KR100519693B1 - α1Ｇ Ｔ-형 칼슘 채널 활성 연구 및 고효율 억제제 검색용 ＨＥＫ２９３ 세포주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 레트로바이러스 발현 시스템을 이용하여 α1G T-형 칼슘 채널이 안정적으로 발현되는 HEK293 세포를 인간 Kir2.1 유전자로 형질전환시킨 세포주에 관한 것이다. 본 발명의 HEK293 세포주는 Kir2.1 (칼륨 내부 정류 채널 (potassium inwardly-rectifying channel))을 영구적으로 추가 발현함으로써 세포 막전압을 과분극쪽으로 더 낮추어 안정적인 막전압을 발현하고, 따라서 전기생리학적 방법 이외에도 고농도의 KCl에 의하여 α1G가 활성화된다.
Description
본 발명은 레트로바이러스 발현 시스템을 이용하여 α1G T-형 칼슘 채널이 안정적으로 발현되는 HEK293 세포를 인간 Kir2.1 유전자로 형질전환시킨 세포주에 관한 것이다.
막 단백질인 전압 의존성 칼슘 채널 (Voltage-dependent Ca2+ channel)은 세포 바깥쪽으로부터 칼슘이온의 유입을 조절함으로써 근육수축, 신경세포 발생 및 시냅스 가소성 (synaptic plasticity), 신경전달 물질 및 호르몬의 분비, 유전자 발현 등의 다양한 세포내 작용들을 조절한다. 이러한 전압의존성 칼슘 채널의 종류로는 낮은 전압에서 활성화되는 저전위 활성화 (low-voltage-activated) (LVA) 칼슘 채널 또는 T-형(transient-type) 칼슘 채널로 불리는 채널이 잘 알려져 있고, 현재까지 α1H, α1I, α1G 3가지 형태가 존재한다고 알려져 있다.
T-형 칼슘 채널의 알려진 기능으로는 신경세포의 버스팅 파이어링 (bursting firing) (Huguenard, J.R. 등, Annu. Rev. Physiol. 58, 329-348, 1996), 심장의 페이스 메이커 활동 (Zhou, Z & Lipsius, S.L. J. Mol. Cell. Cardiol. 26, 1211-1219, 1994), 호르몬 알도스테론 분비 (Rossier, M.F. 등, Endocrinology 137, 4817-4826, 1996) 및 수정 (fertilization) (Arnoult, C. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 13004-13009, 1996)을 조절하는 것으로 알려져 있다.
아주 빠르게 활성-비활성화되는 작은 전도도가 특징인 T-형 칼슘 채널은 -40 ~ -30 mV에서 활성화된다. 그러나, 빠른 비활성화 성질 때문에 활성되기 전의 세포 막전압의 유지 조건이 매우 중요하다. 그러나, T-형 칼슘 채널을 발현하는 대부분의 세포들의 막전압은 T-형 칼슘 채널을 활성화시키기에 충분히 과분극되어 있지 않으므로 막전압을 조절할 수 있는 전기생리학적 방법을 제외하고는 그 연구방법이 전무했다. 따라서, 신경세포에서 다양한 기능의 T-형 칼슘 채널의 신호전달 경로 기전 연구 및 T-형 칼슘 채널 저해제 개발을 위한 기반 연구가 거의 이루어지고 있지 않고 있으며, 전기생리학적 방법 이외의 방법으로 T-형 칼슘 채널을 연구할 수 있는 방법이 필요하나 현 기술상태로는 불가능하다.
