MXPA00001196A - Tratamiento de lesion agudadel pulmon y de la fibrosis con antagonistas de alfavbeta6 - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a uso de un anticuerpo y composiciones que comprenden antagonistas de alfavß6 para tratamiento de lesión aguda y fibrosis de riñón.

Description

TRATAMIENTO DE LESIÓN AGUDA DEL PULMÓN Y DE LA FIBROSIS CON ANTAGONISTAS DE aVßß DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Este trabajo fue apoyado en parte por el donativo ^ del NIH, cuyos números HL47412 y HL53949. El gobierno de los Estados Unidos podría tener ciertos derechos en este invento . Los integrinos son receptores celulares heterodinámicos de adhesión celular compuestos de dos subunidades, a y ß. El integrino avßd es un receptor de fibronectina y uno de tenascina, manifiestos predominantemente en las células epiteliales. En los tejidos de un primate adulto saludable, ad, ARNm y la proteína son raramente detectados, aunque ßd se manifiesta durante el desarrollo fetal, en la curación de heridas, y en algunos tumores epiteliales. Cuando la subunidad ß6 se manifiesta en una serie de células en un carcinoma de colon, del cual está normalmente ausente, la manifestación de la subunidad le confirma mayor habilidad para proliferar. Se requiere una región de 11 aminoácidos terminados en COOH, única para la unidad ß6, para la actividad aumentada de proliferación del integrido avßd (Agrez et al. J. Cell. Biol. 127:547-556 (1994). La manifiestación de ßd se induce en el tipo II de células epitaleales alveorales durante un herida causada por la infección de bacterias, y la manifestación de ß6 se observa en sitios focales de inflamación subclínica, como también en una variedad de especímenes clínicos de pacientes con inflamación crónica o aguda de los pulmones o ríñones (Breuss et al., J.Cell Sci. 108:2241-2251 (1995). Huang et al. (J. Cell.Biol. 133:921-928 (1996) descubrió el homozigoto de los ratones, debido a que ninguna mutación en el gen que codifica la subunidad ß6 tiene la calvicie juvenil asociada con la infiltración de macrófagos en la piel, y con acumulación de actividad de linfocitos alrededor de los conductos aéreos de los pulmones . La fibrosis pulmonar es una enfermedad común, , a pesar de deberse al efecto destructivo de los productos que sueltan los leucoticos (ver por ejemplo, Marshall et al., Int. J. Biochem. Cell Bio. 29:107-120 (1997)). La lesión pulmonar inducida por bleomicina y la fibrosis pulmonar son asociadas con, y pueden depender del reclutamiento y activación de los linfocitos (Schrier, D.J. et al., Am. J. Pathol. 116-270-278 (1984)). Entre las terapias propuestas para la lesión de pulmón parenquimal y la fibrosis pulmonar está el uso de las aproximaciones terapéuticas de la "anticitocina" (Coker et al. Thorax 52 (2): 294-296 (1997) ) .

Sin embargo, las terapias normales para la lesión aguda de pulmón y la fibrosis pulmonar son bastante inadecuadas (ver, por ejemplo, King et al., "Idiopathyic Pulmonary Fibrosis and other Interstitial Lung Diseases of Unknown Etiology, " en Textbook of Respiratory Medicine, Murray and Nadel, eds., W.B. Saunders, Philadelphia, PA. Pp. 1827-1839 (1994)). Por lo que existe la necesidad de terapias para la lesión aguda pulmonar y la fibrosis pulmonar. El presente invención se dirige a esta necesidad y a otras. Un aspecto de la invención es un método que trata la lesión aguda del pulmón en un paciente que consiste en administrar al paciente una dosis terapéutica de un antagonista de avß6. La invención también provee métodos de inhibir la metástasis del pulmón que comprende administrar al paciente una dosis terapéutica de un antagonista de avß6. Un aspecto adicional de la invención es un método de tratar la fibrosis en un paciente que comprende el administrar al paciente una dosis terapéutica de un antagonista de avßd. Otro aspecto de la invención es un anticuerpo monoclonado producido por el hibridoma ATCC HB12382. Un aspecto más de la invención es ' el hibridoma ATCC HB12382.