−ＧＴＧ
ＡＡＴＧＣＣＡＧＧＡＡＴＧＧＴＧＣＴ−３’（配列番号１２）を用いてＰＣＲ
を行った結果、２５３ｂｐの産物を得た。内部対照としては遍在的に発現するハ
ウスキーピング型遺伝子であるＰＭＳ２を用いた（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら、Ge
nomics 29:329−334, １９９５）。産物を２％アガロースゲル上で電気泳動し、
エチジウム・ブロミド染色で可視化した。図１５に示すように、ＩＬ−９はヒト
初代肺培養中でＩＣＡＣＣ−１を誘導した。また一方、ＩＬ−９非存在下での培
養物は、検出できる量のＩＣＡＣＣ−１を有しなかった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３８】 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第９章（
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載された方法を用いて、
ｍＩＣＡＣＣ−１配列のうちから選んだペプチドでウサギを免疫することによっ
てｍＩＣＡＣＣ−１に対する抗血清を調製した。免疫に用いたペプチドは、第３
０９−３３０残基、ＣＬＶＬＤＫＳＧＳＭＬＮＤＤＲＬＮＲＭＮＱＡ（配列番号
１３）、第３５７−３７５残基、ＱＳＥＬＫＱＬＮＳＧＡＤＲＤＬＬＩＫＨＣ（
配列番号１４）、第３９８−４２２残基，ＫＫＫＹＰＴＤＧＳＥＩＶＬＬＴＤＧ
ＥＤＮＴＩＳＳＣ（配列番号１５）、第５２４−５４６残基、ＴＴＨＰＰＴＩＦ
ＩＷＤＰＳＧＶＥＱＮＧＦＩＬＤＣ（配列番号１６）、第５９０−６１０残基、
ＣＰＰＩＴＶＴＰＶＶＮＫＮＴＧＫＦＰＳＰＶＴ（配列番号１７）であった。前
記ペプチドは自動化ペプチド合成の標準的手法により、八価の多価抗原ペプチド
（ＭＡＰ）または単鎖ペプチドとして合成した。単鎖ペプチドは免疫用にＫＬＨ
と結合し、ＭＡＰ抗原は共役せずに使用した。５個のペプチド全部の混合物をＫ
ＬＨコンジュゲート、またはＭＡＰのいずれかでウサギに免疫した。ｍＩＣＡＣ
Ｃ−１を免疫沈降する能力で示されるように、どちらの免疫原も有効な抗血清を
生成した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 抑制ＰＣＲｃＤＮＡサブトラクション手法の模式図である。
【図２】 マウスＩＣＡＣＣ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）及びアミノ
酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】 マウスＩＣＡＣＣ−１タンパク質とカルシウムにより活性化されたウシクロラ
イドチャネル（配列番号１８）との整列を示す図である。
【図４Ａ】 ヒトＩＣＡＣＣ−２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）及びアミノ酸
配列（配列番号４）を示す図である。
【図４Ｂ】 ヒトＩＣＡＣＣ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）及びアミノ酸
配列（配列番号４）を示す図である。
【図５】 マウスＩＣＡＣＣ−１タンパク質と、ヒトＩＣＡＣＣ−１及びＩＣＡＣＣ−２
タンパク質との整列を示す図である。
【図６】 ＩＬ−９遺伝子（Ｔｇ５）を過度発現しているトランスジェニックマウスと比
較した、正常なマウス（ＦＶＢ）の肺におけるＩＣＡＣＣ−１発現を示す図であ
る。
【図７】 ＤＢＡ及びＣ５７Ｂ６マウスの肺におけるＩＣＡＣＣ−１発現を示す図である
。
【図８】 ＩＬ−９の気管内投与有りと、無しの場合の、Ｃ５７Ｂ６マウスの肺における
ＩＣＡＣＣ−１発現を示す図である。
【図９】 正常（Ｂａｌｂ／Ｃ）及びＩＬ−９を過度発現している（Ｔｇ５）マウス由来
の組織における、ＩＣＡＣＣ−１発現を示す図である。
【図１０】 Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける、アスペルギルス属フマガタス抗原により誘導さ
れた、ＢＨＲ及び好酸球増加症を示す図である。
【図１１】 未処置及び抗原に曝されたマウスにおける、ＩＣＡＣＣ−１の組織分布を示す
図である。
