KR20000070760A

KR20000070760A - 당뇨병성 합병증의 예방에 치료적으로 개입하는 화합물 및 방법

Info

Publication number: KR20000070760A
Application number: KR1019997007019A
Authority: KR
Inventors: 브라운트루먼알; 카플러프란시스; 쯔베르골드벤자민; 랄선딥; 수반깅
Original assignee: 폭스 체이스 캔서 센터
Priority date: 1997-02-05
Filing date: 1998-02-05
Publication date: 2000-11-25
Also published as: CN1919201A; CA2279428C; IL131229A; IL131229A0; EP1021175B1; CA2279428A1; EP1021175A1; AU741351B2; JP2001512424A; WO1998033492A1; CN1251521A; EP1021175A4; AU6268498A; JP4738554B2; KR100654261B1; US6004958A; ES2539101T3; KR20060013700A; CN100406005C

Abstract

새로이 발견된 대사 경로중 ATP 의존성 반응에서 프럭토오스-리신으로부터 프럭토오스-리신-3-포스페이트로의 효소적 전환을 저해하는 부류의 화합물이 본원에 개시되어 있다. 이 경로상의 정상적인 작용에 따라, 프럭토오스-리신-3-포스페이트(FL3P)는 분해되어 유리 리신, 무기 인산염 및 3-데옥시글루코손(3DG)을 형성하며, 후자는 반응성 단백질 개질제이다. 3DG는 3-데옥시프럭토오스(3DF)로의 환원에 의해 탈독성화될 수 있거나, 내인성 단백질과 반응하여 진행성 최종 당화 산물에 의해 개질된 단백질(AGE-단백질)을 형성할 수 있는데, 상기 AGE-단백질은 당뇨병성 합병증을 유발하는 것으로 생각된다. 또한, 상기 저해제를 사용하여 AGE-단백질의 형성을 감소시킴으로써 당뇨병성 합병증을 예방, 감소 및 지연하는 치료 방법 및 당뇨병 환자가 합병증을 발병시킬 위험을 평가하는 방법과 경구 용량의 프럭토오스-리신을 함유하는 식이 생성물을 섭취한 후 생물학적 샘플중 3DG 대 3DF의 비를 측정함으로써 개시된 저해제 치료의 효능을 측정하는 방법을 개시한다.

Description

당뇨병성 합병증의 예방에 치료적으로 개입하는 화합물 및 방법 {COMPOUNDS AND METHODS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION IN PREVENTING DIABETIC COMPLICATIONS}

4가지의 특히 심각한 당뇨병성 합병증은 소위, 당뇨병성 신증(腎證) 또는 신장 질환; 망막의 파괴로 인해 실명을 야기하는 당뇨병성 망막증; 말초 신경 기능의 손실에 수반하는 당뇨병성 신경장애; 및 모세 혈관의 손상으로 인한 순환 장애이다. 망막증과 신경장애 모두는 본 질병 상태에 연관된 일반적인 순환 장애의 한 부류로 생각된다. 말기 당뇨병에서 미소혈관계의 기능장애의 역할이 최근 제시되었다[Tooke, Diabetes, 44: 721 (1995)]. 상기 문헌에서, "당뇨병과 관계된 병적 상태" 라는 용어 및 그 동의어는 다수의 널리 알려진 망막증, 신경장애, 신증, 거대혈관병증(macroangiopathic) 및 기타 당뇨병성 합병증을 포함하는 것으로 해석된다.

당뇨병에 기인한 병적 상태와 노화에 기인한 병적 상태의 유사점은 광범위하게 보고되었다. 연구 결과, 당뇨병에 관계된 병적 상태중 다수는 노화에 정상적으로 관계된 병적 상태와 임상적으로 매우 유사하다는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, 당뇨병에서는 동맥과 관절이 조숙히 경화되고, 폐의 탄력성 및 폐활량이 조숙히 감소되는 것으로 나타났다. 게다가, 죽상동맥경화증, 심근경색 및 졸증은 노화에 관계된 비당뇨병 개체에서보다 당뇨병 환자에서 더 빈번하게 발생한다. 또한, 당뇨병 환자는 감염에 민감하고, 비당뇨병 환자보다 조기에 고혈압, 가속화된 골 손실, 골관절염 및 감소된 T-세포 기능을 나타내기 쉽다.

당뇨병에 관계된 병적 상태와 노화의 유사점은 공통된 메커니즘 원리를 제시하는 것으로 생각된다. 당뇨병에 관계된 병적 상태와 노화에 대한 공통된 생화학적 기초로서 다수의 메커니즘이 제안되었다. 사람 피검체로부터의 데이터에 의해 가장 강력하게 지지되는 가설은 비효소적 글리코실화(glycosylation) 메커니즘을 전제로 한다. 이 가설에 따르면, 노화의 진행 및 전술한 것과 같은 당뇨병에 관계된 병적 상태중 적어도 일부분은 포도당에 의한 단백질의 개질(modification), 및 가교(cross-linking) 및 메일라드(Maillard) 반응를 통해 포도당에서 유래된 대사 물질에 의해 유발된다고 한다[Monnier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 583 (1984) 및 Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 123: 888 (1984)]. 본원에서는 이런 글리코실화 반응의 결과 생성된 개질 단백질은 진행성 최종 당화 산물에 의해 개질된 단백질(advanced glycation end product-modified protein; AGE-단백질)을 의미한다. 3-데옥시글루코손(3-deoxyglucosone, 3DG)은 AGE-단백질을 형성시키는 다단계 반응 순서 중에서 중요한 중간체이다. 3DG는 콜라겐 및 기저막과 같은 세포내부 및 세포외부 단백질 모두를 가교시키는 단백질과 반응할 수 있는 포도당에서 유래된 대사체이다.

당뇨병성 합병증의 경우에서, AGE-단백질을 유발하는 반응은 이 질병과 관계된 만성 과혈당증(hyperglycemia)에 의해 동력학적으로 촉진된다고 생각된다. 상기 메커니즘을 뒷받침하는 증거는, 당뇨병의 피검체로부터 얻은 콜라겐 및 수정체와 같이 장기간 생존하는 단백질이 노화와 관계된 정상 대조군에서 얻은 단백질보다 AGE-단백질 함량이 현저히 높다는 사실을 나타내는 데이터를 포함한다. 따라서, 비교적 낮은 연령의 당뇨병 환자에서 백내장의 특징적인 발병은 수정체의 개질 및 가교 비율의 증가로 설명될 수 있다. 유사하게, 당뇨병 환자에서 관찰되는 관절 및 동맥 경화의 조기 발병 및 폐활량의 손실은 중요한 구조 단백질인 콜라겐의 개질 및 가교 비율의 증가로 설명될 수 있다. 이들 단백질은 수명이 길기 때문에, 개질의 결과가 누적되는 경향이 있다.

