JP2002262884A - 植物に対するストレス耐性付与方法 - Google Patents
植物に対するストレス耐性付与方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 乾燥や高塩濃度等の環境ストレスに対して耐
性を持つ植物体を作出することを可能とする。 【解決手段】 植物体内のガラクチノール量を増大させ
ることによって、当該植物体にストレス耐性を付与す
る。
性を持つ植物体を作出することを可能とする。 【解決手段】 植物体内のガラクチノール量を増大させ
ることによって、当該植物体にストレス耐性を付与す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物に対して優れ
た乾燥耐性及び/又は高塩濃度耐性等のストレス耐性を
付与することができる植物に対するストレス耐性付与方
法に関する。
た乾燥耐性及び/又は高塩濃度耐性等のストレス耐性を
付与することができる植物に対するストレス耐性付与方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】地球上の陸地の約３分の１は乾燥地に属
し、今後予想される深刻な食糧不足への対策として乾燥
地域の農業利用の重要性が認識されるようになってき
た。また、現在の技術では過剰な潅漑水による塩類集積
や乾燥や高熱により、農耕に不適な乾燥、半乾燥土壌の
全体に占める割合が年々増大しており、この問題解決は
急務である（石谷 学 他 植物の化学調節Vol.25, No.
2, 149-162, 1990）。この問題に対する解決法として
は、これらの環境ストレスに対する耐性機構を解明し、
耐性を持つ植物を作出するという方法が挙げられる。
し、今後予想される深刻な食糧不足への対策として乾燥
地域の農業利用の重要性が認識されるようになってき
た。また、現在の技術では過剰な潅漑水による塩類集積
や乾燥や高熱により、農耕に不適な乾燥、半乾燥土壌の
全体に占める割合が年々増大しており、この問題解決は
急務である（石谷 学 他 植物の化学調節Vol.25, No.
2, 149-162, 1990）。この問題に対する解決法として
は、これらの環境ストレスに対する耐性機構を解明し、
耐性を持つ植物を作出するという方法が挙げられる。
【０００３】植物は移動の自由を持たないため、自身が
置かれた環境の変化を耐え抜いて成長分化を続けていか
なければならない。このため植物は環境の変化に速やか
に応答して適応する応答機構を、進化の過程で獲得して
きたものと考えられる。植物を取り巻く環境因子のうち
乾燥や塩類集積は、陸上植物にとって生死に関わる重要
な因子であり、また、植物の生長に大きな影響を与える
因子となる。植物は乾燥ストレスを受けると成長が阻害
され、細胞は膨圧が低下し種々の生理的過程に影響を受
ける (Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, Plant Phy
siol. 115:327-334, 1997)。
置かれた環境の変化を耐え抜いて成長分化を続けていか
なければならない。このため植物は環境の変化に速やか
に応答して適応する応答機構を、進化の過程で獲得して
きたものと考えられる。植物を取り巻く環境因子のうち
乾燥や塩類集積は、陸上植物にとって生死に関わる重要
な因子であり、また、植物の生長に大きな影響を与える
因子となる。植物は乾燥ストレスを受けると成長が阻害
され、細胞は膨圧が低下し種々の生理的過程に影響を受
ける (Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, Plant Phy
siol. 115:327-334, 1997)。
【０００４】植物においては、これらのストレスに対し
て個体レベル、組織レベル及び細胞レベルで種々の応答
機構が働き、さらに分子生物学的研究により遺伝子発現
レベルでも応答していることが明らかにされた。すなわ
ち、種々の植物で乾燥や塩処理により、mRNA量が増加す
るストレス誘導性の遺伝子が数多く存在するといった遺
伝子発現レベルでの応答機構が明らかとなった。植物
は、これらのストレス誘導性遺伝子群の産物のいずれか
により耐性を獲得するものと考えられている。
て個体レベル、組織レベル及び細胞レベルで種々の応答
機構が働き、さらに分子生物学的研究により遺伝子発現
レベルでも応答していることが明らかにされた。すなわ
ち、種々の植物で乾燥や塩処理により、mRNA量が増加す
るストレス誘導性の遺伝子が数多く存在するといった遺
伝子発現レベルでの応答機構が明らかとなった。植物
は、これらのストレス誘導性遺伝子群の産物のいずれか
により耐性を獲得するものと考えられている。
【０００５】これらストレス誘導性遺伝子群の発現に
は、植物ホルモンの一種であるアブシジン酸 (Abscisic
acid; ABA)が深く関与しており、植物が乾燥などのス
トレスを受けるとABA依存的経路とABA非依存的経路によ
りシグナル伝達され、このシグナル伝達によりストレス
誘導性遺伝子群の発現を調節していることが知られてい
る。この遺伝子群には、プロリンやグリシンベタインと
いった適合溶質の合成に関わるものなどが含まれてい
る。プロリンやグリシンベタインは非常に良く研究が進
んでおり、これらの合成系又は分解系を操作して過剰に
プロリンやグリシンベタインを蓄積させたトランスジェ
ニック植物で、NaClや低温のストレスに対して耐性を示
すことが知られている。
は、植物ホルモンの一種であるアブシジン酸 (Abscisic
acid; ABA)が深く関与しており、植物が乾燥などのス
トレスを受けるとABA依存的経路とABA非依存的経路によ
りシグナル伝達され、このシグナル伝達によりストレス
誘導性遺伝子群の発現を調節していることが知られてい
る。この遺伝子群には、プロリンやグリシンベタインと
いった適合溶質の合成に関わるものなどが含まれてい
る。プロリンやグリシンベタインは非常に良く研究が進
んでおり、これらの合成系又は分解系を操作して過剰に
プロリンやグリシンベタインを蓄積させたトランスジェ
ニック植物で、NaClや低温のストレスに対して耐性を示
すことが知られている。
【０００６】ところでRFOの生合成経路は、図１０に示
すように、初めにガラクチノール合成酵素によってガラ
クチノールが合成され、このガラクチノールとシュクロ
ースを基質としてラフィノース合成酵素によりラフィノ
ースが合成され、さらにガラクチノールとラフィノース
とを基質としてスタキオース合成酵素によりスタキオー
スが合成される。このラフィノース、スタキオースの総
称をRFOという。これまでのRFOに関する報告としては、
ラフィノース及びスタチオースが種子の乾燥耐性に重要
な役割を果たしていることを示唆するもののみであった
(Blackman S.A. et al. Plant Physiol. 100:225-230,1
992, Ooms J.J.J. et al. Plant Physiol. 102:1185-11
92,1993)。しかしながら、種子ではなく植物体における
RFOの機能や役割等に関する報告はなかった。種子と植
物体とでは、重複する乾燥耐性獲得機構を持つ場合もあ
れば、全く別の機構が働いていることもある。
すように、初めにガラクチノール合成酵素によってガラ
クチノールが合成され、このガラクチノールとシュクロ
ースを基質としてラフィノース合成酵素によりラフィノ
ースが合成され、さらにガラクチノールとラフィノース
とを基質としてスタキオース合成酵素によりスタキオー
スが合成される。このラフィノース、スタキオースの総
称をRFOという。これまでのRFOに関する報告としては、
ラフィノース及びスタチオースが種子の乾燥耐性に重要
な役割を果たしていることを示唆するもののみであった
(Blackman S.A. et al. Plant Physiol. 100:225-230,1
992, Ooms J.J.J. et al. Plant Physiol. 102:1185-11
92,1993)。しかしながら、種子ではなく植物体における
RFOの機能や役割等に関する報告はなかった。種子と植
物体とでは、重複する乾燥耐性獲得機構を持つ場合もあ
れば、全く別の機構が働いていることもある。
【０００７】例えば、植物においては、乾燥などのスト
レスにさらされると先に述べたABAを蓄積させることに
よって、気孔を閉鎖し、水分蒸散を抑制することによっ
て過剰な水分の体外流出を防ぐことが知られている。実
際にABAの合成系に変異が生じたシロイヌナズナのABA欠
損変異株であるaba1は通常湿度下では生育できないほど
萎れやすくなっている。しかしながら、ABA欠損変異株
の種子においては、完全に乾燥しても発芽することが出
来る。つまりABA欠損変異株の種子における乾燥耐性の
低下は認められない(Koornneef, M et al., Physiol. P
lant. 61:377-383, 1984, Duckham, S.C. et al., Plan
t Cell and Environ. 14:601-606, 1991, Rock, C.D. a
nd Zeevaart, J.A.D., Proc.Natl. Acad. Sci. 88:7496
-7499,1991)。
レスにさらされると先に述べたABAを蓄積させることに
よって、気孔を閉鎖し、水分蒸散を抑制することによっ
て過剰な水分の体外流出を防ぐことが知られている。実
際にABAの合成系に変異が生じたシロイヌナズナのABA欠
損変異株であるaba1は通常湿度下では生育できないほど
萎れやすくなっている。しかしながら、ABA欠損変異株
の種子においては、完全に乾燥しても発芽することが出
来る。つまりABA欠損変異株の種子における乾燥耐性の
低下は認められない(Koornneef, M et al., Physiol. P
lant. 61:377-383, 1984, Duckham, S.C. et al., Plan
t Cell and Environ. 14:601-606, 1991, Rock, C.D. a
nd Zeevaart, J.A.D., Proc.Natl. Acad. Sci. 88:7496
-7499,1991)。
【０００８】また、シロイヌナズナのABA非感受性変異
株であるabi3は、種子の乾燥耐性が失われており、完全
に乾燥させると発芽能を失うことが知られているが、乾
燥が進む前に播種させた種子では発芽でき、しかも植物
体ではaba1のような萎れる表現型は観察されない(Namba
ra, E., et al, Plant J. 2:435-441, 1992, Kriz, A.
R., et al, Plant Physiol. 92:538-542, 1990, Parcy,
F., et al, Plant Cell 6:1567-1582)。つまり種子の
乾燥耐性獲得については種子のみで機能するABI3がABA
よりも遙かに大きい働きを持つことが考えられる。この
ように、種子と植物体とでは、乾燥耐性獲得機構に大き
な隔たりがあり、種子の乾燥耐性に重要と示唆されてい
るRFOがそのまま植物体の乾燥耐性にもなんらかの役割
を果たしているのかは不明であり、予測すらできないの
が現状であった。
株であるabi3は、種子の乾燥耐性が失われており、完全
に乾燥させると発芽能を失うことが知られているが、乾
燥が進む前に播種させた種子では発芽でき、しかも植物
体ではaba1のような萎れる表現型は観察されない(Namba
ra, E., et al, Plant J. 2:435-441, 1992, Kriz, A.
