KR100776010B1 - Ｔ-형 α1Ｈ 칼슘 채널의 고효율 억제제 검색 및 광범위 특성연구용 ＨＥＫ293 세포주 - Google Patents

Ｔ-형 α1Ｈ 칼슘 채널의 고효율 억제제 검색 및 광범위 특성연구용 ＨＥＫ293 세포주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포타슘(potassium) 채널이 도입된 세포주에 관한 것으로서, 구체적으로는 탈분극에 의하여 T-형 α1H 칼슘 채널이 활성화 될 수 있는 포타슘 채널이 도입된 세포주에 관한 것이다. 본 발명의 세포주는 T-형 α1H 칼슘 채널의 억제제 후보군의 고효율 검색에 유용하게 이용될 수 있으므로 T-형 α1H 칼슘 채널의 발현 이상으로 발생하는 여러 질환의 치료제 개발을 가속화 시킬 수 있다.
T-형 α1H 칼슘 채널, 포타슘 채널, 세포기반 고효율 검색

Description

Ｔ-형 α1Ｈ 칼슘 채널의 고효율 억제제 검색 및 광범위 특성연구용 ＨＥＫ293 세포주{ A HEK 293 cell line for HTS of blockers and broad-spectrum studies of T-type calcium channel α1H}
도 1은 인간 포타슘 채널 Kir2.1의 염기서열을 나타낸 것이고,
도 2는 인간 포타슘 채널 Kir2.1의 아미노산 서열을 나타낸 것이고,
도 3은 인간 포타슘 채널 Kir2.1이 서브클로닝된 hKir2.1-pcDNA3.1(+) 벡터의 개열지도이고,
도 4는 본 발명의 HEK293-TChH-IRK2.1 세포주의 전기생리학적 적합성 테스트 결과를 나타낸 것으로서,
도 4의 A는 본 발명의 HEK293-TChH-IRK2.1 세포주에서 램프 자극에 의해 활성화된 T-형 전류 및 내향성 정류 IRK 포타슘 전류를 기록한 것; 도 4의 B는 테스트 자극에 의해 기록된 바륨에 민감한 IRK 전류를 나타낸 것; 도 4의 C는 같은 세포에서 안정 막전압 형성을 확인한 결과; 도 4의 D는 안정 막전압이 기록된 세포에 Kir2.1 억제제인 바륨을 가하여 탈분극시켰을 때 나타나는 칼슘 활동 전압을 기록한 것이고,
도 5는 본 발명의 HEK293-TChH-IRK2.1 세포주에서 칼슘 신호를 형광측정한 결과를 나타낸 것으로서, 세포에 형광 염료 fura-2/AM을 부하(loading)한 후 고농도의 염화칼륨을 가하여 탈분극시켰을 때 세포 내로 유입되는 칼슘에 의한 F340/F380 비의 변화를 포톤 멀티플라이어 튜브(PMT)로 증폭한 후 측정한 것이고,
도 6은 본 발명의 HEK293-TChH-IRK2.1 세포주에서 세포 외액의 칼슘 농도에 비례하여 F340/F380 비가 변화함, 즉, 칼슘 신호가 증가함을 나타낸 것이고,
도 7은 형광 칼슘 이미징 방법을 이용하여 본 발명의 HEK293-TChH- IRK2.1 세포주를 테스트 한 결과를 나타낸 것으로서, 세포에 Fluo-3를 부하하여 냉각 CCD 카메라로 캡처된 여러 세포들에서의 칼슘 신호의 변화를 디지털 형광 이미지로 전환한 것이고(비특이적 T-형 채널 억제제인 미베프라딜(mibefradil)은 고농도의 염화 칼륨에 의해 나타나는 형광 칼슘이미지를 완전히 차단하였음),
도 8은 본 발명의 세포주를 이용한 고효율 약물검색 프로토콜을 나타낸 것이다.
본 발명은 포타슘 채널(potassium channel)이 도입된 세포주에 관한 것으로서, 구체적으로는 탈분극에 의하여 T-형 α1H 칼슘 채널(calcium channel)이 활성화될 수 있는 포타슘 채널이 도입된 세포주에 관한 것이다.
T-형 채널은 낮은 전압에서 활성화되는 전압 의존적 칼슘 채널(voltage- dependent Ca2+ channel)의 한 종류로 현재까지 T-형 채널을 코딩하는 유전자는 세 가지 종류의 아형(α1G, α1H 및 α1I)이 알려져 있다(Perez-Reyes 등, Nature, 391:896-900, 1998; Cribbs 등 Cir. Res., 83:103-109, 1998; Lee 등, J. Neurosci., 19:1912-1921, 1999). 이들 T-형 채널 아형들은 Xenopus oocyte나 HEK293 세포와 같은 이종 발현계(heterologous expression system)에 발현되었을 때 (a) -60mV 근처의 낮은 전압에서 활성화, (b) 채널의 빠른 활성 및 비활성, (c) 현저히 느린 탈활성(deactivation) 및 (d) 작은 콘덕턴스 등의 생물리학적 특성들을 나타낸다.