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1A es una gráfica que compara el contenido del hidroxiprolina del pulmón en los ratones, que no manifiesta ninguna mutación en el gen ßd de la subunidad del integrino con ratones de control en presencia de bleomicina (blm) o de una solución salina (sal) . La Figura IB es una fotografía de teñido de tres colores de secciones de pulmón a bajo aumento, que demuestra la densa acumulación de una matriz extracelular de colágeno en los pulmones de ratones de tipo silvestre tratados con bleomicina (ßd+/+) , pero no con ratones tratados con ß6-/-, 30 días después del tratamiento. La Figura 2 es una gráfica que compara el incremento en el agua de los pulmones de los ratones silvestres (ßd+/+) comparados con los ratones ßd-/- en presencia de bleomicina (blm) o solución salina (sal) . La Figura 3 es una gráfica que compara el reclutamiento de los linfocitos en los ratones silvestres (ß6+/+) y ß6-/-, después de la administración de bleomicina (blm) o solución salina (sal) . La presente invención provee métodos y compuestos para el tratamiento de la lesión aguda del pulmón, tales como pero, no limitados a la lesión del pulmón que resulta por sepsia bacterial, choque hemorrágico, inhalación tóxica, y blemocina u otra droga que induzca la lesión pulmonar. Además, las composiciones de la invención son útiles en el tratamiento de la fibrosis en órganos epiteliales, tales como el pulmón, hígado, ríñones, vejiga y esófago. Tales composiciones pueden proveerse profiláctica o terapéuticamente a pacientes que tengan o que estén en riesgo de tener síntomas de lesión aguda pulmonar o de fibrosis. Por ejemplo, pacientes que hayan estado expuestos a inhalaciones tóxicas querrían ser tratados después de tal exposición, puesto que un paciente que recibe bleomicina puede ser tratado profiláctica y/o terapéuticamente. En forma típica, las composiciones de la invención se administran con una base diaria por lo menos durante un periodo de 1 a 5 días, sin embargo, pacientes con fibrosis pulmonar establecida, es decir una enfermedad progresiva, pueden recibir dosis terapéuticas por periodos de meses o años. Como se usa en la presente, "dosis terapéutica" es una dosis que previene, mitiga, abate, o reduce de alguna forma la severidad de los síntomas en un paciente. En algunas modalidades de la invención, se proveen antagonistas de avßd. Tales antagonistas incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos que específicamente enlazan con el ßd; los anticuerpos que específicamente enlazan con un ligando avßd; los ligandos para avß6; ácidos nucleicos en contrasentido; y péptidos; no péptidos, y análogos peptidomiméticos de tales ligandos . Los" anticuerpos pueden ser sintéticos, monoclonales, o policlonales y pueden ser hechos por técnicas bien conocidas en la técnica. En una modalidad preferida, el antagonista es un anticuerpo que específicamente reconoce la región citoplasmática de una subunidad ßd (por ejemplo, ver Weinacker et al. J. Cell . Biol . 269:1-9 (1994)). Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos monoclonales "humanos" que tienen regiones humanas constantes y variables son con frecuencia preferidos, para minimizar la respuesta inmune de un paciente contra el anticuerpo. Tales anticuerpos pueden generarse inmunizando animales transgénicos que contengan genes de inmunoglobulina humana. Ver Jakobovits et al. Ann NY Acad Sci 764:525-535 (1995). En relación con los anticuerpos sintéticos y semisintéticos, tales términos pretenden abarcar, pero no limitar fragmentos de anticuerpos, de anticuerpos de isótopo conmutados, anticuerpos humanizados (por ejemplo, ratón humano, humano-ratón y similares) , híbridos, anticuerpos que tienen especificaciones plurales, anticuerpos en forma de moléculas completamente sintéticas, y similares. Como se discutió en lo siguiente, los anticuerpos pueden ser separados por su habilidad para bloquear la ligadura de un ligando con el avßd y/o por otras propiedades, tales como la capacidad para proteger in vivo contra la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina. Un anticuerpo ejemplar del anti-ßd monoclonado es el 10D5 (ATCC-depósito no. HB12382, depositado el 6 de agosto de 1997) . En otras modalidades de la invención, los antagonistas usados son péptidos, polipéptidos, proteínas, o peptidomiméticos diseñados como ligandos para avßd, con base en la presencia del ácido arginina-glicina-aspártico (RGD) , cuyo campo es la adhesión celular. El diseño de tales moléculas como ligandos para los integrinos se ejemplifica, por ejemplo, en Pierschbacher et al., J. Cell.

