JP2001512424A - 糖尿病性合併症の予防における治療介入のための化合物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新たに見出された代謝経路におけるＡＴＰ依存反応においてフルクトース−リジンのフルクトース−リジン−３−リン酸への酵素的変換を阻害する、ある種の化合物が開示される。該経路に対する通常の作用によって、フルクトース−リジン−３−リン酸（ＦＬ３Ｐ）が分解されて、遊離のリジン、無機リン酸塩および３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）を生成し、後者は反応性タンパク質修飾物質である。３ＤＧは３−デオキシフルクトース（３ＤＦ）への還元によって無毒化でき、または内因性タンパク質と反応して、糖尿病性合併症の原因であると考えられる進行性糖化終末産物修飾タンパク質（ＡＧＥ−タンパク質）を生成することができる。また、ＡＧＥ−タンパク質の生成を減少させ、それにより、糖尿病性合併症を少なくし、減少させ、遅らせるためにかかるインヒビターを使用する治療法、ならびに糖尿病の合併症を発現する危険性を評価するための方法およびフルクトース−リジン含有食品の経口投与後の生物学的試料において３ＤＧの３ＤＦに対する割合を測定することによって開示されたインヒビター治療の効果を決定するための方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 糖尿病性合併症の予防における治療介入のための化合物および方法 ３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２０２（ｃ）に従い、これにより、国立衛生研究所からの 基金により一部作成された本明細書に記載する発明において、米国政府がある特 定の権利を有することを承認する（登録番号ＤＫ４４０５０、ＤＫ５０３１７お よびＤＫ５０３６４）。 発明の背景 本発明は、糖尿病の治療、特に、糖尿病性合併症または関連のある病因の他の 障害の発症を予防、減少または遅延させるための治療薬およびそれらの使用に関 する。より詳細には、本発明は、フルクトースリジン（ＦＬ）のフルクトース− リジン−３−リン酸（ＦＬ３Ｐ）への酵素的変換を阻害し、糖尿病性合併症に至 る生物化学的メカニズムにおける重要な段階であると考えられる、ある種の酵素 インヒビターに関する。本発明は、また、糖尿病患者の糖尿病性合併症を併発す る危険性を評価する方法、ならびに糖尿病性合併症の発症の予防、減少または遅 延における治療介入の効果を決定する方法にも関する。 糖尿病の４つの特に重い合併症、すなわち、糖尿病性腎障害または腎臓疾患； 網膜の破壊のため失明を引き起こす糖尿病性網膜症；末梢神経機能の喪失を含む 糖尿病性神経障害；および毛細管の損傷に起因する循環性の問題が存在する。網 膜症および腎障害のどちらも、該病態に付随した一般的な循環性の問題のサブセ ットであると考えられる。後期糖尿病における微小血管機能不全の役割が近年、 要約された（Tooke，Diabetes，44:721(1995)）。該開示を通して、「糖尿病に 付随した病状」なる語はおよび類義語は、種々のよく知られた網膜症、神経障害 、腎障害、マクロ脈管障害ならびに糖尿病の他の合併症を包含することを意味す る。 糖尿病から発生する病状と老化による病状との間の類似性は、多数報告されて いる。研究は、多くの糖尿病に付随した病状が通常の老化に付随した病状に臨床 上、非常に類似するということを明らかにした。例えば、糖尿病において、動脈 および関節が早期にこわばり、肺の弾力性および肺活量が早期に減少することが 明らかにされた。さらに、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞および卒中は、同 じ年齢の非糖尿病性の個体におけるよりも頻繁に糖尿病患者において起こる。糖 尿病患者はまた、より感染されやすく、非糖尿病患者よりも若年で、高血圧、骨 喪失の促進、骨関節炎およびＴ細胞機能の障害を有するようである。 糖尿病に付随した病状と老化の間の類似性は、共通のメカニズム原理を示すよ うである。種々のメカニズムが糖尿病に付随した病状と老化の両方に関する共通 の生物化学的基礎として提案された。ヒト対象由来のデータにより最も強く支持 される仮説は非酵素的グリコシル化メカニズムを前提とする。該仮説は、前記の ような老化過程および糖尿病に付随した病状が少なくとも一部、グルコースおよ びメイラード反応を介するグルコース誘導代謝産物によるタンパク質修飾および 架橋によって引き起こされることを示す（Monnierら、Proc．Natl．Acad．Sci； USA，81:583(1984)およびLeeら、Biochem．Biophys．Res．Comm.，123:888(1984 )）。かかるグリコシル化反応により得られる修飾タンパク質を本明細書では、 進行性糖化終末産物修飾タンパク質（（advanced glycation end product modif ied proteins）ＡＧＥタンパク質）という。３−デオキシグルコソン（３ＤＧ） がＡＧＥタンパク質形成を導く多工程反応経路において鍵となる中間物質である ことが広く認められている。３ＤＧは、タンパク質と反応してコラーゲンおよび 基底膜のような細胞内および細胞外タンパク質の両方の架橋を導くことができる 、グルコース誘導の代謝産物である。 糖尿病性合併症の場合、ＡＧＥタンパク質に至る反応は、該疾患に付随した慢 性高血糖により速度論的に加速されると考えられる。該メカニズムを支持する証 拠には、糖尿病対象由来のコラーゲンおよび水晶体のような長命のタンパク質が 同じ年齢の正常な対照由来のタンパク質よりも有意に多くのＡＧＥタンパク質を 含有することを示すデータが包含される。したがって、比較的若年での糖尿病患 者における白内障の異常な発病率は、水昌体の修飾および架橋率の増加によって 説明できる。同様に、糖尿病患者に見られる関節および動脈硬化、ならびに肺活 量の喪失の初期の発症は、重要な構造タンパク質であるコラーゲンの修飾および 架橋率の増加によって説明される。これらのタンパク質は長命なので、修飾の結 果が累積する傾向にある。 糖尿病性合併症と高血糖の間の原因および効果の関係を明らかにするもう一つ 別の因子は、高血糖性記憶である。該現象の特に著しい一例は、最初、糖尿病で あって、次いで、正常な血中グルコースレベルに戻るように治療したイヌが重篤 な網膜症を発病することである。イヌの目は治療の期間、組織学的に正常であっ たが、時間が経ち、グルコース濃度が正常化したにもかかわらず、これらの動物 は糖尿病性網膜症を発病した（Engermanら、Diabetes，36:808(1987)）。したが って、目に対する潜在的な損傷は、臨床症状が現れる前に、初期の高血糖症の期 間に不可逆的に起こった。 糖尿病のヒトおよび動物は、正常より高い濃度の初期および後期糖修飾ＡＧＥ タンパク質を有することが明らかにされた。実際、ＡＧＥタンパク質の増加は、 血中グルコースレベルの増加よりも大きい。ＡＧＥタンパク質の濃度は、糖分子 の何パーセントかが転位してタンパク質結合蛍光分子を生成するので、蛍光測定 によって測定できる。 ＡＧＥタンパク質の病原的役割は、糖尿病に限らない。タンパク質糖化（glyc ation）は、アルツハイマー病に関係する（Harringtonら、Nature，370:247(199 4)）。タンパク質蛍光の増加は、また、老化とともに見られる。さらに、いくつ かの学説は、老化過程が酸化的損傷および糖に誘導されるタンパク質修飾の組み 合わせであることを明らかにしている。したがって、ＡＧＥタンパク質生成を減 少させる治療はまた、他の病因学的に類似したヒトの病態の治療にも有用であり 、おそらく、老化過程を減速させるかもしれない。 一般に、ＡＧＥタンパク質の形成はタンパク質アミノ基と糖、主としてグルコ ースの反応で開始すると仮定されている。１の典型的な参考文献は、「リジン残 基のε−アミノ基の糖化により形成される最初の付加生成物は、アマドリ化合物 、フルクトースリジン．．．である。糖化は、集合的にメイラードまたは褐変反 応として知られる複雑な一連の反応における開始工程であり、最終的に、架橋さ れた、沈殿した、酸化した、褐色の蛍光タンパク質の形成に至る。」と述べてい る（K．J．Knechtら、Archives of Biochem．Biophys.，294;130(1992)）。 糖からのＡＧＥタンパク質の形成は、フルクトース−リジン含有タンパク質を 生成するための初期に糖との不可逆的反応を含む多工程プロセスである。次いで 、これらの修飾タンパク質は、反応し続けて、不可逆的に修飾されたＡＧＥタン パク質を生成する。ＡＧＥタンパク質に対して作成された抗体がフルクトース− リジンと反応しないので、ＡＧＥタンパク質が糖化リジン残基を含有するタンパ ク質と同一でないことは、明らかである。また、ＡＧＥタンパク質が多数の化学 種として存在することも明らかであるが；ほとんど同定されていない。化学種（ ε−アミノ−（カルボキシメチル）リジンは、近年の研究において、１つの重要 な最終的なＡＧＥタンパク質構造として同定された（Reddyら、Biochem.，34:10 872(1995)およびIkedaら、Biochemistry，35:8075(1996)）。該研究は、約５０ ％の修飾部位を作成する別のＡＧＥタンパク質エピトープを化学的に同定できな かった。リボースからのＡＧＥタンパク質生成の速度論を研究する方法は、近年 、発展してきた（Khalifahら、Biochemistry，35:4645(1996)）。しかしながら 、該研究は、リボースがＡＧＥタンパク質生成において重要な生理学的役割を果 たし得ることを示唆し、後記に挙げる糖化リジンおよびフルクトース−リジンの 比較的幅広い定義を支持する。 他の参考文献は、糖化リジン残基を含有するタンパク質とＡＧＥタンパク質と の間の定義、「シッフ塩基およびアマドリ生産物は、各々、数時間および数週で 平衡レベルに達する。初期のグリコシル化産物の全量は、非常に長命のタンパク 質上であっても、短期間で定常期に到達するので、該生成物の可逆的に平衡な性 質は重要である。．．．慢性糖尿病において、これらの初期のグリコシル化産物 は、何年にもわたってコラーゲンおよび他の安定な組織タンパク質上に蓄積し続 けないので、それらの濃度が糖尿病性網膜症の存在または重篤度のいずれかと相 関しないことは驚くべきことではない．．．しかしながら、脈管壁のコラーゲン および他の長命なタンパク質上の初期のグリコシル化産物のいくつかは、解離し ない。その代わり、それらは、ゆっくりとした複雑な一連の化学的転位を行って 、不可逆的な進行性糖化終末産物を生成する」と示している（M．Brownleeら、N ew England Journal of Medcine，318:1315(1988)）。科学文献に記載されたこ れらの修飾タンパク質を生成する唯一の経路は、タンパク質と糖分子間の開始反 応 を含む。 多数の参考文献は、ＡＧＥタンパク質の生成が多工程経路によって起こり、３ −デオキシグルコソン（３−ＤＧ）が該経路の鍵となる中間物質であることを示 す（M.Brownlee，Diabetes，43:836(1994);M．Brownlee，Diabetes Care，15:18 35(1992);T．Niwaら、Nephron，69:438(1995)；W．L．Dills，Jr.，Am．J．Clin ．Nutr.，58:S779(1993);H．Yamadatら、J．Biol．Chem.，269:20275(1994)；N ．Igakiら、Clin．Chem.，36:631(1990)）。糖とタンパク質の反応からの３ＤＧ の形成に関して一般に受け入れられた経路を図１に説明する。図１に示すように 、糖（グルコース）分子は、最初、タンパク質−リジンアミノ基（Ｉ）とシッフ 塩基を形成する。次いで、得られたシッフ塩基が転位して、フルクトース−リジ ン修飾タンパク質（ＩＩ）を生成する。（ＩＩ）に至るまでの反応は、自由で可 逆的である。（ＩＩ）が転位して、３ＤＧおよび遊離のタンパク質リジンを生成 することができる。３ＤＧとタンパク質の間のその後の反応は、ＡＧＥタンパク 質形成における第１の不可逆的工程である。 知られる限りでは、３ＤＧが別の経路でも生成できると報告されておらず、あ るいは実際、３ＤＧの主源が、図１に示される非触媒的反応よりもむしろ、酵素 触媒代謝経路由来であることも報告されていない。 糖尿病患者は、非糖尿病患者よりも有意に多くの３ＤＧを血清中に有する（１ ２．７８±２．４９μＭ対１．９４±０．１７μＭ）（Toshimitsu Niwaら、Nep hron，69:438(1995)）。それにもかかわらず、この毒性化合物は、正常な健康な 個体において見出される。したがって、身体が該分子の無毒化経路を発達させた ことは驚くべきことではない。これらの反応の１つは、アルデヒド還元酵素によ り触媒され、尿中に効率よく排出される３−デオキシフルクトース（３ＤＦ）に 還元することによって３ＤＧを無毒化する（Takahashiら、Biochem，34:1433(19 95)）。別の無毒化反応は、オキソアルデヒド脱水素酵素によって３ＤＧを３− デオキシ−２−ケトグルコン酸（ＤＧＡ）に酸化する（Fujiiら、Biochem．Biop hys．Res．Comm.，210:852(1995)）。 現在までの研究の結果は、これらの酵素の少なくとも１種類、アルデヒド還元 酵素の有効性が糖尿病において悪影響を及ぼすことを明らかにしている。