T-형 α1H 채널의 생리적 기능을 살펴보면 중추 신경계에 존재하는 신경의 흥분성(excitability)을 조절하는 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다(Huguenard 등, Annu. Rev. Physiol., 58:329-334, 1996). 뿐만 아니라 T-형 α1H 채널은 심장 박동(Hagiwara 등, J. Physiol., 395:233-253), 호르몬 분비(Cohen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2412-2416, 1988; Enyeart 등, Mol. Endocrinol., 7:1031-1040, 1993), 평활근의 수축(Akaike 등 J. Physiol., 416:141-160, 1989), 생식(Arnoult 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13004-13009, 1996) 또는 세포의 성장 및 분화(Berridge, Neuron, 21:13-26, 1998; Guo 등, J. Mol. Cell Cardiol., 30:1095-1103, 1998; Kono 등, J. Cell Biol., 132:915-923, 1996) 등 여러 다양한 기능들을 조절하는 것으로 알려져 있다.
이러한 T-형 α1H 채널이 유전적으로 또는 다른 원인에 의해 조직에서 과도하게 발현될 경우에 소아 간질(absence epilepsy)(Huguenard 등, J. Neurosci., 14:5485-5502, 1994; Tsakiridou 등. J. Neurosci., 15:3110-3117, 1995; Kim 등, Neuron, 31:35-45, 2001), 심장병(예, 심실비대 및 고혈압)(Nuss 등 Cir. Res., 73:777-782, 1993; Martinez 등, J. Mol. Cell Cardiol., 31:1617-1625, 1999), 신경병성 통증 (Dogrul 등, Pain, 105:159-168, 2003) 또는 전립선암 (Mariot 등 J. Biol. Chem., 277:10824-10833) 등 여러 질환이 유발될 수 있다.
따라서, 현재 T-형 α1H 채널은 세계적으로 신약 개발의 주요한 표적(target)이 되고 있으며, 생리 및 병태생리학적 상황에서 T-형 α1H 채널의 여러 가지 특성들(생물리적 및 약리적 특성, 유전자 발현 및 세포막 운반 조절, 신호 전달 등)이 어떻게 조절되는지에 관한 메커니즘의 연구는 새로운 신약 개발의 표적을 발굴할 수 있기 때문에 매우 중요하다.
T-형 α1H 채널을 억제할 수 있는 신약의 개발을 위해서는 기본적으로 유기 화학자들에 의한 선도 화합물(leading chemical)의 탐색과 또 관련 물질들의 디자인 및 합성과정이 중요하다. 또한, 신약 개발을 성공적으로 실현하기 위해서는 합성한 물질들이 T-형 α1H 채널을 억제하는지를 빠르고 효과적으로 테스트할 수 있는 고효율 검색(HTS) 시스템의 구축이 선행되어야 한다.
이들 물질들이 T-형 α1H 채널의 억제제인지 여부는 기존의 전기생리학적(즉, patch-clamp) 방법으로 칼슘 전류를 측정함으로써 쉽게 알 수 있다. 그러나, 이 방법은 이온 채널에 관한 정보를 가장 정확히 제공한다는 장점을 가지고 있지만, 단위 시간에 처리할 수 있는 데이터 포인트(data point, 테스트할 수 있는 화합물의 수)가 제한되기 때문에 많은 물질들을 빠른 시간 내에 검색하는 데에는 부적합한 면이 있다.
최근 고효율로 T-형 α1H 채널의 활성을 전기적으로 측정을 할 수 있는 패치-클램프 (patch-clamp) HTS 시스템이 Axon Instrument(미국)에서 개발되어 T-형 α1H 채널에 관련된 신약을 개발하는 연구자들은 이를 활용하는 것이 상기 문제점을 극복할 수 있는 하나의 선택이 될 수 있다. 그러나, 패치-클램프 기술 자체의 정교하고 복잡한 시퀀스를 기계가 만족스럽게 처리할 수 있는지에 대한 검증의 문제는 여전히 남아 있다.
전기생리학적 HTS의 대안으로서, 형광을 측정하여 T-형 α1H 채널 억제제를 검색하는 방안이 있다. 이는 칼슘에 결합하는 fura와 같은 형광 물질을 이용하여 칼슘 채널의 활성도를 칼슘 전류의 크기대신 T-형 α1H 채널을 통해 세포 내로 유입되는 칼슘에 비례하여 증가하는 형광의 광도를 측정하여 간접적으로 평가하는 것이다. 그러나 이 방법은 T-형 α1H 채널의 개폐를 패치-클램프에 의한 막전압 고정 방법과 같이 인위적으로 조절할 수 없다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자 들은 전술한 기존의 고효율 검색 방법의 문제점을 인식하고, T-형 α1H 채널이 안정적으로 발현되는 HEK293 세포에 포타슘 채널을 도입하여 높은 안정 막전압을 부여함으로써 전기적 자극이 없이도 세포외부에 고농도의 염화칼륨(KCl)을 가하였을 때 T-형 α1H 채널이 활성화되는 세포주 및 이에 기반한 고 효율 검색 방법을 개발하였다. 테스트 결과 세포외부에 고농도의 KCl을 가하였을 때 세포가 탈분극되어 T-형 α1H 채널이 활성화되었고, 이에 따라 세포내로 유입되는 칼슘이온의 변화를 높은 신호 대 잡음(signal-to-noise) 형광 비로 측정할 수 있었다. 따라서 본 발명의 세포주가 T-형 α1H 칼슘 채널 억제제의 고효율 검색 및 광범위 특성연구를 위한 최적의 세포주임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 T-형 α1H 칼슘 채널을 발현하는 HEK293 세포에 높은 안정 막전압을 부여함으로써 고농도 KCl에 의해 T-형 α1H 칼슘 채널이 활성화되어 칼슘 신호를 낼 수 있는 새로운 형질의 세포주 및 이에 기반한 T-형 α1H 칼슘 채널 억제제의 고효율 검색 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 T-형 α1H 칼슘 채널을 발현하는 세포에 포타슘 채널을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 형질 도입된 세포주를 제공한다.
