KR100695178B1 - 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 내병성을 부여하는방법 - Google Patents

갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 내병성을 부여하는방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 내병성, 내건성 또는 내염성을 부여하는 방법 및 상기 방법에 의하여 제조된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 내병성, 내건성 또는 내염성을 갖는 식물체는 병원성 곰팡이나 병원성 세균이 감염된 조건에서 우수한 생존율을 보일 뿐만 아니라 건조하거나 염농도가 높은 조건에서도 우수한 생존율을 보인다.
갈락티놀 합성효소, 오이, 내병성, 내건성, 내염성, 형질전환, 식물

Description

갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 내병성, 내건성 또는 내염성을 부여하는 방법 {Method for Generating Disease, Drought or Salt Tolerance in Plants by Using Nucleotide Sequence Encoding a Galactinol Synthase}
도 1은 오이 (Cucumis sativus)의 서로 다른 기관에서 곰팡이인 오이갈색무늬병균을 접종하기 전과 접종한 후에 갈락티놀 합성효소의 발현을 비교하여 살펴 본 그래프이다. 파종 후 4주 째 키운 오이의 뿌리, 줄기 및 잎에서 분리한 총 RNA (200 ng)를 실시간 RT-PCR 처리하여 발현된 갈락티놀 합성효소의 전사수준을 1 ng 총 RNA당 분자 복제수 (copy number)로 나타내었다. 3회의 독립적인 실험으로부터 평균값 및 표준 오차(오차막대)를 얻었다.
도 2는 갈락티놀 합성효소의 발현에 의한 병원균의 방제효과를 나타낸다. 도 2A의 그래프는 갈락티놀 합성효소를 과다 발현하는 형질전환 된 담배에 세균성 병원균, Erwinia carotovora SCC1을 처리하여, 갈락티놀 합성효소가 과다 발현되지 않는 대조구에 대한 상대적인 병 방제효과를 나타낸 것이다. 도 2B의 그래프는 갈락티놀 합성효소를 과다 발현하는 형질전환 된 담배에 곰팡이병원균, Botrytis cinerea 4709를 처리하여, 갈락티놀 합성 효소가 과다 발현되지 않는 대조구에 대 한 상대적인 병 방제효과를 나타낸 것이다. 병원균 처리에 대한 3회의 독립적인 실험으로부터 평균값 및 표준오차(오차막대)를 얻었다. WT:야생형담배; 벡터: 발현벡터만 형질전환된 담배; 0-1, O-2, O-3 및 0-4: 갈락티놀 합성효소 유전자가 발현되는 4가지 서로 다른 형질전환 담배.
도 3은 갈락티놀 합성효소가 과다 발현되는 형질전환 담배의 가뭄에 대한 내성을 대조구와 비교하여 나타낸 그래프이다. 가뭄 처리에 대한 3회의 독립적인 실험으로부터 평균값 및 표준오차(오차막대)를 얻었다. WT:야생형담배; 벡터: 발현벡터만 형질전환된 담배; 0-1, O-2, O-3 및 0-4: 갈락티놀 합성효소 유전자가 발현되는 4가지 서로 다른 형질전환 담배.
도 4는 갈락티놀 합성효소가 과다 발현되는 형질전환 담배의 고염에 대한 내성을 대조구와 비교하여 나타낸 그래프이다. MS/km 배지에서 선별한 형질전환체를 250mM의 NaCl이 첨가된 고염 MS배지에 옮겨 배양하고, 배양 후 7일 째에 생육양상(생존비율)을 평가하였다. 고염 처리에 대한 3회의 독립적인 실험으로부터 평균값 및 표준오차(오차막대)를 얻었다. WT:야생형담배; 벡터: 발현벡터만 형질전환된 담배; 0-1, O-2, O-3 및 0-4: 갈락티놀 합성효소 유전자가 발현되는 4가지 서로 다른 형질전환 담배.
도 5은 갈락티놀 합성효소 유전자를 벡터에 삽입하여 제작한 발현벡터의 유전자 지도의 일예로서 사용된 벡터는 pBI121 이다.
본 발명은 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 내병성, 내건성 또는 내염성을 부여하는 방법 및 그 형질전환체에 관한 것이다.