당뇨병성 합병증과 과혈당증 사이의 원인과 결과 관계를 입증하는 다른 인자는 과혈당적 기억(hyperglycemic memory)이다. 이 현상의 특히 두드러진 하나의 예로 초기에 당뇨병이었으나 그 이후에 치료하여 정상 혈당 농도를 회복한 개에서 심한 망막염이 발병하는 것을 들 수 있다. 개의 눈은 치료시에는 조직학적으로 정상이었으나, 시간이 경과하면서 당뇨병성 망막증이 정상화된 포도당 농도에도 불구하고 이들 동물에서 발병했다[Engerman et al., Diabetes, 36: 808 (1987)]. 그러므로, 눈에 대한 잠재적인 손상은 임상적인 증상이 나타나기 전인 초기 과혈당증 기간동안 비가역적으로 발생했다.

당뇨병 환자 및 동물은 초기 및 말기 당 개질 AGE-단백질의 정상적인 농도보다 더 높은 농도를 나타낸다. 사실상, AGE-단백질은 혈중 포도당 농도에 비해 더 많이 증가한다. 일부 백분율의 당 분자들이 재배열되어 단백질이 결합된 형광 분자를 생성함에 따라, AGE-단백질의 농도는 형광 측정법에 의해 측정될 수 있다.

AGE-단백질의 병원성 역할은 당뇨병에 제한되지는 않는다. 단백질 당화(glycation)는 알츠하이머 병에도 관계된다[Harrington et al., Nature, 370: 247 (1994)]. 또한, 노화에서도 단백질 형광의 증가를 볼 수 있다. 게다가, 몇가지 이론은 노화의 진행을 산화적 손상 및 당에 의해 유도된 단백질 개질의 조합으로 규명한다. 그러므로, AGE-단백질 형성을 감소시키는 치료는 기타 병인학적으로 유사한 사람의 질병 상태를 치료하는 데 유용할 수 있고, 아마도 노화의 진행을 늦출 수 있을 것이다.

일반적으로, AGE-단백질의 형성은 단백질 아미노기와 당, 주로 포도당과의 반응으로 개시된다고 가정한다. 하나의 전형적인 인용 문헌에서는 "리신 잔기의 ε-아미노기의 당화에 의해 형성된 최초의 부가 생성물은 아마도리(Amadori) 화합물, 프럭토오스리신....이라고 설명하고 있다. 당화는 최종적으로 가교된, 침전된, 산화된, 갈색 및 형광 단백질을 형성시키는 메일라드 또는 갈변(browning) 반응으로 집합적으로 공지된 복합적인 일련의 반응중 개시 단계이다[K.J. Knecht et al., Archives of Biochem. Biophys., 294: 130 (1992)].

당으로부터 AGE-단백질의 형성은, 단백질을 함유하는 프럭토오스-리신을 생성하기 위한 당과의 초기 가역적인 반응을 포함하는 다단계 공정이다. 이어서, 이들 개질 단백질은 연속적으로 반응하여 비가역적으로 개질된 AGE-단백질을 생성한다. AGE-단백질에 대항해 생성된 항체가 프럭토오스-리신과 반응하지 않기 때문에, AGE-단백질이 당화-리신 잔기를 함유하는 단백질과 동일하지 않다는 것은 분명하다. 또한, AGE-단백질이 다수의 화학종으로서 존재한다는 것은 분명하지만, 확인된 것은 거의 없다. 최근의 연구에서 화학종 ε-아미노-(카르복시메틸)리신이 하나의 중요한 최종 AGE-단백질 구조로서 확인되었다[Reddy et al., Biochem., 34: 10872 (1995) 및 Ikeda et al., Biochemistry, 35: 8075 (1996)]. 이 연구는 개질 부위의 약 50%를 구성하는 다른 AGE-단백질 에피토프(epitope)를 화학적으로 확인하는 데 실패했다. 리보오스로부터 AGE-단백질의 형성에 대한 동력학을 연구하는 방법이 최근에 개발되었다[Khalifah et al., Biochemistry, 35: 4645 (1996)]. 그러나, 이 연구는 리보오스가 AGE-단백질 형성에 있어서, 아래에 제시된 당화-리신 및 프럭토오스-리신의 비교적 넓은 정의를 뒷받침하는 중요한 생리학적인 역할을 한다는 것을 제시한다.

다른 참고 문헌은 당화 리신 잔기를 함유하는 단백질과 AGE 단백질을 함유하는 단백질 사이의 차이를 지적한다. " 수시간 및 수주후에 각각 시프(Schiff)-염기 및 아마도리 생성물의 평형 레벨에 도달된다. 초기 글리코실화 생성물의 가역적 평형 성질은 중요한데, 이는 그러한 생성물의 총량이 단기간내에 정상 상태에 도달하기 때문이다.....만성 당뇨병에서는 수년에 걸쳐 이들 초기 글리코실화 생성물이 콜라겐 및 기타 안정한 조직 단백질 상에 계속해서 축적되지 않기 때문에, 이들의 농도가 당뇨병성 망막염의 발병 또는 중증도와 관련이 없다는 것은 놀라운 것이 아니다.... 그러나, 콜라겐 및 기타 수명이 긴 혈관벽 단백질 상의 초기 글리코실화 생성물 중 일부는 분리되지 않는다. 대신에, 이들은 느리고 복합적인 일련의 화학적 재배열을 거쳐, 비가역적인 진행성 최종 글리코실화 산물을 형성한다."[M. brownlee et al., New England Journal of Medicine, 318: 1315 (1988)]. 과학 문헌에 기재된 이들 개질 단백질을 생성하는 유일한 경로는 단백질과 당 분자들간의 개시 반응을 수반한다.