또한, 상기 세포주를 이용하여 T-형 α1H 칼슘 채널의 억제제를 검색하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 T-형 α1H 칼슘 채널을 발현하는 세포에 포타슘 채널을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 형질도입된 세포주를 제공한다.
칼슘 형광 신호를 측정하는 HTS 시스템을 구축함에 있어, 기술적 한계는 T-형 α1H 칼슘 채널이 안정적으로 발현되는 HEK293 세포가 가지는 안정 막전압이 매우 낮아 대부분의 T-형 α1H 채널의 기능이 완전히 비활성화 되어있기 때문에 (Perez-Reyes 등, Nature, 391:896-900, 1998; Cribbs 등 Cir. Res., 83:103-109, 1998; Lee 등, J. Neurosci., 19:1912-1921, 1999) 고농도의 KCl로 세포막을 탈분극시켜도 원하는 칼슘 신호를 얻기가 어렵다는 것이다.
지금까지 T-형 α1H 채널의 특성 연구는 HEK293 세포와 같은 이종 발현계에 일시적(transiently) 또는 안정적(stably)으로 발현시켜 이루어졌다. 그러나 높은 안정 막전압을 가지는 흥분성 조직에서의 T-형 α1H 채널의 특성(예, 생물리적 및 약리적 특성, 유전자 발현 및 세포막 운반 조절, 인산화 정도, 신호 전달 등)이 HEK293 세포에서의 그것과 많이 다를 수 있다는 점에서 기존의 HEK293 세포의 사용은 큰 한계를 가지게 된다. 따라서 본 발명의 목적은 기존의 안정적으로 T-형 α1H 채널을 발현하는 HEK293 세포에 높은 안정 막전압을 부여함으로써 고농도 염화 칼륨(KCl)에 의해 T-형 α1H 채널이 활성화되어 칼슘 신호를 낼 수 있는 새로운 형질의 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명에서는 안정 막전압의 형성에 중요한 역할을 하는 인간 포타슘 채널 Kir2.1을 코딩하는 서열번호 1의 유전자(hKir2.1-Genebank accession No.: AF153820)를 클로닝하고, 인간 T-형 칼슘 채널 α1H(hCav3.2-Genebank accession No.: AF051946)를 안정적으로 발현하고 있는 HEK293 세포(Dr. Edward Perez-Reyes, Deptmenet of Pharmacology, Unversity of Virginia)에 트랜스펙션하여 형질 전환된 세포군(colony)을 항생제를 이용하여 선별하였다. 선별된 세포주 후보군 클론들을 대상으로 패치-클램프 및 세포 내 칼슘 측정방법을 시행하여 최적으로 형질 전환된 세포주를 확인하고, 상기 과정을 거쳐 높은 안정 막전압을 가지며 고농도 염화 칼륨 또는 바륨에 의해 T-형 α1H 채널이 활성화되어 높은 칼슘 신호를 낼 수 있는 새로운 형질의 세포주를 최종 확립하여 HEK293-TChH-IRK2.1로 명명하였다. 본 발명의 HEK293-TChH-IRK2.1 세포주는 2005년 2월 22일에 한국 생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에 기탁되었으며 수탁번호는 KCTC 10780BP이다.
본 발명의 세포주를 사용하여 실제로 비전기생리학적인 형광 칼슘 측정방법으로 (1) 높은 칼슘 신호(calcium signal)를 얻을 수 있는지, (2) T-형 α1H 채널 선택적 억제제에 의해 칼슘 신호가 차단되는지를 확인하였다.
패치-클램프 방법을 사용할 경우에는 전기 자극을 가하여 인위적으로 T-형 α1H 채널을 활성화시켰지만, 비전기생리학적 형광 측정방법을 사용할 경우에는 세포가 충분한 안정 막전압을 가지고 있기 때문에 세포 외부에 바륨을 가하거나 염화 칼륨을 가하여 탈분극시키는 것이 필요하다.
Fura-2/AM을 부하한 클론(T-형 α1H 채널과 hKir2.1이 안정적으로 발현된 세 포)의 단일 세포에 60mM 염화 칼륨을 가하여 탈분극시키면 F340/F380이 1.1에서 1.55로 증가하였고, 이러한 T-형 α1H 채널을 통해 유입된 세포 내 칼슘의 증가는 비특이적 T-형 채널 억제제인 미베프라딜(mibefradil)의 전 처리(pre-treatment)에 의해 완전히 차단되었다(도 5 참조). 또한, 세포에서 탈분극에 의한 F340/F380의 비율 변화는 세포 외액 내 칼슘의 농도가 2mM과 10mM일 때 각각 0.18±0.06(실험 수=6)와 0.59±0.07(실험 수=6)로, 세포 외액 내 칼슘의 농도에 비례하여 증가하였다.