【図１２】 アスペルギルス属フマガタスに曝されたマウスにおける、ＢＨＲ及び肺好酸球
増加症の抗−ＩＬ９による抑制を示す図である。
【図１３】 抗−ＩＬ９により処理された、抗原に曝された動物におけるＩＣＡＣＣ−１の
抑制を示す図である。
【図１４】 ヒト初代肺上皮細胞（ＮＨＢＥ）における、ＩＬ−９によるＩＣＡＣＣ−１誘
導を示す図である。
【図１５】 ヒト初代肺培養物における、ＩＬ−９によるＩＣＡＣＣ−１誘導を示す図であ
る。
【図１６】 ＩＣＡＣＣ−１ペプチドに対して生産される抗血清が、天然のＩＣＡＣＣ−１
を認識できることを示す図である。
【図１７】 初代肺培養物における上皮細胞から、ＩＬ−９がエオタキシン生産を誘導する
ことを示す図である。
【図１８】 クロライドチャネル遮断薬による、ＩＬ−９により誘導されたエオタキシンの
抑制を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 11/00 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 1/00 11/06 11/00 37/08 11/06 43/00 １１１ 37/08 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 レヴィト， ロイ， シー． アメリカ合衆国， ペンシルヴェニア州， アムブラー， マルステングリーン コ ート 660 (72)発明者 マロイ， ダブリュー．， リー アメリカ合衆国， ペンシルヴェニア州， ランスデール， クレアモント ドライ ヴ 106 (72)発明者 ローアヘッド， ジャミラ アメリカ合衆国， ペンシルヴェニア州， イースト ノリスタウン， ハンナ ア ヴェニュー 2920 シー224 (72)発明者 マクレーン， マイク アメリカ合衆国， ペンシルヴェニア州， ランスデール， グリーン スプリング サークル 103 (72)発明者 ニコライディス， ニコラス， シー． アメリカ合衆国， ペンシルヴェニア州， メディア， ブラックル レーン 212 (72)発明者 ツォー， ユホン アメリカ合衆国， ペンシルヴェニア州， ドレッシャー， セント ジョージ ス トリート 1801 (72)発明者 ドン， キュー アメリカ合衆国， ペンシルヴェニア州， ランスデール， イースト メイン ス トリート 757 ダブリュー205 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 EA04 GA11 HA12 HA15 4B064 AG26 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4C057 MM04 4C084 AA02 AA17 BA44 DA12 NA14 ZA592 ZA612 ZA662 ZB072 ZB112 ZB132 ZC542 4C085 AA13 AA14 BB11 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA59 ZA61 ZA66 ZB07 ZB11 ZB13 ZC54

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトＩＣＡＣＣ−１（配列番号６）をコードするヌクレオチ
    ド配列を有する核酸分子と、配列番号１を有する核酸分子にハイブリダイズする
    核酸分子と、機能的に有効なそれらの断片を含む核酸分子とからなる群から選択
    される、精製及び単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 マウスＩＣＡＣＣ−１（配列番号２）、又は機能的に有効な
    その断片をコードするヌクレオチド配列を有する、精製及び単離されたＤＮＡ分
    子。
  3. 【請求項３】 ヒトＩＣＡＣＣ−１（配列番号４）、又は機能的に有効なそ
    の断片をコードするヌクレオチド配列を有する、精製及び単離されたＤＮＡ分子
    。
  4. 【請求項４】 前記ＤＮＡ分子がゲノムである、請求項１、２又は３に記載
    の精製及び単離されたＤＮＡ分子。
  5. 【請求項５】 ヒトＩＣＡＣＣ−１、又は機能的に有効なその断片をコード
    するヌクレオチド配列を有する、化学的に合成されたＤＮＡ分子。