따라서, 본 발명의 목적은 외부 KCl의 농도 변화로 T-형 칼슘 채널을 활성화시킴으로써, T-형 칼슘 채널의 세포내 신호전달 과정연구 및 현재까지 선택적인 저해제 개발이 이루어지고 있지 않은 T-형 칼슘 채널의 저해제 개발의 기반 연구 및 고효율 검색에 활용될 수 있는 세포주를 확보하는데 그 발명의 목적이 있다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 연구를 수행한 결과, 세포막 전압형성에 가장 크게 기여하는 칼륨 채널을 α1G T-형 칼슘 채널이 안정적으로 발현되는 HEK293 세포주에 발현시킴으로써, 세포 막전압을 과분극쪽으로 더 낮추어 안정적인 막전압을 발현하여 전기생리학적 방법 이외의 방법으로 T-형 칼슘 채널을 연구할 수 있는, 고농도의 KCl에 의하여 α1G가 활성화되는 세포주를 개발할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 레트로바이러스 발현 시스템을 이용하여 α1G T-형 칼슘 채널이 안정적으로 발현되는 HEK293 세포를 인간 Kir2.1 유전자로 형질전환시킨 세포주에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 레트로바이러스 발현 시스템을 이용하여 α1G T-형 칼슘 채널이 안정적으로 발현되는 HEK293 세포를 인간 Kir2.1 (potassium inwardly-rectifying channel, Gnebank accession: AF153820) 유전자를 포함하는 플라스미드, 바람직하게는 도 2의 플라스미드로 형질전환시킨 세포주를 제공한다.
본 발명의 세포주는 고농도 KCl 처리에 의해 T-형 칼슘 채널이 활성화되고, 2003년 9월 29일자로 한구 생명공학 연구원 유전자 은행(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁되었으며, 기탁 기관에 의해 부여된 수탁 번호는 KCTC 10519BP이었다.
발명에 사용된 세포주는 본원의 발명자 중의 1인인 에드워드 페레즈-레이에스에 의해 확립된, α1G T-형 칼슘 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주 (인간 신장 배아세포주 (human embryonic kidney cell line))를 사용하였다 (Lee, J.H. 등, J. Neurosci. 19, 1912-1921, 1999).
본 발명에 따르면, 서열 1의 인간 Kir2.1 유전자를 XhoI과 EcoRI 제한효소로 처리한 후 이를 동일하게 처리한 pMSCVpuro에 도입하여 플라스미드 Kir2.1-pMSCVpuro를 제조하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 사용하여 야생형 HEK293 세포를 형질감염시킨 후 배양하고, 그 배양액을 α1G T-형 칼슘 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주 배양 상등액과 혼합한 후 배양하여 Kir2.1을 안정적으로 발현하는 본 발명의 세포주를 얻을 수 있다.
본 발명에서 확립한 세포주가 Kir2.1 발현으로 인하여 안정적인 막전압을 형성하는지를 결정하기 위해 전기생리학적 천공 패치 클램프(perforated patch-clamp) 기법을 사용하여 세포 막전압을 측정하였고, 발현된 Kir2.1과 이미 발현된 α1G T-형 칼슘 채널의 생물리학적 및 약리학적 성질을 전 세포 패치 클램프 방법으로 확인하였고, 최종적으로 단지 고농도 KCl의 처리에 의해서 T-형 칼슘 채널이 활성화되는지를 푸라(fura)-2 AM 염료를 이용하여 세포내 칼슘이온 농도변화를 측정하였다.
본 발명에 따른 세포주는 Kir2.1 발현을 통하여 KCl에 민감하게 반응할 수 있는 적정 수준의 막전압을 생성시키고, 이에 의해 T-형 칼슘 채널만이 활성화되기 때문에 전기생리학적 방법 이외의 방법으로 T-형 칼슘 채널을 연구할 수 있는 토대를 제공함이 밝혀졌다.
<실시예 1> 발명에 사용된 세포주와 배양방법
발명에 사용된 세포주는 본원의 발명자 중의 1인인 에드워드 페레즈-레이에스에 의해 확립된, α1G T-형 칼슘 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주를 사용하였다. 상기 T-형 칼슘 채널을 안정적으로 발현하는 세포주 (α1G HEK293)를 대조군으로, α1G T-형 칼슘 채널과 함께 Kir2.1을 안정적으로 발현시키는 본 발명의 HEK293 세포주 (Kir2.1+α1G HEK293)에 대해 실험을 진행하였다.
대조군의 배양액은 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에 10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 (v/v)을 첨가하여 제조하고, 세포는 95% 공기/5% CO2의 가습 (humidified) 조건의 배양기에서 37 ℃에서 배양한다. 배양액은 3-4일에 한번씩 교환하고, 세포는 매 일주일마다 분주(sub-culture)하고, 제네티신 선별 항생제(geneticin selective antibiotic)인 G-418 (0.5 mg/ml) 용액을 사용하여 α1G T-형 칼슘 채널을 발현시킨 세포만을 성장시킨다.