다수의 참고 문헌들은 AGE-단백질의 형성이 다단계 경로를 통해 일어나며, 3-데옥시글루코손(3-DG)이 이 경로의 중요한 중간체라는 것을 지적하고 있다[M. Brownlee, Diabetes, 43: 836 (1994); M. Brownlee, Diabetes Care, 15: 1835 (1992); T. Niwa et al., Nephron, 69: 438 (1995); W.L. Dills, Jr., Am. J. Clin. Nutr., 58; S779 (1993); H. Yamadat et al., J. Biol. Chem., 269: 20275 (1994); N. Igaki et al., Clin. Chem., 36: 631 (1990)]. 당과 단백질의 반응으로부터 3DG를 형성하기 위해 일반적으로 인정되는 경로는 도1에 도시되어 있다. 도1에 도시된 것과 같이, 당(포도당) 분자는 초기에 단백질-리신 아미노기(Ⅰ)를 가진 시프 염기를 형성한다. 이어서, 생성된 시프 염기는 재배열되어 프럭토오스-리신 개질 단백질(Ⅱ)을 생성한다. (Ⅱ)에 이르는 반응은 지유로운 가역 반응이다. (Ⅱ)는 재배열되어 3DG 및 유리 단백질 리신을 생성할 수 있다. 3DG와 단백질의 후속적 반응은 AGE-단백질 형성에서 제1의 비가역적 단계이다.

다른 경로에 의해 3DG가 생성될 수 있다는 것 또는 그외에 3-DG의 주된 공급원이 도1에 도시된 비촉매화 반응이 아니고 효소 촉매화 대사 경로라는 것은 지금까지 알려진 바로는 보고된 바 없다.

당뇨병 환자의 혈청 3DG가 비당뇨병 환자에 비해 현저히 많다(12.78 ±2.49 μM 대 1.94 ±0.17 μM). [Toshimitsu Niwa et al., Nephron, 69: 438 (1995)]. 그러나, 이 독성 화합물은 정상적인 건강한 개체에서도 발견된다. 따라서, 신체가 이 분자에 대한 탈독성화 경로를 발전시켜 왔다는 것은 놀라운 것이 아니다. 이들 반응 중 하나는 알데히드 환원효소에 의해 촉매화되는데, 이 효소는 3DG를 유효하게 요(urine)로 배출되는 3-데옥시프럭토오스(3DF)로 환원시킴으로써 3DG를 탈독성화한다[Takahashi et al., Biochem, 34: 1433 (1995)]. 다른 탈독성화 반응은 옥소알데히드 탈수소효소에 의해 3DG를 3-데옥시-2-케토글루콘산(DGA)로 산화시킨다[Fujii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 210: 852 (1995)].

지금까지의 연구 결과는 이들 효소, 알데히드 탈수소효소 중 적어도 하나의 효능이 당뇨병에서 역으로 영향을 받는다는 것을 보여준다. 정상적인 래트의 간에서 분리되었을 때, 상기 효소의 분획은 리신 67, 84 및 140 상에서 부분적으로 당화되고, 정상적인 비개질 효소에 비해 낮은 촉매적 효능을 가진다[Takahaski et al., Biochem., 34: 1433 (1995)]. 당뇨병 환자는 정상 혈당의 개체보다 당화 단백질의 비율이 높으므로, 이들은 높은 레벨의 3DG를 가지는 경향이 있고, 3DF로의 환원에 의해 반응성 분자를 탈독성화하는 능력이 감소되기 쉽다.

알데히드 환원효소의 메커니즘은 연구의 대상이 되어왔다. 이들 연구 결과, 상기 중요한 탈독성화 효소는 알도오스 환원효소 저해제(aldose reducing inhibitor; ARI)에 의해 저해된다는 것이 밝혀졌다[Barski et al., Biochem., 34: 11264 (1995)]. ARI는 당뇨병성 합병증을 감소시키는 이들의 가능성에 대한 임상 시험이 현재 진행중이다. 한 부류로서 이들 화합물은 단기간의 당뇨병성 합병증에 대해 상당한 효과를 나타내었다. 그러나, 이들은 장기간의 당뇨병성 합병증에 대한 임상적 효과가 부족하고, 높은 단백질 식이(diet)를 공급한 래트에서 신장 기능을 악화시킨다. 이하에서 나타난 바와 같이, 이 발견은 본 발명의 기초가 되는 새로이 발견된 리신 회수 대사 경로와 일치한다. 높은 단백질 식이는 신장 리신 회수 경로(lysine recovery pathway)에 의해 3DG로의 전환을 거치는 프럭토오스-리신의 소비를 증가시킬 것이다. 3DF로의 환원에 의해 생성된 3DG의 탈독성화는 ARI 치료법에 의해 저해될 것이고, 그 결과 ARI를 투여받지 않은 래트에 비해서 신장 손상을 증가시킨다. 이것은 ARI에 의한 알도오스 환원효소의 저해가 3DG를 3DF로 환원시키기 위한 알도오스 환원효소의 이용을 감소시키기 때문이다.

아래에 제시된 특허의 개관에서 이해되는 것과 같이, 사람의 질병을 유발하는 데 있어서 3-DG의 역할은 이미 연구되었다.

미국 특허 번호 제 5,476,849호(울리히 등)는 아미노-벤조산 및 그 유도체를 이용하여 AGE-단백질의 형성을 저해하는 방법을 기술하고 있다. 아마 이들 화합물은 단백질과 반응하여 AGE-단백질 형성의 비가역적인 단계를 개시하기 전에, 3-DG와 반응하여 시스템으로부터 그것을 제거함으로써 작용할 수 있을 것이다.

미국 특허 번호 제 4,798,583호 및 제 5,128,360호(세라미 등)는 AGE-단백질 형성, 및 당뇨병에 의해 유도된 동맥벽의 단백질 가교를 예방하는 아미노구아니딘의 용도를 기술하고 있다. 아미노구아니딘은 초기 글리코실화 생성물과 반응하는 것으로 생각되었다. 본원에 정의된 것과 같이, 이 초기 생성물은 3DG이다. 이들 특허는 3-DG의 형성을 저해하는 가능성을 고려하지 않는다. 그들은 단지 그 독성 분자 복합체(cmoplexing)에만 중점을 둔다.

미국 특허 번호 제 5,468,777호(프란스 등)는 구강에서 단백질의 비효소적 갈변(browning)에 의해 유발된 치아의 착색을 예방하는 약제 및 방법을 기술하고 있다. 시스테인 및 시스테인 유도체는 상기 용도에 특히 유용한 것으로 기재되어 있다.