라피노스 (raffinose), 스타키요스 (stachyose), 버바스코스 (vervascose) 등과 같은 라피노스계 올리고당류 (raffinose family oligosaccharides; RFOs)는 주로 여러 가지 식물 종의 종자에 풍부히 존재하지만, 식물이 스트레스를 받게 되면 종자 이외에 식물의 다른 조직에서도 이들 물질이 집적된다. 이들 RFOs 생합성회로에 열쇠 역할을 하는 갈락티놀 합성효소 (galactinol synthase: GolS)는 유디피 갈락토스 (UDP-Gal)와 묘이노시톨 (myoinositol)로부터 갈락티놀을 합성하며 이 갈락티놀은 RFOs의 형성에 필요한 갈락토실 제공자 (galactosyl donor) 역할을 수행한다. 이 GolS의 활성과 mRNA로의 전사수준이 저온이나 가뭄에 의해 증가됨이 강낭콩과 토마토에서 입증되었다 (Liu et al., 1998; Downie et al., 2003).
Taji 등 (2002)에 의하면, 애기장대 (Arabidopsis)에는 7가지의 GolS 유전자계 (gene family)가 존재한다. 그 중에 GolS1과 GolS2는 성숙한 종자에서 검출되지만 가뭄과 고염 스트레스를 받게 되면 잎 조직에서도 발현이 증가하며, GolS3은 저온스트레스에 의해서 발현이 증가되었다. 상기의 GolS2유전자가 항상적으로 증폭 발현되는 형질전환 식물의 잎에서는 갈락티놀과 라피노스의 함량이 높았으며 이 식물은 가뭄에 대한 내성을 나타내었다 (Taji et al., 2002). 반면, 상기 GolS1 유전자는 고온에 의해 모든 영양조직에서 발현이 증가하며, 고온전사조절인자인 히트샥인자3 (heat shock factor3, HSF3)의 표적 유전자 (target gene)임이 밝혀졌다.
따라서, 식물의 GloS 유전자는 저온, 고온 및 가뭄과 같은 스트레스에 대응하여 이를 극복하는 데에 어떤 역할을 수행할 것으로 여겨지지만 GolS2를 제외하고는 이 유전자의 정확한 기능이 아직 알려지지 않았다.
특히, 갈락티놀 합성효소 유전자의 내병성에 관련된 기능은 아직 문헌상에서 언급된 적도 없다.
본 명세서 전체에 걸쳐 몇 가지 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 담배 (Nicotiana tabacum)의 다양한 스트레스반응에서 갈락티놀 합성효소의 역할을 규명하고자 예의 연구 노력한 결과, 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 식물체가 내병성, 내건성 또는 내염성을 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 식 물에 내병성, 내건성 또는 내염성을 부여하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합벡터를 이용하여 형질전환된 내병성, 내건성 또는 내염성을 갖는 식물 형질전환체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물에 존재하는 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 상향 조절하는 단계를 포함하는 식물에 내병성, 내건성 또는 내염성을 부여하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 식물에 내병성, 내건성 또는 내염성을 부여하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 식물 유래, 바람직하게는 오이에서 유래된 서열이며, 보다 바람직하게는 서열목록 제 2 서열의 아미산 서열로 이루어지는 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고, 가장 바람직하게는 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명에 있어서 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터는 원핵 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pL λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli (예, HB101, BL21, DH5α등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pL λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 숙주세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터 (Appl. Environ. Microbiol. 64:3932-3938(1998); Mol. Gen. Genet. 250:734-741(1996)) 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절부위로 이용될 수 있다. 한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pGEM-T Easy, pBI121 pTRG, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λ△z1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작 될 수 있다.
본 발명에서 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 (또는 식물세포)을 숙주로 하여 구축된다.
본 발명에서 이용되는 벡터는 기본적으로 (a) 식물세포내에서 작용하는 복제원점; (b) 식물세포내에서 전사를 촉진할 수 있는 프로모터; (c) 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (d) 식물세포내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열을 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열"에서 용어 "기능적으로 연결된"은 유전자의 발현이 프로모터에 의해 조절되는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "폴리아데닐 시그널 서열"은 진핵세포에서 생성되는 mRNA의 3'의 폴리아데닐레이션을 조절하는 서열이다.