  6. 【請求項６】 マウスＩＣＡＣＣ−１、又は機能的に有効なその断片をコー
    ドするヌクレオチド配列を有する、化学的に合成されたＤＮＡ分子。
  7. 【請求項７】 ヒトＩＣＡＣＣ−２、又は機能的に有効なその断片をコード
    するヌクレオチド配列を有する、化学的に合成されたＤＮＡ分子。
  8. 【請求項８】 ヒトＩＣＡＣＣ−１、又は機能的に有効なその断片をコード
    するヌクレオチド配列を有する、精製及び単離されたＲＮＡ分子。
  9. 【請求項９】 マウスＩＣＡＣＣ−１、又は機能的に有効なその断片をコー
    ドするヌクレオチド配列を有する、精製及び単離されたＲＮＡ分子。
  10. 【請求項１０】 ヒトＩＣＡＣＣ−２、又は機能的に有効なその断片をコー
    ドするヌクレオチド配列を有する、精製及び単離されたＲＮＡ分子。
  11. 【請求項１１】 ヒトＩＣＡＣＣ−１（配列番号６）、又は機能的に有効な
    その断片を含むアミノ酸配列を有する、精製及び単離されたタンパク質分子。
  12. 【請求項１２】 マウスＩＣＡＣＣ−１（配列番号２）、又は機能的に有効
    なその断片を含むアミノ酸配列を有する、精製及び単離されたタンパク質分子。
  13. 【請求項１３】 ヒトＩＣＡＣＣ−２（配列番号４）、又は機能的に有効な
    その断片を含むアミノ酸配列を有する、精製及び単離されたタンパク質分子。
  14. 【請求項１４】 喘息治療を必要とする患者に、ヒトＩＣＡＣＣ−１の機能
    をダウンレギュレートするための化合物の有効量を投与することによって、喘息
    を緩和する方法。
  15. 【請求項１５】 前記化合物がクロライドチャネル阻害剤である、請求項１
    ４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記化合物がアミノステロールである、請求項１４に記載
    の方法。
  17. 【請求項１７】 喘息治療を必要とする患者に、ＩＣＡＣＣの機能を遮断し
    ＩＣＡＣＣ−１の活性をダウンレギュレートする抗体の有効量を投与することに
    よって、喘息を緩和する方法。
  18. 【請求項１８】 前記抗体が、ＩＣＡＣＣ−１の機能的ドメインを含有する
    ペプチドから生産される、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記抗体が、配列番号１１〜１５の群から得られたペプチ
    ドから生産される、請求項１７に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載
    の方法。
  21. 【請求項２１】 （ａ）ヒト被験者からの生物学的サンプル中の、ＩＣＡＣ
    Ｃ−１ポリペプチドのレベルを測定すること；及び （ｂ）正常な被験者に存在するＩＣＡＣＣ−１ポリペプチドのレベルと比較す
    ること、ここで正常レベルと比較したとき、ＩＣＡＣＣ−１ポリペプチドのレベ
    ルの増加は、喘息体質を示唆する、 以上のステップを含む、前記ヒト被験者におけるＩＣＡＣＣ−１ポリペプチド
    のレベル上昇と関連する、喘息への罹り易さを検出又は診断する方法。
  22. 【請求項２２】 治療処置を受けている前記被験者から、種々の時間点で得
    られた、一連の生物学的サンプルにおける、ＩＣＡＣＣ−１ポリペプチドのレベ
    ルを測定することを含み、前記ＩＣＡＣＣ−１ポリペプチドレベルのかなりの減
    少は、治療処置の成功を示唆する、ヒト被験者のＩＣＡＣＣ−１ポリペプチドレ
    ベルの上昇と関連する喘息の治療処置をモニターする方法。
  23. 【請求項２３】 （ａ）配列番号６又は配列番号４を含有するＩＣＡＣＣポ
    リペプチド、或いは少なくとも１０個のアミノ酸を含むその断片をキャリアータ
    ンパク質にコンジュゲートすること； （ｂ）宿主動物を、アジュバントと混合された、前記ＩＣＡＣＣポリペプチド
    断片−キャリアータンパク質のコンジュゲートで免疫化すること；及び （ｃ）免疫化された宿主細胞から抗体を得ること、 以上のステップを含む、請求項１１又は請求項１２に記載のタンパク質分子、
    又はその断片を含む、ＩＣＡＣＣポリペプチドに特異的な抗体を調製する方法。
  24. 【請求項２４】 前記タンパク質断片が、配列番号１１〜１５の群から得ら