正常な ラット肝臓から単離される場合、該酵素のフラクションは、リジン６７、８４お よび１４０において部分的に糖化され、正常な非修飾酵素と比べて低い触媒効率 を有する（Takahashiら、Biochem.，34:1433(1995)）。糖尿病患者は、正常な血 糖の個体よりも高い割合の糖化タンパク質を有するので、より高レベルの３ＤＧ を有し、３ＤＦへの還元によって該反応性分子を無毒化する能力が減少している ようである。 アルデヒド還元酵素のメカニズムは、研究されてきた。これらの研究は、この 重要な無毒化酵素がアルドース還元酵素インヒビター（ＡＲＩ）によって阻害さ れることを決定した（Barskiら、Biochem.，34:11264(1995)）。ＡＲＩは、現在 、糖尿病性合併症を減少させる可能性について臨床研究の下にある。これらの化 合物は、ある特定の種類として、短期の糖尿病性合併症に対するいくつかの効果 を明らかにされた。しかしながら、それらは、長期の糖尿病性合併症に対する臨 床上の効果が欠けており、それらは、高タンパク質食餌を与えられたラットにお ける腎臓機能を悪化させる。後記に明らかにされるように、この知見は、本発明 の基礎となる新たに見出されたリジン回収のための代謝経路と一致する。高タン パク質食餌は、腎臓リジン回収経路（lysine recovery pathway）により３ＤＧ への変換を行うフルクトース−リジンの消費を増加させるであろう。得られた３ ＤＧの３ＤＦへの還元による無毒化は、ＡＲＩを受けていないラットと比べて結 果として腎臓損傷の増加を導くＡＲＩ治療により阻害されるであろう。これは、 ＡＲＩによるアルドース還元酵素の阻害が、３ＤＧおよび３ＤＦを還元するため のアルドース還元酵素の有効性を減少させたためである。 ヒト疾患に関与する３ＤＧの役割は、後記に要約される特許の論評から明らか になるように、以前に研究されていた。 Ulrichらによる米国特許第５，４７６，８４９号は、アミノ−安息香酸および 誘導体を用いるＡＧＥタンパク質の生成を阻害する方法を記載している。これら の化合物は、おそらく、３ＤＧがタンパク質と反応してＡＧＥタンパク質生成の 不可逆的段階を開始する前に、３ＤＧと反応し、該系からそれを除去することに よって作用する。 Ceramiらによる米国特許第４，７９８，５８３号および第５，１２８，３６０ 号は、ＡＧＥタンパク質生成および糖尿病に誘導される動脈壁タンパク質架橋を 予防するためのアミノグアニジンの使用を記載している。アミノグアニジンは、 初期グリコシル化産物と反応することが明らかにされた。この初期産物は、本明 細書に定義されるような３ＤＧである。これらの特許は、３ＤＧの生成を阻害す る可能性を予測してはいない。それらは、専ら、該毒性分子の複合体形成に集中 している。 Franceらによる米国特許第５，４６８，７７７号は、口腔におけるタンパク質 の非酵素的褐変によって引き起こされる歯の変色を予防する方法および薬剤を記 載している。システインおよびシステイン誘導体は、該適用において特に有用で あると記載されている。 Ulrichらによる米国特許第５，３５８，９６０号は、アミノ置換イミダゾール を用いてＡＧＥタンパク質生成を阻害する方法を記載している。これらの化合物 は、初期グリコシル化産物（３ＤＧ）と反応することが明らかにされた。該特許 において、３ＤＧの代謝源が存在し得るという記載はない。該特許は、３ＤＧが 専ら、タンパク質の非酵素的褐変における中間物質として生成されると考えてい る。 Ulrichらによる米国特許第５，３３４，６１７号は、ＡＧＥタンパク質生成の インヒビターとして有用なアミノ酸を記載している。リジンおよび他の二官能性 アミノ酸は、この点に関して特に有用であるとして記載される。これらのアミノ 酸は、グルコースとタンパク質の反応由来の初期グリコシル化産物と反応すると して記載される。該特許に記載される初期グリコシル化産物は３ＤＧであるよう である。 Ulrichらによる米国特許第５，３１８，９８２号は、阻害剤として１，２，４ −トリアゾールを用いるＡＧＥタンパク質生成の阻害を記載している。該特許に 記載されるインヒビターは、３ＤＧと反応し複合体を形成するように配置された ジアミノ置換基を含有する。該特許は、これらの化合物を初期グリコシル化産物 （本明細書に定義されるような３ＤＧ）と反応するとして記載している。 Ulrichらによる米国特許第５，２７２，１６５号は、ＡＧＥタンパク質生成の インヒビターとしての２−アルキリデン−アミノグアニジンの使用を記載してい る。該特許に記載されたインヒビターは、３ＤＧとよく反応するといわれる。該 特許において、３ＤＧの代謝生成を阻害するという記載はない。 Ulrichらによる米国特許第５，２６２，１５２号は、ＡＧＥタンパク質生成を 阻害するためのアミドラゾンおよび誘導体の使用を記載している。該特許に記載 された化合物は、α−効果アミンである。W.P．Jencks，第３版、McGraw Hill， New York。該カテゴリーの化合物は、ジカルボニル化合物、例えば、３ＤＧと反 応することが知られている。 Ulrichらによる米国特許第５，２５８，３８１号は、ＡＧＥタンパク質生成を 阻害するための２−置換−２−イミダゾリンの使用を記載している。該特許に記 載された化合物は、３ＤＧと容易に反応できる隣接したアミノ基を含有する。 Ulrichらによる米国特許第５，２４３，０７１号は、ＡＧＥタンパク質生成を 阻害するための２−アルキリデン−アミノグアニジンの使用を記載している。該 特許に記載された化合物は、３ＤＧとよく反応し、この反応性の毒性分子を複合 体化することによって機能する。 Ulrichらによる米国特許第５，２２１，６８３号は、ＡＧＥタンパク質生成を 阻害するジアミノピリジン化合物の使用を記載している。特に有用であるとして 記載されたジアミノピリジン化合物は、３ＤＧと反応して、安定な６員環を含有 する複合体を形成するであろう。 Ulrichらによる米国特許第５，１３０，３３７号は、ＡＧＥタンパク質生成を 阻害するためのアミドラゾンおよび誘導体の使用を記載している。該特許に記載 されたインヒビターは、３ＤＧと迅速に反応し、安定な複合体を形成するであろ う、当該分野で周知のα−効果アミンである。 Ulrichらによる米国特許第５，１３０，３２４号は、ＡＧＥタンパク質生成を 阻害するための２−アルキリデン−アミノグアニジンの使用を記載している。該 特許に記載された化合物は、グルコースとタンパク質の反応から生じる初期グリ コシル化産物（３ＤＧ）と反応することによって機能する。 Ulrichらによる米国特許第５，１１４，９４３号は、ＡＧＥタンパク質生成を 阻害するためのアミノ置換ピリミジンの使用を記載している。該特許に記載され た化合物は、３ＤＧと迅速に反応し、無毒化するといわれる。 前記特許のいずれも、糖尿病性合併症を予防するための治療介入の手段として ３ＤＧの代謝生成の阻害を提唱するものはない。さらに、これらの特許のいずれ も、３ＤＧ生産における酵素的経路の関与を提唱すらしない。 Ulrichらによる米国特許第５，１０８，９３０号は、生物学的試料中のアミノ グアニジンのレベルを検出する方法を記載している。該アッセイは、アミノグア ニジン排出時間を測定することによって腎臓機能を決定する潜在的な有用性を有 するものとして記載される。該特許に記載されたアッセイ方法に向けられた主な 有用性は、ＡＧＥタンパク質生成を阻害するのに十分な投与量を動物およびヒト 研究において維持できるように、アミノグアニジンの組織レベルを測定すること にある。該特許において、尿３ＤＧ、３ＤＦまたはＤＧＡ比を用いて糖尿病患者 の合併症の危険性を決定するという記載はない。 Szwergoldらによる米国特許第５，２３１，０３１号は、糖尿病に付随した病 状の危険性を評価し、これらの合併症に対する治療の効力を決定する方法を記載 している。該特許は、糖尿病患者の赤血球中の２つのリン酸化化合物の測定を記 載している。これらの２つの化合物は、該特許において化学的に同定されなかっ た。しかしながら、どちらの化合物も、そのレベルが本発明の診断的具体例にお いて尿中において測定される３ＤＧまたは３ＤＦではなかった。 グリコシル化終末産物の測定によって糖尿病患者における代謝制御をモニター する方法が知られている。グリコシル化ヘモグロビンの濃度は、先の数週間の平 均血中グルコース濃度を反映することが知られる。A．Ceramiらによる米国特許 第４，３７１，３７４号は、尿中のグリコシル化タンパク質の分解産物、より詳 細には、非酵素的にグリコシル化されたアミノ酸およびペプチドの定量によって グルコースレベルをモニターする方法を記載している。該方法は、グリコシル化 終末産物に見られる同一平面上のシス−ジオール基と特異的複合体を形成するこ とに対するアルカリ性ホウ酸のアフィニティーを利用して、かかる終末産物を分 離し、定量することすることを意味する。 A．Ceramiによる米国特許第４，７６１，３６８号は、褐変したポリペプチド 、例えば、ウシ血清アルブミンおよびポリ−Ｌ−リジンに存在する発色団の単離 および精製を記載している。発色団、２−（２−フロイル）−４（５）−２（フ ロ イル）−１Ｈ−イミダゾール（ＦＦＩ）は、グルコースの２分子と２つのリジン 由来のアミノ基の縮合から誘導される複合複素環である。さらに、該特許は、タ ンパク質試料中において「老化」（進行性グリコシル化の度合い）を測定する方 法であって、試料中の前記の発色団の量を測定し、次いで、該測定値を標準と比 較することによって試料「老化」が決定される方法におけるＦＦＩの使用を記載 している（タンパク質試料は、試料の「老化」に相関したＦＦＩ量を有する）。 糖尿病患者の現存する治療計画には、治療介入によって糖尿病に付随した病状 の発症を予防、減少または遅延させ、かかる治療介入の利益を決定するために、 かかる病状を発現する危険性のある患者を同定する有効な方法に対して長年にわ たる満たされていない要求がある。 発明の概要 本発明は、ＦＬのＦＬ３Ｐへの酵素介在変換を含み、糖尿病によって影響を及 ぼされた器官において比較的高濃度の３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）を生成 する代謝経路を見出したことから生まれたものである。この新たに見出された経 路のその後の生物学的機能の研究は、該経路が糖尿病性腎疾患の病因において重 要な役割を果たすことを示すのに役立つ。また、該経路は様々な既知の糖尿病に 付随した病状の発病に関与することが推測される。 この知見により、一の態様において、酵素阻害活性を有し、フルクトース−リ ジンのフルクトース−リジン−３−リン酸への酵素的変換を阻害するのに有効な 一連の化合物を提供する、本発明において実用的な用途が見出された。本発明の 化合物の関連した酵素阻害活性は、アッセイによって容易に測定できる。アッセ イ方法は、フルクトース−リジン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、フルクトー ス−リジン−３−リン酸キナーゼの供給源および阻害活性を明らかにするのに十 分な量の本発明の化合物の水溶液を準備し、前記のキナーゼ、フルクトース−リ ジンおよびアデノシン三リン酸の相互反応の生産物としてフルクトース−リジン −３−リン酸およびアデノシン二リン酸の形成を促進する条件下に得られた溶液 を付し、かかる生産物の少なくとも１種類の生成を測定することからなり、本発 明の化合物は、同じ相対量のフルクトース−リジン、アデノシン三リン酸および フルクトース−リジン−３−リン酸キナーゼの供給源を含み、本発明の化合物を 含まない水溶液と比べて、かかる生産物の量を減少させる。ここに記載のアッセ イ方法もまた、本発明の範囲内にある。 もう一つ別の態様によると、本発明は、糖尿病患者において糖尿病性合併症の 発症を予防、減少または遅延させる製剤であって、活性剤として、前記のような 本発明の化合物および医薬上許容されるビヒクルを含んでなる製剤を提供する。 本発明のさらなる態様によると、糖尿病性合併症を発病する危険性のある患者 において糖尿病性合併症の発症を予防、減少または遅延させる方法であって、該 患者にフルクトース−リジンのフルクトース−リジン−３−リン酸への酵素的変 換を阻害するのに有効な量の本発明の化合物を投与することからなる方法が提供 される。該方法は、さらに後記されるように、他の病因学的に類似した病態の予 防または治療に使用してもよい。 まだ別の態様によると、本発明は、糖尿病患者の糖尿病に付随した病状を併発 する危険性を評価する方法を提供する。該方法は、所定量の糖化リジン残基を付 与する量にて糖化リジン残基の供給源を患者に投与し、患者から得られた生物学 的試料中の３−デオキシグルコソンの３−デオキシフルクトースに対する割合を 、正常な対象、すなわち、非糖尿病対象または糖尿病の臨床症状のない対象にお ける３−デオキシグルコソンの３−デオキシフルクトースに対する割合を基準と して測定することからなる。無症候性の対象の割合と比べて、糖尿病患者の試料 中の３−デオキシグルコソンの３−デオキシフルクトースに対する高い割合は、 糖尿病患者が糖尿病に付随した病状を併発するより危険な状態にあることを示す 。 本発明は、また、糖尿病性合併症の予防において治療介入の効果を評価する方 法も提供する。該方法は、治療介入の開始前および開始後の両方の糖尿病患者か ら得られた生物学的試料中の３−デオキシグルコソン、３−デオキシフルクトー スおよびフルクトース−リジン濃度を測定することを含む。