Biochem. 56:150-154 (1994)); Ruoslahti, Ann. Rev. Cell.Dev. Biol. 12:697-715 (1996); Chorev et al., Biopolymers 37:367-375 (1995)); Pasqualini et al., J. Cell. Biol. 130:1189-1196 (1995)) y Smith et al., J.Biol. Chem. 269:32788-32795 (1994) ) . En algunas modalidades de la invención, las moléculas del ácido nucleico antisentido son usadas como antagonistas de avß6. Las moléculas del ácido nucleico en contrasentido son hebras oligonucleótidos complementarios de los ácidos nucleicos designados para enlazar a una secuencia específica de nucleótidos que inhiban la producción de una proteína objetivo. La secuencia de nucleótidos de la subunidad ßd del integrino se describe en U.S.S.N. 07/728.215, presentada el 11 de julio de 1991, incorporada en la presente para referencia en su totalidad. Estos agentes pueden usarse solos o en combinación con otros antagonistas. El antagonista antinsentido es provisto como un oligonucleótido antisentido tal como el ARN (ver por ejemplo, Murayama et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:109-114 (1997)). os genes antisentido también pueden ser provistos en un vector viral, tal como por ejemplo, en el virus de la hepatitis B (ver, por ejemplo, Ji et al., J.

Viral Hepat, 4:167-173 (1997)); en el virus adeno asociado (ver por ejemplo, Xiao et al. Brain Res. 756:76-83 (1997)), o en otros sistemas que incluyan pero no limitan a un HVJ • (Sendai virus) del sistema de distribución de genes del liposoma (ver por ejemplo, Kaneda et al., Ann . N.Y. Acad.Sci. 811:299-308 (1997)), un "vector péptido" (ver por ejemplo, Vidal et al. CR Acad.Sci III 32): 279-287 (1997)), como un gen en un vector episomal o plásmido (ver por ejemplo, Cooper et al. Proc. Nati. Acad.Sci. U.S.A. 94:6450- 6455 (1997), Yew et al. Hum Gene Ther, 8:575-584 (1997)), como un gen en un agregado péptido de ADN (ver por ejemplo, Niido e et al. J. Biol. Chem. 272:15307-15312 (1997)); como "ADN puro" (ver por ejemplo, U.S. 5,580,859 y U.S. 5,589,466); y en los sistemas de vectores lipidíeos (ver por ejemplo, Lee et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 14:173-206 (1997) ) . Los candidatos antagonistas para avßd pueden ser separados por su función con una variedad de técnicas ya conocidas en la técnica y/o descubiertas dentro de la presente solicitud, tales como la protección contra la fibrosis inducida por la bleomicina en un ratón de pruebas; la inhibición de la proliferación de células tumorales (Agrez et al., J.Cell Biol. , 127 : 547-556 (1994)), e inhibición de la migración de las células y/o la inhibición de las células de adhesión (ver la Sección de Ejemplos Experimentales) . Una multitud de fórmulas apropiadas de antagonistas de la invención pueden encontrarse en un formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Pharmaceutical Sciences de Remington (15th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1975), particularmente el capítulo 87, por Blaug, Seymour, en la presente. Estas formulaciones incluyen por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, bases de absorción anhídridas, emulsiones de aceite en agua o agua en aceite, emulsiones carbowax (glicoles de polietileno de varios pesos moleculares), geles semisólidos, y mezclas semisólidas que contengan carbowax.

