JP2002502367A

JP2002502367A - ｐＡＤＰＲＴインヒビターを用いる炎症および炎症性疾患の処置法

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Publication number: JP2002502367A
Application number: JP54960898A
Authority: JP
Inventors: クン，アーネスト
Original assignee: Octamer Inc
Current assignee: Octamer Inc
Priority date: 1997-05-13
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 2002-01-22
Anticipated expiration: 2018-05-13
Also published as: IL132758A0; NZ501650A; CN1261278A; CA2289119A1; AU7484798A; BR9809115A; EP1009404A1; EP1009404A4; WO1998051308A1; WO1998051307A1; CN1198614C; AU7492698A; CA2289119C; JP4362638B2; AU745790B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、動物または哺乳動物にｐＡＤＰＲＴ抑制化合物の有効量を投与することからなる、動物または哺乳動物における炎症または炎症性疾患を治療する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ｐＡＤＰＲＴインヒビターを用いる炎症および炎症性疾患の処置法本発明は、動物または哺乳類の炎症および関節炎を含む炎症性疾患の処置法に関する。また本発明は、全身性感染から生じるまたはリポ多糖類によるインフェステーションから生じる、グラム陰性およびグラム陽性内毒素症状の両方を持っ動物または哺乳類の処置法にも関係する。これらの方法には、治療上有効量のｐＡＤＰＲＴ抑制化合物の使用が必要である。背景技術ｐＡＤＰＲＴ抑制化合物の使用は、癌やウイルス感染の処置用として報告されている。これらの処置法の具体例は、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５４６４８７１、５４７３０７４、５４８２９７５、５４８４９５１、５５１６９４１および５５８３１５５に記載されている。出版文献において、核酵素ポリ−ＡＤＰリボース・ポリメラーゼ（ｐＡＤＰＲＴ）の新規インヒビターである５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ＢＰ）は最近になって、Ｈａ−ｒａｓトランスフェクション内皮細胞系におけるインビボ腫瘍形成を抑制することが認められている［Bauerらの「Int ．J．Oncol.」（８、２３９−２５２、１９９５年），“５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ＢＰ）を用いる処置による、ｒａｓ−形質転換ウシ内皮細胞系の腫瘍形成の、成長関連酵素経路の変異と明らかな喪失”； Bauerらの「Biochimie」（７７、３４７−３７７、１９９５年），“ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの非共有結合リガンドである５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロンによる悪性表現型の逆転”］。またＩＮＨ₂ＢＰによる処置は、トポイソメラーゼＩおよびIIおよびＭＡＰキナーゼ活性において変化をもたらす［Bauerらの「Int．J．Oncol.」（８、２３９−２５２、１９９５年），“５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ＢＰ）を用いる処置による、ｒａｓ−形質転換ウシ内皮細胞系の腫瘍形成の、成長関連酵素経路の変異と明らかな喪失”；Bauerらの「Biochimie」(７７、３４７−３７７、１９９５年），“ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの非共有結合リガンドである５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロンによる悪性表現型の逆転 ”］。考察効果に基づき、癌治療におけるＩＮＨ₂ＢＰの潜在的使用に関する仮説が提案されている[Bauerらの「Int．J．Oncol.」（８、２３９−２５２、１９９５年），“５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ＢＰ）を用いる処置による、ｒａｓ−形質転換ウシ内皮細胞系の腫瘍形成の、成長関連酵素経路の変異と明らかな喪失”；Bauerらの「Biochimie」(７７、３４７−３７７、１９９５年），“ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの非共有結合リガンドである５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロンによる悪性表現型の逆転”］。悪性成長および炎症性経過は、一定の細胞シグナル形質導入経路、たとえばＭＡＰキナーゼの活性化を分配する［Kyriakisらの「J．Biol．Chem.」（２７１、２４３１３−２４３１６、１９９６年），“アラームの響き：ストレスや炎症によって活性化されるタンパクキナーゼ・カスケード”；Ferrell J．E.の「ＴＩＢＳ」（２１、４６０−４６６、１９９６年），“異様なスイッチの始動：タンパクキナーゼ・カスケードはグレード入力をスイッチ様出力に如何に変換しうるか”］。慢性炎症は、たとえば腸管上皮の場合に証明されるように、発癌性形質転換になることが少なくない［Kawaiらの「CancerRes.」（５３、５１７２−５１７５、１９９３年），“リポ多糖類誘発炎症によるラットの膀胱腫瘍形成の増加”；Rosinらの「CanserRes．」（５４（７Suppl.）、１９２９ｓ−１９３３ｓ、１９９４年），“炎症、染色体の不安定性、および癌：住血吸虫症モデル”； Choiらの「Ｇｕｔ．」（３５、９５０−９５４、１９９４年），“Crohn病および潰瘍性大腸(結腸)炎における結腸直腸癌の類似性：発癌と予防に対する暗示” ］。慢性炎症と発癌性形質転換の因果関係に基づき、この研究の目的は、ＩＮＨ₂ ＢＰがインビトロおよびインビボの炎症経過に影響を及ぼすかどうかを調べることであった。我々の研究では、多発性前炎症性メディエイタの産生は、細菌性リポ多糖類（内毒素、ＬＰＳ）によって誘発された。ＬＰＳは、数多くの細胞反応を誘発することが知られ、かつ全身性炎症応答を引き起こす。ＬＰＳ誘発の前炎症性メディエイタとしては、腫瘍壊死アルファ因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−Ｉ、インターフェロン−ガンマが包含され、一方、抗炎症性メディエイタとしては、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）やインターロイキン− １３が包含される［Deltenreらの「Acta Gastroenterol Belg.」（５８、１９３ −２００、１９９５年），“胃癌：ヘリコバクター幽門跡”；Beutlerの「J．In vest．Med.」（４２、２２７−２３５、１９９５年），“ＴＮＦ、免疫および炎症性疾患：過去１０年間のレッスン”；Lilesらの「J．InfectDis.」（１７２、１５７３−１５８０、１９９５年），“評論：炎症に必然的に伴なうシトキンの命名と生物学的重要性および宿主免疫応答”；Giroirの「Critical Car．Med.」（２１、７８０−７８９、１９９３年），“敗血症性ショック：内因性炎症性カスケードを中断する新しいアプローチ”］。これら炎症性シトキンの産生の結果として、ＬＰＳは炎症性遊離ラジカル（酸素が中心、たとえばスーパーオキシド；および窒素が中心のラジカル、たとえば酸化窒素［ＮＯ］）のおよびプロスタグランジンの産生を起こす［Nathanの「ＦＡＳＥＢＪ．」（６、３０５１−３０６４、１９９２年），“補乳類細胞の分泌産物としての酸化窒素”；Vane J． R.の「Proc．Roy．Soc．Lond B」（３４３、２２５−２４６、The Croonian Lec ture １９９３年），“内皮：血液循環のマイストロ(maestro)”；Szabo C.の「 New Horizons」（３、３−３２、１９９５年），“種々形態の循環ショックにおける酸化窒素の産生の変化”］。炎症におけるＮＯの産生は、ＮＯシンターゼの異なるイソフォーム（isoform）(ｉＮＯＳ)の発現に基づくが、炎症性シトキンの産生は、シクロオキシゲナーゼの異なるイソフォーム（シクロオキシゲナーゼ −２、ＣＯＸ−２）の発現によって説明される［Nathanの「ＦＡＳＥＢＪ．」（６、３０５１−３０６４、１９９２年），“哺乳類細胞の分泌産物としての酸化窒素”；Vane J．R.の「Proc．Roy．Soc．Lond B」（３４３、２２５−２４６、The Croonian Lecture １９９３年），“内皮：血液循環のマイストロ”；Sza boC.の「New Horizons」（３、３−３２、１９９５年），“種々形態の循環ショックにおける酸化窒素の産生の変化］。ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、並びに上述の前炎症性シトキンおよび遊離ラジカルは、ＬＰＳ誘発の炎症性応答において重要な役割を演じる［Nathanの「ＦＡＳＥＢＪ．」（６、３０５１−３０６４、１９９２年），“哺乳類細胞の分泌産物としての酸化窒素”；Vane J．R.の「Proc． Roy．Soc．Lond B」（３４３、２２５−２４６、The Croonian Lecture １９９３年），“内皮：血液循環のマイストロ”；SzaboC.の「New Hor izons」（３、３−３２、１９９５年），“種々形態の循環ショックにおける酸化窒素の産生の変化］。さらに、ＮＯ（またはその毒性副生物であるパーオキシニトリット(亜硝酸塩)）は、発癌性経過への炎症性応答の形質転換になる基本メディエイタとして意味づけられている［Bartschらの「Pharmacogenetics」（２、２７２−２７７、１９９４年），“ヒト癌病因学における内因性で形成したＮ −ニトロソ化合物およびニトロシル化剤”；Liuらの「Carcinogenesis」（１５、２８７５−２８７７、１９９２年），“ウッドチャックの肝炎ウイルス表面抗原は、肝細胞でのＮＯ合成を誘発する”；Ohshimaらの「Mutation Res.」（３０５、２５３−２６４、１９９４年），“慢性感染および癌危険因子としての炎症経過：発癌における酸化窒素の可能な役割”］。最新の研究で、我々は最初に、ＩＮＨ₂ＢＰによる処置が、ＬＰＳ誘発モデルの炎症においてインビボで、炎症性メディエイタの腫瘍壊死アルファ因子［ＴＮＦ］、インターロイキン−１０、インターロイキン−６、ＮＯ、およびプロスタグランジンの産生に影響を及ぼすかどうかを調べた。前炎症性メディエイタの産生に先行する数多くの細胞内経過がある。チロシン・キナーゼの活性化［Levitzki A.の「Eur．J．Biochem.」（２２６、１−１３、１９９４年），“シグナル−形質導入療法疾病管理への新しいアプローチ” ；Novogrodekyらの「Science ２６４Ｕ(Wash)」（１３１９−１３２２、１９９４年），“リポ多糖類誘発の致死毒性のチロシン・キナーゼインヒビターによる予防”；Marczinらの「Am．J．Physiol.」（２６５、Ｈ１０１４−１０１８、１９９３年），“チロシン・キナーゼインヒビターは、大動脈平滑筋細胞における内毒素およびＩＬ−１ベータ誘発のＮＯ合成を抑止する”］；ミトゲン−活性化タンパクキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）［Matsudaらの「J．Leukocyte Biol.」（５６、５４８−５５３、１９９４年），“ミトゲン−活性化タンパク（ＭＡＰ）キナーゼ／ＭＡＰキナーゼ・カスケードによって仲介されるシグナリング経路” ；L' Allemain G.の「Progr．Growth Factor Res.」（５、２９１−３３４、１９９４年），“ＭＡＰキナーゼ経路の解読”；Cowleyらの「Cells」（７７、８４１−８５２、１９９４年），“ＭＡＰキナーゼの活性化は、ＰＣ１２分化およびＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換に対して必要十分である”］；および核因子カッパＢ（ＮＦ−ｋＢ）経路［Baeuerleらの「Ann．Rev．Immunol.」（１２、１４１−１７９、１９９４年），“免疫系におけるＮＦ−Ｂの機能と活性化”；Schr eckらの「Free Radical Res．Comm.」（１７、２２１−２３７、１９９２年）， “核因子カッパＢ：真核生物細胞の酸化ストレス−応答転写因子（評論）”；Mu llerらの「Immunobiol.」（１８７、２３３−２５６、１９９３年），“リポ多糖類影響のメディエイタである核因子カッパＢ”］は、炎症性応答の重要な因子として認められ、かつ炎症性メディエイタの発現または産生に寄与する。従って、我々はまた、ＩＮＨ₂ＢＰがＭＡＰキナーゼのＬＰＳ誘発活性化やＬＰＳによるＮＦ−ｋＢにも影響を及ぼすかどうかをも調べた。最新の研究結果から、ＩＮＨ₂ＢＰはＬＰＳ誘発炎症性応答の多重成分(multiple components)の調整によつて、潜在的な抗炎症性効果を有することが証明される。発明の概要本発明の１つの側面は、動物または哺乳類の炎症または炎症性疾患の処置法であって、該方法は、上記動物または哺乳類に対して有効量のｐＡＤＰＲＴ抑制化合物を投与する工程から成る。本発明の他の側面は、有効量のｐＡＤＰＲＴ抑制化合物を投与する工程から成る、動物または哺乳類の炎症または炎症性疾患の処置法であって、ここで、ｐＡＤＰＲＴ抑制化合物は、下記の化合物群から選ばれる。式：［式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆はそれぞれ、水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキルまたはフェノールの群から選ばれ、必要に応じてアルキル、アルコキシ、ヒドロキシもしくはハロで置換されてよく、かつＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆の１つのみがアミノである］の化合物；式：［式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄およびＲ₅はそれぞれ、水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキルまたはフェノールの群から選ばれ、必要に応じてアルキル、アルコキシ、ヒドロキシもしくはハロで置換されてよく、かつＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄およびＲ₅の１つのみがアミノである］の化合物；および式：［式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄およびＲ₅はそれぞれ、水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキルまたはフェノールの群から選ばれ、必要に応じてアルキル、アルコキシ、ヒドロキシもしくはハロで置換されてよく、かつＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄およびＲ₅の１つのみがアミノである］の化合物。好ましいｐＡＤＰＲＴ化合物としては、６−アミノ−１，２−ベンゾピラン、３−ニトロソベンズアミド、５−アミノ−１(２Ｈ)−イソキノリノン、７−アミノ−１(２Ｈ)−イソキノリノンおよび８−アミノ−１(２Ｈ)−イソキノリノンが挙げられる。さらに本発明の他の側面として、動物または哺乳類の両グラム陰性およびグラム陽性誘発症状の処置法が包含され、該方法は、動物または哺乳類に対して治療上有効量のｐＡＤＰＲＴ抑制化合物を投与する工程から成る。さらにまた本発明の他の側面は、動物または哺乳類に対して治療上有効量のｐＡＤＰＲＴ抑制化合物を投与する工程から成る、動物または哺乳類の両グラム陰性およびグラム陽性誘発の内毒素症状の処置法であって、ここで、上記抑制化合物は上述の化合物Ｉ、化合物II、または化合物IIIの群から選ばれる。さらにまた本発明の他の側面は、動物または哺乳類に対して治療上有効量のｐＡＤＰＲＴ抑制化合物を投与する工程から成る、動物または哺乳類の両グラム陰性およびグラム陽性誘発の内毒素症状の処置法であって、ここで、上記抑制化合物は化合物Ｉ，IIまたはIIIと同様な上記構造式を有する。