CS235440B1 - Způsob přípravy 4-deoxy-4-fluor-D-fruktózy - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy nového monosacharidu, 4-deoxy-4-fluor-D-fruktozy, který byl získán fermentační dehydrogenací 3-deoxy-3-fluor- -D-mennitolu kmenem Gluconobacter oxydans. Jeho struktura byle potvrzena elementární analýzou a protonovou magnetickou resonancí. Získaný fluorovaný monosacharid je cenná sloučenina pro studium metabolismu cukrů a potenciální inhibitor invertasy

Description

Vynález se týká přípravy 4-deoxy-4-fluor-D-fruktózy, potenciálního inhibitoru invertázy (beta-D-fruktofuranozidázy) a cenná sloučeniny pro studium biochemie cukrů. 4-deoxý-4-fluor-D-fruktóza nebyle dosud v literatuře popsána.

Způsob přípravy 4-deoxy-4-fluor-D-fruktózy spočívá v biochemická dehydrogeneci 3-deoxy-3-fluor-D-mennitolu (M. Černý, J. Doležalová, J. Mácová. J. Pacák. J. Trnka,

M. Buděšinský: Collec. Czech. Chem. Commun. 48 /1983/ v tisku) působením enzymovéhosystému octových bakterií, tj. bakterií rodu Oluconobecter nebo Acetobaoter, a výhodou druhu Gluconobacter oxydens, dříve označovaného jako Acetobacter auboxydens. Bylo zjištěno, že dehydrogenace probíhá podle Bertrandova a Hudsonova pravidla (M. Kulhánek, li. Tedra:

Zbl. Bakt. Abt. II 128 /1973/ 25), to znamená selektivně na C-5 3-deoxy-3-fluor-D-mannltolu ze vzniku 4-deoxy-4-fluor-D-fruktózy. Bertrendovo a Hudsonovo previdlo určuje závislost mezi strukturou alditolů s jejich dehydrogeneci v ketosy působením buněk Gluconobscter oxydans s některých jiných octových bakterií. Postup podle vynálezu rozěiřuje jeho plet nost i ne dehydrogeneci 3-deoxy-3-fluor-hexitolu.

Vhodný kmen byl vybrán z octových bekteril, které úplně dehydrogenovaly D-gluoitol za vzniku L-sorbózy i v koncentraci 20 g ve 100 ml. Bylo zjiětěno, že růst octových bakterií není inhibován přítomností 3-deoxy-3-fluor-D-mennitolu nejméně do koncentrace 2 g ve 100 ml. Jejich růst věek probíhá jen pokud je ve fermentečním prostředí alespoň malé množství asimilovatelného cukru. Tato zjiětění umožňují připravovat 4-deoxy-4-fluor-D-fruktózu běžným aseptickým fermentačním postupem, tj. inokulecí živných půd obsahujících 3-deoxy-3-fluor-D-mannitol a aerobní kultivací do úplné konverze. Výhodnější způsob přípravy spočívá v použití biomasy vybraného kmenu připravené eseptickou fermentací na některé běžné živné půdě.

Buněčná suspenze se pak izoluje odstředěním a po prbmytí přidá k roztoku 3-dsoxy-3-fluor-D-mannitolu ve vodě s přísadou vhodného konzervačního činidla. Dehydrogenace pak probíhá na třepacím stroji do vymizení výchozí látky. Fermentací vodného roztoku transformovaného sacharidu promytou buněčnou suspenzí se v tomto případě zláká roztok metabolitů neznečištěný složkami živné půdy, což je velmi výhodné pro dalěí Izolaci.

Struktura získané 4-deoxy-4-fluor-D-fruktózy o teplotě tání 123 až 126 °C (po krystalizací z etanolu) a hodnotě optické otáčivosti O»Jp⁰ -116° (c = 0,45 voda) byl® potvrzena elementární enelýzou a protonovou magnetickou rezonancí.

Následující příklad uvedený vynález pouze ilustruje, nikoliv omezuje.