R., et al, Plant Physiol. 92:538-542, 1990, Parcy,
F., et al, Plant Cell 6:1567-1582)。つまり種子の
乾燥耐性獲得については種子のみで機能するABI3がABA
よりも遙かに大きい働きを持つことが考えられる。この
ように、種子と植物体とでは、乾燥耐性獲得機構に大き
な隔たりがあり、種子の乾燥耐性に重要と示唆されてい
るRFOがそのまま植物体の乾燥耐性にもなんらかの役割
を果たしているのかは不明であり、予測すらできないの
が現状であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、上
述したような実状に鑑み、乾燥及び/又は高塩濃度等の
環境ストレスに対して耐性を持つ植物体を作出すること
を可能とする植物に対するストレス耐性付与方法を提供
することを目的とする。
述したような実状に鑑み、乾燥及び/又は高塩濃度等の
環境ストレスに対して耐性を持つ植物体を作出すること
を可能とする植物に対するストレス耐性付与方法を提供
することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上述した目的を達成する
ため本発明者が鋭意検討した結果、植物体内のガラクチ
ノール量を増大させることによって、当該植物体にスト
レス耐性を付与することができるといった知見を得て、
本発明を完成するに至った。
ため本発明者が鋭意検討した結果、植物体内のガラクチ
ノール量を増大させることによって、当該植物体にスト
レス耐性を付与することができるといった知見を得て、
本発明を完成するに至った。
【００１１】すなわち、本発明は、以下を包含する。 （１）ガラクチノール合成酵素遺伝子を植物体内に導入
することを特徴とする植物に対するストレス耐性付与方
法。
することを特徴とする植物に対するストレス耐性付与方
法。
【００１２】（２）上記ガラクチノール合成酵素遺伝子
は、以下の(a)又は(b)の遺伝子であることを特徴とする
（１）記載の植物に対するストレス耐性付与方法。 (a)配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコー
ドする遺伝子。 (b)配列番号１のアミノ酸配列における少なくとも１又
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有するタン
パク質をコードする遺伝子。
は、以下の(a)又は(b)の遺伝子であることを特徴とする
（１）記載の植物に対するストレス耐性付与方法。 (a)配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコー
ドする遺伝子。 (b)配列番号１のアミノ酸配列における少なくとも１又
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有するタン
パク質をコードする遺伝子。
【００１３】（３）上記ガラクチノール合成酵素遺伝子
は、以下の(c)又は(d)の遺伝子であることを特徴とする
（１）記載の植物に対するストレス耐性付与方法。 (c)配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコー
ドする遺伝子。 (d)配列番号２のアミノ酸配列における少なくとも１又
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有するタン
パク質をコードする遺伝子。
は、以下の(c)又は(d)の遺伝子であることを特徴とする
（１）記載の植物に対するストレス耐性付与方法。 (c)配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコー
ドする遺伝子。 (d)配列番号２のアミノ酸配列における少なくとも１又
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有するタン
パク質をコードする遺伝子。
【００１４】（４）植物体内におけるガラクチノール量
を増大させることを特徴とする（１）記載の植物に対す
るストレス耐性付与方法。
を増大させることを特徴とする（１）記載の植物に対す
るストレス耐性付与方法。
【００１５】（５）植物体内におけるガラクチノール合
成活性を向上させることを特徴とする（１）記載の植物
に対するストレス耐性付与方法。
成活性を向上させることを特徴とする（１）記載の植物
に対するストレス耐性付与方法。
【００１６】（６）植物体内におけるガラクチノール量
を増大させることを特徴とする植物に対するストレス耐
性付与方法。
を増大させることを特徴とする植物に対するストレス耐
性付与方法。
【００１７】（７）植物体内におけるガラクチノール合
成活性を向上させることを特徴とする植物に対するスト
レス耐性付与方法。
成活性を向上させることを特徴とする植物に対するスト
レス耐性付与方法。
【００１８】（８）以下の(e)又は(f)のタンパク質を、
植物内に過剰発現させることを特徴とする植物に対する
ストレス耐性付与方法。 (e)配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質。 (f)配列番号１のアミノ酸配列における少なくとも１又
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有するタン
パク質。
植物内に過剰発現させることを特徴とする植物に対する
ストレス耐性付与方法。 (e)配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質。 (f)配列番号１のアミノ酸配列における少なくとも１又
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有するタン
パク質。
【００１９】（９）以下の(g)又は(h)のタンパク質を、
植物内に過剰発現させることを特徴とする植物に対する
ストレス耐性付与方法。 (g)配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質。 (h)配列番号２のアミノ酸配列における少なくとも１又
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有するタン
パク質。
植物内に過剰発現させることを特徴とする植物に対する
ストレス耐性付与方法。 (g)配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質。 (h)配列番号２のアミノ酸配列における少なくとも１又
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有するタン
パク質。
【００２０】
【発明の実施の形態】以下、本発明に係る植物に対する
ストレス耐性付与方法を詳細に説明する。本発明に係る
植物に対するストレス耐性付与方法は、植物体内に例え
ば、ガラクチノール合成酵素をコードする遺伝子（ガラ
クチノール合成酵素遺伝子と呼ぶ）を導入することによ
って、当該植物体にストレス耐性を付与する手法であ
る。ここで、植物としては、特に限定されないが、例え
ば、シロイヌナズナ、ダイズ、ソラマメ、ナタネ、ヒマ
ワリ、ワタ、シュガービート、イネ、サトウキビ、コー
ン及びソルガム等を挙げることができる。
ストレス耐性付与方法を詳細に説明する。本発明に係る
植物に対するストレス耐性付与方法は、植物体内に例え
ば、ガラクチノール合成酵素をコードする遺伝子（ガラ
クチノール合成酵素遺伝子と呼ぶ）を導入することによ
って、当該植物体にストレス耐性を付与する手法であ
る。ここで、植物としては、特に限定されないが、例え
ば、シロイヌナズナ、ダイズ、ソラマメ、ナタネ、ヒマ
ワリ、ワタ、シュガービート、イネ、サトウキビ、コー
ン及びソルガム等を挙げることができる。
【００２１】ここでガラクチノール合成酵素遺伝子と
は、ガラクチノール合成酵素活性を有するタンパク質を
コードするのであるかぎりいかなるものでも良い。ガラ
クチノール合成酵素活性とは、ＵＤＰ−ガラクトースと
ｍｙｏ−イノシトールを基質としてガラクチノールを合
成する活性をいう。具体的には、ＵＤＰ−ガラクトース
とｍｙｏ−イノシトールを有する反応液に、植物体から
抽出したガラクチノール合成酵素を含む画分を加えてガ
ラクチノール合成反応を行い、反応溶液中に生じたガラ
クチノールを定量することによってガラクチノール合成
活性を評価することができる。さらに具体的には、Liu,
J.J. et al., Plant Physiol. 109: 505-511, 1995に
記載されている方法に準じて測定することができる。す
なわち、4mMMnCl2を含む反応緩衝液(50mM Hepes-Na, 2m
M DTT, pH7.0), に測定対象のタンパク質0.017mgを加え
30℃、15分間インキュベートした後、4mM UDP-ガラクト
ース、 20mM myo-イノシトール及び0.16mg BSAを加え、
トータル1mlの系でさらに30℃、30分間インキュベート
してガラクチノール合成反応を行い、反応液中のガラク
チノールを定量する。なお、反応後2mlのcold 100% EtO
Hを加えてガラクチノール合成反応を停止させることが
できる。
は、ガラクチノール合成酵素活性を有するタンパク質を
コードするのであるかぎりいかなるものでも良い。ガラ
クチノール合成酵素活性とは、ＵＤＰ−ガラクトースと
ｍｙｏ−イノシトールを基質としてガラクチノールを合
成する活性をいう。具体的には、ＵＤＰ−ガラクトース
とｍｙｏ−イノシトールを有する反応液に、植物体から
抽出したガラクチノール合成酵素を含む画分を加えてガ
ラクチノール合成反応を行い、反応溶液中に生じたガラ
クチノールを定量することによってガラクチノール合成
活性を評価することができる。さらに具体的には、Liu,
J.J. et al., Plant Physiol. 109: 505-511, 1995に
記載されている方法に準じて測定することができる。す
なわち、4mMMnCl2を含む反応緩衝液(50mM Hepes-Na, 2m
M DTT, pH7.0), に測定対象のタンパク質0.017mgを加え
30℃、15分間インキュベートした後、4mM UDP-ガラクト
ース、 20mM myo-イノシトール及び0.16mg BSAを加え、
トータル1mlの系でさらに30℃、30分間インキュベート
してガラクチノール合成反応を行い、反応液中のガラク
チノールを定量する。なお、反応後2mlのcold 100% EtO
Hを加えてガラクチノール合成反応を停止させることが
できる。
【００２２】ガラクチノール合成酵素遺伝子は、植物体
から調製することができる。植物体としては、ガラクチ
ノールを合成している植物であればいかなる植物体でも
よく、例えば、シロイヌナズナ、ソラマメ、ナタネ、ヒ
マワリ、ワタ、シュガービート等を挙げることができ
る。
から調製することができる。植物体としては、ガラクチ
ノールを合成している植物であればいかなる植物体でも
よく、例えば、シロイヌナズナ、ソラマメ、ナタネ、ヒ
マワリ、ワタ、シュガービート等を挙げることができ
る。
【００２３】ガラクチノール合成酵素遺伝子は、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋなどのデータベースを用いて、シロイヌナズナ
由来のガラクチノール合成酵素遺伝子に対し相同性を有
する遺伝子を検索することによって、塩基配列情報を得
ることができる。ホモロジー解析プログラムはＬｉｐｍ
ａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用したＧＥＮＥＴＩＸ−Ｍ
ＡＣ（遺伝子情報処理ソフトウエア、ソフトウエア開発
社）などを用いてもよく、また、インターネット上に公
開されているものを使用してもよい。このような方法に
より得られた塩基配列は遺伝子全長を含む場合と、遺伝
子全長を含まない場合がある。遺伝子全長を含まない場
合は、目的植物組織より抽出したＲＮＡを鋳型に、シロ
イヌナズナ由来のガラクチノール合成酵素遺伝子と相同
性の高い部位に対応するプライマーを用い、５’ＲＡＣ
Ｅ法、３’ＲＡＣＥ法にて、容易に全長遺伝子を取得す
ることができる。得られた全長遺伝子は、Soluble Prot
ein Expression System(INVITROGEN社)や、Tight Contr
ol Expression System (INVITROGEN社）や、QIAexpress
System(QIAGEN社)などのキットが提供する適当な発現
ベクターに組み込み、遺伝子を発現させ、記載の方法で
ガラクチノール合成酵素活性を測定し、活性を有するク
ローンを選抜すればよい。遺伝子の発現方法について
は、Plant Molecular Biology, A Laboratory Manual
(Melody S. Clark (Ed.), Springer)などに詳しく記載
されている。
Ｂａｎｋなどのデータベースを用いて、シロイヌナズナ
由来のガラクチノール合成酵素遺伝子に対し相同性を有
する遺伝子を検索することによって、塩基配列情報を得
ることができる。ホモロジー解析プログラムはＬｉｐｍ
ａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用したＧＥＮＥＴＩＸ−Ｍ
ＡＣ（遺伝子情報処理ソフトウエア、ソフトウエア開発
社）などを用いてもよく、また、インターネット上に公
開されているものを使用してもよい。このような方法に
より得られた塩基配列は遺伝子全長を含む場合と、遺伝
子全長を含まない場合がある。遺伝子全長を含まない場
合は、目的植物組織より抽出したＲＮＡを鋳型に、シロ
イヌナズナ由来のガラクチノール合成酵素遺伝子と相同
性の高い部位に対応するプライマーを用い、５’ＲＡＣ
Ｅ法、３’ＲＡＣＥ法にて、容易に全長遺伝子を取得す
ることができる。得られた全長遺伝子は、Soluble Prot
ein Expression System(INVITROGEN社)や、Tight Contr
ol Expression System (INVITROGEN社）や、QIAexpress
System(QIAGEN社)などのキットが提供する適当な発現
ベクターに組み込み、遺伝子を発現させ、記載の方法で
ガラクチノール合成酵素活性を測定し、活性を有するク
ローンを選抜すればよい。遺伝子の発現方法について
は、Plant Molecular Biology, A Laboratory Manual
(Melody S. Clark (Ed.), Springer)などに詳しく記載
されている。
【００２４】また、ガラクチノール合成酵素遺伝子は、
シロイヌナズナ等の植物体から単離したｐｏｌｙ（Ａ）
＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製し、このｃＤ
ＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションによってス
クリーニングすることによって、取得することができ
る。ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、ガラ
クチノール合成酵素の部分アミノ酸配列に基づいて合成
されたオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ
（polymerase chain reaction）によって増幅すること
によって、取得することができる。
シロイヌナズナ等の植物体から単離したｐｏｌｙ（Ａ）
＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製し、このｃＤ
ＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションによってス
クリーニングすることによって、取得することができ
る。ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、ガラ
クチノール合成酵素の部分アミノ酸配列に基づいて合成
されたオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ
（polymerase chain reaction）によって増幅すること
によって、取得することができる。
【００２５】以下に、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡからガラ
クチノール合成酵素遺伝子を取得する方法を具体的に説
明する。ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの抽出部位としては、
ガラクチノール合成酵素遺伝子が発現していれば如何な
る部位を用いても良い。全ＲＮＡを抽出するには、効率
よく損傷の少ないＲＮＡが得られるならば方法は制限さ
れず、例えば、フェノール／ＳＤＳ法、グアニジンイソ
チオシアネート／塩化セシウム法等、公知のいずれの方
法によっても可能である。こうして得た全ＲＮＡからオ
リゴ（ｄＴ）担体を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを分
離できる。また、全ＲＮＡを抽出せずにｐｏｌｙ（Ａ）
＋ＲＮＡを得ることのできるキット（MPG Direct mRNA
Purification Kit、CPG,INC.社等）を使用しても良い。
クチノール合成酵素遺伝子を取得する方法を具体的に説
明する。ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの抽出部位としては、
ガラクチノール合成酵素遺伝子が発現していれば如何な
る部位を用いても良い。全ＲＮＡを抽出するには、効率
