JP2001517682A

JP2001517682A - 喘息および関連疾患を含むアトピー性アレルギーを治療するための標的としての喘息関連因子

Info

Publication number: JP2001517682A
Application number: JP2000512948A
Authority: JP
Inventors: ジャン−クリストファレナウルド，; ジャミラローアヘッド，; ロイレヴィト，; ニコラスニコライデス，; クードン，
Original assignee: マガイニンファーマシューティカルズインク．; ルドヴィクインスティテュートフォーキャンサーリサーチ
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-18
Publication date: 2001-10-09
Also published as: US20030166150A1; WO1999015656A2; WO1999015656A3; AU760274B2; CA2302936A1; AU9490698A; EP1025223A2

Abstract

(57)【要約】ＩＬ−９によって誘導され、したがってＩＬ−９が媒介するアトピー性アレルギー、喘息関連疾患およびある種のリンパ腫または白血病の発症における治療標的となる、Ｇ共役タンパク質受容体ファミリーの新しい遺伝子が記載される。その遺伝子によってコードされるポリペプチドの組換え生産法を開示する。アトピー性アレルギー、喘息関連疾患およびある種のリンパ腫または白血病を治療するためのＧＣＲ９のアゴニストとアンタゴニストの同定法と使用法も含まれる。生物学的試料中のＧＣＲ９の濃度をＧＣＲ９ポリペプチドに特異的な抗体、またはＧＣＲ９核酸に特異的な核酸プローブを用いて測定することにより、アトピー性アレルギー、喘息関連疾患およびある種のリンパ腫または白血病への罹病性を診断する方法、またはそれらの治療を評価する方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の相互参照）本願は１９９７年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／０５９，５
１０号の利益を主張する。本発明は、いずれも１９９６年８月２３日に出願され
引用により本明細書に援用される米国特許出願第０８／６９７，４１９号、同第
０８／６９７，３６０号、同第０８／６９７，４７３号、同第０８／６９７，４
７２号、同第０８／６９７，４７１号、同第０８／７０２，１０５号、同第０８
／７０２，１１０号、同第０８／７０２，１６８号、同第０８／６９７，４４０
号および同第０８／８７４，５０３号の主題に関係する。本願は、１９９６年１
２月２日に出願され引用により本明細書に援用される米国仮特許出願第６０／０
３２，２２４号にも関係する。

【０００２】

【発明の属する技術分野】

本発明は、喘息などのアトピー性アレルギーとその関連疾患を治療するために
ＩＬ−９経路に関係する活性を調節することに関する。また、癌を治療するため
のＩＬ−９経路の阻害にも関する。

【０００３】

【従来の技術】

炎症は身体の防御システムが異物と戦う複雑な過程である。この異物に対する
戦いは生体の生存にとって必要だといえるが、一部の防御システムは異物に対し
て、無害なものにさえ危険なものとして反応し、そうすることによって、その結
果起こる戦いのなかで周囲の組織を損傷する。

【０００４】アトピー性アレルギー（アトピー）は、遺伝的背景が花粉、食品、羽毛および
昆虫毒などといった環境中の刺激物質に対する反応を指示する環境遺伝学的疾患
である。一般に、この疾患は、どこにでもある抗原に反応してＩｇＥ抗体を産生
するリンパ球の能力が増加していることを特徴とする。これらの抗原による免疫
系の活性化はアレルギー性炎症をもたらし、摂食、皮膚を通した浸透、または吸
入後に起こりうる。この免疫活性化が起こり、それが肺の炎症と気管支の反応性
亢進を伴う場合、その疾患は一般に喘息と特徴づけられる。この炎症反応にはあ
る種の細胞が不可欠であり、それらにはＴ細胞と抗原提示細胞、ＩｇＥを産生す
るＢ細胞、およびＩｇＥを結合する好塩基球と好酸球が含まれる。好酸球の気道
浸潤は、気道上皮への損傷をもたらす喘息の顕著な特徴である。好酸球と気管支
反応性亢進の関係を裏付ける証拠はかなり存在する（Ｄｅｖｏｓら，１９９５）
。したがって、細胞動員シグナリングカスケードの阻害による気道上皮での好酸
球蓄積の予防は、喘息治療用の潜在的抗炎症剤の治療標的となる。

【０００５】喘息は一般に気道の炎症性疾患と定義されるが、その臨床症状は間欠性の気流
阻害から生じる。これは日常生活に支障をきたす慢性の障害該で、その罹患率と
重篤度は増しつつあると思われる（Ｇｅｒｇｅｎら，１９９２）。全住民の３０
〜４０％がアトピー性アレルギーを患い、全住民のうち小児の１５％、成人の５
％が喘息を患っていると見積もられている（Ｇｅｒｇｅｎら，１９９２）。この
ように我々の健康医療財源には莫大な負荷がかかっている。

【０００６】興味深いことに、ほとんどの人々がよく似た環境への曝露を経験するのだが、
アトピー性アレルギーと喘息を発症するのはある特定の人々に過ぎない。「アト
ピー」として知られるこの環境アレルゲンへの過敏症は、多くの場合、非アトピ
ー患者と比較してアトピー患者では血清ＩｇＥレベルが上昇していることや、ア
レルゲンに対する皮膚試験反応が異常に強いことによって示される（Ｍａｒｓｈ
ら，１９８２）。アトピー性アレルギーと喘息の密接な関係を示す有力な証拠は
、ほとんどの喘息患者がアトピーの臨床的、血清学的証拠を有するという事実か
ら導かれる（Ｃｌｌｉｆｏｒｄら，１９８７；Ｇｅｒｇｅｎ，１９９１；Ｂｕｒ
ｒｏｗｓら，１９９２；Ｊｏｈａｎｎｓｏｎら，１９７２；Ｓｅａｒｓら，１９
９１；Ｈａｌｏｎｅｎら，１９９２）。とくに、若い喘息患者ほどアトピーの罹
患率が高い（Ｍａｒｓｈら，１９８２）。また、総血清ＩｇＥレベルの増加に関
係する免疫学的因子類は損なわれた肺機能に極めて密接に関係する（Ｂｕｒｒｏ
ｗｓら，１９８９）。

【０００７】これらの疾患の診断と治療はどちらにも問題が多い（Ｇｅｒｇｅｎら，１９９
２）。炎症を起こした肺組織の評価は困難なことが多く、その炎症源を特定でき
ないことがしばしばある。気道炎症源に関する知見と、１または複数の刺激性外
来環境物質からの保護がなければ、その炎症過程を妨げることはできない。肺炎
症制御の失敗が徐々に肺機能の重大な喪失をもたらすということは、現在では一
般に受け入れられている。

【０００８】現行の治療法にはそれぞれに一連の欠点がある。主な治療薬であるβアゴニス
ト（作動薬）は症状を軽減することによって肺機能を一時的に改善するが、根底
にある炎症には作用しないので、肺組織は危険な状態のままである。また、βア
ゴニストの常用は脱感作をもたらし、それによって効力と安全性が低下する（Ｍ
ｏｌｉｎｏｆｆら，１９９５）。根底にある炎症を減少させうる薬剤、抗炎症性
ステロイド類は、それぞれに免疫抑制から骨の消失に及ぶ一連の欠点を有してい
る（Ｍｏｌｉｎｏｆｆら，１９９５）。

【０００９】従来の治療法には様々な問題が伴うので、代替的治療法の評価が行なわれてい
る。グリコフォリンＡ（Ｃｈｕら，１９９２）、シクロスポリン（Ａｌｅｘａｎ
ｄｅｒら，１９９２；Ｍｏｒｅｌｙ，１９９２）、インターロイキン２（ＩＬ−
２）のノナペプチド断片（Ｚａｖｙａｌｏｖら，１９９２）は、すべて、ホメオ
スタシスに関係する潜在的に重要な免疫機能を阻害する。当該技術分野で必要と
されているのは、根底をなす病因に対処する喘息の治療法である。さらにまた、
それらの治療法はこの疾患の挿間性およびアレルギーとの密接な関係に対処し、
かつ、重要な免疫機能の下流に介入するものでなければならない。

【００１０】上記の関連特許出願では、インターロイキン９（ＩＬ−９）、その受容体、お
よびＩＬ−９によって達成される活性が、喘息とその関連疾患を含むアトピー性
アレルギーにおける治療的介入にとって好適な標的であることを証明した。ここ
に本出願人は、アトピー性アレルギー、喘息およびある種のリンパ腫で重要な関
連遺伝子と、治療的介入のためにこれらの遺伝子を調節する方法を開示する。

【００１１】アレルゲンによるマスト細胞からの媒介物質の放出は、古くから、アレルギー
における決定的な誘発事象であるとみなされてきた。ＩＬ−９は、元々はマスト
細胞成長因子として同定されたものであり（Ｓｃｈｍｉｔｔら，１９８９）、先
に本出願人は、ＩＬ−９がＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−４（Ｇｏｄｆｒａ
ｉｎｄら，１９９８）とグランザイムＢ（Ｌｏｕａｈｅｄら，１９９５）を含む
マスト細胞プロテアーゼ類の発現をアップレギュレートするらしいことを証明し
た。このようにＩＬ−９はマスト細胞の増殖と分化にある役割を果たしうる。さ
らにまたＩＬ−９は高親和性ＩｇＥ受容体のアルファ鎖の発現をアップレギュレ
ートする（Ｌｏｕａｈｅｄら，１９９５）。上昇したＩｇＥレベルは、アトピー
性アレルギーの顕著な特徴であり、喘息の危険因子であるとみなされている。さ
らに、ＩＬ−９が感作Ｂ細胞からのＩｇＥの放出を強化することは、インビトロ
試験とインビボ試験の両方で示されている（Ｄｕｇａｓら，１９９３；Ｐｅｔｉ
ｔ−Ｆｒｅｒｅら，１９９３）。

【００１２】上に挙げた関連特許に提示したデータによると、喘息におけるＩＬ−９遺伝子
候補の裏付けはかなりある。まず本出願人は、ヒトとマウスの間の連鎖相同性を
証明するが、これは同じ遺伝子が、両方の種で、抗原に対する反応の生物学的変
動性を生む原因になっていることを示唆する。第二に、マウスＩＬ−９候補遺伝
子の発現量の相違は気管支反応性の生物学的変動性と相関した。具体的に述べる
と、機能の喪失は、Ｂ６マウスにおけるベースライン気管支反応の低下と相関し
ている。第三に、ヒトから得られたデータにおける連鎖不平衡を示す最近の証拠
は、両種におけるこの遺伝子の役割と合致して、ＩＬ−９がアトピーおよび気管
支反応性亢進と相関しうることを示唆している（Ｄｏｕｌｌら，１９９６）。さ
らに本出願人は、このヒト遺伝子の遺伝子変異がサイトカイン機能の喪失および
ＩｇＥレベルの低下と相関するらしいことを証明した。第四に、アレルギー性免
疫反応におけるこのサイトカインとその受容体の多面的機能は、喘息の複雑な病
因におけるＩＬ−９経路の役割を強く裏付けるものである。第五に、ヒトでは、
ＩＬ−９受容体の生物学的変動性も、アトピー性アレルギーおよび喘息と相関す
るようである。最後に、ＩＬ−９受容体機能の遺伝的欠損にもかかわらず、それ
らの個体はその他の点では健康であるように見える。このように自然は、ＩＬ−
９およびＩＬ−９受容体遺伝子またはＩＬ−９とその受容体によって活性化され
る遺伝子の治療的ダウンレギュレーションが安全であるらしいことを、アトピー
患者で証明してきた。

【００１３】ＩＬ−９のアトピー性疾患との関係と同等に重要なことは、その細胞増殖およ
び細胞分化との関係である。ＩＬ−９は当初、Ｔヘルパー細胞の増殖を促進する
その能力についても特徴づけられた（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅら，１９８８）。続
いて、造血系および神経系前駆細胞の分化と増殖、ならびにマスト細胞の分化を
含む、いくつかの他の活性がＩＬ−９に帰された（Ｒｅｎａｕｌｄら，１９９５
）。また、ヒトとマウス両方の腫瘍形成にＩＬ−９が関与するという証拠もいく
つかある（Ｖｉｎｋら，１９９３）。ＩＬ−９の過剰発現は、インビボでＴ細胞
リンパ腫への高い罹病率と関連付けられており、オートクリンＩＬ−９ループが
いくつかのヒトホジキンリンパ腫で特徴づけられている（Ｒｅｎａｕｌｄら，１
９９４；Ｍｅｒｚら，１９９１）。したがってＩＬ−９はＴ細胞白血病や菌状息
肉症を含むＴ細胞起源の他の新生物にも関与するように思われる。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】

このように、ＩＬ−９遺伝子、その受容体およびそれらの機能がアトピー性ア
レルギー、喘息、細胞増殖、トランスフォーメーションおよび腫瘍形成といかに
関係するかは、当該技術分野では現在理解されている。したがって、当該技術分
野には、ＩＬ−９によって調節される遺伝子のこれらの疾患の病因における役割
を解明するという具体的必要がある。さらに最も重要なことに、これらの疾患を
治療するために、この知識に基づいて、これら遺伝子またはそれらの遺伝子産物
の活性を調節できる薬剤を同定する必要がある。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本出願人は、７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体ファミリーから、ＩＬ−９
によって選択的にアップレギュレートされ、したがってＩＬ−９シグナリング経
路の一部であるＧＣＲ９と命名された新しい遺伝子を同定した。

【００１６】第一の実施の形態として本発明は、ヒトＧＣＲ９または機能的に有効なその断
片をコードするヌクレオチド配列を有する精製および単離されたＤＮＡ分子を提
供する。

【００１７】さらに本発明は、ヒトＧＣＲ９または機能的に有効なその断片を含んでなるア
ミノ酸配列を有する精製および単離されたタンパク質分子を提供する。

【００１８】第二の実施の形態として本発明は、マウスＧＣＲ９または機能的に有効なその
断片をコードするヌクレオチド配列を有する精製および単離されたＤＮＡ分子を
提供する。

【００１９】さらに本発明は、マウスＧＣＲ９または機能的に有効なその断片を含んでなる
アミノ酸配列を有する精製および単離されたタンパク質分子を提供する。

【００２０】機能的に有効な断片としては、例えばコグネイトリガンドに結合するＧＣＲ９
のドメインや、ＧＣＲ９依存的な生理学的シグナル伝達機序を惹起するドメイン
などがあるが、これらに限るわけではない。

【００２１】本出願人は、アトピー性アレルギー、喘息およびある種のリンパ腫または白血
病の診断と治療の必要を、これらの疾患の病因におけるＧＣＲ９の役割を証明す
ることによって満たした。これらの疾患の治療法は、ＩＬ−９経路の一員として
のＧＣＲ９のダウンレギュレーションから導かれる。