미국 특허 번호 제 5,358,960호(울리히 등)는 아미노치환된 이미다졸을 사용하여 AGE-단백질 형성을 저해하는 방법에 대해 기술하고 있다. 이들 화합물은 초기 글리코실화 생성물(3DG)과 반응하는 것으로 생각된다. 상기 특허에서는 3DG의 대사적 공급원이 존재한다는 것에 대한 언급이 없다. 본 특허는 3DG가 단백질의 비-효소적 갈변에서 중간체로서 유일하게 생성된다는 것을 예상하고 있다.

미국 특허 번호 제 5,334,617호(울리히 등)는 AGE-단백질 형성의 저해제로 사용되는 아미노산을 기술하고 있다. 리신 및 다른 양기능성(bifunctional) 아미노산은 이 점에 있어서 특히 유용한 것으로서 기술되어 있다. 이들 아미노산은 포도당과 단백질의 반응으로부터의 초기 글리코실화 생성물과 반응하는 것으로 기술되어 있다. 본 특허에 기재된 초기 글리코실화 생성물은 3DG로 생각된다.

미국 특허 번호 제 5,318,982(울리히 등)는 저해제로서 1,2,4-트리아졸을 사용하여 AGE-단백질의 형성을 저해하는 것에 대해 기술하고 있다. 이 특허에 기재된 저해제는 3DG와 반응하여 복합체화 하도록 배치된 디아미노-치환체를 함유한다. 이 특허는 이들 화합물이 초기 글리코실화 생성물(본원에 정의된 3DG)과 반응하는 것으로 기재하고 있다.

미국 특허 번호 제 5,272,165호(울리히 등)는 AGE-단백질 형성의 저해제로서 2-알킬리덴-아미노구아니딘을 사용하는 것에 대해 기재하고 있다. 이 특허에 기재된 저해제는 3DG와 매우 반응성이 크다고 한다. 상기 특허에서는 3DG의 대사적 형성을 저해하는 것에 대한 언급이 없다.

미국 특허 번호 제 5,262,152호(울리히 등)는 AGE-단백질 형성을 저해하기 위해 아미드라존 및 유도체를 사용하는 것에 대해 기재하고 있다. 이 특허에 기재된 화합물은 α-효능 아민(α-effect amine)이다[W.P. Jencks, 3rd ed., McGraw Hill, New York]. 이 부류의 화합물은 3DG와 같은 디카르보닐 화합물과 반응하는 것으로 알려져 있다.

미국 특허 번호 제 5,258,381호(울리히 등)는 AGE-단백질 형성을 저해하기 위해 2-치환된-2-이미다졸린을 사용하는 것에 대해 기재하고 있다. 이 특허에 기재된 화합물은 3DG와 용이하게 반응할 수 있는 인접한 아미노기를 함유한다.

미국 특허 번호 제 5,243,071호(울리히 등)는 AGE-단백질 형성을 저해하기 위해 2-알킬리덴-아미노구아니딘을 사용하는 것에 대해 기재하고 있다. 이 특허에 기재된 화합물은 3DG와 반응성이 크고, 이들 반응성 독성 분자와 복합체를 형성함으로써 작용한다.

미국 특허 번호 제 5,221,683호(울리히 등)는 AGE-단백질 형성을 저해하기 위해 디아미노피리딘 화합물을 사용하는 것에 대해 기재하고 있다. 특히 유용한 것으로 기재된 디아미노피리딘 화합물은 3DG와 반응하여 6-원 고리를 함유하는 안정한 복합체를 형성한다.

미국 특허 번호 제 5,130,337호(울리히 등)는 AGE-단백질 형성을 저해하기 위해 아미드라존 및 유도체를 사용하는 것에 대해 기재하고 있다. 이 특허에 기재된 저해제는 당해 기술 분야에 공지된 것과 같이, 3DG와 신속히 반응하여 안정한 복합체를 형성하는 α-효능 아민이다.

미국 특허 번호 제 5,130,324호(울리히 등)는 AGE-단백질 형성을 저해하기 위해 2-알킬리덴-아미노구아니딘을 사용하는 것에 대해 기재하고 있다. 이 특허에 기재된 화합물은 포도당과 단백질(3DG)의 반응 결과 생성된 초기 글리코실화 생성물과의 반응에 의해 작용한다.

미국 특허 번호 제 5,114,943호(울리히 등)는 AGE-단백질 형성을 저해하기 위해 아미노-치환된 피리미딘을 사용하는 것에 대해 기재하고 있다. 이 특허에 기재된 화합물은 3DG와 신속히 반응하여 이를 탈독성화한다.

전술한 특허중 어느 것도 당뇨병성 합병증의 예방을 위한 치료적 개입의 수단으로 3DG의 대사적 형성을 저해하는 것에 대해 제안한 바 없다. 또한, 이들 특허 중 어느 것도 3DG의 생성중 효소적 경로의 관여에 대해서조차 제안한 바 없다.

미국 특허 제 5,108,930호(울리히 등)는 생물학적 샘플에서 아미노구아니딘의 레벨을 탐지하는 방법에 대해 기재하고 있다. 이 분석은 아미노구아니딘 제거 시간을 측정함으로써 신장 기능을 측정하는 데에 잠재적 용도를 가지는 것으로 기재되어 있다. 본 특허에 기재된 분석 방법이 목적하는 주된 용도는 아미노구아니딘의 조직 레벨을 측정하는 것이다. 따라서, AGE- 단백질 형성을 저해하는 데 충분한 용량을 동물 및 사람 연구에서 유지시킬 수 있다. 본 특허에서는 합병증의 위험이 있는 당뇨병 환자를 결정하기 위해, 환자에서 요의 3DG, 3DF 또는 DGA 비를 사용하는 것에 대해서는 언급되어 있지 않다.

미국 특허 번호 제 5,231,031호(쯔베르골드 등)는 당뇨병과 관련된 병적 상태의 위험성을 평가하는 방법 및 이들 합병증에 대한 치료 효능을 측정하는 방법에 대해 기재하고 있다. 이 특허는 당뇨병 환자의 적혈구에 있는 2가지 인산화 화합물을 측정하는 것에 대해 기재하고 있다. 이 특허에서 이들 2가지 화합물은 화학적으로 확인되지 않았다. 그러나, 화합물은 3DG 또는 3DF중 어느 것도 아니며, 이들의 레벨은 본 발명의 진단 구체예에서는 요에서 측정된다.