次いで、３−デオキ シグルコソンおよび３−デオキシフルクトース濃度の和を試料中のフルクトース −リジン濃度と比較する。治療介入の開始前に得られた生物学的試料中で測定し たフルクトース−リジン濃度に相対的な３−デオキシグルコソンおよび３−デオ キシフルクトース濃度の和と比べて、治療介入の開始後に得られた生物学的試料 中のフルクトース−リジン濃度に相対的な３−デオキシグルコソンおよび３−デ オキシフルクトース濃度の和における減少は、治療介入の効果を示す。 本発明のまた別の態様の場合、糖尿病に付随した病状の発病に関与する可能性 のある食品を糖尿病患者に通告する方法が提供される。該方法は、食品中の糖化 リジン残基含量を測定し、例えば、食品のパッケージ上または糖尿病患者が利用 するための出版物において、該情報を糖尿病患者に提供することを含む。 図面の簡単な記載 図１は、不可逆的に修飾されたＡＧＥタンパク質を導く多工程反応に含まれる 開始工程を示す。 図２は、リジン回収経路に含まれる反応を示す。 図３は、２ｇのＦＬを与えられた単一の個体由来の３ＤＦ、３ＤＧおよびＦＬ の経時的変化を示し、２４時間追跡した尿プロフィールのグラフである。 図４は、２ｇのフルクトースリジンを与えられた７人のボランティア由来の３ ＤＦの時間に対する尿中排出のグラフである。 図５は、対照動物群と０．３％糖化タンパク質を含有する食餌を維持した実験 群との間の３ＤＦおよびＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）の比 較のグラフである。 図６は、対照食餌かまたは糖化タンパク質に富む食餌のいずれかを与えられた ラットの尿中３ＤＦおよび３ＤＧレベル間の直線関係を示すグラフである。 図７Ａおよび７Ｂは、正常および糖尿病患者の空腹時の尿中３ＤＧレベルを空 腹時の３ＤＦレベルに対してプロットしたグラフである。 発明の詳細な説明 以下の定義は、さらに詳細に後記するように、本発明の理解を容易にするため に提供される： １．糖化リジン残基 本明細書で使用される場合、「糖化リジン残基」なる表現は、還元糖とリジン 含有タンパク質の反応によって生成される安定な付加生成物の修飾リジン残基を いう。 タンパク質リジン残基の大部分は、陽電荷アミノ酸に関して予想されるように タンパク質の表面に位置する。したがって、血清または他の生物学的液体と接触 するタンパク質上のリジン残基は、溶液中で自由に糖分子と反応できる。該反応 は、多数の段階において起こる。開始段階は、リジン遊離アミノ基と糖ケト基間 のシッフ塩基の形成を含む。次いで、この開始生成物がアマドリ転位を受けて、 安定なケトアミン化合物を生成する。 この一連の反応は、種々の糖で起こり得る。関与する糖がグルコースの場合、 開始のシッフ塩基生成物は、グルコースのＣ−１上のアルデヒド基とリジンε− アミノ基間のイミン形成を伴うであろう。アマドリ転位の結果、本明細書ではフ ルクトース−リジンまたはＦＬという、フルクトースのＣ−１炭素に結合したリ ジン、１−デオキシ−１−（ε−アミノリジン）−フルクトースが生成するであ ろう。 同様な反応が、他のアルドース糖、例えば、ガラクトースおよびリボースで起 こるであろう（Dills，Am．J．Clin．Nutr.，58:S779(1993)）。本発明の目的の 場合、いずれかの還元糖とタンパク質リジンのε−アミノ残基との反応の初期生 成物は、修飾糖分子の正確な構造にかかわらず、意義的に糖化リジン残基に包含 される。 また、糖化リジン残基、糖化タンパク質およびグリコシル化タンパク質または リジン残基なる語は、本明細書において互換可能に使用され、それは、科学雑誌 においてかかる表現がしばしば互換可能に使用される最近の慣習と一致する。 ２．フルクトース−リジン 「フルクトース−リジン」（ＦＬ）なる語は、タンパク質／ペプチドに取り込 まれるかまたはタンパク質分解消化によりタンパク質／ペプチドから放出された いずれかの糖化リジンを意味するために本明細書で使用される。この語は、特に 、タンパク質リジン残基とグルコースの反応から生成されることが報告された、 一般にフルクトース−リジンと呼ばれる化学構造に限定されない。前記のように 、リジンアミノ基は、多種多様な糖と反応できる。さらに、ある報告では、グル コースが試験した１６の異なる糖の群の中で最も反応性の低い糖であることを示 す （Bunnら、Science，213:222(1981)）。したがって、グルコースと同様にガラク トースおよびリジンから形成されるタガトース−リジンは、天然または非天然の 全ての他の糖の縮合物と同様に、本明細書の記載においてフルクトース−リジン なる語が挙げられている場合には必ず包含される。本明細書の記載から、タンパ ク質−リジン残基と糖との間の反応は多数の反応段階を含むことが理解されるで あろう。この一連の反応における最終工程は、タンパク質の架橋およびＡＧＥタ ンパク質として知られ、そのいくつかが蛍光性である多量体種の生成を含む。か かる修飾タンパク質のタンパク質分解消化は、糖分子に共有結合したリジンを生 じない。したがって、これらの種は、本明細書で使用される場合の「フルクトー ス−リジン」の意味に包含されない。 ３．フルクトース−リジン−３−リン酸 該化合物は、ＡＴＰからＦＬへの高エネルギーリン酸基の酵素的転移によって 生成する。本明細書で使用される場合、フルクトース−リジン−３−リン酸（Ｆ Ｌ３Ｐ）なる語は、遊離かまたはタンパク質に結合して酵素的に形成され得る全 てのリン酸化フルクトース−リジン部分を包含することを意味する。 ４．フルクトース−リジン−３−リン酸キナーゼ この語は、高エネルギーリン酸塩の供給源を付加的に与えるとき、前記のよう にＦＬをＦＬ３Ｐに酵素的に変換できる１以上のタンパク質をいう。 ５．３−デオキシグルコソン ３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）は、１，２−ジカルボニル−３−デオキシ 糖（また、３−デオキシヘキスロソンとしても知られる）であり、遊離のリジン および無機リン酸を生じるＦＬ３Ｐの分解において生成される。本発明の目的の 場合、３−デオキシグルコソンなる語は、前記のＦＬ３Ｐの幅広い定義を有する ＦＬ３Ｐの分解において生成される全ての可能なジカルボニル糖を包含すること を意味する。 ６．ＦＬ３Ｐリジン回収経路 リジン回収経路は、ヒト腎臓あるいは他の組織に存在し、遊離のアミノ酸とし てかまたはポリペプチド鎖に組み込まれた非修飾リジンを再生する。さらに後記 に説明するように、該経路は、糖尿病の合併症に関与する重要な因子である。 ７．ＡＧＥタンパク質 「ＡＧＥタンパク質」（進行性糖化終末産物修飾タンパク質）なる語は、糖と タンパク質との間の反応の最終生成物を示すために、科学雑誌に使用され、本明 細書に用いられる（Brownlee，Diabetes Care，15:1835(1992)およびNiwaら、Ne phron，69:438(1995)）。例えば、タンパク質リジン残基とグルコース間の反応 がフルクトース−リジンの生成をもって終止しないことは明らかである。ＦＬは 、複数の脱水および転位反応を介して非酵素的３ＤＧを生成することができ、そ れは遊離アミノ基とさらに反応して関連するタンパク質の架橋および褐変をもた らす。実際に、本明細書に前記したように、３ＤＧが該修飾反応における中心的 中間物質であるという妥当な証拠がある。 ９．糖化食餌 本明細書で使用する場合、この表現は、一定の割合の通常のタンパク質が糖化 タンパク質で取り替えられるいずれの食餌をもいう。「糖化食餌」および「糖化 タンパク質食餌」なる表現は、本明細書では互換可能に使用される。 少なくともいくつか、あるいは全ての糖尿病の合併症は、グルコースおよび他 の反応性の糖によるタンパク質の共有結合修飾に起因する（M．Brownlee，Diabe tes，43:836(1994)）。前記のように、糖尿病のヒトおよび動物は、正常よりも 高濃度の糖修飾タンパク質を有することが明らかになった。実際、糖尿病に付随 したＡＧＥタンパク質における増加は、血中グルコースレベルの増加より大きい 。 以前には、イン・ビボでの３ＤＧの起源は糖化リジン残基を含有するタンパク 質の分解に由来すると、一般に認識されていた。また、これらの糖化リジンはア ミノ酸供給源として使用できないと、一般に考えられていた。後記で明らかにす るように、この上記の考えは間違っていた。 前記のように、本発明は、酵素触媒反応において３ＤＧを生成する以前に知ら れていなかった代謝経路を見出したことから発展した。該酵素的経路は、酵素的 阻害ができ、それにより、毒性３ＤＧの生成を減少させることができる。 糖尿病性腎臓における一連の研究の過程の間、ストレプトゾトシン（streptoz otoxin）誘導化糖尿病ラットから得た腎臓の過塩素酸抽出液の³¹Ｐ ＮＭＲスペクトル試験は、ＮＭＲスペクトルにおいて異常な新規のピークを表し た。本発明者らによる以前の研究では、ラット水晶体およびヒト赤血球において フルクトース−３−リン酸の存在を明らかにした（A．Petersenら、Biochem．J. ，284:363-366(1992);Lalら、Arch．Biochem．Biophys.，318:191(1995)；Szwer goldら、Science，247:451(1990)およびLalら、Investigative Opthalmology an d Visual Science，36(5):969(1995)）。より初期の研究では、ラット水晶体に おいて他の異常なリン酸化糖を同定した（Szwergoldら、Diabetes，44:810(1995 )およびKapplerら、Metabolism，44:1527(1995)）。したがって、この新たに同 定されたピークは別のリン酸化糖であると仮定することが理にかなっていた。さ らに多くの研究室の研究では、この新規な化合物が単純な糖ではなく、むしろ、 フルクトース成分の３位でリン酸化されたフルクトース-リジンであることを明 らかにした。 該同定は、２つの方法で確認された。標準のフルクトース-リジン−３−リン 酸（ＦＬ３Ｐ）を後記実施例２に開示の手法によって合成し、³¹Ｐ ＮＭＲスペ クトルにおいて糖尿病ラット腎臓におけるピークと互いに共鳴することを明らか にした。また、合成フルクトース-リジンを非糖尿病ラットに注射した。これら のラットは、注射後に、腎臓においてＦＬ３Ｐレベルの実質的な増加を示した。 ＦＬ３Ｐが酵素触媒反応においてＦＬから直接誘導されることを証明するため に、２つの実験を行った。フルクトース部分のＣ３位を重水素で標識したフルク トース-リジンを合成し、ラットに注射した。注射して３時間後に、これらのラ ットの腎臓を取り出し、過塩素酸で抽出した。ＮＭＲ分光法は、これらのラット から単離したＦＬ３Ｐ物質がフルクトース部分のＣ３位に重水素標識を含有する ことを示した。さらに、ラット腎臓ホモジネートは、ＡＴＰおよびフルクトース −リジンの両方を必要とする反応においてＦＬ３Ｐを生成できることを明らかに する。この最後に記載した実験は、フルクトースリジンおよびＡＴＰのみを生理 学的条件下で一緒にインキュベートする場合、ＦＬ３Ｐが形成されないので、特 異的ＦＬ３Ｐキナーゼの存在を確認するものである。腎臓皮質のフラクションを 含むさらなる実験は、該キナーゼ活性が腎臓において一様に分散されるのではな く、ヒトおよび動物の糖尿病の腎臓において損傷を示す最も初期の解剖部位の１ つである近位尿細管領域に濃縮されることを証明した。 ＦＬ３Ｐは、水性溶液中において不安定である。それは迅速に分解して、３Ｄ Ｇ、リジンおよび無機リン酸塩を生成する。また、該反応はイン・ビボでも起こ る。ＦＬ３Ｐのイン・ビボでの分解が自然発生的または酵素触媒反応であるかど うかは、現在、知られていない。しかしながら、フルクトース−リジンからの３ ＤＧの生成は無傷腎臓において非常に迅速に起こるので、酵素的触媒反応が関与 していると大いに推測される。 ＦＬ３Ｐリジン回収経路における反応工程は、図２に示す。第１工程において 、フルクトース-リジンおよびＡＴＰをＦＬ３Ｐキナーゼ触媒反応にて反応させ 、フルクトース−リジン−３−リン酸（ＦＬ３Ｐ）およびＡＤＰを生成する。フ ルクトース部分の３−位にリン酸化が起こり、フルクトースリジン分子の不安定 化を導く。次いで、得られたＦＬ３Ｐが分解して、３−デオキシグルコソン（３ ＤＧ）、無機リン酸塩およびタンパク質合成において利用可能な、修飾されてい ない遊離の再利用可能なリジンを生成する。アルデヒド還元酵素は、尿中に排出 される３−デオキシフルクトース（３ＤＦ）への還元によって３ＤＧを無毒化す る。 図２は、最も一般に行われている糖化リジン、フルクトース−リジンを用いる 該経路を説明するが、多種多様な同様の分子が該経路を流れることができること は、当業者にとって容易に明らかであろう。さらに詳細に後記に説明するように 、むしろ、ＦＬ３Ｐリジン回収経路の基質選択性は非常に広く、前記の用語の幅 広い定義を正当化するものである。 付加的な実験は、リジン回収経路が、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウサギ、ウシ、マ ウスおよびニワトリを包含する多種多様な動物種に見出されることを明らかにし た。該経路は、また、ヒトにも存在する。ＦＬ３Ｐリジン回収経路の遍在は、リ ジンが大抵の食物に比較的低濃度で存在する必須アミノ酸であることにより理解 できる。さらに、食物中におけるリジン残基のかなりの割合が、糖化形態で存在 し、該修飾リジンの割合は、食物を調理するときに増加するであろう。