【００２２】ＧＣＲ９の同定はその活性をダウンレギュレートできる化合物の発見につなが
った。したがって、本発明ではＧＣＲ９をダウンレギュレートする分子を特許請
求する。ダウンレギュレーションとは、ここでは、ＧＣＲ９、そのリガンドまた
は活性化因子の活性化、機能または合成の減少と定義される。これはさらに、Ｇ
ＣＲ９、そのリガンドまたは活性化因子の分解の増加と定義される。さらにこれ
は、その受容体の細胞表面からの除去、またはその受容体の二次エフェクター（
例えばＧタンパク質、イオンチャネル、ヌクレオチドシクラーゼ、ホスホリパー
ゼ、ホスホジエステラーゼなど）からの脱共役とも定義される。したがって、ダ
ウンレギュレーションは、いくつかの方法で達成される。例えば、ＧＣＲ９のそ
のリガンドとの結合を不安定化させうる分子の投与による。そのような分子には
、例えばＧＣＲ９遺伝子のＤＮＡ配列またはこの遺伝子の様々な突然変異を含む
ＤＮＡ配列によってコードされるものなどのポリペプチド産物が包含される。そ
れらの突然変異はＧＣＲ９遺伝子の点変異、挿入、欠失またはスプライス変異な
どでありうる。本発明は、上述のＤＮＡ分子によってコードされる切断型ポリペ
プチドも包含する。これらのポリペプチドは、ＧＣＲ９のそのリガンドおよび他
のタンパク質との相互作用に干渉する能力をもつ。

【００２３】本発明のさらなる実施の形態として、ＧＣＲ９遺伝子の発現を変化させること
によるＧＣＲ９機能のダウンレギュレーションがあり、アンチセンス治療の使用
がその一例である。ＧＣＲ９発現のダウンレギュレーションは、有効量のアンチ
センスオリゴヌクレオチドを投与することによって達成される。これらのアンチ
センス分子は、ＧＣＲ９遺伝子のＤＮＡ配列または様々な突然変異、欠失、挿入
またはスプライス変異を含む配列から作ることができる。本発明のもう一つの実
施の形態は、ＧＣＲ９遺伝子から誘導される単離されたＲＮＡまたはＤＮＡ配列
の使用に関する。これらの配列は、ＧＣＲ９遺伝子の点変異、挿入、欠失または
スプライス変異などといった様々な変異を含有し、遺伝子治療に役立ちうる。

【００２４】さらに本発明は、ＧＣＲ９とそのリガンドとの相互作用を遮断するために十分
な親和性で結合するのに要求される必要な三次元構造を有する小分子を包含する
。ＧＣＲ９活性のダウンレギュレーションをもたらすＧＣＲ９遮断、カルシウム
フラックスおよびＧＣＲ９が発現される炎症誘発細胞の他の過程は、これらの分
子を、アトピー性アレルギー、喘息および関連疾患に伴う炎症の治療に役立つも
のにする。これら同一の分子によるＧＣＲ９遮断は、それらをある種のリンパ腫
または白血病の治療にも役立つものにする。

【００２５】さらなる実施の形態として、アミノステロール化合物がＩＬ−９または抗原に
よるＧＣＲ９誘導を抑制することが明らかになり、したがってそれらの化合物は
アトピー性アレルギー、喘息およびある種のリンパ腫または白血病の治療に役立
つ。さらにもう一つの実施の形態として、ＧＣＲ９の下流にある活性化経路を遮
断する阻害剤がＩＬ−９経路をダウンレギュレートすることが明らかになり、し
たがってそれら阻害剤もアトピー性アレルギー、喘息およびある種のリンパ腫ま
たは白血病の治療に使用できる。

【００２６】上述の産物は、アトピー性アレルギー、喘息およびある種のリンパ腫または白
血病の治療に有効な種々の治療薬になる。本出願人は、ＧＣＲ９をダウンレギュ
レートできるアンタゴニストと、それらアンタゴニストの同定方法を提供した。
本出願人は、切断型タンパク質産物、アミノステロール類などを投与することに
よってＧＣＲ９活性をダウンレギュレートする方法も提供する。

【００２７】また本出願人は、ＧＣＲ９、その機能または下流の活性の誘導を測定する方法
を述べることにより、アトピー性アレルギー、喘息およびある種のリンパ腫また
は白血病への罹病性を診断する方法も提供する。さらなる実施の形態として、本
出願人は、アトピー性アレルギー、喘息およびある種のリンパ腫または白血病の
治療を追跡する手段としてＧＣＲ９ダウンレギュレーションの効果をモニターす
るための方法を提供する。

【００２８】

【発明の実施の形態】

本出願人は、ここでＧＣＲ９と呼ぶＩＬ−９経路中の遺伝子を解明し、アトピ
ー性アレルギー、喘息およびある種のリンパ腫または白血病の診断、予防または
治療に使用できる、その経路に影響を及ぼす組成物を同定することにより、当該
技術分野の必要を満たした。喘息は、可逆的な気流閉塞を伴う気道の炎症性疾患
を包含する。アトピー性アレルギーとは、喘息、気管支反応性亢進、鼻炎、じん
ま疹、腸のアレルギー性炎症性疾患および様々な形の湿疹を含むアトピーとその
関連疾患を指す。アトピーは、対照群と比較したときの血清ＩｇＥの上昇または
アレルゲンに対する異常な皮膚試験反応として表される環境アレルゲンへの過敏
症である。気管支反応性亢進とは、ここでは、様々な刺激に対する増進した気管
支収縮反応と定義される。

【００２９】ＧＣＲ９のマウスおよびヒトｃＤＮＡが単離された。マウス（図１）およびヒ
ト（図１０）ＧＣＲ９遺伝子はどちらも３３０アミノ酸タンパク質をコードする
。マウスＧＣＲ９アミノ酸配列はヒト配列と８０％以上の同一性を示す。マウス
ＧＣＲ９の構造を分析すると、多くのＧタンパク質共役受容体と有意な相同性が
認められる（図２）。配列分析により、ＧＣＲ９はプリン受容体ファミリーと最
も高い相同性を有することが示された。ヒトおよびマウスＧＣＲ９の最も大きい
細胞外ドメインは、染色体１９ｑ１３．３上のいくつかのＧタンパク質共役オー
ファン受容体（Ｓａｗｚｄａｒｇｏら、１９９７）およびニワトリ由来のＴ細胞
中のＩＬ−２誘導性Ｇタンパク質共役受容体（Ｋａｐｌａｎら，１９９３）と有
意な相同性を示した。ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで相同性を示すＧタン
パク質共役受容体ファミリーの他のメンバーであってより遠い関係にあるものに
は、トロンビン受容体と血小板活性化因子がある。

【００３０】ヒトＧＣＲ９遺伝子は、雑種細胞マッピングにより、マウス第７染色体とシン
テニックである第１９染色体の長腕上に同定された。マウスとヒトのＧＣＲ９遺
伝子はどちらも、図１と１０にΔで示す、開始コドンの上流に１．２キロ塩基長
のイントロンを含有する。ヒトＧＣＲ９遺伝子のヌクレオチド配列は、第１９染
色体上で近接する他の遺伝子の配列、特にＧＰＲ４０（４４％）、ＧＰＲ４１（
５４％）およびＧＰＲ４２（５４％）と、多少の相同性を示した。アトピー性疾
患におけるＧＣＲ９の役割は、喘息で重要な染色体１９ｑ１３近くの遺伝子座を
記述する遺伝子連鎖試験によってさらに裏付けられる（喘息の遺伝学に関する共
同研究−人種的に多様な集団における喘息罹病性遺伝子座の全ゲノム検索、１９
９７、ＴｈｅＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＧｅ
ｎｅｔｉｃｓｏｆＡｓｔｈｍａ−ＡＧｅｎｏｍｅｗｉｄｅＳｅａｒｃ
ｈｆｏｒＡｓｔｈｍａＳｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙＬｏｃｉｉｎ
ＥｔｈｎｉｃａｌｌｙＤｉｖｅｒｓｅＰｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ，１９７７）
。このように、近接遺伝子における生物学的変動性は、喘息反応の一因に貢献す
るに違いない。

【００３１】したがって本発明は、マウス（図１）またはヒト（図１０）ＧＣＲ９もしくは
その断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる精製および単離された核酸
配列を提供する。本発明は、前記ＤＮＡの縮重配列および実質的に相同な配列も
包含する。本発明はどの供給源に由来するＧＣＲ９でも包含するが、ここに例示
する本発明ＧＣＲ９の供給源はマウスとヒトである。本核酸分子またはその断片
は、当該技術分野で公知の方法を使って合成できる。また、遺伝子操作法により
、任意の一般に認められた手法でＤＮＡを構築し、そのＤＮＡを発現媒体にクロ
ーニングし、該媒体を細胞にトランスフェクトする（該細胞は本化合物を発現さ
せることになる）ことによって、化合物を生産することもできる。（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８５を参照）。

【００３２】本発明の核酸分子には、それぞれ配列番号１と配列番号３の配列を有するマウ
スおよびヒトＧＣＲ９をコードするポリヌクレオチドと、それらの配列に相補的
な全ての核酸配列が含まれる。相補配列はアンチセンスヌクレオチドを含みうる
。

【００３３】また、ＧＣＲ９の全部または一部をコードするポリヌクレオチドは、それらが
ここに記載するようなＧＣＲ９の機能的活性を有するポリペプチドをコードする
限り、すべてここに含まれると解される。本発明のポリヌクレオチド配列にはＧ
ＣＲ９をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる
。そのようなポリヌクレオチドには天然ポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチ
ドおよび意図的に操作されたポリヌクレオチドも含まれる。例えばそのようなポ
リヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡ（天然のイントロンを含んでも含まなくても
よい）を含んでよい。また、そのようなゲノムＤＮＡを、プロモーター領域また
はポリアデニル化配列と共に得ることもできる。もう一つの例として、選択的Ｒ
ＮＡスプライシング（alternate RNA splicing）様式により、またはＲＮＡ転写
に代替プロモーターを使用することにより、ｍＲＮＡ配列の一部が改変されても
よい。さらにもう一つの例として、ＧＣＲ９ポリヌクレオチドを部位特異的突然
変異誘発にかけてもよい。

【００３４】さらに、本発明のポリヌクレオチドには、遺伝コードの結果として縮重した配
列が含まれる。２以上のヌクレオチドトリプレットが同じアミノ酸をコードする
ので、遺伝コードは縮重しているといわれる。天然アミノ酸は２０種類あり、そ
のほとんどは２以上のコドンによって指定される。遺伝コードの縮重の結果、多
数のヌクレオチド配列（その一部は配列番号１と配列番号３のヌクレオチド配列
に対して最小のヌクレオチド配列相同性を有する）を本発明の結果として作りう
ることは、当業者には理解されるだろう。したがって、縮重ヌクレオチド配列は
、そのヌクレオチド配列によってコードされるＧＣＲ９ポリペプチドのアミノ酸
配列が機能的に変わらないか、その機能が実質上類似する限り、すべて本発明に
含まれる。本発明は、配列番号１および配列番号３に適用されるような標準的ト
リプレット遺伝コードに従ってなされる可能なアミノ酸およびコドン選択に基づ
いた組合せを選択することによって作ることのできるペプチドまたはヌクレオチ
ド配列の考え得る変異体をいずれもすべて具体的に考慮しており、そのような変
異体はすべてここに具体的に開示したものとみなされる。

【００３５】また、ここに開示する配列の断片（部分、区分）であって、配列番号１および
配列番号３の配列に選択的にハイブリダイズするものも本発明に含まれる、本明
細書で用いる選択的ハイブリッド形成とは、関連するヌクレオチド配列を無関係
なヌクレオチド配列と区別するストリンジェントな条件（Ｍａｎｉａｔｉｓら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓ
ｓ，１９８９を参照）でのハイブリッド形成を指す。ｍＲＮＡとＤＮＡのコーデ
ィング鎖に相補的な本発明の活性断片は、通常少なくとも約１５ヌクレオチドで
あり、より通常には少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは３０ヌクレオチド
であって、５０ヌクレオチド以上がより好ましいかもしれない。

【００３６】本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリッド形成が明瞭
で判読可能な配列を与える条件である。ストリンジェントな条件は、（１）洗浄
に低イオン強度と高温（例えば５０℃で、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０
０１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ緩衝液）を使用するか、（２）ハ
イブリッド形成中にホルムアミドなどの変性剤（例えば４２℃で、５０％ホルム
アミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニ
ルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、７５０ｍＭ塩
化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用するものである。もう一つ
の例は、４２℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処
理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキス
トラン硫酸を使用し、洗浄を０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中４２℃で行
うことである。当業者は、明瞭で検出可能なハイブリッド形成シグナルを得るの
に適したストリンジェンシー条件を容易に決定、変更できる。

【００３７】本発明は、配列番号１または配列番号３のいずれかに相補的な配列を含んでな
る核酸分子に十分なストリンジェンシーの条件でハイブリダイズして明瞭なシグ
ナルを与える、ＧＣＲ９タンパク質をコードする核酸分子を提供する。本明細書
で用いる「核酸」は、ＧＣＲ９ペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡと、そ
れらのペプチドをコードする核酸に相補的であるＲＮＡまたはＤＮＡと、それら
の核酸にハイブリダイズしてストリンジェントな条件でそれらに安定に結合した
ままであるＲＮＡまたはＤＮＡと、ＧＣＲ９ペプチド配列と少なくとも６０％の
配列同一性、好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは少なく
とも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡ
として定義される。また本発明の核酸には、配列番号１のオープンリーディング
フレームと、または配列番号３に対して、少なくとも６０％または７０％の配列
同一性を有する、好ましくは配列番号１のオープンリーディングフレームと、ま
たは配列番号３に対して、少なくとも８０または８５％の配列同一性を有する、
より好ましくは配列番号１のオープンリーディングフレームと、または配列番号
３に対して、９０％、９１％、９５％または９７％の配列同一性を有するヌクレ
オチド配列を含んでなる核酸分子も含まれる。

【００３８】相同性や同一性は、ＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎ
ｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）分析により、配列類似性検索用に作られたプログ
ラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘ（Ｋａ
ｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４
−２２６８（１９９０）とＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．
３６：２９０−３００（１９９３）；これらは引用により本明細書に完全に援用
される）で使用されているアルゴリズムを使って決定される。ＢＬＡＳＴプログ
ラムが使用する手法は、まず質問配列とデータベース配列の間の類似区間を考慮
し、次に、確認された全ての一致の統計的有意性を評価し、最後に、前もって選
択した有意性の閾値を満たす一致だけを要約するというものである。配列データ
ベースの類似性検索に関する基本的問題の議論については、引用により本明細書
に完全に援用されるＡｌｔｓｃｈｕｌらの文献（ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃ
ｓ６：１１９−１２９（１９９４）を参照。ｈｉｓｔｏｇｒａｍ、ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ、ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ、ｅｘｐｅｃｔ（すなわちデータベース
配列に対する一致を報告するための統計的有意性閾値）、ｃｕｔｏｆｆ、ｍａｔｒｉｘおよびｆｉｌｔｅｒに関する検索パラメータはデフォルトの設定通りであ
る。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘで使用
されるデフォルトのスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリック
ス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
９：１０９１５−１０９１９（１９９２）；これは引用により本明細書に完全に
援用される）である。ｂｌａｓｔｎについては、スコアリングマトリックスがＭ（すなわち一対の一致残基に対する報奨点）のＮ（不一致残基に対する罰則点）
に対する比率によって設定され、ＭとＮのデフォルト値はそれぞれ５と−４であ
る。