さらにまた本発明の他の側面は、有効量のｐＡＤＰＲＴ抑制化合物を投与する工程から成る、動物または哺乳類の関節炎の処置法であって、ここで、上記抑制化合物は化合物Ｉ，IIまたはIIIと同様な上記構造式を有する。さらにまた本発明の他の側面は、有効量のｐＡＤＰＲＴ抑制化合物を投与する工程から成る、動物または哺乳類のChron病の処置法であって、ここで、上記抑制化合物は化合物Ｉ，IIまたはIIIと同様な上記構造式を有する。さらにまた本発明の他の側面は、有効量のｐＡＤＰＲＴ抑制化合物を投与する工程から成る、動物または哺乳類のBarrett病の処置法であって、ここで、上記抑制化合物は化合物Ｉ，IIまたはIIIと同様な上記構造式を有する。本発明のｐＡＤＰＲＴ抑制化合物は、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５４６４８７１、５４７３０７４、５４８２９７５、５４８４９５１、５５１６９４１および５５８３１５５に記載の方法に従って製造することができる。本発明の方法で用いるのに好ましい抑制化合物としては、ハロ基がヨード、Ｒ基の１つがアミノであり、Ｒ基の１つが上記Ｕ．Ｓ．特許に記載の如くニトロソまたはニトロであってもよく、しかし好ましいＲ基がアミノである化合物が含まれる。また、ｐＡＤＰＲＴ抑制活性は、ヨード成分がアミノ成分に隣接するときに著しく示されることが認められた。いずれにせよ、本発明の方法で使用される化合物は、ｐＡＤＰＲＴ抑制活性を有するべきである。かかる化合物は、それ単独でまたは好ましくは、当該分野で公知の医薬的に許容しうる酸付加塩または他の適当な医薬担体といっしょに使用されてよい。図面の簡単な説明図１．Ｊ７７４細胞におけるＬＰＳ誘発の（ａ）ニトリット(亜硝酸塩)産生、（ｂ）６−ケトプロスタグランジンＦ１α産生、（ｃ）ＴＮＦ産生および（ｄ）ミトコンドリア呼吸の抑止に対するＩＮＨ₂ＢＰの効果。ＴＮＦは４ｈで測定し、他の全てのパラメータはＬＰＳ後２４ｈで測定した。＊＊は対照(コントロール)（ｐ＜０．０１）ｍと比較したときのＬＰＳに対する応答の有意変化を示し；＃＃はＬＰＳ単独（ｐ＜０．０１）と比較したときのＬＰＳの存在下のＩＮＨ₂ ＢＰの有意効果を示し；ｎ＝６〜１２ウェル。図２．ＩＮＨ₂ＢＰはＪ７７４およびＲＡＷ２６４．７細胞におけるｉＮＯＳ発現を抑制する。（ａ）対照条件下(レーン１)、ＬＰＳ処置の４ｈ後(レーン２) およびＩＮＨ₂ＢＰ（１００μＭ）の存在下細胞中のＬＰＳ処置の４ｈ後(レーン３)の、Ｊ７７４細胞（Ａ）およびＲＡＷ２６４．７マクロファージ（Ｂ）におけるｉＮＯＳおよび１８ｓｍＲＮＡの代表的ノーザン斑点(Northern blots)、（ｂ）対照条件下(ＣおよびＣ＋ＩＮＨ₂ＢＰ)およびＬＰＳ処置（ＬＰＳおよびＬＰＳ＋ＩＮＨ₂ＢＰ）の１２ｈ後のＪ７７４細胞のホモジネートにおけるｉＮＯＳ活性に関するＩＮＨ₂ＢＰの効果、＊＊は対照（ｐ＜０．０１）と比較したときのＬＰＳの有意効果を示し；＃＃はＩＮＨ₂ＢＰ（ｐ＜０．０１）による有意抑制を示し；ｎ＝４、（ｃ）ＩＮＨ₂ＢＰの存在または非存在下、対照Ｊ７７４細胞およびＬＰＳの１２ｈ後の細胞における代表的ｉＮＯＳウェスタン斑点（ Western blot）。図３．（ａ）ＩＮＨ₂ＢＰ（１００μＭ）をＬＰＳの２ｈ前、ＬＰＳといっしよに、またはＬＰＳの２，４および６ｈ後に付与したときのニトリット蓄積の時間に依存する抑制損失、（ｂ）ＬＰＳとＩＦＮの組合せによって刺激されるＪ７７４細胞におけるニトリット蓄積に対するＩＮＨ₂ＢＰの効果；ｎ＝６〜１２ウェル。図４．全長(full length)(−１５９２ｂｐ)または欠失(deletional)(−３６７ｂｐ)ｉＮＯＳプロモータールシフェラーゼ構造(構築物)のいずれかで一時的にトランスフェクションしたＲＡＷ２６４．７細胞における、ＬＰＳによるルシフェラーゼ活性の誘発に対するＩＮＨ₂ＢＰの効果。全長構造または欠失構造（黒色バー）のいずれかでトランスフェクションした細胞において、ＬＰＳ（１０μ ｇ／ｍｌ、４ｈ）による処置は、対照値に対して１０〜１２倍のルシフェラーゼ活性の誘発になった。ＩＮＨ₂ＢＰとの共同処置は、全長構造でトランスフェクションした細胞においてルシフェラーゼ活性のＬＰＳ−仲介増加を抑制したが、 −３６７ｂｐ欠失構造（灰色バー）でトランスフェクションした細胞では有意効果はなかった。データは対照細胞に対してルシフェラーゼ活性の倍増加で表示し、かっそれぞれのベーターガラクトシダーゼ活性に対して修正する。＊はＬＰＳ単独（ｐ＜０．０５）と比較したときのＬＰＳ存在下のＩＮＨ₂ＢＰの有意効果を示し；ｎ＝４それぞれのトランスフェクション。図５．ＩＮＨ₂ＢＰは意識のあるラットにおけるｉＮＯＳの誘発を抑止する。対照ラット（ｃ）、ＩＮＨ₂ＢＰ（ＩＮＨ₂ＢＰ）を注射したラット；ＬＰＳ(１５ｍｇ／ｋｇ i.p.、６ｈ）を注射したラットにおける肺ホモジネート（ａ）および血漿(プラズマ)ニトリット−ニトレート濃度（ｂ）のｉＮＯＳ活性；およびＩＮＨ₂ＢＰ（１０ｍｇ／ｋｇ i.p.）をＬＰＳの１０分前（ＩＮＨ₂ＢＰ＋ＬＰＳ）またはＬＰＳの２ｈ後（ＬＰＳ＋ＩＮＨ₂ＢＰ）に付与して処置した効果。＊＊は対照（ｐ＜０．０１）と比較したときのＬＰＳの有意効果を示し；＃＃はｐＡＤＰＲＴインヒビター（ｐ＜０．０１）による有意抑制を示し；ｎ＝４〜５。図６．ＬＰＳ投与（４ｍｇ／ｋｇ i.p.）の９０分後のマウスにおけるＬＰＳ誘発のＴＮＦ、ＩＬ−１０およびＩＬ−６応答に対するＩＮＨ₂ＢＰ（１０ｍｇ／ｋｇ i.p.）の効果。＊＊は対照（ｐ＜０．０１）と比較したときのＬＰＳの有意効果を示し；＃＃はＩＮＨ₂ＢＰ（ｐ＜０．０１）による応答の有意増加を示し；ｎ＝４〜５。図７．ＩＮＨ₂ＢＰは、内毒素ショックに付したマウスの生存を改善する：マウスにおける内毒素誘発（１２０ｍｇ／ｋｇ i.p.）の死亡率に対するＩＮＨ₂ＢＰ前処置（０．３〜１０ｍｇ／ｋｇ）の効果；各グループでｎ＝７〜８匹。図８．（ａ）１００μＭ−ＰＤ９８０５９または１５０μＭ−ＩＮＨ₂ＢＰの存在または非存在下、ビヒクルまたはＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）を２４ｈ処置したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＭＡＰキナーゼ活性、データは典型的な実験で得た値を示し、３つの異なる実験日で類似の結果が認められた。（ｂ）１５０μ Ｍ−ＩＮＨ₂ＢＰの存在または非存在下、ビヒクルまたはＬＰＳ処置の２４ｈ後のＲＡＷ２６４．７細胞における代表的なゲルＭＡＰキナーゼ・アッセイ、レーン１〜４はそれぞれ以下のグループを示す：１：ビヒクル処置対照、２：ＬＰＳ処置、３：１５０μＭ−ＩＮＨ₂ＢＰ存在下のビヒクル処置、４：１５０μＭ− ＩＮＨ₂ＢＰ存在下のＬＰＳ処置。図９．ｐＡＤＰＲＴのＩＮＨ₂ＢＰによる抑制は、対照Ｊ７４細胞の核抽出物のおよびＩＮＨ₂ＢＰ（１００μＭ）の存在または非存在下のＬＰＳ処置の９０分後の細胞におけるＮＦ−ｋＢウェスタン斑点の核転座を変えない。図１０．カラゲナン誘発の足浮腫の発生に対するＩＮＨ₂ＢＰの効果が記載。データはカラゲナン注射の１〜４ｈ後の足容積を示す(平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、各グループのｎ＝６匹)。１時間の足容積に有意増加があり（ｐ＜０．０１）、１〜４時間においてＩＮＨ₂ＢＰの足浮腫発生の有意抑制があった（^**ｐ＜０．０２）。図１１．コラーゲン誘発関節炎の発病に対するＩＮＨ₂ＢＰの効果が記載。関節炎マウス（マウスが示す関節炎の臨床的スコア＞１）の割合(％)を示す。２１日目の矢印は、第２コラーゲン免疫処置の時間を示し、２５日からの水平バーは、ＩＮＨ₂ＢＰ（Ｎ＝６）またはＶＥＨＩＣＬＥ(ビヒクル)(Ｎ＝１０)による処置の開始の時間を示す。図１２．コラーゲン誘発関節炎の苛酷に対するＩＮＨ₂ＢＰの効果が記載。コラーゲン誘発関節炎中の平均関節炎スコア。２１日目の矢印は、第２コラーゲン免疫処置の時間を示し、２５日からの水平バーは、ＩＮＨ₂ＢＰ（ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝１０）による処置の開始の時間を示す。２６日から関節炎スコアに有意増加があり（Ｉｐ＜０．０１）、２６〜３５日間でＩＮＨ₂ＢＰによる関節炎スコアの有意抑止があった（＃ｐ＜０．０５）。発明の好ましい具体例の説明本明細書で用いる定義： “抗炎症性”疾患とは、体組織の炎症がある疾患あるいは状態を指称する。かかる疾患としては、たとえばChron病、Barrett病、関節炎、多発性硬化症、心筋症疾患、大腸炎、感染性髄膜炎、脳炎等が挙げられる。 “医薬的に許容しうる酸付加塩”とは、生物学的有効性と遊離塩基の性質を保持し、および塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、メタンスルホン酸、サリチル酸等との反応によって得られる塩を指称する。 “ＡＤＰＲＴ”とは、アデノシンジホスホリボース・トランスフェラーゼを指称し、ＡＤＰ−リボースの重合を触媒する真核生物の特異的ＤＮＡ−結合核タンパクである、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＥＣ２．４．９９）としても公知である。該酵素プロセスはＤＮＡに依存する。 “アルキル”とは、飽和または不飽和の分枝鎖もしくは直鎖炭化水素基を指称する。典型的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。 “アルコキシ”とは、−Ｏ−アルキルの基を指称する。典型的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシおよびペントキシ等が挙げられる。 “シクロアルキル”とは、３〜８個の炭素原子含有の飽和モノ環式炭化水素基を指称し、たとえばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。 “置換フェニル”とは、可能な異性フェニル基の全てを指称し、たとえばアルキル、アルコキシ、ヒドロキシまたはハロの群から選ばれる置換基でモノまたはジ置換したものが挙げられる。 “ハロ”とは、クロロ、フルオロ、ブロモまたはヨードを指称し、ヨードが好ましい。本発明のｐＡＤＰＲＴ抑制化合物（特に上述の化合物Ｉ、IIまたはIIIの如き化合物）は、効力ある、特異的で非毒性の抗炎症性化合物であって、たとえば関節炎、Chron病、Barrett病などの炎症に関して公知の状態および疾病に使用することができる。また、これらの化合物は、グラム陰性およびグラム陽性誘発感染に付随する状態、特にグラム陰性感染に付随する状態（およびリポ多糖類状況や敗血症に付随する状態を含む）での処置に有用である。かかる化合物は特に、毒性があっても、極めて少ないという点で有用である。実際に、本発明化合物またはその医薬的に許容しうる塩は、動物または哺乳類において、炎症性状態もしくは疾患の抑制および／または炎症または炎症性疾患の発生の予防において十分な量で投与され、かつかかる使用目的に最適な医薬剤形で使用される。本明細書に記載の活性化合物および塩の投与は、治療作用物質の場合の許容される投与方式のいずれかによって行なうことができる。これらの投与方法としては、経口、非経口、経皮、皮下などの全身もしくは局所投与、あるいは局所的な投与方式が挙げられる。これらの薬物の好ましい投与方法は経口投与である。ある特定の場合、組成物を他の非経口剤形で投与することが必要となりうる。組成物は、意図される投与方式に基づき、固体、半固体または液体投与剤形、たとえば注射剤、錠剤、坐剤、丸剤、時間−放出力プセル剤、粉剤、液剤、懸濁液等の剤形で、好ましくは単位投与剤形であってよい。組成物は、有効量の活性ｐＡＤＰＲＴ抑制化合物またはその医薬的に許容しうる塩を含有し、さらに、該組成物は通常の医薬賦形剤や医学で慣用されている他の薬効のあるもしくは製薬上の薬物または作用物質、担体、佐剤、希釈剤等を含有してもよい。固体組成物の場合の賦形剤としては、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムが包含され、また同類のものも使用しうる。上記の活性ｐＡＤＰＲＴ抑制化合物は、たとえば担体としてポリアルキレングリコール（プロピレングリコールなど）を用いて坐剤として調剤されてもよい。液体、特に注射用組成物はたとえば、水、食塩水、水性ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどの製薬液への活性化合物の溶解、分散等を行なうことにより、注射溶液もしくは懸濁液を形成することによって調製することができる。要すれば、投与される医薬組成物は、最小量の非毒性助剤物質、たとえば湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤や、酢酸ナトリウム、トリエタノールアミン・オレエートなどの他の物質を含有してもよい。また要すれば、投与される医薬組成物は、リン脂質、陰荷電リン脂質と、コレステロール、コレステロールの脂肪酸エステルまたは不飽和脂肪酸から選ばれる化合物から成るリポソーム製剤を含有してもよい。典型的な中性リン脂質としては、Ｌ−ａ−ホスファチジルコリン、Ｌ−ａ−ホスファチジルイノシトール、Ｌ −ａ−ホスファチジル−セリン、Ｌ−ａ−ホスファチジルイノソトール、Ｌ−ａ −ホスファチジン酸、Ｌ−ａ−ホスファチジルグリセロール、Ｌ−ａ−リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミセリンおよびカルジオリピンが挙げられる。典型的な陰荷電リン脂質としては、ジアセチルホスフェートまたはホスホジグリセリド、たとえばジラウロイル，ジミリストイルホスフェート、ジパルミトイルホスフェート、ジステロイルホスフェートが挙げられる。典型的なコレステロールおよびコレステロールエーテル類としては、コレステロール、３Ｓ−ヒドロキシ−５−コレステン、ポリオキシエタニルコレステリル・セバケート、コレステロール−５，６−エポキシド、コレステリル・アセテート、コレステリル・ｎ−ブチルエーテル、コレステリル・カプレート、コレステリル・ドデカノエート、コレステリル・エチルエーテル、コレステリル・ヘプタデカノエート、コレステリル・メチルエステルが挙げられる。典型的な不飽和脂肪酸としては、アラキドン酸、ドコサヘキサン酸、エライジン酸、エルカ酸、リノール酸、ネルボン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸が挙げられる。ハロニトロ化合物は、カプセル化またはＵ．Ｓ．特許出願Ｎｏ．０８／０２００３５［名称：リポソーム製剤並びにその作成および使用法、１９９３年２月１９日出願］の記載に従って、リポソーム製剤の二層リポソームに分配してもよい。第１の具体例において、最初にリポソームを形成し、次いでＣ−アミノ，ニトロソまたはニトロ化合物を加える。Ｃ−アミノ，ニトロソまたはニトロ化合物は、カプセル化するよりはむしろ、脂質二層のリポソームに分配する（配置する）。この組成物を作成するため、典型例として、ホスファチジルコリン、ジセチルホスフェートおよびコレステロールなどの成分を、クロロホルムなどの溶剤とブレンドする。ブレンド後、クロロホルムを追い出す。次いで、これに水を加える。リポソームに水を加えると、多層板状の（multilamellar）リポソームが作成される（すなわち、該リポソームは多数の層を有するタマネギの皮に類似する）。次工程として、それらを凍結し、解凍する。液体窒素中で急速に凍結させる。急速な凍結および解凍の目的は、リポソームの寸法をより均一にするためである。このときのリポソームの寸法はまちまちであり、１回以上、たとえば５回で取扱う。解凍は、３７度の水浴で起る。凍結および解凍前に、混合物を音波破砕する。音波破砕と解凍の組合せは、皮の数を減じる。目標は、単板状系(unilamellar system)を作ることである。このとき、Ｃ−ニトロソ化合物を加え、１０ミリモル（Ｍｕ）濃度を得る。濃度は１５ミリモル以上であってもよい。この濃度の脂質で、６０ｍｌバッチの場合、総脂質濃度は６４８ｍｇで、６０ｍｌの水を加える。ホスファチジルコリンは５００ｍｇ、コレステロールは３６ｍｇ、ジセチルホスフェートは１１２ｍｇである。混合物のリポソーム濃度の増加は、混合物がより多くのＣ−アミノ，ニトロソまたはニトロ化合物を含有するのを可能ならしめる。たとえば、上記混合物の現状濃度を２倍にすることができる。６０ミルバッチの場合、上記数値を２倍にすることができ、１０００ｍｇのホスファチジルコリン、２２４ｍｇのジセチルホスフェートおよび７２ｍｇのコレステロールを有する。濃度の減少は、そこに入れるＣ−ニトロソ化合物の量を減じる。仮定の６０ｍｌバッチの場合、Ｃ−アミノ化合物アプローチの上限は、１５ミリモル濃度のＣ−アミノ化合物である。３ −ニトロソベンズアミドの場合、６０ｍｌバッチに対して１３５ｍｇである。次工程として、再水和する。