Las cantidades de ingredientes activos necesarios - para la efectividad terapéuticas dependerán de varios factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. Por lo tanto, las dosis de tratamiento deberán ser tituladas para optimizar la seguridad y la eficacia. De manera típica, las dosis usadas in vitro pueden proveer una guía útil de las cantidades útiles para la administración in situ de los ingredientes activos. Las dosis efectivas en animales de prueba para el tratamiento de enfermedades particulares proveerán indicaciones que ayuden a predecir la dosis para .humanos. Varias consideraciones se describen por ejemplo, en Goodman and Gilman 's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Edition (1985), MacMillan Publishing Company, New York. And Remington's Pharmaceutical Sciences 18th Edition, (1990) Mack Publishing Co, Easton Penn. Los métodos para la administración se discuten en la presente, incluyendo la vía oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, nasal, iontoforética, y similares . Las composiciones de la invención pueden administrarse en una variedad de formas unitarias de dosificación dependiendo en el método de administración. Por ejemplo, las unidades de dosificación adecuadas para la administración oral incluyen formas de dosificación sólida tales como el polvo, tabletas, pildoras, cápsulas, grageas, y formas de dosificación líquida, tales como elíxires, jarabes, y suspensiones. Los ingredientes activos también pueden administrarse parenteralmente en dosis líquidas estériles. Las cápsulas de gelatina contienen ingredientes • activos e ingredientes inactivos, o sea portadores, en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidón, celulosa o derivados de la celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina de sodio, talco, carbonato de magnesio y similares. Ejemplos de los ingredientes inactivos adicionales que pueden agregarse para proporcionar un color, sabor, estabilidad, capacidad de amortiguación, dispersión deseables u otras características deseables son el óxido de hierro rojo, gel de sílice, laurilsulfato de sodio, dióxido de titanio, tinta blanca comestible y similares. Diluyentes similares pueden usarse para comprimir tabletas. Ambas tabletas y cápsulas pueden ser fabricadas como productos exentos de apoyo, para proveer una continua administración del cedicamento por periodos de horas. Las tabletas comprimidas pueden estar cubiertas con azúcar o cubiertas con una película para enmascarar cualquier sabor indeseable y proteger la tableta de la atmósfera, o tener una capa entérica para una desintegración selectiva en el tracto gastrointestinal. Las dosis de forma líquida para administración oral pueden contener colorantes y saborizantes para incrementar la aceptación del paciente. La concentración de las composiciones de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, desde menos de 0.1% , usualmente hasta por lo menos 2% o cuando mucho 20% al 50%, o más por peso, y serán seleccionados primeramente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el particular modo elegido de administración. Las composiciones de la invención pueden también administrarse vía liposomas. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líguidos dispersiones de fosfolípidos, capas lamelares y otras parecidas. En estas preparaciones la composición de la invención a ser suministradas se incorporan como parte de un liposoma, solo o en conjunto con una molécula que une a un blanco deseado, tal como un anticuerpo, o con otros compuestos terapéuticos o inmunogénicos. Así, los liposomas ya sea llenos o salpicados con una composición deseada de la invención puede liberar sistemáticamente o puede ser dirigido hacia un tejido de interés, en donde los liposomas entonces liberen los compuestos terapéuticos/inmunogénicos péptidos seleccionados.

Los liposomas que se usan en la invención provienen de lípidos normales que forman vesículas, las que generalmente incluyen fosfolípidos cargados neutral y negativamente y un esterol, tal como el colesterol. La selección de los lípidos es guiada generalmente considerando por ejemplo, el tamaño de liposoma, su sensibilidad acida y su estabilidad en la corriente sanguínea. Una variedad de métodos están disponibles para preparar los liposomas, como se describe por ejemplo, en Szoka et al. Ann Rev. Biophys Bioeng 9:467 (1980), Patentes Norteamericanas Nos . , 235, 871, 4,501,728, 4,837,028 y 5,019,369, incorporadas en la presente para referencia. Una suspensión de liposoma que contenga una composición de la invención puede administrarse intravenosa, local, tópicamente, etc., en una dosis que varía de acuerdo con inter alia, la manera de la administración, la composición de la invención que se esté - liberando y el estado de la enfermedad a tratar. Para las composiciones sólidas, se. pueden usar vehículos sólidos no tóxicos convencionales, que incluyen, por ejemplo, graduaciones farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Para la administración oral, un compuesto farmacéutico aceptable no tóxico se forma incorporando los excipientes empleados normalmente, tales como los vehículos previamente listados, y generalmente del 10-95% de un ingrediente activo, esto es, una o más composiciones de la invención y más preferiblemente en una concentración del 2 D "S — / O "6. Para// la administración en aerosol, las composiciones de la invención son preferiblemente proporcionadas divididas muy finamente, con un tensioactivo y un propelente. Los porcentajes típicos de las composiciones de la invención son de 0.01%-20% por peso, preferiblemente del 1%-10%. El tensioactivo debe, por supuesto, ser no tóxico y preferiblemente soluble en el propelente. Representantes de tales agentes son los esteres o esteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, octanoico, laúrico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol alifático polihídrico o su anhídrido cíclico. Esteres mezclados tales como los glicéridos naturales o mezclados pueden emplearse. El tensioactivo puede constituir del 0.1%-20% por peso de la composición, preferiblemente del 0.25%-5%. El equilibrio de la composición es ordinariamente el propelente. Un • vehículo puede también incluirse, si se desea, con por ejemplo, lecitina para distribución intranasal.