よく損傷の少ないＲＮＡが得られるならば方法は制限さ
れず、例えば、フェノール／ＳＤＳ法、グアニジンイソ
チオシアネート／塩化セシウム法等、公知のいずれの方
法によっても可能である。こうして得た全ＲＮＡからオ
リゴ（ｄＴ）担体を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを分
離できる。また、全ＲＮＡを抽出せずにｐｏｌｙ（Ａ）
＋ＲＮＡを得ることのできるキット（MPG Direct mRNA
Purification Kit、CPG,INC.社等）を使用しても良い。
【００２６】ｃＤＮＡライブラリーを作製するために
は、まずｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型にし、オリゴ
（ｄＴ）プライマー、ランダムプライマー等を用い、逆
転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡを合成し、次にグブラ
−ホフマン（Gubler and Hoffman）法、オカヤマ−バー
グ（Okayama-Berg）法（Molecular Cloning 2nd editio
n、Cold Spring Harbor press、1989）等により二本鎖ｃ
ＤＮＡを合成する。ガラクチノール合成酵素遺伝子の発
現量が少ない場合には、ＰＣＲを利用したｃＤＮＡライ
ブラリー作製キット（Capfinder PCR cDNA Library Con
struction Kit(CLONTECH社)等）を用いて、ＰＣＲによ
ってｃＤＮＡを増幅してもよい。このようにして合成し
たｃＤＮＡは、平滑末端化、リンカーの付加、ＰＣＲに
よる制限酵素サイトの付加等を行うことにより、ファー
ジベクター、プラスミド等のクローニングベクターにク
ローニングできる。
は、まずｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型にし、オリゴ
（ｄＴ）プライマー、ランダムプライマー等を用い、逆
転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡを合成し、次にグブラ
−ホフマン（Gubler and Hoffman）法、オカヤマ−バー
グ（Okayama-Berg）法（Molecular Cloning 2nd editio
n、Cold Spring Harbor press、1989）等により二本鎖ｃ
ＤＮＡを合成する。ガラクチノール合成酵素遺伝子の発
現量が少ない場合には、ＰＣＲを利用したｃＤＮＡライ
ブラリー作製キット（Capfinder PCR cDNA Library Con
struction Kit(CLONTECH社)等）を用いて、ＰＣＲによ
ってｃＤＮＡを増幅してもよい。このようにして合成し
たｃＤＮＡは、平滑末端化、リンカーの付加、ＰＣＲに
よる制限酵素サイトの付加等を行うことにより、ファー
ジベクター、プラスミド等のクローニングベクターにク
ローニングできる。
【００２７】ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに
使用するプローブのＤＮＡ断片は、ＰＣＲを行うことで
得ることができる。例えば、イネ等の植物における既知
のガラクチノール合成酵素遺伝子ホモログの塩基配列情
報を用いて、シロイヌナズナ等の抽出対象植物のゲノム
塩基配列を蓄積したデーターベースから該遺伝子のホモ
ログを検索する。その結果、抽出対象植物におけるガラ
クチノール合成酵素遺伝子ホモログを同定し、PCRにお
けるプライマーを設計することができる。
使用するプローブのＤＮＡ断片は、ＰＣＲを行うことで
得ることができる。例えば、イネ等の植物における既知
のガラクチノール合成酵素遺伝子ホモログの塩基配列情
報を用いて、シロイヌナズナ等の抽出対象植物のゲノム
塩基配列を蓄積したデーターベースから該遺伝子のホモ
ログを検索する。その結果、抽出対象植物におけるガラ
クチノール合成酵素遺伝子ホモログを同定し、PCRにお
けるプライマーを設計することができる。
【００２８】このように設計して合成したプライマー及
びゲノムＤＮＡを用いてPCRを行うことによって、ハイ
ブリダイゼーションに使用するプローブを作製すること
ができる。また、いわゆるＲＡＣＥ法（Rapid Amplific
ation of cDNA End:PCR PROTOCOLS A Guide to Methods
and Applications、ACADEMIC press INC.p28〜38）を行
ってプローブを作製しても良い。プローブのラベルに
は、ラジオアイソトープ、ビオチン等、種々のものを用
いることができるが、ランダムプライミング法でラベル
することが望ましい。また、スクリーニングにはハイブ
リダイゼーションではなくＰＣＲを用いてもよい。さら
に、ハイブリダイゼーションとＰＣＲを組み合わせても
よい。抽出対象植物のゲノム情報が得られない場合に
は、異種植物のガラクチノール合成酵素ホモログの塩基
配列に基づいて作製したプローブを用いてスクリーニン
グを行うことができる。
びゲノムＤＮＡを用いてPCRを行うことによって、ハイ
ブリダイゼーションに使用するプローブを作製すること
ができる。また、いわゆるＲＡＣＥ法（Rapid Amplific
ation of cDNA End:PCR PROTOCOLS A Guide to Methods
and Applications、ACADEMIC press INC.p28〜38）を行
ってプローブを作製しても良い。プローブのラベルに
は、ラジオアイソトープ、ビオチン等、種々のものを用
いることができるが、ランダムプライミング法でラベル
することが望ましい。また、スクリーニングにはハイブ
リダイゼーションではなくＰＣＲを用いてもよい。さら
に、ハイブリダイゼーションとＰＣＲを組み合わせても
よい。抽出対象植物のゲノム情報が得られない場合に
は、異種植物のガラクチノール合成酵素ホモログの塩基
配列に基づいて作製したプローブを用いてスクリーニン
グを行うことができる。
【００２９】ガラクチノール合成酵素遺伝子のクローニ
ングには、上述した方法以外に下記の方法が挙げられ
る。 （１）植物体からガラクチノール合成酵素を単離精製
し、決定されるアミノ酸配列を基に全塩基配列を化学合
成する。 （２）植物体から染色体ＤＮＡを調製し、プラスミドベ
クター等を用いて染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、
このライブラリーからガラクチノール合成酵素遺伝子
を、ハイブリダイゼーンション又はＰＣＲによって取得
する。尚、染色体由来のガラクチノール合成酵素遺伝子
は、コード領域にイントロンが含まれることが予想され
るが、このようなイントロンによって分断されたＤＮＡ
であっても、ガラクチノール合成酵素をコードする限り
本発明のＤＮＡに含まれる。 （３）ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを分子量等によって分画
し、ホイートジャーム又はウサギ網状赤血球を用いたイ
ンビトロ翻訳系に供し、ガラクチノール合成酵素活性を
有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡが存在する画
分を決定し、それより目的のｃＤＮＡ断片を作製、取得
する。 （４）ガラクチノール合成酵素抗体を作製し、タンパク
質発現ベクターにｃＤＮＡライブラリーを乗せ、適当な
宿主に感染させてｃＤＮＡがコードするタンパク質を発
現させ、この抗体を用いて目的のｃＤＮＡをスクリーニ
ングする。 （５）ペプチド断片のアミノ酸配列から適当なプライマ
ーを合成し、ＲＡＣＥ法によって、末端を含む配列を増
幅し、これをクローニングする。
ングには、上述した方法以外に下記の方法が挙げられ
る。 （１）植物体からガラクチノール合成酵素を単離精製
し、決定されるアミノ酸配列を基に全塩基配列を化学合
成する。 （２）植物体から染色体ＤＮＡを調製し、プラスミドベ
クター等を用いて染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、
このライブラリーからガラクチノール合成酵素遺伝子
を、ハイブリダイゼーンション又はＰＣＲによって取得
する。尚、染色体由来のガラクチノール合成酵素遺伝子
は、コード領域にイントロンが含まれることが予想され
るが、このようなイントロンによって分断されたＤＮＡ
であっても、ガラクチノール合成酵素をコードする限り
本発明のＤＮＡに含まれる。 （３）ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを分子量等によって分画
し、ホイートジャーム又はウサギ網状赤血球を用いたイ
ンビトロ翻訳系に供し、ガラクチノール合成酵素活性を
有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡが存在する画
分を決定し、それより目的のｃＤＮＡ断片を作製、取得
する。 （４）ガラクチノール合成酵素抗体を作製し、タンパク
質発現ベクターにｃＤＮＡライブラリーを乗せ、適当な
宿主に感染させてｃＤＮＡがコードするタンパク質を発
現させ、この抗体を用いて目的のｃＤＮＡをスクリーニ
ングする。 （５）ペプチド断片のアミノ酸配列から適当なプライマ
ーを合成し、ＲＡＣＥ法によって、末端を含む配列を増
幅し、これをクローニングする。
【００３０】ガラクチノール合成酵素遺伝子を発現させ
るには、酵素をコードする領域のＤＮＡを種々の発現ベ
クターに組み込めばよく、詳しくは、Plant Molecular
Biology-A Laboratory Manual(M.S.Clark(eds.),Spring
er）などに記載されている。ベクターとしては、市販の
発現ベクターを使用してもよい。発現の確認は、本明細
書に記載の方法によって活性を測定することによって行
うことができる。
るには、酵素をコードする領域のＤＮＡを種々の発現ベ
クターに組み込めばよく、詳しくは、Plant Molecular
Biology-A Laboratory Manual(M.S.Clark(eds.),Spring
er）などに記載されている。ベクターとしては、市販の
発現ベクターを使用してもよい。発現の確認は、本明細
書に記載の方法によって活性を測定することによって行
うことができる。
【００３１】ガラクチノール合成酵素遺伝子としては、
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードす
るもの、又は、配列番号１のアミノ酸配列における少な
くとも１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有す
るタンパク質をコードするものが挙げられる。また、ガ
ラクチノール合成酵素遺伝子としては、配列番号２のア
ミノ酸配列を含むタンパク質をコードするもの、又は、
配列番号２のアミノ酸配列における少なくとも１以上の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
を含み、ガラクチノール合成活性を有するタンパク質を
コードするものが挙げられる。また、ガラクチノール合
成酵素遺伝子としては、配列番号３のものが挙げられ
る。
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードす
るもの、又は、配列番号１のアミノ酸配列における少な
くとも１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有す
るタンパク質をコードするものが挙げられる。また、ガ
ラクチノール合成酵素遺伝子としては、配列番号２のア
ミノ酸配列を含むタンパク質をコードするもの、又は、
配列番号２のアミノ酸配列における少なくとも１以上の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
を含み、ガラクチノール合成活性を有するタンパク質を
コードするものが挙げられる。また、ガラクチノール合
成酵素遺伝子としては、配列番号３のものが挙げられ
る。
【００３２】ガラクチノール合成酵素遺伝子は、ガラク
チノール合成酵素の活性、すなわちUDP-ガラクトースと
myo-イノシトールとからガラクチノールを生成する活性
が損なわれない限り、配列番号１又は２のアミノ酸配列
において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個の
アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むガ
ラクチノール合成酵素タンパク質をコードするものであ
ってもよい。ガラクチノール合成酵素遺伝子とは、ガラ
クチノール合成酵素活性を有するタンパク質をコードす
るのであるかぎりいかなるものでも良い。ガラクチノー
ル合成酵素活性とは、ＵＤＰ−ガラクトースとｍｙｏ−
イノシトールを基質としてガラクチノールを合成する活
性をいう。具体的には、ＵＤＰ−ガラクトースとｍｙｏ
−イノシトールを有する反応液に、植物体から抽出した
ガラクチノール合成酵素を含む画分を加えてガラクチノ
ール合成反応を行い、反応溶液中に生じたガラクチノー
ルを定量することによってガラクチノール合成活性を評
価することができる。さらに具体的には、Liu, J.J. et
al., Plant Physiol. 109: 505-511, 1995に記載され
ている方法に準じて測定することができる。すなわち、
4mM MnCl2を含む反応緩衝液(50mM Hepes-Na, 2mM DTT,
pH7.0), に測定対象のタンパク質0.017mgを加え30℃、1
5分間インキュベートした後、4mM UDP-ガラクトース、
20mM myo-イノシトール及び0.16mg BSAを加え、トータ
ル1mlの系でさらに30℃、30分間インキュベートしてガ
ラクチノール合成反応を行い、反応液中のガラクチノー
ルを定量する。なお、反応後2mlのcold 100% EtOHを加
えてガラクチノール合成反応を停止させることができ
る。ガラクチノール合成活性を有するとは、配列番号１
または２に示されるガラクチノール合成酵素が有する活
性の３０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好まし
くは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の活性を保
持するものをいう。
チノール合成酵素の活性、すなわちUDP-ガラクトースと
myo-イノシトールとからガラクチノールを生成する活性
が損なわれない限り、配列番号１又は２のアミノ酸配列
において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個の
アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むガ
ラクチノール合成酵素タンパク質をコードするものであ
ってもよい。ガラクチノール合成酵素遺伝子とは、ガラ
クチノール合成酵素活性を有するタンパク質をコードす
るのであるかぎりいかなるものでも良い。ガラクチノー
ル合成酵素活性とは、ＵＤＰ−ガラクトースとｍｙｏ−
イノシトールを基質としてガラクチノールを合成する活
性をいう。具体的には、ＵＤＰ−ガラクトースとｍｙｏ
−イノシトールを有する反応液に、植物体から抽出した
ガラクチノール合成酵素を含む画分を加えてガラクチノ
ール合成反応を行い、反応溶液中に生じたガラクチノー
ルを定量することによってガラクチノール合成活性を評
価することができる。さらに具体的には、Liu, J.J. et
al., Plant Physiol. 109: 505-511, 1995に記載され
ている方法に準じて測定することができる。すなわち、
4mM MnCl2を含む反応緩衝液(50mM Hepes-Na, 2mM DTT,
pH7.0), に測定対象のタンパク質0.017mgを加え30℃、1
5分間インキュベートした後、4mM UDP-ガラクトース、
20mM myo-イノシトール及び0.16mg BSAを加え、トータ
ル1mlの系でさらに30℃、30分間インキュベートしてガ
ラクチノール合成反応を行い、反応液中のガラクチノー
ルを定量する。なお、反応後2mlのcold 100% EtOHを加
えてガラクチノール合成反応を停止させることができ
る。ガラクチノール合成活性を有するとは、配列番号１
または２に示されるガラクチノール合成酵素が有する活
性の３０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好まし
くは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の活性を保
持するものをいう。
【００３３】アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコ
ードするガラクチノール合成酵素遺伝子を調製するため
の当業者によく知られた方法としては、例えば、PCRに
よるin vitro変異導入法が挙げられる（伊沢毅、PCRに
よるin vitro mutagenesis、151-158頁、監修 島本
功、佐々木卓治、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ７
新版植物のＰＣＲ実験プロトコール、秀潤社）。タンパ
ク質におけるアミノ酸の改変は、人為的に行うのであれ
ば、通常、200アミノ酸以内、好ましくは100アミノ酸以
内、さらに好ましくは50アミノ酸以内、さらに好ましく
は10アミノ酸以内である。また、塩基配列の変異により
コードする蛋白質のアミノ酸配列が変異することは、自
然界においても生じ得る。このように天然型のガラクチ
