JP2001518920A - 脱カフェイン化マテ茶抽出物およびその使用 - Google Patents

脱カフェイン化マテ茶抽出物およびその使用

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Abstract

(57)【要約】 脱カフェイン化マテ茶抽出物およびその抗酸化剤、遊離基捕捉剤、医薬品、化粧品および食品/栄養補給組成物としての使用を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 脱カフェイン化マテ茶抽出物およびその使用 本発明は、コーヒー酸誘導体に特徴があり、ポリフェノール含有量を規定した 脱カフェイン化マテ茶抽出物および医薬品、栄養補給剤、化粧品の製造において 抗酸化剤および遊離ラジカル捕捉剤としての使用、およびそれを含む医薬品、化 粧品、栄養補給剤/食品組成物への使用に関する。 疫学的および臨床的試験でよく知られている[1]ように、食品からの抗酸化剤 /遊離ラジカル捕捉剤の摂取または医薬品および栄養捕給剤としてのそれらの投 与は、健康の享受および健康の保持、その発現に過剰な遊離ラジカルの負荷が関 与している酸化傷害に関連した慢性および変性性疾病(アテローム硬化症、癌、 冠状心疾患、リュウマチ様動脈炎、アルツハイマーおよびパーキンソン病、およ び老化)の予防に大きな効果がある[2-7]。化粧品の分野では、紫外線暴露によ って皮膚の上皮細胞層に生成する遊離のラジカルが皮膚の早期老化および皮膚癌 、特に悪性メラノーマの強力な誘発因子として認識されている[8]ことから、抗 ラジカル活性を有する化合物は皮膚の自然防御を亢進し、光防御因子の生成を誘 導することに大きな期待が持たれる。 マテ茶は、ウルグアイ、パラグアイ、アルゼンチンおよびブラジル等南米諸国 で広く消費されている興奮性飲料の一つであり、Ilex paraguayensis St.Hill( Aguifoliaceae)およびその他Ilex種のカフェインに富んだ葉の温水浸出液である 。その他に広く使用されているコーヒーおよび茶等の興奮性飲料と同様に、マテ 茶が利用されている理山は中枢神経系および心臓を刺激するカフェインを含んで いるからである。 キサンチンが含まれている[9,10]ことからマテ茶抽出物は化粧品または医薬品 に利用されているが、マテ茶の脱カフェイン化抽出物の天然抗酸化剤/ラジカル 捕捉剤としての使用は知られていない。 マテ茶の葉の水浸出液が単離した低密度リポ蛋白のCu2+誘導過酸化反応に抗酸 化作用を有することが報告され(11,12)、また別の特許2件にはマテ茶抽出物の抗 酸化剤/ラジカル捕捉剤としての効果が開示されている[13,14]が、驚くべきこ とに本発明では脱カフェイン化し、十分に特性が明らかなポリフェノールに富み 、ポリフェノール/クロロゲン酸含有量を標準化した抽出物が過酸化作用の発現 (超酸化アニオンO2 -、ヒドロキシラジカルHO・:予防的抗酸化剤)およびその 増殖(ペルオキシラジカルLOO・;チェーン切断抗酸化剤)に関与する全ての遊離 ラジカルに対してきわめて大きなラジカル捕捉効果を有することが認められた。 本発明の第一の目的は、Ilex種の植物の脱カフェイン化抽出物を提供すること である。本発明の抽出物はIlex paraguayensisの植物から得、カフェインの含有 量が0.1重量%以下であることが好ましい。 このような抽出物は、以下の手順によって調製した。 Ilex paraguayensisの葉を乾燥し、粉砕した後、攪拌しながら沸騰水(50mg/ml )で抽出し、冷却した。抽出液を10,000xgで10分間遠心し、上清を塩素系溶媒、 好ましくは塩化メチレンで十分抽出し、カフェイン、テオブルミンおよびその他 の非フェノール系物質を除去した。 水溶性残渣を減圧下で濃縮乾固し、淡黄色の脱カフェインマテ茶水抽出物粉末 を得た(収量23%)。 