次いでプロセスの次工程は、押出機（カナダ、ブリティッシュ・コロンビア、バンクーバーのリペックス・ビオメンブランズ・In c.）を用いる押出である。押出プロセスは２つの目的、すなわち、（１）リポソームの寸法の均一化および（２）滅菌に役立つ。押出には典型例として、０．１ミクロンフィルターによる濾過が含まれ、かつその後に通常、混合物を凍結乾燥する（混合物から水を取出し、微粉末とする）。これによって溶解性が改善される結果、約４０ミリモル溶液に調合でき、これは凍結乾燥前の濃度の約３倍である。凍結乾燥は粉末脂質と粉末Ｃ−アミノ化合物の混合物を生成する。そこで、同量のＣ−アミノ化合物とより少量の液体を用いて、濃度の高い混合物を作成することができる。たとえば、同重量のＣ−アミノ，ニトロソまたはニトロ化合物を有しうるが、元の容量の３分の１以下である。上記プロセスの工程を改変、たとえば凍結乾燥といった工程を削除することができよう。この第１具体例のプロセスは、Ｃ−アミノ，ニトロソまたはニトロ化合物を有意的にカプセル化するものではない。化合物をリポソームの中間に有する代わりに、化合物は膜自体に存在する。リポソームの膜内に分配されたＣ−アミノ，ニトロソまたはニトロ化合物は、標的細胞に移行し、脂質はＣ−アミノ，ニトロソまたはニトロ化合物を細胞膜の中へ運ぶだろう。このプロセスは好ましくは、直径約０．０５〜０．４５ミクロン、好ましくは約０．１〜０．２ミクロンのリポソームを作成する。単板状または多層板状のリポソームが有効である。押出の第２目的は、混合物を滅菌することである。滅菌するため、リポソームを一般に直径が４５ミクロン以下となるように作成する。０．０５ミクロン以下の寸法が、理論的に作用するだろう。第１具体例のプロセスは、たとえば水中の３ＮＯＢＡのみが０．５ミリモル濃度を有するという利点を持つ。かかるリポソーム組成物は１５ミリモルの濃度を達成する。さらに、水溶液中の３−ＮＯＢＡのみとは異なり、ＮＯＢＡ含有リポソーム溶液は、アスコルビン酸に対し耐性である。このことから、該溶液は実験室におけるマウス実験に有用となる。溶液はＮＯＢＡモノマーまたはＮＯＢＡダイマーを含有してもよい。第２の具体例において、出発物質として脂質成分の被膜を用い、該被膜を薬物の水溶液で水和する。これは自動的に、薬物を閉じ込める（カプセル化する）脂質を形成する。これは、リポソーム膜不透過性の化合物といっしょに生じる。かかる化合物の一例は、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５２６２５６４（１９９３年１１月１６日特許）に記載のもの、たとえば３−ＮＯＢＡのＬ−シスチン−スルフィン酸アダクトである。皮下投与、筋肉内または静脈内注射および注入の場合、一般に非経口の注射投与が用いられる。注射剤は、注射の前に液体に溶解するのに適当な液状溶液もしくは懸濁液または固体形状などの通常の形状で製造することができる。非経口投与のためより最近に案出されたアプローチでは、遅放出性または持続放出性システムの移植（植込み）が採用され、これは、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．３７１０７９５の記載に従って、一定レベルの投与量の維持を確実にする。上記医薬組成物のいずれも、活性成分として、０．１〜９９％、好ましくは１〜７０％の活性ｐＡＤＰＲＴ抑制化合物、特に上記式Ｉ、IIまたはIIIのハロ− Ｃ−アミノ，ニトロソまたはニトロ化合物を含有しうる。慢性炎症は、各種組織における発癌性形質転換を促進することが知られている。核酵素ポリ−ＡＤＰリボース・ポリメラーゼ（ｐＡＤＰＲＴ）の新規インヒビターである５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ＢＰ）は最近、種々の細胞シグナル形質導入経路を調節し、かつＨａ−ｒａｓトランスフェクション内皮細胞系によるインビボ腫瘍形成を取消すことが認められた。本発明の１つの側面として、インビトロおよびインビボの、炎症性メディエイタ腫瘍壊死アルファ因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）、酸化窒素（ＮＯ）およびプロスタグランジンの産生に関して内毒素（細菌性リポ多糖類、ＬＰＳ）による活性化に対するｐＡＤＰＲＴ抑制化合物、たとえばＩＮＨ₂ＢＰの効果が証明される。さらに、本発明は、インビトロのミトゲン−活性化タンパクキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）および核因子ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）の活性化に対するｐＡＤＰＲＴ抑制化合物、たとえばＩＮＨ₂ＢＰの効果を示す。培養したＪ７７４およびＲＡＷ２６４．７マクロファージにおいて、ＬＰＳは、プロスタグランジン代謝産物の産生、ＴＮＦの放出および誘発性イソフォームのＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）の発現を誘発した。プロスタグランジンおよびＮＯの産生は、用量に依存してＩＮＨ₂ＢＰによって抑制され、一方、ＴＮＦ−アルファの短時間放出の影響はなかった。ＩＮＨ₂ＢＰは、全長（−１５９２ｂｐ）ネズミ・マクロファージｉＮＯＳプロモータールシフェラーゼ構造で一時的にトランスフェクションしたＲＡＷ細胞におけるＬＰＳ仲介のルシフェラーゼ活性を顕著に抑止したが、−３６７ｂｐからなる欠失構造においてはそうではなかった。インビボのＩＮＨ₂ＢＰ前処置（ラットのＬＰＳによるｉＮＯＳの誘発を抑制）は、ＬＰＳ誘発のＴＮＦおよびＩＬ−６応答に影響を及ぼさず、かつＬＰＳ−誘発ＩＬ−１０産生を高めた。ＩＮＨ₂ＢＰ前処置は、致死モデルの内毒素ショックにおけるマウスの生存を顕著に改善した。これらの結果から、ｐＡＤＰＲＴ抑制化合物、たとえばＩＮＨ₂ＢＰはインビトロおよびインビボの効力ある抗炎症性作用を有することが証明される。ポリ−ＡＤＰリボース・シンセターゼ（ＰＡＲＳ）は、ＤＮＡ単鎖破壊によって活性化される核酵素である。ＰＡＲＳの大規模な活性化は、過酸化水素−パーオキシニトリットまたは電離線誘発の広範なＤＮＡ単鎖破壊に応じて、細胞損傷において頂点に達するエネルギー消耗の無益サイクル（futile cycle）を起こす。パーオキシニトリットの産生は最近、関節炎やカラゲナン誘発の足浮腫を含む種々の炎症において証明された。本発明は、ラットモデルのカラゲナン誘発の足浮腫およびマウスモデルのコラーゲン誘発の足浮腫において１〜４ｈで、ＰＡＲＳ，ｐＡＤＰＲＴ抑制化合物、たとえば５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ＢＰ）の新規で効力のあるインヒビターの効果を示す。雄ＤＭＡ／１Ｊマウスにおけるコラーゲン誘発関節炎は、１日目と２１日目のタイプ IIコラーゲンの２回の注射で誘発した。マウスのＩＮＨ₂ＢＰ（１日当り０．５ｇ／ｋｇ）による経口処置は、関節炎の発病時（２５日）に開始したが、２６〜３５日目の関節炎の臨床徴候の発生を遅らせた。ＩＮＨ₂ＢＰ処置動物は、ひざと足で調べたように、関節炎指数の減少（関節炎スコア：ビヒクル処置マウスで見られるスコアの２０〜５０％）と、組織状態の改善を示した。これらのデータから、ＰＡＲＳインヒビターＩＮＨ₂ＢＰは、インビボＩＮＨ₂ＢＰで抗炎症性効果を示すことが証明され、かつ投与の開始を比較的に遅くしても、コラーゲン誘発関節炎の経過を遅らせることができた。本発明のデータによって、ＰＡＲＳ活性化は関節炎、あるいは他種の炎症および炎症性疾患の発生において役割を演じるという見方が支持される。次に挙げる実施例は本発明を例示するのに役立つもので、本発明を狭くしたり、その技術的範囲を制限すると解釈すべきではない。実施例１細胞培養：マウスマクロファージセルラインＪ７７４およびＲＡＷ２６４．７を、スザボら、１９９６、「ＤＮＡ鎖切断、ポリ−ＡＤＰリボシルシンセターゼの活性化、および細胞エネルギー消耗はマクロファージ内およびペルオキシ亜硝酸塩(perox ynitrite)に曝された平滑筋細胞における細胞毒性に関与する」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１７５３−１７５８；ジンガレリら、１９９６、「ペルオキシ亜硝酸塩−媒介ＤＮＡ鎖切断はポリ−ＡＤＰリボシルシンセターゼを活性化し、細菌性リポポリサッカライドで刺激されたマクロファージにおける細胞エネルギー消耗を引き起こす」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３５０−３５８に開示のように、ダルベッコ修正イーグル培地(ＤＭＥＭ)で培養した。別の研究では、腹膜マクロファージは雄性ウィスターラットから得、インビトロで２４時間ＬＰＳの存在下あるいは非存在下で、ＩＮＨ₂ ＢＰと共に、あるいは非存在下で培養した。ラットを殺し、腹膜マクロファージを摘出し、ＤＭＥＭで培養した。細胞をＥ.ＣｏｌｉＬＰＳ(１０ｍｇ／ｍｌ) あるいはＬＰＳおよびＩＮＦ(５０μ／ＭＬ)で、様々の濃度(１−１５０ｍＭ)のＩＮＨ₂ＢＰあるいは他の薬理学的インヒビターの存在下あるいは非存在下で、種々の時間処理した。ＭＡＰキナーゼ関連アッセイ：未処理の細胞をＰＢＳで洗浄し、集め、１００万個の細胞あたり１００ｍｌの溶解緩衝液(５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．４、１％ＮＰ−４０、０．４ＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＮＡＶＯ₃、５０ｍＭＫＦ、１ｍＭＥＧＴＡ、２ｍＭＰＭＳＦ、２５ｎＭオカダイックアシッド(okadaic acid)、ロイペプチン、アプロチニン、アルナスタチンおよびアンチパインを各１ｍｇ／ｍｌ)を用いて溶解した。溶解は２０分間氷上で行い、エッペンドルフ(Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ)遠心機を用いて、１３０００ｒｐｍで１４分間遠心分離した。上清を集め、そのタンパク含量をバイオーラド(Ｂｉｏ−Ｒａｄ)染料アッセイを用いて測定した。ゲルＭＡＰキナーゼアッセイにおいて：タンパク試料(５０ｍｇ／レーン)を固定化ミエリン塩基性タンパク(ＭＢＰ、２５０ｍｇ／ｍｌゲル)を含有する１００％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル内で電気泳動した。電気泳動後、ゲルを５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７.７緩衝液(２５ｍｌ、２０分間)で１回洗浄し、ついで２５％イソプロパノール含有の同緩衝液で３０分間ずつ２回ィンキュベーションした。ゲルをついで該トリス-塩酸緩衝液で洗浄し、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.７、ｍＭ２−メルカプトエタノール、５Ｍグアニジン塩酸塩(５０ｍＬ)溶液に、３０分後にインキュベーション溶液を替えながら、１時間浸漬した。ゲルを５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.７、Ｍｍ２−メルカプトエタノール、０.０４％ＮＰ−４０の溶液を１６時間かけて５回替えながらインキュベーションすることにより、タンパクを再度栄養供給した。ゲルを２回洗浄し、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.７、５ｍＭＭｇＣｌ₂、７ｍＭ２− メルカプトエタノール含有溶液内で半時間プレインキュベーションした。最終インキュベーションは、１０ｍＭの³²ｐ−ｇ]ＡＴＰ(５０ｍＣｉ／測定)を補足した同溶液内で１時間行った。インキュベーション終了後、１０％ＴＣＡ(３×２５ｍｌ)および１０％酢酸(３×２５ｍｌ)を用いて、非結合の放射活性が無くなるまで洗浄し、乾燥し、オートラジオグラフィーに付した；サカキら、１９９５「成長因子−誘導細胞増殖に対するセラミドの増強効果」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１１：８２９−８３４。ＭＡＰキナーゼウェスタンブロッティング：細胞抽出タンパク１００ｍｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに賦し、電気泳動し、ニトロセルロース膜上にトランスブロットし、イムノプローブした。第１抗体(抗−ＭＡＰキナーゼ)をＵＢＩから得、第２抗体はアルカリホスファターゼ標識した、ＮＥＮバイオラボから得た。測定は増強ケミルミネセンス(化学発光)により行った；バウエルら、１９９５、「成長関連酵素経路の変法とラス−形質変換ウシアンドセリアルセルラインの、５−ヨード−６−アミノ−１,２−ベンゾピロン(ＩＮＨ₂ＢＰ)処理による発癌性の明白な喪失」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．８：２３９−２５２。細胞核抽出物の調製およびＮＦ−ｋＢウェスタンブロッティング：細胞をＬＰＳでＩＮＨ₂ＢＰの存在下または非存在下で９０分間処理した。ミニ細胞核抽出物を、ハサナインら、１９９３、「ＤＮＡ−結合因子の増強ゲル可動性シフトアッセイ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３：１６２−７に開示のように調製した。細胞を暫時スクレープし、暫時遠心分離し、得られたペレットを４００ｍｌの冷緩衝液Ａ[ヘペス、ｐＨ７.９(１０ｍＭ)、ＫＣｌ(１０ｍＭ) 、ＥＤＴＡ(０.１ｍＭ)、ＥＧＴＡ(０.１ｍＭ)、ＤＴＴ(１ｍＭ)、ＰＭＳＦ(０. ５ｍＭ)、ペプスタチンＡ(１ｍｇ／ｍｌ)、ロイペプチン(１０ｍｇ／ｍｌ)、およびアプロチニン(１０ｍｇ／ｍｌ)]に、２５ｍｌの１％ＮＰ−４０の存在下、氷冷下１５分間再懸濁した。ついで、試料を渦巻撹拌し、１０,０００ｇで１分間遠心分離し、得られたペレットを１００ｍｌの緩衝液Ｂ[ヘペス、ｐＨ７.９(２０ｍＭ)、ＮａＣｌ(４００ｍＭ)、ＥＤＴＡ(１ｍＭ)、ＥＧＴＡ(１ｍＭ)、ＤＴＴ(１ｍＭ)、ＰＭＳＦ(０.５ｍＭ)、ペプスタチンＡ(ｍｇ／ｍｌ)、ロイペプチン(１０ｍｇ／ｍｌ)、およびアプロチニン(１０ｍｇ／ｍｌ)]に再懸濁した。ロッカープラットフォーム上で４℃１５分間振とう後、試料を４℃で１５１００，１００ｇで１５分間遠心分離した。７０ｍｌ部ずつ１５０mlのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で処理した。ウェスタンブロッティングを、ウサギ抗−マウスＮＦ −ｋＢ１次抗体(サンタ・クルズ・バイオテクノロギー、サンタ・クルズ、ＣＡ) のツイーンＴＢＳ(０.０２％)の１：７５０を用いて上記の如く行った。亜硝酸塩または亜硝酸塩／硝酸塩濃度の測定：刺激後２４時間後の培養上清中の亜硝酸塩を、スザボら、１９９６、「ＤＮＡ鎖切断、ポリ−ＡＤＰリボシルシンセターゼの活性化、および細胞エネルギー消耗はマクロファージ内およびペルオキシ亜硝酸塩(peroxynitrite)に曝された平滑筋細胞における細胞毒性に関与する」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ.Ｓ.Ａ．９３：１７５３−１７５８；ジンガレリら、１９９６、「ペルオキシ亜硝酸塩−媒介ＤＮＡ鎖切断はポリ−ＡＤＰリボシルシンセターゼを活性化し、細菌性リポポリサッカライドで刺激されたマクロファージにおける細胞エネルギー消耗を引き起こす」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３５０−３５８；スザボら、１９９４、「スペルミンは免疫−刺激Ｊ７７４．２マクロファージにおける酸化窒素の生成を阻害する：血清因子の要求」、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１２：３５５−３５６に開示の如く、グリース(Ｇｒｉｅｓｓ)試薬(１％スルファニルアミドおよび０.１％ナフチルエチレンジアミンの５％燐酸溶液) を培地１００ｍｌ試料に加えて、測定した。５５０ｎｍにおける光学濃度(ＯＤ₅ ₅₀ )をスペクトラマックス(Spectramax)２５０マイクロプレートリーダー(モレキュラー・デバイシス、サニーベイル、ＣＡ)を用いて測定した。血漿試料中の総亜硝酸塩／硝酸塩濃度の測定のため、硝酸塩は硝酸塩還元酵素とインキュベーションすることにより亜硝酸塩に還元した；ジンガレリら、１９９６、「ペルオキシ亜硝酸塩−媒介ＤＮＡ鎖切断はポリ−ＡＤＰリボシルシンセターゼを活性化し、細菌性リポポリサッカライドで刺激されたマクロファージにおける細胞エネルギー消耗を引き起こす」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３５０−３５８。６−ケトプロスタグランジンＦ_1aの測定：ＬＰＳ刺激４時間後の６−ケトプロスタグランジンＦ_1a生成を、細胞培養上清１００ｍｌ試料内で、特異的放射免疫測定法を用いて測定した；スザボら、１９９４、「スペルミンは免疫−刺激Ｊ７７４．