JP2002148264A - 標識複合体および免疫学的検査法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ベロ毒素産生性大腸菌の判定が可能であり、ベ
ロ毒素１型と２型の検出を簡便、迅速にかつ同時に検出
することができる免疫学的検査法を提供すること。 【解決手段】ＶＴ１第１特異的結合物質とＶＴ２第１特
異的結合物質とを同一担体上に固定化した標識複合体；
免疫クロマトグラフィーで、吸水性基材上の一端にＶＴ
１第２特異的結合物質とＶＴ２第２特異的結合物質とを
異なる位置に固定化した固定相を有する試験片の固定相
上で、下記：（ａ）ＶＴ１第１特異的結合物質とＶＴ２
第１特異的結合物質とを同一担体上に固定化した標識複
合体、（ｂ）被検試料中のＶＴ１又はＶＴ２、及び
（ｃ）固定相上のＶＴ１第２特異的結合物質又はＶＴ２
第２特異的結合物質、からなる複合体を形成させ、該複
合体を検出することを特徴とする、免疫学的検査法；な
らびに免疫クロマトグラフィー用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、簡単、迅速に且つ
高精度に、被検試料中のベロ毒素１型と２型の検出を同
一の試験片上で同時に行なうことができる免疫学的検査
用の標識複合体および免疫学的検査法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】近年問題となっているベロ毒素産生性大
腸菌であるＯ１５７は、主に感染源となる食品から体内
に入り、４〜９日間程度の潜伏期間を経たのちに発症す
る。また、血便は感染初期から呈することもあり、その
のち、場合によってはＯ１５７が産生するベロ毒素の作
用によって、溶血性貧血、腎不全、血小板減少などの症
状を引き起こし、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）に至る
こともある。

【０００３】下痢症状を有する患者の糞便中から、この
ようなベロ毒素産生性大腸菌の診断を行なう操作は非常
に煩雑であり、結果が出るまでには多くの日数を要する
ものであるが、最近は免疫測定法を用いることによって
比較的簡便に検出することができるようになっている。

【０００４】具体的な検出法としては、ラテックス凝集
法（商品名：大腸菌Ｏ１５７検出キット「ＵＮＩ」、ユ
ニパス社製）を用いる方法がある。その他に、ＥＬＩＳ
Ａ法（商品名：オーソＥ．ｃｏｌｉＯ１５７、オーソダ
イアグノスティック社製）がある。しかしながら、上記
のラテックス凝集法は測定するまでに増菌培養が必要で
あり、ＥＬＩＳＡ法は操作に手間がかかるものである。

【０００５】一方、近年、迅速かつ簡便に免疫学的検査
が行なえる方法として、免疫クロマトグラフ法が注目さ
れている。かかる免疫クロマトグラフ法は、例えば、以
下のようなステップにより行なわれる：被検物質と結合
しうる特異的結合物質を固定化した固定相を有する吸水
性基材上で被検液を展開する。ついで、前記被検物質に
特異的に結合しうる特異的結合物質を有する標識複合体
と被検物質との複合体を前記固定相上で捕捉する。その
後、固定相に捕捉された標識複合体を検出することによ
り、被検試料中の被検物質を測定することができる。か
かる免疫クロマトグラフ法による検査用キット（商品
名：Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７ダイレクトワコー、和光純薬
社製）が市販されている。

【０００６】しかしながら、上記の検出法は、すべてベ
ロ毒素産生性大腸菌の外膜のＯ抗原であるリポ多糖（Ｌ
ＰＳ）を検出し、直接的に菌の存在を測定する手法であ
り、糞便試料中でＬＰＳは、経時的に分解・減少する
為、保存糞便では偽陰性を示すおそれがある。また、同
じベロ毒素産生性大腸菌であっても血清型の異なるＯ２
６やＯ１１１などでは検出できないという欠点がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、近年問題視
されているＯ１５７に代表されるベロ毒素産生性大腸菌
の判定が可能であり、ベロ毒素１型と２型の検出を簡
便、迅速にかつ同時に検出することができる免疫学的検
査法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、〔１〕
ベロ毒素１型（ＶＴ１という）に特異的に結合しうる
第１特異的結合物質（ＶＴ１第１特異的結合物質とい
う）とベロ毒素２型（ＶＴ２という）に特異的に結合し
うる第１特異的結合物質（ＶＴ２第１特異的結合物質と
いう）とを同一担体上に固定化してなる標識複合体、
〔２〕 免疫クロマトグラフィーにおいて、吸水性基材
上の一端にＶＴ１に特異的に結合しうる第２特異的結合
物質（ＶＴ１第２特異的結合物質）とＶＴ２に特異的に
結合しうる第２特異的結合物質（ＶＴ２第２特異的結合
物質）とを異なる位置に固定化した固定相を有する試験
片の固定相上で、下記： （ａ）ＶＴ１第１特異的結合物質とＶＴ２第１特異的結
合物質とを同一担体上に固定化してなる標識複合体、
（ｂ）被検試料中のＶＴ１又はＶＴ２、及び（ｃ）固定
相上のＶＴ１第２特異的結合物質又はＶＴ２第２特異的
結合物質、からなる複合体を形成させ、該複合体を検出
することを特徴とする、免疫学的検査法、並びに〔３〕
（Ａ）ＶＴ１に特異的に結合しうる第１特異的結合物
質（ＶＴ１第１特異的結合物質）とＶＴ２に特異的に結
合しうる第１特異的結合物質（ＶＴ２第１特異的結合物
質）とを同一担体上に固定化してなる標識複合体；及び
（Ｂ）吸水性基材上の一端にＶＴ１に特異的に結合しう
る第２特異的結合物質（ＶＴ１第２特異的結合物質）と
ＶＴ２に特異的に結合しうる第２特異的結合物質（ＶＴ
２第２特異的結合物質）とを異なる位置に固定化した固
定相を有する試験片を含有してなる、免疫クロマトグラ
フィー用キット、に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の標識複合体は、ベロ毒素
１型（以下、ＶＴ１という）に特異的に結合しうる第１
特異的結合物質とベロ毒素２型（以下、ＶＴ２という）
に特異的に結合しうる第１特異的結合物質とを同一担体
上に固定化したものである。