Los materiales de la invención pueden adicionalmente ser liberados en un sistema de tipo depósito, en una forma encapsulada, o en un implante con técnicas bien conocidas en el área. Similarmente, los materiales de la invención pueden ser liberados a través de * una bomba hacia un tejido señalado. Cualquiera de las formulaciones anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, siempre que el agente activo en la fórmula no sea activado por ésta y que la fórmula sea fisiológicamente compatible. Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar ciertos aspectos de la presente invención y no intentan limitar el tema de la materia. EJEMPLOS EXPERIMENTALES 1. Introducción La fibrosis pulmonar es una enfermedad común a pesar de deberse a los destructivos efectos de los productos liberados por leucocitos. Aunque el epitelio respiratorio se daña durante el desarrollo de la fibrosis, no se ha probado anteriormente que las células epiteliales mismas contribuyan a ese proceso. Examinamos los efectos de la bleomicina, una droga conocida como que provoca que la fibrosis pulmonar, en los ratones, que no manifiestan ninguna mutación en ningún gen de la subunidad (ßd) del integrino, que está .completamente restringido a las células epiteliales. Los ratones ßd-/-fueron notablemente protegidos de la fibrosis inducida por la bleomicina. Las terapias que tienen como objetivo este integrino podrán a partir de esto, proveer nuevos alcances para el tratamiento de esta enfermedad, ampliamente sin tratamiento El integrino avß6 se manifiesta exclusivamente en las células epiteliales, principalmente, durante la organogénesis y en respuesta a una lesión. Los ratones ß6-/- tienen una exagerada reacción inflamatoria a una lesión cutánea o de las vías aéreas, pero se desarrollan y se reproducen normalmente (Huang, X.Z., et al., J.Cell Biol. 133:921-928 (1996) ) . II . Inactivación del gen de la Subunidad ß6 del Integrino que Protege a los Ratones contra la Fibrosis Pulmonar Inducida por Bleomicina La toxicidad pulmonar de la bleomicina (0.03 unidades (u) en 60 µl de solución salina) o un vehículo de solución salina (60 µl) dado por una inyección intratraqueal se examinó en ratones silvestres de la misma edad y sexo (ßd+/+) y en ratones ßd-/- de la especie de 129SVEMS/ter .sepa La fibrosis pulmonar se evalúo en 15, 30 y 60 días después del tratamiento examinando la morfología del pulmón, inhibiendo su contenido de hidroxiprolina, que es un índice de la sedimentación del colágeno. La fibrosis fue significativa en los ratones silvestres tratados con bleomicina por 30 días y progresó hasta los 60 días (Figuras ÍA -IB) . En contraste, en la morfología del pulmón _ de los ratones ß6-/-, permanecieron casi normales a través del experimento, con sólo pequeñas manchas de fibrosis; y el contenido en el pulmón de hidroxiprolina no fue significativo respecto de la medida en los animales tratados con una solución salina en cualquier momento del proceso. Este hallazgo no fue único en los 129 ratones, ya que resultados similares se obtuvieron en los descendientes de los 129 por cruzas de C57B1/6. Estos resultados inesperados indican que la manifestación del integrino avß6 se requiere para la inducción de la fibrosis pulmonar. Para determinar el papel de avßd en las etapas tempranas de la fibrosis inducida por bleomicina, medimos el contenido de agua en el pulmón, un indicador del edema pulmonar que resulta de la incrementada permeabilidad vascular a 1,5 y 15 días después de la administración de la bleomicina o solución salina. En los ratones silvestres, el agua en el pulmón se incrementó como máximo por 5 días y permaneció incrementándose hasta por 15 días después de la bleomicina (Figura 2) . Como con la fibrosis pulmonar, los ratones ßd-/- estuvieron ampliamente protegidos de los efectos tempranos de la bleomicina, indicando que el avßd tiene un rol epitelial anterior al desarrollo del escape vascular inducido por la bleomicina. Hemos reportado previamente que los ratones ßd-/-demostraban respuestas inflamatorias exageradas en células mononucleares en la piel y en las vías aéreas (Huang, X.Z. et al. J.Cell Biol. 133:921-928 (1996)). La lesión pulmonar inducida por bleomicina y la fibrosis pulmonar están asociadas con y pueden depender del reclutamiento y de la actividad de linfocitos (Schrier, D.J. et al., Am. J. Pathol. 