【００３９】さらに本発明は、実質的に純粋なＧＣＲ９ポリペプチドを提供する。本明細書
で用いる用語「実質的に純粋」とは、他のタンパク質、脂質、炭水化物またはＧ
ＣＲ９ポリペプチドに天然に付随する他の物質を実質的に含まないＧＣＲ９ポリ
ペプチドを指す。当業者は標準的なタンパク質精製手法を用いてＧＣＲ９を精製
できる。

【００４０】さらに本発明は、ＧＣＲ９ポリペプチドの組換え生産を提供する。関連する側
面として、ＧＣＲ９をコードするＤＮＡ（天然配列の変異体および置換体を含む
）はクローニング媒体に作動可能に連結され、ここに該媒体はプラスミド、コス
ミド、人工染色体またはウイルスベクターもしくはそれら媒体の組合せである［
Ｋｒｅｉｇｌｅｒ（１９９０）を参照］。作動可能に連結されたＤＮＡは原核お
よび／または真核宿主細胞での発現用に細菌プロモーターまたは真核プロモータ
ーおよび／またはエンハンサー配列を含みうる（Ｋｒｅｉｇｌｅｒ，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＡＬａｂｈｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ１９９０，ＭＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ニューヨ
ークとＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１９８９，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングを
参照）。作動可能に連結されたＧＣＲ９をコードするＤＮＡを含んでなるクロー
ニング媒体でトランスフェクションまたは形質転換された宿主細胞はそのポリペ
プチドを生産するために使用でき、その場合、前記細胞はＧＣＲ９を発現させる
のに適した条件で生育され、そのタンパク質が宿主細胞および周囲の栄養分から
分離される［封入体からの精製を含む；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照
］。関連する側面として、転写配列とは、ｍＲＮＡの発現が調節されるようにＲ
ＮＡポリメラーゼを指示する核酸の配列と定義される。本発明はマウスＧＣＲ９
ポリペプチド（配列番号２）とヒトＧＣＲ９ポリペプチド（配列番号４）をコー
ドするアミノ酸配列も提供する。本発明のポリペプチドには保存的変異の結果と
して配列番号２および配列番号４とは異なるものが含まれる。本明細書で用いる
「保存的変異」や「保存的置換」という用語は、あるアミノ酸残基の、生物学的
に類似する別の残基による置換を意味する。保存的変異または置換は、おそらく
そのポリペプチド鎖の形状を変化させないだろう。保存的変異または置換の例と
しては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの疎水性残基の
一つを別の疎水性残基で置換すること、あるいは極性残基の一つを別の極性残基
で置換すること、例えばリジンをアルギニンで、アスパラギン酸をグルタミン酸
で、アスパラギンをグルタミンで置換することなどがある。したがって、すべて
の保存的置換は、そのヌクレオチド配列によってコードされるＧＣＲ９ポリペプ
チドが機能的に無変化であるか類似している限り、本発明に包含される。

【００４１】本明細書で用いる単離されたＧＣＲ９タンパク質は、全長ＧＣＲ９タンパク質
、またはそのようなタンパク質の任意の相同体、例えばアミノ酸が削除（例えば
切断型のタンパク質（ペプチドなど））、挿入、反転、置換および誘導体化（例
えば糖鎖付加、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミト
イル化、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトールの付加などによる）
されているＧＣＲ９タンパク質であることができ、ここに修飾タンパク質は天然
ＧＣＲ９の生理学的特徴を保っているものとする。ＧＣＲ９タンパク質の相同体
は、天然ＧＣＲ９タンパク質アミノ酸配列に十分に類似するアミノ酸配列を有し
ていて、前記相同体をコードする核酸配列が天然ＧＣＲ９タンパク質アミノ酸配
列をコードする核酸配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズできるタン
パク質である。適当なストリンジェンシー要件については上に述べた。

【００４２】ＧＣＲ９タンパク質相同体はＧＣＲ９タンパク質をコードする天然遺伝子の対
立遺伝子変異の結果でありうる。天然遺伝子とは、自然界に最も頻繁に見出され
る形の遺伝子を指す。ＧＣＲ９タンパク質相同体は、例えば古典的手法または組
換えＤＮＡ手法などを用いてタンパク質をコードする遺伝子に直接的修飾を施す
ことによってランダムまたは標的突然変異誘発を達成するなど（ただしこれに限
らない）、当該技術分野で知られている手法を使って生産することができる。

【００４３】ＧＣＲ９一次アミノ酸配列の軽微な修飾は、本明細書の配列番号２と配列番号
４に記載のＧＣＲ９ポリペプチドと比較して実質的に等価な活性を有するタンパ
ク質をもたらしうる。本明細書で用いるＧＣＲ９タンパク質の「機能的等価物」
とは、非組換えまたは天然ＧＣＲ９に特有な生物学的活性または免疫学的特徴と
実質的に類似する生物学的活性または免疫学的特徴を有するタンパク質である。
用語「機能的等価物」は、本発明のＧＣＲ９タンパク質の生物学的活性を有する
断片、変種、類似体、相同体または化学的誘導体を含むものとする。ＧＣＲ９の
生物学的活性は、生理的にＧＣＲ９を作らない細胞を組換えＧＣＲ９を発現する
ようにトランスフェクトして非トランスフェクト細胞と比較した時に観察される
シグナリング特性の刺激、と定義することができ、ここでは各細胞セットをある
化合物と接触させるとトランスフェクト細胞で二次メッセンジャー（例えばｃＡ
ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ²⁺、ＰＩ）の刺激だけが起こる（オーファン受容体に関す
る生理学的シグナル伝達機構の評価については、引用により完全に援用されるＲ
ｙａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）Ｖｏｌ．２７３（２２）：１
３６１３−１３６２４およびＳｔａｂｌｅｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（
１９９７）Ｖｏｌ．２５２（１）：１１５−１２６を参照）。

【００４４】マウスＧＣＲ９プローブは、ＩＬ−９の存在下に培養したマウスサイトカイン
依存性Ｔヘルパー細胞株ＴＳ６およびＳＴ２Ｋ９で、大量の１．８キロベースｍ
ＲＮＡをたやすく検出したが、ＩＬ−２の存在下に培養した同細胞株にはそれを
検出しなかった（図５）。マウス脾細胞でのコンカナバリンＡによるこの遺伝子
の誘導は、この遺伝子がマイトジェンシグナリングにある役割を果たすことを示
唆している。さらにこの遺伝子産物は、トランスジェニック動物でのＩＬ−９の
過剰発現により、インビボの肺および腸で特異的に誘導される（Ｇｏｄｆｒａｉ
ｎｄら，１９９８）。さらにこのデータから、これらの器官、とりわけＩＬ−９
とその受容体の構造または機能の生物学的変動性が喘息と関連疾患を含むアトピ
ー性アレルギーの病態生理にある役割を担うところで、ＧＣＲ９がＩＬ−９によ
って特異的に誘導され、ある役割を果たすことが確認される。

【００４５】気管支反応性亢進、喘息および関連疾患を含むアトピー性アレルギーの病因に
おけるＧＣＲ９の役割を明らかにする証拠は、ＩＬ−９がＧＣＲ９を選択的に誘
導するという本出願人の観察から直接導かれる。このように、いくかの抗原誘導
反応にとって不可欠なＩＬ−９の多面的役割は、部分的に、アトピー性アレルギ
ーに不可欠ないくつかの細胞の生理学にある役割を果たすＧＣＲ９の調節に依存
している。抗原のエアロゾルチャレンジ前に抗体前処置によってＩＬ−９の機能
をダウンレギュレートすると、その動物を抗原誘導反応から完全に保護すること
ができる。これらの反応には気管支反応性亢進、気管支洗浄における細胞数の上
昇と好酸球増加、炎症に伴う肺の組織学的変化、総血清ＩｇＥの上昇が含まれる
。このように、アトピー性アレルギーの病因にとって不可欠であってアトピー性
アレルギーに伴うアレルギー性炎症を特徴づけるこのような反応をＧＣＲ９をダ
ウンレギュレートすることにより治療することは、本発明の範囲に含まれる。

【００４６】本出願人は、ＧＣＲ９が、喘息反応と密接に関係する細胞中で誘導されること
を明らかにした。例えばマウスＧＣＲ９の発現はＩＬ−９で刺激されたＴ細胞（
図５）とＩＬ−９トランスジェニックマウスの胃（図６）で誘導される。組織分
布試験は、ＧＣＲ９がリンパ細網組織を含む他の多くの組織で発現され（図４）
、好酸球やＢ細胞などの喘息に重要な細胞タイプで誘導されるらしいことを示し
ている。ヒトＧＣＲ９は好酸球とマスト細胞中で発現され、ＩＬ−９への曝露に
続いて誘導が起こる（図１２）。好酸球におけるこの誘導は、好酸球が炎症反応
と喘息の両方に関係する一貫した特徴であることから（Ｇｌｅｉｃｈ，１９９０
）、これらの過程におけるＧＣＲ９の役割を確証するものである。したがって、
好酸球とマスト細胞でのＧＣＲ９の遮断による細胞シグナリングカスケードの抑
制による炎症反応の遮断から、喘息の治療法が導かれる。

【００４７】本出願人は、ＩＬ−９、その受容体とＧＣＲ９との間の関係に基づいてアトピ
ー性アレルギーとその関連疾患への罹病性を診断する方法およびそれらの疾患を
治療する方法を教示する。ある診断の形態では、ＧＣＲ９のＤＮＡ配列中の変異
の認識を行なう。当業者には理解されるであろうが、一つの方法として、十分な
ハイブリッド形成条件下に本発明のＧＣＲ９に相補的な配列を有する核酸分子（
プローブとしても知られる）を導入する。ある態様では、その配列がＧＣＲ９の
一つの対立遺伝子またはその断片に特異的に結合することになり、もう一つの態
様では、複数の対立遺伝子に結合することになる。これらの疾患に関係するＤＮ
Ａ配列変異を認識するもう一つの方法は、当該技術分野で周知の複数の方法によ
る直接ＤＮＡ配列分析である（Ｏｔｔ，１９９１）。もう一つの態様では、これ
らの疾患に関係するＧＣＲ９遺伝子中のＤＮＡ配列変異の検出を行なう（Ｓｃｈ
ｗｅｎｇｅｌら，１９９３；Ｓｃｈｅｆｆｉｅｌｄら，１９９３；Ｏｒｉｔａら
，１９８９；Ｓａｒｋａｒら，１９９２；Ｃｏｔｔｏｎ，１９８９）。それらに
はポリメラーゼ連鎖反応、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、一本鎖コンフォメ
ーション分析がある。

【００４８】もう一つの診断の形態では、ある被験者における上昇したＧＣＲ９ポリペプチ
ド濃度が関係する喘息関連疾患とある種のリンパ腫および白血病への罹病性を、
（ａ）その被験者から採取した生物学的試料中のＧＣＲ９ポリペプチドの濃度を
測定し、（ｂ）正常被験者群に存在するＧＣＲ９ポリペプチドの濃度と比較する
という段階によって測定でき、ここで正常濃度と比較した場合のＧＣＲ９ポリペ
プチド濃度の増加は、喘息関連疾患とある種のリンパ腫または白血病に対する素
因を示す。そのようなリンパ腫と白血病には、慢性リンパ球性白血病、大型顆粒
リンパ球白血病、成人広汎性急速進行性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ
細胞白血病、急性リンパ球性白血病、リンパ芽球性リンパ腫がある。

【００４９】もう一つの診断の形態として、被験者における上昇したＧＣＲ９ポリペプチド
濃度に関係する喘息またはある種のリンパ腫もしくは白血病の治療的処置を、治
療的処置を受けている前記被験者から様々な時点で得られる一連の生物学的試料
中のＧＣＲ９ポリペプチドの濃度を測定することによってモニターでき、そこで
該ＧＣＲ９ポリペプチドの濃度の有意な減少は治療的処置の成功を示す。

【００５０】本発明のこのようなアッセイに役立つ診断プローブには、ＧＣＲ９に対する抗
体がある。ＧＣＲ９に対する抗体は、当該技術分野でよく知られている標準的手
法を用いて生産されるモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい（Ｈ
ａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ'ｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８８を参照）。それらは、当該タンパク質への結合と
それに続くその抗体−タンパク質複合体のＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなど
による検出によってＧＣＲ９を検出するために使用できる。これらの抗体を生成
させるために使用するＧＣＲ９は、上述のＧＣＲ９変異体のいずれでもよい。ま
た抗体は当該技術分野の標準的手法を用いてＧＣＲ９のペプチド配列からも生産
される，（ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９４を参照）。遮断抗血清を生産するために使用で
きるマウスＧＣＲ９由来のペプチド配列は、そのタンパク質の細胞外部分を包含
するものであり、ＭＴＰＤＷＨＳＳ（残基１〜８）（配列番号５）；ＲＩＶＥＡ
ＡＳＮＦＲＷＹＬＰＫＩＶＣ（残基６５〜８２）（配列番号６）；ＱＹＬＮＳＴ
ＥＱＶＧＴＥＮＱＩＴＣ（残基１４８〜１６４）（配列番号７）；ＱＶＧＴＥＮ
ＱＩＴＣＹＥＮＦＴＱＥＱＬＤ（残基１５４〜１７４）（配列番号８）；ＣＹＥ
ＮＦＴＱＥＱＬＤＶＶＬＰＶＲＬＥ（残基１６４〜１８２）（配列番号９）およ
びＳＨＬＶＧＦＹＬＲＱＳＰＳＷＲ（残基２４１〜２５５）（配列番号１０）と
同定された。遮断抗血清の生産に役立つであろうヒトＧＣＲ９の細胞外配列から
同定された２つのペプチドはＫＩＩＥＡＡＳＮＦＲＷＹＬＰＫＶＶＣ（残基６５
〜８２）（配列番号１１）とＱＹＬＮＴＴＥＱＶＲＳＧＮＥＩＴＣ（残基１４８
〜１６４）（配列番号１２）である。これに加えて、配列番号５と８〜１０のマ
ウス残基に相当するヒト配列も治療用抗体の生産に役立つだろう。免疫学的に重
要な部分を含有するポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体の断片も調
製できる。Ｆａｂ、Ｆａｂ'またはＦ（ａｂ'）₂断片などの免疫反応性断片は、一般に完全な免疫グロブリンよりも免疫原性が低いので、とりわけ治療面では、
それら断片の使用がしばしば好ましい。