２マクロファージにおける酸化窒素の生成を阻害する：血清因子の要求」、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１２：３５５−３５６。サイトカイン測定：血漿および細胞培養上清中のサイトカインレベルをＥＬＩＳＡで測定した。ＩＬ−１０およびＩＬ−６の血漿レベルは、エンドーゲン(エンドーゲン・インコーポレィテッド、ボストン、ＭＡ)のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＴＮＦ−αの血漿および細胞培養上清中の濃度は、ゲンザイム(ゲンザイム・コーポレイテッド、ボストン、ＭＡ)のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した；スザボら、１９９７、「イソプロテレナールは腫瘍壊死因子、インターロイキン−１０、インターロイキン−６および酸化窒素の生成を調節し、内毒素血症の血管性低反応性の発生に対して保護する」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９０：９５−１００。ミトコンドリア呼吸の測定：２４時間後のミトコンドリア呼吸は、３−(４,５−ジメチルチアゾール−２− イル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドのホルマザンへのミトコンドリア−依存還元によって、評価した；スザボら、１９９６、「ＤＮＡ鎖切断、ポリ−ＡＤＰリボシルシンセターゼの活性化、および細胞エネルギー消耗はマクロファージ内およびペルオキシ亜硝酸塩(peroxynitrite)に曝された平滑筋細胞における細胞毒性に関与する」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ.Ｓ. Ａ．９３：１７５３−１７５８；ジンガレリら、１９９６、「ペルオキシ亜硝酸塩−媒介ＤＮＡ鎖切断はポリ−ＡＤＰリボシルシンセターゼを活性化し、細菌性リポポリサッカライドで刺激されたマクロファージにおける細胞エネルギー消耗を引き起こす」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３５０−３５８。ｉＮＯＳｍＲＮＡのノーザンブロッティング細胞を、ＩＮＨ₂ＢＰの存在下または非存在下でＬＰＳに４時間さらしたのち、全ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬを用いて記載されているように抽出した。１５ｍｇの全ＲＮＡを含むアリコートを、３％ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル電気泳動にかけた。ＲＮＡをナイロンメンブランにブロッティングして移し、ＵＶ自己架橋させた。メンブランを、ランダムプライミング（Pharmacia，Pisca taway，NJ）により[³²Ｐ]ｄＣＴＰ（比活性３,０００Ｃｉ／ｍＭ；ＮＥＮ）で標識したネズミｉＮＯＳｃＤＮＡプローブ（１０⁶cpm／ｍＬ）と、４２℃にて一晩、記載されているようにしてハイブリダイゼーションした（Lowensteinら,1993, “Macrophage nitric oxide synthase gene:two upstream regions mediate ind uction by interferon gamma and lipopolysaccharide,”Proc ．Natl．Acad．Sc i．U.S.A. 90:9730-9734）。ハイブリダイゼーションしたフィルターを、５３℃ にて、２×クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、０.１％ＳＤＳおよび２.５ｍＭＮａＨＰＯ₄、１ｍＭＥＤＴＡ、０.１％ＳＤＳ溶液で順次に洗浄した。ｉＮＯＳのプロービングの後、沸騰した５ｍＭＥＤＴＡでメンブランから脱離させ、ハウスキーピング遺伝子としての１８ＳリボソームＲＮＡについて[³²Ｐ]放射能標識オリゴヌクレオチドプローブと再びハイブリダイゼーションした。洗浄したのち、Phosphor Imagerスクリーンを用い、一晩露光した。ｉＮＯＳウェスタンブロッティング細胞を、ｐＡＤＰＲＴ阻害剤の存在下および非存在下に、ＬＰＳで２０時間処理した。次いで、冷却したＰＢＳ中で細胞を破壊し、１４０００Ｇで３０秒間遠心した。上清を除去し、ＲＩＰＡ(５００ｍＬ)、アプロチン(１０ｍｇ／ｍＬ)およびＰＭＳＦ（０.５ｍＭ）を含む溶解緩衝液を加えた。試料を２２ゲージの針に通すことによりＤＮＡをせん断した。タンパク質含量は、Bradford法（BIO-Ra d）により測定した。サイトゾルタンパク質(２００ｍｇ／レーン）をＳＤＳ-ＰＡＧＥ緩衝液に加え、５分間煮沸し、７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、等速電気泳動緩衝系を使用するSemi-Dry法を用いてニトロセルロース膜（０.２ｍｍ）へ移した。３％ゼラチン中で１時間ブロッキングしたのち、洗浄し、トゥイーンTris緩衝塩水（ＴＴＢＳ）および１％ゼラチン中、ＴＴＢＳ中１：１０００（０.０％）の一次ウサギ抗マウスｉＮＯＳ（upstate Biotechnology，Lake Pla cid，NY）で試料を２.５時間イムノブロッティングした。アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ウサギｉＧＧ抗体を二次抗体として使用した。抗体結合を、炭酸緩衝液中のニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロインドリルホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ）によって視覚化した。ｉＮＯＳ活性の測定細胞を、ｐＡＤＰＲＴ阻害剤の存在下および非存在下に、ＬＰＳで１２時間処理した。Ｊ７７４細胞のホモジネートまたは肺ホモジネートにおけるＬ−アルギニンのＬ−シトルリンへのカルシウム非依存性変換の測定値を、記載されているようにｉＮＯＳ活性の指標として使用した（Szaboら，1994，“Spermine inhibi ts the production of nitric oxide in immuno-stimulated J744.2 macrophage s:requirement of a serum factor,”Br ．J．Pharmacol. 112:355-356）。細胞を破壊するか、または肺を、５０ｍＭ Tris HCl、０.１ｍＭＥＤＴＡ、０.１ｍＭＥＧＴＡおよび１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ｐＨ７.４）からなるホモジネーション緩衝液に入れ、Tissue Tearor 985-370ホモジナイザー（Biospec Products，Racine，WI）を用い、緩衝液中、氷の上でホモジネーションした。次いで、ホモジネート中での[³Ｈ]-Ｌ-アルギニンの[³Ｈ]-Ｌ-シトルリンへの変換を測定した。ホモジネート（３０ｍＬ）を[³Ｈ]-Ｌ-アルギニン（１０ｍＭ，５ｋＢｑ／チューブ）、ＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）、カルモジュリン（３０ｎＭ）、テトラヒドロビオプテリン（５ｍＭ）、およびＥＧＴＡ（５ｍＭ）の存在下に、２２℃にて２０分間インキュベーションした。ＥＧＴＡ（２ｍＭ）とＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含有する０.５ｍＬの氷冷ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５.５）で希釈することにより反応を止めた。反応混合物をDowex ５０Ｗ（Ｎａ＋型）カラムに注ぎ、溶出した[³Ｈ]-Ｌ-シトルリン活性をシンチレーション計測により測定した。ｉＮＯＳプロモーターの機能アッセイ我々の実験条件の下では、Ｊ７７４細胞は、リン酸カルシウム、リポフェクチンおよびリポフェクタミン法を使用してそれら細胞を一過性トランスフェクションする我々の試みには耐性であったので、トランスフェクション試験は、ＲＡＷ２６４.７細胞で行った。レポーター遺伝子ルシフェラーゼの上流に５’ネズミマクロファージｉＮＯＳプロモーター領域を組み込んだリポーター遺伝子構築物でＡＷ２６４.７細胞を一過性トランスフェクションすることにより、ｉＮＯＳプロモーター活性を評価した；Lowensteinら，1993，“Macrophase nitric oxid e synthase gene:two upstream regions mediate induction by interferon gam ma and lipopolysaccharide,”Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A.．99:9730-9734; （Dr．Charles J．Lowenstein．Johns Hopkins Universityより提供された）。２種類の構築物を使用した：完全長のプロモーター構築物（約１５９２bp）と約３６7bpからなる欠失構築物。細胞を６ウェルのカルチャープレートに集密度約５０％で加え、カチオンリポソーム（Lipofectin，Gibco）を用い、等モルの各ｉＮＯＳプロモータールシフェラーゼ構築物でトランスフェクションした。トランスフェクション効率の違いを調整するために、細胞をｐＳＶ４０−ｂ−ガラクトシダーセで同時トランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を一晩回復させ、次いで培地単独（コントロール）、ＬＰＳ（１０ｍｇ/ｍＬ）、またはＬＰＳ＋ＩＮＨ₂ＢＰ（１００ｍＭ）で処理した。４時間処理したのち、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、リポーター溶解緩衝液（Promega）中で溶菌し、ルシフェラーゼ活性を分析し、各粗（raw）-ガラクトシダーゼ活性について較正し、コントロール細胞（トランスフェクション後、培地単独で処理）を越える増加倍数で表示する。インビボ実験雄性Wisterラットおよび雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスをCharles River Laboratori es（Wilimington，MAまたはBudapest，Hungary）より入手した。動物に餌と水を自由に与え、照明は１２時間周期で維持した。ラットにE．coli ＬＰＳ（１５ｍｇ／kg）を腹腔内注射し、６時間後に屠殺した。亜硝酸塩／硝酸塩測定のためにプラズマ試料を採取し、ｉＮＯＳ測定のために肺試料を採取した。個々のラット群を、ＬＰＳ注射の１０分前またはＬＰＳ注射の２時間後にＩＮＨ₂ＢＰ（１０ｍｇ／ｋｇi.p.）で処理した。ＬＰＳ誘導性のサイトカイン応答の測定に関する実験では、マウスに、体重１０gあたり０.１ｍＬの容量で賦形薬またはＩＮＨ₂ＢＰ(１０ｍｇ／ｋｇ)のいずれかを腹腔内注射した。３０分後、４ｍｇ／kgのＬＰＳを腹腔内投与した。マウスをＬＰＳ処置の９０分後に屠殺し、血液を、ＥＤＴＡを含む氷冷したエッペンドルフチューブに採取し、４℃にて１０分間遠心した。分析するまでプラズマを −７℃で保存した。マウスを用いるいくつかの実験では、０時間目でマウスにＬＰＳ（１２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、生存をＬＰＳ投与後４２時間監視した。それぞれの群のマウスには、ＬＰＳ投与の１８時間前、４時間前、０時間後、６時間後、２４時間後および３０時間後に、賦形薬またはＩＮＨ₂ＢＰによる処置(０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内)を施した。材料ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＴＲＩＺＯＬおよびウシ胎児血清は、Gibco（Grand Isl and，NY）から入手した。[³Ｈ]ＮＡＤ＋および[³²Ｐ]ＮＡＤ＋は、DuPont NEN（ Boston，MA）より入手した。アルコールデヒドロゲナーゼおよびＮＤ＋は、Boeh ringer Mannheim（Indianapolis，IN）より入手した。ＰＤ９８０５９は、Cal B iochem（La Jolla，CA）より入手した。その他の試薬はすべてSigma（St．Louis ，MO）より入手した。統計学的評価の平均±標準誤差で示す。スチューデント無対（unpaired）ｔ−テストを群間の平均値の比較に使用した。０.０５未満のｐ値は、統計学的有意であるとみなした。結果ＩＮＨ₂ＢＰは、Ｊ７７４マクロファージにおいてＬＰＳ誘導性の一酸化窒素およびプロスタグランジンを抑制するが、ＴＮＦ−ａ産生は抑制しない。ＩＮＨ₂ＢＰ処理は、Ｊ７７４マクロファージにおいてＬＰＳ誘導性の一酸化窒素形成の用量依存的阻害をもたらした（図１ａ）。ＩＮＨ₂ＢＰは、６−ケトプロスタグランジンＦ_1aのＬＰＳ誘導性の産生を同様に抑制した（図１ｂ）が、ＴＮＦの産生は抑制せず（図１ｃ）、ＬＰＳ誘導性のミトコンドリア呼吸の抑制を元の水準に戻した（図１ｄ）。ＩＮＨ₂ＢＰは、ｉＮＯＳｍＲＮＡおよびタンパク質発現の著しい阻害をもたらした（図２ａ〜ｃ）。ＩＮＨ₂ＢＰによる亜硝酸塩産生の阻害は、ｉＮＯＳ誘導の刺激の前とは対照的に、薬剤をＬＰＳ投与の数時間後に投与した場合に大きく減少した（図３ａ）。さらに、ｉＮＯＳに対するＩＮＨ２ＢＰの阻害効果は、ＬＰＳをインターフェロンガンマ（ＩＮＦ−ｇ５０μ／mL）と組み合わせて免疫刺激に使用した場合に大きく減少した（図３ｂ）。ＩＮＨ₂ＢＰによるｉＮＯＳプロモーター誘導の選択的抑制ＩＮＨ₂ＢＰによるｉＮＯＳの調節をさらに試験するために、我々は、ネズミマクロファージｉＮＯＳプロモーター−ルシフェラーゼ構築物を用いる一過性分析を行った。以前のデータ（Lowensteinら，1993，“Macrophase nitric oxide synthase gene:two upstream regions mediate induction by interferon gamma and lipopolysaccharide”Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A. 90:9730-9734）と一致して、我々は、ＬＰＳによるルシフェラーゼ活性の約１０倍〜１２倍の誘導によって証明されるように、ＬＰＳが介在するネズミマクロファージｉＮＯＳの転写調節に関係する重要な役割を見い出した。完全長のプロモーター構築物（約１５９２ｂｐ）でトランスフェクトした細胞を、ＩＮＨ₂ＢＰで同時処置すると、ＬＰＳが介在するルシフェラーゼ活性が完全に阻害された（図４）。しかし、約３６７ｂｐの欠失構築物でトランスフェクトした細胞を、同じく同時処置すると、ＬＰＳが介在するルシフェラーゼ活性に対する有意な影響はなかった（図４）。ＩＮＨ₂ＢＰのインビボ抗炎症効果ＩＮＨ₂ＢＰの前処置は、プラズマ亜硝酸塩／硝酸塩のＬＰＳ誘導性の増加、および意識のあるラットにおける肺ｉＮＯＳ活性の増加を減少させた（図５）。ＮＯ産生に対するＩＮＨ₂ＢＰの阻害効果は、薬物をＬＰＳ刺激の数時間後に細胞または動物に投与した場合には減少した（図５）。形質転換した細胞系と同様、１００ｍＭＩＮＨ₂ＢＰによる処置は、インビトロでＬＰＳ（１０ｍｇ／ｍＬ）により刺激された初代細胞（ラットから得た腹腔マクロファージ）における亜硝酸塩産生を有意に減少させた（５６±７％、ｐ＜０.０１）（ｎ＝４）。インビトロでの結果（図１ｃ）と同様に、ＩＮＨ₂ＢＰは、マウスにおけるプラズマＴＮＦレベルのＬＰＳ誘導性の増加に対して有意な影響は及ぼさなかった（図６ａ）。ＩＮＨ₂ＢＰは、ＬＰＳ誘導性のＩＬ−６産生にも影響を及ぼさなかった（図６ｃ）。しかし、ＩＮＨ₂ＢＰは、ＬＰＳ誘導性のＩＬ−１０プラズマ応答の増大をもたらした（図６ｂ）。ＩＮＨ₂ＢＰによるマウスの前処置は、ＬＰＳの致死用量投与時の生存率において、有意で用量依存的な改善をもたらした（図７）。ＩＮＨ₂ＢＰ活性は、ＭＡＰキナーゼのＬＰＳ誘導性の活性化を破壊するが、ＮＦ−κＢの活性化と核移行には変化を及ぼさない。ｉＮＯＳの誘導および他の炎症メディエーターの産生に先立つ複数の細胞内過程が存在する。チロシンキナーゼの活性化は、炎症メディエーターにおける重要な因子であると認識されている（Levitzki，A，1994，“Signal-transduction t herapy．A novel approach to disease management,”Eur ．J．Biochem. 226:1- 13;Novogrodskyら，1994,“Prevention of lipopolysaccharide-induced lethal toxicity by tyrosine kinase inhibitors,”Science 264(Wash):1319-22;Marc zinら，1993，“Tyrosine kinase inhibotors surppress endotoxin-and IL-1-b eta-induced NO synthesis in aortic smooth muscle cells,”Am ．