116:270-278 (1984)). Para determinar si la resistencia de los ratones de ßd-/- a la lesión pulmonar inducida por bleomicina y la fibrosis era debida a la alteración del reclutamiento de linfocitos o a su activación, contamos CD4+ y CD8+ linfocitos y evaluamos la activación de los linfocitos midiendo la manifestación del receptor interleucin-2 (CD25) en células obtenidas de pulmón de ratón cortado en pedacitos o tratados con solución salina o bleomicina a 5 y 15 días después del tratamiento. Consistentemente con nuestro reporte anterior, había más células de CD4+, CD8+ y CD25+ en los pulmones de ratones silvestres ßd-/-. La bleomicina indujo un amplio incremento en los números de la manifestación de los linfocitos CD4 y CD8, y marcó un incremento en el porcentaje de la manifestación de linfocitos CD25 (Figura 3), en ambos tipos de ratones el silvestre el ß6-/-. En ambos tipos el silvestre y el ßd-/- de los ratones, el 'reclutamiento y la activación de los linfocitos de los pulmones fue máxima 5 días después de la administración de la bleomicina y empezó a declinar a los 15 días. Sin estar limitado a ninguna otra teoría, estos datos sugieren que una falla en el reclutamiento de los linfocitos o en su activación en los ratones de ßd-/- es improbable para fundamentar su protección del daño pulmonar causado por los efectos de la bleomicina. La interacción de los integrinos con sus ligandos matriz modula varias funciones importantes de la célula incluyendo la proliferación (Agrez, M. et al., J.Cell Biol. 127:547-556 (1994), sobrevivencia (Lukacs, N.W. et al., Eur. J. Immuno .25 : 245-251 (1995)) y expresión de citocinas (Miyake, S. Et al., J. Exp. Med. 177:863-868 (1993)) y metaloproteinasas (Werb, Z. Et al., J.Cell Biol. 109:877- 889 (1989)) . Se ha reportado que la subunidad ß6 solamente forma un único integrino heterodimérico avßd y que está restringido a las células hepiteliales . Paralelamente a la rápida inducción de la expresión avß6 como consecuencia de una lesión epitelial, las concentraciones locales de por lo menos dos ligandos de este integrino (fibronectina y tenascina) se incrementan. Hemos reportado previamente que la manifestación de avßd juega un papel en las respuestas inflamatorias terminales de las células mononucleares en la piel y en los conductos aéreos del pulmón (Huang, X.Z. et al., J.Cell Biol. 133:921-928 (1996)) . Los resultados reportados aquí indican que este integrino también juega un papel muy importante en la inducción de la lesión pulmonar y la fibrosis pulmonar en respuesta a la bleomicina. Las células epiteliales respiratorias han sido por mucho tiempo consideradas principalmente como componentes de una barrera pasiva, que separa las otras células del pulmón de los potencialmente tóxicos componentes del aire inhalado. En esta interfase, sin embargo, estas células están bien colocadas para iniciar y modular las respuestas locales a la lesión. Evidencia reciente sugiere que las células respiratorias epiteliales tienen la capacidad de sintetizar y secretar un número de proteínas que puede iniciar y modular las respuestas a la lesión, incluyendo la quimicina (por ejemplo, interleucina- 8, GROa, GRO?,RANTEs,GMCSF, MlP-la y MCP-l), otras citocinas (por ejemplo IL-6, IL-11, y IL15) y factores de crecimiento (por ejemplo TGFß) . Sin limitarse a ninguna teoría, un posible mecanismo por el cual la avßd epitelial * pudiera contribuir al desarrollo de la lesión del pulmón y a la fibrosis pulmonar es modulando la manifestación de uno o más de estas proteínas. Las actuales terapias de la fibrosis pulmonar son muy inadecuadas. Los resultados del presente estudio, indican que las células epiteliales respiratorias y el integrino epitelial avßd juegan un papel importante en la patogénesis de la herida pulmonar parencimal en la fibrosis pulmonar, y que las terapias específicamente diseñadas para interferir con la función de este integrino son útiles en el tratamiento de estas enfermedades del pulmón sin tratamiento ampliamente efectivo III. Generación y Bloqueo del Anticuerpo A. Generación de un Anticuerpo Monoclonado Para generar anticuerpos contra el avßd, los ratones ßd-/- fueron inmunizados con ya sea keratinocitos obtenidos de los ratones silvestres o recombinando la avß6 segregada por los humanos (Weinacker et al., J. Biol . Chem. 269:6940-6948 (1994)) en los adyuvantes de Freund. Los esplenocitos de ratón fueron recolectados y fundidos con células SP2/0 de mieloma de ratón de acuerdo