JP2001513333A5

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Publication number: JP2001513333A5
Application number: JP2000506994A
Authority: JP
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2008-10-02

Description

ＩＶ．β６ノックアウトマウスは肺転移率を減少させた。
自然に転位性乳癌を発症する遺伝子導入マウス系統（ＭＭＴＶ−ｍＴＡｇマウス）をβ６ノックアウトマウスと交配した。β６を欠いている子マウスは急速に増殖する原発性乳腺腫瘍を発症したが、β６を発現している同腹の子マウスと比較して肺転移率および転移の程度は大きく減少した。免疫組織化学的に、β６は転移病巣端周囲で強く発現されることが示された。このことは、β６はこのモデルで最大の転移に必要であることを提唱している。

インテグリンは、２つのサブユニット、αおよびβで構成された異種二量体細胞粘着レセプターである。インテグリンαｖβ６は、主に上皮細胞で発現されるフィブロネクチンおよびテナシンレセプターである。健常な霊長類の成人組織では、β６ｍＲＮＡおよびタンパク質はほとんど検出されないが、β６は、胎児の発育時、創傷治癒時、およびいくつかの上皮性腫瘍で発現される。β６サブユニットが結腸癌細胞株で発現されるとき（ここには通常は存在しない）、このサブユニットの発現によって増殖能力が強化される。β６サブユニットに固有の１１アミノ酸のＣＯＯＨ末端領域がαｖβ６インテグリンの増殖強化活性に必要である（Agrez et al., J. Cell. Biol. 127:547-556(1994)）。β６の発現は、生菌の注射によって惹起される損傷時のＩＩ型肺胞上皮細胞で誘発され、β６の発現は、肺または腎の慢性または急性炎症をもつ患者の多様な臨床標本と同様に不顕性炎症の病巣部位で認められる（Breuss et al., J. Cell Sci. 108:2241-2251(1995）。

ホアンら（Huang et al., J. Cell Biol. 133:921-928(1996))は、β６サブユニットをコードする遺伝子のヌル変異について同型接合体のマウスは、マクロファージの皮膚への浸潤を伴う若年禿頭症を有し、肺の誘導気道周囲に活性化リンパ球を蓄積させることを開示した。

Ｉ．序
肺線維症は、白血球から遊離される生成物の有害作用によるものと考えられる一般的疾患である。呼吸系上皮は線維症の発生時に損傷を受けるが、上皮細胞自体がこの過程の一因であることは以前には示されなかった。我々は、ただ１つのインテグリンサブユニット（β６）遺伝子のヌル変異を発現しているマウスに対するブレオマイシン（肺線維症を惹起することが知られている薬剤）の作用を調べた（この遺伝子は完全に上皮細胞に限定されている）。β６−／−マウスは、ブレオマイシン誘発線維症から劇的に防御された。したがってこのインテグリンを標的とする治療法は、大部分が治療不能のこの疾患について新規な治療方針を提供する。

【図１Ａ】
β６インテグリンサブユニットのヌル変異を発現しているマウスの肺ヒドロキシプロリン含有量をブレオマイシン（ｂｌｍ）または食塩水（ｓａｌ）の存在下でコントロールマウスと比較したグラフである。

前記組成物は、急性肺損傷または線維症をもつ患者またはそのようなリスクを有する患者に治療的または予防的に提供できる。例えば、毒性吸入剤に暴露された患者はそのような暴露後におそらく治療できるであろうし、一方、ブレオマイシンを投与される患者は予防的および／または治療的に処置できる。典型的には、本発明の組成物は、毎日を基準として少なくとも１〜５日間投与されるが、既に肺線維症が定着した患者、進行している患者には数カ月または数年の期間治療的用量を投与できる。本明細書で用いられるように、"治療的用量"とは、患者の症状の重篤度を予防し、軽減し、減少し、あるいは低下させる用量である。

本発明のいくつかの実施態様では、アンチセンス核酸分子がαｖβ６の拮抗物質として用いられる。アンチセンス核酸分子は、特定のヌクレオチド配列と結合し標的タンパク質の産生を抑制するようにデザインされた相補性核酸ヌクレオチド鎖である。β６インテグリンサブユニットのヌクレオチド配列はＵＳＳＮ０７／７２８２１５号（１９９１年７月１１日出願）で開示されている（この文献は参照により本明細書に含まれる）。これらの物質は単独または他の拮抗物質と併用して用いることができる。アンチセンス拮抗物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＲＮＡとして提供できる（例えば以下を参照のこと：Murayama et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:109-114(1997))。アンチセンス遺伝子はまた、ウイルスベクターに入れて（例えばＢ型肝炎ウイルスに入れて（例えば以下を参照のこと：Ji et al., J. Viral Hepat. 4:167-173(1997)）；アデノ付随ウイルスに入れて（例えば以下を参照のこと：Xiao et al., Brain Res. 756:76-83(1997))；またはＨＶＪ（センダイウイルス）−リポソーム遺伝子供給系（例えば以下を参照のこと：Kaneda et al., Ann. NY Acad. Sci. 811:299-308(1997))を含む（ただしこれに限定されないが）他の系に入れて）；"ペプチドベクター"の状態で（例えば以下を参照のこと：Vidal et al., CR Acad. Sci. III32:279-287(1997))；エピソームベクターまたはプラスミドベクター中の遺伝子として（例えば以下を参照のこと：Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:6450-6455(1997); Yew et al., Hum. Gene Ther. 8:575-584(1997)）；ペプチド−ＤＮＡ凝集物中の遺伝子として（例えば以下を参照のこと：Niidome et al., J. Biol. Chem. 272:15307-15312(1997)）；"裸のＤＮＡ"として（例えば米国特許第５５８０８５９号および米国特許第５５８９４６６号を参照のこと）；および脂質ベクター系に入れて（例えば以下を参照のこと：Lee et al., Crit. Rev. Ther.
Drug Carrier Syst. 14:173-206(1997)）提供できる。