Kultura bakterie Gluconobacter oxydans CCM 2370 udržovaná ve sbírce byla dvakrát přeočkována na šikmé tuhé půdy obsahující 5 g D-glukózy, 2 g uhličitanu vápenatého, autolyzát z 2,5 g pekařských kvasnic a 2,5'g egaru ve 100 ml teplé půdy. Po růstu vždy 2 dny bylo získanou kulturou zeočkováno 80 ml půdy obsahující 5 g D-glucltolu a autolýzát ze 2,5 g pekařských kvasnic ve 100 ml. Po dvoudenní inkubaci na třepacím stroji byla fermentační půda odstředěna. Odstředěná biomass byla promyta dvakrát opakovaným rozmícháním v 80 ml sterilní destilované vody a novým odstředěním.

Získaná promytá biomass byle přidána do 17 ml sterilní destilované vody obsahující 0,319 g 3-deoxy-3-fluor-D-msnnitolu e 3,2 mg D-chloremfenikolu. Baňka s roztokem e suspendovanými buňkami byla uzavřena vatovou zátkou a umístěna ne třepacím stroji. Veěkeré kultivační práce byly prováděny při 32 °C za aerobních podmínek. Průběh dehydrogenace byl sledován chromatografií na papíře. Na chromatografický papír Whatman č. 1 impregnovaný protažením 3% vodným roztokem metefosforečné kyseliny a usušením dvojmo bylo naneseno 50 ,ul fermentujiclho roztoku a 200 A>g 3-deoxy-3-řluor-D-mannitolu. Po vyvíjení v soustavě 2-butanon nasycený vodou měl výchozí 3-deoxy-3-fluor-D-msnnitol Rf kolem 0,12, redukující sacharid vzniklý fermentací, tj. 4-deoxy-4-fluor-D-fruktoza, měl Rf kolem 0,18.

Uspokojivé rozdílení se doséhne při vyvíjení na přetečení po cca 16 h. Chromatogrsmy byly detegovény: (1) jodistanem a amoniakálním roztokem dusičnanu stříbrného, (2) hydrogenftslanem anilinu. Již po 24 h roztok obsahoval pouze 1 redukující sacharid vzniklý fermentací. Filtrací přes asbestocelulózovou filtrační vložku EK s přísadou karborafinu se získal čirý, téměř bezbarvý roztok. Odpařením za sníženého tlaku se získalo 0,27 g sirupu.

Po přidání 10 ml metanolu byl vzniklý zákal odfiltrován a roztok znovu odpařen. Získaný sirup byl rozpuštěn ve směsi metanol-etylacetát 1:1 a roztok byl znovu odpařen. Zbylý sirup vykrystalovsl. Po dvojí krystalizaci z etanolu bylo získáno 0,19 g 4-deoxy-4-fluor-D-fruktózy ve formě bezbarvých krystalů o t. t. 123 až 126 °C, [ci] _D -116° (c = 0,45, voda). Látka redukuje za tepla Fehlingovo činidlo.

Pro CgH,,FO₅ (182,2) vypočteno: 39,56 » C, 6,08 % H, 10,43 % F;

nalezeno: 39,56 % C, 5,88 % H, 10,55 % F.

Protonová magnetická resonance: 3,72 delte (H-1), 3,56 delta (H-ť), 4,06 delta (H-3),

4,78 delta (H-4), 4,26 delta (H-5), 4,03 de-lta (H-6), 3,75 delta (H-6').

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob přípravy 4-deoxy-4-fluor-D-fruktózy, vyznačující se tím, že se 3-deoxy-3-fluor-D-mannitol biochemicky dehydrogenuje selektivně ne C-5, s výhodou působením enzymových systémů bakterií oxidujících monosacharidy, tj. bakterií rodu Gluconobacter, ' Acetobacter, Pseudomonas, Serratia n. Klebsiella, s výhodou druhu Gluconobacter oxydens.