Kir2.1+α1G HEK293 세포주 배양액은 대조군의 배양액에 푸로마이신 (Puromycin) (1 ㎍/ml)만 더 첨가하여 제조한 것이고, 배양조건은 동일하다. T-형 칼슘 채널 활성 측정법에 사용된 세포들은 매번 분주할 때 폴리-L-리신 (0.5 ㎎/㎖)으로 코팅 처리한 커버 슬립에 배양한 후 2-7일 후에 기록하였다.
<실시예 2> 레트로바이러스 발현 시스템
도 1의 인간 Kir2.1 유전자의 총 염기서열(서열 1)을 pMSCVpuro (Clontech, 도 2)에 클로닝하였다. Kir2.1의 염기서열을 얻기 위해 다음과 같은 프라이머로 인간 플라스미드형 cDNA 라이브러리 (Takara)를 주형으로 PCR 반응 (95 ℃ 5 min 반응한 후 95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 2 min의 반응 싸이클을 30회 반복한 후, 72 ℃ 7분 반응을 수행)을 수행하였다. 얻어진 Kir2.1 유전자를 XhoI과 EcoRI 제한효소로 처리한 후 이를 동일하게 처리한 pMSCVpuro에 도입하여 플라스미드 Kir2.1-pMSCVpuro를 제조하였다.
Kir2.1 XhoI Fw;
ccgctcgaggccgccatgggcagtgtgag
Kir2.1 RI Rv;
ccggaattctcatatctccgattctcgcc
이렇게 얻어진 표적 벡터를 이용하여 Kir2.1이 안정적으로 발현되는 HEK293 세포주를 다음과 같이 제작하였다.
야생형 HEK293 세포를 6 cm 배양접시에 2.6 X 106 정도 도포하여 DMEM (0.1 mM 비필수 아미노산 및 10% FBS로 보충됨, 배양조건; 37 ℃, 공기와 CO2의 95:5% (v/v) 가습 혼합물)이 충전된 챔버에서 성장시켰다. 18시간 후에 Kir2.1-pMSCVpuro (도 2) 6 ㎍, pEQPAM3 (Clontech) 3 ㎍, 그리고 pVSV-G (Clontech) 3 ㎍을 0.5 M의 칼슘 수용액에 침전시켜 얻은 용액을 사용하여 세포주를 형질감염시키고, 6시간 후에 배지를 교환하였다. 20시간 배양한 후 배지를 3 ml의 배지로 교환하였다. 20시간 경과 후에, 상기 Kir2.1-pMSCVpuro로 형질감염시킨 야생형 HEK293 세포 배양액을 2000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액 2.5 ml을 최종농도 6 mg/ml의 폴리브렌 (polybrene) (Sigma)과 혼합하였다.
이와 별도로, α1G T-형 칼슘 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주를 6 cm 배양접시에 2 X 105 정도 도포하여 20시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고, 그 대신에 상기 준비한 형질감염된 HEK293 세포 배양 상등액과 폴리브렌의 혼합물을 넣어주었다. 6시간 배양 후 배양액을 교환하고, 24시간 배양한 후 다시 한번 배양액을 교환하였다. 24시간 배양 후 같은 배양액에 1 ㎍/ml 농도의 푸로마이신 (Sigma)를 첨가하여 저항성 있는 세포를 선택적으로 배양하였다. 14일간 선택배양을 한 결과 Kir2.1을 안정적으로 발현하는 세포주를 얻을 수 있었다. 상기 사용한 세포는 1 mg/ml 농도의 G418로 선택된 세포이기 때문에 이 세포 사용 이후의 배지에는 해당농도의 G418이 첨가되도록 하였다.