【００１０】なお、本明細書において、「特異的結合物
質」とは、ベロ毒素１型またはベロ毒素２型に特異的に
結合しうる物質をいう。また、前記特異的結合物質のな
かで、標識複合体に固定化される物質を、第１特異的結
合物質といい、後述の試験片上の固定相に固定化される
物質を、第２特異的結合物質という。具体的には、ＶＴ
１に特異的に結合する第１特異的結合物質を、ＶＴ１第
１特異的結合物質、ＶＴ１に特異的に結合する第２特異
的結合物質を、ＶＴ１第２特異的結合物質と表記し、Ｖ
Ｔ２に特異的に結合する第１特異的結合物質を、ＶＴ２
第１特異的結合物質、ＶＴ２に特異的に結合する第２特
異的結合物質を、ＶＴ２第２特異的結合物質と表記す
る。

【００１１】本発明の標識複合体は、ＶＴ１第１特異的
結合物質とＶＴ２第１特異的結合物質とが同一担体上に
固定化されているため、１回の検査で、ＶＴ１とＶＴ２
との両方を検出することが可能になるという優れた性質
を有する。

【００１２】一方、従来のように、抗ＶＴ１抗体を担体
に固定化した標識複合体と抗ＶＴ２抗体を担体に固定化
した標識複合体との２種を用いる場合、展開混合液中
（被検物質＋標識複合体）に添加するラテックスビーズ
量は、被検物質であるＶＴ１およびＶＴ２それぞれに対
して、十分な検出感度を得るに適した量であることが望
ましい。すなわち、各被検物質は、ある一定量の標識複
合体を各々添加する必要がある。その結果、標識複合体
濃度の上昇により、バックグラウンドの上昇を招き、目
視判定の妨げとなるという欠点を有する。

【００１３】しかしながら、本発明の標識複合体のよう
に、抗ＶＴ１抗体と抗ＶＴ２抗体とを同一担体上に固定
化した標識複合体の場合、１種類の標識複合体を添加す
るだけでよいため、標識複合体濃度は一定であり、発色
感度を保ちつつ、バックグラウンドの発色を抑制するこ
とができるという優れた効果を発揮する。

【００１４】ベロ毒素産生性大腸菌は、人体など感染
後、産生するベロ毒素により様々な症状を引き起こす。
血便は、感染初期から呈することもあり、そののち、場
合によっては溶血性貧血や腎不全や血小板減少などの症
状を引き起こし、溶血性尿素症症候群（ＨＵＳ）に至る
こともある。ベロ毒素１型とベロ毒素２型の両者共に人
体への病原因子となりうるが、ベロ毒素２型がＨＵＳな
どの重篤な症状に移行しやすいと疑われている。したが
って、ベロ毒素の検査において、１型と２型との判別
は、治療指針の設定に重要である。本発明の標識複合体
によれば、１回の検査で、ベロ毒素産生性大腸菌が産生
している毒素の種類が判明するため、重篤症状への移行
を早期に予見することができるという優れた効果を発揮
する。

【００１５】特異的結合物質としては、例えば、モノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体などが挙
げられる。第１特異的結合物質と第２特異的結合物質と
は、用いる抗体の種類によっても異なるが、同一の抗原
決定基を認識する同一種の抗体を用いてもよく、異なる
抗原決定基を認識する二種の抗体を用いてもよい。一方
の特異的結合物質がモノクローナル抗体である場合に
は、もう一方の特異的結合物質は、当該モノクローナル
抗体とは異なる抗原決定基を認識するものであることが
望ましい。

【００１６】本発明の標識複合体における第１特異的結
合物質の全固定化量は、検出感度及び再現性の観点か
ら、担体乾燥重量１ｇあたり０．５ｍｇ以上、好ましく
は１ｍｇ以上であることが望ましく、経済性及び凝集の
防止の観点から、担体乾燥重量１ｇあたり１００ｍｇ以
下、好ましくは５０ｍｇ以下であることが望ましい。

【００１７】本発明の標識複合体に用いられる担体とし
ては、その表面上に、特異的結合物質および、任意に標
識物質を固定することができる担体であればよく、金属
コロイド、水分散型高分子粒子が挙げられる。

【００１８】金属コロイドとしては、金コロイドやセレ
ニウムコロイド等が例示される。

【００１９】前記水分散型高分子粒子は、不飽和二重結
合を有する少なくとも１種の単量体の乳化重合によって
調製される。かかる単量体としては、例えば、エチレ
ン、プロピレンなどのオレフィン系単量体、酢酸ビニ
ル、塩化ビニルなどのビニル系単量体、スチレン、メチ
ルスチレン、クロロスチレンなどのスチレン系単量体、
メタアクリル酸メチルなどのメタクリル酸エステル系単
量体、ブタジエンなどのジエン系単量体などが挙げられ
る。