ノール合成酵素における1もしくは複数のアミノ酸が置
換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配
列を有する蛋白質をコードするガラクチノール合成酵素
遺伝子であっても、ガラクチノール合成酵素を有する蛋
白質をコードする限り、ガラクチノール合成酵素遺伝子
に含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合で
も、それが蛋白質中のアミノ酸の変異を伴わない場合
（縮重変異）もあり、このような縮重変異体もガラクチ
ノール合成酵素遺伝子に含まれる。
ードするガラクチノール合成酵素遺伝子を調製するため
の当業者によく知られた方法としては、例えば、PCRに
よるin vitro変異導入法が挙げられる（伊沢毅、PCRに
よるin vitro mutagenesis、151-158頁、監修 島本
功、佐々木卓治、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ７
新版植物のＰＣＲ実験プロトコール、秀潤社）。タンパ
ク質におけるアミノ酸の改変は、人為的に行うのであれ
ば、通常、200アミノ酸以内、好ましくは100アミノ酸以
内、さらに好ましくは50アミノ酸以内、さらに好ましく
は10アミノ酸以内である。また、塩基配列の変異により
コードする蛋白質のアミノ酸配列が変異することは、自
然界においても生じ得る。このように天然型のガラクチ
ノール合成酵素における1もしくは複数のアミノ酸が置
換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配
列を有する蛋白質をコードするガラクチノール合成酵素
遺伝子であっても、ガラクチノール合成酵素を有する蛋
白質をコードする限り、ガラクチノール合成酵素遺伝子
に含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合で
も、それが蛋白質中のアミノ酸の変異を伴わない場合
（縮重変異）もあり、このような縮重変異体もガラクチ
ノール合成酵素遺伝子に含まれる。
【００３４】このような配列番号１又は２以外のアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードするガラクチノール
合成酵素遺伝子は、例えば、配列番号３に示したガラク
チノール合成酵素遺伝子に対して部位特異的変異法によ
って、特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加
されるように塩基配列を改変して得ることもできる。ま
た、上記のような改変されたガラクチノール合成酵素遺
伝子は、従来知られている突然変異処理によっても取得
され得る。突然変異処理としては、ガラクチノール合成
酵素遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理す
る方法、及びガラクチノール合成酵素遺伝子を保持する
エシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−
N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜
硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によ
って処理する方法が挙げられる。また、上記のような塩
基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、植物体
の個体差、品種間差、遺伝子の多コピー化、各器官、組
織の違いに基づく場合などの天然に生じる変異も含まれ
る。
酸配列を有するタンパク質をコードするガラクチノール
合成酵素遺伝子は、例えば、配列番号３に示したガラク
チノール合成酵素遺伝子に対して部位特異的変異法によ
って、特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加
されるように塩基配列を改変して得ることもできる。ま
た、上記のような改変されたガラクチノール合成酵素遺
伝子は、従来知られている突然変異処理によっても取得
され得る。突然変異処理としては、ガラクチノール合成
酵素遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理す
る方法、及びガラクチノール合成酵素遺伝子を保持する
エシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−
N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜
硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によ
って処理する方法が挙げられる。また、上記のような塩
基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、植物体
の個体差、品種間差、遺伝子の多コピー化、各器官、組
織の違いに基づく場合などの天然に生じる変異も含まれ
る。
【００３５】上記のような変異を有するガラクチノール
合成酵素遺伝子を、適当な細胞で発現させ、発現産物の
ガラクチノール合成酵素活性を調べることにより、配列
番号１又は２と異なるアミノ酸配列を有するガラクチノ
ール合成酵素をコードするガラクチノール合成酵素遺伝
子が得られる。また、変異を有するガラクチノール合成
酵素遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし、かつ、ガラクチノール合成酵素活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、
配列番号１又は２と異なるアミノ酸配列を有するガラク
チノール合成酵素をコードするガラクチノール合成酵素
遺伝子が得られる。ここでいう「ストリンジェントな条
件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、
非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。こ
の条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を
示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の
相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それよ
り相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条
件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗
いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、
好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当す
る塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。この
ような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中に
ストップコドンが発生したものや、活性中心の変異によ
り活性を失ったものも含まれるが、それらについては、
市販の活性発現ベクターにつなぎガラクチノール合成酵
素活性を記述の方法で測定することによって容易に取り
除くことができる。ガラクチノール合成活性を有すると
は、配列番号１または２に示されるガラクチノール合成
酵素が有する活性の３０％以上、好ましくは６０％以
上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０
％以上の活性を保持するものをいう。
合成酵素遺伝子を、適当な細胞で発現させ、発現産物の
ガラクチノール合成酵素活性を調べることにより、配列
番号１又は２と異なるアミノ酸配列を有するガラクチノ
ール合成酵素をコードするガラクチノール合成酵素遺伝
子が得られる。また、変異を有するガラクチノール合成
酵素遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし、かつ、ガラクチノール合成酵素活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、
配列番号１又は２と異なるアミノ酸配列を有するガラク
チノール合成酵素をコードするガラクチノール合成酵素
遺伝子が得られる。ここでいう「ストリンジェントな条
件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、
非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。こ
の条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を
示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の
相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それよ
り相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条
件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗
いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、
好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当す
る塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。この
ような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中に
ストップコドンが発生したものや、活性中心の変異によ
り活性を失ったものも含まれるが、それらについては、
市販の活性発現ベクターにつなぎガラクチノール合成酵
素活性を記述の方法で測定することによって容易に取り
除くことができる。ガラクチノール合成活性を有すると
は、配列番号１または２に示されるガラクチノール合成
酵素が有する活性の３０％以上、好ましくは６０％以
上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０
％以上の活性を保持するものをいう。
【００３６】植物体内に上述したようなガラクチノール
合成酵素遺伝子を導入することによって、ガラクチノー
ル合成酵素を過剰発現するトランスジェニック植物を得
ることができる。ガラクチノール合成酵素遺伝子を導入
する際には、所定のプロモーターの下流に当該ガラクチ
ノール合成酵素遺伝子を連結した発現ベクターを構築す
る。発現ベクターを構築する際には、詳しくは、Plant
Molecular Biology-ALaboratory Manual(M.S.Clark(ed
s.),Springer）などに記載されている方法を適宜使用す
る。ベクターとしては、市販のものを使用してもよい。
また、形質転換の方法としては、特に限定されないが、
アグロバクテリウム感染方法（特公平２−５８９１７号
公報参照）、エレクトロポレーション方法（特開平５−
６８５７５号公報参照）、パーティクルガン法（特開平
５−５０８３１６号公報参照）等を挙げることができ
る。特に、アブラナ科植物に対する形質転換は、Plan C
ellReports (1987) , 6, 321 - 325に記載の方法に準じ
て行うことができる。ダイズに対する形質転換は、Pro.
Natl. Acad. Sci. USA, 86. 145 (1989)、TIBTECH, 8,
145 (1990)、 Bio/Technology, 6, 923 (1988)、 Plan
t Physiol., 87, 671 (1988), Plant Physiol., 91, 12
12 (1992)、 Bio/Technology, 6, 915 (1988)、 Plant
Physol., 99, 81 (1992)等に記載の方法に準じて行うこ
とができる。イネに対する形質転換は、「モデル植物の
実験プロトコール イネ、シロイヌナズナ編」７８頁記
載の方法に準じて行うことができる。ガラクチノール合
成酵素遺伝子の発現の確認は、本明細書に記載の方法に
よって活性を測定することによって行うことができる。
合成酵素遺伝子を導入することによって、ガラクチノー
ル合成酵素を過剰発現するトランスジェニック植物を得
ることができる。ガラクチノール合成酵素遺伝子を導入
する際には、所定のプロモーターの下流に当該ガラクチ
ノール合成酵素遺伝子を連結した発現ベクターを構築す
る。発現ベクターを構築する際には、詳しくは、Plant
Molecular Biology-ALaboratory Manual(M.S.Clark(ed
s.),Springer）などに記載されている方法を適宜使用す
る。ベクターとしては、市販のものを使用してもよい。
また、形質転換の方法としては、特に限定されないが、
アグロバクテリウム感染方法（特公平２−５８９１７号
公報参照）、エレクトロポレーション方法（特開平５−
６８５７５号公報参照）、パーティクルガン法（特開平
５−５０８３１６号公報参照）等を挙げることができ
る。特に、アブラナ科植物に対する形質転換は、Plan C
ellReports (1987) , 6, 321 - 325に記載の方法に準じ
て行うことができる。ダイズに対する形質転換は、Pro.
Natl. Acad. Sci. USA, 86. 145 (1989)、TIBTECH, 8,
145 (1990)、 Bio/Technology, 6, 923 (1988)、 Plan
t Physiol., 87, 671 (1988), Plant Physiol., 91, 12
12 (1992)、 Bio/Technology, 6, 915 (1988)、 Plant
Physol., 99, 81 (1992)等に記載の方法に準じて行うこ
とができる。イネに対する形質転換は、「モデル植物の
実験プロトコール イネ、シロイヌナズナ編」７８頁記
載の方法に準じて行うことができる。ガラクチノール合
成酵素遺伝子の発現の確認は、本明細書に記載の方法に
よって活性を測定することによって行うことができる。
【００３７】得られたトランスジェニック植物において
は、ストレスに対する耐性が向上している。ここで、ス
トレスとは、例えば、高塩濃度条件及び/又は乾燥条件
を意味する。得られたトランスジェニック植物は蒸散量
を抑えることによって、土壌中に水分吸収を抑制するこ
とができる。ここで、乾燥条件とは、野生型植物が生育
できる環境において湿度、給水が制限された状態で野性
型植物の生育が抑制されるような条件を意味する。ま
た、ここで高塩濃度条件とは、特に制限はないが、農業
肥料、または、酸性土壌、アルカリ性土壌における塩
（例えば、NaCl）を高濃度で含む条件を意味する。
は、ストレスに対する耐性が向上している。ここで、ス
トレスとは、例えば、高塩濃度条件及び/又は乾燥条件
を意味する。得られたトランスジェニック植物は蒸散量
を抑えることによって、土壌中に水分吸収を抑制するこ
とができる。ここで、乾燥条件とは、野生型植物が生育
できる環境において湿度、給水が制限された状態で野性
型植物の生育が抑制されるような条件を意味する。ま
た、ここで高塩濃度条件とは、特に制限はないが、農業
肥料、または、酸性土壌、アルカリ性土壌における塩
（例えば、NaCl）を高濃度で含む条件を意味する。
【００３８】高塩濃度条件及び/又は乾燥条件といった
ストレスに対する耐性が向上するというのは、野性型植
物の生育が抑制される又は生育できないような条件下で
あっても、生育が抑制される程度が抑えられることを意
味する。ここで、生育を評価する方法としては、特に限
定されず、例えば、生育速度、草丈、重量、葉面積、花
の稔性、花粉稔性、種子重量若しくは収量又はこれらの
組み合わせ等を挙げることができる。
ストレスに対する耐性が向上するというのは、野性型植
物の生育が抑制される又は生育できないような条件下で
あっても、生育が抑制される程度が抑えられることを意
味する。ここで、生育を評価する方法としては、特に限
定されず、例えば、生育速度、草丈、重量、葉面積、花
の稔性、花粉稔性、種子重量若しくは収量又はこれらの
組み合わせ等を挙げることができる。
【００３９】なお、トランスジェニック植物としては、
ホモ接合体、野性型植物とホモ接合体を戻し交雑したヘ
テロ後代植物であってもよい。また、野性型植物と比較
してヘテロ接合体、ヘテロ接合体と比較してホモ接合体
の方がストレスに対する耐性がより向上していることが
ある。
ホモ接合体、野性型植物とホモ接合体を戻し交雑したヘ
テロ後代植物であってもよい。また、野性型植物と比較
してヘテロ接合体、ヘテロ接合体と比較してホモ接合体
の方がストレスに対する耐性がより向上していることが
ある。
【００４０】植物体内にガラクチノール合成酵素遺伝子
を導入することによって、植物体内のガラクチノール量
を増大させることができる。ガラクチノールとは、UDP-
ガラクトースとmyo-イノシトールとを基質としてガラク
チノール合成酵素により合成される糖成分である。植物
体内におけるガラクチノール量を測定する際には、先
ず、ガラクチノールを含む抽出液を植物体から抽出す
る。抽出液は、植物体を液体窒素により凍結後、破砕
し、これにあらかじめ80℃にあたためておいた10mlの80
%エタノールを加えた後、90℃で10分間煮出し、これを