본 발명의 벡터에서 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, Adeno 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터에서 이용될 수 있는 프로모터는 예컨대, 1' 프로모터, 2' 프로모터 또는 노팔린 합성효소 (nos), 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터), 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바 이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터) 또는 식물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 콜리플라우어 모자이크 바이러스 35S 프로모터)가 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바람직하게는 콜리플라우어 모자이크 바이러스 35S 프로모터이다.
본 발명에서 상기 외래 단백질을 인코딩 하는 구조 유전자 서열은 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 벡터에서 바람직한 폴리아데닐 시그널 서열은 아크로박테리움의 플라즈미드 종양-유발 (Ti) 유전자들 예컨대, 노팔린 신타아제 (nos) 유전자, 식물 유전자들 예컨대, 7s 콩 저장 단백질 유전자 및 RuBP 카복실라제 유전자의 완두콩 E9 스몰 서브유닛의 폴리아데닐 시그널, SV40 polA 서열 및 BGH polA 서열 등이 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 진핵 세포용 발현 벡터는 당업계에 공지된 다양한 벡터로부터 선택할 수 있다. 예를 들어, pBI121, pSG5, pEGFP, YIp5, YCp19, 아데노바이러스-유래 벡터, 폴리오바이러스-유래 벡터 및 소 파필로마 바이러스-유래 벡터가 있다.
본 발명에 이용되는 발현 벡터는 T7-Tag, S-Tag, His-Tag, HSV-Tag, pelB/ompT, KSI, Trx-Tag, GST-Tag, Nus-Tag, Dsb-Tag 및 CBD-Tag 등 다양한 태그를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 이용되는 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 엠피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 한편, 상기 벡터는 추가적으로 리포터 물질 (루시퍼라아제, β-글루쿠로니다아제 등)을 인코딩 하는 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바람직한 벡터는 pBI121 벡터이며, 도 5는 pBI121 벡터의 바람직한 구현 예이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터로 식물을 형질전환하는 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.
상기 형질전환된 숙주를 선별하는 단계는 상술한 선택표지에 의해 발현되는 표현형 (phenotype)을 이용하여, 용이하게 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 선택표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 식물의 형질전환은 아그로박테리움을 매개로 하는 방법을 사용하며, 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스로 실시한다 (Depicker et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York, 1983). 아그로박테리움을 매개로하는 방법을 사용하는 경우에는 바람직하게는 바이너리 (binary) 벡터 시스템을 이용한다 (An et al., Binary vectors. In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York, 1986). 상기한 바이너리 벡터는 예컨대, pBin19, pRD400, pRD320 등이 있다.
본 발명의 벡터를 내재하고 있는 아그로박테리움에 의한 식물 세포의 감염은 당 업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 진공 인필트레이션 방법 등이 있다.
본 발명의 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 형질전환된 식물은 탁월한 내병성, 내건성 또는 내염성을 갖는다.
본 명세서에서 용어 "내병성"은 식물이 세균, 사상균 (곰팡이), 바이러스 또는 선충 등에 침범되었으나 병의 증세가 가볍거나 또는 거의 영향이 없는 성질을 말한다.
따라서, 본 발명에서 식물의 내병성은 세균, 사상균 (곰팡이), 바이러스 또는 선충에 대한 식물의 내병성이며, 바람직하게는 세균 또는 사상균 (곰팡이)에 대한 식물의 내병성이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 세균은 Erwinia carotovora SCC1이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 사상균은 Botrytis cinerea 4709이다.
본 명세서에서 용어 "내건성"은 식물이 정상적으로 성장하기에 필요한 수분이 공급되는 않는 환경에 대하여 식물이 이를 견디어 낼 수 있는 성질을 말한다.
본 명세서에서 용어 "내염성"은 식물이 정상적으로 성장하는데 영향을 줄 수 있는 염도의 환경에 대하여 이를 견디어 낼 수 있는 성질을 말한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물 내병성 부여용 조성물을 제공한다.