【００２０】水分散型高分子粒子は、単量体の単独重合
体または共重合体に改質用単量体を共重合して得られた
重合体でもよい。このような改質用単量体としては、例
えば、アクリル酸、メタクリル酸、２，２，２−トリフ
ルオロエチルメチルメタクリレートなどのフッ素化メタ
クリル酸エステル、アクリロニトリル、メタクリロニト
リル、アクリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウ
ム、スルホプロピル（メタ）アクリレートナトリウム
塩、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２−ヒドロキシエチ
ルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレー
ト、グリシジルメタクリレートなどが挙げられる。

【００２１】また本発明においては、担体は、市販され
ている種々の水分散性高分子粒子でもよい。市販されて
いる水分散性高分子粒子としては、例えば、スチレン−
ブタジエン共重合体、スチレン−アクリロニトリル−ブ
タジエン共重合体等の種々のスチレン共重合体からなる
エマルジョン等のスチレンまたはその誘導体を単量体成
分とする単独重合体や共重合体のエマルジョン；（メ
タ）アクリル酸の長鎖アルキルエステルまたはその誘導
体を単量体成分とする単独重合体、該単量体成分と（メ
タ）アクリル酸メチルや（メタ）アクリル酸エチル、グ
リシジル（メタ）アクリレート等との共重合体；前記し
たスチレンまたはその誘導体と、（メタ）アクリレート
エステルやその誘導体との共重合体；ゴム、ナイロン、
ポリウレタン、微結晶質セルロース等が挙げられる。

【００２２】個々の単量体の具体的な種類は、得られる
水分散型高分子粒子を担体として使用された標識複合体
が、その使用時や保存時に融着、凝集を起こさないよう
に当該高分子粒子が所要のガラス転移点を有するように
選ばれる。水分散型高分子粒子のガラス転移点は、好ま
しくは１０℃以上、特に好ましくは室温以上であること
が望ましい。

【００２３】担体として水分散型高分子粒子を用いる場
合、後述の着色ラテックスとして用いてもよく、酵素、
蛍光物質などに代表される標識物質を固定化した水分散
型高分子粒子として用いてもよい。担体として、酵素を
固定化した水分散型高分子粒子を用いる場合、適宜、標
識複合体の展開の後に、酵素基質を展開してもよい。

【００２４】前記酵素としては、公知の標識に用いられ
る酵素を用いることができる。具体的にはペルオキシダ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エス
テラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙げられる。
より高感度で安定な検出を達成することが可能なペルオ
キシダーゼまたはアルカリホスファターゼが好ましい。

【００２５】前記蛍光物質としては、フルオレセインイ
ソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシ
アネート等が挙げられる。

【００２６】担体は、着色粒子でもよい。着色粒子とし
ては、肉眼で検出可能なものであればよく、例えば、
金、銀、銅などの金属からなるコロイド粒子、スダンブ
ルーやスダンレッドIV、スダンIII 、オイルオレンジ、
キニザリングリーンなどに代表される顔料や染料などで
ラテックスを着色してなる着色ラテックスなどが挙げら
れる。目視確認性の点からは、好ましくは、金コロイ
ド；青色、赤色、緑色またはオレンジ色などに着色した
着色ラテックスが望ましく、さらに好ましくは、青色や
赤色などで着色した水分散型高分子重合体粒子からなる
着色ラテックスを用いることが分散安定性や検出感度の
調整し易さなどの点から望ましい。

【００２７】上記担体の粒径は、着色粒子を用いる場
合、十分な目視確認性を得る観点から、平均粒子径約
０．０１μｍ以上であり、好ましくは約０．０５μｍ以
上であることが望ましく、吸水性基材における目詰まり
及び非特異的発色を抑制する観点から、平均粒子径約３
μｍ以下であり、好ましくは約０．５μｍ以下であるこ
とが望ましい。

【００２８】前記担体に第１特異的結合物質を固定化す
る方法としては、従来からよく知られている方法、例え
ば共有結合法、物理的吸着法、イオン結合法などが挙げ
られる。なかでも、固定化後の特異的結合物質の安定性
の観点から、共有結合法が望ましい。

【００２９】標識複合体は、抗原抗体反応が行なわれう
るｐＨ及び塩濃度の緩衝液に分散させて用いてもよい。
この時、展開時の標識複合体濃度は、固定相に結合する
粒子数を向上させ目視確認性を向上させる観点から、
０．００５重量％以上であり、好ましくは０．０１重量
％以上であることが望ましく、経済性、十分な目視確認
性を得る観点から、５重量％以下であり、好ましくは
０．５重量％以下であることが望ましい。なお、標識複
合体を含有した溶液を標識複合体液ともいう。

【００３０】本発明の標識複合体によれば、ベロ毒素１
型とベロ毒素２型の検出を同時に、簡便かつ迅速に検出
することができる免疫学的検査法を行なうことができ
る。かかる免疫学的検査法も本発明の範囲に含まれる。

【００３１】本発明の免疫学的検査法は、免疫クロマト
グラフィーにおいて、吸水性基材上の一端にＶＴ１第２
特異的結合物質とＶＴ２第２特異的結合物質とを異なる
位置に固定化した固定相を有する試験片の固定相上で、
下記： （ａ）ＶＴ１第１特異的結合物質とＶＴ２第１特異的結
合物質とを同一担体上に固定化してなる標識複合体、
（ｂ）被検試料中のＶＴ１又はＶＴ２、及び（ｃ）固定
相上のＶＴ１第２特異的結合物質又はＶＴ２第２特異的
結合物質、からなる複合体を形成させ、該複合体を検出
することを特徴とする。