さらに二回、合計三回行うことによって得る。
を導入することによって、植物体内のガラクチノール量
を増大させることができる。ガラクチノールとは、UDP-
ガラクトースとmyo-イノシトールとを基質としてガラク
チノール合成酵素により合成される糖成分である。植物
体内におけるガラクチノール量を測定する際には、先
ず、ガラクチノールを含む抽出液を植物体から抽出す
る。抽出液は、植物体を液体窒素により凍結後、破砕
し、これにあらかじめ80℃にあたためておいた10mlの80
%エタノールを加えた後、90℃で10分間煮出し、これを
さらに二回、合計三回行うことによって得る。
【００４１】次に、この抽出液をＨＰＬＣ（高速液体ク
ロマトグラフィー）により定量する。ＨＰＬＣに際し
て、例えば、糖分析システムＤＸ５００（CarboPac MA
1、パルスドアンペロメトリー検出器（ダイオネクス社
製））を用いて行うことができる。このように、植物体
からの抽出液に含まれるガラクチノール量を定量するこ
とによって、当該植物内におけるガラクチノール量の増
加を検出することができる。
ロマトグラフィー）により定量する。ＨＰＬＣに際し
て、例えば、糖分析システムＤＸ５００（CarboPac MA
1、パルスドアンペロメトリー検出器（ダイオネクス社
製））を用いて行うことができる。このように、植物体
からの抽出液に含まれるガラクチノール量を定量するこ
とによって、当該植物内におけるガラクチノール量の増
加を検出することができる。
【００４２】本方法において、ガラクチノール量を増大
させるとは、同条件で生育した野生型の植物体内におけ
るガラクチノール量と比較して多量のガラクチノールを
含有することを意味する。具体的に、ロゼット葉におい
て、新鮮重あたりのガラクチノール含量が、無処理の野
性型植物のレベルに対し、1.1から50倍、好ましくは2倍
から30倍、より好ましくは5から20倍の程度となること
を意味する。更に好ましくは、植物体全体において、新
鮮重あたりのガラクチノール含量が、無処理の野性型植
物のレベルに対し、1.1から50倍、好ましくは2倍から30
倍、より好ましくは5から20倍の程度となることを意味
する。
させるとは、同条件で生育した野生型の植物体内におけ
るガラクチノール量と比較して多量のガラクチノールを
含有することを意味する。具体的に、ロゼット葉におい
て、新鮮重あたりのガラクチノール含量が、無処理の野
性型植物のレベルに対し、1.1から50倍、好ましくは2倍
から30倍、より好ましくは5から20倍の程度となること
を意味する。更に好ましくは、植物体全体において、新
鮮重あたりのガラクチノール含量が、無処理の野性型植
物のレベルに対し、1.1から50倍、好ましくは2倍から30
倍、より好ましくは5から20倍の程度となることを意味
する。
【００４３】ここで、植物内におけるガラクチノール合
成活性を向上させることによっても、植物体内のガラク
チノール量を増大させることができ、植物に対してスト
レス耐性を付与することができる。ここで、ガラクチノ
ール合成活性は、Liu, J.J.et al., Plant Physiol. 10
9: 505-511, 1995に記載されている方法に準じて測定す
ることができる。具体的には、4mM MnCl2を含む反応緩
衝液(50mM Hepes-Na,2mM DTT, pH7.0), に測定対象のタ
ンパク質0.017mgを加え30℃、15分間インキュベートし
た後、4mM UDP-ガラクトース、 20mM myo-イノシトール
及び0.16mg BSAを加え、トータル1mlの系でさらに30
℃、30分間インキュベートしてガラクチノール合成反応
を行い、反応液中のガラクチノールを定量する。なお、
反応後2mlのcold 100% EtOHを加えてガラクチノール合
成反応を停止させることができる。
成活性を向上させることによっても、植物体内のガラク
チノール量を増大させることができ、植物に対してスト
レス耐性を付与することができる。ここで、ガラクチノ
ール合成活性は、Liu, J.J.et al., Plant Physiol. 10
9: 505-511, 1995に記載されている方法に準じて測定す
ることができる。具体的には、4mM MnCl2を含む反応緩
衝液(50mM Hepes-Na,2mM DTT, pH7.0), に測定対象のタ
ンパク質0.017mgを加え30℃、15分間インキュベートし
た後、4mM UDP-ガラクトース、 20mM myo-イノシトール
及び0.16mg BSAを加え、トータル1mlの系でさらに30
℃、30分間インキュベートしてガラクチノール合成反応
を行い、反応液中のガラクチノールを定量する。なお、
反応後2mlのcold 100% EtOHを加えてガラクチノール合
成反応を停止させることができる。
【００４４】また、植物内におけるガラクチノール合成
活性を向上させるとは、同条件で生育した野性型植物体
内のガラクチノール合成酵素活性と比較し、新鮮重あた
りの活性若しくは比活性又は葉あたりの活性若しくは比
活性を向上させることを意味する。具体的には、ロゼッ
ト葉において、新鮮重あたりの活性が、無処理の野性型
植物のレベルに対し、1.1から50倍、好ましくは2倍から
30倍、より好ましくは5から20倍の程度となることを意
味する。更に好ましくは、植物体全体において新鮮重あ
たりの活性が、無処理の野性型植物のレベルに対し、1.
1から50倍、好ましくは2倍から30倍、より好ましくは5
から20倍の程度となることを意味する。ただし、野性株
における内在性のガラクチノール合成酵素活性は、植物
種や生育環境によっては検出できない場合がある。その
場合、植物内におけるガラクチノール合成活性を向上さ
せるとは、検出できる程度の活性を有することを意味す
る。
活性を向上させるとは、同条件で生育した野性型植物体
内のガラクチノール合成酵素活性と比較し、新鮮重あた
りの活性若しくは比活性又は葉あたりの活性若しくは比
活性を向上させることを意味する。具体的には、ロゼッ
ト葉において、新鮮重あたりの活性が、無処理の野性型
植物のレベルに対し、1.1から50倍、好ましくは2倍から
30倍、より好ましくは5から20倍の程度となることを意
味する。更に好ましくは、植物体全体において新鮮重あ
たりの活性が、無処理の野性型植物のレベルに対し、1.
1から50倍、好ましくは2倍から30倍、より好ましくは5
から20倍の程度となることを意味する。ただし、野性株
における内在性のガラクチノール合成酵素活性は、植物
種や生育環境によっては検出できない場合がある。その
場合、植物内におけるガラクチノール合成活性を向上さ
せるとは、検出できる程度の活性を有することを意味す
る。
【００４５】植物内のガラクチノール合成活性を増加さ
せる方法としては、ガラクチノール合成酵素遺伝子を発
現可能なベクターに組み込みこれを植物に導入する方
法、ガラクチノール合成酵素遺伝子を植物の染色体上に
導入する方法、染色体上のガラクチノール合成酵素遺伝
子の発現を増強するような転写因子をコードする遺伝子
を植物体に導入する方法などがあげられる。
せる方法としては、ガラクチノール合成酵素遺伝子を発
現可能なベクターに組み込みこれを植物に導入する方
法、ガラクチノール合成酵素遺伝子を植物の染色体上に
導入する方法、染色体上のガラクチノール合成酵素遺伝
子の発現を増強するような転写因子をコードする遺伝子
を植物体に導入する方法などがあげられる。
【００４６】また、ガラクチノール合成酵素遺伝子の発
現が向上した変異株をスクリーニングしても良く、具体
的には、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の化
学変異剤を用いてラフィノース合成酵素遺伝子の転写活
性が上昇した植物をノーザン解析によりスクリーニング
しても良い。
現が向上した変異株をスクリーニングしても良く、具体
的には、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の化
学変異剤を用いてラフィノース合成酵素遺伝子の転写活
性が上昇した植物をノーザン解析によりスクリーニング
しても良い。
【００４７】また、ガラクチノール合成活性を増加させ
る方法としては、エチルメタンスルフォネート（ＥＭ
Ｓ）等の化学変異剤を用いて得た変異株より蛋白質を抽
出し、ウエスタン解析、あるいは、エライザ（ＥＬＩＳ
Ａ）などで、ガラクチノール合成酵素のタンパク質量の
多いものを選抜することでも可能である。本明細書で引
用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考
として本明細書に取り入れるものとする。
る方法としては、エチルメタンスルフォネート（ＥＭ
Ｓ）等の化学変異剤を用いて得た変異株より蛋白質を抽
出し、ウエスタン解析、あるいは、エライザ（ＥＬＩＳ
Ａ）などで、ガラクチノール合成酵素のタンパク質量の
多いものを選抜することでも可能である。本明細書で引
用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考
として本明細書に取り入れるものとする。
【００４８】
【実施例】以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定さ
れるものではない。実施例１ １．ガラクチノール合成酵素遺伝子の単離 イネのガラクチノール合成酵素遺伝子ホモログwsi76 (w
ater stress-induced)の塩基配列（Takahashi, R. et a
l. Plant Mol. Biol., 26:339-352）を元にしてブラス
トサーチ(Blast search National Center for Biotech
nology Infometion, NCBI社製)を用いて、シロイヌナズ
ナ染色体塩基配列におけるホモログを検索した。その結
果、相同性の高い領域を７つ見出すことができた。そし
て、これら7領域について、ノーザン解析を行い、スト
レスに対して応答して発現する３領域を見出した。これ
らストレス応答性の3領域を増幅するためのプライマー
を以下のように設計した。 プライマー1：5'-CAAGGATCCGCAGATCACGTGCTAATCAC-3'
（配列番号４） プライマー2：5'-CAAGGATCCCCTGGCAATCAAGCAGCGGA-3'
（配列番号５） プライマー3：5'-CGCCACAGTACAAGATCGGTTA-3'（配列番
号６） プライマー4：5'-CATGAAGAGGCGTATGCAGC-3'（配列番号
７） プライマー5：5'-CTTTCTCGGACAAGATGGCA-3'（配列番号
８） プライマー6：5'-GTGTTGACAAGAACCTCGCT-3'（配列番号
９）
明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定さ
れるものではない。実施例１ １．ガラクチノール合成酵素遺伝子の単離 イネのガラクチノール合成酵素遺伝子ホモログwsi76 (w
ater stress-induced)の塩基配列（Takahashi, R. et a
l. Plant Mol. Biol., 26:339-352）を元にしてブラス
トサーチ(Blast search National Center for Biotech
nology Infometion, NCBI社製)を用いて、シロイヌナズ
ナ染色体塩基配列におけるホモログを検索した。その結
果、相同性の高い領域を７つ見出すことができた。そし
て、これら7領域について、ノーザン解析を行い、スト
レスに対して応答して発現する３領域を見出した。これ
らストレス応答性の3領域を増幅するためのプライマー
を以下のように設計した。 プライマー1：5'-CAAGGATCCGCAGATCACGTGCTAATCAC-3'
（配列番号４） プライマー2：5'-CAAGGATCCCCTGGCAATCAAGCAGCGGA-3'
（配列番号５） プライマー3：5'-CGCCACAGTACAAGATCGGTTA-3'（配列番
号６） プライマー4：5'-CATGAAGAGGCGTATGCAGC-3'（配列番号
７） プライマー5：5'-CTTTCTCGGACAAGATGGCA-3'（配列番号
８） プライマー6：5'-GTGTTGACAAGAACCTCGCT-3'（配列番号
９）
【００４９】シロイヌナズナ染色体ＤＮＡを鋳型とし
て、プライマー１及び２を用いたPCRで増幅されるＤＮ
Ａは、シロイヌナズナにおけるガラクチノール合成酵素
遺伝子AtGolS1に含まれるＤＮＡ断片である。また、同
様にプライマー３及び４を用いたPCRで増幅されるＤＮ
Ａは、シロイヌナズナにおけるガラクチノール合成酵素
遺伝子AtGolS2に含まれるＤＮＡ断片である。プライマ
ー5及び6を用いたPCRで増幅されるＤＮＡは、シロイヌ
ナズナにおけるガラクチノール合成酵素遺伝子AtGolS3
に含まれるＤＮＡ断片である。
て、プライマー１及び２を用いたPCRで増幅されるＤＮ
Ａは、シロイヌナズナにおけるガラクチノール合成酵素
遺伝子AtGolS1に含まれるＤＮＡ断片である。また、同
様にプライマー３及び４を用いたPCRで増幅されるＤＮ
Ａは、シロイヌナズナにおけるガラクチノール合成酵素
遺伝子AtGolS2に含まれるＤＮＡ断片である。プライマ
ー5及び6を用いたPCRで増幅されるＤＮＡは、シロイヌ
ナズナにおけるガラクチノール合成酵素遺伝子AtGolS3
に含まれるＤＮＡ断片である。
【００５０】各PCRで増幅したＤＮＡ断片をpBluescript
II SK+ (Stratagene社製)のEcoRVサイトにそれぞれ別
個にクローニングした。各ＤＮＡ断片をクローニングし
たプラスミドをプローブとして、乾燥処理したシロイヌ
ナズナより調製された完全長cDNAライブラリー(Seki et
al. Plant J. 15:707-720, 1995)をスクリーニングし
た。ここで得られた完全長cDNAの塩基配列を決定した。
II SK+ (Stratagene社製)のEcoRVサイトにそれぞれ別
個にクローニングした。各ＤＮＡ断片をクローニングし
たプラスミドをプローブとして、乾燥処理したシロイヌ
ナズナより調製された完全長cDNAライブラリー(Seki et
al. Plant J. 15:707-720, 1995)をスクリーニングし
た。ここで得られた完全長cDNAの塩基配列を決定した。
【００５１】２．ガラクチノール合成酵素遺伝子の発現 先ず、MS培地（ムラシゲスクーグ(Murashige and Skoog
1962)培地、ミネラル塩、1 X B5 Vitamin(Ganborg et
al. 1968)、0.5％MES、3％sucrose、pH5.7、0.8%agar)
にシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana, columbia,
wt)の種子を播種し、2日間4℃で低温処理を行い3週間22
℃で生育させた。
1962)培地、ミネラル塩、1 X B5 Vitamin(Ganborg et
al. 1968)、0.5％MES、3％sucrose、pH5.7、0.8%agar)
にシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana, columbia,
wt)の種子を播種し、2日間4℃で低温処理を行い3週間22
℃で生育させた。
【００５２】生育したシロイヌナズナをMSプレートより
静かに引き抜き、根に付いた寒天をキムワイプで静かに
ふき取り、空のシャーレに入れ、急激な乾燥を避けるた
め30分間ほどシャーレの蓋を閉じたまま乾燥処理するこ
とによって、シロイヌナズナに対して乾燥ストレスを与
えた。また、250mM NaCl溶液（イオン交換水にNaClを添
加）をシャーレに植物体の根が浸る程度（約10ml、葉が
できる限り溶液に浸らないように）注ぎ、そこに乾燥処
理と同様にMSプレートより引き抜いたシロイヌナズナを
浸すことによって、シロイヌナズナに対して高塩濃度ス
トレスを与えた。さらに、250mM NaCl溶液に代えて10-4
mM ABA溶液をシャーレに注ぎ、MSプレートより引き抜い
たシロイヌナズナを浸すことによって、シロイヌナズナ
に対してABAストレスを与えた。さらに、シロイヌナズ
ナを生育させたMSプレートを4℃のインキュベーターに
置くことによって、シロイヌナズナに対して低温ストレ
スを与えた。
静かに引き抜き、根に付いた寒天をキムワイプで静かに
ふき取り、空のシャーレに入れ、急激な乾燥を避けるた
め30分間ほどシャーレの蓋を閉じたまま乾燥処理するこ
とによって、シロイヌナズナに対して乾燥ストレスを与
えた。また、250mM NaCl溶液（イオン交換水にNaClを添
加）をシャーレに植物体の根が浸る程度（約10ml、葉が
できる限り溶液に浸らないように）注ぎ、そこに乾燥処
理と同様にMSプレートより引き抜いたシロイヌナズナを
浸すことによって、シロイヌナズナに対して高塩濃度ス
トレスを与えた。さらに、250mM NaCl溶液に代えて10-4
mM ABA溶液をシャーレに注ぎ、MSプレートより引き抜い
たシロイヌナズナを浸すことによって、シロイヌナズナ
に対してABAストレスを与えた。さらに、シロイヌナズ
ナを生育させたMSプレートを4℃のインキュベーターに
置くことによって、シロイヌナズナに対して低温ストレ
スを与えた。
【００５３】次に、これら各種ストレスを与えたシロイ
ヌナズナを液化窒素中で破砕し、全RNAを抽出した (Nag
y F, Kay SA and Chua N-H (1988) Analysis of gene e
xpression In transgenic plants. In Gelvin and Schi
lperoort, eds, Plant Molecular Biology Manual, B4.
Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 1-29)。
得られたＲＮＡ溶液を1%のアガロースゲルを用いて１レ
ーン当たり5μgずつ電気泳動した。電気泳動後の1%のア
ガロースゲルからRNAをナイロンメンブレン（プラスチ
ャージ）に転写した。得られたナイロンメンブレンをノ
ーザンプロット解析に供した。
ヌナズナを液化窒素中で破砕し、全RNAを抽出した (Nag
y F, Kay SA and Chua N-H (1988) Analysis of gene e
xpression In transgenic plants. In Gelvin and Schi
lperoort, eds, Plant Molecular Biology Manual, B4.
Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 1-29)。
得られたＲＮＡ溶液を1%のアガロースゲルを用いて１レ
ーン当たり5μgずつ電気泳動した。電気泳動後の1%のア
ガロースゲルからRNAをナイロンメンブレン（プラスチ
ャージ）に転写した。得られたナイロンメンブレンをノ
ーザンプロット解析に供した。
【００５４】ノーザンプロット解析に使用したプローブ
としては、上記１で得られたプラスミドを鋳型として、
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Roche社) を用いてDI
GでラベルしたＲＮＡプローブを用いた。したがって、
このノーザンプロット解析により、各種ストレスを与え
たときのAtGolS1〜3の発現を確認することができる。
としては、上記１で得られたプラスミドを鋳型として、
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Roche社) を用いてDI
GでラベルしたＲＮＡプローブを用いた。したがって、
このノーザンプロット解析により、各種ストレスを与え
たときのAtGolS1〜3の発現を確認することができる。
【００５５】結果を図１及び図２に示す。図１は土植え
で生育したシロイヌナズナにおけるAtGolS1〜3の発現を
確認した電気泳動写真であり、図２はシャーレ上で生育
したシロイヌナズナにおけるAtGolS1〜3の発現を確認し
た電気泳動写真である。これら図１及び図２に示すよう
に、AtGolS1及びAtGolS2は、乾燥ストレス及び高塩濃度
ストレスを与えたときに発現誘導されることが判る。ま
た、AtGolS3は、低温ストレスを与えたときに発現誘導
されることが判る。なお、ABAストレスを与えた場合に
は、AtGolS1及びAtGolS2が発現誘導されている。
で生育したシロイヌナズナにおけるAtGolS1〜3の発現を
確認した電気泳動写真であり、図２はシャーレ上で生育
したシロイヌナズナにおけるAtGolS1〜3の発現を確認し
た電気泳動写真である。これら図１及び図２に示すよう
に、AtGolS1及びAtGolS2は、乾燥ストレス及び高塩濃度
ストレスを与えたときに発現誘導されることが判る。ま
た、AtGolS3は、低温ストレスを与えたときに発現誘導
されることが判る。なお、ABAストレスを与えた場合に
は、AtGolS1及びAtGolS2が発現誘導されている。
【００５６】３．AtGolS1〜3タンパク質の機能 AtGolS1〜3タンパク質におけるガラクチノール合成活性
を確認するため、先ず、AtGolS1〜3タンパク質を精製し
た。上記１で調製した完全長cDNAクローンにおけるコー
ディング領域を、下記のプライマーを用いてPCRにより
単離した。 プライマー7：5'-CGCGGATCCATGGCTCCGGGGCTTACTCAAAC-
3'(配列番号１０) プライマー8：5'-CGCGGATCCCCACCGACAATTTTAACTCCTGG-
3'(配列番号１１) プライマー9 ：5'-CGCGGATCCATGGCACCTGAGATCAATACC-3'
(配列番号１２) プライマー10：5'-CGCGGATCCGAGGCGTATGCAGCAACGAGC-3'
(配列番号１３) プライマー11:5'-CGCGGATCCATGGCACCTGAGATGAACAACAAGT
TG-3'(配列番号１４) プライマー12:5'-CGCGGATCCCTGGTGTTGACAAGAACCTCGCTC-
3'(配列番号１５) すなわち、プライマー7及び8を用いてAtGolS1タンパク
質のコーディング領域を増幅し、プライマー9及び10を
用いてAtGolS2タンパク質のコーディング領域を増幅
し、プライマー11及び12を用いてAtGolS3タンパク質の
コーディング領域を増幅した。
を確認するため、先ず、AtGolS1〜3タンパク質を精製し
た。上記１で調製した完全長cDNAクローンにおけるコー
ディング領域を、下記のプライマーを用いてPCRにより
単離した。 プライマー7：5'-CGCGGATCCATGGCTCCGGGGCTTACTCAAAC-
3'(配列番号１０) プライマー8：5'-CGCGGATCCCCACCGACAATTTTAACTCCTGG-
3'(配列番号１１) プライマー9 ：5'-CGCGGATCCATGGCACCTGAGATCAATACC-3'
(配列番号１２) プライマー10：5'-CGCGGATCCGAGGCGTATGCAGCAACGAGC-3'
(配列番号１３) プライマー11:5'-CGCGGATCCATGGCACCTGAGATGAACAACAAGT
TG-3'(配列番号１４) プライマー12:5'-CGCGGATCCCTGGTGTTGACAAGAACCTCGCTC-
3'(配列番号１５) すなわち、プライマー7及び8を用いてAtGolS1タンパク
質のコーディング領域を増幅し、プライマー9及び10を
用いてAtGolS2タンパク質のコーディング領域を増幅
し、プライマー11及び12を用いてAtGolS3タンパク質の
コーディング領域を増幅した。
【００５７】次に、得られたＤＮＡ断片をpBluescript
IISK+ (Stratagene) のEcoRVサイトにクローニングし
た。PCRによるDNA塩基配列に変異が導入されていないか
を確認した。変異の認められないDNA断片を、グルタチ
オン S-トランスフェラーゼ (GST） 遺伝子を含むpGEX4
T-1 (Amersham Pharmacia biotech) のBamHIサイトにフ
レームが合うようにクローニングし、キメラプラスミド
pGST-AtGolS1、pGST-AtGolS2及びpGST-AtGolS3を構築し
た。これらpGST-AtGolS1、pGST-AtGolS2又はpGST-AtGol
S3を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、LB培地中で37
℃で培養した。
IISK+ (Stratagene) のEcoRVサイトにクローニングし
た。PCRによるDNA塩基配列に変異が導入されていないか
を確認した。変異の認められないDNA断片を、グルタチ
オン S-トランスフェラーゼ (GST） 遺伝子を含むpGEX4
T-1 (Amersham Pharmacia biotech) のBamHIサイトにフ
レームが合うようにクローニングし、キメラプラスミド
pGST-AtGolS1、pGST-AtGolS2及びpGST-AtGolS3を構築し
た。これらpGST-AtGolS1、pGST-AtGolS2又はpGST-AtGol
S3を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、LB培地中で37
℃で培養した。
【００５８】培養液のOD600が約0.5になったところでイ
ソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)を加え、17℃
で12時間培養を続けた。大腸菌を回収し、洗浄後、抽出
バッファー[10 mM Tris-HCl (pH8.0), 5mM MgCl, 5% gl
ycerol, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMS
F),および 0.1 mM dithiothreitol (DTT)] に懸濁し
た。GST融合タンパク質は、glutathione-Sepharose 4B
[the GST gene fusion system (Amersham Pharmacia bi
otech)]を用いたクロマトグラフィにより精製し、その
後、トロンビンによるGST部分を切断した。得られたタ
ンパク質の濃度は protein assay kit (Bio-Rad,CA,US
A) を用いて決定した。
ソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)を加え、17℃
で12時間培養を続けた。大腸菌を回収し、洗浄後、抽出
バッファー[10 mM Tris-HCl (pH8.0), 5mM MgCl, 5% gl
ycerol, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMS
F),および 0.1 mM dithiothreitol (DTT)] に懸濁し
た。GST融合タンパク質は、glutathione-Sepharose 4B
[the GST gene fusion system (Amersham Pharmacia bi
otech)]を用いたクロマトグラフィにより精製し、その
後、トロンビンによるGST部分を切断した。得られたタ
ンパク質の濃度は protein assay kit (Bio-Rad,CA,US
A) を用いて決定した。
【００５９】GST-AtGolS1タンパク質、GST-AtGolS2タン
パク質及びGST-AtGolS3タンパク質におけるガラクチノ
ール合成活性をLiu, J.J. et al., Plant Physiol. 10
9: 505-511, 1995に記載されている方法に準じて測定し
た。具体的には、4mM MnCl2を含む反応緩衝液(50mM Hep
es-Na, 2mM DTT, pH7.0), に測定対象のタンパク質0.01
7mgを加え30℃、15分間インキュベートした後、4mM UDP
-ガラクトース、 20mMmyo-イノシトール及び0.16mg BSA
を加え、トータル1mlの系でさらに30℃、30分間インキ
ュベートしてガラクチノール合成反応を行った。反応後
2mlのcold 100%EtOHを加えてガラクチノール合成反応を
停止させた。
パク質及びGST-AtGolS3タンパク質におけるガラクチノ
ール合成活性をLiu, J.J. et al., Plant Physiol. 10
9: 505-511, 1995に記載されている方法に準じて測定し
た。具体的には、4mM MnCl2を含む反応緩衝液(50mM Hep
es-Na, 2mM DTT, pH7.0), に測定対象のタンパク質0.01
7mgを加え30℃、15分間インキュベートした後、4mM UDP
-ガラクトース、 20mMmyo-イノシトール及び0.16mg BSA
を加え、トータル1mlの系でさらに30℃、30分間インキ
ュベートしてガラクチノール合成反応を行った。反応後
2mlのcold 100%EtOHを加えてガラクチノール合成反応を
停止させた。
【００６０】GST-AtGolS1タンパク質、GST-AtGolS2タン
パク質及びGST-AtGolS3タンパク質におけるガラクチノ
ール合成活性を測定した結果を、それぞれ図３A〜Dに示
す。図３Aは測定対象のタンパク質を加えないで行った
対象実験である。これら図３B〜Dに示すように、GST-At
GolS1タンパク質、GST-AtGolS2タンパク質及びGST-AtGo
lS3タンパク質は、それぞれガラクチノール合成活性を
有することが判る。
パク質及びGST-AtGolS3タンパク質におけるガラクチノ
ール合成活性を測定した結果を、それぞれ図３A〜Dに示
す。図３Aは測定対象のタンパク質を加えないで行った
対象実験である。これら図３B〜Dに示すように、GST-At
GolS1タンパク質、GST-AtGolS2タンパク質及びGST-AtGo
lS3タンパク質は、それぞれガラクチノール合成活性を
有することが判る。
【００６１】４．トランスジェニック植物の作出 上記１〜３で明らかになったように、AtGolS1及びAtGol
S2は、それぞれガラクチノール合成活性を有し、乾燥ス
トレス及び高塩濃度ストレスによって発現誘導された。
そこで、これらAtGolS1及びAtGolS2を過剰発現するトラ
ンスジェニック植物を作出した。供試体としては、シロ
イヌナズナ(Arabidopsis thaliana (L.)Heynh. Ecotype
Columbia)を用いた。このシロイヌナズナは、培養土を
入れた直径9cmのプラスティック製ポットに播種し、22
℃、16時間日長の条件下で、6週間栽培した後、以下の
ように形質転換した。
S2は、それぞれガラクチノール合成活性を有し、乾燥ス
トレス及び高塩濃度ストレスによって発現誘導された。
そこで、これらAtGolS1及びAtGolS2を過剰発現するトラ
ンスジェニック植物を作出した。供試体としては、シロ
イヌナズナ(Arabidopsis thaliana (L.)Heynh. Ecotype
Columbia)を用いた。このシロイヌナズナは、培養土を
入れた直径9cmのプラスティック製ポットに播種し、22
℃、16時間日長の条件下で、6週間栽培した後、以下の
ように形質転換した。
【００６２】図４に示すように、カナマイシン耐性マー
カーとカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモータ
ーとを有するpBE2113ベクター (Mitsuhara, I. Et al.