단일 세포가 아닌 여러 세포들로부터 칼슘 신호의 형광 이미지를 한꺼번에 측정할 수 있는 냉각 CCD 이미지 시스템은 실제로 약물의 HTS에 사용되는 형광이미지 플레이트 리더(fluorescence Imaging plate reader, FLIPLR)와 비슷한 실험환경과 원리를 제공한다. 따라서 본 이미지 시스템을 사용하여 실제로 본 발명의 세포주가 T-형 α1H 채널 억제제를 고효율로 검색하는 데 적합한지를 최종 검증하였다. 형광 칼슘이미지를 측정하기 위하여 세포 내에 fluo-3를 부하하였다. 그 결과, 염화 칼륨을 가하지 않은, 즉 탈분극 되지 않은 안정 상태에서도 세포 내 칼슘 레벨이 약간 높아져 있는데(일부 세포가 적색을 띄고 있음), 비특이적 T-형 채널 억제제인 미베프라딜에 의해 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다(적색을 띈 세포 수가 현저히 줄어들었음).
또한, 세포에 60mM 염화 칼륨을 가하여 탈분극시켰을 때 매우 빠르게 형광 이미지의 밝기가 증가함을 볼 수 있었다(도 6 참조). 이러한 세포 내 칼슘 신호의 증가는 비특이적 T-형 채널 억제제인 미베프라딜 또는 100mM 니켈(Ni2+)의 전 처리 에 의해 완전히 억제되었다(도 7 참조).
상기 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 세포주는 세포 외부에 고농도의 염화 칼륨을 가하였을 때 탈분극되어 T-형 α1H 채널이 활성화되었고, 이에 따라 세포내로 유입되는 칼슘 이온의 변화를 높은 신호 대 잡음(signal-to-noise) 형광 비로 측정할 수 있으므로 T-형 α1H 칼슘 채널의 억제제 검색 및 광범위 특성 연구를 위한 최적의 세포주임을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 이용하여 T-형 α1H 칼슘 채널의 억제제를 검색하는 방법을 제공한다.
T-형 α1H 칼슘 채널이 유전적으로 또는 다른 원인으로 인하여 조직에서 과도하게 발현되는 경우에 소아 간질, 심장병(예, 심실비대 및 고혈압), 신경병성 통증 또는 전립선암 등 여러 질환이 유발될 수 있다. 따라서 T-형 α1H 칼슘 채널은 세계적으로 신약 개발의 주요한 표적(target)이 되고 있으며, 이를 억제할 수 있는 물질은 관련 질환의 새로운 신약 (후보) 물질이 될 수 있다.
상기 검색방법은 바람직하게는,
i) 제1항의 세포에 형광 염료를 부하하는 단계;
ii) 단계 i)의 세포에 검색 약물을 가하는 단계;
iii) 단계 ii)의 세포를 탈분극 시키는 단계 및;
iv) 단계 iii)의 세포의 형광 빛의 세기를 기록하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 과정을 거쳐 iv)의 단계에서 세포의 형광 변화가 없거나 빛의 세기가 약한 세포를 선별하여 단계 ii)에서 처리된 약물을 T-형 α1H 칼슘 채널의 억제제 또는 그 후보 물질로 판정할 수 있다.
상기 방법의 iii)의 단계는 세포에 염화 칼륨 또는 바륨을 처리하는 것으로 할 수 있고, 처리하는 염화 칼륨의 농도는 10mM 내지 100mM인 것이 바람직하며, 50 mM 내지 60mM인 것이 보다 바람직하다.
도 8에서는 본 발명의 세포주를 이용한 고효율 검색 방법의 프로토콜을 보여주고 있으나, 이는 하나의 실시예에 불과할 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것이 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 인간 포타슘 채널을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 hKir2.1-pcDNA3.1(+)를 제공한다.
본 발명자들은 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 프라이머를 디자인하고, 뇌 라이브러리로부터 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR 반응으로 상기 서열번호 1의 인간 포타슘 채널을 코딩하는 DNA(hKir2.1 cDNA)를 클로닝하였다.
클로닝된 hKir2.1 cDNA는 포유류 세포 HEK293에서 안정적으로 발현시키기 위하여 포유류 CMV 프로모터가 있는 pcDNA3.1(+) 벡터(미국 인비트로젠 제품)의 BamHI과 XhoI 제한(효소)사이트에 서브클로닝하여 hKir2.1-pcDNA3.1(+) 벡터를 제조하였다. 상기 벡터의 개열지도는 도 3과 같다.
본 발명의 재조합 벡터는 T-형 α1H 칼슘 채널을 발현하는 세포에 도입되어 세포내 안정 막전압의 형성에 기여할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니다.
<실시예 1> 인간 Kir2.1 포타슘 채널의 클로닝 및 서브클로닝
본 발명자들은 연쇄 중합 반응(PCR)에 의하여 hKir2.1 유전자를 특이적으로 증폭하기 위하여 PCR 프라이머를 하기와 같이 디자인하여 제작하였다.