【００３２】ここで、被検試料は、液体であっても、固
体であってもよい。被検試料が固体である場合、該被検
試料を適切な緩衝液等に懸濁して、液体試料として用い
てもよい。

【００３３】本発明の免疫学的検査方法は、具体的に
は、下記の態様が挙げられる： 態様１ （Ｉ）前記（ａ）の標識複合体と被検試料とを接触させ
て、該標識複合体と前記（ｂ）のＶＴ１又はＶＴ２との
複合体を形成するステップ； （II）吸水性基材上の一端にＶＴ１第２特異的結合物質
とＶＴ２第２特異的結合物質とを異なる位置に固定化し
た固定相を有する試験片で、前記（Ｉ）のステップで得
られた複合体を展開するステップ；並びに (III) 前記（II）のステップで展開された複合体を、固
定相に捕捉するステップを含む、免疫学的検査法。

【００３４】態様２（Ｉ）吸水性基材上の一端にＶＴ１
第２特異的結合物質とＶＴ２第２特異的結合物質とを異
なる位置に固定化した固定相を有する試験片の他端か
ら、被検試料を展開し、該固定相で被検試料中のＶＴ１
又はＶＴ２を捕捉するステップ；並びに（II）試験片に
前記（ａ）の標識複合体を展開し、固定相に捕捉するス
テップを含む、免疫学的検査法。

【００３５】態様３（Ｉ）吸水性基材上の一端にＶＴ１
第２特異的結合物質とＶＴ２第２特異的結合物質とを異
なる位置に固定化した固定相を有し、かつ該吸水性基材
上の他端に試薬受領部を有する試験片上の固定相と試薬
受領部との間に、被検試料を供するステップ；（II）該
試薬受領部に前記（ａ）の標識複合体を供して、展開
し、それにより、該標識複合体と前記（ｂ）のＶＴ１又
はＶＴ２との複合体を形成するステップ；並びに(III)
前記（II）のステップで得られた複合体を展開し、固定
相に捕捉するステップを含む、免疫学的検査法。

【００３６】前記態様１の方法において、まず、被検試
料と標識複合体液とを混合させる。この時、被検試料中
にＶＴ１及び／又はＶＴ２が含まれる場合、該ＶＴ１及
び／又はＶＴ２は、それぞれに特異的に結合する各標識
複合体と結合し、標識複合体とＶＴ１又はＶＴ２との複
合体〔標識複合体（担体−第１特異的結合物質）−ＶＴ
１〕又は〔標識複合体（担体−第１特異的結合物質）−
ＶＴ２〕をそれぞれ形成する。ついで、ＶＴ１及びＶＴ
２のそれぞれに対応する固定相を設けた吸水性基材の一
端から、前記被検試料と標識複合体液との混合物を吸収
させる。混合物中で形成された複合体は、液体成分の移
動とともに吸水性基材を移動し、固定相に到達する。固
定相においては、移動してきた複合体が、対応する固定
相に固定された第２特異的結合物質と更に結合し、新た
に〔標識複合体（担体−第１特異的結合物質）−ＶＴ１
−第２特異的結合物質〕又は〔標識複合体（担体−第１
特異的結合物質）−ＶＴ２−第２特異的結合物質〕の複
合体を形成して、固定相上に固定化される。ＶＴ１又は
ＶＴ２に対応する固定相に固定化された複合体を検出す
ることにより、ＶＴ１又はＶＴ２の存在を検査すること
ができる。

【００３７】前記態様２の方法において、ＶＴ１及びＶ
Ｔ２のそれぞれに対応する固定相を設けた吸水性基材の
一端から、被検試料を吸収させ、被検試料中のＶＴ１又
はＶＴ２を固定相上の対応する第２特異的結合物質に結
合させる。それにより、〔ＶＴ１−第２特異的結合物
質〕又は〔ＶＴ２−第２特異的結合物質〕が形成され
る。この方法では、被検試料は、液体であっても、固体
であってもよい。被検試料が固体である場合、該被検試
料を適切な緩衝液等に懸濁して、液体試料として用い
る。ついで、標識複合体液を展開することにより、各標
識複合体は、固定相に結合しているＶＴ１又はＶＴ２と
複合体を形成して、新たに〔標識複合体（担体−第１特
異的結合物質）−ＶＴ１−第２特異的結合物質〕又は
〔標識複合体（担体−第１特異的結合物質）−ＶＴ２−
第２特異的結合物質〕の複合体を形成して、固定相上に
固定化結合される。ＶＴ１又はＶＴ２に対応する固定相
に固定化された複合体を検出することにより、ＶＴ１又
はＶＴ２の存在を検査することができる。

【００３８】前記態様３の方法において、まず、試験片
上の固定相と試薬受領部との間に、被検試料を供する。
ついで、試験片上の試薬受領部から標識複合体液を展開
させる。これにより、対応する標識複合体と被検試料中
のＶＴ１又はＶＴ２との複合体が形成する。形成した複
合体は、液体成分の移動とともに吸水性基材を移動し、
固定相に到達する。固定相においては、移動してきた複
合体が、固定化された対応する第２特異的結合物質と結
合し、新たに〔標識複合体（担体−第１特異的結合物
質）−ＶＴ１−第２特異的結合物質〕又は〔標識複合体
（担体−第１特異的結合物質）−ＶＴ２−第２特異的結
合物質〕の複合体を形成して、固定相上に固定化結合さ
れる。ＶＴ１又はＶＴ２に対応する固定相に固定化され
た複合体を検出することにより、ＶＴ１又はＶＴ２の存
在を検査することができる。