글리코실화 최종 산물을 측정함으로써 당뇨병 환자에서 대사성 억제를 모니터하는 방법이 알려져 있다. 글리코실화 헤모글로빈의 농도는 선행하는 수주간의 평균 혈당 농도를 반영하는 것으로 알려져 있다. 미국 특허 번호 제 4,371,374호(에이. 세라미 등)는 글리코실화 단백질의 분해 생성물, 더 구체적으로 요중에서 비효소적으로 글리코실화된 아미노산 및 펩티드를 정량함으로써 포도당 레벨을 모니터하는 방법에 대해 기재하고 있다. 이 방법은 글리코실화 최종-생성물에서 발견되는 동일 평면상 시스-디올기와 특이적인 복합체를 형성하기 위한 알칼리성 보론산의 친화성을 이용하여 상기 최종 산물을 분리하고 정량하는 것을 의미한다.

미국 특허 번호 제 4,761,368호(에이. 세라미 등)는 갈변된 폴리펩티드, 예를 들어 소의 혈청 알부민 및 폴리-L-리신에 존재하는 발색단(chromophore)의 분리 및 정제에 대해 기재하고 있다. 이 발색단, 2-(2-푸로일)-4(5)-2(푸로일)-1H-이미다졸(FFI)는 2 분자의 포도당과 리신에서 유래된 2개의 아미노기의 축합반응에 의해 유도된 복합 헤테로사이클이다. 또한, 이 특허는 단백질 샘플에서 "노화"(진행성 글리코실화의 정도)를 측정하는 방법에서 FFI를 사용하는 것에 대해 기재하고 있는데, 샘플의 "노화"는 샘플내 전술한 발색단의 양을 측정한 후, 이 측정 결과를 표준(샘플의 "노화"와 관련된 양의 FFI를 지닌 단백질 샘플)과 비교함으로써 측정된다.

당뇨병에 관계된 병적 상태를 발병할 위험이 있는 당뇨병 환자를 확인하고 치료적 개입에 의해 상기 상태의 발병을 예방, 감소 또는 지연시키며, 상기 치료적 개입의 이익을 측정하는 유효한 수단에 대해 당뇨병 환자의 현존하는 치료 요법에서 오랜기간 필요성이 충족되지 않았다.

35 U.S.C. 202(c)조에 의거하여, 미국 정부는 본원에 기재된 발명에 있어 특정한 권리를 가진다는 것을 알리며, 본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)의 기금으로 일부 이루어졌다(허가 번호 DK44050, DK50317 및 DK50364).

본 발명은 당뇨병 환자의 치료, 특히 당뇨병성 합병증 및 기타 관련된 병인의 질병의 발병을 예방, 감소 또는 지연시키기 위한 치료 약제들 및 이들의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 당뇨병성 합병증을 유발하는 생화학적 메커니즘에서 중요한 단계라고 생각되는, 프럭토오스 리신(fructose lysine, FL)에서 프럭토오스-리신-3-포스페이트(FL3P)로의 효소적 전환을 저해하는 한 부류의 효소 저해제(enzyme inhibitor)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당뇨병 환자가 당뇨병성 합병증에 걸릴 위험을 평가하는 방법 및 당뇨병성 합병증의 발병을 예방, 감소 또는 지연하는 데 있어서 치료적 개입의 효능을 측정하는 방법에 관한 것이다.

도1은 비가역적으로 개질된 AGE-단백질을 생성하는 다단계 반응중의 관련 개시 반응을 도시한다.

도2는 리신 회수 경로중의 관련 반응들을 도시한다.

도3은 2 g의 FL을 공급한 후 24시간이 경과된 단일 개체로부터 3DF, 3DG 및 FL의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 요의 프로파일을 그래프로 도시한 것이다.

도4는 2 g의 프럭토오스리신을 공급한 7명의 지원자로부터 얻은 3DF의 시간의 경과에 따른 요배설을 그래프로 도시한 것이다.

도5는 대조 동물과 0.3% 당화 단백질을 함유하는 식이를 유지시킨 실험군 사이의 3DF 및 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(NAG)를 그래프상으로 비교한 것이다.

도6은 대조 식이 또는 당화 단백질이 풍부한 식이 중 어느 하나를 공급한 래트의 요중 3DF와 3DG 레벨간의 직선 관계를 도시하는 그래프이다.

도7A 및 도7B는 질식시의 3DF 레벨에 대해 플롯된 정상 개체 및 당뇨병 환자의 요중 3DG의 절식 레벨을 그래프로 도시한 것이다.

발명의 개요

본 발명은 FL에서 FL3P로의 효소-매개 전환에 관계되고, 당뇨병에 의해 영향을 받은 기관에서 비교적 고농도의 3-데옥시글루코손(3DG)을 생성하는 대사 경로의 발견에서 비롯된 것이다. 상기 새로이 발견된 경로의 생화학적 기능에 대한 연속된 연구는 당뇨병성 신장 질환의 병인에서 중요한 역할을 하는 것을 밝혀낸다. 또한, 이 경로는 다수의 공지된 당뇨병에 관련된 병적 상태의 발병에 있어서 원인이 되는 것으로 생각된다.