Forward primer: 5'ACTGGAGTCCCCAGCAGAA3'(서열번호 3);
Reverse primer: 5'AGACCGTGTTGTAAAGTAACT3'(서열번호 4)
PCR의 주형으로 사용할 상보적 DNA(cDNA)는 AMV 역전사효소(reverse transcriptase)(일본 다카라 제품)를 사용하여 인간 뇌 RNA 라이브러리(미국 인비트로젠 제품) 0.5mg으로부터 역전사 반응에 의하여 합성하였다. Taq DNA 중합효소를 사용하여 수행한 PCR 반응 조건은 다음과 같다. 우선, 1분간 94℃에서 비활성화시킨 후, 30회의 온도 변화 사이클(94℃에서 30 초, 52℃ 에서 30 초, 72℃에서 1분 20 초)을 수행하였다. 상기 PCR 결과 증폭된 cDNA는 1% 아가로즈 젤에서 분리한 후 정제하고, TOPO TA 벡터(미국 인비트로젠 제품)에 클로닝하였다. 형질 전환을 통하여 다시 획득된 PCR 산물은 염기서열 결정으로 인간 포타슘 채널 Kir2.1의 cDNA임을 확인하였으며, 이의 염기서열(서열번호 1)과 번역된 아미노산 서열(서열번호 2)은 도 1 및 도 2와 같다.
클로닝된 hKir2.1 cDNA는 포유류 세포인 HEK293 세포에서 안정적으로 발현시 키기 위하여 포유류 CMV 프로모터가 있는 pcDNA3.1(+) 벡터(미국 인비트로젠 제품)의 BamHI과 XhoI 제한 효소 사이트에 서브클로닝(sub-cloning) 하여 hKir2.1-pcDNA3.1(+) 벡터를 제조하였다. 상기 벡터의 개열지도는 도 3과 같다.
<실시예 2> HEK293 세포주의 배양 및 인간 포타슘 채널 Kir2.1 유전자를 포함하는 hKir2.1-pcDNA3.1(+) 벡터의 트렌스펙션
발명에 사용된 세포주로 발명자 중의 한사람인 페레즈-레이스 박사(미국 버지니아 대학)에 의해 수립된 인간 T-형 α1H 채널(Genebank accession No.: AF051946)을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주를 사용하였다. 이 세포주의 배양에 사용된 배지는 둘베코의 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM, 미국 시그마)로, 10% 태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, 미국 GibcoBRL), 2.5g/L 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 100,000unit/L 페니실린, 100mg/L 스트렙토마이신(미국 라이프 테크놀러지 제품)을 첨가하여 사용하였다. HEK293 세포주는 37℃ CO2 배양기(humidified CO2 incubator; 95% 공기-5% 이산화탄소)에서 7일을 주기로 계대 배양하였다. 이때, 배지에 제네티신 선별 항생제(Geneticin-selective antibiotics)인 G-418(미국 라이프 테크놀러지 제품)을 추가로 첨가하였으며 배지를 3일에 한번씩 교체하여 T-형 α1H 채널을 안정적으로 발현하는 세포주를 유지하였다.
본 발명에서는 인간 T-형 α1H 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주에 <실시예 1>에서 제작된 hKir2.1-pcDNA3.1(+) 벡터를 도입하기 위하여 칼슘포스페이트 트렌스펙션 키트(미국 인비트로젠 제품)를 사용하였다. 구체적으로, 칼슘포스페이트(CaPO4)를 이용하여 상기 벡터를 트렌스펙션하기 24시간 전, 35mm 배양 접시(미국 코닝 제품)에 총 2x105개의 세포를 접종(seeding)하여 배양하고 트렌스펙션 3~4시간 전에 새로운 배지(배지의 조성은 위와 동일)로 교환하였다. 트렌스펙션을 위한 준비로 한 개의 E-(에펜도르프) 튜브에 7.5μl의 2M 염화 칼슘(CaCl2)와 1μg의 hKir2.1-pcDNA3.1(+) 벡터를 넣은 후 총 60μl 부피로 맞춘 후 부드럽게 교반하였다. 60μl 2X 행크 완충식염수(Hank's buffered saline, HBS)가 들어있는 다른 튜브에 1~2분 동안 서서히 벡터가 들어 있는 용액을 떨어뜨리면서 기포를 생성(bubbling)하여 교반하였다. 벡터 침전물이 형성되면 실온에서 30분 간 방치하고, 세포가 접종되어 있는 35mm 배양접시에 천천히 떨어뜨렸다. 벡터 침전물이 잘 혼합되도록 부드럽게 배양접시를 흔들어 준 뒤, CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 새로운 배지로 교환하였다.
<실시예 3> 형질전환된 세포군의 선별 및 세포 클론의 배양
T-형 α1H 채널 hCav3.2와 포타슘 채널 hKir2.1이 안정적으로 발현되어 형질이 전환된 세포주군을 트렌스펙션 후 4 주 동안 G418(1 mg/ml)과 하이그로마이신(hygromycin)(0.1 mg/ml)을 첨가한 배지에서 배양하여 선별하였다. 두 종류의 항생제에 살아남은 세포군(colony)을 클로닝 실린더(cloning cylinder)를 이용하여 분리한 후 트립신(trypsin)을 처리하여 단일 세포들을 수득하였다. 이들 단일 세포들을 24 웰-플레이트에 나누어 접종하여 배양한 후 25개의 다른 세포 클론(clone)을 얻었다.