【００３９】このように、〔標識複合体（担体−第１特
異的結合物質）−ＶＴ１−第２特異的結合物質〕又は
〔標識複合体（担体−第１特異的結合物質）−ＶＴ２−
第２特異的結合物質〕の複合体は、それぞれ対応する固
定相に捕捉される。そのため、標識複合体中の担体は、
一カ所に集合し、固定化されるので、明瞭な呈色を得る
ことができる。したがって、被検物質の存在を目視確認
できる。本発明では固定相には、ＶＴ１及びＶＴ２のそ
れぞれに対応する第２特異的結合物質がそれぞれ異なっ
た位置に固定されているので、一度にＶＴ１及びＶＴ２
のそれぞれの存在を確認することができる。

【００４０】本発明に用いられる試験片としては、吸水
性基材上の一端にＶＴ１第２特異的結合物質とＶＴ２第
２特異的結合物質とを異なる位置に固定化した固定相を
有する試験片が挙げられる。また、前記試験片におい
て、吸水性基材上の他端に試薬受領部をさらに有する試
験片であってもよい。

【００４１】試験片に用いられる吸水性基材は、被検試
料、例えば、食品から抽出した溶液や培養液の上澄み、
糞便懸濁（溶解）溶液；これらを緩衝液によって希釈し
て得られた希釈液；標識複合体を含有した液などを吸収
・展開できるものであればよい。本発明においては、検
査時間の短縮及び検出感度の向上の観点から、被検試料
中のＶＴ１又はＶＴ２と、標識複合体や固定相上の対応
する第２特異的結合物質とが、十分に抗原抗体反応をす
るための時間を確保できるような吸水性を有する吸水性
基材が用いられる。具体的には、例えば、不織布、濾
紙、ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニトロセルロー
スフィルター、多孔質材料等が挙げられる。これらの基
材は適度な吸水速度を有すると共に、担体が結合して発
色した際の目視確認性に優れるものである。

【００４２】以上の点を考慮すると、本発明における吸
水性基材の吸水の程度は、５ｍｍ幅の短冊状に裁断した
吸水性基材の片端部を水に浸漬し、１分間経過後の吸水
距離が０．５〜５ｃｍ程度のものが望ましい。

【００４３】また、前記基材の吸水性を調整するため
に、吸水性基材の表面に親水性重合体や界面活性剤を被
覆させることもでき、該基材を親水性重合体や界面活性
剤を含浸させることもできる。さらに、本発明において
は、吸水性基材として同一材料からなる基材を用いても
よいし、あるいは異種の材料からなるものを任意の接着
手段によって接合して得た連続した基材を用いることも
できる。

【００４４】本発明において、吸水性基材の形状は、被
検試料を展開できる形状であれば特に限定されるもので
はなく、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状な
どが好ましい。

【００４５】本発明において、固定相とは、吸水性基材
上の一端において、ＶＴ１第２特異的結合物質又はＶＴ
２第２特異的結合物質が固定化された領域を意味する。
第２特異的結合物質を吸水性基材上に固定化する方法
（固定化相の作製方法）は、特に限定されるないが、従
来から知られている物理吸着法及び共有結合法が好適で
あり、特に、特異的結合物質が基材から脱離しにくい観
点から、共有結合法が望ましい。吸水性基材が上記共有
結合法のための官能基を有しないときは、例えば適宜の
官能基を有する重合体を、吸水性基材の吸水性を阻害し
ない程度に付着させる。また、第２特異的結合物質およ
び親水性重合体を含む溶液を吸水性基材に塗布したの
ち、前記親水性重合体を凝固させる凝固溶剤に浸漬する
ことで固定相を作製することもできる。親水性重合体と
しては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビ
ニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロースなどが挙
げられる。凝固溶剤としては、アセトン、エタノール、
メタノール、エーテルなどが挙げられる。

【００４６】固定化する第２特異的結合物質の量は、検
出感度及び再現性の観点から、０．０１〜１ｍｇ／ｃｍ
² であることが望ましい。

【００４７】各固定相に関して、被検試料の吸液によっ
て移動してきたＶＴ１、ＶＴ２、対応する複合体などを
捕捉して、ＶＴ１及びＶＴ２を別々に検出するために
は、各第２特異的結合物質は少なくとも１ｍｍ以上、各
発色が混じり合わないようにするためには、好ましくは
５ｍｍ以上の間隔を設けて吸水性基材上に固定化するこ
とが望ましい。

【００４８】また、試験片における固定相と、被検試料
および／または標識複合体を含有する液の吸収が開始さ
れる部位（以下、試薬受領部という）との間の距離は、
適切な発色感度、検査に要する時間の短縮の観点から、
１ｃｍ以上、好ましくは３ｃｍ以上であることが望まし
く、発色の均一性、発色感度の向上の観点から、６ｃｍ
以下、好ましくは４ｃｍ以下であることが望ましい。

【００４９】なお、前記固定相は、前記試薬受領部から
同じ距離の異なる位置に各固定相を並列に配置してもよ
く、前記試薬受領部から異なる距離の位置に各固定相を
直列に配置してもよい。