本発明の組成物は投与方法に応じて種々のユニット製剤として投与できる。例えば、経口投与に適したユニット製剤には、固形製剤（例えば粉末、錠剤、ピル、カプセル、および糖衣丸）および液状製剤（例えばエリキシル、シロップ、および懸濁液）が含まれる。活性成分はまた滅菌液状製剤として非経口的に投与してもよい。ゼラチンカプセルは、活性成分および不活性成分として粉末化担体（例えばブドウ糖、乳糖、蔗糖、マンニトール、澱粉、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムなど）を含む。所望の色、味、安定性、緩衝能、分散性または他の既知の所望の特徴を付加することができる付加的不活性成分の例には、べんがら、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用ホワイトインクなどである。同様な希釈剤を圧縮錠剤の製造に用いることができる。錠剤もカプセルも、数時間にわたる医薬の持続的放出を提供するために持続放出製品として製造できる。圧縮錠剤は、不快な味を隠蔽し、かつ錠剤を大気から保護するために糖衣とするか、またはフィルム被覆してもよいし、また胃腸管における選択的崩壊のために腸溶皮で被覆してもよい。経口投与のための液状製剤は、患者が受け入れ易くするために着色料および香料を含むことができる。
医薬製剤中の本発明の組成物の濃度は大きく変動することが可能で、すなわち重量で約０．１％未満から（通常約２％または少なくとも２％）２０％、５０％またはそれ以上で、さらに選択した具体的な投与態様にしたがって主として溶液の体積、粘度によって選択できる。

本発明の組成物はまたリポソームを介して投与できる。リポソームには乳液、泡沫、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、層板などが含まれる。これらの調製物では、供給されるべき本発明の組成物は、単独または所望の標的と結合する分子（例えば抗体）もしくは他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と合わせて、リポソームの一部分として包含される。したがって、本発明の所望の組成物を充填または添加したリポソームを全身的に供給してもよいし、また問題の組織にリポソームを誘導し、続いて前記組織でリポソームが選択した治療用ペプチド／免疫原性ペプチド組成物を供給することができる。

本発明の組成物を含有するリポソーム懸濁液は、静脈内、局部的、局所的等で投与できるが、その投与量はとりわけ投与態様、供給される本発明の組成物および処置される疾患の段階にしたがって変動させることができる。
固形組成物の場合は、通常の無毒な固形担体を用いることができるが、これらには例えば医薬等級のマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、ブドウ糖、蔗糖、炭酸マグネシウムなどが含まれる。経口投与の場合は、通常用いられる賦形剤（例えば先に列挙したような担体）のいずれか、および一般に１０〜９５％の活性成分（すなわち本発明の１つまたは２つ以上の組成物）をより好ましくは２５％〜７５％の濃度で包含させることによって、医薬的に許容できる無毒な組成物を形成することができる。

肺線維症は、白血球から遊離された生成物の有害作用によるものと考えられる一般的な疾患である（例えば以下を参照のこと：Marshall et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 29:107-120(1997))。ブレオマイシン誘発肺損傷および肺線維症はリンパ球の動員および活性に付随し、かつそれらに左右されるであろう（D.J. Schrier et al., Am. J. Pathol. 116:270-278(1984))。"抗サイトカイン"治療の使用は、肺実質の損傷および肺線維症の推奨される治療法である（Coker et al., Thorax 52(2):294-296(1997)）。