これらの 糖化リジン残基はタンパク質合成に利用できないので、リジンの回収経路は、大 いに有用性があり、それを有する生物に選択的な利点を提供する。 糖尿病はリジン回収経路に２つの影響を及ぼす。血中タンパク質は、非糖尿病 個体よりも糖尿病患者から単離された場合に高い濃度の糖化リジンを含有する。 したがって、糖尿病患者は、非糖尿病患者よりもより多くの流量がリジン回収経 路を介することとなる。そのうえ、糖尿病患者および正常体の尿中の３ＤＧおよ び３ＤＦの比率における予備的な観察から、糖尿病患者は、該経路を経て生成さ れる３ＤＧを無毒化する能力が減少するようである。これらの２つの因子が合わ さって、糖尿病患者においてより高い尿中濃度の３ＤＧが生じる（図７参照；ま た、Lalら、Arch．Biochem．and Biophys.，342(1)：254-60(1997)参照）。 リジン回収経路に関わる物質は、腎臓のほかにも他の組織、特に赤血球、水晶 体および末梢神経組織において同定された。これらの組織の全ては、糖尿病の合 併症によって影響を受ける。赤血球中における所在は、糖尿病の微小血管合併症 、例えば、糖尿病性網膜症に相関し、腎臓における所在は、糖尿病性腎障害に相 関し、一方、末梢神経における所在は、糖尿病性末梢神経障害に相関する。これ らの物質は、また、膵臓においても見出される。皮膚におけるこれらの物質の存 在を測定するための実験がなされている。存在することが見出されると、コラー ゲン架橋を防止するために適当なビヒクル中の本発明の阻害物質を用いる典型的 な治療によってそれらの心身に有害な影響を改善し、それにより皮膚の弾力性を 改善し得ると考えられる。 ヒトが３ＤＧおよび３ＤＦの両方を経口的に摂取した糖化リジン残基含有タン パク質から生成することを証明するための実験が行われた。詳細に後記されるこ れらの実験は、リジン回収経路がヒトに存在することを納得のゆくように立証す る。これらの実験は、また、混乱する現象、すなわち、糖尿病性合併症を発病す る糖尿病患者もいれば、不十分な血糖調節であっても、かかる合併症を発病しな い糖尿病患者もいるという現象を解明する。該現象の理由は、本明細書に与えら れたデータから明らかである。糖尿病患者は、３ＤＧを無毒化するための異なる 能力を有する。糖尿病集団のあるサブセットは、多数の糖尿病患者よりも比較的 高いアルデヒド還元酵素活性を有するようである。それゆえ、これらの個体は、 正常レベルよりも高いレベルの３ＤＧを効率よく無毒化することによってリジン 回収経路を通る流量の増加を処理することができる。その能力の減少した者は、 それらの増加した３ＤＧレベルをほとんど無毒化できず、それゆえ、糖尿病性合 併症を発病するより危険な状態にある。 より詳細に後記されるように、リジン回収経路の刺激を糖化タンパク質食餌の 使用によって起こすことができることが、実験的に立証された。前記のＦＬを用 いる場合、ＦＬ３Ｐ、３ＤＧおよび３ＤＦの増加が、糖化タンパク質食餌を与え られた試験動物において観察された。 本発明の酵素インヒビター化合物は、リジン回収経路を遮断し、ＦＬ３Ｐから の毒性３ＤＧの生成を防止する。 後記に、本発明の実施における使用に適当な酵素インヒビターが示すべき一連 の広範囲な特徴、ならびにいずれかの推定インヒビターがこれらの特徴を兼ね備 えるかどうかを決定するためのある特定の試験を記載する。本発明にしたがって 使用するための候補キナーゼインヒビターは、植物または微生物から単離された 天然物であってもよい。別法で、それらは、酵素的反応およびそのメカニズムの 合理的知見から誘導された合成分子であってもよい。インヒビターは、また、コ ンビナトリアル法によって合成されてもよい。コンビナトリアルライブラリーは 、ランダムな開始点から生成してもよい。さらに、コンビナトリアル法を利用し て、以前に同定された標的ＦＬ３Ｐキナーゼのインヒビターに関連した多種多様 な化合物を生成することができる。 推定インヒビターの供給源にかかわらず、後記に挙げる特徴の全てを兼ね備え ない化合物は、リジン回収経路を阻害し、それにより、糖尿病性合併症または関 連する病因の障害の発症を予防、減少または遅延させることができる有用な治療 薬とは考えられない。 １．インヒビターは、小型分子であって、細胞によって容易に吸収されるべき である。該特徴を兼ね備えるために、インヒビターは２，０００未満、より典型 的には、約１，０００ダルトン以下の分子量を有さなければならない。 ２．インヒビターは、ＦＬ３Ｐキナーゼの拮抗的、非拮抗的、不可逆的または 自殺的阻害を示さなければならない。インヒビターが拮抗的または非拮抗的イン ヒビターならば、阻害定数Ｋｉは、約１ｍＭ未満でなければならない。典型的に は、それは、１００μＭ未満、より典型的には、約４０μＭ以下でなければなら ない。インヒビターが自殺的または他の不可逆的阻害を示すならば、阻害定数に 対する該要求は議論の余地がある。 ３．インヒビターは、水性溶液に溶解でき、生理学的ｐＨで水性溶液中で安定 でなければならない。溶解性に対する要求は、インヒビターまたはインヒビター の塩が生理食塩水または血清中に１０μＭ以上の濃度で溶解できる場合のみ、満 たされる。該安定性要求は、３７℃で生理食塩水中に溶解したインヒビター溶液 が１時間インキュベーション後に５０％以上の活性を保持する場合にのみ、満た される。典型的には、インヒビターは１日以上のインキュベーションにおいて５ ０％より大きい活性を保持しなければならない。 ４．インヒビターは、許容できる薬物動力学を示さなければならない。すなわ ち、それは、該物質の投与後少なくとも１時間、治療的に有効な濃度で残存しな ければならない。典型的には、それは、少なくとも８時間有効濃度を維持すべき である。より典型的には、１日に１回の投与が、インヒビターの治療的濃度を維 持するために必要とされる全てであるべきである。該要求は、初めの投与後に、 インヒビターが治療的濃度を確立することができなければならないことを意味し ない。成功した製薬の多くの例が、医学的効果が長時間の投与においてのみ見ら れるものに存在する。特徴は、効果のある濃度に達するとすぐに、該物質の最後 の投与後１時間より長く該濃度を維持できるべきであることを意味する。治療効 果に関する試験を本明細書に記載する。 ５．インヒビターは非毒性でなければならない。該特徴は、治療用量で投与さ れる場合、インヒビターがヒトに毒性を示さないことを要求する。典型的には、 インヒビターが治療効果に必要な２倍の血中および／または標的組織レベルで存 在する場合、毒性は顕性であるべきではない。より典型的には、治療範囲の６倍 以上のレベルではっきりとした毒性があるべきではない。糖尿病性合併症は、長 期のインヒビター治療によって予防できるのみである。したがって、非毒性に対 する要求は、延長した長期の使用によって顕性になるかもしれない急性毒性およ び慢性毒性の両方を包含しなければならない。候補分子の毒性は、よく確立され た動物研究を用いて容易に評価できる。ヒト毒性は、第１段階臨床試験において 評価される。 本発明の実施における有用な化合物の中でも、式： ［式中、Ｘは−ＮＲ'−または−Ｏ−であり、ここでＲ’は、Ｈ、および直鎖ま たは分枝鎖アルキル基（Ｃ₁−Ｃ₄）および非置換または置換アリール基（Ｃ₆− Ｃ₁₀）もしくはアラルキル基（Ｃ₇−Ｃ₁₀）よりなる群から選択され；Ｒは、Ｈ 、アミノ酸残基、ポリアミノ酸残基、ペプチド鎖、置換されていないかまたは少 なくとも１個の窒素もしくは酸素−含有置換基で置換されている直鎖または分枝 鎖脂肪族基（Ｃ₁−Ｃ₈）、置換されていないかまたは少なくとも１個の窒素−も しくは酸素−含有置換基で置換され、少なくとも１個の−Ｏ−、−ＮＨ−もしく は−ＮＲ''−部分によって割り込まれた直鎖または分枝鎖脂肪族基(Ｃ₁−Ｃ₈)よ りなる群から選択される置換基であり、ここでＲ’’は、直鎖または分枝鎖アル キル（Ｃ₁−Ｃ₆）および非置換または置換アリール基（Ｃ₆−Ｃ₁₀）もしくはア ラルキル基（Ｃ₇−Ｃ₁₀）であり、但し、Ｘが−ＮＲ’−を示すならば、Ｒおよ びＲ’はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜７個の環原子を有する 置換または非置換複素環式環を示してもよく、少なくとも１個の窒素および酸素 が該環において唯一のヘテロ原子であり、該アリール基（Ｃ₆−Ｃ₁₀）またはア ラルキル基（Ｃ₇−Ｃ₁₀）および該複素環式環置換基は、Ｈ、アルキル(Ｃ₁−Ｃ₆ )、ハロゲン、ＣＦ₃、ＣＮ、ＮＯ₂および−Ｏ−アルキル（Ｃ₁−Ｃ₆）よりなる 群から選択され； Ｒ₁は、１〜４個の直鎖炭素原子を有するポリオール部分であり、Ｙはカルボ Ｚは、−Ｈ、−Ｏ−アルキル（Ｃ₁−Ｃ₆）、−ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＣＮ、 −ＣＯＯＨおよび−ＳＯ₃Ｈ₂および所望により−ＯＨよりなる群から選択される ］ で示される化合物ならびに該化合物の異性体および医薬上許容される塩が包含さ れる。 窒素または酸素含有”Ｒ”置換基の実例は、γ−アミノ−α−ヒドロキシ酪酸 （−（ＣＨ₂）₂−ＣＨＯＨ−ＣＯＯＨ）、１，２，４トリアミノブタン（−（Ｃ Ｈ₂）₂−ＣＨＮＨ₂−ＣＨ₂ＮＨ₃）、３，６−ジアミノ−５−ヒドロキシヘプタ ン酸（−ＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂−ＣＨ（ＮＨ₂）−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）など から誘導される置換基を包含する。 式Ｉの構造は不斉中心を有し、ラセミ化合物、ラセミ混合物および種々の立体 異性体ならびにその混合物として生じ、かかる異性体形態の全てが本発明の範囲 内にある。 前記の式Ｉの構造を有するある特定の化合物は以前に知られていたが、その他 のものは新規であると考えられ、イン・ビボでの３ＤＧの酵素触媒的生成を阻害 するための式Ｉの全ての化合物の使用と同様に、それ自体、本発明の範囲内にあ る。 前記の式のインヒビターは、適当な糖、例えば、グルコース、ガラクトース、 マンノース、リボース、キシロース、またはその誘導体とアミノ酸または他の適 当な第１もしくは第２アミンを反応させることによって調製して、カルボニル部 分を有するインヒビター（すなわち、Ｙ＝−Ｃ（＝Ｏ）−）を得てもよい。別法 で、糖、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、リボース、キシロー スなどを本明細書に記載の型のアミノ−またはヒドロキシル−置換反応物とＮａ ＢＨ₃ＣＮのような選択的にシッフ塩基中間物質をアミンに還元する試薬の存在 下で反応させ、それにより、アルコール部分を有するインヒビター（すなわち、 Ｙ＝−ＣＨ（−ＯＨ）−）を生成してもよい。アミノ酸反応物を使用する場合、 アミノ酸反応物の反応性部分は、α−炭素におけるアミン基または酸側鎖におけ るアミン基もしくはヒドロキシル基であってもよい。適当なアミノ酸は必須アミ ノ酸を包含する。特定の例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロ イシン、セリン、スレオニン、メチオニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン 、チロシン、ヒスチジンおよびトリプトファンを限定することなく包含する。他 の適当な反応物は、より幅広い種類のアミノカルボン酸、例えば、ピログルタミ ン酸、ベーターアラニン、ガンマーアミノ酪酸、イプシロン−アミノカプロン酸 など由来である。前記アミノ酸のＮ−アシル誘導体、例えば、ホルミルリジンも ま た、所望により使用してもよい。 他の適当な反応物は、限定するものではないが、非置換または置換基がアルキ ル（Ｃ₁−Ｃ₃）、アルコキシ、カルボキシ、ニトロもしくはハロゲン基であって もよい置換アリール（Ｃ₆−Ｃ₁₀）化合物、非置換または置換基が少なくとも１ 個のアルコキシ基であってもよい置換アルカン；あるいは非置換または置換基が アルキル（Ｃ₁−Ｃ₃）、アリール（Ｃ₆−Ｃ₁₀）、アルコキシ、カルボキシ、ニ トロもしくはハロゲン基であってもよい置換含窒素複素環式化合物を包含する。 最後に記載した反応物群の実例は、ｍ−メチル−、ｐ−メチル−、ｍ−メトキシ −、ｏ−メトキシ−およびｍ−ニトロ−アミノベンゼン、ｏ−およびｐ−アミノ 安息香酸；ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、３−メトキシプロピルアミ ン；モルホリンおよびピペリジンを包含する。 前記の式を有する代表的なインヒビター化合物を添付の表Ａに示す。本発明の 実施においてインヒビターとして使用してもよい既知化合物の例は、限定するも のではないが、メグルミン、ソルビトールリジンおよびマンニトールリジンを包 含する。 本明細書に記載のインヒビター化合物は、種々の無機または有機酸または塩基 と医薬上許容される塩を形成できる。適当な塩基は、例えば、アルカリ金属塩、 アルカリ土類金属塩、アンモニウム、置換されたアンモニウムおよび他のアミン 塩を包含する。適当な酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸およびメタンスルホン酸 を包含する。 式Ｉの化合物の医薬上許容される塩は、当業者によく知られている手法にした がって調製できる。 化合物のＦＬ３Ｐキナーゼを阻害する能力は、多種多様なキナーゼ活性アッセ イを用いて測定できる。