【００５０】試薬受領部としては、被検試料や標識複合
体を含有する液の吸水性基材への移動を妨げるないもの
であればよく、吸水性基材と兼用したものであっても、
新たに不織布や織布等を該吸水性基材に接着させたもの
であってもよい。

【００５１】本発明の免疫学的検査方法は、本発明の免
疫クロマトグラフィー用キットを用いることにより、よ
り好適に実施できる。前記免疫クロマトグラフィー用キ
ットとしては、（Ａ）ＶＴ１第１特異的結合物質とＶＴ
２第１特異的結合物質とを同一担体上に固定化してなる
標識複合体；及び（Ｂ）吸水性基材上の一端にＶＴ１第
２特異的結合物質とＶＴ２第２特異的結合物質とを異な
る位置に固定化した固定相を有する試験片を含有した、
免疫クロマトグラフィー用キットが挙げられる。また、
前記（Ｂ）の試験片が、吸水性基材上の他端に試薬受領
部をさらに有するものである、免疫クロマトグラフィー
用キットであってもよい。当該キットを構成する標識複
合体及び試験片は、前記したものと同様のものが用いら
れる。

【００５２】例えば、本発明の免疫クロマトグラフィー
用キットを用いて検査する場合、用いる吸水性基材の種
類や大きさ、用いる特異的結合物質の特性によっても異
なるが、通常、液量にして１〜５００μｌ、ＶＴの量に
して、０．０１〜１．０×１０⁵ ｎｇの被検試料を好適
に測定することが可能である。

【００５３】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げ、さらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定され
るものではない。

【００５４】実施例１ （１）標識複合体の作製 青色着色カルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子分
散液（固形分濃度５重量％、平均粒子径約０．１μｍ、
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．０）３ｍｌに水溶性
カルボジイミド（１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、抗ベロ毒素
１型抗体（マウスＩｇＧ、１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−
ホウ酸緩衝液ｐＨ８．０）１ｍｌ及び抗ベロ毒素２型抗
体（マウスＩｇＧ、１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸
緩衝液ｐＨ８．０）１ｍｌを加えて１０℃で３時間反応
させた。ついで、得られた反応物について、洗浄液とし
て０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて遠
心分離洗浄を行ない、抗ＶＴｌ抗体と抗ＶＴ２抗体との
両方を固定化した青色着色ラテックス粒子からなる標識
複合体を得た（固形分濃度２％）。

【００５５】（２）試験片の作製 吸水性基材として、ニトロセルロースメンブラン（孔径
８μｍ、６ｍｍ×６０ｍｍ）を用い、該メンブレンの一
端から２５ｍｍの箇所に抗ベロ毒素１抗体（マウスＩｇ
Ｇ、２ｍｇ／ｍｌ）、２０ｍｍの箇所に抗ベロ毒素２抗
体（マウスＩｇＧ、２ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ１．５μ
ｌずつ、ディスペンサーを用いてライン状に塗布した。
かかるライン状の領域を固定相とする。なお、かかる固
定相側の端部を下流端とする。

【００５６】得られたメンブレンをウシ血清アルブミン
（１重量％）とポリオキシエチレン（１０）オクチルフ
ェニルエーテル（和光純薬工業社製、０．１重量％）と
からなる水溶液中に１０分間浸漬させた後、４０℃で２
時間乾燥させた。

【００５７】ついで、得られたメンブレンの裏側（抗体
塗布面の反対側）にポリエステルフィルム（９０μｍ
厚、大きさ：６ｍｍ×６０ｍｍ）をスプレー糊を用いて
貼り合わせた。

【００５８】上流端から０〜８ｍｍの箇所にポリエステ
ル不織布（６ｍｍ×８ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）を貼り合
わせて、試薬受領部を作製した。以上のように試験片を
得た。

【００５９】（３）ＶＴ２及びＶＴ２の検出 ０．１Ｍリン酸緩衝液（０．９重量％ＮａＣｌ含有、ｐ
Ｈ７．４）にＶＴｌ型、ＶＴ２型を表１に示した濃度で
分散させた被検試料を調製した。

【００６０】この被検試料に前記（１）で得られた標識
複合体を固形分濃度０．０２重量％となるように混合し
た後、混合液１００μｌを上記で作製した試験片のポリ
エステル不織布部に滴下し、２０分後の発色の有無を目
視観察した。

【００６１】

【表１】

【００６２】表１に示すように、バックグラウンドの着
色は見られず、視認性が良好であることがわかる。

【００６３】比較例１ （１）標識複合体の作製 青色着色カルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子分
散液（固形分濃度５重量％、平均粒子径約０．１μｍ、
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．０）３ｍｌに水溶性
カルボジイミド（１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、および抗ベ
ロトキシン１型抗体（マウスＩｇＧ、１ｍｇ／ｍｌ、
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．０）１ｍｌを加えて
１０℃で３時間反応させた。その後、得られた反応物に
ついて、洗浄液としてホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用
いて、遠心分離洗浄を行ない、抗ＶＴｌ抗体を固定化し
た青色着色ラテックス粒子からなる標識複合体を得た
（固形分濃度２％）。

【００６４】同様に、青色着色カルボキシル化ポリスチ
レンラテックス粒子分散液（固形分濃度５重量％、平均
粒子径約０．１μｍ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ
８．０）３ｍｌに水溶性カルボジイミド（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）１ｍｌ、および抗ベロトキシン２型抗体（マウスＩ
ｇＧ、１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ
８．０）１ｍｌを加えて１０℃で３時間反応させた後、
洗浄液としてホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて遠心
分離洗浄を行ない、抗ＶＴ２抗体を固定化した青色着色
ラテックス粒子からなる標識複合体を得た（固形分濃度
２％）。