<실시예 3> 세포 막전압 측정법
단일세포수준에서 IRK (inwardly rectifying potassium)-형 칼륨 채널인 Kir2.1의 발현 후 세포막 전압차를 측정하기 위해 EPC-9 증폭기 (HEKA, German)를 사용하여 전기생리학적 니스타틴(Nystatin)-천공 패치 클램프 방법으로 측정하였다. IRK-형 칼륨 채널 활성 측정을 위한 세포 외부용액으로 KCl 10 mM, KOH 90 mM, L-아스파르트산 90 mM, MgCl2 1 mM, NaCl 1 mM, HEPES 10 mM (pH 7.4)을 사용하고 세포 내부용액으로는 NaCl 140 mM, KCl 3 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1.5 mM, 글루코스 10 mM, HEPES 10 mM (pH 7.4)을 사용하였다.
막전압 측정을 위해, 상기 제조한 세포 내부용액과 니스타틴 (250 ㎍/ml)을 혼합해 넣은 3-4 ㏁ 저항의 미세유리 전극으로 단일세포를 찔러 전세포 기록 (whole-cell recording) 모드에서 세포의 막전압의 크기를 측정하였다.
도 3은 α1G T-형 칼슘 채널만을 선택적으로 발현시킨 HEK293 세포 (α1G HEK293 세포, 대조군)와 α1G와 Kir 2.1을 선택적으로 같이 발현시킨 HEK293 세포 (Kir2.1+α1G HEK293 세포, 비교군)의 막전압 비교도이다.
도 3에 따르면, Kir2.1을 발현시키기 전의 α1G HEK293 세포의 막전압은 -12.2 ±2.8 mV (n=12)을 나타내지만, Kir2.1을 발현시킨 Kir2.1+α1G HEK293 세포의 막전압은 -57.3 ±3.7 mV (n=16)로서 Kir2.1 발현에 의해 안정한 막전압을 형성함을 알 수 있다.
<실시예 4> T-형 칼슘 채널 및 Kir2.1 채널 활성 측정법
단일세포수준에서 T-형 칼슘 채널의 전류측정을 위해 EPC-9 증폭기 (HEKA, German)를 사용하여 전기생리학적 전세포 패치 클램프 방법으로 측정하였다. T-형 칼슘 채널 활성 측정을 위한 세포 외부용액으로 NaCl 140 mM, CaCl2 2 mM, HEPES 10 mM (pH 7.4)을 사용하고, 세포 내부용액으로는 KCl 130 mM, HEPES 10 mM, EGTA 11 mM, MgATP 5 mM (pH 7.4)을 사용하였다. 상기 제조한 세포 내부용액을 넣은 3-4 ㏁ 저항의 미세유리 전극으로 단일세포를 찔러 전세포 기록 모드에서 세포막 전위를 -100 mV로 고정한 후 매 10초마다 -30 mV (50 ms duration)로 저분극시켰을 때의 T-형 칼슘 채널 활성으로 인해 생기는 내향전류의 크기를 측정하였다.
단일세포수준에서 IRK-형 칼륨 채널인 Kir2.1의 전류측정도 전세포 패치 클램프 방법으로 측정하였다. IRK-형 칼륨 채널 활성 측정을 위해 세포 외부용액으로 NaCl 135 mM, KCl 5.4 mM, CaCl2 1.8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, 글루코스 10 mM (pH 7.4)을 사용하고 세포 내부용액으로는 D-글루콘산 (칼륨염) 140 mM, MgCl2 2 mM, EGTA 1 mM, HEPES 5 mM, Na2ATP 1 mM (pH 7.4)을 사용하였다. 전세포 기록 모드에서 세포막 전위를 -60 mV로 고정한 후, -140 내지 -60 mV의 200 ms 스텝 펄스(step pulse)를 인가하여 HEK293 세포의 내부 정류 칼륨 채널 (potassium inwardly-rectifying channel) 활성화로 인해 생기는 내향전류의 크기를 측정하였다.