PlantCell Physiol. 37 : 49-59 (1996))からGUSレポー
ター遺伝子を欠失したベクター(pBE2114NOT)を作製し、
さらにカナマイシン耐性遺伝子をハイグロマイシン耐性
遺伝子に置換したベクター (pBIG2113NOT) を作製し、
シロイヌナズナから単離したAtGols1〜3のいずれかのcD
NAをそのBamHIサイトに正方向（センス方向）に連結し
たものを作製した。また、AtGols1〜3のいずれかのcDNA
を、pBIG2113NOTのBamHIサイトに逆方向（アンチセンス
方向）に連結したものも作製した。
カーとカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモータ
ーとを有するpBE2113ベクター (Mitsuhara, I. Et al.
PlantCell Physiol. 37 : 49-59 (1996))からGUSレポー
ター遺伝子を欠失したベクター(pBE2114NOT)を作製し、
さらにカナマイシン耐性遺伝子をハイグロマイシン耐性
遺伝子に置換したベクター (pBIG2113NOT) を作製し、
シロイヌナズナから単離したAtGols1〜3のいずれかのcD
NAをそのBamHIサイトに正方向（センス方向）に連結し
たものを作製した。また、AtGols1〜3のいずれかのcDNA
を、pBIG2113NOTのBamHIサイトに逆方向（アンチセンス
方向）に連結したものも作製した。
【００６３】得られたベクターを三者混合法により土壌
細菌(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (pMP9
0))に導入した。目的の遺伝子を導入した土壌細菌をカ
ナマイシン(Km)耐性により選択し、減圧浸潤法(Bechtol
d,N. et al. C. R. Acad. Sci. Paris. LifeSci. 316,
1194-1199 (1993))をもちいて野生型シロイヌナズナに
感染させた。感染後の植物体から乾燥種子を採取し、ハ
イグロマイシンを添加した寒天プレートに播種して栽培
し形質転換第１世代個体 (T1) を選抜した。形質転換体
代１世代から得られた形質転換体第２世代個体 (T2) の
種子を採取した。そして、この種子を栽培し、得られた
植物体における導入遺伝子の発現量を確認し、導入遺伝
子が十分に発現しているものをトランスジェニック植物
として以後の実験に使用した。具体的には、第２世代個
体 (T2) の種子を10mg/mlのハイグロマイシンを添加し
たMSプレートに播種し、二日間の４℃処理後３週間２２
℃で生育させた。センス方向に導入したものは無処理の
ままに回収し、アンチセンス方向に導入したものは生育
したシロイヌナズナをMSプレートより静かに引き抜き、
根に付いた寒天をキムワイプで静かにふき取り、空のシ
ャーレに入れ、急激な乾燥を避けるため30分間ほどシャ
ーレの蓋を閉じたまま乾燥処理することによって、シロ
イヌナズナに対して乾燥ストレスを与え、８時間後に回
収した。上記で作製したDIGでラベルしたものをプロー
ブとして、ノーザンプロット解析により導入遺伝子の発
現量を確認した結果を図５に示す。図５に示すように、
AtGols1遺伝子を導入した場合、No.1及び3においてAtGo
ls1遺伝子が過剰発現しており、これらNo.1及び3をトラ
ンスジェニック植物とした。また、AtGols2遺伝子を導
入した場合、No.11及び29においてAtGols2遺伝子が過剰
発現しており、これらNo.11及び29をトランスジェニッ
ク植物とした。
細菌(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (pMP9
0))に導入した。目的の遺伝子を導入した土壌細菌をカ
ナマイシン(Km)耐性により選択し、減圧浸潤法(Bechtol
d,N. et al. C. R. Acad. Sci. Paris. LifeSci. 316,
1194-1199 (1993))をもちいて野生型シロイヌナズナに
感染させた。感染後の植物体から乾燥種子を採取し、ハ
イグロマイシンを添加した寒天プレートに播種して栽培
し形質転換第１世代個体 (T1) を選抜した。形質転換体
代１世代から得られた形質転換体第２世代個体 (T2) の
種子を採取した。そして、この種子を栽培し、得られた
植物体における導入遺伝子の発現量を確認し、導入遺伝
子が十分に発現しているものをトランスジェニック植物
として以後の実験に使用した。具体的には、第２世代個
体 (T2) の種子を10mg/mlのハイグロマイシンを添加し
たMSプレートに播種し、二日間の４℃処理後３週間２２
℃で生育させた。センス方向に導入したものは無処理の
ままに回収し、アンチセンス方向に導入したものは生育
したシロイヌナズナをMSプレートより静かに引き抜き、
根に付いた寒天をキムワイプで静かにふき取り、空のシ
ャーレに入れ、急激な乾燥を避けるため30分間ほどシャ
ーレの蓋を閉じたまま乾燥処理することによって、シロ
イヌナズナに対して乾燥ストレスを与え、８時間後に回
収した。上記で作製したDIGでラベルしたものをプロー
ブとして、ノーザンプロット解析により導入遺伝子の発
現量を確認した結果を図５に示す。図５に示すように、
AtGols1遺伝子を導入した場合、No.1及び3においてAtGo
ls1遺伝子が過剰発現しており、これらNo.1及び3をトラ
ンスジェニック植物とした。また、AtGols2遺伝子を導
入した場合、No.11及び29においてAtGols2遺伝子が過剰
発現しており、これらNo.11及び29をトランスジェニッ
ク植物とした。
【００６４】なお、AtGols1遺伝子及びAtGols2遺伝子を
アンチセンス方向に導入た場合のAtGols1遺伝子及びAtG
ols2遺伝子の発現量をそれぞれ確認した結果も図５に示
す。図５に示すように、AtGols1遺伝子をアンチセンス
方向に導入した場合、No.4及び8においてAtGols1遺伝子
が発現抑制されていた。また、AtGols2遺伝子をアンチ
センス方向に導入した場合、No.1及び5においてAtGols2
遺伝子が発現抑制されていた。
アンチセンス方向に導入た場合のAtGols1遺伝子及びAtG
ols2遺伝子の発現量をそれぞれ確認した結果も図５に示
す。図５に示すように、AtGols1遺伝子をアンチセンス
方向に導入した場合、No.4及び8においてAtGols1遺伝子
が発現抑制されていた。また、AtGols2遺伝子をアンチ
センス方向に導入した場合、No.1及び5においてAtGols2
遺伝子が発現抑制されていた。
【００６５】そして、AtGols2遺伝子を導入したNo.29の
種子、AtGols1遺伝子をアンチセンス方向に導入したNo.
4及び8、及びpBIG2113NOTのみを導入したベクターコン
トロールについて、上記に示す栄養塩類を含む寒天プレ
ート(Valvekens, D. et. Al.Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 85, 5536-5540 (1988))に播種し２週間栽培した。得
られた植物体を土（バーミキュウライト：バーライト＝
１：１）を入れた直径9cmのプラスティック製ポットに
４固体ずつそれぞれ移植し、22℃、16時間日長の条件下
で栽培した。播種３週間後（すなわち、移植の１週間
後）に植物体の入ったポットに対する水やりを止めるこ
とによって無潅水状態にし、植物体に乾燥ストレスを与
えた。無潅水処理開始16日後に写真撮影した。結果を図
６に示す。
種子、AtGols1遺伝子をアンチセンス方向に導入したNo.
4及び8、及びpBIG2113NOTのみを導入したベクターコン
トロールについて、上記に示す栄養塩類を含む寒天プレ
ート(Valvekens, D. et. Al.Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 85, 5536-5540 (1988))に播種し２週間栽培した。得
られた植物体を土（バーミキュウライト：バーライト＝
１：１）を入れた直径9cmのプラスティック製ポットに
４固体ずつそれぞれ移植し、22℃、16時間日長の条件下
で栽培した。播種３週間後（すなわち、移植の１週間
後）に植物体の入ったポットに対する水やりを止めるこ
とによって無潅水状態にし、植物体に乾燥ストレスを与
えた。無潅水処理開始16日後に写真撮影した。結果を図
６に示す。
【００６６】この図６に示すように、AtGols2遺伝子を
過剰発現するNo.29のトランスジェニック植物は、AtGol
s1遺伝子について発現抑制された植物体及びベクターコ
ントロールの植物体と比較して、優れた乾燥耐性を有す
ることが判った。さらにベクターコントロール及びNo.2
9について、無潅水処理開始1７日後に再吸水させ、５日
後に写真撮影した結果を図７に示す。図７から明らかな
ように、無潅水処理開始1７日後に再吸水してベクター
コントロールが枯死してしまうような条件であっても、
No.29は生育できることが判った。
過剰発現するNo.29のトランスジェニック植物は、AtGol
s1遺伝子について発現抑制された植物体及びベクターコ
ントロールの植物体と比較して、優れた乾燥耐性を有す
ることが判った。さらにベクターコントロール及びNo.2
9について、無潅水処理開始1７日後に再吸水させ、５日
後に写真撮影した結果を図７に示す。図７から明らかな
ように、無潅水処理開始1７日後に再吸水してベクター
コントロールが枯死してしまうような条件であっても、
No.29は生育できることが判った。
【００６７】一方、図６に示した植物体に含まれるガラ
クチノール量を測定した結果を図８に示す。図８から判
るように、No.29では、ベクターのみを有する植物体及
びAtGols1遺伝子が発現抑制された植物体と比較して、
ガラクチノール量が有意に増大していた。すなわち図８
に示すように、優れた乾燥耐性を有するNo.29は、ガラ
クチノール量が多量に蓄積されていた。以上の結果よ
り、植物体内にガラクチノールを多量に蓄積させること
によって、植物体に優れた乾燥耐性を付与することがで
きることが明らかとなった。
クチノール量を測定した結果を図８に示す。図８から判
るように、No.29では、ベクターのみを有する植物体及
びAtGols1遺伝子が発現抑制された植物体と比較して、
ガラクチノール量が有意に増大していた。すなわち図８
に示すように、優れた乾燥耐性を有するNo.29は、ガラ
クチノール量が多量に蓄積されていた。以上の結果よ
り、植物体内にガラクチノールを多量に蓄積させること
によって、植物体に優れた乾燥耐性を付与することがで
きることが明らかとなった。
【００６８】なお、図６に示した植物体について、プラ
スティック製ポットに充填された土壌の水分含有率を測
定した結果を図９に示す。図９に示すように、No.29で
は、ベクターのみを有する植物体及びAtGols1遺伝子が
発現抑制された植物体と比較して、土壌の水分含有率が
高い値を示した。この結果から、ガラクチノールを多量
に蓄積した植物体では、気孔の閉鎖制御等のメカニズム
により水分の蒸散が抑制され、優れた乾燥耐性が付与さ
れたものと強く示唆された。
スティック製ポットに充填された土壌の水分含有率を測
定した結果を図９に示す。図９に示すように、No.29で
は、ベクターのみを有する植物体及びAtGols1遺伝子が
発現抑制された植物体と比較して、土壌の水分含有率が
高い値を示した。この結果から、ガラクチノールを多量
に蓄積した植物体では、気孔の閉鎖制御等のメカニズム
により水分の蒸散が抑制され、優れた乾燥耐性が付与さ
れたものと強く示唆された。
【００６９】
【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
れば、植物体内にガラクチノールを多量に蓄積させるこ
とによって、当該植物体に対してストレス耐性を付与す
ることができる。したがって、本発明によれば、各種環
境ストレスに対して耐性を持つ植物体を作出することが
可能となる。
れば、植物体内にガラクチノールを多量に蓄積させるこ
とによって、当該植物体に対してストレス耐性を付与す
ることができる。したがって、本発明によれば、各種環
境ストレスに対して耐性を持つ植物体を作出することが
可能となる。
【００７０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN AJINOMOTO CO., INC. <120> A method for providing a property of stress-resistance <130> RJH12-099K <140> <141> <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 344 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Ala Pro Gly Leu Thr Gln Thr Ala Asp Ala Met Ser Thr Val Thr 1 5 10 15 Ile Thr Lys Pro Ser Leu Pro Ser Val Gln Asp Ser Asp Arg Ala Tyr 20 25 30 Val Thr Phe Leu Ala Gly Asn Gly Asp Tyr Val Lys Gly Val Val Gly 35 40 45 Leu Ala Lys Gly Leu Arg Lys Val Lys Ser Ala Tyr Pro Leu Val Val 50 55 60 Ala Met Leu Pro Asp Val Pro Glu Glu His Arg Arg Ile Leu Val Asp 65 70 75 80 Gln Gly Cys Ile Val Arg Glu Ile Glu Pro Val Tyr Pro Pro Glu Asn 85 90 95 Gln Thr Gln Phe Ala Met Ala Tyr Tyr Val Ile Asn Tyr Ser Lys Leu 100 105 110 Arg Ile Trp Lys Phe Val Glu Tyr Ser Lys Met Ile Tyr Leu Asp Gly 115 120 125 Asp Ile Gln Val Tyr Glu Asn Ile Asp His Leu Phe Asp Leu Pro Asp 130 135 140 Gly Tyr Leu Tyr Ala Val Met Asp Cys Phe Cys Glu Lys Thr Trp Ser 145 150 155 160 His Thr Pro Gln Tyr Lys Ile Arg Tyr Cys Gln Gln Cys Pro Asp Lys 165 170 175 Val Gln Trp Pro Lys Ala Glu Leu Gly Glu Pro Pro Ala Leu Tyr Phe 180 185 190 Asn Ala Gly Met Phe Leu Tyr Glu Pro Asn Leu Glu Thr Tyr Glu Asp 195 200 205 Leu Leu Arg Thr Leu Lys Ile Thr Pro Pro Thr Pro Phe Ala Glu Gln 210 215 220 Asp Phe Leu Asn Met Tyr Phe Lys Lys Ile Tyr Lys Pro Ile Pro Leu 225 230 235 240 Val Tyr Asn Leu Val Leu Ala Met Leu Trp Arg His Pro Glu Asn Val 245 250 255 Glu Leu Gly Lys Val Lys Val Val His Tyr Cys Ala Ala Gly Ser Lys 260 265 270 Pro Trp