<실시예 4> 전기생리학적 방법에 의한 최적으로 형질전환 된 세포주의 확인
본 발명자 등은 전기생리학적인 방법(전류 및 전압 고정법)을 이용하여 <실시예 3>에서 선별된 25개 클론의 hKir2.1의 발현 정도, T-형 α1H 채널의 전류 밀도, 안정 막전압, 세포의 동질성 등을 측정함으로써 형광 칼슘 측정을 이용한 HTS 시스템에 가장 적합한 클론#30을 얻을 수 있었고, 이를 2005년 2월 22일에 한국 생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에 기탁되었으며 수탁번호는 KCTC 10780BP이다.
구체적인 실험 방법과 조건은 다음과 같다. 선별된 여러 세포 클론들 중 최적으로 인간 T-형 α1H 채널과 인간 포타슘 채널 Kir2.1을 발현하는 HEK293 클론을 확인하기 위하여, T-형 칼슘전류와 내향성 정류(inwardly rectifying) 포타슘 전류(이하 “IRK 전류”)를 전압 고정법 중의 하나인 전세포 파열 패치-클램프(Whole-cell ruptured patch-clamp) 방법(Hamil 등, Pflugers Arch., 391:85-100, 198; Jeong 및 Ikeda, Neuron, 21:1201-1212, 1998)으로 기록하였다. 한편, 칼슘 및 포타슘 전류의 측정에 의해 확인된 세포 클론을 대상으로 안정 막전압을 그라미시딘-천공 전류 고정법(gramicidin-perforated current-clamp) (Akaike, Prog. Biophys. Mol. Biol., 65:251-264, 1997)으로 측정하였다.
측정에 사용한 패치 전극(patch electrode)은 P-97 Flaming Brown 마이크로피펫 풀러(미국 Sutter Instrument 제품)를 이용하여 보로실리카(borosilicate) 유리관(미국 코닝 제품)으로 제작하였다. 전극은 내부 용액(internal solution)을 채웠을 때 1-3 MΩ의 저항을 나타내었다. 세포의 전기 용량(capacitance)과 시리즈 저항은 Axopatch-1D(미국 Axon Instruments 제품) 또는 EPC-10 증폭기(amplifier)(독일 HEKA, 제품)를 이용하여 80% 이상 보정하였다. 전압 자극 프로토콜의 생성과 데이터 수집을 위해 ITC18(미국 Instrutech 제품)을 이용한 S4(미국 Stephen R. Ikeda 박사제작)나 Pulse(독일 HEKA 제품)를 사용하였다. 이온 전류는 4-pole Bessel 필터를 이용하여 5KHz에서 고대역 필터링(low-pass filtering)하였고, 2KHz에서 디지털화하여 컴퓨터에 보관하였다. 데이터 분석은 IGOR 프로그램(미국 Wavemetrics 제품)을 사용하였다. 그라미시딘-천공 전류 고정법에 사용한 그라미시딘(미국 시그마 제품)은 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 50mg/ml로 녹여 스톡(stock) 용액으로 제조하였고, 전압 측정 전에 내부전극 용액에 50μg/ml로 희석하여 사용하였다.
전류 및 전압측정에 사용한 외부 및 내부 용액의 조성은 다음과 같다.
① 칼슘 전류 측정용:
내부전극 용액 (in mM) -
120 N-methyl-D-glucamine-methanesulfonate(NMG-MS), 20 tetraethyl- ammonium(TEA)-MS, 20 HCl, 11 EGTA, 1 CaCl2, 10 HEPES, 4 Mg-ATP, 0.3 Na-GTP, 14 creatine phosphate(pH 7.4)
외부 용액(in mM) -
155 Tris-AMEM, 20 HEPES, 10 CaCl2, 10 glucose, 0.0003 tetrodotoxin (TTX)(pH 7.4)
② 포타슘 전류 측정용:
내부 전극 용액(in mM) -
140 K+ gluconate, 5 NaCl, 1 EGTA, 2 MgCl2, 10 HEPES, 2 Na-ATP, 0.1 Na-GTP(pH 7.3)
외부 용액(in mM) -
135 NaCl, 5.4 KCl, 1 MgCl2, 1.8 CaCl2, 5 HEPES, 10 glucose(pH 7.4)
③ 안정 막전압 측정용:
내부전극 용액 (in mM) -
140 KCl, 5 EGTA, 10 HEPES, 0.5 CaCl2, 5 NaCl(pH 7.2)
외부용액 (in mM) -
135 NaCl, 5.4 KCl, 1 MgCl2, 1.8 CaCl2, 5 HEPES, 10 glucose(pH 7.4)
이상의 실험방법으로 실시하여 얻은 결과는 다음과 같다.