이 발견은 본 발명에서 실질적인 용도를 발견하였는데, 하나의 면에서 본 발명은 효소 저해 활성을 가지며 프럭토오스-리신에서 프럭토오스-리신-3-포스페이트로의 효소적 전환을 저해하는 데 효과적인 화합물 부류를 제공한다. 본 발명의 화합물의 관련된 효소 저해 활성은 분석에 의해 쉽게 측정할 수 있다. 분석 방법은 프럭토오스-리신, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 프럭토오스-리신-3-포스페이트 키나아제의 공급원 및 저해 활성을 입증하기에 충분한 양의 본 발명의 화합물을 용해시킨 수용액을 제공하는 단계, 그 결과 생성된 용액을 병적 상태에 적용하여 전술한 키나아제, 프럭토오스-리신 및 아데노신 트리포스페이트와의 상호 작용의 생성물로서 프럭토오스-리신-3-포스페이트 및 아데노신 디포스페이트의 형성을 촉진하는 단계, 및 하나 이상의 상기 생성물의 생성을 측정하는 단계로서, 본 발명의 화합물을 첨가하지 않고 동일한 상대적인 양의 프럭토오스-리신, 아데노신 트리포스페이트 및 프럭토오스-리신-3-포스페이트 키나아제의 공급원을 용해시킨 수용액과 비교하여, 본 발명의 화합물이 그 생성물의 양을 감소시키는 단계를 포함한다. 또한, 이 분석 방법도 본 발명의 범위내에 포함된다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 당뇨병 환자에서 당뇨병성 합병증의 발병을 예방, 감소 또는 지연하기 위해 활성 약제로서 전술한 것과 같은 본 발명의 화합물 및 약학적 허용 비이클(vehicle)을 포함하는 약학적 제제를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 당뇨병성 합병증을 발병할 위험이 있는 환자에서 당뇨병성 합병증의 발병을 예방, 감소 또는 지연하는 방법을 제공하며, 이 방법은 프럭토오스-리신에서 프럭토오스-리신-3-포스페이트로의 효소적 전환을 저해하는 데 유효한 양의 본 발명의 화합물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 아래에서 상세히 기재된 것과 같이, 상기 방법은 기타 병인학적으로 유사한 질병 상태를 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 당뇨병 환자가 당뇨병에 관련된 병적 상태에 걸릴 위험을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 예정된 용량의 당화-리신 잔기를 제공하는 양의 당화-리신 잔기의 공급원을 환자에게 투여하는 것, 및 정상적인 피검체, 즉 비당뇨병 피검체 또는 당뇨병의 임상적 징후가 없는 피검체 중에서 3-데옥시글루코손 대 3-데옥시프럭토오스의 비를 기준으로 하여, 환자에서 수득한 생물학적 샘플중 3-데옥시글루코손 대 3-데옥시프럭토오스의 비를 측정하는 것을 포함한다. 무증후성 피검체에 비해 당뇨병 환자 샘플에서 3-데옥시글루코손 대 3-데옥시프럭토오스의 비가 높은 것은 당뇨병 환자가 당뇨병에 관련된 병적 상태에 걸릴 위험이 크다는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 당뇨병성 합병증을 예방하는 데 있어서 치료적 개입의 효능을 평가하는 방법을 제공한다. 그 방법은 치료적 개입을 개시하기 전후에 당뇨병 환자로부터 수득한 생물학적 샘플중 3-데옥시글루코손, 3-데옥시프럭토오스 및 프럭토오스-리신의 농도를 측정하는 것을 수반한다. 이어서, 3-데옥시글루코손 및 3-데옥시프럭토오스 농도의 합계를 샘플중 프럭토오스-리신의 농도와 비교한다. 치료적 개입의 개시 이전에 취한 생물학적 샘플에서 측정한 프럭토오스-리신 농도에 비해, 치료적 개입의 개시 이후에 취한 생물학적 샘플 중 프럭토오스-리신 농도에 비례하는, 3-데옥시글루코손 및 3-데옥시프럭토오스 농도 합계의 감소는 치료적 개입의 효능을 나타낸다.

본 발명의 다른 측면으로서, 당뇨병 환자에게 당뇨병에 관계된 병적 상태를 발병시킬 가능성이 있는 음식물을 알리기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 음식물중 당화-리신 잔기의 함량을 측정하는 것 및 당뇨병 환자에게 상기 정보를, 예를 들어 식이의 포장 또는 당뇨병 환자가 사용하는 간행물 중에 제공하는 것을 포함한다.

발명의 상세한 설명

이하 더 상세히 설명된 것과 같이, 하기의 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다:

1. 당화-리신 잔기(Glycated-Lysine Residue)

본원에 사용된 "당화 리신 잔기"라는 표현은 환원당과 리신을 함유하는 단백질과의 반응에 의해 생성된 안정한 부가 생성물의 개질 리신 잔기를 의미한다.

단백질 리신 잔기의 대부분은 양으로 하전된 아미노산에 대해 예상된 바와 같이, 단백질의 표면상에 존재한다. 따라서, 혈청 또는 기타 생물학적 유체와 접촉하는 단백질 상의 리신 잔기는 용액중의 당 분자와 자유롭게 반응할 수 있다. 이 반응은 다단계로 일어난다. 개시 단계는 리신 유리 아미노기와 당 케토-기 사이에 시프 염기의 형성을 수반한다. 이어서, 상기 최초 생성물은 아마도리 재배열을 거쳐 안정한 케토아민 화합물을 생성한다.

이런 일련의 반응은 여러 가지 당에서 일어날 수 있다. 관여된 당이 포도당인 경우, 최초 시프 염기 생성물은 포도당의 C-1상에 있는 알데히드 부(moiety)와 리신 ε-아미노기 사이에 이민(imine)의 형성을 수반할 것이다. 아마도리 재배열 결과 프럭토오스의 C-1 탄소와 결합된 리신, 1-데옥시-1-(ε-아미노리신)-프럭토오스(본원에서는 프럭토오스-리신 또는 FL로 나타냄)를 형성할 것이다.

다른 알도오스 당, 예를 들어 갈락토오스 및 리보오스와도 유사한 반응이 일어날 수 있다[Dills, Am. J. Clin. Nutr., 58: S779 (1993)]. 본 발명의 목적을 위해, 임의의 환원당과 단백질 리신의 ε-아미노 잔기와의 반응의 초기 생성물은 개질하는 당 분자의 정확한 구조에 무관하게 당화-리신 잔기의 의미내에 포함된다.

또한, 당화-리신 잔기, 당화 단백질 및 글리코실화 단백질 또는 리신 잔기라는 용어는 본원에서 교환적으로 사용되며, 이런 표현들이 자주 교환적으로 사용되는 과학 저널에서 현재 사용되는 것과 일치한다.

2. 프럭토오스 리신(Fructose-lysine)

"프럭토오스-리신"(FL)이라는 용어는 본원에서 단백질/펩티드 중에 포함되거나 단백질 분해 소화(proteolytic digestion)에 의해 단백질/펩티드로부터 이탈된 임의의 당화-리신을 의미한다. 이 용어가 단백질 리신 잔기와 포도당의 반응으로부터 형성된다고 보고된, 프럭토오스-리신으로 통상 간주되는 화학 구조로 특히 제한되는 것은 아니다. 전술한 것과 같이, 리신 아미노기는 광범위한 당과 반응할 수 있다. 또한, 한 보고서는 포도당이 16개의 상이한 시험 당들 중에서 가장 반응성이 작은 당이라는 것을 나타낸다[Bunn et al., Science, 213: 222 (1981)]. 그러므로, 포도당과 유사하게, 갈락토오스와 리신으로부터 형성된 타가토오스-리신은, 천연적으로 생겨난 것이든 아니든 간에 모든 다른 당의 축합반응 생성물인 프럭토오스-리신이 본 명세서 중 언급된 곳이라면 어디에나 포함된다. 본 명세서로부터 단백질-리신 잔기와 당의 반응은 여러 반응 단계를 수반한다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 상기 반응 순서중 최종 단계는 단백질의 가교 및 일부가 형광인, AGE-단백질로 알려진 다중결합된 종류의 생성을 수반한다. 그러한 개질 단백질의 단백질 분해 반응은 당 분자와 공유 결합된 리신을 생성하지 않는다. 그러므로, 이들 종류는 본원에 사용된 용어와 같은 "프럭토오스-리신"의 의미에 포함되지 않는다.