도 4는 Kir2.1+α1G HEK293 세포에서 전기생리학적 전세포 패치 클램프 방법을 사용하여 Kir2.1 발현을 확인한 것이다. 도 4a (α1G HEK293 세포) 및 도 4b (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 전류-전압 상관 그래프이고, 도 4c (α1G HEK293 세포) 및 도 4d (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 각 전압에서의 실제적인 전류곡선이다. -140에서 -60 mV의 스텝 펄스를 가할 때 α1G HEK293 세포에서 거의 나타나지 않는 칼륨 전류 (도4c)가 Kir2.1 발현으로 인하여 Kir2.1+α1G HEK293 세포에서는 크게 나타나고 (도 4d), 각 전압에서 활성화된 전류 크기를 전류-전압 상관 그래프로 다시 도식했을 때 Kir2.1+α1G HEK293 세포 (도 4b)는 내부 정류 형태를 나타내어 Kir2.1 발현을 확인할 수 있었다.
또한, 기존의 IRK-형 칼륨 채널 억제제로 알려진 Ba+ 과 Cs+ 에 대한 IC50값의 비교를 통해 채널의 특성을 확인하였다. 이를 위해 위에서 언급한 Kir2.1 채널 활성 측정법을 사용하였고, Kir2.1 억제제로 알려진 바륨 (Ba2+) 및 세슘 이온 (Cs+)에 대한 억제 효과를 관찰하였다.
도 4e 및 도 4f는 Kir2.1 억제제로 알려진 1 - 100 μM의 바륨 이온 (Ba+) 및 5 - 500 μM의 세슘 이온 (Cs+)을 -140에서 -60 mV까지의 스텝 펄스 하에서 Kir2.1+α1G HEK293 세포에 투여하였을 때 각 전압에서 발생한 전류의 최대치를 나타낸 그래프로서, Kir2.1 발현이 Kir2.1 억제제인 바륨 및 세슘 이온에 대한 농도 의존적 방식으로 억제됨을 재확인할 수 있다.
도 5는 Kir2.1 발현으로 α1G T-형 칼슘 채널의 약물학적 성질이 변화하지 않음을 나타낸 것이다. 도 5a (α1G HEK293 세포) 및 도 5b (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 α1G T-형 칼슘 채널 활성의 전류-전압 상관 그래프이고, 도 5c (α1G HEK293 세포) 및 도 5d (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 각 전압에서의 실제적인 전류곡선으로서, Kir2.1 발현으로 인하여 기존재하는 α1G T-형 칼슘 채널 활성의 전류-전압 상관관계와 그 크기가 변화지 않았음을 나타낸다.
또한, 기존의 T-형 칼슘 채널 억제제로 알려진 Ni2+과 미베프라딜(mibefradil)에 대한 IC50값의 비교를 통해 채널의 특성을 확인하였다. 위에서 언급한 전기생리학적 전세포 패치 클램프 방법으로 1 μM 내지 1 mM의 Ni2+, 0.1 내지 10 μM의 미베프라딜을 각각 세포에 투여한 후 -30 mV에서 활성화된 T-형 칼슘 채널을 통해 발생한 내향전류의 최대치에 대한 억제율을 나타내었다.
도 5e (α1G HEK293 세포) 및 도 5f (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 α1G T-형 칼슘 채널 억제제로 알려진 니켈 이온 (Ni2+) 농도에 따른 내향전류의 억제율을 나타낸 그래프이고, 도 5g (α1G HEK293 세포) 및 도 5h (Kir2.1+α1G HEK293 세포)과 미베프라딜에 대한 농도 의존 그래프이다. 상기 도 5e 내지 5h에 따르면, Kir2.1+α1G HEK293 세포는 α1G HEK293 세포에 비해 니켈 이온과 미베프라딜에 대해 각각 IC50값이 차이가 없고, Kir2.1발현으로 α1G T-형 칼슘 채널의 약리학적 성질이 변하지 않음을 알 수 있다.
도 6은 Kir2.1 발현으로 인한 α1G T-형 칼슘 채널의 생물리학적 성질이 변화하지 않음을 나타낸 것으로, 도 5a (α1G HEK293 세포) 및 도 5b (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 T-형 칼슘 채널 게이트 활성-비활성 비교 그래프이다. 비활성 그래프 (h∽)는 -100 내지 -45 mV의 5 mV 간격의 예비 탈분극(pre-depolarization) 조건 후에 -30 mV에서 100 ms 스텝 펄스 하에서 얻어지는 내향전류의 최대치를 표준화시킨 것이고, 활성 그래프 (m∽)는 세포막 전위를 -100 mV로 고정한 후 -60 내지 +30 mV의 스텝 펄스를 인가하여 얻어지는 테일 전류 (tail-current)를 표준화시킨 것이다. 도 6을 통해 T-형 칼슘 채널 고유의 활성 및 비활성 곡선이 Kir2.1 발현 후에도 크게 차이나지 않음을 알 수 있다.