도 4 의 A에 나타난 바와 같이 클론#30 세포를 -80mV에 고정하고 -140mV에서 +50mV로 변하는 램프전압(ramp voltage)를 가하였을 때 -140mV에서 최대로 활성화되는 hKir2.1에 의해 코딩되는 IRK 전류와 -50mV에서 활성화 되어 -30mV에서 최대 크기를 보이는 T-형 α1H 채널 전류를 기록할 수 있었다. IRK와 T-형 α1H 채널의 평균 전류 밀도(current density)는 각각 24.9±5.7pA/pF와 50±14.8pA/pF(실험수=3∼6)으로 나타났다. IRK 전류는 선택적 차단제인 100 mM 바륨(Ba2+)에 의해 억제되었다(도 2의 B). 이러한 바륨에 민감한 IRK 전류는 -140mV로부터 +10mV 씩 증가하는 전압 자극(test pulse)에 의해 활성화 되었다. hKir2.1을 HEK293 세포에 안정적으로 발현시켰을 때 높은 안정 막전압이 생성되었는지를 전류 고정법으로 확인하였는 바, 이때 세포 내의 이온의 조성이 변하지 않도록 하여 정확한 막전압을 측정하기 위해 그라미시딘-천공 패치-클램프 방법을 사용하였다. 도 2의 C에서 나타난 바와 같이 측정 결과 -72mV의 높은 안정 막전압이 생성되었음을 확인할 수 있었다. 평균적으로 hKir2.1가 발현되지 않은 대조군 HEK293 세포(T-형 α1H 채널은 발현된)에서는 안정 막전압이 -26.7±3.9mV로 측정되었으며, hKir2.1이 안정적으로 발현됨으로써 안정 막전압이 -66.2±4.2mV로 통계적으로 의의있게 높아졌다(P<0.001). 또한, hKir2.1를 일시적(transiently)으로 발현시켰을 때 얻은 안정 막전압 -57.6±4.8mV 보다 hKir2.1를 안정적(stably)으로 발현시켰을 때가 통계적으로 더 높게 나타났다(p<0.05). 한편, 른 클론들의 테스트 결과에서 HEK293 세 포에서 측정된 IRK 전류 밀도의 크기가 커지더라도 생성된 안정 막전압의 크기가 비례하여 크게 증가하지는 않았고, 오히려 hKir2.1의 과발현은 T-형 α1H 채널 전류 밀도를 많이 감소시켰다. 도 4의 D에서 보는 바와 같이 전류 고정법으로 클론#30의 세포막 전압을 측정하면서 IRK의 억제제인 바륨(100μM)을 가하였을 때 세포 막전압의 탈분극(depolarization)과 함께 칼슘 스파이크 또는 활동전압(Ca2+ spike 또는 action potentials)이 유도되었다. 이러한 결과는 소듐(sodium) 채널이 없는 HEK293 세포에서 탈분극에 의해 충분히 많은 수의 T-형 α1H 채널이 활성화되고 이 채널을 통한 칼슘의 유입이 상당히 많다는 것을 의미하며, 이는 hKir2.1의 안정적 발현으로 형성된 높은 안정 막전압이 탈분극시 활성화시킬 수 있는 T-형 α1H 채널의 수(number)를 크게 증가시켰기 때문이다. 따라서 전기생리학적 측정 결과를 종합해 볼 때, 안정 막전압이 높게 생성되면서, T-형 α1H 채널 전류의 밀도도 높게 유지되어야하는 필요 조건을 만족시키는 클론#30이 HTS 시스템 구축에 가장 적합한 세포임을 알 수 있었다.
<실시예 5> 형광측정방법을 이용한 세포주(#30)의 적합성 검증
전기생리학적 방법으로 검증된 세포주(클론#30)을 사용하여 실제로 비전기생리학적인 형광 칼슘 측정방법으로 (1) 높은 칼슘 신호(calcium signal)를 얻을 수 있는지, (2) 비특이적 T-형 채널 억제제에 의해 칼슘 신호가 차단되는지를 확인하였다.
세포 내 칼슘 농도의 측정은 형광현미경(니콘 TE2000, 일본)에 장착된 ratio 형광시스템(Ratiomaster, 포톤 테크놀러지 인터내셔날, 미국) 및 CoolSNAP CCD 이미징 시스템(로퍼 사이언티픽, 미국)을 각각 사용하여 시행하였다. 먼저 커버 슬립(cover slip) 위에서 배양된 세포에 Fura-2/AM 또는 Fluo-3(Molecular Probes, 미국)를 5μM이 되도록 가하여, 상온에서 빛이 차단된 상태로 30-60분간 부하(loading)시켰다. 부하시킨 후 세포 외 관류액으로 2회 세척한 다음, 세포가 붙어있는 커버 슬립을 현미경위 관류 챔버에 장착하였다. Fura-2/AM을 사용한 경우 세포 내 칼슘(Ca2+) 농도 변화는 340nm와 380nm의 빛으로 번갈아 가며 여기(excitation)시켰을 때 510nm로 방출(emission)되는 형광의 비(F340/F380 ratio)를 포톤 멀티플라이어 튜브(photon multiplier tube, PMT)를 통하여 측정하였다. Fluo-3를 사용한 경우는 형광 비를 측정하지 않고 525nm에서 방출되는 형광 이미지를 냉각 CCD로 캡처하여 기록하고 메타이미지 6.1 프로그램(Imaging corporation, 미국)으로 분석하였다.
패치-클램프 방법을 사용할 때에는 전압 자극을 가하여 인위적으로 T-형 α1H 채널을 활성화시켰지만, 비전기생리학적 형광 측정방법을 사용할 경우에는 세포가 충분한 안정 막전압을 가지고 있기 때문에 세포 외부에 바륨을 가하거나 염화 칼륨을 가하여 탈분극시키는 것이 필요하다. 도 5에 나타난 바와 같이 Fura-2/AM을 부하한 클론#30(T-형 α1H 채널과 hKir2.1이 안정적으로 발현된 세포)의 단일 세포를 60mM 염화 칼륨을 가하여 탈분극시켰을 때 F340/F380가 1.1에서 1.55로 증가하 였고, 이러한 T-형 α1H 채널을 통해 유입된 세포 내 칼슘의 증가는 비특이적 T-형 채널 억제제인 미베프라딜(mibefradil)(3μM)의 전 처리에 의해 완전히 차단되었다. 도 6에 요약한 대로 클론#30 세포에서 탈분극에 의한 F340/F380의 비율 변화는 세포 외액 내 칼슘의 농도가 2mM과 10mM일 때 각각 0.18±0.06(실험 수=6)와 0.59±0.07(실험 수=6)로, 세포 외액 내 칼슘의 농도에 비례하여 증가하였다.