J．Physiol. 265:H1014-1018，mitogen-activated protein kinase(MAP kinase);Matsudaら，1994，“Signaling pathways mediated by the mitogen-activated protein（ MAP）kinase/MAP kinase cascade,”J ．Leukocyte Biol. 56:548-53;L'Allema in，G.，1994，“Deciphering the MAP kinase pathway,”Progr．Growth Facto r Res. 5:291-334;Cowleyら，1994，“Activation of MAP kinase kinase is ne cessary and significant for PC12 differentiation and for transformation of NIH 3T3 cells,”Cells 77:841-52;and the NF-κB pathway;Baeuerleら，19 94，“Function and activation of NF-κB in the immunesystem,”Ann ．Rev． Immunol. 12:141-79;Schreckら，1992，“Nuclear factor kappa B:an oxidativ e stress-response transcription factor of eukaryotic cells(areview),”Fr ee Radical Res ．Comm. 17:221-37;Mullerら，1993，“Nuclear factor kappa B ，a mediator of lipopolysaccharide effects,”Immunobiol. 187:233-56）。したがって、我々は、炎症過程のＩＮＨ₂ＢＰによる阻害作用におけるこれらの経路の関与の可能性を解明するために、ＬＰＳ刺激に応答するＭＰＡキナーゼおよびＮＦ-κＢの活性化にＩＮＨ₂ＢＰが影響を及ぼすかどうかについて調べた。刺激していないＲＡＷ２６４.７マクロファージにおいて、かなりの基底ＭＡＰキナーゼ活性が存在していた。ＬＰＳ処置（１０ｍｇ／ｍＬ、２４時間）は、ウェスタンブロット（示していない）によって示されるように、免疫反応性のＭＡＰキナーゼ含量に影響を及ぼすことなく、ＭＡＰキナーゼ活性の約２.５倍の増加を誘導した（図８）。ＩＮＨ₂ＢＰ（１５０ｍＭ）による３日間の細胞の前処理は、基底のＭＡＰキナーゼ活性を約５０％抑制し、ＭＡＰキナーゼのＬＰＳ誘導性の増加を破壊した（示していない）。基底のＭＡＰキナーゼ活性は、ＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤（Pangら，1995，“inhibition of MAP kinase kinas e blocks the differentiation of PC-12 cells induced by nerve growth fact or,”J ．Biol．Chem. 270:13585-8）、ＰＤ９８０５９（１００ｍＭ）によってわずかに抑制され、ＬＰＳ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化もまた阻害された（図８）。心筋細胞における最近のデータ（Singhら，1996，“Regulation of cytol ine-inducible nitric oxide synthesis in cardiac myocytes and microvascul ar endothelial cells,”J ．Biol．Chem. 271:1111-1117）と一致して、ＬＰＳ誘導性の亜硝酸塩産生もまたＰＤ９８０５９によって抑制された（５３％、１００ｍＭ、ｎ＝３）。単核細胞系の領域における最近の観察（Baeuerleら，1994，“Function and a c tivation of NF-κB in the immune system,”Ann ．Rev．immunol. 12:141-79）と同様に、我々は、Ｊ７７４細胞およびＲＡＷ２６４.７細胞における基底（構成性）の核ＮＦ−κＢを見い出した。ＬＰＳ刺激は、ＮＦ−κＢの核移行の増加をもたらし、ＩＮＨ₂ＢＰの阻害は、ＬＰＳに応答する核移行に影響しなかった（図９）。考察ポリ（ＡＤＰ−リボース）シンテターゼ（ｐＡＤＰＲＴ）は、核内に豊富に存在する、タンパク質修飾およびＡＤＰ重合化酵素である（Uedaら，1985，“ADP- ribosylation,”Ann ．Rev．Biochem. 54:73-100）。ｐＡＤＰＲＴの生理学的機能は、多くの議論の対象になってきた。ｐＡＤＰＲＴがＤＮＡ修復酵素であるという最初の提案とは対照的に、現在では、ｐＡＤＰＲＴはＤＮＡ修復には直接関与しておらず（Lindahlら，1995，“Post-translational modification of poly (ADP-ribose)polymerase induced by DNA strand breaks,”Trends Biochem ．Sc i. 20:405-411）、ｐＡＤＰＲＴ遺伝子を除去したトランジェニックマウス由来の細胞が正常なＤＮＡ修復特性を有することが明らかになっている（Bukiら，19 95，“Identification of domains of poly(ADP-ribose)polymerase for protei n binding and self association”J ．Biol．Chem. 270:3370-3377）。生理学的条件下で、ｐＡＤＰＲＴは数多くの細胞タンパク質やＤＮＡ部位に結合することができ、多面発現的な細胞調節機能を発揮し得る（Bauerら，1995，“Modificat ion of growth related enzyme pathways and apparent loss of tumorigenicit y of a ras-transformed bovine endotherial cell line by treatment with 5- iodo-６-amino-１,２-benzpyrone(INH₂BP),”Int ．J．Oncol. 8:239-252;Bauer ら，1995，“Reversal of malignant phenotype by 5-iodo-６-amino-１,２-ben zopyrone，a non-covalently binding ligand of poly(ADP-ribose)polymerase, ”Biochimie 77:347-377;Bukiら，1995，“Identification of domains of poly (ADP-ribose)polymerase for protein binding and self association,”J ．Bio l．Chem. 270:3370-3377）。ｐＡＤＰＲＴ活性化はまた、特に放射線による傷害およびオキシダントストレスの後、細胞死を誘導するメカニズムとしてはたらくと提唱されてきた（Cochrane，1991，“Mechanisms of oxidant injury of cells,”Molec ．Aspects Med. 12:137-147;Berger，1991，“Oxidant-induced cytotoxic ity：a challenge for metabolic modulation,”Am ．J．Respir．Cell．Biol．B iol. 4:1-3）。ｐＡＤＰＲＴの重要な生理学的機能のうちの１つは、酵素の誘導、遺伝子発現および細胞分化の調節であり得る（Bauerら，1995，“Modificatio n of growth related enzymatic pathways and apparent loss of tumorigenici ty of a ras-transformed bovine endothelial cell line by treatment with 5 -iodo-６-amino-１,２-benzopyrone(INH₂BP),”Int ．J．Oncol. 8:239-252;Baue rら，1995，“Reversal of malignant phenotype by 5-iodo-６-amino-１,２-be nzopyrone，a non-covalently binding ligand of poly(ADP-ribose)polymerase ,”Biochimie 77:347-377;Minagaら，1978，“Induction of cardiac L-ornithi ne decarboxylase by nicotinamide and its regulation by putrescine,”Eur ．J．Biochem. 91:577-85;Griffinら，1984，“The in vivo effect of benzami de and phenobarbital on liver enzymes:poly(ADP-ribose)polymerase，cytoch rome P-450，styrene oxide hydrolase，cholesterol oxide hydrolase，choles terol oxide hydrolase，glutathione S-transferase and UDP-glucuronyl tran sferase,”Biochem ．Biophys．Res．Comm. 122:770-5）。ＩＮＨ₂ＢＰによるアルカリホスファターゼの誘導（Bauerら，1995，“Modification of growth rela ted enzymatic pathways and apparent loss of tumorigenicity of a ras-tran sformed bovine endothelial cell line by treatment with 5-iodo-６-amino- １,２-benzopyrone(INH₂BP),”Int ．J．Oncol. 8:239-252）は、ある種のリン酸化依存性酵素、たとえばＭＡＰキナーゼ、トポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩＩの不活化をもたらすようである。Ha-rasでトランスフェクトされたウシ内皮細胞においてＩＮＨ₂ＢＰは発癌性を排除し、細胞増殖を抑制し、トポィソメラーゼＩ、トポイゾメラーゼＩＩ、およびＭＡＰキナーゼ活性を増加させ、ＤＮＡ-メチル-トランスフェラーゼおよびタンパク質キナーゼＣを下方調節し、ＯＤＣは、Ｒｂタンパク質の低リン酸化（hypophosphorylation）を増大させ、ｒａｓ遺伝子の発現を癌遺伝子の損失なしに阻害する（Bauerら，1995，“Modif ication of growth related enzymatic pathways and apparent loss of tumori g enicity of a ras-transformed bovine endothelial cell line by treatment w ith 5-iodo-６-amino-１,２-benzopyrone(INH₂BP),”Int ．J．Oncol. 8:239-252 ;Bauerら，1995，“Reversal of malignant phenotype by 5-iodo-６-amino-１, ２-benzopyrone，a non-covalently binding ligand of poly(ADP-ribose)polym erase，”Biochimie 77:347-377）。ＩＮＨ₂ＢＰの最近記載された抗癌作用（Bauerら，1995，“Modification of growth related enzymatic pathways and apparent loss of tumorigenicity of a ras-transformed bovine endothelial cell line by treatment with 5-iodo -６-amino-１,２-benzopyrone(INH₂BP)，”Int ．J．Oncol. 8:239-252;Bauerら，1995，“Reversal of malignant phenotype by 5-iodo-６-amino-１,２-benzo pyrone，a non-covalently binding ligand of poly(ADP-ribose)polymerase,”Biochimie 77:347-377）、および特にＮＯ産生に関係する慢性炎症と癌との関連（緒言を参照）に基づいて、ここで我々は、ＩＮＨ₂ＢＰがＬＰＳ誘導性の炎症応答をインビトロおよびインビボで調節するかどうかを観察した。我々は、試験した経路とメディエーターのいくつか（ＭＡＰキナーゼ、プロスタグランジン、ＮＯ）が、ＩＮＨ₂ＢＰによって抑制されたが、他のメディエーター（ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＮＦκＢ）は影響されなかったか、あるいは増加した（ＩＬ−１０）ことを見い出した。概して、本発明のデータは、ＩＮＨ₂ＢＰなどのｐＡＤＰＲＴ阻害化合物は抗炎症作用を発揮し、これらの作用の組み合わせが、このｐＡＤＰＲＴの阻害剤で前処理された動物または哺乳類の生存率の改善の基礎となり得ることを示している。実施例２ＩＮＨ₂ＢＰはｉＮＯＳのＬＰＳ誘導性誘導を抑制する背景技術では、種々の細胞において、前炎症性刺激に応答して、誘導可能な一酸化窒素（ＮＯ）シンターゼのイソ体（ｉＮＯＳ）を発現させている。ｉＮＯＳによるＮＯの過剰産生は、ショックおよび炎症において重要な役割を演じ［Nath anの（１９９２）“哺乳類細胞の分泌産物としてのＮＯ”、FASEB J．，６:３０５１−３０６４；Vane,J.R.のThe Croonian Lecture“内皮：血液循環の指揮者 ”、Proc.Rov.Soc.Lond B、３４３：２２５−２４６；Szabo,C.の（１９９５）“循環性ショックの種々の形態における一酸化窒素の産生の変更”、New Horizons、３：３−３２］、ガン原性形質転換しやすくする［Bartschらの（１９９４）“ヒト癌病因学における内因的に形成されたＮ−ニトロソ化合物およびニトロソ化剤”、Pharmacogenetics、２：２７２−７；Liuらの（１９９２）“ ウッドチャック肝炎ウイルス表面抗原は肝細胞においてＮＯ合成を誘導する”、 Carcinogenesis、１５１５：２８７５−７；Ohshimaらの（１９９４）“ガンの危険因子としての慢性感染および炎症プロセス：ガン原性における一酸化窒素の可能な役割”、Mutation Res.、３０５：２５３−６４］。マウスｉＮＯＳ遺伝子のプロモーター領域がクローニングされており、ＬＰＳおよびＩＦＮに応答する誘導能力の原因となる別の領域が同定されている。ｉＮＯＳのＬＰＳ媒介性誘導は、ＮＦ−ｋＢの可動化および核トランスロケーションに関与するように思われる。ｉＮＯＳの誘導は、チロシンキナーゼの薬理学的インヒビターおよびＮＦ −ｋＢ活性化によっても阻害される［Szabo,C.の（１９９５）“循環性ショックの種々の形態における一酸化窒素の産生の変更”、New Horizons、３：３−３２］。ｉＮＯＳ発現におけるＩＮＨ₂ＢＰの阻害効果は、亜硝酸塩の産生の阻害、ｉＮＯＳｍＲＮＡの発現およびｉＮＯＳタンパク質の発現によって示される。ＩＮＨ₂ＢＰは、ｉＮＯＳ誘導のために刺激後回数を増やしながら適用される場合に、徐々にその効果を失うので、調節はｉＮＯＳ産生の初期段階で起こる。ＩＮＨ₂ ＢＰによるｉＮＯＳ誘導の調節は、インビトロおよび動物の両方において起こる。さらに、我々のデータは、ＬＰＳ誘導性シクロオキシゲナーゼ代謝物の産生が、ｉＮＯＳの誘導と同様に、ＩＮＨ₂ＢＰによって調節されることを示している。前炎症性サイトカインによるシクロオキシゲナーゼ代謝物の産生は、新規ｍＲＮＡおよびタンパク質合成およびｉＮＯＳ誘導のプロセスと類似したプロセスによるＣＯＸ−２の発現によるものである［Vaneらの（１９９５）“抗炎症性薬物の作用のモードへの新規洞察”、Inflamm.Res.、４４：１−１０］。しかし、ＬＰＳによるＴＮＦの誘導は、Ｊ７７４細胞内のこの作用剤によって影響を受けないので、炎症メディエーターのＬＰＳ誘導性発現の阻害は非特異的応答ではない。興味深いことに、ｉＮＯＳにおけるＩＮＨ₂ＢＰの阻害効果は、ＬＰＳをＩＮＦと組み合わせて免疫刺激に用いた場合、大きく減少した。