3. 프럭토오스-리신-3-포스페이트

이 화합물은 ATP에서 FL로의 고에너지 인산염기의 효소적 전이에 의해 형성된다. 본원에 사용된 용어인, 프럭토오스-리신-3-포스페이트(FL3P)는 유리된 것이든 단백질에 결합된 것이든 효소적으로 형성될 수 있는 모든 인산화된 프럭토오스-리신 부를 포함하는 것을 의미한다.

4. 프럭토오스-리신-3-포스페이트 키나아제

이 용어는 고에너지 인산염의 공급원을 추가로 공급할 때, 전술한 것과 같이 FL에서 FL3P로 효소적으로 전환할 수 있는 하나 이상의 단백질을 의미한다.

5. 3-데옥시글루코손

데옥시글루코손(3DG)은 FL3P 분해시 유리 리신 및 무기 인산염과 함께 형성되는 1,2-디카르보닐-3-데옥시당(3-데옥시헥술로손으로도 알려져 있음)이다. 본 병세서에서, 3-데옥시글루코손이라는 용어는 전술한 것과 같이 넓은 정의의 FL3P를 지니면서, FL3P의 분해시 형성되는 모든 가능한 디카르보닐 당을 포함하는 것을 의미한다.

6. FL3P 리신 회수 경로(FP3P Lysine Recovery Pathway)

리신 회수 경로는 사람의 신장 및 가능한 다른 조직에서 존재하며, 이는 비개질 리신을 유리 아미노산으로 또는 펩티드 쇄에 포함된 형태로 재생성한다. 아래에 더 상세히 설명되는 것과 같이, 이 경로는 당뇨병성 합병증을 유발하는 가장 중요한 인자이다.

7.AGE-단백질

"AGE-단백질"(진행성 최종 당화 산물에 의해 개질된 단백질)이라는 용어는 과학 저널 및 본원에서 사용되는데, 이는 당과 단백질과의 반응의 최종 산물을 의미한다[brownlee, Diabetes Care, 15: 1835 (1992) 및 Niwa et al., Nephron, 69: 438 (1995)]. 단백질 리신 잔기와 포도당과의 반응과 같은 류의 반응은 프럭토오스-리신의 형성에 의해 중단되지 않는다. FL은 여러번의 탈수 및 재배열 반응을 거쳐서 비효소적 3DG를 생성할 수 있는데, 이것은 유리 아미노기와 다시 반응하여 관여한 단백질의 가교 및 갈변을 유발한다. 또한, 전술한 것과 같이, 3DG가 상기 개질 반응의 중심적인 중간체라는 이론적인 증거가 있다.

9."당화 식이(Glycated Diet)"

본원에 사용된 상기 표현은 일정 백분율의 정상 단백질이 당화 단백질로 대체된 임의의 공급된 식이(diet)를 의미한다. "당화 식이" 및 "당화 단백질 식이"이라는 표현은 본원에서 교환적으로 사용된다.

당뇨병성 합병증 중 적어도 일부 및 가능하게는 모두 포도당 및 기타 반응성 당에 의한 단백질의 공유적(covalent) 개질에 기인한다[M. Brownlee, Diabetes, 43: 836 (1994)]. 전술한 바와 같이, 당뇨병 환자 및 동물은 정상에 비해 당에 의해 개질된 단백질 농도가 높다. 사실상, 당뇨병에 관계된 AGE-단백질의 증가는 혈당 레벨의 증가보다 더 크다.

생체내의 3DG가 당화 리신 잔기를 함유하는 당백질의 분해 산물이라는 것은 이미 일반적으로 인정되고 있다. 또한, 이들 당화-잔기는 아미노산의 공급원으로 사용될 수 없다고 통상 생각되었다. 아래 기재된 것과 같이, 이런 기존관념은 옳지 않았다.

전술한 것과 같이, 본 발명은 효소 촉매 반응 중 3DG를 생성하는 미공지된 대사 경로의 발견으로부터 발전된 것으로서, 상기 경로는 효소 촉매 반응에서 3DG를 생성한다. 이 효소적 경로는 효소적 저해를 가능하게 하여, 독성 3DG의 생성을 감소시킨다.

당뇨병 신장에 대한 일련의 연구 과정 중, 스트렙토조톡신(streptozotoxin)에 의해 유도된 당뇨병 래트로부터 얻은 신장의 과염소산 추출물을³¹P NMR 스펙트럼 검사한 결과 NMR 스펙트럼 중에 특이한 새로운 피크가 나타났다. 본 발명자들이 이전에 수행한 연구 결과, 래트의 수정체 및 사람의 적혈구 중 프럭토오스-3-포스페이트의 존재가 입증되었다[A. Petersen et al., Biochem. J., 284: 363-366 (1992); Lal et al., Arch. Biochem. Biophys., 318: 191 (1995); Szwergold et al., Science, 247: 451 (1990) 및 Lal et al., Investigative Opthalmology and Visual Science, 36(5): 969 (1995)]. 초기 연구에서 래트의 수정체에서 다른 특이한 인산화 당이 확인되었다[Szwergold et al., Diabetes, 44: 810 (1995) 및 Kappler et al., Metabolism, 44; 1527 (1995)]. 그러므로, 이 새로이 확인된 피크가 또 다른 인산화 당이라고 가정하는 것이 당연했다. 더 광범위한 실험실 연구 결과, 상기 신규 화합물은 단순한 당이 아닌, 프럭토오스 성분의 3위치가 인산화된 프럭토오스-리신이라는 사실이 밝혀졌다.