コーヒーや茶と同様に、マテ茶の脱カフェイン工程の全てまたは一部を、液固 抽出、液液抽出、クロマトグラフィー分離、超臨界抽出または臨界内抽出(CO2、 等)等別の方法で行うこともできる。 また、脱カフェイン化は最終ポリフェノールリッチ抽出物の抽出を行う前に、 直接マテ茶について行うこともできる。 上記の工程で得られた脱カフェイン化したマテ茶水抽出物のHPLCプロファイル (図1)で、330nmで最大吸収を示すクロロゲン酸、カフェオル誘導体[15]およ びフラボノイド類に典型的な少なくとも7本のピークが認められた。ポリフェノ ール画分の成分は、全てLC-MSで特性を検討した。 図4に示す典型的なマスクロマトグラム(下段には対応する330nmでのUVプロフ ァイルを示す)から7本の主要なピークが検出された。単一成分の陰イオンMSを 図5〜8に示す。ピーク1〜3はm/z 353に分子イオン[M-H]-(分子量354)とm/z 179[カフェイン酸-H]-およびm/z 191[キナ酸-H]-にイオンフラグメントパタ ー ンが認められ、カフェオルキナ誘導体の構造[16]と一致し、ピーク2は合成標準 化合物との比較でクロロゲン酸(3−O−カフェオルキナ酸)であった。ピーク 1および3は、クロロゲン酸の異性体(すなわちイソクロロゲン酸=5−O−カ フェオルキナ酸またはネオクロロゲン酸、プソイドクロロゲン酸)と同定したが 、市販の標準化合物がなかったので、明確な構造決定を行うことはできなかった 。ピーク4〜6はm/z 515に分子イオンを示し(分子量516)、m/z 353にカフェオ ル残基(162μ)を失ったことによる[M-Caff-H]-の診断的ピークとm/z 179と191 にキナ酸のジカフェオルエステルに典型的なイオン[16]を示した。分子量および フラグメントパターンに基づいて、われわれはこのポリフェノール画分から3種 類のジカフェオルエステル(すなわち、キナ酸の3,4−O−ジカフェオル、4 ,5−O−ジカフェオル、3,5−O−ジカフェオルまたは1,5−ジカフェオ ルエステル)を検出し、同定した。一方、ピーク7はm/z 609に分子イオン[M-H]- を示し(分子量610)、グリコシル誘導体に典型的なフラグメントパターンが認め られ、m/z 463[M-H-Rha]-およびm/z 301[M-H-Rha-Glu]-にイオンを示し、この最 後のイオンはケルセチンの脱プロトン化分子イオンに相当した。フラグメントパ ターンに基づき、また標準化合物のLC-MSプロファイルとの比較によって、ピー ク7の構造はルチン(ケルセチン−3−ルチノシド)と同定した。 上記の手順に従って得られたマテ茶の脱カフェイン化水抽出物における総ポリ フェノール含有量は、フォリン−シオカルト法[17]で測定したところ50±0. 8%(w/w)で、クロロゲン酸の含有量はHPLC法で分析した(図1a、ピーク 2,保持時間21.86分)ところ5.1±0.2%であり、クロロゲン酸異性 体の吸収係数が全て同じであると仮定して求めた総クロロゲン酸含有量は17. 7±0.5%(図1aのピーク1は8.2%、保持時間13.3分、ピーク3は 4.4%、保持時間23.4分)、ルチンの含有量(ピーク4,保持時間33. 68分)は1.96±0.3%であった。 調製物中のカフェイン含有量は、ほとんどの場合0.1%以下であった。 細胞フリー系、膜系および細胞系等各種の実験モデルを用い、本発明の抽出物 について抗リポ過酸化活性およびラジカル捕捉活性を検査した。抗リポ過酸化( チェーン切断)活性は、従来のマテ茶浸出液[11,12]と比較して、IC50値(8. 1対12.5μg/ml)および過酸化過程の完全阻害を示す濃度(20対37 .5μg/ml)ともはるかに高かった。安定的なラジカルDPPHのクエンチ ング効果(下記参照)として測定した脱カフェイン化抽出物の全体的な抗酸化活 性は、従来のマテ茶浸出液と比較して高かった(IC50=4μg/ml対6.2 μg/ml)。