この効果は、インターフェロン調節因子といったようなＩＦＮ誘導性転写因子が、上記作用剤によるｉＮＯＳ誘導の阻害をバイパスするという事実によるものである［Martinらの（１９９４）“一酸化炭素シンターゼの誘導におけるインターフェロン調節因子１の役割”、J.Exp.Med.、１８０：９７７−８４］。これまでのインビトロの研究において、インビトロにおいてｉＮＯＳの誘導がマクロファージ内の薬理学的インヒビターｐＡＤＰＲＴによって調節されることが示唆されている［Hauschildtらの（１９９２）“腫瘍壊死α因子によるＬ９２９細胞内における一酸化窒素シンターゼの誘導は、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼのインヒビターによって防止される”、Biochem.J.、２８８：２５５− ２６０；Pellat-Seceunykらの（１９９４）“ニコチンアミドは活性化マクロファージ内の一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡ誘導を阻害する”、Biochem.J.、２９７：５３−５８］。しかし、これらの研究では、ｐＡＤＰＲＴインヒビターである３０のアミノベンズアミドとニコチンアミドは、高濃度（１０−３０ｍＭ）で用いられて総タンパク質とＲＮＡ合成を阻害し、さらにフリーラジカルスカベンジングといったような薬理作用ももつていた[“腫瘍壊死α因子によるＬ９２９細胞内における一酸化窒素シンターゼの誘導は、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼのインヒビターによって防止される”、Biochem.J.、２８８：２５５−２６０]。ＩＮＨ₂ＢＰを用いる本発明の実験は、ｉＮＯＳｍＲＮＡ転写プロセスにおけるｐＡＤＰＲＴの多面作用的関わりをさらに示唆するものである。ＩＮＨ₂ ＢＰによるｉＮＯＳプロモーターの調節を研究するために、マウスマクロファージｉＮＯＳプロモータールシフェラーゼ構築物を用いる一次的感染アッセイを行つた。欠失構築物のこれらのデータは、ＩＮＨ₂ＢＰが、１５９２ｂｐと３６７ｂｐの間のマウスｉＮＯＳプロモーター領域に関与する転写イベントを調節することを示唆する。ヒストンおよびヌクレアーゼのＡＤＰリボシル化は、緩んだクロマチン構造の維持に関与している[Bauerらの（１９９５）“成長関連酵素反応の修飾および５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ＢＰ）処理によるras形質転換ウシ内皮細胞系の腫瘍原性の明らかな減少”、Int.J.Onc ol.、８：２３９−２５２；Bauerらの（１９９５）“ポリ（ＡＤＰ− リボース）ポリメラーゼの非共有結合リガンド、５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロンによる悪性表現型の逆転”、Biochemie、７７：３４７−３７７；Uedaらの（１９８５）“ＡＤＰ−リボシル化”、Ann.Rev.Biochem.、５４：７３−１００]。Bauerらの（１９９５）“成長関連酵素反応の修飾および５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ＢＰ）処理によるras形質転換ウシ内皮細胞系の腫瘍原性の明らかな減少”、Int.J.Oncol.、８：２３９−２５２；Bauerらの（１９９５）“ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの非共有結合リガンド、５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロンによる悪性表現型の逆転”、Biochemie、７７：３４７−３７７といったような先の実験データに基づいて、これらの実験系において、ＩＮＨ₂ＢＰなどのｐＡＤＰＲＴ阻害化合物による前処理によって、ｐＡＤＰＲＴおよびヒストンの自己ポリ−ＡＤＰ −リボシル化が阻害されることが示唆されるのは合理的である。このような作用がリラックス型染色質から凝縮染色質への転換の引き金となることが知られており、ヌクレアーゼおよび他のＤＮＡ構造調節酵素のアップレギュレーションを介して、プロモーター機能に影響を及ぼす［Bauerらの（１９９５）“成長関連酵素反応の修飾および５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ ＢＰ）処理によるras形質転換ウシ内皮細胞系の腫瘍原性の明らかな減少”、Int .J.Oncol.、８：２３９−２５２；Bauerらの（１９９５）“ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの非共有結合リガンド、５−ヨード−６−アミノ−１，２− ベンゾピロンによる悪性表現型の逆転”、Biochemie、７７：３４７−３７７］。実施例３ＭＡＰキナーゼにおけるＩＮＨ₂ＢＰの阻害の影響およびＮＦ−ｋＢの活性化これらの結果から、ＩＮＨ₂ＢＰ処理がＭＡＰキナーゼのＬＰＳ誘導性活性化を阻害することが実証されている。これらのデータは形質転換された内皮細胞に関する発見と類似している［Bauerらの（１９９５）“成長関連酵素反応の修飾および５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ＢＰ）処理によるras形質転換ウシ内皮細胞系の腫瘍原性の明らかな減少”、Int.J.Oncol.、８：２３９−２５２］。ＭＡＰキナーゼ活性化の阻害は、ＩＮＨ₂ＢＰによる多面細胞応答トリガーによって起こると考え得る。ＭＡＰキナーゼは、ＬＰＳまたは種々の前炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、インターロイキン−１、神経成長因子）で処理された種々の細胞型内で活性化されることがわかっている［Kyriak isらの（１９９６）“警鐘を鳴らす：ストレスおよび炎症によって活性化されたタンパク質キナーゼカスケード”、J.Biol.Chem.、２７１：２４３１３−２４３１６；Matsudaら（１９９４）の“マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼキナーゼ／ＭＡＰキナーゼカスケードによって媒介されたシグナル生成経路”、J.Leukocyte Biol.、５６：５４８−５３；Cowleyらの（１９９４）“ＰＣ１２分化およびＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換には、ＭＡＰキナーゼの活性化が必要および十分条件である”、Cells、７７：８４１−５２；Pangらの（１９９５）“ＭＡＰキナーゼキナーゼの阻害は、神経成長因子によって誘導されるＰＣ −１２細胞の分化を遮断する”、J.Biol.Chem.、２７０：１３５８５−８；Will isらの（１９９６）“培養された単球およびアストログリア中の細菌性リポ多糖によるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路の分化誘導”Biochem.J.、３１３：５１９−５２４；Saklatvalaらの（１９９３）“インターロイキン１および腫瘍壊死因子αは、培養細胞中で、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼキナーゼを活性化する”、FEBS Lett.、３３４：１８９−９２］。種々の細胞外シグナルは、異なるＭＡＰキナーゼキナーゼ−キナーゼを介してＭＡＰキナーゼキナーゼ／ＭＡＰキナーゼカスケードに集まり、細胞応答の欠陥スペクトルを引き出す［Kyriakisらの（１９９６）“警鐘を鳴らす：ストレスおよび炎症によって活性化されたタンパク質キナーゼカスケード”、J.Biol.Chem.、２７１：２４３１３−２４３１６；Ferrell,JEの（１９９６）“スイッチを入れる：タンパク質キナーゼカスケードはどのように類別された入力をスイッチ様出力に変換しうるか”、TIBS、２１：４６０−４６６］。ＭＡＰキナーゼまたはＭＡＰキナーゼキナーゼの封鎖は、多数の細胞内経路を変更し、細胞分化および増殖を阻害する［Kyriakisらの（１９９６）“警鐘を鳴らす：ストレスおよび炎症によって活性化されたタンパク質キナーゼカスケード”、J.Biol.Chem.、２７１：２４３１３−２４３１６；Matsudaら（１９９４）の“マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼキナーゼ／ＭＡＰキナーゼカスケードによって媒介されたシグナル生成経路”、J.Leukocyte Biol.、５６：５４８−５３；Cowleyらの（１９９４）“ＰＣ１２分化およびＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換には、ＭＡＰキナーゼの活性化が必要および十分条件である”、Ce lls、７７：８４１−５２；Pangらの（１９９５）“ＭＡＰキナーゼキナーゼの阻害は、神経成長因子によって誘導されるＰＣ−１２細胞の分化を遮断する”、 J.Biol.Chem.、２７０：１３５８５−８；Willisらの（１９９６）“培養された単球およびアストログリア中の細菌性リポ多糖によるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路の分化誘導”Biochem.J.、３１３：５１９−５２４；Saklatva laらの（１９９３）“インターロイキン１および腫瘍壊死因子αは、培養細胞中で、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼキナーゼを活性化する” 、FEBS Lett.、３３４：１８９−９２］。近年、ＰＤ９８０５９によるＭＡＰキナーゼキナーゼの阻害が、培養内皮細胞および心臓単球におけるｉＮＯＳｍＲＮＡの発現を抑制することが明らかにされている［Singhらの（１９９６）“心臓単球および微小血管内皮細胞における細胞系誘導一酸化炭素の調節”、J.Biol.C hem.、２７１：１１１１−１１１７］。この発見は、ＰＤ９８０５９が、ＲＡＷマクロファージにおいて、ＬＰＳによる亜硝酸塩の産生を目覚しく抑制するという我々の観察と一致している。ＮＦ−ｋＢの活性化は炎症応答における主要経路であり、ＩＮＦではなくてＬＰＳによるｉＮＯＳの誘導に関連しているので［Szabo,C.の（１９９５）“循環性ショックの種々の形態における一酸化窒素の産生の変更”、New Horizons、３：３−３２；Martinらの（１９９４）“一酸化炭素シンターゼの誘導におけるインターフェロン調節因子１の役割”、J.Exp.Med.、１８０：９７７−８４］、我々は、ＮＦ−ｋＢにおけるＩＮＨ₂ＢＰの潜在的効果を調査しようとした。我々が得た結果から、ＩＮＨ₂ＢＰが、ＮＦ−ｋＢの活性化の核トランスロケーション、もしくはＩＮＨ₂ＢＰによるＮＦ−ｋＢ媒介細胞内イベントの調節を変更せず、もしあったとしても、多くは、ＮＦ−ｋＢの核トランスロケーションから遠い細胞イベントにおいて起こることが実証される。実施例４病態生理学的および治療的関連；ＩＮＨ₂ＢＰは複数のレベルで炎症プロセスを調節する前炎症性遺伝子ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の発現のｐＡＤＰＲＴインヒビターによる抑制およびそれに続くＮＯおよびプロスタグランジンの形成の減少は、種々の形態の炎症において有益である［Nathanの（１９９２）“哺乳類細胞の分泌産物としてのＮＯ”、FASEB J．,６:３０５１−３０６４；Vane,J.R.のThe Croo nian Lecture“内皮：血液循環の指揮者”、Proc.Rov.Soc.Lond B、３４３：２２５−２４６；Szabo,C.の（１９９５）“循環性ショックの種々の形態における一酸化窒素の産生の変更”、New Horizons、３：３−３２；Vaneらの（１９９５）“抗炎症剤の作用のモードへの新規洞察”、Inflamm.Res.、４４：１−１０］。さらに、ＩＬ−１０の放出の増加は、さらなる抗炎症作用をもたらす［Liles らの（１９９５）“論説：炎症および宿主免疫応答に関連するサイトカインの命名法および生物学的重要性”、J.Infect Dis.、１７２：１５７３−８０；Giroi rらの（１９９３）“敗血性ショックのメディエーター：内因性炎症カスケードの妨害のための新規アプローチ”、Critical Car.Med.、２１：７８０−９；Sza boらの（１９９７）“イソプロテレナールは腫瘍壊死因子、インターロイキン１０、インターロイキン６および一酸化窒素の産生を調節し、内毒血症における血管の反応減退の進行を防止する”、Immunology、９０：９５−１０Ｏ］。このような効果は、ＩＮＨ₂ＢＰ前処理などのｐＡＤＰＲＴ阻害化合物による改良および致死量の内毒素を投与したマウスの生存率に、有意に寄与するということが考えられる。しかし、ＩＮＨ₂ＢＰが、種々の炎症メディエーターのＬＰＳ誘導性発現において効果を発揮する正確なメカニズムの概要を得るにはさらに詳細な研究が必要である。一方では、ｐＡＤＰＲＴ活性またはｐＡＤＰＲＴタンパク質の結合は、炎症メディエーターの産生および／または炎症プロセスの化合物をコードする遺伝子の発現の調節に関連していると考えられる。他方では、ＩＮＨ₂ＢＰによるＭＡＰキナーゼ活性の非直接的ダウンレギュレーション［Bauerらの（１９９５）“成長関連酵素反応の修飾および５−ヨード−６−アミノ−１，２− ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ＢＰ）処理によるras形質転換ウシ内皮細胞系の腫瘍原性の明らかな減少”、Int.J.Oncol.、８：２３９−２５２］もまた、他の実験によって予測されたように、観察された効果に寄与することが考えられる［Kyriakisらの（１９９６）“警鐘を鳴らす：ストレスおよび炎症によって活性化されたタンパク質キナーゼカスケード”、J.Biol.Chem.、２７１：２４３１３−２４３１６；Ferrell,JEの（１９９６）“スイッチを入れる：タンパク質キナーゼカスケードはどのように類別された入力をスイッチ様出力に変換しうるか”、TIBS、２１：４６０−４６６］。本発明は、種々の炎症性疾患におけるＩＮＨ₂ＢＰといったようなｐＡＤＰＲＴ阻害化合物の治療能力を実証する。実施例５一酸化窒素（ＮＯ）の毒性効果のいくつかは、ＮＯとスーパーオキシドの急速反応によって形成される反応性酸化物であるペルオキシ亜硝酸の産生に関連している［Crowらの（１９９５）“一酸化窒素媒介性毒性におけるペルオキシ亜硝酸の役割”、Current Top Microbiol.Immunol.、１９６：５７−７３；Pryorらの（１９９５）“ペルオキシ亜硝酸の化学：一酸化窒素とスーパーオキシドの反応からの生成物”、Am.J.Physiol.、Ｌ６９９−Ｌ７７２］。ペルオキシ亜硝酸の形成は、内毒素によって引き起こされた全身性炎症などの種々の炎症状況において確認されている［Szaboらの（１９９５）“循環性ショックの種々の形態における一酸化窒素の産生の変更”、New Horizons、３：３−３２；関節炎；Kaurらの“慢性炎症における一酸化窒素媒介性酸化的ダメージの証拠。リューマチ患者由来の血清および関節液中のニトロチロシン”、FEBS Lett.、１３５９：９−１２；およびカラギーナン誘発性；*Salveminiらの（１９９６）足（ｐａｗ）浮腫］。実のところ、ＮＯシンターゼ（ＮＯＳ）インヒビターおよびスーパーオキシドジスムターゼ類似体を用いた薬理学的実験から、炎症プロセスの進行においてペルオキシ亜硝酸が重要な病原性の役割を演じることが結論づけられた［StaboC .の（１９９６）“ショック、炎症および虚血再潅流損傷の病態生理学におけるペルオキシ亜硝酸の役割”、Shock、６：７９−８８；*Salveminら（１９９６）；*Zingarelliら（１９７７）］。さらに、関節炎の治療に現在使用されているいくつかの作用剤は、実のところ、ペルオキシ亜硝酸のスカベンジャーであることが実証されている［Whitemanらの（１９９６）“抗炎症剤および抗生物質テトラサイクリンによる、ペルオキシ亜硝酸依存性チロシンのニトロ化およびα１− アンチプロテイナーゼの不活性化”、Annals.of the Rheumatic Diseases、５５：３８３−７］。ＮＯ関連細胞毒性の重要な部分が、ペルオキシ亜硝酸の形成によるという現実は、ペルオキシ亜硝酸の形成および作用に基づいた新規な治療的アプローチの発達を必要とするようになってきている。ペルオキシ亜硝酸が引き金となる細胞内経路のひとつは、ＤＮＡ−本鎖切断およびポリ（ＡＤＰ−リボース）シンセターゼ（ＰＡＲＳ）の活性化に関連がある［StaboC.の（１９９６）“ショック、炎症および虚血再潅流損傷の病態生理学におけるペルオキシ亜硝酸の役割”、Shock、６：７９−８８；*Szabo（１９９６ｂ）］。