con procedimientos normales. Las células ßd y falsamente transfectadas SW 480, fueron usadas para filtrar el sobrenadante resultante mediante citometría de flujo. Los anticuerpos encontrados para reconocer las células ßd transfectadas pero no falsamente transfectadas SW4800 fueron utilizadas para experimentos posteriores. B . Caracterización de Anticuerpos Monoclonales Para generar anticuerpos contra la murina avßd, se usaron el avßd secretados por los humanos y los keratinocitos de murino como inmunógenos en los 129/C57 ratones ßd-/-del antecedente. Los sobrenadantes de los hibridomas generados fueron separados por teñidos diferenciales o por células falsamente transfectadas ßd-transfectadas SW480. Los anticuerpos resultantes fueron el CSßd y el 10D5 teñidos ambos, el humano ßd manifiesto en las células SW480 y el ßd del ratón manifiesto en los keratinocitos de los ratones silvestres. CSßd fue más caracterizado por la inmunoprecipitación del keratinocito lisato de murino etiquetado (35S) . Este anticuerpo heterodimérico precipitado de la masa molecular adecuada, o sea del avß6 de los keratinocitos ß6+/+, pero no de los keratinocitos de ß6-/-, indican que estos anticuerpos son específicos para el integrino avßd. También probamos ambos Csßd y 10D5 para impedir la actividad llevando a cabo análisis de adhesión de las células con células ßd transfectadas SW480 y keratinocitos de murina en fibronectina. Sin embargo, solamente 10D5 mostraron actividad bloqueada en las células de murino. 10D5 inhibió la migración de los keratinocitos de los ratones silvestres en fibronectina, hasta un grado idéntico al visto en los keratinocitos ßd-/-. C . Análisis de la Adhesión Celular 96 pozos con multicavidades microtiter con cultivo convexo tratado con poliestireno (Linbro/Titertek, Flow Laboratories, McLean, VA) fueron cubiertos con vitronectina, fibronectina o colágeno. A lOOµl de solución que contiene varias cantidades de matriz se agregó a las cavidades y se incubó a 37°C durante 1 hora. Después de la incubación, las cavidades se lavaron con PBS, luego fueron obstruidos con 1% de BSA en DMEM libre de suero a 37 °C durante 30 minutos. Las cavidades de control se llenaron con 1% de BSA en DMEM. Las células fueron recolectadas de la misma manera como fueron las del análisis de migración y vueltas a suspender en KGM libre de suero, y luego agregadas a cada cavidad cubierta de proteína en presencia o ausencia de PMA. Para los experimentos de obstrucción, unas células se incubaron con los anticuerpos durante 5 minutos a 4°C antes de ponerlas en portaobjetos. Los portaobjetos fueron centrifugados (con el lado extremo hacia arriba) a 10 x g durante 5 minutos antes de la incubación durante 1 hora a 34 °C con una humedad de 7% de C02. Células no adherentes se removieron por centrifugación con el lado extremo hacia abajo a 48 x g durante 5 minutos. Las células adheridas se fijaron con 1% de formaldehído y fueron teñidas con 0.5% de violeta cristal, entonces los orificios se lavaron con PBS. El número relativo de células en cada cavidad se evalúo midiendo la absorbancia a 595 nm en un Portaobjetos de Lectura (Bio-Rad) . D. Análisis de Migración Los análisis de migración de las células se llevaron a cabo con portaobjetos con cavidades recubiertas (poros de 8 µm, Costar, Cambridge, MA) . La subsuperficie de la membrana fue cubierta con colágeno (10 µg/ml) , fibronectina (10 µg/ml) o vitronectina (10 µg/ml) en PBS durante 1 hora a 37°C y bloqueada con 1% de BSA. Los keratinocitos del cultivo primario fueron recolectados con tripsina/EDTA y la tripsina fue inactivada con un inhibidor de tripsina del frijol de soya. Las células se suspendieron en KGM libres de suero y puestas en portaobjetos en la cámara de más arriba a una densidad de 3.6 x 104 por cavidad en un medio de 100 µl, en presencia o ausencia del acetato miristato de forbol (PMA, 10 ng/ml) . Para los experimentos de inhibición, se agregaron anticuerpos en las cámaras más alta y más baja en presencia de PMA. Después de 6 horas de incubación, las células se fijaron con 2% de paraformaldehído y se tiñeron con 0.5% de violeta cristal en 1% de formaldehído. Las células en la cámara de más arriba se removieron y las células en la superficie de más abajo se contaron con una rejilla de 10 x con aumento de alto poder (40 x) . Múltiples campos se contaron y promediaron para cada condición estudiada. IV Ratones Violentos ßd