本発明に係わる抽出物のラジカル捕捉活性は、低分子量のカフェ イン酸誘導体、クロロゲン酸およびその他の同属体の存在によるものであり、こ れらの成分はHPLCおよびLC-MSを用いて完全に特性を明らかにした。さらに、試 験の結果からクロロゲン酸はラジカル捕捉剤としての活性がマテ茶抽出物よりも 弱く、脱カフェイン化マテ茶抽出物中のポリフェノール成分間に協力抗酸化相互 作用のあることが確認された(表1参照)。 マテ茶の脱カフェイン抽出物は単独または別の天然物抽出物および/または親 水性/親油性抗酸化剤、天然/合成香料等の各種物質と混合して、食品、飲料、 食物、化粧品および医薬品に使用することができ、さらに医薬品、化粧品および 栄養捕助剤の分野で従来使用されている技術にしたがって、適当な担体、賦形剤 または添加物とともに製剤にすることができる。 ポリフェノール含有量を規定した脱カフェイン抽出物は、液体、粘稠液体また は固体(粉末、顆粒等)の物理的形態であってもよい。また、糖類、麦芽デキス トリン、ガム等の適当な保持体を用いた噴霧乾燥工程で粉末にしてもよい。 さらに、本発明の目的は本発明にかかわる抽出物を含む医薬品、化粧品、栄養 補助剤/食品組成物に関する。すなわち、医薬品の形態としては錠剤、カプセル 、袋詰め、シロップ、坐薬、瓶詰め、および軟膏等、化粧品の形態としては乳化 剤、ゲル、ローションまたは粉末等、飲食物の形態としては食品、飲料および飲 食物製品等がアテローム硬化症、癌、心血管系の疾病、リューマチ性動脈炎、神 経障害(アルツハイマーおよびパーキンソン病)、老化にともなう白内障、感染性 疾病等の遊離ラジカルによる病理の予防/治療、および免疫機能の保持に抗酸化 剤およびラジカル捕捉剤として、皮膚の急激な老化および皮膚および髪の光酸化 変性の防止を目的とした光酸化防止剤として、身体の老化を防止するための栄養 補給剤として、職業アスリートのための激しい運動下の身体機能を維持するため の栄養補給剤として特に適している。 特に遊離ラジカルに起因するあらゆる種類の生理病理学的状況の防止/治療に おいて、本発明にかかわる製品はカロチノイド、ビタミンE、アスコルビン酸、 グルタチオンおよび硫黄含有アミノ酸等その他の内因性抗酸化物質と混用し、相 乗作用による抗酸化効果を最大限発揮させ、生理学的抗酸化物質プールを保存し 、維持すると有利である。 図の簡単な説明 図1−マテ茶の脱カフェイン化水抽出物のHPLCプロファイル。クロマトグラフ ィー条件:逆相カラムLC−18;移動相:100%A(0.0127N H3P O4/CH3CN/酢酸エチル=96.5/3/0.5)から30%B(CH3C N)まで30分間で直線グラジエント;流速:1ml/分;検出:UV−DAD 330nm。クロロゲン酸、カフェオル誘導体[15]およびフラボノイドに典型 的な330nmで最大吸収を示す7本のピークが検出された。 図2a−カフェイン(保持時間18.63分)およびテオブロミン(保持時間 8.28分)を含む塩化メチレン抽出物のHPLCプロファイル(検出波長270n m)。 図2b−マテ茶の脱カフェイン化水抽出物のHPLCプロファイル(検出波長27 0nm)。(カフェインの18.63分のピークおよびテオブロミンの8.28 分のピークがないことに注目)。 図3−脱カフェイン化マテ茶水抽出物のHPLCクロマトグラム(検出波長330 nm)。(a)DPPH反応前、(b)0.0625mMのDPPHで反応、( c)0.125nMのDPPHで反応、(d)0.25mMのDPPHで反応、(e) 0.5mMのDPPHで反応。 図4−脱カフェイン化マテ茶水抽出物のLC−MSプロファイル(下段はUV トレース)。