ＰＡＲＳの顕著な活性化によって、その基質、ＮＡＤ＋の細胞内濃度が急速に激減され、糖質分解、電子輸送および、それにともなうＡＴＰ形成の速度が遅くなり、最終的に細胞機能不全になる［*Berger（１９９１）；*Cochrane （１９９１）］。したがって、ＰＡＲＳのインヒビターは、これらの条件下で細胞損傷に対する保護作用を示す。“ＰＡＲＳ自殺仮説”として知られるこのメカニズムは、これまでに、Ｈ₂Ｏ₂誘導オキシダントダメージおよび放射線損傷との関係において特徴付けられており［*Berger（１９９１）；*Cochrane（１９９１）］、最近、内毒素ショック、発作、虚血−再灌流損傷および糖尿病におけるＮＯ−およびペルオキシ亜硝酸関連性細胞損傷に関係が有ることが明らかにされている［Stabo C.の（１９９６）“ショック、炎症および虚血再灌流損傷の病態生理学におけるペルオキシ亜硝酸の役割”、Shock、６：７９−８８；*Zhangら（１９９４）；*Hellerら（１９９５）］。最近、Krogerらによって、関節炎におけるＰＡＲＳの潜在的役割が提案されている。ペルオキソクロム酸カリウム誘導モデルにおいて、ニコチンアミド処理によって平均関節炎スコアが２５〜３５％減少した［*Mieselら（１９９６）］。しかし、フリーラジカルのスカベンジング活性とニコチンアミドのＰＡＲＳ阻害効果の間に明確な区別を設けることができなかったので、その研究からは、阻害のメカニズムは不明確なままであった［*Mieselら（１９９５）］。新規の、強力なＰＡＲＳ活性インヒビターである［*Bauerら（１９９５ａ）；*Bauerら（１９９５ｂ）］５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ＢＰ）の助けを借りる本発明の実験において、本発明者らは、カラギーナン誘発性足浮腫およびコラーゲン誘発性関節炎の過程におけるＰＡＲＳの薬理学的阻害効果を研究した。我々の実験の結果は、ＰＡＲＳを阻害することが炎症に抗う可能性のひとつであるという考察を支持するものである。実施例６カラギーナン誘発性足浮腫の誘発および評価雄性ウィスターラット（２５０〜３００ｇ、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ、ウィルミントン、ＭＡ）を用いてこの実験を行った。動物の右の後ろ足に１％カラギーナンを含む食塩水０．１ｍｌを足底下注射を行った。ＩＮＨ₂ＢＰ処置動物またはビヒクル処置動物のいずれかに、この起炎剤を与えた。カラギーナン注射を行う前に、動物をＩＮＨ₂ＢＰ（０．５ｇ／ｋｇｐ.ｏ.）で２４時間および２時間処置した。先行文献の記載にしたがって体積測定機にて足の体積を迅速に測定した［*Sautebinら（１９９５）］。以後、６０分間隔で同じ足の体積を読み取り、開始時の読み取りと比較した。これらの実験には、ビヒクル処置（ｎ＝６）およびＩＮＨ₂ＢＰ処置（ｎ＝６）動物を用いた。実施例７コラーゲン誘発性関節炎の誘発と評価雄性ＤＢＡ/１Ｊマウス（９週齢、ジャクソン・ラボラトリー、バー・ハーバー、ＭＥ）を用いて本実験を行った。ニワトリＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）を０．０１Ｍの酢酸に２ｍｇ／ｍｌの濃度となるように４℃にて一夜攪拌しながら溶解した。溶解したＣＩＩは使用するまで−７０℃にて冷凍した。濃度２ｍｇ／ｍｌの結核菌Ｈ３７ｒａを加えることにより、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を調製した。注射前に、ＣＩＩを同量のＣＦＡで乳化した。コラーゲン誘発性関節炎を先行文献の記載に従って誘発した［Hugesらの（１９９４）“非マイトジェン性抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いることによる、自己免疫の実験モデルにおけるヘルパーＴ細胞低応答性の誘発”、J.Immunol.、１５３：３３１９ −３３２５］。第１日に、マウスの尻尾のつけ根に１００ｍｌのＣＩＩを皮内注射した。第２１日に、第２回目のＣＩＩ／ＣＦＡの注射を行った。第２５日から、ビヒクル（ｎ＝１０）またはＩＮＨ₂ＢＰ（ｎ＝６０（０．５ｇ／ｋｇｐ.ｏ. ））のいずれかで２４時間毎に動物を処置した。肉眼で見た０〜４の得点システム［１−膨潤および／または足もしくは一本の指の赤み；２−２つの関節が関節炎；３−２つ以上の関節が関節炎；４−足および指全体の重篤な関節炎］でマウスの関節炎を毎日評価した。個々の足についての４個の得点を加算することによって、各マウスについての関節炎指数を算出した。実験の最終日（第３５日）に、動物を麻酔下で屠殺し、足（ＰＡＷ）と膝を切除して、組織学的審査用に固定した。組織学的審査は処置レジメを知らされていない研究者によって行った。データ分析および発表カラギーナン誘発性足浮腫に関する実験については、処置および非処置動物の足の体積を、不対スチューデントテストにて比較した。関節炎実験については、マン−ホイットニーＵテスト（２テール、独立的）を用いて関節炎指数における統計的差異を試験した。測定の目盛りが序数なので、この非パラメーター的統計量を用いては、平均よりもむしろメジアンを比較した。分散値は、代表的には、非標準的分散であった［Hugesらの（１９９４）“非マイトジェン性抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いることによる、自己免疫の実験モデルにおけるヘルパーＴ細胞低応答性の誘発”、J.Immunol.、１５３：３３１９−３３２５］。図１０の値は、ｎ個の観察の平均±標準誤差を示す（ここで、ｎはラットの数である。各グループ６匹の動物。）。図１１の値は、発生率（％）を示し、図１２の値は、メジアンを示す。０．０５以下のｐ値を統計的に有意であるとみなした（Ｉ’＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０２）。物質５−ヨード−６−アミノ−１,２−ベンゾピロン（ＩＮＨ₂ＢＰ）を以前に記載の通り製造した（^※Bauerらによる1995a;^※Bauerらによる1995b）。ニワトリ・コラーゲンII型はエラスチン・プロダクト社(Elastin Products Company，Inc. 、オーエンスビル、ＭＯ)製である。マイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒａ（Mycobacterium tuberculosisＨ３７Ｒａ）はディフコ（Difco、デトロイト、ＭＩ）製である。他の化学品は全てシグマ社（Sigma Chemical Co.社、セントルイス、ＭＯ）製である。ラットの足へカラギーナンを足底下注射することにより足の大きさが時間に依存して増加し、３時間時に最大応答を示した（図１０）。本カラギーナンによって誘発される足の浮腫は、ＩＮＨ₂ＢＰを用いて処理することで有意に減少した(図１０)。マウスにおけるコラーゲンによって誘発した関節炎のモデルの場合、最初のコラーゲンによる免疫感作後の２６〜３５日間、関節炎発生率の増加及び関節炎スコアの増加で証明される通り（図１１〜１２）、動物は徐々に関節炎を発生した。ＩＮＨ₂ＢＰを用いて処置することにより、３３日目まで関節炎の発生率は減少し、また実験期間全般にわたって該疾患の重度が軽減された。３０日目まで、関節炎スコアは１０まで増加し、一方ＩＮＨ₂ＢＰで処理した動物における中間関節炎スコアはおよそ５を維持した(図１２)。３５日目まで、賦形薬で処理した全ての動物およびＩＮＨ₂ＢＰで処理したほとんどの動物がある程度の関節炎を有していた(図１１)。しかしながら、３５日目でさえ中間関節炎スコアはＩＮＨ₂ ＢＰ処理によって有意に減少した(図１２)。３５日目では、賦形薬で処理した関節炎の動物における足を組織学的評価したところ、より大きな足首の関節および末端の指への（好中球、マクロファージおよびリンパ球）浸潤が混ざった塊を伴った重度の化膿性関節炎のサインを示した。加えて、滑膜の激しいまたは穏やかな壊死、過形成およびか痴形成が、繊維症を伴った近接筋肉組織への炎症の拡大および粘性産生の増加と併せて見られた。該ＩＮＨ₂ＢＰ動物において、炎症の程度は有意に減少した。それにもかかわらず、これらの動物において、いくつかのより大きな関節への穏やかな主に好中球の浸潤を伴い、また滑膜の壊死および過形成を緩和するのに適度な大きさの有意な程度の炎症がなお存在した。足における該発見と同様に、ひざにおいても重度の化膿性関節炎のサインが見られたが、これはＩＮＨ₂ＢＰを用いた処置によって軽減された（図示せず）。議論ペルオキシ亜硝酸塩、オキシラジカルおよび誘導可能なシクロオキシゲナーゼの産物はいずれも独立して、例えば関節炎などの様々な形態の炎症の病原論において重要な因子であると提案されたことはなかった。（以下の文献を参照：序論およびまた、Brahnの報告(1991)、「リウマチ関節炎の動物モデル。病因への糸口と処置（Animal models of rheumatoid arthritis．Clues to etiology and t reatment）」Clin ．Orthop．Rel．Res. 265：42-53;Kaurらの報告(1994)、「慢性炎症における一酸化窒素が媒介した酸化的障害の証拠。リウマチ患者からの血清および滑膜液中のニトロチロシン(Evidence for nitric oxide-mediated oxid ative damage in chronic inflammation．Nitrotyrosine in serum and synovia l fluid from rheumatoid patients)」FEBS Lett．1359:9-12;OyanaguiYらの報告(1994)、「一酸化窒素およびスーパーオキシドラジカルはラットにおける関節炎アジュバントの初期および周囲の両方において含まれる(Nitric oxide and su peroxide radical are involved in both initiation and envelopment of adju vant arthritis in rats)」Life Sci. 54 PL 285-9;Mieselらの報告(1994)、「マウスにおける関節炎のインビボ抑制およびヒト血球全般における酸素ラジカルの食細胞産生の半ビボモジュレーションにおけるアロプリノールの影響(Effects on allupurinol on in vivo suppression of arthritis in mice and ex vivo modulation of phagocytic production of oxygen radicals in whole human bl ood)」、Inflammation 6：597-612；Whitemanらの報告(1996)、「ペルオキシ亜硝酸塩に対する保護はいくつかの抗炎症薬および抗生物質テトラサイクリンによるチロシンのニトロ化反応およびアルファ−１−抗タンパク分解酵素の失活に依存する（Protection against peroxynitrite dependent tyrosine nitration an d alpha 1-antiproteinase inactivation by some anti-inflammatory drugs an d by the antibiotic tetracycline）」Annals ．of the Rheumatic Diseases 55 ：383-7;Andersonらの報告(1996)、「シクロオキシゲナーゼ(ＣＯＸ)−２を選択的に阻害することにより、ラットアジュバント関節炎における炎症並びにＣＯＸ −２およびインターロイキン６の発現が後退する(Selective inhibition of cyc looxygenase(ＣＯＸ)−2 and interleukin 6 in rat adjuvant arthritis)」、J ．Clin．Invest. 97:2672-2679。本研究はカラギーナンが誘発する足浮種モデルにおいておよび該コラーゲンによって誘発される関節炎モデルにおいてＩＮＨ₂ ＢＰの抗炎症性効果を示すものであるが、本研究によりＰＡＲＳは炎症過程の進行に関与し、およびＰＡＲＳの薬理学的阻害は抗炎症能力を有するという点が支持される。ＩＮＨ₂ＢＰの作用の主要な様式は、ＤＮＡ損傷によって特徴付けられる無益細胞内カスケード（the futile intracellular cascade）の分断に関連しているであろう。様々な細胞型の炎症性関節におけるＰＡＲＳ活性化、ＡＤＰリボシル化およびＮＡＤ＋およびＡＴＰ消耗。３−アミノベンズアミド、ニコチンアミドおよびＩＮＨ₂ＢＰなどの様々なＰＡＲＳのインヒビターを用いて本経路を阻害することにより、多くの細胞型を損傷から保護することが示されている；^※Coch raneの報告(1991)；Szaboらの報告(1996)、「ショック、炎症および虚血性再灌流損傷の病態生理学におけるペルオキシ亜硝酸塩の役割(The role of peroxynit rite in the pathophysiology of shock，inflammation and schemiareperfusio n injury)」、Schock 6:79-88；^※Szaboの報告(1996b)。炎症性条件におけるＮＯの過剰生産はＮＯＳの誘導性イソ型(iNOS)の抑制に起因する；Nathanの報告(1992)、「哺乳類細胞の分泌産物としての一酸化窒素(Nit ric oxide as a secretory product of mammalian cells)」、FASEB J. 6:3051- 3064;Szaboの報告(1995)、「様々な循環ショックの形態における一酸化窒素の産生の改変（Alterations in nitric oxide production in various forms of cir culatory shock）」、New Horizons 3:2-32;Southanらの報告(1996)、「アミノアルキルグアニジンのメルカプトアルキルグアニジンへの同時転移−誘導性イソ型に対して選択性を有する新規なクラスの一酸化窒素シンターゼインヒビター（ Spontaneous rearrangement of aminoalkylguanidines into mercaptoalkylguad idines-a novel class of nitric oxide synthase inhibitors with selectivit y toward the inducible isoform）」Br ．J．Pharmacol. 117:619-632。いくつかの証拠の道筋は、関節炎の病原論におけるｉＮＯＳおよびＮＯの過剰産生の役割を提案している（以下の総説を参照：Stenovic-Racicらの報告(1993)、「一酸化窒素と関節炎(Nitric oxide and arthritis)」、Anthr ．Rhemat. 36:1036-104 4；^※Evansらの報告(1995)。第一に、ｉＮＯＳの発現および大量のＮＯの産生が実験動物およびヒトからの軟骨細胞において見られた(Haeselmannらの報告(1994 )、“アルギネート培地中でのヒト関節細胞による一酸化窒素およびプロテオグリカンの合成（Nitric oxide and proteoglycan synthesis by human articular chondrocytes in alginate culture）」、FEBS Lett. 352：361-364；Sakuraiらの報告(1995)、「炎症性関節炎における一酸化窒素の産生および誘導性一酸化窒素シンターゼの発現（Nitr ic oxide production and inducible nitric oxide synthase expression in in flammatory arthritis）」、J ．Clin．Invest. 96:2357-63;Grabowskiらの報告( 1996)、「ヒトの関節から誘導された細胞における一酸化窒素の産生(Nitric oxi de production in cells derived from the human joint)」、Br ．J．Rheumatol ．35:207-12;Murrellらの報告(1996)、「一酸化窒素：重要な関節のフリーラジカル(Nitric oxide:an important articular free radical)」、J ．Bone Joint Sur.-Am. 78:265-74。第二に、亜硝酸塩／硝酸塩（ＮＯの分解生成物）の循環レベルにおける増加が関節炎を持つ患者において見られた;（Farrellらの報告(199 2)）、「滑膜液および血清試料中での亜硝酸塩の濃度の増加はリマチ疾患における一酸化窒素合成の増加を支持している(Increased concentrations of nitrite in synovial fluid and serum samples suggest increased nitric oxide synt hesis in rheumatic diseases)」Ann ．