본 발명의 식물 내병성 부여용 조성물은 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터을 유효성분으로 포함하므로 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 내병성, 내건성 또는 내염성을 갖는 식물의 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 형질전환체는 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되기 때문에, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 식물은 식용작물 (벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 귀리, 수수 및 고구마), 채소작물 (애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근), 특용작물 (차, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채), 과수 (사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나), 화훼 (잔디, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립 및 정원수) 및 목초, 사료작물 (라이그라스, 레드클로버, 오차드 그리스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스) 등이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 식물에 존재하는 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 상향조절하는 단계를 포함하는 식물에 내병성, 내건성 또는 내염성을 부여하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 본 발명의 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하는 것이므로, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따르면, 식물에 존재하는 갈락티놀 합성효소는 그 발현 정도에 의하여 식물의 내병성, 내건성 또는 내염성에 영향을 미친다.
따라서, 진핵 세포에서의 유전자 발현 메커니즘을 참조하여, 유전공학적 방법으로 식물에 존재하는 갈락티놀 합성효소의 유전자의 발현을 조절하는 조절부위 (예: 프로모터, 인핸서 또는 서프레서)서열을 조작하거나 또는, 발현 관련 전사인 자들의 활성조작 등을 통하여 단백질 발현의 상향조절을 함으로써 식물의 내병성, 내건성 또는 내염성을 개선할 수 있다. 진핵 세포에서의 유전자 발현 메커니즘에 대하여는 Benjamin Lewin (2000), genes VII, Oxford university press; Buchanan, Gruissem, Jones (2000), Biochemistry 및 Molecular Biology of Plants, American Society of Plant Biologists 등을 참조할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
I: 식물 재료 및 스트레스 처리
본 발명에서 사용된 식물은 담배 Nicotiana tabacum cv. Xanthi 야생형 및 형질전환체였다. 기내에서는 담배를 MS/km 배지 (Murashige 및 Skoog 1962)에 파종하여 23℃에서 배양하였다.
담배종자를 바이오상토에 파종하였다. 습적 (stratification)을 위하여 암조건에서 3일 동안 4℃에서 배양한 후 정상적인 성장조건에서 배양하였다. 식물체는 28℃의 100μEm-2s-1, 장일 조건 (16 시간 명조건/8시간 암조건 주기)에서 배양 하였고, 주 1회 물을 주었다.
갈릭티놀 합성효소가 과다 발현되는 형질전환 담배의 내병성 여부를 확인하기 위하여 식물체에 잿빛곰팡이병을 일으키는 Botrytis cinerea 4709를 25℃의 PDA (potato dextrose agar) 배지에서 배양하였다. 포자를 획득하기 위하여 다시 1/2 PDA로 계대 배양하여 창문가에 하루정도 두었다. 회수된 포자는 PDB (potato dextrose broth)로 현탁하여 현미경으로 포자수를 확인하였다. 2.5×105 농도의 포자현탁액을 형질전환된 담배에 분부하여 접종하였고 3일 후 내병성 정도를 체크하였다.
갈락티놀 합성효소가 과다 별현되는 형질전환 담배의 내병성 여부를 확인하기 위하여 식물체에 무름병을 일으키는 Erwinia carotovora SCC1 을 LB 배지에서 28℃, 24시간 배양하였다. SCC1 균주를 멸균수에 약 1x108 cfu/㎖이 되게 현탁하여 각 담배 잎에 5 ㎕씩 접종하고 2일 후에 식물의 무름 증상 유무를 관찰하여 내병성 능력을 체크하였다.
갈락티놀 합성효소가 과다 발현되는 형질전환 담배의 가뭄에 대한 내성을 알아보기 위하여 MS 배지에서 담배를 키운 후 4주째에 각각의 담배를 플레이트에서 꺼내어 실온에 노출시킨 다음, 3시간 후에 각 식물체의 시들음 정도를 보고 가뭄에 대한 내성을 체크하였다 (Taji et al., 2002).
갈락티놀 합성효소가 과다 발현되는 형질전환 담배의 고염에 대한 내성을 알아보기 위하여 NaCl이 250 mM의 농도로 첨가된 MS배지를 만들었다. 형질전환 된 담배를 고염의 MS배지에 옮긴 다음, 일주일 후에 백화 되지 않고 정상적으로 발아해서 자라나는 식물체를 체크하여 생존비율을 알아보았다 (Zhu et al., 1998).