実験条件:Finnigan LCQマススペクトロメーター;逆 相カラムLC−18:移動相:100%A(95%蟻酸アンモニウム/5% C H3CN、HCOOHでpH4.5)から30%B(95% CH3CN/5%蟻 酸アンモニウム、HCOOHでpH4.5)まで30分間で直線グラジエント; 流速;1ml/分;陰イオン検出 ピーク1:[M−H]-はm/z 353で、クロロゲン酸異性体。ビーク2:[M −H]-はm/z 353で、クロロゲン酸。ピーク3:[M−H]-はm/z 35 3で、クロロゲン酸異性体。ピーク4,5,6:[M−H]-はm/z 515で、 キニン酸のジカフェオルエステル。ピーク7:[M−H]-はm/z 609で、ル チン酸。 図5−ピーク1の陰イオンエレクトロスプレー(ES)マススペクトル。 図6−ピーク2および3の陰イオンエレクトロスプレー(ES)マススペクト ル。 図7−ピーク4および5のESマススペクトル。 図8−ピーク6および7のESマススペクトル。 図9−ホスファチジルコリン リポソームにおける液体過酸化反応の増殖およ び分解相における共役ジエンの時間的推移:脱カフェイン化マテ茶水抽出物のチ ェーン切断抗酸化活性。値は、5回測定の平均±S.D. 図10−脱カフェイン化マテ茶水抽出物のUVB誘導溶血反応に対する防御効 果。各種濃度の脱カフェイン化マテ茶水抽出物の存在下および非存在下で、赤血 球細胞(0.2%懸濁液)にUVBを210分間照射;溶血率は、比濁計を用い 、710nmで30分ごとに測定した。値は、5回測定の平均±S.D. 以下の実施例で、本発明をさらに詳細に説明する。 実施例1脱カフェイン化マテ茶抽出物の抗酸化およびラジカル補足活性の検定 a)2,2−ジフェニル−1−ピクリルヒドラジル(DっPH)ラジカル 各種濃度のマテ茶抽出物の存在下および非存在下でDPPHメタノール溶液の 517nmにおける吸収[18]の消失をモニターし、安定な遊離ラジカルDPPH に対する抽出物の水素転移反応によるクエンチング活性を試験した。表Iに要約 する結果から明らかなように、マテ茶抽出物のDPPHラジカルクエンチング活 性(IC50=4.2μg/ml)はクロロゲン酸(IC50=4.34μg/ml) とは同等であったが、アスコルビン酸またはビタミンE(IC50=19μg/m l)よりもはるかに高かった。段階的に濃度を上げたDPPH(0.625、0 .125、0.25、0.5mM)と反応させると、ピーク1〜7の消失が徐々 に増加した(図3)ことから、HPLC分析で検出された全ての成分(図1)が 抽 出物のDPPHクエンチングに寄与しているものと推察された。 b)超酸化アニオン マテ茶の脱カフェイン水抽出物は、フェナジンメトスルフェート/NADHシ ステムで生成した超酸化アニオンによる塩化ニトロテトラゾリウム ブルー(N BT)の還元を濃度依存的に阻害し[18]、最低有効濃度は5μg/mlで、IC50 値は15μg/mlであった。クロロゲン酸は超酸化ラジカルの捕捉活性がや や弱く、IC50は24μg/mlであった(表I)。カイネティック競合試験[18] で測定した超酸化ラジカルとマテ茶抽出物の二分子反応速度常数Kは1.2x1 05-1cm-1で、クロロゲン酸(K=0.5x105-1cm-1)と比較して高 かった。 c) ヒドロキシラジカル デオキシリボース検定法[19]を用い、脱カフェイン化マテ茶水抽出物は添加量 が増加するとチオバルビツール酸−マロンジアルデヒド(TBA−MDA)クロ モーゲンの生成を比例的に減少させることから、抽出物はHO−誘導デオキシリ ボース分解を阻害することが確認された。デオキシリボースのK値を3.1x1 09-1-1としてAruoma[19]にしたがって算出したマテ茶抽出物とHO −の反応速度常数(K)は、4.5±0.3x109-1-1であった。クロロ ゲン酸の活性はマテ茶抽出物よりもやや弱く、K値は2.1±0.2x109- 1-1であった(表I)。 よく知られているホスファチジルコリン リボソームのHO 誘導過酸化(超 音波暴露による)モデルを用い、過酸化過程の増殖期における共役ハイドロ過酸 化物の生成をモニターし[20-22]、脱カフェイン化マテ茶水抽出物のチェーン切 断抗酸化活性を測定した。