【００５１】生物学的試料中のＧＣＲ９ポリペプチドを抗体プローブで検出または測定する
ためのアッセイは、利用可能などのフォーマットに基づいてもよい。例えば、Ｇ
ＣＲ９ポリペプチドが分析物である免疫アッセイでは、試験試料（通例、生物学
的試料）を抗原−抗体複合体の形成が可能な条件で抗ＧＣＲ９抗体と共にインキ
ュベートする。例えば固形支持体に結合した抗体を試験試料と共にインキュベー
トし、洗浄し、分析物に対する二次標識抗体と共にインキュベートし、その支持
体を再び洗浄する「サンドイッチ」アッセイなど、様々なフォーマットを使用で
きる。二次抗体が支持体に結合されるかどうかを決定することによって、分析物
が検出される。競合フォーマット（これは不均一系でも均一系でもよい）では、
通常、試験試料を抗体および標識した競合抗原と共に、逐次的にまたは同時にイ
ンキュベートする。これらのフォーマットは他のフォーマットと共に当該技術分
野では周知である。

【００５２】本発明のさらなる実施の形態は、アンチセンス治療または遺伝子治療に関する
。現在、当該技術分野では、アンチセンス治療または遺伝子治療として提供され
るときに、特定の選択効果を与えるように改変ＤＮＡ分子を調製できることが知
られている。ＧＣＲ９をコードする天然のＤＮＡ区分は、他の全ての哺乳類ＤＮ
Ａ鎖と同様に二本の鎖、すなわち水素結合によって互いに結合しているセンス鎖
とアンチセンス鎖を有する。ＧＣＲ９をコードするｍＲＮＡはセンス鎖と同じヌ
クレオチド配列を持ち、ウリジンによるチミジンの置換が予想される。したがっ
て、ＧＣＲ９配列の知識に基づいて、合成オリゴヌクレオチドを合成できる。こ
れらのオリゴヌクレオチドはＧＣＲ９をコードするＤＮＡおよびＲＮＡに結合で
きる。ｍＲＮＡおよびＤＮＡのコーディング鎖に相補的な本発明の活性断片は通
常少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より通常は少なくとも２０ヌクレオチ
ド、好ましくは３０ヌクレオチドであって、５０ヌクレオチド以上がより好まし
いかもしれない。このような核酸分子の最大サイズに関する上限は、その核酸分
子がある遺伝子の一部、一つの遺伝子全体、または複数の遺伝子もしくはその一
部を含みうるという点での、事実上の限界以外にはない。センス鎖とアンチセン
ス鎖の間の結合強度は、全水素結合に依存する。したがって当業者は、ｍＲＮＡ
中の塩基の総数に基づいて、オリゴヌクレオチド配列の最適な長さを容易に計算
できる。その配列はｍＲＮＡの配列のどの部分に相補的であってもよい。例えば
、それは５'末端またはキャッピング部位の近位にあってもよいし、キャッピング部位の下流、キャッピング部位と開始コドンの間にあってもよく、非コード領
域またはコード領域の全部または一部分のみを覆ってもよい。アンチセンス配列
が結合する具体的部位は、所望する抑制の程度、配列の一義性、そのアンチセン
ス配列の安定性などに依存して変化するだろう。

【００５３】本発明の実施では、有効量の上記合成アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を
投与することにより、ＧＣＲ９の発現がダウンレギュレートされる。本発明のオ
リゴヌクレオチド化合物は、ヒトＧＣＲ９をコードするｍＲＮＡに結合し、それ
によって前記タンパク質の発現（翻訳）を抑制する。ＧＣＲ９の点突然変異、挿
入、欠失またはスプライス突然変異など様々な突然変異を含有する単離されたＤ
ＮＡ配列も、同様に遺伝子治療に役立つ。

【００５４】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子とタンパク質の生物学的機能を決
定するために、インビトロのツールとしても使用できる。オリゴヌクレオチドホ
スホロチオエート（ＰＳ−オリゴ）は、遺伝子発現のアンチセンス媒介阻害剤と
して治療上大きな可能性が示されてきた（Ｓｔｅｉｎら，１９９３とその引用文
献）。アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成には様々な方法が開発されてきた
（Ａｇｒａｗａｌら，ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｓ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，１９９３およびＥｃｋｓｔｅ
ｉｎら，ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙＰｒｅｓｓ，１９９１を参照）。

【００５５】本発明の実施では、有効量の上記合成アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を
投与することにより、ＧＣＲ９の発現を調節する。本発明のオリゴヌクレオチド
化合物は、ヒトＧＣＲ９をコードするｍＲＮＡに結合し、それによってそれらタ
ンパク質の発現（翻訳）を抑制する。ＧＣＲ９の点突然変異、挿入、欠失または
スプライス突然変異など様々な突然変異を含む単離されたＤＮＡ配列も、同様に
遺伝子治療に役立つ。

【００５６】本発明は、ＧＣＲ９タンパク質の活性化を遮断するＧＣＲ９のアンタゴニスト
も包含する。アンタゴニストとは、それら自体は薬理活性を欠くが、アゴニスト
の作用を防止することによって効果を発揮する化合物である。本発明のアンタゴ
ニストを同定するには、ＧＣＲ９の天然リガンドとの競争的結合について試験す
ればよい。拮抗的結合と活性のアッセイは、本明細書と引用文献に記述されてい
るように、ダウンレギュレーションに関してＧＣＲ９機能をモニターすることか
ら導きうる。ＧＣＲ９への結合を試験して、本発明のアロステリックリガンドま
たはインバースアゴニストを同定することができる。アンタゴニストの結合には
、例えばイオン力、水素結合、疎水相互作用、ファンデルワールス力、共有結合
など、知られているすべてのタイプの相互作用が関与しうる。多くの場合、アン
タゴニストとＧＣＲ９のような分子との相互作用には、複数のタイプの結合が重
要である。

【００５７】さらなる実施の形態として、これらの化合物はＧＣＲ９またはそのリガンドの
類似体でありうる。ＧＣＲ９類似体は、その遺伝子の単離されたＤＮＡ配列中の
点突然変異、ヌクレオチド置換および／または欠失（これらはすべて当該技術分
野で詳しく記述されている方法によって生成できる）によって生産できる（Ｓｉ
ｍｏｎｃｓｉｔｓら，１９９４）。本発明は、例えばそのエキソンの１またはそ
れ以上の欠失を含むＧＣＲ９の単離された核酸配列など、ＧＣＲ９のスプライス
変異体も包含する。本明細書で用いる用語「スプライス変異体」とは、少なくと
も１つのエキソンを含んでなるヒトＧＣＲ９をコードする精製および単離された
ＤＮＡ分子を意味する。加えて、これらのエキソンは様々な点突然変異を含んで
もよい。

【００５８】本発明のアンタゴニストを修飾するために構造活性相関を使用できる。例えば
、Ｘ線結晶学とＮＭＲの手法を用いて本発明の修飾を施しうる。例えば、分子グ
ラフィックスを使って欠失突然変異体の構造モデルを構築するためのテンプレー
トとして使用できるヒトＧＣＲ９の三次元構造を作成することができる。次に、
これらのモデルを使って、天然リガンドに匹敵する親和性を有するが天然リガン
ドと比較すると低いＧＣＲ９活性を有するＧＣＲ９のリガンドを同定し、構築す
ることができる。低い生物学的活性の意味するところは、天然リガンドがもたら
す活性の２〜１００，０００分の１のＧＣＲ９活性、好ましくは天然リガンドが
もたらす活性の１００〜１０００分の１のＧＣＲ９活性である。さらにもう一つ
の実施の形態として、これらの化合物はＧＣＲ９構造の動的プローブとして使用
でき、また、細胞株もしくは他の適当なＧＣＲ９活性測定手段を用いてＧＣＲ９
アンタゴニストを開発するためにも使用できる。

【００５９】また本発明は、ＧＣＲ９の合成を防止するまたはＧＣＲ９の生物学的安定性を
低下させる化合物も提供する。生物学的安定性は、その分子の合成とその分解の
間の時間の尺度である。例えば、タンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣体（
Ｋａｕｖａｒ，１９９６）治療物質の安定性は、その配列を変化させて酵素分解
に対するその感受性を高めることによって短くなりうる。

【００６０】ＧＣＲ９遺伝子の直接的調節の他に、本発明はＧＣＲ９による細胞内シグナリ
ングの阻害方法も包含する。著しく発エルゴン性のホスホリル転移反応がキナー
ゼとして知られる様々な酵素によって触媒されることは当該技術分野で知られて
いる。すなわちキナーゼはＡＴＰと代謝産物の間でホスホリル基を転移させる。
プロテインキナーゼの特異的阻害剤は本発明の範囲に包含される。このように、
これらキナーゼの阻害剤はＧＣＲ９の調節に役立ち、アトピー性アレルギーと喘
息の治療に有用である。ＧＣＲ９シグナリングのもう一つの側面は、ＧＣＲ９の
Ｇタンパク質との相互作用に関わる。ＧＣＲ９−Ｇタンパク質相互作用を遮断す
るアンタゴニスト、またはＧタンパク質活性化を防止するアンタゴニストを開発
することができる。このようなＧタンパク質活性化の阻害剤には、ファルネシル
化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化またはゲラニルゲラニル
化の阻害剤があり、これらはすべて当該技術分野でよく知られている。本発明の
さらなる側面は、ＧＣＲ９が媒介するシグナル伝達の他の下流エフェクターの阻
害剤の使用に関わる。これらには、この受容体ファミリーの既知の下流エフェク
ターであるホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２、アデニリルシクラーゼ、Ｍ
ＡＰキナーゼおよびＲａｓの阻害剤が含まれる。ＧＣＲ９の活性を拮抗するもう
一つの方法は、ＧＣＲ９シグナル伝達の異種脱感作を起こすもう一つのＧタンパ
ク質共役レセプターのリガンドの使用である。この効果の例は当該技術分野では
周知である。

【００６１】本発明のさらにもう一つの側面として、驚くべきことに、アミノステロール化
合物がマイトジェン刺激によるＧＣＲ９誘導の抑制に有用であることがわかった
。本発明で有用なアミノステロール化合物は米国特許出願第０８／２９０，８２
６号とその関連出願０８／４１６，８８３および０８／４７８，７６３、ならび
に０８／４８３，０５９とその関連出願０８／４８３，０５７、０８／４７９，
４５５、０８／４７９，４５７、０８／４７５，５７２、０８／４７６，８５５
、０８／４７４，７９９および０８／４８７，４４３（これらは特に引用により
本明細書に援用される）に記載されている。

【００６２】また本発明は、薬学上許容できる担体と共に本発明の化合物を含んでなる薬学
的組成物を包含する。薬学上許容できる担体は、水や油（例えば石油、動物、植
物または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油）など
の滅菌液体でありうる。薬学的組成物が静脈内に投与される場合は、水が好まし
い担体である。食塩溶液とデキストロースおよびグリセロール水溶液も液体担体
として、とりわけ注射用溶液に使用できる。好適な薬学的担体は、引用によって
特に本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，
ペンシルヴァニア州イーストン，１９９５）に記載されている。

【００６３】本発明の治療法に使用される化合物は、治療される状態、部位特異的治療の必
要性、投与される薬物の量などの考察すべき事項に応じて、全身投与または局所
投与されうる。

【００６４】局所投与を使用しうる。溶液、懸濁液、ゲル、軟膏など、任意の一般的局所用
製剤を使用できる。そのような局所用製剤の調製は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ 'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓによって例示されるように、医薬製剤の技術分野で詳細に記述されている。局所適用には、これらの化
合物を粉末またはスプレーとして、とりわけエアロゾルの形でも投与できる。活
性成分は全身投与に適合させた薬学的組成物の形で投与できる。知られているよ
うに、薬物を全身投与すべき場合は、それを散剤、丸剤、錠剤などとして、また
は経口投与用のシロップ剤またはエリキシル剤として調製できる。静脈内、腹腔
内または病変内投与には、化合物が注射によって投与できる溶液または懸濁液と
して調製されるだろう。場合によっては、これらの化合物を坐剤の型に製剤化す
るか、皮膚下デポジットまたは筋間注射用の持続放出製剤として製剤化すること
が有用であるかもしれない。好ましい実施の形態として本発明の化合物は吸入に
よって投与できる。吸入療法には、化合物が、定量吸入器による投与に有用な溶
液または乾燥粉末吸入器に適した形をとりうる。

【００６５】有効量とはＧＣＲ９を調節することになる量である。所定の有効量は状態ごと
に異なり、場合によっては、治療される状態の重篤度と治療に対する患者の感受
性によって変わりうる。したがって所定の有効量はその時にその場所で定型的な
実験によって決定されるのが一番よい。しかし、本発明に従ったアトピー性アレ
ルギーと喘息関連疾患の治療では、通常は、０．００１〜５重量％、好ましくは
約０．０１〜１％を含有する製剤が治療有効量を構成するだろう。全身投与する
場合は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の量、好ましくは約０．１〜１０
ｍｇ／ｋｇが、ほとんどの例で治療成果をもたらすだろう。

【００６６】本出願人はＧＣＲ９またはＧＣＲ９によって制御される機能を調節する化合物
をスクリーニングする方法にも備えている。ＧＣＲ９によって発現される機能が
ダウンレギュレートされるかどうかは、当該技術分野で標準的な手法を用いて決
定できる。具体的な一実施の形態として、本出願人はインビトロおよびインビボ
でＧＣＲ９を調節する化合物を同定する方法に備える。一実施の形態として、血
清ＩｇＥを当該技術分野で周知の手法を使って測定することにより、ある化合物
がインビボで抗原によって誘導されるＧＣＲ９の機能をダウンレギュレートする
効力を評価できる。もう一つの実施の形態として、気管支反応性亢進、気管支肺
胞洗浄および好酸球増加を、当該技術分野で周知の手法を用いて測定することに
より、ある化合物がインビボでＧＣＲ９の機能をダウンレギュレートする効力を
評価できる。さらに別の実施の形態においてインビトロでＧＣＲ９の機能を評価
されるであろう。当業者には知られているように、Ｇタンパク質共役受容体とし
てヒトＧＣＲ９はＧタンパク質を特異的に活性化し、これらの細胞過程はＧＣＲ
９の機能的阻害剤をアッセイする手段としてモニターすることができる。