병원균, 가뭄, 염 처리 후, 샘플을 표시한 시간 주기에서 수집하고, 즉시 액체 질소에서 동결하였으며, RNA 추출 및 차후 분석에 사용하였다. 모든 실험은 최소한 3회 반복하였다.
Ⅱ: RNA 추출 및 역전사 PCR
총 RNA를 동결된 샘플로부터 추출하였으며, Plant Rneasy추출 키트(Qiagen, USA)를 사용하였다. RNA의 농도를 분광광도계로 정확히 정량하고, 5㎍의 총 RNA를 1.2% 포름알데하이드 아가로스 겔에서 분리하여 농도를 측정하고 RNA의 온전성 (integrity)을 조사하였다. 0.5 내지 1 ㎍의 총 RNA를 RT-PCR 시스템에서 유전자 특이 프라이머들과 함께 사용하였다. RNA 전사물 (transcript)을 20 내지 25 PCR주기로 증폭하였다.
Ⅲ: 정량적 실시간 (real-time) RT-PCR
다양한 스트레스-처리 샘플에서 갈락티놀 합성효소의 전사 수준을 Rotor- Gene 2000 실시간 열적 사이클링 시스템 (Corbett Research)에서 결정하였으며, QuantiTect SYBR Green RT-PCR 키트 (Qiagen)를 사용하였다. 실시간 RT-PCR을 위한 PCR 프라이머 세트를 GeneRunner 프로그램을 사용하여 디자인하였으며, PCR 산물은 길이가 약 120-bp되고 어떠한 프라이머도 어떠한 다른 유전자와 70%이상의 상동성을 갖지 않도록 하였다.
총 RNA 샘플에 존재하는 갈락티놀 합성효소 유전자의 복제수를 측정하기 위하여, 참조 매트릭스로서 갈락티놀 합성효소를 포함하는 5배 희석 범위의 pGEM-T Easy 플라스미드(Promega)를 RNA 샘플과 동일한 조건에서 검사하였다. 상기 희석 범위에서 존재하는 유전자의 수를 DNA의 크기 및 질량에 기초하여 결정하고 이를 기준으로 하여 총 RNA 샘플에 존재하는 갈락티놀 합성효소 유전자의 복제수를 계산하였다.
Ⅳ: 벡터 제작 및 담배 형질전환
과발현 컨스트럭트를 제작하기 위하여, 갈락티놀 합성효소 cDNA의 코딩 부위를 PCR (polymerase chain reaction)로 제조하였으며, pGEM-T Easy 벡터로 리게이션하였다. 벡터를 XbaI-KpnI 이중 가수분해로 가수분해하고, 동일한 제한효소에 의하여 가수분해되어 선형화된 pBI121 벡터로 상기에서 얻어진 DNA를 서브클론하였다.
모든 DNA 조작은 표준적인 방법 (Sambrook et al., 1989)에 따랐으며, 갈락티놀 합성효소 코딩 부위, 프로모터 부위 및 접합 (junction) 서열을 DNA 서열분석 으로 확인하였다. 담배의 형질전환은 아그로박테리움 튜머페이션스 LBA4404을 사용하였다. 종자를 수확하고 카나마이신 선택 배지 (50㎍/㎖-1)에 접종하여 형질전환된 식물체를 동정하였다. 3:1 분리 비율 (segregation ratio)로 형질전환된 라인을 추가적으로 선택한 후, T2 동질접합체 (homozygous) 라인을 표현형 조사에 사용하였다.
V: 스트레스 조건 하에서 생존비율 분석
동일한 환경 조건에서 배양한 개개의 식물체로부터 동일자에 수확한 종자를 생존비율 분석에 사용하였다. 생존비율 분석은 20-30개의 종자를 3벌씩 사용하여 실시하였다. 종자를 3% 수크로오스를 포함하는 MS 배지에 뿌리고 상기 플레이트를 암조건에서 3일 동안 4℃에서 배양한 후 정상 성장 조건에서 배양하였다.