도 7a (α1G HEK293 세포)는 70 mM KCl 처리로 칼슘 유입에 변화가 없는 대조군의 그래프이고, 도 7b (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 70 mM KCl 처리로 T-형 칼슘 채널이 활성화되어 칼슘 유입이 있음을 제시하는 그래프이다.
세포내 칼슘 농도는 푸라-2/AM을 형광성 Ca2+ 표지물로 사용하여 측정하였다. HEPES 완충용액 (단위 mM: 150 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 2CaCl2, 10 HEPES, 10 글루코스, pH 7.4)에서 5 μM 푸라-2/AM과 0.001% 플루로닉(Pluronic) F-127와 함께 세포를 실온에서 40 내지 60분간 1차 배양하여 표지한 후 HEPES 완충용액으로 수회 세척하였다. 10분간 안정화시킨 후에 도립 현미경을 사용하여 340 nm 및 380 nm에서 세포를 선택적으로 노출시킨 후 515 nm 고대역 통과 여파기(long-pass filter)를 통과하여 들어온 방출 형광(emitter fluorescence light)은 냉각 CCD 카메라를 통과하여 디지탈 형광 분석기에 의해 비율값과 세포내 칼슘농도로 전환하여 칼슘농도를 측정하였다. 도 7을 통해, Kir2.1 발현으로 인한 안정한 막전압 형성으로 전기생리학적 방법이 아닌 고농도 KCl 처리로 T-형 칼슘 채널이 활성화되어 칼슘 유입이 되었음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 세포주는 KCl에 민감하게 반응하여 적정 수준의 막전압을 생성시키고, 이에 의해 T-형 칼슘 채널만이 활성화되기 때문에, 이후의 세포 신호전달을 분자생물학적, 생화학적 연구를 통해 규명할 수 있을 것이다. 또한, 현재까지 T-형 칼슘 채널 저해제로 개발된 화합물인 미베프라딜은 부작용으로 임상으로 사용되지 못하는 단점이 있으므로 새로운 의약품으로의 개발을 위한 선도물질의 도출을 위한 스크리닝, 특히 고속 검색 기술에 사용되어 T-형 칼슘 채널 저해제 개발을 가속화시킬 것으로 사료된다.
도 1은 인간 Kir2.1의 염기서열과 아미노산 서열.
도 2는 인간 전체 Kir2.1의 염기서열을 포함하는 pMSCVpuro 플라스미드.
도 3은 α1G T-형 칼슘 채널만을 선택적으로 발현시킨 HEK293 세포 (α1G HEK293 세포, 대조군)와 α1G와 Kir 2.1을 선택적으로 같이 발현시킨 HEK293 세포 (Kir2.1+α1G HEK293 세포, 비교군)의 막전압 비교도.
도 4는 Kir2.1+α1G HEK293 세포에서 전기생리학적 전세포 패치 클램프 방법을 사용하여 Kir2.1 발현을 확인한 것으로, 도 4a (α1G HEK293 세포) 및 도 4b (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 전류-전압 상관 그래프이고, 도 4c (α1G HEK293 세포) 및 도 4d (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 각 전압에서의 실제적인 전류곡선이며, 도 4e 및 도 4f는 Kir2.1+α1G HEK293 세포에서 Kir2.1 억제제로 알려진 바륨 (Ba+) 및 세슘 이온 (Cs+)에 대한 억제도에 의해 Kir2.1 발현을 재확인한 그래프.