Rhem．Dis. 51:1219-22;Stichtenothらの報告(1995)、「尿の硝酸塩の排出はリウマチ関節炎を持つ患者において増加しており、およびプレドニソロンによって減少する (Urinary nitrate excretion i s increased in patients with rheumatoid arthritis and reduced by prediso lone)」、Ann ．Rhem．Dis. 54．820-4。第３に、関節炎の発生はＮＯＳの非イソ型−選択インヒビターによって減少すると示されてきた（^※Ialentialらの報告( 1993)；McCartney-Francisらの報告(1993)、一酸化窒素シンターゼのインヒビターによる関節炎の抑制(Suppression of arthritis by an inhibitor of nitric oxide synthase)」、J ．Exp．Med. 178:749-753；Weinbergらの報告(1994)、「自発性マウス自己免疫疾患の病原論、ＭＲＬ−１ｐｒ／１ｐｒマウスでの一酸化窒素産生および一酸化窒素シンターゼ発現の増加、並びにＮＧ−モノメチル−Ｌ −アルギニンの経口投与による自発性糸球体腎炎および関節炎の軽減における一酸化窒素の役割（The role of nitric acid in the pathogenesis of spontaneo us murine autoimmune disease，increased nitric oxide production and nitr ic oxide synthase expression in MRL-1pr/1pr mice，and reduction of spont aneous glomerulonephritis and arthritis by orally administered NG-monomethyl-L-arginine）」、J ．Exp．M ed. 1979:651-60;Stefanovic-Racicらの報告(1994)、「Ｎ−モノメチルアルギニン、一酸化窒素シンターゼ・インヒビターは、ラットにおけるアジュバント関節炎の発生を抑制する（N-monomethyl arginine，an inhibitor of nitric oxide synthase，suppresses the development of adjuvant arthritis in rats）」Ar thr ．Rheumat. 37:1062-9；およびより最近では、ｉＮＯＳに対する選択性を有するインヒビターによって（Connorらの報告(1995)、「誘導性一酸化窒素シンターゼの選択的阻害によるアジュバントによって誘発された関節炎の抑制（Suppre ssion of adjuvant-induced arthritis by selective inhibition of inducible nitric oxide synthase）」、Eur ．J．Phamacol. 273：15-24。本観点において、免疫刺激の前にＰＡＲＳインヒビター（ＩＮＨ₂ＢＰと同様に３−アミノベンズアミド、ノコチンアミドを含む）を用いた多数の細胞型の前処理はｉＮＯＳの代わりにｍＲＮＡの発現を抑制し、またＮＯの産生を減少させる（^※Haushildt らの報告(1992)、^※Pellat-Seceunykらの報告(1994);Zingarelliらの報告(1996) 、“ペルオキシ亜硝酸塩が媒介したＤＮＡ鎖の切断はポリＡＤＰリボシルシンターゼを活性化し、およびバクテリア性リポポリサッカライドを用いて刺激したマクリオファージ中での細胞エネルギーの消耗を引き起こす（Peroxynitrite-medi ated DNA strand breakage activates poly-ADP ribosyl synthetase and cause s cellular energy depletion in macrophages stimulated with bacterial lip opolysaccharide）」J ．Immunol. 156:350-358;Szaboらの報告(1997)。これらの実験データから、未だ解明されていない機構によってＰＡＲＳはまたｉＮＯＳ発現過程を調節し、および本効果が様々な炎症の形態におけるＰＡＲＳ阻害の更なる有利な作用様式を表していると結論できる。しかしながら、上記の発見を解釈する際には注意を換気すべきである。例えば、上記に引用したインビボ研究において、ＰＡＲＳインヒビタ−３−アミノベンズアミドおよびニコチンアミドの極端な高濃度(10〜30ｍＭ)が、ｉＮＯＳ誘導の抑制を示すために必要となる。これらの試薬のこういった高濃度により、総タンパク質の阻害およびＲＮＡ合成および／またはフリーラジカル捕捉作用といった薬理学的作用がさらにもたらされ得る。^※Haushildtらの報告(1992)、^※ Pellat-Seceunykらの報告(1994);Zingarelliらの報告(1996)、“ペルオキシ亜硝酸塩が媒介したＤＮＡ鎖の切断はポリＡＤＰリボシルシンターゼを活性化し、およびバクテリア性リポポリサッカライドを用いて刺激したマクリオファージ中での細胞エネルギーの消耗を引き起こす（Peroxynitrite-mediated DNA strand br eakage activates poly-ADP ribosyl synthetase and causes cellular energy depletion in macrophages stimulated with bacterial lipopolysaccharide）」J ．Immunol. 156:350-358。一方、ＩＮＨ₂ＢＰはより低い非細胞毒素の濃度（ 100〜300ｍＭ）でさえも、ｉＮＯＳの発現を効果的に抑制する。しかしながら、本試薬は細胞応答の二次的、多面モジュレーションを有するアルカリ性ホスファターゼの誘導物質であるので、ＩＮＨ₂ＢＰの場合においていくつかの様式の作用を考慮すべきである；^※Bauerらの報告(1996)、^※Szaboらの報告(1997))。ＰＡＲＳ遺伝子の切除を伴う細胞または動物における実験においては、ＰＡＲＳ自体の阻害がｉＮＯＳ誘導の過程を抑制するかどうかといった問題に明確に取り組む必要がある。エールリッヒ(Ehrlich)およびその同僚達の最近の研究において、兎の滑膜の繊維芽細胞の培養において、サイトカインが誘発したコラゲナーゼの発現活性は３−アミノベンズアミドによって抑制される；^※Ehrlichらの報告(1995)。薬理学的作用（それにもかかわらず、このものにより関節炎の過程の経過を抑制することが期待される）や、用いた特定のインヒビターの性質または現実にＰＡＲＳの触媒活性の減少に関連するかどうかを決定することが現在では可能である。本観点において、薬理学的インヒビターを用いた研究に基づくと、ＰＡＲＳが例えば主要組織適合性複合体クラスII遺伝子（^※Hiromatsuらの報告(1992)；Taniguc hiらの報告(1993)）、ras c-myc（^※XBauerらの報告(1996)；^※Naganoらの報告( 1991)）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（^※XBauerらの報告(1996)）およびプロテインキナーゼＣ（^※Bauerらの報告(1996)）などの様々な遺伝子の調節に関係している。併せて、本研究は局所的炎症性応答の発生の回復およびコラーゲンによって誘発された関節炎の進行のＩＮＨ₂ＢＰによる阻害を示す。最近の１０年間ＰＡＲＳの役割はＤＮＡの修復の場合において提案されてきたが、最近の観察によりＰＡＲＳに対する遺伝の切除がＤＮＡ修復を含まないことが示された：ＰＡＥＳノックアウト動物は正常であり、生存可能であるように思われる（^※Wangらの報告 (1995)）。本観察により、ＰＡＲＳの薬理学的インヒビターの抗炎症性能力が強調される。ＰＡＲＳ阻害（ｉＮＯＳ阻害に対するものとして）は、侵入する微生物がＰＡＲＳを含有していないので、ＮＯの重要な抗菌性効果を干渉していないように思われる。一方、ＰＡＲＳ阻害は酸化剤で誘発される細胞毒性の一部を阻害することが期待されるだけではなく、他のフリーラジカルスカベンジャーまたは他の免疫抑制剤と併せて用いる場合により有効となることが期待される。本研究の結果は、ＰＡＲＳ単独または他の抗炎症剤と組み合わせることで前途有望な新規な抗−炎症性アプローチを表している。上記の例中で見られるのと同様な様式で、式IIおよびIIIの化合物をグラム陰性およびグラム陽性感染の処置と同様に炎症または炎症性疾患を処置するのに使用する。これまでに記載の明細書は当業者が本発明を実行するのに充分可能であることを考慮すべきである。実際、医薬処方の分野またはその関連分野において当業者にとって明白である、本発明を実行するための上記に記載の様式の様々な改良法は下記の請求の範囲の範囲内である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年４月１５日（１９９９．４．１５）【補正内容】請求の範囲１．動物または哺乳動物にｐＡＤＰＲＴ抑制化合物（３−アミノベンズアミドを除く）の有効量を投与することを特徴とする、動物または哺乳動物における炎症または炎症性疾患を治療する方法。２．ｐＡＤＰＲＴ抑制化合物が、式（式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆は各々水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキルまたはフェノールからなる群から選ばれ、それらは適宜アルキル、アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンで置換されていてもよく、またＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆の１個だけはアミノである）で示される化合物および式（式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄およびＲ₅は各々水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキルまたはフェノールからなる群から選ばれ、それらは適宜アルキル、アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンで置換されていてもよく、またＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄およびＲ₅の1個だけはアミノである）で示される化合物からなる群から選ばれる請求項１の方法。３．該化合物が、６−アミノ−２−ベンゾピロン、５−アミノ−１(２Ｈ)−イソキノリノン、７−アミノ−１(２Ｈ)−イソキノリノン、および８−アミノ−１（２Ｈ）−イソキノリノンからなる群から選ばれる請求項２の方法。４．該化合物が５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロンである請求項１の方法。５．動物または哺乳動物にｐＡＤＰＲＴ抑制化合物の治療上有効量を投与することを特徴とする、動物または哺乳動物におけるグラム陰性およびグラム陽性の両方で誘引される内毒素症状を治療する方法。６．該化合物が、式（式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆は互いに独立して水素、ヒドロキシ、アミノ、ニトロソ、ニトロ、ハロゲン、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₃−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₇）シクロアルキルまたはフェニルおよびその医薬上許容される塩からなる群から選ばれ、該６個のＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆のうち少なくとも3個は常に水素であり、かつ該６個のＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆のうち少なくとも１個はアミノ基である）で示される化合物から選ばれる請求項５の方法。７．該化合物が、式で示される構造式を有する請求項６の方法。８．Ｒ₄がアミノである請求項６の方法。９．ハロゲンがヨードである請求項８の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 43/00 Ｃ０７Ｄ 217/24 Ｃ０７Ｄ 217/24 311/08 311/08 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．動物または哺乳動物にｐＡＤＰＲＴ抑制化合物の有効量を投与することを特徴とする、動物または哺乳動物における炎症または炎症性疾患を治療する方法。２．ｐＡＤＰＲＴ抑制化合物が、式（式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆は各々水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキルまたはフェノールからなる群から選ばれ、それらは適宜アルキル、アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンで置換されていてもよく、またＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆の1個だけはアミノである）で示される化合物、式（式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆は各々水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキルまたはフェノールからなる群から選ばれ、それらは適宜アルキル、アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンで置換されていてもよく、またＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆の1個だけはアミノ、ニトロソまたはニトロである）で示される化合物および式（式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄およびＲ₅は各々水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキルまたはフェノールからなる群から選ばれ、それらは適宜アルキル、アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンで置換されていてもよく、またＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄およびＲ₅の1個だけはアミノである）で示される化合物からなる群から選ばれる請求項１の方法。３．該化合物が、６−アミノ−２−ベンゾピロン、３−アミノベンズアミド、５ −アミノ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、７−アミノ−１（２Ｈ）−イソキノリノン、および８−アミノ−１（２Ｈ）−イソキノリノンからなる群から選ばれる請求項２の方法。４．該化合物が５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロンである請求項１の方法。５．動物または哺乳動物にｐＡＤＰＲＴ抑制化合物の治療上有効量を投与することを特徴とする、動物または哺乳動物におけるグラム陰性およびグラム陽性の両方で誘引される内毒素症状を治療する方法。６．該化合物が、式（式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆は互いに独立して水素、ヒドロキシ、アミノ、ニトロソ、ニトロ、ハロゲン、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₃−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₇）シクロアルキルまたはフェニルおよびその医薬上許容される塩からなる群から選ばれ、該６個のＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆のうち少なくとも3個は常に水素であり、かつ該6個のＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄，Ｒ₅およびＲ₆のうち少なくとも１個はアミノ基である）で示される化合物から選ばれる請求項５の方法。７．該化合物が、式で示される構造式を有する請求項６の方法。８．Ｒ₄がアミノである請求項６の方法。９．ハロゲンがヨードである請求項８の方法。