생존비율에 대한 병원균의 효과를 측정하기 위하여, 상기 MS 플레이트내의 식물체에 병원균을 처리하고 배양기에서 배양하였다.
식물체의 생존비율에 대한 가뭄의 효과를 시험하기 위하여, MS 배지에서 담배를 키운 후 4주 째에 각각의 담배를 플레이트에서 꺼내어 실온에 노출시킨 다음, 3시간 후에 각 식물체의 시들음 정도를 보고 가뭄에 대한 내성을 체크하였다.
식물체의 생존비율에 대한 고염의 효과를 시험하기 위하여, MS 플레이트내의 식물체에 250 mM의 NaCl를 처리하고 배양기에서 배양하였다.
결과 및 고찰
I: 오이 식물체에서의 각 부위별 갈락티놀 합성효소의 발현
오이의 서로 다른 기관에서 갈락티놀 합성효소 전사 수준을 실시간 RT-PCR로 분석하였다. 도 1은 서로 다른 기관에서 갈락티놀 합성효소의 전사 수준을 보여주며 전사수준은 총 RNA의 나노그램당 복제수로 나타내었다. 애기장대의 경우, 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 유전자는 종자에서 집중적으로 발현되고 뿌리나 줄기, 잎에서의 발현은 매우 미미하거나 없다고 알려져 있다. 오이에서도 조직 부위별로 갈락티놀 합성효소 유전자의 발현을 살펴본 결과, 뿌리와 줄기에서는 발현이 되지 않았지만, 잎에서는 상당량의 발현을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 병원균을 처리한 오이 식물체에서는 정상식물에서와 마찬가지로 뿌리와 줄기에서는 발현의 정도에 변화가 없었지만, 잎에서는 병원균을 처리하기 전보다 약 2.5배나 더 많은 양의 전사체가 발현되었다. 본 실험은 최소 3회 반복되었으며 히스토그램은 별도의 실험의 평균값을 나타낸다.
따라서 본 실험에 공시한 갈락티놀 합성효소 유전자의 발현양상은 이미 알려져 있는 애기장대의 갈락티놀 합성효소의 발현양상과는 차이가 있으며, 다음 항의 병원균에 대한 내성기능이 이와 같은 발현양상에서 기인하는 것으로 여겨진다.
Ⅱ: 형질전환 담배에서의 갈락티놀 합성효소 과다 발현의 내병성 기능
갈락티놀 합성효소 발현의 내병성 기능을 시험하기 위하여, 형질전환 담배에 병원균을 처리하여 생존비율을 조사하였다. 곰팡이병원균에 대한 내병성 여부를 알아보기 위하여 잿빛곰팡이균인 Botrytis cinerea 4709를 2.5×105 spore/㎖의 포자농도로 담배에 살포하여 접종한 다음, 3일 후 내병성 정도를 체크하였다. 대조구 식물체들은 병 진전이 빠르게 이루어지고 더 진전된 후에는 병원균에 못 이겨 주저앉아 버렸다. 이에 반해 갈락티놀 합성효소가 과다 발현되는 식물체에서는 상기의 곰팡이병에 대해 강력한 내병성 기능을 나타내었다 (도2B).
또한, 세균병에 대한 형질전환 담배의 내병성 여부를 알아보기 위하여, 식물체에 무름병을 일으키는 Erwinia carotovora SCC1 을 멸균수에 약 1×108 cfu/㎖이 되게 현탁하여 각 담배 잎에 5 ㎕씩 접종하고 2일 후에 식물의 무름 증상 유무를 관찰하여 내병성 여부를 체크하였다. 대조구 식물체들은 곰팡이병과 마찬가지로 병 진전이 빠르게 이루어져 무름증상이 식물체 전체에 나타나 괴사하였다. 이에 반해 갈락티놀 합성효소가 과다 발현되는 식물체들은 무름병에 대해서도 강력한 내병성 기능을 보여주었다 (도2A).
이상의 결과는 갈락티놀 합성효소의 발현이 형질전환 식물체에서 곰팡이 및 세균성 병원균의 공격에 대항하는 기능을 부여한다는 사실을 시사한다. 본 실험들은 최소 3회 반복되었으며 히스토그램은 별도의 실험의 평균값을 나타낸다.