도 5는 Kir2.1 발현으로 α1G T-형 칼슘 채널의 약물학적 성질이 변화하지 않음을 나타낸 것으로서, 도 5a (α1G HEK293 세포) 및 도 5b (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 α1G T-형 칼슘 채널 활성의 전류-전압 상관 그래프이고, 도 5c (α1G HEK293 세포) 및 도 5d (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 각 전압에서의 실제적인 전류곡선이며, 도 5e (α1G HEK293 세포) 및 도 5f (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 α1G T-형 칼슘 채널 억제제로 알려진 니켈 이온 (Ni2+) 농도에 따른 <전류>를 나타낸 그래프이고, 도 5g (α1G HEK293 세포) 및 도 5h (Kir2.1+α1G HEK293 세포)과 미베프라딜 (mibefradil)에 대한 농도 의존 그래프.
도 6은 Kir2.1 발현으로 인한 α1G T-형 칼슘 채널의 생물리학적 성질이 변화하지 않음을 나타낸 것으로, 도 5a (α1G HEK293 세포) 및 도 5b (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 T-형 칼슘 채널 게이트 활성-비활성 비교 그래프.
도 7a (α1G HEK293 세포)는 70 mM KCl 처리로 칼슘 유입에 변화가 없는 대조군의 그래프이고, 도 7b (Kir2.1+α1G HEK293 세포)는 70 mM KCl 처리로 T-형 칼슘 채널이 활성화되어 칼슘 유입이 있음을 제시하는 그래프.
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> HEK293 Cell Line for Activity Studies and HTS System of Alpha 1G
T-Type Ca2+ Channel
<160> 4
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<221> CDS
<222> (1)..(1281)
<400> 1
atg ggc agt gtg cga acc aac cgc tac agc atc gtc tct tca gaa gaa 48
Met Gly Ser Val Arg Thr Asn Arg Tyr Ser Ile Val Ser Ser Glu Glu
1 5 10 15
gac ggt atg aag ttg gcc acc atg gca gtt gca aat ggc ttt ggg aac 96
Asp Gly Met Lys Leu Ala Thr Met Ala Val Ala Asn Gly Phe Gly Asn
20 25 30
ggg aag agt aaa gtc cac acc cga caa cag tgc agg agc cgc ttt gtg 144
Gly Lys Ser Lys Val His Thr Arg Gln Gln Cys Arg Ser Arg Phe Val
35 40 45
aag aaa gat ggc cac tgt aat gtt cag ttc atc aat gtg ggt gag aag 192
Lys Lys Asp Gly His Cys Asn Val Gln Phe Ile Asn Val Gly Glu Lys
50 55 60
ggg caa cgg tac ctc gca gac atc ttc acc acg tgt gtg gac att cgc 240
Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Asp Ile Phe Thr Thr Cys Val Asp Ile Arg
65 70 75 80
tgg cgg tgg atg ctg gtt atc ttc tgc ctg gct ttc gtc ctg tca tgg 288
Trp Arg Trp Met Leu Val Ile Phe Cys Leu Ala Phe Val Leu Ser Trp
85 90 95
ctg ttt ttt ggc tgt gtg ttt tgg ttg ata gct ctg ctc cat ggg gac 336
Leu Phe Phe Gly Cys Val Phe Trp Leu Ile Ala Leu Leu His Gly Asp
100 105 110
ctg gat gca tcc aaa gag ggc aaa gct tgt gtg tcc gag gtc aac agc 384
Leu Asp Ala Ser Lys Glu Gly Lys Ala Cys Val Ser Glu Val Asn Ser
115 120 125
ttc acg gct gcc ttc ctc ttc tcc att gag acc cag aca acc ata ggc 432
Phe Thr Ala Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gly
130 135 140
tat ggt ttc aga tgt gtc acg gat gaa tgc cca att gct gtt ttc atg 480
Tyr Gly Phe Arg Cys Val Thr Asp Glu Cys Pro Ile Ala Val Phe Met
145 150 155 160
gtg gtg ttc cag tca atc gtg ggc tgc atc atc gat gct ttc atc att 528
Val Val Phe Gln Ser Ile Val Gly Cys Ile Ile Asp Ala Phe Ile Ile
165 170 175
ggc gca gtc atg gcc aag atg gca aag cca aag aag aga aac gag act 576
Gly Ala Val Met Ala Lys Met Ala Lys Pro Lys Lys Arg Asn Glu Thr