    れる、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 （ａ）ＩＣＡＣＣポリペプチドを含んでいると推測される
    サンプルを、抗体及びＩＣＡＣＣポリペプチドを含有する反応複合体の形成を許
    容する条件下で、ＩＣＡＣＣポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させる
    こと；及び （ｂ）前記サンプル中で、抗体及びＩＣＡＣＣポリペプチドを含有する反応複
    合体の形成を検出すること、 以上のステップを含み、前記反応複合体の定量は、前記サンプル中のＩＣＡＣＣ
    ポリペプチドのレベルを指す、請求項１１又は請求項１２に記載のＩＣＡＣＣポ
    リペプチドを定量化する方法。
  26. 【請求項２６】 （ａ）気道反応性亢進に罹り易い、ヒト以外の動物を得る
    こと； （ｂ）気道反応性亢進を誘導する薬剤を投与すること； （ｃ）結果として起こる気道反応性亢進の特性を、ＩＣＡＣＣ−１の可能なア
    ンタゴニスト剤で前処置することによって得られた気道反応性亢進の特性と比較
    すること；及び （ｄ）前処置が前記特性を減少させた薬剤を選択すること、 以上のステップを含む、ＩＣＡＣＣ−１のアンタゴニストを同定する方法。
  27. 【請求項２７】 前記動物が、ヒトＩＣＡＣＣ−１を発現する、請求項２６
    に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 （ａ）ＩＬ−９に反応する細胞系を得ること； （ｂ）前記細胞系をＩＬ−９の存在下で増殖させること； （ｃ）ＩＬ−９による誘導特性を、ＩＣＡＣＣ−１の可能なアンタゴニストで
    前処置することにより得られた特性と比較すること；及び （ｄ）前処置が前記特性を減少させた薬剤を選択すること、 以上のステップを含む、ＩＣＡＣＣ−１のアンタゴニストを同定する方法。
  29. 【請求項２９】 前記細胞系が、ヒトＩＬ−９受容体でトランスフェクトさ
    れたマウス肺上皮細胞、又はヒトＮＨＢＥ細胞である、請求項２７に記載の方法
    。
  30. 【請求項３０】 ヒトＩＣＡＣＣ−１、又はその活性断片のアンチセンス配
    列を含有するアンチセンスＤＮＡ。
  31. 【請求項３１】 前記化合物が請求項３０に記載のアンチセンスＤＮＡであ
    る、請求項１４に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 嚢胞性繊維症治療を必要とする患者に、ヒトＩＣＡＣＣの
    機能をアップレギュレートするための化合物の有効量を投与することによって、
    嚢胞性繊維症を治療する方法。
  33. 【請求項３３】 炎症性腸疾患治療を必要とする患者に、ヒトＩＣＡＣＣ−
    １の機能をアップレギュレートするための化合物の有効量を投与することによっ
    て、炎症性腸疾患を治療する方法。
  34. 【請求項３４】 前記化合物がＩＬ−９である、請求項３２又は請求項３３
    に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 （ａ）ヒト被験者からの生物学的サンプル中の、ＩＣＡＣ
    Ｃ−１ポリペプチドのレベルを測定すること；及び （ｂ）正常な被験者に存在するＩＣＡＣＣ−１ポリペプチドのレベルと比較す
    ること、ここで正常レベルと比較したＩＣＡＣＣ−１ポリペプチドのレベルの減
    少は、炎症性腸疾患体質を示唆する、 以上のステップを含む、前記ヒト被験者におけるＩＣＡＣＣ−１ポリペプチド
    のレベル減少と関連する、炎症性腸疾患への罹り易さを検出又は診断する方法。
  36. 【請求項３６】 治療処置を受けている被験者から、種々の時間点で得られ
    た、一連の生物学的サンプルにおける、ＩＣＡＣＣ−１ポリペプチドのレベルを
    測定することを含み、前記ＩＣＡＣＣ−１ポリペプチドレベルのかなりの増加は
    、治療処置の成功を示唆する、ヒト被験者のＩＣＡＣＣ−１ポリペプチドレベル
    の減少と関連している炎症性腸疾患の治療処置をモニターする方法。
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