단일 세포가 아닌 여러 세포들로부터 칼슘 신호의 형광 이미지를 한꺼번에 측정할 수 있는 냉각 CCD 이미지 시스템은 실제로 약물의 HTS에 사용되는 형광이미지 플레이트 리더(fluorescence Imaging plate reader, FLIPLR)와 비슷한 실험환경과 원리를 제공한다. 따라서 본 이미지 시스템을 사용하여 실제로 본 발명이 T-형 α1H 채널 억제제를 HTS로 검색하는 데 적합한지를 최종 검증하였다. 형광 칼슘 이미지를 측정하기 위하여 클론#30 세포 내에 fluo-3을 부하하였다. 본 칼슘 이미지 측정실험에서 Fluo-3을 Fura-2/AM 대신 사용한 이유는 Fluo-3이 약물 개발을 위한 세포 기반(cell-based) HTS에 매우 많이 쓰이는 형광염료(Velicelebi 등, Methods Enzymol., 294:20-47, 1999)로 알려져 있기 때문이다. 도 7은 세포 내 칼슘 신호의 형광 이미지를 나타내었다(Fluo-3이 결합하는 칼슘의 농도에 비례하여 적색이 증가하도록 나타냄). 염화 칼륨을 가하지 않은, 즉 탈분극되지 않은 안정 상태에서도 세포 내 칼슘 레벨이 약간 높아져 있는데(일부 세포가 적색을 띄고 있음) 비특이적 T-형 채널 억제제인 미베프라딜(3μM)에 의해 현저히 감소되었다(적색이 띈 세포 수가 현저히 줄어들었음). 이로부터 안정 막전압에서 T-형 α1H 채 널의 일부가 활성이 일어나 자극을 가하지 않아도 약간의 칼슘이 T-형 α1H 채널을 통해 세포 내로 들어감을 알 수 있다(이를 “윈도우 전류"라고 함). 그러나 이러한 윈도우 전류를 이용하여 약물을 테스트하는 것은 신호/잡음 비(Signal-to-Noise ratio)가 매우 낮기 때문에 바람직하지 않다. 클론#30 세포를 60mM 염화 칼륨을 가하여 탈분극시켰을 때 매우 빠르게 형광 이미지의 밝기가 증가하였다(도 7의 A). 이러한 세포 내 칼슘 신호의 증가는 비특이적 T-형 채널 억제제인 미베프라딜(3μM)(도 7의 B) 또는 100μM 니켈(Ni2+)의 전 처리에 의해 완전히 억제되었다.
상기 살펴본 바와 같이, 본 발명의 세포주는 칼슘 형광의 측정을 통한 T-형 α1H 칼슘 채널 억제제 후보군의 고효율 검색에 이용될 수 있을 것이며 이는 앞으로 T-형 채널의 발현 이상으로 발생하는 여러 질환의 치료제 개발을 촉진시킬 것으로 기대된다. 또한, 지금까지 안정 막전압이 거의 형성되지 않는 이종 발현계에서 수행했던 T-형 α1H 채널의 생물리학적 및 약리적 특성, 유전자 발현 및 세포막 운반조절, 인산화 정도 및 신호 전달 등의 광범위 특성에 관한 연구를 높은 안정 막전압을 가지며 신경세포와 유사해진 흥분성 세포주에서 수행함으로써 T-형 α1H 채널의 특성과 이에 따른 생체현상의 규명에 접근할 수 있을 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. T-형 α1H 칼슘(calcium) 채널을 발현하는 HEK293 세포에 포타슘(potassium) 채널을 코딩하는 서열번호 1로 기재되는 인간 Kir2.1 유전자를 포함하는 도 3의 개열지도로 표시되는 벡터 hKir2.1-pcDNA3.1(+)가 형질도입된 수탁번호 KCTC 10780BP로 기탁된 HEK293 세포주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 염화 칼륨 또는 바륨을 처리하였을 때 T-형 α1H 칼슘 채널이 활성화 되는 것을 특징으로 하는 세포주.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. i) 제1항의 세포주에 형광 염료를 부하(loading)하는 단계;
    ii) 단계 i)의 세포주에 검색 약물을 가하는 단계;
    iii) 단계 ii)의 세포주를 탈분극시키는 단계;
    iv) 단계 iii)의 세포주의 형광 이미지 및 빛의 세기를 기록하는 단계를 포함하는 T-형 α1H 칼슘 채널의 억제제를 검색하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 단계 iii)은 세포에 염화 칼륨 또는 바륨을 처리하여 세포를 탈분극 시키는 것을 특징으로 하는 T-형 α1H 칼슘 채널의 억제제를 검색하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 처리하는 염화 칼륨의 농도가 50mM 내지 60mM인 것을 특징으로 하는 T-형 α1H 칼슘 채널의 억제제를 검색하는 방법.
  10. 삭제
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