Ⅲ: 가뭄 스트레스 하에서 갈락티놀 합성효소 과다발현 형질전환 식물체의 생존 비율
갈락티놀 합성효소의 발현이 가뭄 스트레스에 대한 내성을 부여하는 데에도 관여하는지의 여부를 시험하기 위하여, MS 배지에서 키운 형질전환 실온에 노출시켰을 때, 생존비율을 조사하였다.
식물체를 플레이트 내에서 꺼내어 3시간이 지난 후에 각 식물체의 시들음 정도를 보고 가뭄에 대한 내성을 체크한 결과, 대조구 식물체들은 실온에 노출시킨지 30분 이내에 모두 시들음 증상을 보여주었지만, 갈락티놀 합성효소가 과다 발현되는 식물체들은 길게는 3시간 이후까지도 정상적인 형태를 유지하면서 시들음 증상을 보이지 않았다. 따라서 갈락티놀 합성효소가 과다 발현되는 식물체가 내건성에도 상당한 효과가 나타나는 것은 갈락티놀 합성효소의 발현이 가뭄에 대한 식물체의 내성 반응에도 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 본 실험은 최소 3회 반복되었으며 히스토그램은 별도의 실험의 평균값을 나타낸다 (도3).
Ⅳ: 고염 스트레스 하에서 갈락티놀 합성효소 과다발현 형질전환 식물체의 생존비율
갈락티놀 합성효소의 발현이 고염 스트레스에 대한 내성을 부여하는 데에도 관여하는지의 여부를 시험하기 위하여, 담배에 고농도의 NaCl을 처리한 후 생존비율을 조사하였다. 형질전환 된 담배를 고농도의 염이 첨가된 MS배지에 옮겨 일주일 후에 생존비율을 알아본 결과, 대조구 식물체들은 거의 백화되어 더 이상의 생장이 이루어지지 않았지만 갈락티놀 합성효소가 과다 발현되는 식물체들은 정상적으로 생장하여 내염성 효과를 보여주었다. 이는 갈락티놀 합성효소가 염에 대한 식물체의 반응에도 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 본 실험은 최소 3회 반복되었으며 히스토그램은 별도의 실험의 평균값을 나타낸다 (도4).
참고문헌
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Liu, J-J.J., Krenz, D.C., Galvez, A.F. and deLumen, B.D. (1998) Galactinol synthase (GS): increased enzyme activity and levels of mRNA due to cold and desiccation. Plant Sci. 134, 11-20.
Taji, T., Ohsumi, C., Iuchi, S., Seki, M., Kasuga, M., Kobayashi, M., Yamaguchi-Shinozaki. K. and Shinozaki, K. (2002) Important roles of drought- and coldinducible genes for galactinol synthase in stress tolerance in Arabidopsis thaliana. Plant J. 29, 417-426.
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Zhu, J. K., Liu, J. and Xiong, L. (1998) Genetic analysis of salt tolerance in Arabidopsis. Evidence for a critical role of potassium nutrition. Plant Cell 10, 1181-1191.
이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명은 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에 내병성, 내건성 또는 내염성을 부여하는 방법 및 상기 방법에 의하여 제조된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 내병성, 내건성 또는 내염성을 갖는 식물체는 병원성 곰팡이나 병원성 세균이 감염된 조건에서 우수한 생존율을 보일 뿐만 아니라 건조하거나 염농도가 높은 조건에서도 우수한 생존율을 보인다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물에 내병성을 부여하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 오이에서 유래하는 것을 특징으로 하는 식물에 내병성을 부여하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 2 서열의 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 식물에 내병성을 부여하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 1 서열인 것을 특징으로 하는 식물에 내병성을 부여하는 방법.
  5. 갈락티놀 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물 내병성 부여용 조성물.
  6. 삭제
  7. 식물에 존재하는 갈락티놀 합성효소 유전자의 발현을 조절하는 조절부위로서 프로모터, 인핸서 또는 서프레서 서열을 조작하여 상기 유전자의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물에 내병성을 부여하는 방법.
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