一の有用なアッセイは、可能なインヒビターをフルクト ース−リジンおよびＡＴＰと共に腎臓ホモジネートまたは他の酵素供給源の存在 下でインキュベートすることを含む。典型的には、１ミリモル以下の本発明のイ ンヒビター化合物、１−１０ミリモルの範囲の量のフルクトースリジン（ＦＬ） 、０．１−１０ミリモルの範囲の量のＡＴＰおよびＦＬのフルクトースリジン− ３−リン酸への変換に十分な量の酵素供給源を含有するアッセイ成分の溶液を調 製 する。インキュベーションは、ｐＨ４．５ないし９．５の範囲内、典型的には中 性かまたは中性付近のｐＨで行うべきである。インキュベーションは、酵素活性 に適合する温度、４〜４０度で行うべきである。典型的には、インキュベーショ ンは、生理学的温度で行う。インキュベーション後、タンパク質の酸性沈殿によ って反応を終止し、ＦＬ３Ｐの生成を³¹Ｐ−ＮＭＲ分光法によって測定する。 インヒビターを含まない対照試料と比較して、インヒビター化合物を含有する試 料において、ＦＬ３Ｐ生成が減少または消去するであろう。 他のアッセイは、酵素阻害の迅速な測定に対して有用性を有する。一のかかる アッセイは、フルクトース−リジンおよびγ−標識³²Ｐまたは³³Ｐ−ＡＴＰの使 用を含む。ＦＬ３ＰはＤｏｗ−１に結合しないが、ＡＴＰおよび他のほとんどの リン酸塩は結合するので、予め決定した反応時間、典型的には１０分後にＤｏｗ −１樹脂のカラムにアッセイ溶液を通過させることによって、生成ＦＬ３Ｐを残 りの反応混合物から分離することが可能である。得られた溶液をシンチレーショ ン液、例えば、Ｅｃｏｓｃｉｎｔ Ａの容器に添加し、カウントして、生じた放 射能の量を測定する。 大量のヒト組織を入手するのは困難なので、イー・コリ（E．Coli）のような 発現系中でクローン化されたキナーゼの組換え型を使用するのが望ましい。クロ ーン化キナーゼは、組織特異的ｃＤＮＡライブラリーの「ショットガン」クロー ニングから容易に得ることができる。かかるライブラリーは、市場から容易に入 手できる。例えば、それらをカリフォルニア州パロアルトのクロンテック（Clon tech）から入手してもよい。構想されるショットガンクローニングは、カリフォ ルニア州サンディエゴにあるストラタジェン（Stratagen）から商業上入手可能 なラムダクローニングシステムを用いて行ってもよい。該クローニングキットは 、その使用に関する詳細な説明書を含む。 本発明の製剤は、活性成分として１以上の前記の化合物を医薬上許容される担 体媒質または補助剤と共に含んでなる。 これらの成分は、液体および固体の両方を包含する投与のための種々の形態で 調製してもよい。したがって、製剤は、錠剤、キャプレッツ、丸剤または糖衣錠 の形態であってもよく、あるいはカプセルのような適当な容器中に充填でき、ま たは、懸濁液の場合、瓶に充填できる。本明細書で使用される場合、「医薬上許 容される担体媒質」なる語は、個々の所望の投薬形態に適するような、いずれか および全ての溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁補助剤、 界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などを包 含する。適当な担体媒質の代表例は、ゼラチン、ラクトース、デンプン、ステア リン酸マグネシウム、タルク、植物性および動物性脂肪および油、ゴム、ポリア ルキレングリコールなどを包含する。Remington's Pharmaceutical Science、第 １５版（Mack Publishing Co.，Easton，PA 1975）においてE．W．Martinは、医 薬組成物の処方において使用される種々の担体およびその調製のための既知技術 を開示している。いずれかの従来の担体媒質が本発明の酵素インヒビターと、例 えば、いずれかの望まれない生物学的効果を生じるか、またはそうでなくとも、 製剤のいずれか他の成分と心身に有害な方法で相互作用することによって適合し ない範囲を除いて、その使用は本発明の範囲内にあるとされる。 本発明の製剤において、活性剤は、もしあれば担体媒質および／または補助剤 を包含する製剤の全重量を基準にして、少なくとも５重量％、一般には９８重量 ％以下の量で存在してもよい。好ましくは、活性剤の割合を組成物の６５重量％ 〜９５重量％に変化させる。 好ましい補足活性剤は、イン・ビボで３ＤＧに結合する化合物である。この種 の化合物は、限定するものではないが、アミノグアニジン、アミノ安息香酸およ びその誘導体、システインおよびその誘導体、アミノ置換イミダゾール、１，２ −二置換ベンゾイミダゾール、置換１，２，４−トリアゾール、ジアミノピリジ ンおよびその誘導体、アミノ置換ピリミジン、アミノアルコール、ジアミンなど を包含する。特にアンギオテンシン−変換酵素（ＡＣＥ）インヒビターを包含す る抗高血圧薬もまた、補足活性剤として本発明の製剤に包含され得る。 胃において活性化合物を酸分解から保護するかまたは活性化合物の血流への吸 収を促進する化合物のような補助剤もまた、必要または所望ならば、製剤に組み 込むことができる。かかる補助剤は、例えば、胃における酸性条件を部分的にオ フセットするホウ酸塩または他の塩のような錯化剤などを包含し得る。活性化合 物を脂肪酸の塩として（活性化合物が１以上の塩基性官能基を有する場合）デリ バリーすることによって、吸収を増加できる。 いずれかの補足活性成分と一緒に本発明の化合物を、ＦＬ３Ｐリジン回収経路 の阻害に有効ないずれかの量およびいずれかの投与経路を用いて投与してもよい 。したがって、本明細書で使用される「治療上有効量」なる表現は、非毒性であ るが、糖尿病性合併症を妨げるためまたは他の病因となる３ＤＧの代謝生成を阻 害するための所望の治療を提供する、例えば、老化の影響またはＡＧＥタンパク 質形成が原因となる他のヒトの病態を減少させるのに十分な量の酵素インヒビタ ーをいう。要求される正確な量は、患者の種、年齢および一般的な条件、合併症 の種類、個々の酵素インヒビターおよびその投与様式によって変化し得る。 本発明の化合物は、好ましくは、投与の容易さおよび投薬の均一性のための投 薬形態で処方される。本明細書で使用される投薬単位形態とは、治療されるべき 患者に適当な酵素インヒビターの物理的に分離した単位をいう。各投薬は、所望 の治療効果を生じるように算出された量の活性物質をそれ自体でまたは選択され た医薬担体媒質と一緒に含有すべきである。典型的には、本発明の化合物は、製 剤の重量あたり約１ｍｇ〜約２，５００ｍｇの化合物を、好ましくは、約５ｍｇ 〜約２５０ｍｇの範囲で含有する投薬単位で投与されるであろう。 本発明の化合物は、治療すべき糖尿病性合併症の種類によって、経口的、非経 口的、例えば、筋内注射、腹膜内注射、静脈内点滴などによって投与してもよい 。本発明の化合物は、所望の治療効果を得るために、１日に患者の体重あたり約 ０．７μｇ〜約２０ｍｇ、好ましくは、約３０μｇ〜約３．５ｍｇ／ｋｇの投薬 レベルで、１日に１回以上、経口または非経口的に投与してもよい。 経口的に活性な酵素インヒビターが特に好ましく、供給される経口投与量は、 治療上活性なインヒビターの血中および／または標的組織レベルを生じることが できる。当業者は、血液、腎臓および他の標的組織の除タンパク質試料中の小型 分子インヒビターのレベルを容易に測定することができる。これらの試料中のイ ンヒビター濃度は、予め決定した阻害定数と比較することができる。阻害定数よ りはるかに低い組織レベルは、治療活性の不足を示す。不可逆性インヒビターの 場合、この不足は、各組織におけるＦＬ３Ｐキナーゼレベルのアッセイによって 確認または異議を唱えることができる。全ての場合、ヒトまたは動物対象に糖化 リジン残基またはフルクトース−リジンに富む食物を与え、食物摂取前および後 の両方で、それらの尿中の３ＤＧおよび３ＤＦの量を測定することによって、治 療活性を評価することができる。それらの系において治療上活性なインヒビター を有する対象は、さらに詳細に後記するように、インヒビター治療前のこれらの 同一の対象による分泌レベルと比べて、３ＤＧおよび３ＤＦの両方の分泌が減少 し、フルクトース−リジンの尿への分泌が増加するであろう。 本発明の化合物は、典型的には、選択された的確なインヒビターに依存して、 １日に１回または１日に４−５回まで投与されるであろう。１日１回の投与計画 が好ましいが、糖尿病患者は病態に細かい注意を払うことに慣れているので、前 記の１日の投与量をデリバリーするように、必要ならば、より頻繁な投与計画を 容易に受け入れるであろう。しかしながら、本明細書に記載の化合物および組成 物の的確な投与計画は、必然的に、治療すべき患者個人の要求、投与される治療 の型および担当する内科医の判断によるであろう。本明細書に使用される場合、 「患者」なる語は、ヒトおよび動物の両方を包含する。 本明細書に記載のインヒビター化合物は、糖尿病性合併症、特に、糖尿病患者 の４０％より多くが罹患し、透析および移植を必要とする末期腎疾患の主用な原 因である糖尿病性腎障害を妨げるのに有用である。そのほか、これらのインヒビ ターは、ＡＧＥタンパク質の生成に関与する他の病状、例えば、高血圧、卒中、 神経変性障害、例えば、アルツハイマー型の老人痴呆、循環性疾患、アテローム 性動脈硬化症、骨関節炎、白内障および老化の一般的な衰弱する影響の予防また は治療に用いてもよい。 予備実験は、重い健康を害する影響が糖化タンパク質の長期間の消費によるリ ジン回収経路の刺激の結果、生じることを示した。ＦＬを用いる場合、ＦＬ３Ｐ 、３ＤＧおよび３ＤＦの増加が糖化タンパク質食餌を与えられた試験動物におい て観察された。表Ｂ参照のこと。後記の実施例１０においてさらに記載されるよ うに、かかる食餌の８ヶ月後、糖尿病の腎臓に見られるものと類似する腎臓病状 の明らかな証拠が、糖化タンパク質食餌における動物に見られた。また、３ＤＧ および３ＤＦレベルの一時的な増加が、少量の糖化タンパク質を食べたヒトボラ ンティアの尿中に観察された。 新たに見出されたリジン回収経路の刺激は、全身の３ＤＧレベルの実質的な増 加を導くので、糖化食餌が妊娠に対して有意な影響を引き起こすかどうかを決定 するために研究が行われた。これまでに得られた結果は、後記の実施例において 明らかなように、該経路のために非常に強い影響があることを示す。 さらに、ラットおよびマウスの感受性系統において、若い時期（離乳後）に動 物に与えられる食餌は、１０％〜９０％の範囲の発病率で、１型糖尿病の発病率 に対して著しく影響し得ることが知られている。過去１０年にわたってこの現象 の研究に相当な努力がなされてきた。例えば、Diabetes，46(4)：589-98（1997 ）およびDiabetes Metab．ReV.，12(4)：341-59(1996)ならびにそこに引用され た参考文献を参照のこと。糖尿病の誘導のために両極端な２つの食餌に関する研 究が本発明者らの幾人かによって行われた。ＡＩＮ−９３（Dyets，Inc.）は、 最も低い糖尿病の発病率を引き起こし、今まで観察された最も低い比率の尿中３ ＤＦ／クレアチニン（１．０）を生ずる。ピュリーナ５００は、最も高い糖尿病 の発病率を誘導し、３ＤＦ／クレアチニン比において２．５倍増加を生ずる。Ｆ Ｌ３Ｐ、３ＤＧおよび３ＤＦはラットの膵臓において観察されたので、フルクト ースリジンキナーゼおよび該代謝経路の代謝産物は、Ｉ型糖尿病の発現に関係す るようである。この型の糖尿病に感受性の動物（ヒトにおけるインスリン依存ま たはＩ型糖尿病の有用なモデル）は、該動物を膵臓のβ細胞において発現する未 知抗原に対して感受性にし、その結果、そのβ細胞における動物自身の免疫系に よる自己免疫攻撃を生じる異常な免疫系を有する。この結果、次いでそ れらの破壊が生じ、それにより、動物からインスリンを製造する能力を奪う。タ ンパク質と反応する３ＤＧが新規な抗原部位を作成できることは、よく知られて いる。したがって、種々の食餌の抗原性の性質の起源は、膵臓においてフルクト ースリジン−３−リン酸の分解によって生成される３ＤＧであるようである。 また、３ＤＧは一般にアミンと相互作用することが知られているので、それは ＤＮＡと相互作用でき、架橋タンパク質と同様に、突然変異誘発および発癌の可 能性を示すかもしれない。 ＦＬ３Ｐリジン回収経路の知見により、初めて、糖尿病の集団を区別すること および該集団のサブセットが糖尿病性合併症を発現しそうであることを決定する ことが実用的になる。この決定は、都合のよいことに、試験対象の生物学的液体 、例えば、血液フラクション（特に血漿または血清）、リンパ液、間質液などで 行うことができる。 一晩絶食後、ヒト対象に比較的高濃度の糖化リジン残基を含有する食物供給源 を与える。例として、該食物は、後記の実施例５に記載のようなカゼイン／糖「 クッキー」、または糖化リジンもしくは合成フルクトース−リジンのいくつかの 他の適当な供給源の形態であることができる。糖化リジン残基を含有するタンパ ク質を利用する場合、糖化リジン含量は、好ましくは、全タンパク質アミノ酸の ０．０２〜１０％、またはより好ましくは、約０．２〜０．４％であるべきであ る。経口投与量において糖化リジン残基の全量は、約０．３グラムであるべきで ある。好ましくは、糖化リジン供給源の消費前に、次いで、１、３および５時間 後にまたは個々の臨床状況によって保証され得るような他の適当な時間に尿試料 を収集する。 これらの尿試料中の３ＤＧおよび３ＤＦレベルを測定し、これらの代謝産物比 を算出する。該測定に利用した特別の方法論は、本発明の実施に必須ではない。 後記の実施例５に記載のＧＣ法を所望により利用してもよい。