180 185 190
ctt gtc ttc agt cac aat gcc gtg att gcc atg aga gac ggc aag ctg 624
Leu Val Phe Ser His Asn Ala Val Ile Ala Met Arg Asp Gly Lys Leu
195 200 205
tgt ttg atg tgg cga gtg ggc aat ctt cgg aaa agc cac ttg gtg gaa 672
Cys Leu Met Trp Arg Val Gly Asn Leu Arg Lys Ser His Leu Val Glu
210 215 220
gct cat gtt cga gca cag ctc ctc aaa tcc aga att act tct gaa ggg 720
Ala His Val Arg Ala Gln Leu Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ser Glu Gly
225 230 235 240
gag tat atc cct ctg gat caa ata gac atc aat gtt ggg ttt gac agt 768
Glu Tyr Ile Pro Leu Asp Gln Ile Asp Ile Asn Val Gly Phe Asp Ser
245 250 255
gga atc gat cgt ata ttt ctg gtg tcc cca atc act ata gtc cat gaa 816
Gly Ile Asp Arg Ile Phe Leu Val Ser Pro Ile Thr Ile Val His Glu
260 265 270
ata gat gaa gac agt cct tta tat gat ttg agt aaa cag gac att gac 864
Ile Asp Glu Asp Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ser Lys Gln Asp Ile Asp
275 280 285
aac gca gac ttt gaa atc gtg gtc ata ctg gaa ggc atg gtg gaa gcc 912
Asn Ala Asp Phe Glu Ile Val Val Ile Leu Glu Gly Met Val Glu Ala
290 295 300
act gcc atg acg aca cag tgc cgt agc tct tat cta gca aat gaa atc 960
Thr Ala Met Thr Thr Gln Cys Arg Ser Ser Tyr Leu Ala Asn Glu Ile
305 310 315 320
ctg tgg ggc cac cgc tat gag cct gtg ctc ttt gaa gag aag cac tac 1008
Leu Trp Gly His Arg Tyr Glu Pro Val Leu Phe Glu Glu Lys His Tyr
325 330 335
tac aaa gtg gac tat tcc agg ttc cac aaa act tac gaa gtc ccc aac 1056
Tyr Lys Val Asp Tyr Ser Arg Phe His Lys Thr Tyr Glu Val Pro Asn
340 345 350
act ccc ctt tgt agt gcc aga gac tta gca gaa aag aaa tat atc ctc 1104
Thr Pro Leu Cys Ser Ala Arg Asp Leu Ala Glu Lys Lys Tyr Ile Leu
355 360 365
tca aat gca aat tca ttt tgc tat gaa aat gaa gtt gcc ctc aca agc 1152
Ser Asn Ala Asn Ser Phe Cys Tyr Glu Asn Glu Val Ala Leu Thr Ser
370 375 380
aaa gag gaa gac gac agt gaa aat gga gtt cca gaa agc act agt acg 1200
Lys Glu Glu Asp Asp Ser Glu Asn Gly Val Pro Glu Ser Thr Ser Thr
385 390 395 400
gac acg ccc cct gac ata gac ctt cac aac cag gca agt gta cct cta 1248
Asp Thr Pro Pro Asp Ile Asp Leu His Asn Gln Ala Ser Val Pro Leu
405 410 415
gag ccc agg ccc tta cgg cga gag tcg gag ata tga 1284
Glu Pro Arg Pro Leu Arg Arg Glu Ser Glu Ile
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<213> human being
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<211> 29
<212> DNA
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<220>
<223> primer
<400> 4
ccggaattct catatctccg attctcgcc 29
Claims (4)
- 레트로바이러스 발현 시스템을 이용하여 α1G T-형 칼슘 채널이 안정적으로 발현되는 HEK293 세포를 인간 Kir2.1 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킨 세포주.
- 제1항에 있어서, 고농도 KCl 처리에 의해 T-형 칼슘 채널이 활성화되는 세포주.
- 제1항에 있어서, 상기 플라스미드가 도 2의 pMSCVpuro 플라스미드인 세포주.
- 제1항에 있어서, 기탁번호 KCTC 10519BP의 세포주.
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