【００６７】また本発明は、インビトロ翻訳されたシグナリングタンパク質へのＧＣＲ９結
合の簡単なスクリーニングアッセイも包含する。一実施の形態として、細胞ＲＮ
Ａと細胞タンパク質を単離し、ウェスタンブロット法（タンパク質）またはＲＴ
−ＰＣＲ（ｃＤＮＡ）によって定常状態で認められるＧＣＲ９の相対量をアッセ
イすることにより、ＧＣＲ９誘導をインビトロおよびインビボでモニターできる
。もう一つの実施の形態として、ＧＣＲ９プロモーターをＣＡＴのルシフェラー
ゼなどのレポーター遺伝子の前にサブクローニングし、そのコンストラクトを使
って、そのレポーター遺伝子の活性を測定することにより、ＧＣＲ９誘導を遮断
する分子を同定することができる。そのような方法は本発明の好ましい実施の形
態である。

【００６８】本発明は、ＧＣＲ９を過剰発現するトランスジェニック動物またはＧＣＲ９を
野生型生物よりもはるかに低いレベルで発現するトランスジェニック動物も提供
する。「野生型」生物とは、ＧＣＲ９発現について最も頻繁に観察される表現型
であるもので、通常は恣意的に「正常」個体と呼ばれる。

【００６９】トランスジェニック動物は、クローン化された遺伝物質が導入されている遺伝
子修飾動物である。クローン化された遺伝物質は、しばしば導入遺伝子と呼ばれ
る。導入遺伝子は標的動物の種と同じ種または異なる種（非動物種を含む）のゲ
ノムに由来する核酸配列からなりうる。

【００７０】トランスジェニック技術の開発により、研究者は、事実上どのような遺伝子型
哺乳動物でも作出でき、特定の外来核酸配列を導入した帰結を形質転換された動
物の生理学的および形態学的特徴に関して評価できる。トランスジェニック動物
を利用できれば、細胞過程に影響を与え、他の大半の試験系では達成できない系
統的かつ特異的な方法でそれらを調べることができる。例えばトランスジェニッ
ク動物の開発は疾患の研究に役立つモデルを生命科学者と医学者に提供する。そ
のような動物は、新らしい医薬活性物質の試験と開発にも役立つ。遺伝子治療は
、遺伝的疾患の症状を改善または治療するために使用できる。

【００７１】トランスジェニック動物は、トランスフェクション、エレクトロポレーション
、マイクロインジェクション、バイオリスティックス（遺伝子粒子加速法または
微粒子射撃法などとも呼ばれる）、胚性幹細胞での遺伝子ターゲティング、組換
えウイルスおよびレトロウイルス感染など、多種多様な方法によって作出できる
（米国特許第４，７３６，８６６号；米国特許第５，６０２，３０７号；Ｍｕｌ
ｌｉｎｓら，１９９３；Ｂｒｅｎｉｎら，１９９７；Ｔｕａｎ，ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓ
ｓ，１９９７を参照）。

【００７２】「ノックアウト」という用語は一般に特定遺伝子のヌル対立遺伝子を含有する
突然変異生物を指す。「ノックイン」という用語は一般に、ある遺伝子が相同組
換えによって挿入されている突然変異生物を指す。ノックイン遺伝子は、内因性
の野生型遺伝子を置換する突然変異型の遺伝子であってもよい。ＧＣＲ９遺伝子
に関してノックインまたはノックアウトマウスであるマウスは本発明の開示によ
って包含される。

【００７３】組換え齧歯動物は、例えば活性化された癌遺伝子配列を発現させるもの（米国
特許第４，７３６，８６６号）、サルＳＶ４０Ｔ抗原を発現させるもの（米国特
許第５，７２８，９１５号）、インターフェロン調節因子１の発現を欠くもの（
米国特許第５，７３１，４９０号）、ドーパミン作用機能不全を示すもの（米国
特許第５，７２３，７１９号）、血圧制御に関与する少なくとも一つのヒト遺伝
子を発現させるもの（米国特許第５，７３１，４８９号）、自然に起こるアルツ
ハイマー病に見られる状態に、より高い類似性を示すもの（米国特許第５，７２
０，９３６号）、細胞接着を媒介する能力が低下しているもの（米国特許第５，
６０２，３０７号）およびウシ成長ホルモン遺伝子をも有するもの（Ｃｌｕｔｔ
ｅｒら，１９９６）など、数多く作出されている。

【００７４】齧歯動物、とりわけマウスとラットは、今も大半のトランスジェニック実験に
うってつけの動物であるが、場合によっては、別の動物種を使用することが好ま
しいか、またはそうする必要さえある。トランスジェニック法は、ヒツジ、ヤギ
、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、ウシおよびモ
ルモットを含むマウス以外の様々な動物で成功裏に使用されてきた（Ｋｉｍら，
１９９７；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，１９９５；Ｐｅｔｔｅｒｓ，１９９４；Ｓｃｈ
ｎｉｅｋｅら，１９９７；Ａｍｏａｈら，１９９７を参照）。

【００７５】組換え適格な哺乳類細胞への核酸断片の導入方法は、複数の核酸分子の同時形
質転換に有利な任意の方法によることができる。当業者は、トランスジェニック
動物を作出するための詳細な手順を、米国特許第５，４８９，７４３号と米国特
許第５，６０２，３０７号中の引用文献を含めて、容易に入手できる。

【００７６】本発明の実施には、当業者の通常の熟練度の範囲内である分子生物学、薬理学
、免疫学および生化学の従来の用語と手法を使用することになる（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８５またはＡｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９４を参照）。

【００７７】本発明の他の実施の形態は、ここに開示する本発明の明細と実施を検討するこ
とによって、当業者に明らかになるだろう。これらの明細と実例は例示とみなさ
れるべきであり、本発明の真の範囲は請求の範囲によって示されるものとする。

【００７８】

【実施例】

（実施例１）ＩＬ−９発現性遺伝子のｃＤＮＡ差異分析マウスＴリンパ球細胞クローンＴＳ２を使用してＩＬ−９誘導性遺伝子を単離
した。ＴＳ２は先に記載されているようにマウスリンパ球の初代培養に由来する
Ｔヘルパー細胞株である（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅら，１９８８；Ｌｏｕａｈｅｄ
ら，１９９５）。この細胞株は培養中のＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−９サイ
トカインに反応して増殖することが示された。ＩＬ−９特異的に誘導される遺伝
子を同定するために、ｃＤＮＡ差異分析をＩＬ−２またはＩＬ−９の存在下に培
養した細胞から得たｍＲＮＡで行なった。

【００７９】細胞培養とサイトカイン。１０％ウシ胎児血清、５０μＭ２−メルカプトエ
タノール、０．５５ｍＭＬ−アルギニン、０．２４ｍＭＬ−アスパラギンお
よび１．２５ｍＭＬ−グルタミンを補足したＤＭＥＭ培地中で、ＴＳ２細胞を
生育した。この因子依存性細胞株はＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−９いずれか
の存在下に抗原またはフィーダー細胞なしで生育できた。

【００８０】ｃＤＮＡ合成。ＩＬ−２（２００Ｕ／ｍｌ）またはＩＬ−９（２００Ｕ／ｍｌ
）で４８時間刺激したＴＳ２細胞から、グアニジンイソチオシアネート法（Ｃｈ
ｏｍｃｚｙｎｓｋｉら，１９８７）によって全ＲＮＡを調製した。ポリアデニル
化ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを使って全ＲＮＡから精製した。Ｓ
ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素とオリゴ（ｄＴ）プライマーを製造者（
Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）の提案通りに使用して、逆転写によって二本鎖ｃＤＮＡ
を調製した。次に、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によっ
てｃＤＮＡ差異分析用のｃＤＮＡを調製した。ヌクレアーゼを含まない水に生成
物を再懸濁し、アガロースで分析することにより、後述のように生成物の品質を
決定した。

【００８１】ｃＤＮＡ差異分析プロトコール。ＩＬ−２またはＩＬ−９で処理されたＴＳ細
胞の示差的ｃＤＮＡ分析は、以前に報告されているように（Ｈｕｂａｎｋら，１
９９４）、Ｌｉｓｉｔｓｙｎら（１９９３）のゲノムｃＤＮＡ差異分析法に基づ
いて行なった。

【００８２】ＴＳ２細胞より単離された細胞質ポリアデニル化ｍＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ
）プライマーを使ってｃＤＮＡを生成させた。ｃＤＮＡをＤｐｎＩＩで消化した
後、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールで２回、クロロホルム−
イソアミルアルコールで１回抽出した。グリコーゲン担体を添加した後、１００
％エタノールで沈殿させた。そのペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し
、ＴＥ緩衝液に再懸濁した。

【００８３】アダプターを連結するために、消化したｃＤＮＡを脱塩したＲ−Ｂｇｌ−２４
オリゴ（５'−ＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＣＡ−３'）とＲ
−Ｂｇｌ−１２オリゴ（５'−ＧＡＴＣＴＧＣＧＧＴＧＡ−３'）（比２：１）、
１０×リガーゼ緩衝液および水と混合した。消化したｃＤＮＡにオリゴを５０℃
で１分間アニールさせた後、１０℃に１時間冷却し、次にＴ４ＤＮＡリガーゼを
添加して１６℃で終夜インキュベートした。次にライゲーション反応液をＴＥ緩
衝液で希釈した。

【００８４】標本（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の生成。希釈したライゲーション反応
液を５×ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰヌクレオチド混合物、水およびＲ−Ｂｇｌ−２
４プライマーと混合した。その反応液を７２℃に３分間加熱して１２マーを除去
した後、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加した。次にそれらの反応液を７２℃で
５分間インキュベートして末端を埋めた後、２０サイクルのＰＣＲサイクリング
プロトコール（９５℃で１分、７２℃で３分）を遂行した。最終伸長段階（７２
℃で１０分）をそのサイクリングプロトコールの最後に含めた。

【００８５】ＰＣＲ産物をフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールで２回、クロ
ロホルム−イソアミルアルコールで１回抽出し、イソプロパノールで沈殿させた
。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、ＴＥ緩衝液に再懸濁した。次に、各標
本をＤｐｎＩＩで消化した後、フェノール−クロロホルムで１回、クロロホルム
でもう１回抽出した。消化した標本をイソプロパノールで沈殿させ、７０％エタ
ノールで洗浄し、ＴＥ緩衝液に再懸濁した。このＤＮＡを切断済ドライバー（Ｄ
ＲＩＶＥＲ）と名付けた。

【００８６】テスター（ＴＥＳＴＥＲ）の調製。消化した標本をＴＥ緩衝液で希釈し、１０
×ローディング緩衝液と混合し、１．２％ＴＡＥ調製用ゲルに充填し、ブロモフ
ェノールブルーが約２ｃｍ移動するまで電気泳動した。そのゲルのアンプリコン
含有部分を切り出して、それを、消化されたリンカーから分離した。このＤＮＡ
をそのゲル切片から精製し、ＴＥ緩衝液に再懸濁し、テスターと名付けた。

【００８７】テスターのＪ−オリゴへの連結。テスターを１０×リガーゼ緩衝液、水、脱塩
したＪ−Ｂｇｌ−２４オリゴ（５'−ＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡ−３'）およびＪ−Ｂｇｌ−１２オリゴ（５'−ＧＡＴＣＴＧＴＴＣＡ
ＴＧ−３'）（比２：１）と混合した後、テスターに５０℃で１分間アニールさせ、次に、１０℃に１時間冷却した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃で
終夜インキュベートした。次にライゲーション反応液をＴＥ緩衝液で希釈した。

【００８８】差引きハイブリッド形成法。消化したドライバー標本とＪ連結テスター標本を
混合した後、フェノール−クロロホルムで抽出した。ＤＮＡを１００％エタノー
ルで沈殿させ、７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥し、ＴＥ緩衝液に再懸濁し
た。反応液の上に鉱油を重層し、９８℃で５分間変性させ、６７℃に冷却した後
、５Ｍ塩化ナトリウムを添加し、２０時間インキュベートしてハイブリッド形成
を完了させた。

【００８９】第一差異産物の生成。鉱油を除去し、ＤＮＡをＴＥ緩衝液と５μｇ／μｌ酵母
ＲＮＡで希釈した。各差引き設定をするために、希釈したハイブリッド形成混合
物を５×ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰヌクレオチド混合物および水と混合した。その
反応液を７２℃で３分間インキュベートして１２マーを除去し、ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼを加え、７２℃でさらに５分間インキュベートし、Ｊ−Ｂｇｌ−２４
プライマーを添加した後、１０サイクルのＰＣＲサイクリングプロトコール（９
５℃で１分、７０℃で３分）を遂行した。そのサイクリングプロトコールの最後
に最終伸長段階（７２℃で１０分）を含めた。反応液をフェノール−クロロホル
ム−イソアミルアルコールとクロロホルム−イソアミルアルコールで１回抽出し
た。グリコーゲン担体を添加した後、１００％エタノールで沈殿させた。そのペ
レットを７０％エタノールで洗浄し、０．２×ＴＥ緩衝液中で再懸濁した。

【００９０】次にＰＣＲ産物をマングビーン（ｍｕｎｇｂｅａｎ）ヌクレアーゼで３０℃
で３５分間消化し、５０ｍＭトリス塩酸の存在下に９８℃で５分間インキュベー
トすることによって反応を停止した。マングビーンヌクレアーゼ処理ＤＮＡを５
×ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰヌクレオチド混合物、水およびＪ−Ｂｇｌ−２４オリ
ゴと混合した。反応液を９５℃で１分間インキュベートし、８０℃に冷却し、Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼを加えた後、１８サイクルからなるＰＣＲサイクリング
プロトコール（９５℃で１分、７０℃で３分）を遂行した。そのサイクリングプ
ロトコールの最後に最終伸長段階（７２℃で１０分）を含めた。ＰＣＲ産物をフ
ェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールで２回、クロロホルム−イソア
ミルアルコールで１回抽出した。ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、７０％
エタノールで洗浄し、ＴＥ緩衝液に再懸濁した。この反応生成物を第一差異産物
（ＤＰ１）と名付けた。

【００９１】差異産物上のアダプターの変更。ＤＰ１をＤｐｎＩＩで消化し、フェノール−
クロロホルム−イソアミルアルコールで２回抽出し、１００％エタノールで沈殿
させた。そのペレットを７０％エタノールで洗浄し、ＴＥ緩衝液に再懸濁した。
鋳型ＤＮＡを消化したＤＰ１、１０×リガーゼ緩衝液、水、Ｎ−Ｂｇｌ−２４オ
リゴ（５'−ＡＧＧＣＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＴＣＣＧＡＧＧＧＡＡ−３'）および
Ｎ−Ｂｇｌ−１２オリゴ（５'−ＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＧ−３'）（比２：１）
と混合した後、５０℃で１分間アニールし、次に１０℃に１時間冷却した後、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃で終夜インキュベートした。