当業者に明らかな ように、別法では、比色または免疫学的アッセイ方法を使用できる。 近年完成した糖尿病調節（Diabetes Control）および合併症試験（Complicati ons Traial）によって明白に立証されたように、糖尿病患者が直面する主要な危 険因子が血糖調節であることは明らかである。しかしながら、糖尿 病性合併症の発病率は、単に血糖レベルによって説明できず；糖尿病性合併症の 発病率を歴史的な血糖レベルと比較する場合、本当に幅広い分散が見られる。 糖尿病性合併症を発現する最も危険な状態にある糖尿病集団のサブセットを決 定する一の方法は、本発明の特に有意な態様である。該方法は、糖化リジンの供 給源を摂取する前および最適には、摂取した後でのＦＬ、３ＤＧおよび３ＤＦレ ベルの測定を含む。 例えば、正常な対象は、約０．０２５の空腹時の尿中３ＤＧ対３ＤＦ比を有す るが、糖尿病患者は、５倍以上の高い比率を有する。このことは、正常な血糖者 は０．０２５（１／３９．７７）の３ＤＧ／３ＤＦ比を該値周辺の本当に狭い分 散とともに有するが、糖尿病患者は２倍より大きい平均比率（平均０．０６９） を平均値周辺の非常により大きな分散とともに有する図７のデータにより支持さ れる。 本明細書で示されるように、糖尿病患者は、３ＤＧの生成が増加する。したが って、糖尿病性合併症に対する耐性は、該毒性代謝産物の非常に有効な除去を必 要とする。本明細書に記載の方法で算出された３ＤＧの３ＤＦに対する比率によ り、３ＤＧ無毒化経路の効率を評価することができる。低い比率を有する個体は 、一般に、糖尿病性合併症の発現に対して耐性であろう。正常な範囲内に含まれ る比率を包含するより高い比率を有する個体は、より危険な状態にあるが、正常 な範囲より上の高い比率を有する個体が、これらの合併症を発現する特に危険な 状態にある。 ４つの異なるラット系統の血漿および尿中におけるフルクトースリジン（ＦＬ ）の最近の測定は、それら各々の腎臓が血中ＦＬを処理する方法においてかなり の変化性を示した。４系統のうち２つ（Long Evans，Brown Norway）において、 クレアチニンに対する該化合物およびその代謝産物の比率に基づいて、腎臓によ ってろ過された事実上全てのＦＬが尿中に現れた。他の２つの系統（Sprague Da wley，Fischer）では、クレアチニンフラクションとの比較に基づいて、血漿中 ＦＬの１０−２０％が尿中に現れた。これらの測定は、哺乳動物の腎臓における ＦＬ処理の主要な変化性を強く示唆する。げっ歯類およびヒトの腎臓はほとんど 機能的に同等であることがわかっているので、ＦＬ処理における同様の変化が ヒトに存在するであろうと仮定することが理にかなっている。ＦＬは、フルクト ースリジン回収経路への第１の投入物であるので、経路全体は、大量のＦＬを限 外ろ過液から吸収したヒトにおいて実質的に刺激されているようであり、それは 、腎臓ならびに全身に３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）の高い局所的レベルを 導く。この観察は、尿試料と同時に得られる血漿または血清の試料との比較によ りＦＬの腎臓への流量および尿中に現れるその流量のフラクションを決定する診 断試験の基礎として役立つかもしれない。次いで、この比率が実質的に１よりも 低い個体は、限定するものではないが、糖尿病性腎障害、老齢における腎不全お よび腎臓癌を包含する種々の腎臓の病状を発現する危険な状態にある。 本発明のキナーゼインヒビターの治療効果は、リジン回収経路の試験を用いて 容易に安全に決定することができる。試験プロトコールは、尿中３ＤＧおよび３ ＤＦレベルに加えて尿中フルクトースリジンレベルを測定すること以外は、直前 に前記したものと同一である。ＦＬ３Ｐキナーゼインヒビター治療の開始前およ び開始後の両方でこの試験を行うことが有用である。３ＤＧおよび３ＤＦの尿中 レベルは各時点で合計し、同一の試料中で測定したフルクトースリジンのレベル と比較する。 糖化リジン残基に富む食物を摂取後に尿中に見られる３ＤＧおよび３ＤＦの最 高レベルは、リジン回収経路の活性によって誘導される。これらの代謝産物濃度 の非反応性フルクトース−リジン（ヒトの尿の通常の成分である）に対する比率 は、該経路の活性を反映する。リジン回収経路の阻害は、排出される３ＤＧおよ び３ＤＦ量の減少、およびフルクトース−リジンの排出量の増加を引き起こすで あろう。したがって、キナーゼインヒビターの治療効果は、阻害治療後の（３Ｄ Ｇ＋３ＤＦ）／フルクトース−リジン比の減少を測定することによって定量する ことができる。該アッセイの解釈において、尿容量または代謝産物濃度が要因で あるのではなく、代謝産物の比率のみが考慮されることに注目すべきである。 高濃度の糖化リジン残基を含有する経口的に消化される食物が腎臓および血清 ３ＤＧの生成を導くであろうことは、先の開示から認められよう。腎臓疾患の危 険性のある個体、例えば、糖尿病患者に、これらを高濃度で有する食物を避ける ように警告することが理にかなっている。糖化リジン残基の濃度は、多種多様な 方法で測定できる。１のかかる測定法を後記の実施例４に記載する。しかしなが ら、正確に糖化リジン残基のレベルを測定するいずれかの適当な測定法を後記に 例示したアッセイ方法の代わりに用いることができる。特に考えられるアッセイ 方法の例は、限定するものではないが、比色および免疫学的方法を包含する。 用いる測定法にかかわらず、調理食品中の糖化リジン残基の含量を測定するこ と、および腎不全を発現する危険性のある個体が糖化リジン含量の高い食品を摂 取することを控えるように、これらの測定値を該個体に通告することは、本発明 の範囲内である。 以下の実施例は、本発明をさらに詳細に記載するために提供される。これらの 実施例は実例となる目的のみに提供されるものであり、いかなる方法において、 本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。別記しない限り、実施例 に与えられる全ての温度は摂氏である。 実施例１ ＦＬ３Ｐの単離および同定： 糖尿病ラット腎臓の過塩素酸抽出物の³¹Ｐ ＮＭＲ分析は、６．２４ｐｐｍに 非腎臓組織では観察されず、非糖尿病腎臓では非常に低いレベルで存在する新規 な糖一リン酸共鳴を示した。観察された共鳴の原因である化合物は、溶出液とし て１−ブタノール−酢酸−水（５：２：３）を用いる微結晶セルロースカラム上 での抽出のクロマトグラフィーによって単離した。プロトン２Ｄ ＣＯＳＹによ って、構造をフルクトース−リジン３リン酸であると決定した。このことは、後 に、以前に記載されたように（Finot and Mauson，Helv．Chim．Acta，52:1488( 1969)）調製されたＦＬを動物に注射し、ＦＬ３Ｐへの直接のリン酸化を明らか にすることによって確かめられた。３−位を特異的に重水素化したＦＬを用いて 、炭素−３でのリン酸塩の位置を確かめた。このことは、カップリングおよびデ カップリングした両方の³¹Ｐ ＮＭＲスペクトルを分析することによって行った 。通常のＰ−Ｏ−Ｃ−Ｈカップリングは、１０．３ＨｚのＪ値を有してＦＬ３Ｐ において２重線を生じるが、３−重水素化ＦＬ３Ｐの場合、Ｐ−Ｏ−Ｃ−Ｄはカ ッ プリングを有さず、カップリングおよびデカップリングした両方で１重線を生じ る。ＦＬ３Ｐの独特の特性は、水素化ホウ素ナトリウムで処理したとき、マンニ トールおよびソルビトール−リジン３リン酸に相当する５．８５および５．９５ ｐｐｍの２つの新たな共鳴に変換されることである。 実施例２ ＦＬ３Ｐの合成： １ミリモルのジベンジルグルコース３−リン酸および０．２５ミリモルのα− カルボベンゾキシ−リジンを５０ｍｌのＭｅＯＨ中で３時間還流した。溶液を１ ００ｍｌの水で希釈し、ピリジニウム形態でＤｏｗ−５０カラム（２．５ｘ２０ ｃｍ）上のクロマトグラフィーに付し、最初に水（２００ｍｌ）で、次いで６０ ０ｍｌのバッファー（０．１Ｍピリジンおよび０．３Ｍ酢酸）で溶出した。標的 化合物は、水洗浄の終わりとバッファー洗浄の始めに溶出した。水素２０ｐｓｉ にて５％Ｐｄ／Ｃを用いるｃｂｚおよびベンジルブロッキング基の除去により、 ６％収率でＦＬ３Ｐを得た。 実施例３ ＦＬおよびＡＴＰからＦＬ３Ｐへの酵素的生産ならびに、インヒビターをスク リーニングするためのアッセイ： 最初に、³¹Ｐ ＮＭＲを用いて、腎臓皮質におけるキナーゼ活性を示した。新 鮮なブタ腎臓皮質の試料３ｇを、９ｍｌの１５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭＤＴＴ、 １５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５中でホモジネ ートした。これを１０，０００ｇで３０分間遠心分離し、次いで、上清を１００ ，０００ｇで６０分間遠心分離した。硫酸アンモニウムを６０％飽和まで添加し た。４℃で１時間後、遠心分離によって沈殿を収集し、５ｍｌの元のバッファー 中に溶解した。該溶液の２ｍｌアリコートを１０ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭの ＦＬ（前記の実施例１のように調製した）とともに３７℃で２時間インキュベー トした。３００μｌの過塩素酸で反応をクエンチし、遠心分離でタンパク質を除 去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０カラム（５ｘ１０ｃｍ）上で脱塩した。反応 混合物の³¹Ｐ ＮＭＲ分析により、ＦＬ３Ｐの生成を検出した。 このように得られたキナーゼ活性の証明に基づいて、放射能アッセイを発展さ せた。該アッセイは、ＦＬ３ＰによるＤｏｗ−１陰イオン交換樹脂への結合がな いことを利用するように設計された。ＦＬ３Ｐのこの特徴は、それを単離するよ う努力する間に見出された。大抵のリン酸塩は該樹脂に結合するので、ＡＴＰと 反応する全ての化合物はいずれかの過剰のＡＴＰと同様に結合され、溶液中にＦ Ｌ３Ｐを残すと考えられた。第１の段階は、アッセイにおいてＡＴＰを除去する のに必要な樹脂の量を決定することであった。これは、混合物を０．９ｍｌ Ｈ₂ Ｏ中２００ｍｇのＤｏｗ−１懸濁液中にピペットで入れ、ボルテックスし、遠心 分離して樹脂をパック（pack）することによって達成された。これから上清０． ８ｍｌをピペットで２００ｍｇの新しい乾燥樹脂上に移し、ボルテックスし、遠 心分離した。０．５ｍｌ容量の上清をピペットで１０ｍｌのＥｃｏｓｃｉｎｔ Ａ中に入れ、カウントした。残留カウントは８５ｃｐｍであった。該手法をアッ セイに用いた。粗皮質ホモジネートの６０％硫酸アンモニウム沈殿由来の沈殿を ４℃でホモジネートバッファー中に再溶解した。アッセイは、５０ｍＭトリスＨ Ｃｌ、ｐＨ７．５の０．１ｍｌ中における１０ｍＭ γ³³Ｐ−ＡＴＰ（４０，０ ００ｃｐｍ）、１０ｍＭ ＦＬ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍ Ｍ ＤＴＴを含有する。ＦＬ３Ｐ生成と酵素濃度の間の関係は、１、２および４ ｍｇのタンパク質を用いて３７℃で３０分間の３重測定を用いて決定する。ＦＬ を含まずに行うブランクを減じ、データを記録した。観察された活性は、およそ のＦＬ３Ｐ合成速度２０ナノモル／時間／ｍｇタンパク質に相当した。 実施例４ メグルミンおよび種々のポリオールリジンによる３−デオキシグルコソンの生 成の阻害 ａ．一般的なポリオールリジン合成 糖（１１ミリモル）、α−カルボベンゾキシ−リジン（１０ミリモル）および ＮａＢＨ₃ＣＮ（１５ミリモル）を５０ｍｌのＭｅＯＨ−Ｈ₂Ｏ（３：２）中に溶 解し、２５℃で１８時間攪拌した。溶液を過剰のＤｏｗ−５０（Ｈ）イオン交 換樹脂で処理して、過剰のＮａＢＨ₃ＣＮを分解した。該混合物（液体プラス樹 脂）をＤｏｗ−５０（Ｈ）カラム（２．５ｘ１５ｃｍ）上に移し、水でよく洗浄 して過剰の糖およびホウ酸を除去した。カルボベンゾキシ−ポリオールリジンを ５％ＮＨ₄ＯＨで溶出した。蒸発で得られた樹脂を水−メタノール（９：１）中 に溶解し、木炭上の１０％パラジウム触媒を用いて水素ガス（２０ｐｓｉ）で還 元した。ろ過および蒸発により、ポリオールリジンを得る。 ｂ．ソルビトールリジン、マンニトールリジンおよびガラクチトールリジンに よる尿および血漿３−デオキシグルコソンの減少のための実験プロトコール ６匹のラットから３時間、尿を収集した。血漿試料も得た。次いで、動物に腹 膜内注射によってソルビトールリジン、マンニトールリジンまたはガラクチトー ルリジンのいずれかを１０マイクロモル与えた。さらに３時間、尿を収集し、３ 時間の最後に血漿試料を得た。 後記の実施例５に記載のように、３−デオキシグルコソンをこれらの試料中で 測定し、種々の容量をクレアチニンに対して標準化した。尿中３−デオキシグル コソンの平均減少は、ソルビトールリジンにより５０％、マンニトールリジンに より３５％およびガラクチトールリジンにより３５％であった。血漿３−デオキ シグルコソンは、ソルビトールリジンにより４０％、マンニトールリジンにより ５８％およびガラクチトールリジンにより５０％減少した。 ｃ．尿中３−デオキシグルコソンを減少させるためのメグルミンの使用 前記のリジン誘導体の代わりにメグルミン（１００マイクロモル）を腹膜内注 射する以外は、前記のｂ）のとおりに３匹のラットを処理した。注射後３時間で 尿中の平均３−デオキシグルコソン濃度が４２％減少した。 実施例５ 糖化タンパク質の注射後のヒトにおける尿中ＦＬ、３ＤＧおよび３ＤＦの増加 ａ．