我々は、β６−／−マウスは皮膚および気道における単核細胞炎症反応の増幅を示すことを以前に報告した（X.Z. Huang et al., J. Cell. Biol. 133:921-928(1966))。ブレオマイシン誘発肺損傷および肺線維症は、リンパ球の動員および活性化に付随するが、さらにそれらに左右される可能性がある（D.J. Schrier et al., Am. J. Pathol. 116:270-278(1984))。β６−／−マウスのブレオマイシン誘発損傷および線維症に対する抵抗性はリンパ球動員または活性化の変化によるものか否かを決定するために、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球を計数し、さらに処置後５日および１５日の食塩水またはブレオマイシン処置マウスの細切肺から得た細胞のインターロイキン２−レセプター（ＣＤ２５）の発現を測定することによってリンパ球の活性化を検定した。我々の初期の報告と一致して、野性型動物の場合よりも多くのＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ２５＋細胞がβ６−／−マウスの肺に存在した。ブレオマイシンは、野性型およびβ６−／−マウスの両方でＣＤ４およびＣＤ８発現リンパ球数の大きな増加を誘発し、さらにＣＤ２５を発現するリンパ球の百分率を増加させた（図３）。野性型およびβ６−／−マウスの両方で、肺リンパ球の動員および活性化はブレオマイシン投与後５日が最大で、１５日までに低下し始めた。いずれの理論にも拘束されないが、これらのデータは、β６−／−マウスでのリンパ球動員および活性化の不足が、ブレオマイシンの有害な肺への影響の防御をもたらしたのではないであろうということを示唆している。

【図３】
ブレオマイシン（ｂｌｍ）または食塩水（ｓａｌ）の投与後のβ６−／−マウスと野性型（β＋／＋）マウスでリンパ球の動員を比較したグラフである。

Ｂ．モノクローナル抗体の性状決定
ネズミのαｖβ６に対する抗体を作製するために、分泌ヒトαｖβ６およびネズミのケラチノサイトを１２９／Ｃ５７由来のβ６−／−マウスでの免疫原として用いた。作製したハイブリドーマの上清を、擬似トランスフェクトＳＷ４８０細胞およびβ６トランスフェクトＳＷ４８０細胞で分染についてスクリーニングした。得られた抗体ＣＳβ６および１０Ｄ５は、ＳＷ４８０細胞上で発現されているヒトβ６および野性型ケラチノサイト上のマウスβ６の両方を染色した。（³⁵Ｓ）標識ネズミケラチノサイト溶解物の免疫沈澱によって、ＣＳβ６の性状をさらに調べた。この抗体は、β６＋／＋ケラチノサイト由来のαｖβ６である適切な分子量の異種二量体は沈澱させたが、β６−／−ケラチノサイト由来のものは沈澱させず、これらの抗体はインテグリンαｖβ６に特異的であることを示した。

Ｃ．細胞粘着アッセイ
非組織培養用処理を施された９６穴（ウェル）のポリスチレン多穴マイクロタイタープレート（Linbro/Titertek, Flow Laboratories, McLean, VA）にビトロネクチン、フィブロネクチンまたはコラーゲンを被覆した。種々の量のマトリックスを含有する１００μｌの溶液をウェルに加え、３７℃で１時間保温した。保温後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、続いて血清非含有ＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡで３７℃で３０分ブロッキングした。コントロールウェルにはＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡを満たした。細胞は移動アッセイと同じ方法で採集し、血清非含有ＫＧＭ中に再懸濁し、続いてＰＭＡの存在下または非存在下で各タンパク質で被覆したウェルに加えた。遮断実験の場合は、細胞はプレートに播く前に４℃で５分抗体とともに保温した。このプレートは、湿潤な７％ＣＯ₂中で３４℃で１時間保温する前に１０ｘｇで５分遠心（上部を上に向けて）した。非粘着細胞は上部を下に向けて４８ｘｇで５分遠心して除去した。粘着細胞は１％ホルムアルデヒドで固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色し、続いてＰＢＳでウェルを洗浄した。マイクロプレート読み取り装置（Bio-Rad)で５９５ｎｍの吸収を測定することによって、各ウェルの相対細胞数を検定した。

Ｄ．移動アッセイ
細胞移動アッセイは、マトリックス被覆トランスウェル型プレート（８μｍ孔、Costar, Cambridge, MA)で実施した。ＰＢＳ中のコラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）、フィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）またはビトロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）で膜の下面を３７℃で１時間被覆し、さらに１％ＢＳＡでブロッキングした。初代培養ケラチノサイトをトリプシン／ＥＤＴＡで採集し、トリプシンはダイズトリプシン抑制物質で不活化した。細胞を血清非含有ＫＧＭ中に懸濁させ、さらにフォルボルミリステートアセテート（ＰＭＡ、１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、非存在下でウェル当たり１００μｌの培養液中３．６ｘ１０⁴の密度で上部小室で平板培養した。抑制実験の場合は、上部小室および下部小室に抗体をＰＭＡの存在下で添加した。６時間保温した後、細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、１％ホルムアルデヒド中の０．５％クリスタルバイオレットで染色した。上部小室の細胞を除去し、下面の細胞を高倍率（４０ｘ）で１０ｘグリッドを用いて計数した。多数の視野を数え、各被験条件について平均した。

２：β６ノックアウトまたは野性型マウスのどちらかの腫瘍に由来する細胞株を同系の野性型のマウスに注射した。野性型細胞株は例外なく肺腫瘍を生じ、一方ノックアウト細胞株はそうではなかった。この実験は、腫瘍細胞β６はこの系で最大の転移に必要であることを提唱している。