【００９２】第二差異産物（ＤＰ２）と第三差異産物（ＤＰ３）の生成。ＤＰ２については
、Ｎ連結ＤＰ１をドライバーと混合し、差引き段階と増幅段階（テスター：ドラ
イバー比１：８００）を上述のように繰り返した（ライゲーション段階にはＪオ
リゴを使用した）。ＤＰ３については、５μｇ／μｌの酵母ＲＮＡを含有するＴ
Ｅ緩衝液でＪ連結ＤＰ２を希釈した。Ｊ連結ＤＰ２をドライバーとハイブリダイ
ズさせ、差引き段階と増幅段階（テスター：ドライバー比１：４００，０００）
を上述のように繰り返し、２２サイクルの最終増幅プロトコールを行なって、Ｄ
Ｐ３を生成させた。

【００９３】ＤＰ３のクローニングは、ＤｐｎＩＩによるＤＰ３の消化、上述したようなＴ
ＡＥ調製用ゲルでの単離、切り出したバンドからの精製、ｐＴＺ１９Ｒベクター
へのクローニングによって達成した。差異産物をまず、元のアンプリコンのブロ
ットに対してプローブすることによる真の差異産物のコンフォメーション、配列
決定またはノーザンブロットで差異産物が２以上の転写物に由来するかどうかを
決定することによるコンフォメーション、クローン化ＤＰ３ミニプレップのプラ
スミドブロットをプローブすることでクローニング頻度を確かめること、および
ＢＬＡＳＴｍａｉｌによる同定を想定して真の相違を配列決定すること、によっ
て特徴づけた。

【００９４】（実施例２）新規なＩＬ−９誘導性Ｇタンパク質共役受容体の同定ｃＤＮＡ差異分析から同定されたいくつかのｃＤＮＡの一つは、Ｎａｔｉｏｎ
ａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎのＥＮＴＲＥＺデータベースに含まれない新規ｃＤＮＡであることがわか
った。差異分析から単離された断片をプローブとして使用することにより、マウ
スｃＤＮＡライブラリーから全長ｃＤＮＡをクローニングした。先に報告されて
いるように（Ｌｏｕａｈｅｄら，１９９５）、ｐＳＶＫ３プラスミドライブラリ
ーに従来の方法でＴＳ２ｃＤＮＡライブラリーを調製した。１７９１塩基のｃＤ
ＮＡが単離された。これは３３０アミノ酸のタンパク質をコードするオープンリ
ーディングフレームを含有し、それをマウスＧＣＲ９と名付けた。図１は、開始
コドンの上流にΔで示す１．２キロベースイントロンを含むマウスＧＣＲ９ｃＤ
ＮＡのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。前記の全長ｃＤＮＡのヌクレオ
チドＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０）データベース検索により、こ
のｃＤＮＡがいくつかのＧ共役受容体タンパク質に類似することが明らかになっ
た。図２はＧＣＲ９に関係するタンパク質メンバーを示すＧ共役受容体ファミリ
ーの系統樹を示す。マウスＧＣＲ９の疎水性プロットは、その遺伝子産物が７回
膜貫通ドメイン配列モチーフを含有するポリペプチドをコードするらしいことを
示している（図３）。これは他のＧタンパク質共役受容体分子の顕著な特徴であ
る（Ｌａｒｈａｍｍａｒら，１９９２）。このデータはマウスＧＣＲ９がシグナ
ル伝達に関与するＩＬ−９誘導性遺伝子であることを示唆している。

【００９５】（実施例３）マウスＧＣＲ９の組織分布マウスＧＣＲ９遺伝子発現をＦＶＢＮＪマウスの様々な組織で評価した。マウ
スを安楽死させ、様々な器官を無菌的に摘出し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｏ−ＢＲ
Ｌ社）法を製造者の記載に従って、使用することにより、全ＲＮＡ抽出物を調製
した。全細胞ＲＮＡを電気泳動によって分画し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃニトロセルロ
ース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に移し、プローブした。ＧＣＲ９プローブは、Ｒ
ａｎｄｏｍＰｒｉｍｅＤＮＡラベリングキット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａ
ｎｎｈｅｉｍ社）を使って標識したＧＣＲ９の全コード配列を含有する１．８キ
ロベースｃＤＮＡとした。オートラジオグラフィー後に、ＲＮＡの完全性を確認
するために全てのブロットをマウスＧＡＰＤＨプローブで再プローブした。

【００９６】全長ＧＣＲ９ｃＤＮＡプローブでプローブした、様々な組織に由来するマウス
ＲＮＡのノーザンブロットの分析により、ＧＣＲ９は脾臓とリンパ節中でかなり
発現され、結腸と骨髄でそれよい少ない程度に発現されることがわかった（図４
）。

【００９７】（実施例４）ＧＣＲ９はマウス細胞中でＩＬ−９によりインビトロで誘導されるマウスＧＣＲ９がＩＬ−９によって誘導されることを確認するために、マウス
Ｔヘルパー細胞株ＴＳ６とＳＴ２Ｋ９を２００Ｕ／ｍｌマウスＩＬ−９またはヒ
トＩＬ−２中で培養した。細胞数を数え、全ＲＮＡを電気泳動によって分画し、
Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に移し、プローブ
した。ＧＣＲ９プローブはＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅＤＮＡラベリングキット（
ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社）を使って標識したＧＣＲ９の全コ
ード配列を含有する１．８キロベースｃＤＮＡとした。オートラジオグラフィー
後に、ＲＮＡの完全性を確認するためにマウスＧＡＰＤＨプローブですべてのブ
ロットを再プローブした。このインビトロ実験の結果は、マウスＧＣＲ９が、サ
イトカイン依存性マウス細胞株ＴＳ６およびＳＴ２Ｋ９中で、ＩＬ−９の存在下
に培養された時に、特異的に発現されることを示した（図５）。ＩＬ−９の特異
的誘導は、その遺伝子がＩＬ−９の存在下で発現され、ＩＬ−２の存在下では発
現されないという事実によって証明される。

【００９８】Ｃ５７ＢＬ６およびＤＢＡ２マウス脾細胞中のＧＣＲ９の誘導性を評価するた
めに、培養を樹立し、ＧＣＲ９発現をノーザンブロットでアッセイした。麻酔し
たマウスからの脾臓の無菌的摘出により、脾細胞を無処置のＤＢＡ２およびＣ５
７ＢＬ６マウスから単離した。次に、その脾臓を無菌的に細断し、組織を滅菌し
た網篩に通した。細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、培地で２回洗浄し
た。次に細胞を溶解緩衝液（脱イオン水５００ミリリットル中、塩化ナトリウム
４．１５ｇ、重炭酸カリウム０．５ｇ、ＥＤＴＡ０．０１９ｇ）に再懸濁して
赤血球を溶解した。次に細胞を３７℃で５分間インキュベートし、１０％ウシ胎
児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０に懸濁した。細胞を遠心分離し、そのペレ
ットを、５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡを添加した２０ミリリットルの培地に
再懸濁した。細胞を収集して、上記グアニジンイソチオシアネート法でＲＮＡを
単離した。ランダムヘキサマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）とＳｕｐｅｒｓｃｒｉ
ｐｔＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）をその製造者の提案通りに使用することに
より、ｃＤＮＡを生成させた。先に記述されているように（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅ
ｓら，１９９５）、メッセージをＰＣＲによって分析した。マウスＧＣＲ９メッ
セージを生成させるために使用したプライマーは５'−ＣＡＧＡＣＴＧＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＡ−３'（配列番号１３）と５'−ＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＧＡ
ＧＧＴＧＴＣ−３'（配列番号１４）で、これは１１６２塩基の遺伝子産物を生成する。β−アクチンをｃＤＮＡの完全性を測るための内部標準として先に記載
されているプライマー（Ｌｏｕａｈｅｄら，１９９５）を用いてアッセイした。
使用した増幅条件は９４℃で１分、６０℃で２分およびで７２℃２分を、βアク
チンとＧＣＲ９について、それぞれ２０でサイクルと２６サイクルである。

【００９９】このデータから、Ｃ５７ＢＬ６（図７）およびＤＢＡ２（図８）に由来する脾
細胞においてコンカナバリンＡ刺激の２４時間および４８時間後にＧＣＲ９発現
が誘導されることが証明された。さらにこのデータは、脾臓に含まれる細胞の生
理学におけるＧＣＲ９の役割を裏付け、マイトジェン活性化に続く脾細胞でのシ
グナリングにある役割を持ちうる。

【０１００】（実施例５）マウスＧＣＲ９はＩＬ−９によりインビトロで誘導される初代ＩＬ−９反応性細胞におけるＧＣＲ９の誘導性を、骨髄由来の初代マスト
細胞を使ってさらに評価した。１ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−３か、あるい
はＩＬ−３と２００Ｕ／ｍｌＩＬ−９の組合せを補足した２０％ウシ胎仔血清
、０．５５ｍＭＬ−アルギニン、０．２４ｍＭＬ−アスパラギン、１．２５
ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプ
トマイシン、５０μＭ２−メルカプトエタノールを補足したＲＰＭＩ−１６４
０培地で、ＢＡＬＢｃマウスから得た骨髄を４週間培養することにより、マウス
骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）を得た。この集団のＦＡＣＳ分析は、ビオチニ
ル化ＩｇＥによる均一な染色を示し、抗Ｍａｃ−１、抗Ｍａｃ−２、抗Ｍａｃ−
３および抗Ｔｈｙ１抗体では染色されなかった。

【０１０１】ＩＬ−３またはＩＬ−３とＩＬ−９の存在下で培養したＢＭＭＣを収集し、実
施例１に記載したようにＲＮＡを抽出し、逆転写した。ｃＤＮＡを、ＧＣＲ９と
β−アクチンの発現について、実施例４に記載したようにＰＣＲで分析した。そ
のデータは、ＩＬ−３＋ＩＬ−９の存在下で生育したＢＭＭＣ中にはＧＣＲ９が
発現されるが、ＩＬ−３のみの存在下で生育したＢＭＭＣ中にはＧＣＲ９が発現
しないことを示した（図９）。このデータにより、ＧＣＲ９が初代マスト細胞中
で誘導され、それらの生理学にある役割を果たしうることが証明された。

【０１０２】（実施例６）マウスＧＣＲ９はＩＬ−９によりインビボで誘導されるＴｇ５マウスとＦＶＢＮＪマウスの両方で、マウスＧＣＲ９発現をインビボで
評価した。ＦＶＢＮＪ（ＦＶＢ）はＩＬ−９を過剰発現するＩＬ−９トランスジ
ェニック系統（Ｔｇ５）の親系統である。ＩＬ−９トランスジェニックマウスの
作出は先に記述されているように行なった（Ｒｅｎａｕｌｄら，１９９４）。マ
ウスを安楽死させ、胃を無菌的に摘出し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社
）法を製造者の記載に従って、使用して全ＲＮＡ抽出物を調製した。実施例４に
記載したようにＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｔｇ５マウスとＦＶＢマウスの胃に由来
するＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＩＬ−９トランスジェニックマウスにおける
ＧＣＲ９の発現を示し、それらの対応する親系統ではその発現が認められなかっ
た。このデータは、増加したＩＬ−９濃度の存在（これはＩＬ−９トランスジェ
ニックマウスで起こり、親系統では起こらない）により、ＧＣＲ９の発現がイン
ビボで誘導されることを証明している。

【０１０３】（実施例７）ヒトＧＣＲ９相同体のクローニングＩＬ−２に反応する同じ細胞がＩＬ−２の存在下にＧＣＲ９を発現させないこ
とから、マウスＧＣＲ９遺伝子はＩＬ−９経路によりＩＬ−９に反応する細胞中
で特異的に誘導されるように見える。ヒト系でのＧＣＲ９のＩＬ−９誘導性を決
定するために、本出願人は２つの戦略を使ってヒトＧＣＲ９相同体を単離した。
まず、低ストリンジェンシーＰＣＲを使用して、相同なヒトＧＣＲ９配列をスク
リーニングした。マウス遺伝子の５'末端に対するオリゴデオキシヌクレオチドを使って、ヒトゲノムＤＮＡを低いストリンジェンシーで増幅した。ＰＣＲ反応
は実施例３に記載の緩衝液中で行なった。使用したプライマーはマウス遺伝子の
Ｎ末端に相当する５０１塩基産物を生成する５'−ＧＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＡＴＣＣＴＣＡ−３'（配列番号１５）および５'−ＧＣＴＣＴＴＧＧＧＴＧＡ
ＡＧＴＴＣＴＣＧＴ−３'（配列番号１６）であった。増幅は９４℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で６０秒の３５サイクルを使って行なった。産物をＴテ
ール付ベクターに製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の記載に従って、クローニ
ングした。１０個の組換えクローンを配列決定したところ、同じインサートを含
有することがわかった。

【０１０４】次に、Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
社、カリフォルニア州パロアルト）を使って、ヒトＧＣＲ９遺伝子をクローニン
グした。このクローニングシステムはＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ）に長距離ＰＣＲを使用し、全長ｃＤＮ
Ａの生成を可能にする。この迅速クローニングシステムはポリＡ＋ＲＮＡからの
二本鎖ｃＤＮＡ合成と、特別に設計されたｃＤＮＡアダプターへの連結から始ま
る。次に、前記ｃＤＮＡをＲＡＣＥＰＣＲで鋳型として使用することにより、
５'または３'末端もしくは全長ｃＤＮＡを得ることができる。ＲＡＣＥ反応に使
用したヒトＧＣＲ９プライマーは、５'反応用の５'−ＧＡＧＣＣＡＣＧＴＧＣＴ
ＧＣＡＧＴＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴ−３'（配列番号１７）と３'反応用の５'−ＣＴＧＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＴＴ−３'（配列番号１８）である。次に、ネステッドプライマー、５'ネステッド反応用の５'−ＧＴＡ
ＣＣＡＧＣＧＧＡＡＧＴＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡ−３'（配列番号１９）と３'ネステッド反応用の５'−ＧＴＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＧＣＡＣＣＡＴ
ＣＧＴ−３'（配列番号２０）、を使った第二ネステッドＰＣＲによってｃＤＮＡをさらに増幅した。次に、そのネステッドＰＣＲ産物をＴＡクローニングベク
ターｐＣＲ２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にクローニングし、配列決定した。

【０１０５】ヒトＧＣＲ９遺伝子の５'領域に由来するプライマーを用いたヒトｃＤＮＡのＲＡＣＥ反応により、ヌクレオチド配列がマウスＧＣＲ９遺伝子に対して８４％
の相同性を示す全長ｃＤＮＡ（図１０）が同定された。推定アミノ酸配列の整列
により、ヒトＧＣＲ９はマウスＧＣＲ９に対して８４％同一であることが明らか
になった。このデータはＩＬ−９誘導性マウスＧＣＲ９のヒト相同体を同定した
ものであり、またマウス配列とヒト配列の間の高度な保存ゆえに、細胞生理学に
おけるこのタンパク質の重要性を証明するものである。