糖化タンパク質含有食品の調製： ２６０ｇのカゼイン、１２０ｇのグルコースおよび７２０ｍｌの水を混合して 、均一混合物を得た。該混合物を金属プレートに移し、６５℃で６８時間調理し た。次いで、得られたケーキをコース（course）粉末になるまで砕いた。 ケルダール法によって測定すると、該粉末は６０％タンパク質を含有した。 ｂ．糖化リジン含量の測定： 前記の工程ａのように調製した粉末１ｇを６Ｎ ＨＣｌで２０時間還流するこ とによって加水分解した。得られた溶液をＮａＯＨ溶液でｐＨ１．８に調整し、 １００ｍｌに希釈した。フルクトースリジン含量は、フルクトースリジンの酸加 水分解から得られた生成物、フロシン（furosine）としてアミノ酸分析器で測定 した。該方法において、ケーキが５．５％（ｗ／ｗ）フルクトースリジンを含有 したことを測定した。 ｃ．実験プロトコール： ボランティアはフルクトースリジン無しの食事で２日間過ごし、次いで、本明 細書に記載のように調製した食品２２．５ｇを消費し、したがって実際上、２ｇ のフルクトースリジンの投与を受けた。１４時間、２時間間隔で尿を収集し、最 後の収集を２４時間目に行った。 ｄ．尿中のＦＬ、３ＤＧおよび３ＤＦの測定： ＦＬは、４６℃でＷａｔｅｒｓ Ｃ１８ Ｆｒｅｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄカラム および１ｍｌ／分でアセトニトリル−メチルアルコール−水（４５：１５：４０ ）からアセトリトリル−酢酸ナトリウム−水（６：２：９２）への勾配溶出系を 用いるＷａｔｅｒｓ９９６ダイオードＡｒｒａｙでのＨＰＬＣによって測定した 。定量は、メグルミンの内部標準を使用した。 ３ＤＦは、試料の脱イオン化後にＨＰＬＣによって測定した。分析は、ＰＡ１ カラム（Dionex）を用い、３２ｍＭ水酸化ナトリウムを用いて１ｍｌ／分で溶出 するＤｉｏｎｅｘ ＤＸ−５００ＨＰＬＣシステムで行った。定量は、合成３Ｄ Ｆで１日に得られた標準曲線から行った。 ３ＤＧは、試料の脱イオン化後にＧＣ−ＭＳによって測定した。３ＤＧは、Ｐ ＢＳ中の１０倍過剰のジアミノナフタレンを用いて誘導された。酢酸エチル抽出 により、塩を含まないフラクションを得、それをＴｒｉ−Ｓｉｌ（Pierce）でト リメチルシリルエーテルに変換した。分析は、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ５８９０選択イオンモニタリングＧＣ−ＭＳシステムで行った。ＧＣは、以下の 温度プログラム：注入口２５０℃、開始カラム温度１５０℃で１分間保持し、次 いで、１６℃／分で２９０℃まで上昇させ、１５分間保持する、を用いる融解シ リカキャピラリーカラム（ＤＢ−５，２５ｍｘ．２５ｍｍ）で行った。３ＤＧの 定量は、Ｕ−１３Ｃ−３ＤＧの内部標準を用いる選択イオンモニタリングを用い た。 図３に示すグラフは、糖化タンパク質消費後の１ボランティアの尿中における ＦＬ、３ＤＦおよび３ＤＧの生成を示す。３つの代謝産物全ての迅速な出現が明 らかである。３ＤＦおよび３ＤＧの両方が、２４時間後でさえもわずかな上昇を 示す。 図４に示すグラフは、７人の試験群のメンバー各々における３ＤＦの生成を示 す。同様なパターンが全ての場合に見られる。図４に明らかなように、３ＤＦ排 出は、ＦＬ食塊(bolus)後４時間で最高になり、食塊後２４時間でさえ３ＤＦの わずかな上昇があることに注目すべきである。 実施例６ 摂食実験： Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧａｓｅ）は、糖尿病患者にお いて高濃度で尿中に排出される酵素である。それは、管損傷の初期の目印である と考えられているが、尿中ＮＡＧａｓｅ増加の病状は、よく理解されていない。 糖尿病患者におけるＮＡＧａｓｅの尿中産出の増加は、細胞の破壊よりもむしろ 尿中への産出増加を伴う糖尿病によって誘導される近位尿細管におけるリソソー ムの活性化のためであると提案されている。 該実施例において得られた結果は、全ての比較において、３ＤＦおよびＮＡＧ ａｓｅレベルが対照と比べて実験群において上昇することを示す。したがって、 糖化タンパク質を与えられた動物は、糖尿病患者で得られた結果と同様に、過剰 のＮＡＧａｓｅを尿中に排出する。対照動物と比べてＮＡＧａｓｅ排出が約５０ ％増加する。これらの動物は、また、対照と比べて尿３ＤＦが５倍増加する。図 ５および６に見られるように、尿中３ＤＦは、３ＤＧと非常によく相関する。ど ちらの化合物も、再吸収されることなく糸球体ろ過値で血漿から除去されるよう である。 実施例７ 腎臓タンパク質のＳＤＳゲル： ２匹のラットに１日にＦＬまたはマンニトール（対照として使用される）のい ずれか５マイクロモルを５日間注射した。動物を殺し、腎臓を取り出し、皮質お よび骨髄に解剖した。５容量の１５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂および ５ｍＭ ＤＴＴを含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５中で組織をホモジ ネートした。細胞破片を１０，０００ｇで１５分間の遠心分離によって除去し、 次いで、上清を１５０，０００ｇで７０分間遠心分離した。溶性タンパク質を１ ２％ポリアクリルアミドゲルならびに４−１５および１０−２０％濃度勾配ゲル のＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。全ての場合、マンニトールを注射した動 物と比べて、ＦＬを注射した動物の腎臓抽出液から、より低分子量のバンドがな くなるかまたは視覚的に減少した。 実施例８ ３−Ｏ−メチルフルクトースリジンの合成： ３−Ｏ−メチルグルコース無水物１９．４ｇ（０．１モル）および重亜硫酸ナ トリウム１ｇのメタノール３０ｍｌおよびグリセロール１５ｍｌ中懸濁液を３０ 分間還流し、次いで、０．０３５モルのα−カルボベンゾキシ−リジンおよび４ ｍｌの酢酸を加えた。該溶液を３時間還流した。溶液を１容量の水で処理し、ピ リジニウム形態でＤｏｗｅｘ−５０カラム（４ｘ５０ｃｍ）上のクロマトグラフ ィーに付し、最初は水、次いで酢酸ピリジニウムで溶出した。純粋な物質を含有 するフラクションを合わせ、蒸発させた。得られた物質を５０ｍｌの水−メタノ ール（９：１）中に溶解し、木炭触媒上の１０％パラジウムを用いて水素ガス（ ２０ｐｓｉ）で還元した。ろ過および蒸発により、３−Ｏ−メチルフルクトース リジンを得た。 前記の式（Ｉ）の構造を有する他の特定の化合物は、例えば、選択された窒素 または酸素含有出発物質、おそらく、アミノ酸、ポリアミノ酸、ペプチドなどを フルクトースのような糖化剤を用いて糖化することによって製造され、所望によ り、それを当業者に周知の手法によって化学的に修飾してもよい。 実施例９ ＦＬ３Ｐキナーゼ活性の付加的アッセイ： ａ．貯蔵溶液の調製： １００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、 ５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦであるアッセイバッファー溶液を調製した 。２ｍＭフルクトシル−スペルミンＨＣｌであるフルクトシル−スペルミン貯蔵 溶液を調製した。２ｍＭスペルミンＨＣｌであるスペルミン対照溶液を調製した 。 ｂ．フルクトシル−スペルミンの合成： フルクトシル−スペルミンの合成は、既知の手法（J．HodgeおよびB．Fisher ，Methods Carbohydr．Chem.，2:99-107(1963)）の適用によって行った。スペル ミン（５００ｍｇ）、グルコース（５００ｍｇ）およびピロ亜硫酸ナトリウム（ ８０ｍｇ）の混合物を５０ｍｌのメタノール−水（１：１）中モル比８：４：１ （スペルミン：グルコース：ピロ亜硫酸塩）中で調製し、１２時間還流した。生 成物を水で２００ｍｌまで希釈し、ＤＯＷ−５０カラム（５ｘ９０ｃｍ）上にロ ードした。非反応グルコースを２カラム容量の水によって除去し、生成物および 非反応スペルミンを０．１Ｍ ＮＨ₄ＯＨで除去した。生成物のプールしたピーク フラクションを凍結乾燥し、フルクトシル−スペルミンの濃度を、生成物の定性¹³ Ｃ ＮＭＲスペクトル（ＮＭＲデータは、４５°パルス、１０秒緩和遅延時間 およびＮＯＥデカップリング無しで収集した）におけるＣ−２フルクトシルピー ク全体を測定することによって決定した。 ｃ．精製のためのキナーゼのアッセイ： １０μｌの酵素調製物、１０μｌのアッセイバッファー、１．０μＣｉの³³Ｐ ＡＴＰ、１０μｌのフルクトシル−スペルミン貯蔵溶液および７０μｌの水を 含むインキュベーション混合物を調製し、３７℃で１時間インキュベートした。 インキュベーションの終わりに、９０μｌ（２ｘ４５μｌ）の試料を２つの２． ５ｃｍ直径リン酸セルロースディスク（Whatman P-81）上にスポットし、乾燥さ せた。ディスクを水で広範囲に洗浄した。乾燥後、ディスクをシンチレーション バイアル中に置き、カウントした。 各酵素フラクションを適当なスペルミン対照を用いて２連でアッセイした。 実施例１０ 糖化タンパク質食餌における試験動物に観察された腎臓病状 ３匹のラットを糖化タンパク質食餌（２０％全タンパク質；３％糖化）で８ヶ 月維持し、対照食餌で維持した同じ年齢の９匹のラットと比較した。主な知見は 、糖化食餌の動物における損傷した糸球体の実質的な増加であった。これらの動 物において観察された典型的な病変は、糸球体嚢（ボーマン嚢）の分節性硬化症 、壁上皮（parietal epithelium）の尿細管形成異常および間質性繊維症であっ た。糖化タンパク質食餌の動物の３匹全ておよび対照食餌の動物の１匹のみが、 １３％より大きい損傷糸球体を示した。これが起こる確立は２％未満である。糸 球体において観察された病状に加えて、尿細管内にいくつかのヒアリン円柱が観 察された。定量されていないが、これらのより多くが糖化食餌の動物に見られた 。ＮＡＧａｓｅのレベルの増加もまた、糖化食餌の動物に観察された。 該実験の結果から、糖化食餌は、試験動物に、糖尿病の腎臓に見られるのと同 様の一連の組織学的病変を発現させるようであった。 実施例１１ 妊娠に対する糖化食餌の影響 予備実験において、５組のマウスが糖化食餌（１８％全タンパク質；３％糖化 ）を与えられ、７ヶ月間にわたって６回子を産んだ。得られた６回の妊娠は、１ ７、２３、１３、０、３および０匹の生存する子を生じた。第３の出産後の生存 する子におけるこの激しい減少を考慮して、１０組からなる２団の各々に糖化食 餌（１３％全タンパク質；３％糖化）かまたは対照食餌（１３％タンパク質、０ ％糖化）のいずれかを与えた。これまでは、２群の子が４回生まれ、両方の群に おいて同様の結果を得た。第１の妊娠は４９／２０（糖化／対照）の子を生じ； 第２は１８／４１；第３は３７／２７、第４は２０／３３であった。第５の妊娠 、現在進行中である。マウスの組は、高血糖について試験された。血中グル コースレベルは、実験および対照群において、各々、１２０および１１２ｍｇ／ ｄｌである。 マウスの尿における３ＤＦレベルの予備測定は、予想通り、本明細書に記載の 糖化食餌の場合、全身の３ＤＦの実質的な増加（約５−１０倍）を示す。 実施例１２ フルクトースリジン経路の発癌効果 フルクトースリジン経路において生成される代謝産物の発癌性の可能性を調べ るために、腎臓癌に高感受性のラット系統で実験を行った。４匹のラットに糖化 食餌を与え、３匹のラットに対照食餌を与えた。食餌を与えて１０週後、動物を 殺し、それらの腎臓を調べた。食餌を与えた４匹全てにおいて、１ｍｍよりも大 きなサイズの腎臓癌が見られ、一方、対照動物においては、このような大きな病 変は見られなかった。これが起こる確率は、２％未満である。データは、腎臓管 状細胞（多くの腎臓癌の起源の細胞であることが知られている）において見られ る動物食餌中の糖化タンパク質由来の過剰のフルクトースリジンによって引き起 こされた３ＤＧレベルの上昇が、細胞ＤＮＡと相互反応し、種々の突然変異を導 き、最終的に発癌事象を導くことができることを示す。腎臓および他の場所での ヒトの癌の発現において該過程が重要である可能性がある。 本発明のある特定の具体例は、前記に記載および／または例示されたが、種々 の他の具体例は、前記の開示から当業者に明らかであろう。したがって、本発明 は、記載および／または例示された特別の具体例に限定されず、以下の請求の範 囲の範囲から逸脱することなく、変更および修飾を考慮することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 27/02 Ａ６１Ｐ 27/02 Ｃ０７Ｃ 229/26 Ｃ０７Ｃ 229/26 255/26 255/26 Ｃ０７Ｈ 15/04 Ｃ０７Ｈ 15/04 Ｆ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｒ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 カプラー，フランシス アメリカ合衆国19149ペンシルベニア州フ ィラデルフィア、ダイアストン・ストリー ト3034番 (72)発明者 シワーゴールド，ベンジャミン アメリカ合衆国03755ニューハンプシャー 州ハノーバー、ポスト・オフィス951 (72)発明者 ラル，サンディープ アメリカ合衆国19446ペンシルベニア州ラ ンズデイル、ハイポイント・サークル1116 番 (72)発明者 ス，バンイン アメリカ合衆国19111ペンシルベニア州フ ィラデルフィア、ソリー711番、ファース ト・フロアー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．