【００６５】（２）試験片の作製 吸水性基材として、ニトロセルロースメンブラン（孔径
８μｍ、６ｍｍ×６０ｍｍ）を用い、該メンブレンの一
端から２５ｍｍの箇所に抗ベロ毒素１抗体（マウスＩｇ
Ｇ、２ｍｇ／ｍｌ）、２０ｍｍの箇所に抗ベロ毒素２抗
体（マウスＩｇＧ、２ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ１．５μ
ｌずつ、ディスペンサーを用いてライン状に塗布した。
かかるライン状の領域を固定相とする。なお、かかる固
定相側の端部を下流端とする。

【００６６】得られたメンブレンをウシ血清アルブミン
（１重量％）とポリオキシエチレン（１０）オクチルフ
ェニルエーテル（和光純薬工業社製、０．１重量％）と
からなる水溶液中に１０分間浸漬させた後、４０℃で２
時間乾燥させた。

【００６７】ついで、得られたメンブレンの裏側（抗体
塗布面の反対側）にポリエステルフィルム（９０μｍ
厚、大きさ：６ｍｍ×６０ｍｍ）をスプレー糊を用いて
貼り合わせた。

【００６８】上流端から０〜８ｍｍの箇所にポリエステ
ル不織布（６ｍｍ×８ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）を貼り合
わせて、試薬受領部を作製した。以上のように試験片を
得た。

【００６９】（３）ＶＴ１及びＶＴ２の検出 ０．１Ｍ−リン酸緩衝液（０．９重量％ＮａＣｌ含有、
ｐＨ７．４）にＶＴｌ型、ＶＴ２型を表２に示した濃度
で分散させた被検試料を調製した。

【００７０】この被検試料に、前記（１）で得られた標
識複合体をそれぞれ固形分濃度０．０２重量％となるよ
うに混合した後、混合液１００μｌを上記で作製した試
験片のポリエステル不織布部に滴下し、２０分後の発色
の有無を目視観察した。その結果を表２に示す。

【００７１】

【表２】

【００７２】表２に示すように、バックグラウンドにお
ける着色が強く、目視観察が困難であることがわかる。

【００７３】比較例２ （１）標識複合体の作製 青色着色カルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子分
散液（固形分濃度５重量％、平均粒子径約０．１μｍ、
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．０）３ｍｌに水溶性
カルボジイミド（１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、および抗ベ
ロトキシン１型抗体（マウスＩｇＧ、１ｍｇ／ｍｌ、
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．０）１ｍｌを加えて
１０℃で３時間反応させた。その後、得られた反応物に
ついて、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．０）を用いて遠心分離洗浄を行ない、抗ＶＴｌ抗体
を固定化した青色着色ラテックス粒子からなる標識複合
体を得た（固形分濃度２％）。

【００７４】同様に、青色着色カルボキシル化ポリスチ
レンラテックス粒子分散液（固形分濃度５重量％、平均
粒子径約０．１μｍ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ
８．０）３ｍｌに水溶性カルボジイミド（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）１ｍｌ、および抗ベロトキシン２型抗体（マウスＩ
ｇＧ、１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ
８．０）１ｍｌを加えて１０℃で３時間反応させた。そ
の後、得られた反応物について、洗浄液として０．０１
Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて遠心分離洗浄
を行ない、抗ＶＴ２抗体を固定化した青色着色ラテック
ス粒子からなる標識複合体を得た（固形分濃度２％）。

【００７５】（２）試験片の作製 吸水性基材として、ニトロセルロースメンブラン（孔径
８μｍ、６ｍｍ×６０ｍｍ）を用い、該メンブレンの一
端から２５ｍｍの箇所に抗ベロ毒素１抗体（マウスＩｇ
Ｇ、２ｍｇ／ｍｌ）、２０ｍｍの箇所に抗ベロ毒素２抗
体（マウスＩｇＧ、２ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ１．５μ
ｌずつ、ディスペンサーを用いてライン状に塗布した。
かかるライン状の領域を固定相とする。なお、かかる固
定相側の端部を下流端とする。

【００７６】得られたメンブレンをウシ血清アルブミン
（１重量％）とポリオキシエチレン（１０）オクチルフ
ェニルエーテル（和光純薬工業社製、０．１重量％）と
からなる水溶液中に１０分間浸漬させた後、４０℃で２
時間乾燥させた。

【００７７】ついで、得られたメンブレンの裏側（抗体
塗布面の反対側）にポリエステルフィルム（９０μｍ
厚、大きさ：６ｍｍ×６０ｍｍ）をスプレー糊を用いて
貼り合わせた。

【００７８】上流端から０〜８ｍｍの箇所にポリエステ
ル不織布（６ｍｍ×８ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）を貼り合
わせて、試薬受領部を作製した。以上のように試験片を
得た。

【００７９】（３）ＶＴ１及びＶＴ２の検出 ０．１Ｍ−リン酸緩衝液（０．９重量％ＮａＣｌ含有、
ｐＨ７．４）にＶＴｌ型、ＶＴ２型を表３に示した濃度
で分散させた被検試料を調製した。

【００８０】この被検試料に前記（１）で得られた標識
複合体をそれぞれ固形分濃度０．０１重量％となるよう
に混合した後、混合液１００μｌを上記で作製した試験
片のポリエステル不織布部に滴下し、２０分後の発色の
有無を目視観察した。その結果を表３に示す。