【０１０６】（実施例８）ＧＣＲ９にハイブリダイズする核酸配列番号１および３に記載のヒトまたはマウスＧＣＲ９ヌクレオチド配列にハ
イブリダイズする核酸分子を同定するには、ハイブリッド形成のストリンジェン
シーを制御するために利用できる任意の方法を使って、ハイブリッド形成アッセ
イを行なう。ハイブリッド形成は数ある変数のなかでもとりわけ配列同一性（相
同性）、配列のＧ＋Ｃ含量、緩衝液塩濃度、配列の長さ、二本鎖融解温度（Ｔ_m ）の関数である（Ｍａｎｉａｔｉｓら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８２）。

【０１０７】ハイブリッド形成分析は、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）
の第９章の方法に従って、ゲノムＤＮＡ、またはＴリンパ球細胞株から得たｍＲ
ＮＡより調製されるｃＤＮＡプールを使って行なうことができる。簡単に述べる
と、ナイロン膜を使ったハイブリッド形成法は、配列番号１および／または配列
番号３からなる放射標識プローブを用いて、４２℃の６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤ
Ｓ、１００μｇ／ｍｌ変性超音波処理サケ精子ＤＮＡおよび５０％ホルムアミド
中で行なわれる。ハイブリッド形成後、フィルターを２×ＳＳＣおよび０．１％
ＳＤＳで洗浄し、３７℃の０．１×ＳＳＣと０．５％ＳＤＳおよび６８℃の０．
１×ＳＳＣと０．５％ＳＤＳで数回洗浄する。結果はオートラジオグラフィーで
視覚化される。

【０１０８】次の配列からなる核酸分子は、上記の条件で配列番号１からなるプローブにハ
イブリダイズする：５'−ＣＡＧＡＣＴＧＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＡ−３'（
配列番号１３）および５'−ＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＴＣ−３'（配列
番号１４）。

【０１０９】次の配列からなる核酸分子は上記の条件で配列番号３からなるプローブにハイ
ブリダイズする：５'−ＧＡＧＣＣＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴ−３'（配列番号１７）、５'−ＣＴＧＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧ
ＣＧＧＧＣＣＴＴ−３'（配列番号１８）、５'−ＧＴＡＣＣＡＧＣＧＧＡＡＧＴ
ＴＣＧＡＣＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡ−３'（配列番号１９）および５−ＧＴＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＧＴ−３'（配列番号２０）。

【０１１０】（実施例９）ヒトＧＣＲ９の組織分布ヒト多組織ノーザンブロット（ｈｕｍａｎｍｕｌｔｉｐｌｅｔｉｓｓｕｅ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，カリフォルニア州パロア
ルト）をヒトＧＣＲ９に特異的なｃＤＮＡプローブでプローブすることによって
、ヒトＧＣＲ９遺伝子発現を評価した。ＧＣＲ９プローブは、ＲａｎｄｏｍＰｒ
ｉｍｅＤＮＡラベリングキット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社
）を使って標識したＧＣＲ９の全コード配列を含有する２．６キロベースのｃＤ
ＮＡとした。オートラジオグラフィー後に、ＲＮＡの完全性を確認するためにヒ
トＧＡＰＤＨプローブで全ブロットを再プローブした。

【０１１１】全長ＧＣＲ９ｃＤＮＡプローブでプローブした、様々な組織に由来するヒトＲ
ＮＡのノーザンブロットの分析から、ＧＣＲ９が末梢血白血球と脾臓でかなり発
現され、結腸ではそれより少ない程度に発現されることが明らかになった（図１
１）。

【０１１２】（実施例１０）ヒトＧＣＲ９はＩＬ−９によりインビトロで誘導されるＩＬ−９経路によって誘導されるというヒトＧＣＲ９の能力を評価するために
、初代好酸球とマスト細胞をヒトＧＣＲ９の発現レベルについてアッセイした。
１×１０⁷細胞を単離し、リン酸緩衝食塩溶液で３回洗浄し、０．５％ウシ血清アルブミンと補因子類（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を補足した１２ミリリットルの
ＲＰＭＩ−１６４０培地に播種した。１２時間インキュベートした後、細胞に５
０ｎｇ／ｍｌＩＬ−９を２４時間補足した。翌日、細胞を収集し、製造者の記
載に従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）法で全ＲＮＡを抽出した。
ＲＮＡをやはり実施例３に記載したように加工し、ｃＤＮＡに逆転写した。次に
、等量のｃＤＮＡを、ヒトＧＣＲ９の単離に使用したものと同じオリゴデオキシ
ヌクレオチドプライマーを使って増幅した。実施例４に記載したようにｃＤＮＡ
の完全性をモニターするための対照としてβ−アクチンを使用した。ＰＣＲ増幅
は９５℃３０秒、６０℃６０秒および７２℃６０秒で３５サイクル行なった。反
応液はアガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色する。

【０１１３】ＲＴ−ＰＣＲで決定したところ、ヒト好酸球とマスト細胞はどちらもＧＣＲ９
を発現した。さらに、ＩＬ−９の存在下で培養したマスト細胞ではＧＣＲ９発現
の誘導が起こる（図１２）。このデータにより、ＧＣＲ９が初代マスト細胞中で
誘導され、したがってこれらの細胞を必要とする免疫反応に関与することが証明
された。

【０１１４】（実施例１１）マウス脾細胞におけるアミノステロールによるＧＣＲ９誘導の遮断ＤＢＡ２気管支反応性亢進マウスから得た脾細胞をアミノステロール化合物で
処理して、マイトジェンに反応して起こるＧＣＲ９の誘導を遮断するというそれ
らの能力について調べた。使用したアミノステロールは、ツノザメ（ｄｏｇｆｉ
ｓｈｓｈａｒｋ）の肝臓から、抗増殖性であるらしい分子群として同定された
化合物である。一連のアミノステロールを、ＤＢＡ２マウスから得たマイトジェ
ン刺激脾細胞におけるＧＣＲ９発現およびＴｈ２活性を阻害するというそれらの
能力についてアッセイした。前記化合物の構造の例を図１３に示す。

【０１１５】麻酔したマウスからの脾臓の無菌的摘出により、未処置ＤＢＡ２マウスから脾
細胞を単離した。次に脾細胞を細断し、組織を滅菌した網篩に通した。細胞をＲ
ＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、ＲＰＭＩ−１６４０中で２回洗浄した。次に
細胞を実施例３と同様に溶解緩衝液に再懸濁して赤血球を溶解した。細胞を３７
℃で５分間インキュベートし、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４
０培地に再懸濁した。次に細胞を遠心分離し、５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ
を補足した２０ミリリットルにペレットを再懸濁した。細胞培養を１０μｇ／ｍ
ｌのアミノステロール化合物で２４時間処理した。次に細胞を収集し、Ｔｒｉｚ
ｏｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）法を製造者の記載に従って、使ってＲＮＡを単離
した。

【０１１６】アミノステロール化合物で処理した脾細胞から得たＲＮＡを逆転写し、メッセ
ージを先に記述されているようにＰＣＲで分析した（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら，
１９９５）。マウスＧＣＲ９メッセージを生成させるのに使用したプライマーは
、２６７塩基の遺伝子産物を生成するセンス５'−ＣＣＡＧＡＣＴＧＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣ−３'（配列番号１７）と５'−ＴＧＣＴＧＴＡＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧ
ＣＣ−３'（配列番号１８）であった。先に記載されたプライマーを用いて、ｃＤＮＡの完全性を測るための内部対照としてβ−アクチンをアッセイした（Ｎｉ
ｃｏｌａｉｄｅｓら，１９９１）。使用した増幅条件は９５℃３０秒、５８℃９
０秒および７２℃９０秒を３５サイクルであった。図１４は、ＧＣＲ９発現に対
するアミノステロール類の効果を表す。このデータにより、特定のアミノステロ
ール（１４０９など）がインビトロでＧＣＲ９の発現を遮断する能力を有するこ
とが明らかになり、一方、１４３６や１５６９などの類似する化合物は発現に影
響しなかった。

【０１１７】（実施例１２）マウスＧＣＲ９タンパク質発現の抗体検出マウスＧＣＲ９タンパク質の残基６５〜８２（ＲＩＶＥＡＡＳＮＦＲＷＹＬＰＫ
ＩＶＣ）（配列番号６）に相当する合成ポリペプチドでウサギを免疫することに
より、ＧＣＲ９に対するポリクローナルウサギ抗血清を生成させた（Ｈａｒｌｏ
ｗ＆Ｌａｎｅ'ｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照）。ウェスタンブロットでＧＣＲ９タンパク質発
現を検出するには、抗血清の１０００倍希釈液で十分であると実験的に決定され
た。

【０１１８】マウスＧＣＲ９ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３発現ベクターにクローニングし、ヒト
胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）にリン酸カルシウム法で導入した。プールしたトラ
ンスフェクト細胞をネオマイシン（３μｇ／ｍｌ）で選択し、ＧＣＲ９タンパク
質発現をウェスタンブロットによってアッセイした。マウスＧＣＲ９遺伝子をコ
ードする発現ベクターをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、ＧＣＲ９
に相当するかなりの量の３７キロダルトンタンパク質を発現した（図１５）。空
ベクターをトランスフェクトされた細胞については、結果は陰性だった。

【０１１９】ＧＣＲ９タンパク質発現がＩＬ−９によって誘導されることを確認するために
、マウスＴヘルパー細胞株ＴＳ２をマウスＩＬ−９（５０μｇ／ｍｌ）または陰
性対照としてのＩＬ−２（４０μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ社）と共に
培養した。細胞数を数え、等しい数の細胞から細胞膜画分を単離し、ＧＣＲ９タ
ンパク質誘導をウェスタンブロットによってアッセイした。

【０１２０】この実験により、ＧＣＲ９がＩＬ−９の存在下で培養した時にサイトカイン依
存性マウス細胞株ＴＳ２で特異的に発現されることが証明された（図１５）。Ｉ
Ｌ−９による特異的誘導は、ウェスタンブロットで調べたところ、その遺伝子が
ＩＬ−９の存在下で発現されるが、ＩＬ−２の存在下では発現されないという事
実によって証明される。このデータは、ＩＬ−９反応性細胞が細胞内シグナリン
グのためにＧＣＲ９を産生するという、ＧＣＲ９発現に対するＩＬ−９の直接的
効果を証明している。

【０１２１】（実施例１３）喘息のマウスモデルにおけるＧＣＲ９の役割：非感作動物の気道反応５〜６週齢のＤＢＡ２、Ｃ５７ＢＬ６またはＢ６Ｄ２Ｆ１マウスはＮａｔｉｏ
ｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅまたはＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ（メイン州バーハーバー）から入手する。ＩＬ−９トランスジェ
ニックマウス（Ｔｇ５）とその親系統（ＦＶＢ）はＬｕｄｗｉｇＩｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ（ベルギー・ブリュッセル）から入手する。動物を、ウイルスおよび抗原
フリー施設の高効率粒子濾過空気層流フード中に飼い、実験操作前に齧歯動物用
飼料と水を３〜７日間自由に摂取させる。その動物施設を２２℃に保ち、明：暗
周期を自動制御する（１０：１４時間周期）。

【０１２２】表現型別と前処置の効力．気管支収縮反応を測定するために、薬物への曝露前
と曝露中に呼吸器系圧を気管で測定し、記録する。マウスを麻酔し、先に記述さ
れているように機器を装着する（Ｌｅｖｉｔｔら，１９８８；Ｌｅｖｉｔｔら，
１９８９；Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒら，１９９０；Ｌｅｖｉｔｔら，１９９１；Ｌ
ｅｖｉｔｔら，１９９５；Ｅｗａｒｔら，１９９５）。気道反応性を次の１また
はそれ以上に対して測定する：５−ヒドロキシトリプタミン、アセチルコリン、
アトラクリウムまたはサブスタンスＰ類似体。気道圧力時間インデックス（Ａｉ
ｒｗａｙＰｒｅｓｓｕｒｅＴｉｍｅＩｎｄｅｘ；ＡＰＴＩ）と呼ばれてい
る、気管支収縮剤投与に続くピーク吸気圧の変化の簡単で反復可能な測定を使用
する（Ｌｅｖｉｔｔら，１９８８；Ｌｅｖｉｔｔら，１９８９）。ＡＰＴＩは注
射の時間からピーク圧力がベースラインまたはプラトーに戻るまで積分されるピ
ーク呼吸圧の変化によって評価される。ＡＰＴＩは気道抵抗に匹敵するが、ＡＰ
ＴＩは気管支収縮からの回復に関係する追加の成分を含む。

【０１２３】屠殺前に、血清ＩｇＥ測定のために、麻酔した動物の下大静脈の針穿刺によっ
て全血を集める。試料を遠心分離して細胞を分離し、血清を集め、総ＩｇＥレベ
ルの測定に使用する。直ちに測定しない試料は−２０℃で凍結する。

【０１２４】ＥＬＩＳＡ抗体サンドイッチアッセイを用いて全てのＩｇＥ血清試料を測定す
る。マイクロタイタープレートを、アジ化ナトリウムを含む炭酸ナトリウム−重
炭酸ナトリウムのコーティング緩衝液中、２．５μｇ／ｍｌの濃度のラット抗マ
ウスＩｇＥ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）でコーテ
ィング（１ウェルあたり５０μｌ）する。プレートをプラスチックラップで覆い
、４℃で１６時間インキュベートする。プレートをリン酸緩衝食塩水中０．０５
％Ｔｗｅｅｎ−２０の洗浄緩衝液で、各洗浄ごとに５分間インキュベートして３
回洗浄する。非特異的結合部位の遮断は、リン酸緩衝食塩水中の５％ウシ血清ア
ルブミンを各ウェルに２００μｌ加え、プラスチックラップで覆い、３７℃で２
時間インキュベートすることによって達成する。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、
２回用の５０μｌ試験試料をウェルに加える。洗浄緩衝液中の５％ウシ血清アル
ブミンで１：１０、１：５０および１：１００に希釈した後、試験試料をアッセ
イする。試験試料の他に、洗浄緩衝液中の５％ウシ血清アルブミン中、０．８ｎ
ｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ濃度の一組のＩｇＥ標品（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社
）をアッセイして、標準曲線を作成する。試料または標品なしのブランクを使っ
てプレートリーダーを０に合わせる（バックグラウンド）。試料と標品を加えた
後、プレートをプラスチックラップで覆い、室温で２時間インキュベートする。
洗浄緩衝液で３回洗浄した後、５０μｌの二次抗体ラット抗マウスＩｇＥ−セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを洗浄緩衝液中の５％ウシ血清アル
ブミン中、２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で加える。そのプレートをプラスチックラッ
プで覆い、室温で２時間インキュベートする。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、１
００μｌの基質、０．１Ｍクエン酸緩衝液中の０．５ｍｇ／ｍｌｏ−フェニレ
ンジアミンを、各ウェルに加える。５〜１０分後に、反応を５０μｌの１２．５
％硫酸で停止し、４９０ｎｍの吸光度をＭＲ５０００プレートリーダー（Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ社）で測定する。標準ＩｇＥ濃度から、ｘ軸（対数目盛）に抗原濃度
、ｙ軸（線形目盛）に吸光度をとって標準曲線を構築する。試料中のＩｇＥの濃
度を標準曲線から内挿する。