redujeron la incidencia de metástasis en el pulmón Una línea de ratones transgénica que espontáneamente desarrolla metástasis de cáncer de pecho (MMT-mTAg) fue cruzada con ratones violentos beta- 6. La progenie de ratones que carecía de ßd desarrolló rápidamente crecientes tumores primarios de la mama, pero se redujo mucho la incidencia y la extensión de la metástasis del pulmón comparado con sus compañeros de camada que si manifestaban ßd. La inmunohistoquímica mostró que la ßd está manifiesto muy fuertemente alrededor de las orillas de las lesiones de metástasis. Esto sugiere que el ßd se requiere para una metástasis máxima en este modelo. Desde el momento en que los ratones violentos ßd tienen inflamación crónica del pulmón, es posible que la metástasis reducida se deba a la presencia de inflamación en el pulmón, que interfiere con el crecimiento de la metástasis. Dos experimentos se llevaron a cabo para aclarar este asunto: 1. Una serie de células que manifestaban ßd derivadas del tumor primario se inyectaron en ratones singeneicos que eran del tipo silvestre o del violento ßd. La metástasis del pulmón ocurrió rápidamente en ambos grupos de ratones, sugiriendo que la presencia de la inflamación en los ratones violentos no interfiere con el crecimiento del tumor en las células del pulmón. 2. Una serie de células derivadas de los tumores tanto de los ratones violentos betad como de los silvestres, se inyectaron en ratones silvestres singeneicos. La serie de células de los ratones silvestres invariablemente dio lugar a tumores de pulmón, mientras que la serie de células de los ratones violentos no lo hizo. Este experimento sugiere que el tumor de prueba y el tumor de la célula ß6 se requiere para la metástasis máxima en este sistema. Todas las referencias (incluyendo libros, artículos, papeles, patentes y solicitudes de patentes) citados aquí son por la presente expresamente incorporados por referencia en su integridad para cualquier propósito. Mientras que la invención ha sido descrita en relación con modalidades específicas del mismo, se entenderá que es susceptible de modificaciones posteriores, y esta solicitud está hecha para cubrir cualquier variación, uso, o adaptaciones de la invención, siguiendo en general, los principios de la invención, e incluyendo los avances del presente descubrimiento como sucede dentro de la práctica ya conocida en la técnica a la que pertenece a la invención, y que puede aplicarse a las características esenciales expuestas aquí anteriormente, y que caiga dentro del alcance de la invención y de los límites de las reivindicaciones anexas.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método de tratamiento de la lesión aguda del pulmón en un paciente que comprende la administración al paciente de una dosis terapéutico de un antagonista de avß6.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista es un anticuerpo que específicamente enlaza a ß6.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista comprende la secuencia de aminoácido RGD.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista comprende una molécula de ácido nucleico de antisentido.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista se administra terapéuticamente.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista se administra profilácticamente .
8. 8. Un método de tratamiento de la fibrosis en un paciente que comprende la administración al paciente de una dosis terapéutica de un antagonista de avßd.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la fibrosis es una fibrosis pulmonar .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la fibrosis pulmonar resulta de una lesión aguda en el pulmón.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el antagonista es un anticuerpo que específicamente enlaza a ßd.
12. 12. El método de conformidad • con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el antagonista comprende la secuencia del aminoácido RGD.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el antagonista comprende una molécula de ácido nucleico en antisentido.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 8, * caracterizado porque el antagonista se administra terapéuticamente.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el antagonista se administra profilácticamente.
17. 17. Un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma ATCC HB12382.
18. 18. El hibridoma ATCC HB12382.