マテ茶抽出物は共役ジエンの増加(誘導後6時間)を 顕著に、かつ濃度依存的に阻害し、1μg/mlで17%、5μg/mlで36 %、10μg/mlで66%、20μg/mlでは100%の阻害が認められた (IC50=8.1μg/ml)。クロロゲン酸はチェーン切断抗酸化活性がやや弱 く、IC50は18.4μg/mlであった(表I)。 さらに、図9に示すように、マテ茶抽出物で保護した試料では対照(t=6時 間)と比較して共役ジエンがプラトーに達する時間が遅く、10μg/mlでは 28時間のラグタイムの後t=34時間でプラトーに達し、最高濃度では50時 間後でも共役ジエンがプラトーに達しなかった。 e)ラット赤血球(RBC)のUVB−誘導溶解 最後に我々は細胞モデル(0.2%赤血球懸濁液)を用い、30分間隔で経時 的溶血をモニターし(710nmで汚濁を測定)、UVB暴露(0.4〜4J/c m2)により誘導される過酸化ストレス[23]に対する脱カフェイン化マテ茶水抽 出物の防御効果を評価した。UVB−誘導溶血に対するマテ茶抽出物(1〜20 μg/ml)の防御効果をクロロゲン酸(1〜20μg/ml)の防御効果と比 較した。 図10に示すように、対照では照射60分後から溶血が始まり、90〜120 分でプラトーに達した(溶血率71.2±4.8%および95.5±5.2%)。 脱カフェイン化マテ茶水抽出物ではUVB−誘導溶血の発現が顕著にかつ濃度 依存的に遅延し、10μg/mlでは30分後から、20μg/mlでは60分 後から始まった。防御効果は低濃度から始まり、90分間照射後の溶血率(%) は1μg/mlでわずか56.6±2.8%、2.5μg/mlでは33.0± 3.2%、5μg/mlでは18.2±2.6%(90分後のIC50は2.35 μg/ml)であった。クロロゲン酸は同じ濃度(データは示さず)で脱カフェ イン化マテ茶水抽出物よりも効果がやや低く、IC50値(90分間照射)は3. 2μg/mlであった。 表I−脱カフェイン化マテ茶水抽出物のラジカル捕捉活性実施例2 以下の組成からなる清涼飲料水(1000ml中) −アセスルフェームK 0.09g −アスバルテーム 0.09g −シクラメート 0.20g −マテ茶の脱カフェイン化水抽出物 1.00g −白ブドウジュース4倍稀釈液 5.00g −クエン酸 1.80g −りんご香料 1.00g −シトロン香料 0.20g −水 定容とする
【手続補正書】特許法第184条の8第1項 【提出日】平成11年4月20日(1999.4.20) 【補正内容】 請求範囲 1. 医薬品として使用するIlex種植物の脱カフェイン化抽出物。 2. 植物がIlex paraguayensis種であることを特徴とす る請求項1または2に記載する脱カフェイン化抽出物。 3. 酸化的障害に関連した病理の予防および治療のための請求項3に記載の 脱カフェイン化抽出物。 4. アテローム硬化症、癌、心血管系疾患、リュウマチ様動脈炎、アルツハ イマーおよびパーキンソン病、およびその他の老化に伴う慢性変性性病理の 予防および治療に用いる請求項3に記載の脱カフェイン化抽出物。 5. Ilex種植物の脱カフェイン化抽出物の抗酸化剤およびラジカル捕捉 剤としての使用。 6. 植物がIiex paraguayensisであることを特徴とする 請求項5に記載の使用。 7. 皮膚の早期老化および皮膚および髪の光酸化変性を防止するための化粧 品の調製を特徴とする請求項5または6に記載の使用。 8. 身体の老化防止および身体機能を維持するための栄養補給剤の調製を特 徴とする請求項5または6に記載の使用。 9. Ilex種植物の脱カフェイン化抽出物単独または別の天然物抽出物、 親水性および親油性抗酸化剤、成分または香料と混合して、適当な担体、賦 形剤または添加物とともに製剤した医薬品、化粧品または食品/栄養捕助剤 。 