【０１２５】気管支肺胞洗浄と細胞分析を先に記述されているように行なう（Ｋｌｅｅｂｅ
ｒｇｅｒら，１９９０）。肺を麻酔下に摘出した後に肺組織学的検査を行なう。
事前の機器装着は人為構造を生じさせるかもしれないので、これらの試験には別
の動物を使う。したがって小さい動物群に、これらの動物が気管支反応性試験を
除く他の試験に使用されない点以外は、様々な前処置を受ける群と正確に同じ処
置を並行して施す。気管支反応性試験の後、肺を摘出し、液体窒素に沈める。凍
結切断と組織学的試験を当業者には自明の方法で行なう。マウスＧＣＲ９経路のアンタゴニストは、この経路の機能をダウンレギュレート
し、また感作および非感作マウスにおける気管支反応性、血清ＩｇＥおよび気管
支肺胞洗浄にとってのこの経路の重要性を評価するために、治療的に使用される
。アンタゴニスト前処置の後、免疫グロブリン一致対照と比較したベースライン
気管支反応性亢進、気管支肺胞洗浄および血清ＩｇＥレベルを決定する。

【０１２６】（実施例１４）喘息のマウスモデルにおけるＧＣＲ９の役割：感作動物の気道反応動物と取り扱いは基本的に実施例１６に記載したとおりである。アスペルギル
ス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）抗原の経鼻
吸引による感作を行なって、気管支反応性亢進、気管支肺胞洗浄および血清Ｉｇ
Ｅに対する影響を評価する。マウスにアスペルギルスまたは食塩水を鼻腔内投与
し（月曜日、水曜日、金曜日を３週間）、最後の投与の２４時間後に表現型別す
る。ＧＣＲ９経路のアンタゴニストによる前処置の効果を用いて、ＧＣＲ９をダ
ウンレギュレートすることのマウスにおける効果を評価する。

【０１２７】本明細書中、様々な具体的物質、方法および実例を参照して、本発明を説明し
、例示し終えたが、本発明はその目的で選択された物質と方法の特定の組合せに
限定されないと理解される。当業者には理解されるであろうが、これらの詳細に
は数多くの変更実施の形態が考えられる。

【０１２８】ここに挙げた全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、
特許または特許出願が引用により本明細書に援用すると個別に明示した場合と同
じ程度に、引用により本明細書に援用するものである。

【０１２９】参考文献 Amoah EA and Gelaye S. Biotechnological advances in goat reproduction. J
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92. 本明細書に組み込まれてその一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつか
の実施の形態を図解し、その説明と合わせて本発明の原理を説明するものである
。

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＧＣＲ９遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号１）およびその推定アミノ酸
配列（配列番号２）を示す図である。

【図２】Ｇタンパク質共役遺伝子ファミリーの関連メンバーのデンドログラム（系統樹
）である。

【図３】マウスＧＣＲ９のヒドロパシープロットおよびＧＣＲ９のトロンビン受容体と
の整列を示す図である。

【図４】マウスＧＣＲ９の組織特異的分布を示すノーザンブロット図である。

【図５】インビトロのＳＴ２Ｋ９細胞およびＴＳ６細胞でマウスＧＣＲ９はＩＬ−９に
よって誘導されるが、ＩＬ−２では誘導されないことを示すノーザンブロット図
である。

【図６】ＧＣＲ９発現がＩＬ−９トランスジェニックマウス（Ｔｇ５）では起こるが、
親系統（ＦＶＢ）では起こらないことを示すＲＴ−ＰＣＲを表わす図である。

【図７】Ｃ５７ＢＬ６Ｊ由来の脾細胞におけるマイトジェンによるＧＣＲ９誘導を示す
ＲＴ−ＰＣＲを表わす図である。

【図８】ＤＢＡ２Ｊマウス由来の脾細胞におけるマイトジェンによるＧＣＲ９誘導を示
すＲＴ−ＰＣＲを表わす図である。

【図９】骨髄由来初代マスト細胞からのマウスＧＣＲ９誘導はＩＬ−９によって起こる
が、ＩＬ−３では起こらないことを示すノーザンブロット図である。

【図１０】ヒトＧＣＲ９遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（
配列番号４）を示す図である。

【図１１】ヒトＧＣＲ９の組織特異的分布を示すノーザンブロット図である。

【図１２】ヒトＧＣＲ９の好酸球における発現とマスト細胞における誘導を示すＲＴ−Ｐ
ＣＲを表わす図である。

【図１３】マウス脾細胞におけるコンカナバリンＡ誘導性ＧＣＲ９発現の阻害について試
験したアミノステロール類の構造を示す図である。

【図１４】種々のアミノステロールによるマウス脾細胞におけるコンカナバリンＡ誘導性
ＧＣＲ９発現の阻害を示す図である。

【図１５】マウスＧＣＲ９に対するポリクローナル抗体血清を示すウェスタンブロット図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 45/00 ４Ｃ０８６Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 11/06 ４Ｃ０９１ 35/00 35/00 ４Ｈ０４５Ｃ０７Ｊ 41/00 Ｃ０７Ｊ 41/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＣＧ０１Ｎ 33/53 ＺＮＡＡ (72)発明者ローアヘッド，ジャミラアメリカ合衆国，ペンシルヴァニア州, イーストノリスタウン，ハンナアヴェニューシー224 2920 (72)発明者レヴィト，ロイアメリカ合衆国，ペンシルヴァニア州, アンブラー，マーステングリーンコート 660 (72)発明者ニコライデス，ニコラスアメリカ合衆国，ペンシルヴァニア州, メディア，ブレイクルレーン 212 (72)発明者ドン，クーアメリカ合衆国，ペンシルヴァニア州, ランスデール，ダブリュー205，イーストメインストリート 757 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 BA26 BA53 BA63 BA80 CA04 CA09 CA11 DA02 FA02 GA11 GA18 HA12 HA17 4B063 QA01 QA05 QA19 QQ08 QQ13 QQ79 QQ91 QR32 QR48 QR56 QR80 QS24 QS33 QS34 4B064 AG20 AG26 BA14 CA10 CA19 CC24 CD20 DA01 DA13 DA14 4C084 AA13 AA17 ZA592 ZB132 ZB262 ZB272 4C085 AA13 AA14 BB11 CC02 CC23 CC32 DD62 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 DA11 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA59 ZB26 ZB27 4C091 AA01 BB01 CC01 DD01 EE10 FF01 GG02 GG13 HH01 JJ03 KK01 LL01 MM03 NN01 PA02 PA05 PB03 QQ01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 DA75 EA22 EA25 EA50 FA72 FA74 HA05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マウスＧＣＲ９または機能的に等価なその断片をコードする
ヌクレオチド配列を有する精製および単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】配列番号１の配列を含んでなる請求項１に記載の精製および
単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３】ヒトＧＣＲ９または機能的に等価なその断片をコードするヌ
クレオチド配列を有する精製および単離されたＤＮＡ分子。
【請求項４】配列番号３の配列を含んでなる請求項２に記載の精製および
単離されたＤＮＡ分子。
【請求項５】ゲノムＤＮＡ分子である請求項１または３に記載の精製およ
び単離されたＤＮＡ分子。
【請求項６】ヒトＧＣＲ９または機能的に等価なその断片をコードするヌ
クレオチド配列を有する化学合成されたＤＮＡ分子。
【請求項７】マウスＧＣＲ９または機能的に等価なその断片をコードする
ヌクレオチド配列を有する化学合成されたＤＮＡ分子。
【請求項８】ヒトＧＣＲ９または機能的に等価なその断片をコードするヌ
クレオチド配列を有する精製および単離されたＲＮＡ分子。
【請求項９】マウスＧＣＲ９または機能的に等価なその断片をコードする
ヌクレオチド配列を有する精製および単離されたＲＮＡ分子。
【請求項１０】ヒトＧＣＲ９または機能的に等価なその断片を含んでなる
アミノ酸配列を有する精製および単離されたポリペプチド。
【請求項１１】マウスＧＣＲ９または機能的に等価なその断片を含んでな
るアミノ酸配列を有する精製および単離されたポリペプチド。
【請求項１２】喘息関連疾患を軽減する方法であって、そのような処置を
必要とする患者にヒトＧＣＲ９の機能をダウンレギュレートするのに等価な量の
化合物を投与することを特徴とする方法。
【請求項１３】前記化合物がアミノステロールからなる請求項１２に記載
の方法。
【請求項１４】前記アミノステロールが１４０９である請求項１３に記載
の方法。
【請求項１５】前記化合物がキナーゼ阻害剤からなる請求項１２に記載の
方法。
【請求項１６】前記化合物が請求項３０または３１に記載の抗体からなる
請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】被験者における上昇したＧＣＲ９ポリペプチド濃度に関係
する喘息関連疾患、ある種のリンパ腫および白血病に対する罹病性を検出または
診断する方法であって、（ａ）前記被験者から得た生物学的試料中のＧＣＲ９ポリペプチドの濃度を測定
すること、（ｂ）正常被験者中に存在するＧＣＲ９ポリペプチドの濃度を比較すること、こ
こで、正常濃度と比較してＧＣＲ９ポリペプチド濃度の増加は、喘息関連疾患と
ある種のリンパ腫または白血病に対する素因を示す、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】被験者における上昇したＧＣＲ９ポリペプチド濃度に関係
する喘息関連疾患、またはある種のリンパ腫もしくは白血病の治療的処置をモニ
ターする方法であって、治療的処置を受けている前記被験者から様々な時点で得
た一連の生物学的試料中のＧＣＲ９ポリペプチドの濃度を測定する（ここで、該
ＧＣＲ９ポリペプチド濃度の有意な低下は治療的処置の成功を示す）ことからな
ることを特徴とする方法。
【請求項１９】腫瘍の治療法であって、そのような治療を必要とする患者
にヒトＧＣＲ９の機能をダウンレギュレートするのに有効な量の化合物を投与す
ることを特徴とする方法。
【請求項２０】前記化合物がアミノステロールからなる請求項１９に記載
の方法。
【請求項２１】前記アミノステロールが１４０９である請求項２０に記載
の方法。
【請求項２２】前記化合物がキナーゼ阻害剤からなる請求項１９に記載の
方法。
【請求項２３】前記化合物が請求項３０または３１に記載の抗体からなる
請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】前記腫瘍がＴ細胞リンパ腫である請求項１９に記載の方法
。
【請求項２５】前記腫瘍がＴ細胞白血病である請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】前記腫瘍がホジキンリンパ腫である請求項１９に記載の方
法。
【請求項２７】前記腫瘍が菌状息肉症である請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】請求項１または３に記載のＤＮＡ分子によってコードされ
るＧＣＲ９ポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を調製する方法であって
、（ａ）前記ＧＣＲ９ポリペプチドまたは少なくとも１０アミノ酸を含有するその
断片を担体タンパク質に接合し、（ｂ）アジュバントと混合した前記ＧＣＲ９ポリペプチド断片−担体タンパク質
コンジュゲートで宿主動物を免疫し、（ｃ）免疫した宿主動物から抗体を得る工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】前記ポリペプチドが配列番号５、６、７、８、９、１０、
１１また１２から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】請求項２８に記載の方法に従って調製される精製および単
離された抗体。
【請求項３１】モノクローナル抗体である請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】（ａ）ＧＣＲ９ポリペプチドを含有すると思われる試料を
該ＧＣＲ９ポリペプチドに特異的に結合する抗体と、該抗体とＧＣＲ９ポリペプ
チドからなる反応複合体の形成が可能な条件で、接触させ、（ｂ）前記試料中での抗体とＧＣＲ９ポリペプチドからなる反応複合体の形成を
検出する、ここでその反応複合体の定量によって、前記試料中のＧＣＲ９ポリペ
プチドの濃度が示される工程を含む、請求項１０または１１に記載のＧＣＲ９ポリペプチドを定量する方
法。
【請求項３３】（ａ）ＩＬ−９に反応する細胞株を入手し、（ｂ）前記細胞株をＩＬ−９の存在下に生育し、（ｃ）ＧＣＲ９誘導のレベルを、ＧＣＲ９アンタゴニスト物質候補による前処理
で得られるものと比較し、（ｄ）前記前処理が諸特徴を減少させた物質を選択する工程を含むＧＣＲ９のアンタゴニストの同定方法。
【請求項３４】前記細胞株がマウスＴＳ６細胞およびマウスＳＴ２Ｋ９細
胞からなる群より選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】（ａ）ＧＣＲ９タンパク質を発現する細胞株を入手し、（ｂ）前記細胞株をＧＣＲ９アンタゴニスト物質候補で処理し、（ｃ）前記処理がＧタンパク質活性化のレベルによって測定されるＧＣＲ９の活
性を減少させた物質を選択する工程を含むＧＣＲ９のアンタゴニストの同定方法。
【請求項３６】（ａ）ＧＣＲ９タンパク質を発現する細胞株を入手し、（ｂ）前記細胞株をＧＣＲ９アゴニスト物質候補で処理し、（ｃ）前記処理がＧタンパク質活性化のレベルによって測定されるＧＣＲ９の活
性を高めた物質を選択する工程を含むＧＣＲ９のアゴニストの同定方法。
【請求項３７】ヒトＧＣＲ９のアンチセンス配列またはその活性な断片を
含んでなるアンチセンスＤＮＡ。
【請求項３８】化合物が請求項３８に記載のアンチセンスＤＮＡからなる
請求項１２に記載の方法。
【請求項３９】化合物が請求項３８に記載のアンチセンスＤＮＡからなる
請求項１９に記載の方法。
【請求項４０】配列番号１または配列番号３に相補的な配列を有する核酸
分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする単離された核酸分子。
【請求項４１】請求項４０に記載の核酸分子によってコードされる単離さ
れたポリペプチド。
【請求項４２】請求項１に記載のＤＮＡを含んでなるベクター。
【請求項４３】原核配列要素または真核配列要素からなる群より選択され
る転写配列要素に作動可能に連結された請求項１に記載のＤＮＡを含んでなるベ
クター。
【請求項４４】前記転写配列がプロモーターである請求項４３に記載のベ
クター。
【請求項４５】請求項４２、４３または４４のベクターを含んでなる宿主
細胞。
【請求項４６】Ａ）請求項４５に記載の宿主細胞を、適当な栄養培地で、
該宿主細胞中でポリペプチドが発現される条件下に生育すること、Ｂ）発現したポリペプチドを宿主細胞および栄養培地から分離することを含むＧ
ＣＲ９ポリペプチドの組換え生産法。