酵素阻害活性を有する化合物であって、フルクトース−リジンのフルクト ース−リジン−３−リン酸への酵素的変換を阻害するのに効果的であり、ここで 、その阻害活性は、所定量のフルクトース−リジン、アデノシン三リン酸、フル クトース−リジン−３−リン酸キナーゼの供給源および該化合物を含有する水溶 液を準備し、該キナーゼ、該フルクトース−リジンおよび該アデノシン三リン酸 の相互反応の結果生じる生産物としてのフルクトース−リジン−３−リン酸およ びアデノシン二リン酸の生成を促進する条件下に該溶液を付し、該生産物の少な くとも１種類の生成を測定することからなるアッセイ方法によって測定され、同 じ相対量のフルクトース−リジン、アデノシン三リン酸およびフルクトース−リ ジン−３−リン酸キナーゼの供給源の水溶液（該化合物を含まない）と比べて、 該生産物の量を減少させる化合物。 ２．フルクトース−リジン−３−リン酸キナーゼの供給源が腎臓組織である請 求項１記載の化合物。 ３．フルクトース−リジン−３−リン酸キナーゼの供給源が赤血球またはそれ らの前駆細胞である請求項１記載の化合物。 ４．フルクトース−リジン−３−リン酸キナーゼの供給源が末梢神経組織であ る請求項１記載の化合物。 ５．フルクトース−リジン−３−リン酸キナーゼの供給源が水晶体組織である 請求項１記載の化合物。 ６．フルクトース−リジン−３−リン酸キナーゼの供給源が膵臓組織である請 求項１記載の化合物。 ７．拮抗的または非拮抗的酵素阻害を示し、約１ｍＭ未満の阻害定数（Ｋｉ） を有する請求項１記載の化合物。 ８．さらに： （ｉ）約２，０００ダルトン未満の分子量； （ｉｉ）１０μＭ以上の生理食塩水または血清中溶解度を有し；および （ｉｉｉ）生理食塩水または血清中で少なくとも１時間インキュベーション後 にその酵素阻害活性の少なくとも５０％を保持する請求項１記載の化合物。 ９．構造式： ［式中、Ｘは−ＮＲ'−または−Ｏ−であり、ここでＲ’は、Ｈ、および直鎖ま たは分枝鎖アルキル基（Ｃ₁−Ｃ₄）および非置換または置換アリール基（Ｃ₆− Ｃ₁₀）もしくはアラルキル基（Ｃ₇−Ｃ₁₀）よりなる群から選択され；Ｒは、Ｈ 、アミノ酸残基、ポリアミノ酸残基、ペプチド鎖、置換されていないかまたは少 なくとも１個の窒素もしくは酸素−含有置換基で置換されている直鎖または分枝 鎖脂肪族基（Ｃ₁−Ｃ₈）、置換されていないかまたは少なくとも１個の窒素−も しくは酸素−含有置換基で置換され、少なくとも１個の−Ｏ−、−ＮＨ−もしく は−ＮＲ''−部分によって割り込まれた直鎖または分枝鎖脂肪族基（Ｃ₁−Ｃ₈） よりなる群から選択される置換基であり、ここでＲ’’は、直鎖または分枝鎖ア ルキル（Ｃ₁−Ｃ₆）および非置換または置換アリール基（Ｃ₆−Ｃ₁₀）もしくは アラルキル基（Ｃ₇−Ｃ₁₀）であり、但し、Ｘが−ＮＲ’−を示すならば、Ｒお よびＲ’はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜７個の環原子を有す る置換または非置換複素環式環を示してもよく、少なくとも１個の窒素および酸 素が該環において唯一のヘテロ原子であり、該アリール基（Ｃ₆−Ｃ₁₀）または アラルキル基（Ｃ₇−Ｃ₁₀）および該複素環式環置換基は、Ｈ、アルキル(Ｃ₁− Ｃ₆)、ハロゲン、ＣＦ₃、ＣＮ、ＮＯ₂および−Ｏ−アルキル（Ｃ₁−Ｃ₆）よりな る群から選択され； Ｒ₁は、１〜４個の直鎖炭素原子を有するポリオール部分であり、Ｙはカルボ Ｚは、−Ｈ、−Ｏ−アルキル（Ｃ₁−Ｃ₆）、−ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＣＮ、 −ＣＯＯＨおよび−ＳＯ₃Ｈ₂よりなる群から選択される］ を有する化合物ならびに該化合物の異性体および医薬上許容される塩。 １０．活性剤として請求項１記載の化合物および医薬上許容されるビヒクルを 含んでなる、糖尿病患者において糖尿病性合併症の発症を予防、減少または遅延 させるための製剤。 １１．さらに、抗高血圧薬および補足活性剤を含んでなる請求項１０記載の製 剤。 １２．液状の請求項１０記載の製剤。 １３．医薬上許容されるビヒクルが活性剤が溶解できる液体である請求項１２ 記載の製剤。 １４．錠剤形態の請求項１０記載の製剤。 １５．錠剤が時間−放出性コーティングを有する請求項１４記載の製剤。 １６．錠剤が腸溶性コーティングを有する請求項１４記載の製剤。 １７．糖尿病性合併症の発病の危険性のある患者に、フルクトース−リジンの フルクトース−リジン−３−リン酸への酵素的変換を阻害するのに有効な化合物 を該変換を阻害するのに十分な量で投与することからなる、該患者において糖尿 病性合併症の発症を予防、減少または遅延させる方法。 １８．化合物が構造式： ［式中、Ｘは−ＮＲ'−または−Ｏ−であり、ここでＲ’は、Ｈ、および直鎖ま たは分枝鎖アルキル基（Ｃ₁−Ｃ₄）および非置換または置換アリール基（Ｃ₆− Ｃ₁₀）もしくはアラルキル基（Ｃ₇−Ｃ₁₀）よりなる群から選択され；Ｒは、Ｈ 、アミノ酸残基、ポリアミノ酸残基、ペプチド鎖、置換されていないかまたは少 なくとも１個の窒素もしくは酸素−含有置換基で置換されている直鎖または分枝 鎖脂肪族基（Ｃ₁−Ｃ₈）、置換されていないかまたは少なくとも１個の窒素−も しくは酸素−含有置換基で置換され、少なくとも１個の−Ｏ−、−ＮＨ−もしく は−ＮＲ''−部分によって割り込まれた直鎖または分枝鎖脂肪族基(Ｃ₁−Ｃ₈)よ りなる群から選択される置換基であり、ここでＲ’’は、直鎖または分枝鎖ア ルキル（Ｃ₁−Ｃ₆）および非置換または置換アリール基（Ｃ₆−Ｃ₁₀）もしくは アラルキル基（Ｃ₇−Ｃ₁₀）であり、但し、Ｘが−ＮＲ’−を示すならば、Ｒお よびＲ’はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜７個の環原子を有す る置換または非置換複素環式環を示してもよく、少なくとも１個の窒素および酸 素が該環において唯一のヘテロ原子であり、該アリール基（Ｃ₆−Ｃ₁₀）または アラルキル基（Ｃ₇−Ｃ₁₀）および該複素環式環置換基は、Ｈ、アルキル(Ｃ₁− Ｃ₆)、ハロゲン、ＣＦ₃、ＣＮ、ＮＯ₂および−Ｏ−アルキル（Ｃ₁−Ｃ₆）よりな る群から選択され；Ｒ₁は、１〜４個の直鎖炭素原子を有するポリオール部分 のいずれかであり；Ｚは、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−アルキル（Ｃ₁−Ｃ₆）、−ハロ ゲン、−ＣＦ₃、−ＣＮ、−ＣＯＯＨおよび−ＳＯ₃Ｈ₂よりなる群から選択され る］ を有し、ならびに該化合物の異性体および医薬上許容される塩である請求項１７ 記載の方法。 １９．化合物がメグルミン、ソルビトールリジン、マンニトールリジンおよび ガラクチトールリジンよりなる群から選択される少なくとも１個である請求項１ ８記載の方法。 ２０．化合物が補足活性剤として抗高血圧薬と共に投与される請求項１７記載 の方法。 ２１．糖尿病に付随した病状が糖尿病性腎障害、糖尿病性網膜症または糖尿病 性末梢神経障害よりなる群から選択される請求項１７記載の方法。 ２２．化合物が経口投与される請求項１７記載の方法。 ２３．糖尿病患者に、体重１キログラムあたり少なくとも約０．０５〜約０． ３グラムの糖化リジン残基を供給する量で糖化リジン残基の供給源を投与し、該 患者から得られた少なくとも１個の生物学的試料において３−デオキシグルコソ ンの３−デオキシフルクトースに対する割合を、糖尿病の臨床症状がない個体に おける３−デオキシグルコソンの３−デオキシフルクトースに対する割合を基準 にして測定することからなり、無症候性個体と比較して糖尿病患者における３− デオキシグルコソンの３−デオキシフルクトースに対するより高い割合が、糖尿 病患者が糖尿病に付随した病状を併発するより危険な状態にあることを示す、糖 尿病患者の糖尿病に付随した病状を併発する危険性を評価する方法。 ２４．糖尿病に付随した病状が糖尿病性腎障害、糖尿病性網膜症または糖尿病 性末梢神経障害よりなる群から選択される請求項２３記載の方法。 ２５．糖化リジン残基の供給源が糖尿病患者に経口投与される請求項２３記載 の方法。 ２６．生物学的試料が尿である請求項２３記載の方法。 ２７．糖尿病患者が糖尿病に付随する病状を併発する危険性を評価する方法で あって、空腹時の糖尿病患者から得られた少なくとも１個の生物学的試料中の３ −デオキシグルコソンの３−デオキシフルクトースに対する割合を糖尿病の臨床 症状がない空腹な個体における３ＤＧの３ＤＦに対する割合との関連で測定する ことからなり、該糖尿病患者における３−デオキシグルコソンの３−デオキシフ ルクトースに対するより高い割合が、該糖尿病患者が該糖尿病に付随した病状を 併発するより危険な状態にあることを示す評価方法。 ２８．糖尿病に付随した病状が糖尿病性腎障害、糖尿病性網膜症または糖尿病 性末梢神経障害よりなる群から選択される請求項２７記載の方法。 ２９．糖化リジン残基の供給源が糖尿病患者に経口投与される請求項２７記載 の方法。 ３０．生物学的試料が尿である請求項２７記載の方法。 ３１．糖尿病性合併症の予防における治療介入の効果を評価する方法であって 、その治療介入の開始の前後で、糖尿病患者から得られた生物学的試料中の３− デオキシグルコソン、３−デオキシフルクトースおよびフルクトース−リジンの 濃度を測定し、該試料中における３−デオキシグルコソンおよび３−デオキシフ ルクトース濃度の和をフルクトース−リジンの濃度と比較することからなり、該 治療介入の開始前に採取した生物学的試料と比べて、該治療介入の開始後に採取 した生物学的試料中のフルクトース−リジン濃度に相対的な３−デオキシグルコ ソンおよび３−デオキシフルクトース濃度の和における減少が該治療介入の効果 を示す評価方法。 ３２．生物学的試料が尿である請求項３１記載の方法。 ３３．生物学的試料を空腹時に得る請求項３１記載の方法。 ３４．生物学的試料が体重１キログラムあたり約０．０５〜０．３グラムの糖 化リジンを含有する糖化リジンの供給源の経口投与後に得られる請求項３１記載 の方法。 ３５．パッケージ食品の糖尿病に付随した病状の発病に関与する可能性を糖尿 病患者に通告する方法であって、該食品中の糖化リジン残基含量を測定し、該食 品のパッケージにまたは糖尿病患者が利用する出版物に該測定結果を提供するこ とからなる方法。 ３６．ＡＧＥタンパク質の生成によって引き起こされる患者における病状を予 防する方法であって、該患者に治療上有効量の該患者による３−デオキシグルコ ソンの生成を阻害する化合物を投与することからなる方法。 ３７．病状が高血圧、卒中、神経変性障害、例えば、アルツハイマー型の老人 性痴呆、循環性疾患、アテローム性動脈硬化症、骨関節炎、白内障よりなる群か ら選択される請求項３６記載の方法。 ３８．化合物が構造式： ［式中、Ｘは−ＮＲ'−または−Ｏ−であり、ここでＲ’は、Ｈ、および直鎖ま たは分枝鎖アルキル基（Ｃ₁−Ｃ₄）および非置換または置換アリール基（Ｃ₆− Ｃ₁₀）もしくはアラルキル基（Ｃ₇−Ｃ₁₀）よりなる群から選択され；Ｒは、Ｈ 、アミノ酸残基、ポリアミノ酸残基、ペプチド鎖、置換されていないかまたは少 なくとも１個の窒素もしくは酸素−含有置換基で置換されている直鎖または分枝 鎖脂肪族基（Ｃ₁−Ｃ₈）、置換されていないかまたは少なくとも１個の窒素−も しくは酸素−含有置換基で置換され、少なくとも１個の−Ｏ−、−ＮＨ−もしく は−ＮＲ''−部分によって割り込まれた直鎖または分枝鎖脂肪族基(Ｃ₁−Ｃ₈)よ りなる群から選択される置換基であり、ここでＲ’’は、直鎖または分枝鎖ア ルキル（Ｃ₁−Ｃ₆）および非置換または置換アリール基（Ｃ₆−Ｃ₁₀）もしくは アラルキル基（Ｃ₇−Ｃ₁₀）であり、但し、Ｘが−ＮＲ’−を示すならば、Ｒお よびＲ’はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜７個の環原子を有す る置換または非置換複素環式環を示してもよく、少なくとも１個の窒素および酸 素が該環において唯一のヘテロ原子であり、該アリール基（Ｃ₆−Ｃ₁₀）または アラルキル基（Ｃ₇−Ｃ₁₀）および該複素環式環置換基は、Ｈ、アルキル(Ｃ₁− Ｃ₆)、ハロゲン、ＣＦ₃、ＣＮ、ＮＯ₂および−Ｏ−アルキル（Ｃ₁−Ｃ₆）よりな る群から選択され；Ｒ₁は、１〜４個の直鎖炭素原子を有するポリオール部分 のいずれかであり；Ｚは、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−アルキル（Ｃ₁−Ｃ₆）、−ハロ ゲン−、ＣＦ₃、−ＣＮ、−ＣＯＯＨおよび−ＳＯ₃Ｈ₂よりなる群から選択され る］ を有する化合物ならびに該化合物の異性体および医薬上許容される塩である請求 項３６記載の方法。 ３９．化合物がメグルミン、ソルビトールリジン、マンニトールリジンおよび ガラクチトールリジンよりなる群から選択される少なくとも１個である請求項３ ８記載の方法。 ４０．糖尿病性腎障害、糖尿病性神経障害、糖尿病性マクロ脈管障害、糖尿病 性網膜症、心血管疾患、神経変性疾患、インスリン依存性糖尿病、糖尿病に付随 した先天的欠損症および癌よりなる群から選択される病状を試験動物に誘導する 方法であって、該試験動物に糖化タンパク質食餌を、実質的に糖化タンパク質を 含まない食餌を与えた同じ種の動物から得られた生物学的液体中の３ＤＧ含量に 相対的な該試験動物の生物学的液体中の３ＤＧ含量を維持するのに十分な量およ び時間で与えることからなる方法。