10. 液体、粘稠液体または固体の形態である請求項10に記載の組成物。 11. 錠剤、カプセル、袋詰め、シロップ、坐薬、瓶詰め、および軟膏、乳化 剤、ゲル、ローションまたは粉末、栄養捕助剤、食品、飲料水いずれかの形態で ある請求項11に記載の組成物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 7/48 A61K 7/48 A61P 9/00 A61P 9/00 9/10 101 9/10 101 25/16 25/16 25/28 25/28 29/00 101 29/00 101 35/00 35/00 C09K 15/34 C09K 15/34 (72)発明者 カリニ、マリナ イタリア国 イ―20131 ミラノ 42 ヴ ィアレ アブルッズィ イスティテュト キミコ ファーマセウティコ トッシコロ ジコ ユニヴァーシタ デグリ ステュデ ィ ディ ミラノ(番地なし) (72)発明者 マリアニ、マルコ イタリア国 イ―20099 セスト サン ジョヴァンニ 508 ヴィアレ フラテリ カシラジ(番地なし)

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. Ilex種の植物の脱カフェイン化抽出物。 2. カフェインの含有量が0.1重量%以下である請求項1に記載する抽出 物。 3. Ilex paraguayensis種の植物から得た請求項1〜2 に記載する抽出物。 4. クロマトグラフィープロファイルが基本的に図1に示すものと一致する 請求項1〜3に示す脱カフェイン化抽出物。 5. LC−MSプロフィールが基本的に図4に示すものと一致する請求項1 〜3に示す脱カフェイン化抽出物。 6. ポリフェノールリッチ脱カフェイン化抽出物の調製工程であって、 −Ilex paraguayensisの葉を乾燥し、微粉砕し、沸騰水で処 理し、 −その前、またはその後カフェインを抽出し、 −最後に、水溶性残渣を乾燥する ことからなる工程。 7. カフェインの抽出を塩素系溶媒で行うことを特徴とする請求項6に記載 の工程。 8. 前記溶媒が塩化メチレンであることを特徴とする請求項7に記載の工程 。 9. カフェインの抽出を液固抽出、液液抽出、クロマトグラフィー分離、超 臨界抽出または臨界未満抽出によって行うことを特徴とする請求項6に記載 の工程。 10. 請求項6〜9に記載の工程によって得られるポリフェノールリッチ脱カ フェイン化抽出物。 11. 請求項1〜5および10に記載した抽出物の抗酸化剤/ラジカル捕捉剤 としての使用。 12. 請求項11に記載した抽出物の液体、粘稠液体または固体の形態での使 用。 13. 請求項1〜5および10に記載した抽出物のアテローム硬化症、癌、心 血管系疾患、リュウマチ様動脈炎、アルツハイマーおよびパーキンソン病、 およびその他の加齢に伴う慢性変性性病理の予防および治療用の医薬品の調 製への使用。 14. 請求項1〜5および10に記載した抽出物の皮膚の早期老化および皮膚 および髪の光酸化変性を防止するための化粧品としての使用。 15. 請求項1〜5および10に記載した抽出物の身体の老化防止および職業 アスリートのための激しい運動下の身体機能を維持するための栄養補給剤の 調製への使用。 16. 請求項1〜5および10に記載した抽出物単独または別の天然物抽出物 、親水性および親油性抗酸化剤、成分または香料と混合して、適当な担体、 賦形剤または添加物とともに製剤した医薬品、化粧品または食品/栄養捕助 剤。 17. 錠剤、カプセル、袋詰め、シロップ、坐薬、瓶詰め、および軟膏、乳化 剤、ゲル、ローションまたは粉末、栄養捕助剤、食品、飲料の形態とした請 求項16に記載の組成物。
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