【００８１】

【表３】

【００８２】表３に示すように、バックグラウンドにお
ける着色は見られず、視認性が良好であったが、実施例
に比べ、感度が低下することがわかる。

【００８３】

【発明の効果】本発明の標識複合体によれば、食品中に
存在するＶＴの検出や、糞便中に存在するＶＴ１とＶＴ
２とを、１回の検査で、同時に検出することを可能にす
る。また、本発明の免疫学的検査法によれば、１回の検
査で、ＶＴ１とＶＴ２の検出を同時に、簡便かつ迅速に
検出することができるという優れた効果を奏する。ま
た、本発明の免疫クロマトグラフィー用キットによれ
ば、本発明の免疫学的検査法を簡便に行なうことができ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 森岡 量子 大阪府茨木市下穂積１−１−２ 日東電工 株式会社内 (72)発明者 千田 修治 大阪府茨木市下穂積１−１−２ 日東電工 株式会社内 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ06 QQ79 QQ91 QR48 QR56 QR83 QR84 QS33 QX01

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ベロ毒素１型（ＶＴ１という）に特異的
   に結合しうる第１特異的結合物質（ＶＴ１第１特異的結
   合物質という）とベロ毒素２型（ＶＴ２という）に特異
   的に結合しうる第１特異的結合物質（ＶＴ２第１特異的
   結合物質という）とを同一担体上に固定化してなる標識
   複合体。
2. 【請求項２】 担体が、着色粒子、金属コロイド及び水
   分散型高分子粒子からなる群より選択された１種であ
   る、請求項１記載の標識複合体。
3. 【請求項３】 免疫クロマトグラフィーにおいて、吸水
   性基材上の一端にＶＴ１に特異的に結合しうる第２特異
   的結合物質（ＶＴ１第２特異的結合物質）とＶＴ２に特
   異的に結合しうる第２特異的結合物質（ＶＴ２第２特異
   的結合物質）とを異なる位置に固定化した固定相を有す
   る試験片の固定相上で、下記： （ａ）ＶＴ１に特異的に結合しうる第１特異的結合物質
   （ＶＴ１第１特異的結合物質）とＶＴ２に特異的に結合
   しうる第１特異的結合物質（ＶＴ２第１特異的結合物
   質）とを同一担体上に固定化してなる標識複合体、
   （ｂ）被検試料中のＶＴ１又はＶＴ２、及び（ｃ）固定
   相上のＶＴ１第２特異的結合物質又はＶＴ２第２特異的
   結合物質、からなる複合体を形成させ、該複合体を検出
   することを特徴とする、免疫学的検査法。
4. 【請求項４】 （Ｉ）前記（ａ）の標識複合体と被検試
   料とを接触させて、該標識複合体と前記（ｂ）のＶＴ１
   又はＶＴ２との複合体を形成するステップ；（II）吸水
   性基材上の一端にＶＴ１第２特異的結合物質とＶＴ２第
   ２特異的結合物質とを異なる位置に固定化した固定相を
   有する試験片で、前記（Ｉ）のステップで得られた複合
   体を展開するステップ；並びに(III) 前記（II）のステ
   ップで展開された複合体を、固定相に捕捉するステップ
   を含む、請求項３記載の免疫学的検査法。
5. 【請求項５】 （Ｉ）吸水性基材上の一端にＶＴ１第２
   特異的結合物質とＶＴ２第２特異的結合物質とを異なる
   位置に固定化した固定相を有する試験片の他端から、被
   検試料を展開し、該固定相で被検試料中のＶＴ１又はＶ
   Ｔ２を捕捉するステップ；並びに（II）試験片に前記
   （ａ）の標識複合体を展開し、固定相に捕捉するステッ
   プを含む、請求項３記載の免疫学的検査法。
6. 【請求項６】 （Ｉ）吸水性基材上の一端にＶＴ１第２
   特異的結合物質とＶＴ２第２特異的結合物質とを異なる
   位置に固定化した固定相を有し、かつ該吸水性基材上の
   他端に試薬受領部を有する試験片上の固定相と試薬受領
   部との間に、被検試料を供するステップ； （II）該試薬受領部に前記（ａ）の標識複合体を供し
   て、展開し、それにより、該標識複合体と前記（ｂ）の
   ＶＴ１又はＶＴ２との複合体を形成するステップ；並び
   に (III) 前記（II）のステップで得られた複合体を展開
   し、固定相に捕捉するステップを含む、請求項３記載の
   免疫学的検査法。
7. 【請求項７】 （Ａ）ＶＴ１に特異的に結合しうる第１
   特異的結合物質（ＶＴ１第１特異的結合物質）とＶＴ２
   に特異的に結合しうる第１特異的結合物質（ＶＴ２第１
   特異的結合物質）とを同一担体上に固定化してなる標識
   複合体；及び（Ｂ）吸水性基材上の一端にＶＴ１に特異
   的に結合しうる第２特異的結合物質（ＶＴ１第２特異的
   結合物質）とＶＴ２に特異的に結合しうる第２特異的結
   合物質（ＶＴ２第２特異的結合物質）とを異なる位置に
   固定化した固定相を有する試験片を含有してなる、免疫
   クロマトグラフィー用キット。
8. 【請求項８】 （Ｂ）の試験片が、吸水性基材上の他端
   に試薬受領部をさらに有するものである、請求項７記載
   の免疫クロマトグラフィー用キット。