Arg Tyr Thr Gly Lys Glu Ala Asn Met Glu Arg Glu Asp Ile 275 280 285 Lys Met Leu Val Lys Lys Trp Trp Asp Ile Tyr Asp Asp Glu Ser Leu 290 295 300 Asp Tyr Lys Lys Pro Val Thr Val Val Asp Thr Glu Val Asp Leu Val 305 310 315 320 Asn Leu Lys Pro Phe Ile Thr Ala Leu Thr Glu Ala Gly Arg Leu Asn 325 330 335 Tyr Val Thr Ala Pro Ser Ala Ala 340 <210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Ala Pro Glu Ile Asn Thr Lys Leu Thr Val Pro Val His Ser Ala 1 5 10 15 Thr Gly Gly Glu Lys Arg Ala Tyr Val Thr Phe Leu Ala Gly Thr Gly 20 25 30 Asp Tyr Val Lys Gly Val Val Gly Leu Ala Lys Gly Leu Arg Lys Ala 35 40 45 Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Ala Val Leu Pro Asp Val Pro Glu 50 55 60 Asp His Arg Lys Gln Leu Val Asp Gln Gly Cys Val Val Lys Glu Ile 65 70 75 80 Glu Pro Val Tyr Pro Pro Glu Asn Gln Thr Glu Phe Ala Met Ala Tyr 85 90 95 Tyr Val Ile Asn Tyr Ser Lys Leu Arg Ile Trp Glu Phe Val Glu Tyr 100 105 110 Asn Lys Met Ile Tyr Leu Asp Gly Asp Ile Gln Val Phe Asp Asn Ile 115 120 125 Asp His Leu Phe Asp Leu Pro Asn Gly Gln Phe Tyr Ala Val Met Asp 130 135 140 Cys Phe Cys Glu Lys Thr Trp Ser His Ser Pro Gln Tyr Lys Ile Gly 145 150 155 160 Tyr Cys Gln Gln Cys Pro Asp Lys Val Thr Trp Pro Glu Ala Lys Leu 165 170 175 Gly Pro Lys Pro Pro Leu Tyr Phe Asn Ala Gly Met Phe Val Tyr Glu 180 185 190 Pro Asn Leu Ser Thr Tyr His Asn Leu Leu Glu Thr Val Lys Ile Val 195 200 205 Pro Pro Thr Leu Phe Ala Glu Gln Asp Phe Leu Asn Met Tyr Phe Lys 210 215 220 Asp Ile Tyr Lys Pro Ile Pro Pro Val Tyr Asn Leu Val Leu Ala Met 225 230 235 240 Leu Trp Arg His Pro Glu Asn Ile Glu Leu Asp Gln Val Lys Val Val 245 250 255 His Tyr Cys Ala Ala Gly Ala Lys Pro Trp Arg Phe Thr Gly Glu Glu 260 265 270 Glu Asn Met Asp Arg Glu Asp Ile Lys Met Leu Val Lys Lys Trp Trp 275 280 285 Asp Ile Tyr Asn Asp Glu Ser Leu Asp Tyr Lys Asn Val Val Ile Gly 290 295 300 Asp Ser His Lys Lys Gln Gln Thr Leu Gln Gln Phe Ile Glu Ala Leu 305 310 315 320 Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Tyr Val Lys Ala Pro Ser Ala Ala 325 330 335 <210> 3 <211> 1064 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 atggctccgg ggcttactca aaccgctgat gctatgtcca ccgtgacgat aacaaaaccg 60 tcactgccat cagtccaaga cagcgatcga gcttacgtga cgtttcttgc tggaaacggt 120 gattacgtga aaggagtcgt tggtttagcc aaagggttaa ggaaagtcaa atcggcttat 180 ccactcgtag tagcgatgtt acccgacgtc ccggaggaac accgtcgtat acttgtggat 240 caaggatgca tcgtccgtga aatcgaaccc gtttacccac ccgagaacca aactcagttc 300 gccatggctt attacgtcat caactactct aaactccgta tctggaagtt tgtggagtat 360 agtaaaatga tatatttaga tggagacatt caagtttacg aaaacatcga tcacttgttt 420 gacctaccag atggctattt gtacgcggtg atggattgtt tctgtgagaa aacatggagt 480 cacacgccgc aatacaagat cagatattgc caacaatgcc ccgacaaagt ccagtggcca 540 aaagcggagc ttggagagcc accggctctt tacttcaacg ccggaatgtt cttgtacgag 600 cctaacctcg agacttacga ggatctacta cgaacactta aaatcactcc tccgactcct 660 ttcgctgaac aggatttttt gaacatgtac tttaagaaaa tctacaagcc gattccttta 720 gtgtacaatc tcgtccttgc gatgttatgg cgtcacccag aaaatgtaga gcttggaaaa 780 gtcaaggtgg ttcactactg tgcagcgggt tcgaagccgt ggagatacac agggaaagaa 840 gcgaacatgg agagggaaga tataaaaatg ttagtgaaaa aatggtggga catttacgac 900 gacgaatcct tggattacaa gaaacctgtt accgttgtgg acacagaggt cgatctcgtg 960 aatctgaagc cgttcatcac cgctcttact gaagctggcc ggctcaacta cgtgaccgca 1020 ccgtccgctg cttgaatgtt gccaggagtt aaaattgtcg gtgg 1064 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 caaggatccg cagatcacgt gctaatcac 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 caaggatccc ctggcaatca agcagcgga 29 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 cgccacagta caagatcggt ta 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 catgaagagg cgtatgcagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 ctttctcgga caagatggca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 gtgttgacaa gaacctcgct 20 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 10 cgcggatcca tggctccggg gcttactcaa ac 32 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 11 cgcggatccc caccgacaat tttaactcct gg 32 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 12 cgcggatcca tggcacctga gatcaatacc 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 13 cgcggatccg aggcgtatgc agcaacgagc 30 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 14 cgcggatcca tggcacctga gatgaacaac aagttg 36 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 15 cgcggatccc tggtgttgac aagaacctcg ctc 33
【００７１】
【配列表フリーテキスト】配列番号４〜１５は合成プラ
イマーである。
イマーである。
【図１】土植えで生育したシロイヌナズナにおけるAtGo
lS1〜3の発現を、各種ストレスを与えた状態で確認した
電気泳動写真である。
lS1〜3の発現を、各種ストレスを与えた状態で確認した
電気泳動写真である。
【図２】シャーレ上で生育したシロイヌナズナにおける
AtGolS1〜3の発現を、各種ストレスを与えた状態で確認
した電気泳動写真である。
AtGolS1〜3の発現を、各種ストレスを与えた状態で確認
した電気泳動写真である。
【図３】GST-AtGolS1タンパク質、GST-AtGolS2タンパク
質及びGST-AtGolS3タンパク質におけるガラクチノール
合成活性を測定した結果示す特性図であり、AはGST単独
の場合であり、BはGST-AtGolS1タンパク質の場合であ
り、CはGST-AtGolS2タンパク質の場合であり、DはGST-A
tGolS3タンパク質の場合である。
質及びGST-AtGolS3タンパク質におけるガラクチノール
合成活性を測定した結果示す特性図であり、AはGST単独
の場合であり、BはGST-AtGolS1タンパク質の場合であ
り、CはGST-AtGolS2タンパク質の場合であり、DはGST-A
tGolS3タンパク質の場合である。
【図４】トランスジェニック植物を作出する際に使用し
たベクターの構成を示す模式図である。
たベクターの構成を示す模式図である。
【図５】トランスジェニック植物における導入遺伝子の
発現量を、ノーザンプロット解析により確認した結果を
示す電気泳動写真である。
発現量を、ノーザンプロット解析により確認した結果を
示す電気泳動写真である。
【図６】トランスジェニック植物に乾燥ストレスを与え
たときの生育状態を示す写真である。
たときの生育状態を示す写真である。
【図７】乾燥ストレスを与えた後に再吸水させたときの
生育状態を示す写真である。
生育状態を示す写真である。
【図８】トランスジェニック植物に含まれるガラクチノ
ール量を比較した特性図である。
ール量を比較した特性図である。
【図９】トランスジェニック植物を生育した土壌の水分
含有率を比較した特性図である。
含有率を比較した特性図である。
【図１０】RFO合成経路を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 篠崎 一雄 茨城県つくば市高野台３丁目１番地１ 理 化学研究所 筑波研究所内 (72)発明者 大住 千栄子 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD21 4B024 AA08 BA10 BA80 CA04 DA01 EA04 GA11 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC08 AC20 BA02 CA21 CA53
Claims (9)
- 【請求項１】 ガラクチノール合成酵素遺伝子を植物体
内に導入することを特徴とする植物に対するストレス耐
性付与方法。 - 【請求項２】 上記ガラクチノール合成酵素遺伝子は、
以下の(a)又は(b)の遺伝子であることを特徴とする請求
項１記載の植物に対するストレス耐性付与方法。 (a)配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコー
ドする遺伝子。 (b)配列番号１のアミノ酸配列における少なくとも１又
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有するタン
パク質をコードする遺伝子。 - 【請求項３】 上記ガラクチノール合成酵素遺伝子は、
以下の(c)又は(d)の遺伝子であることを特徴とする請求
項１記載の植物に対するストレス耐性付与方法。 (c)配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコー
ドする遺伝子。 (d)配列番号２のアミノ酸配列における少なくとも１又
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有するタン
パク質をコードする遺伝子。 - 【請求項４】 植物体内におけるガラクチノール量を増
大させることを特徴とする請求項１記載の植物に対する
ストレス耐性付与方法。 - 【請求項５】 植物体内におけるガラクチノール合成活
性を向上させることを特徴とする請求項１記載の植物に
対するストレス耐性付与方法。 - 【請求項６】 植物体内におけるガラクチノール量を増
大させることを特徴とする植物に対するストレス耐性付
与方法。 - 【請求項７】 植物体内におけるガラクチノール合成活
性を向上させることを特徴とする植物に対するストレス
耐性付与方法。 - 【請求項８】 以下の(e)又は(f)のタンパク質を、植物
内に過剰発現させることを特徴とする植物に対するスト
レス耐性付与方法。 (e)配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質。 (f)配列番号１のアミノ酸配列における少なくとも１又
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有するタン
パク質。 - 【請求項９】 以下の(g)又は(h)のタンパク質を、植物
内に過剰発現させることを特徴とする植物に対するスト
レス耐性付与方法。 (g)配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質。 (h)配列番号２のアミノ酸配列における少なくとも１又
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ガラクチノール合成活性を有するタン
パク質。
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