이 확인은 2가지 방법으로 수행되었다. 진정한 프럭토오스-리신-3-포스페이트(FL3P)는 하기의 실시예 2에 개시된 방법에 따라 합성되었고, 당뇨병 래트의 신장에서의 피크와³¹P NMR 스펙트럼에서 같이 공명하는 것으로 나타났다. 이것을 주사한 후, 이들 래트에서 신장내 FL3P의 레벨이 실질적으로 증가되었다.

FL3P가 효소 촉매 반응 중 FL로부터 직접 유래되었다는 것을 입증하기 위해 2가지 실험을 수행했다. 프럭토오스 부분의 C3 위치를 중수소로 표지한 프럭토오스 리신을 합성하고, 이것을 래트에 주사했다. 주사후 3시간이 경과되었을 때, 이들 래트의 신장을 제거하고 과염소산으로 추출했다. NMR 분광 결과, 이들 래트에서 분리된 FL3P 물질은 프럭토오스 부분의 C3 위치에 중수소 표지를 함유하고 있었다. 게다가, 래트 신장 균질물은 ATP와 프럭토오스-리신 모두를 필요로 하는 반응에서 FL3P를 생성하는 능력을 입증하였다. 단지 프럭토오스리신과 ATP만을 생리학적 조건하에서 함께 배양하였을 때 FL3P가 형성되지 않으므로, 마지막에 언급된 실험은 특정 FL3P 키나아제의 존재를 입증한다. 또한, 신장 피질 분획과 관련된 실험 결과, 상기 키나아제 활성은 신장내 균일하게 분포되지 않고, 사람 및 동물의 당뇨병 신장내 손상을 입증하기 위해 최초로 해부되는 부위중 하나인 근위 세뇨관 부위에 집중되었다는 것을 입증되었다.

FL3P는 수용액 중에서는 불안정하다. 이들은 신속히 분해되어 3DG, 리신 및 무기 인산염을 형성한다. 또한, 이 반응은 생체내에서 일어난다. 생체내에서 FL3P의 분해가 자발적인지 또는 효소 촉매적인지는 현재 알 수 없다. 그러나, 프럭토오스-리신으로부터 3DG의 생성이 손상이 없는 신장에서는 매우 신속하게 일어나므로, 효소 촉매 반응이 관여된 것으로 강하게 추측된다.

FL3P 리신 회수 경로중 반응 단계가 도2에 도시되어 있다. 제1단계에서 FL3P 키나아제에 의해 촉매된 반응에서 프럭토오스-리신과 ATP가 반응하여 프럭토오스-리신-3-포스페이트(FL3P)와 ADP를 형성한다. 프럭토오스 부분의 3-위치에 인산화가 일어나서, 프럭토오스리신 분자를 탈안정화한다. 그 결과 생성된 FL3P는 이후에 분해되어 3-데옥시글루코손(3DG), 무기 인산염 및 비개질되고 유리된, 재사용 가능한 리신을 형성하는데, 상기 리신은 단백질 합성에 사용될 수 있다. 알데히드 환원효소는 3-DG를 3-데옥시프럭토오스(3DF)로 환원시켜 탈독성화하며, 이는 요중 배설된다.

도2는 가장 일반적인 당화-리신인 프럭토오스-리신을 사용하는 상기 경로를 도시하지만, 광범위한 유사 분자들이 상기 경로를 통해 유동될 수 있다는 사실은 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 아래에서 상세히 설명되는 것과 같이, FL3P 리신 회수 경로의 기질 선택성은 매우 광범위하고, 전술한 용어의 넓은 정의를 지지한다.

추가의 실험 결과, 리신 회수 경로가 양, 돼지, 개, 토끼, 소, 마우스 및 닭을 포함하는 광범위한 종의 동물에서 발견되었다. 또한, 이 경로는 사람에게도 존재한다. 리신이 대부분의 식이에 비교적 저농도로 존재하는 필수 아미노산이라는 사실로부터, FL3P 리신 회수 경로의 편재를 이해할 수 있다. 또한, 식이중 상당 비율의 리신 잔기는 당화 형태로 존재할 것이고, 식이을 요리하는 경우 개질 리신의 비율이 증가될 것이다. 이들 당화 리신 잔기는 단백질 합성을 위해 이용될 수 없으므로, 리신 회수 경로는 매우 유용하며, 그것을 지닌 기관에 선택적인 이점을 제공한다.

당뇨병은 리신 회수 경로에 대한 2가지 효과를 지닌다. 비당뇨병 개체에서 분리된 혈액 단백질에 비해 당뇨병 환자에서 분리된 것이 고농도의 당화-리신을 함유한다. 그러므로, 당뇨병 환자는 비당뇨병 환자보다 리신 회수 경로를 통해 더 크게 유동되기 쉽다. 추가로, 당뇨병 환자 및 정상 개체의 요중 3DG 및 3DF의 비를 예비 관찰한 결과, 당뇨병 환자에서 상기 경로를 경유하여 생성된 3DG를 탈독성화하는 능력이 감소되는 것으로 생각된다. 이들 2가지 인자는 결합하여 당뇨병 환자의 요중 3DG 농도를 상승시킨다[도7 및; 또한 Lal et al., Arch. Biochem. and Biophys., 342(1): 254-60 (1997) 참조].

리신 회수 경로에 관여하는 약제는 신장 이외의 다른 조직, 특히 적혈구, 수정체 및 말초 신경 조직중에서 확인되었다. 이들 조직 모두는 당뇨병성 합병증에 의해 영향을 받는다. 적혈구내 배치는 당뇨병성 미세혈관 합병증, 예를 들어 당뇨병성 망막염과 관계가 있고, 신장내 배치는 당뇨병성 신증과 관계가 있는 반면, 말초 신경내 배치는 당뇨병성 신경장애와 관계가 있다. 또한, 이들 약제는 췌장에서도 발견된다. 피부에서 이들 약제의 존재를 측정하기 위한 실험이 진행중이다. 이들 약제가 존재하는 것으로 밝혀진다면, 적당한 비이클 중에 본 발명의 저해제 화합물을 사용하는 국소 치료에 의해 콜라겐 가교를 방지하고, 그로 인해 피부 탄력성을 개선시킴으로써 이들의 유해 효과는 개선될 수 있다고 생각된다.

사람이 경구 섭취한, 당화-리신 잔기를 함유하는 단백질로부터 3DG 및 3DF 모두를 생성한다는 것을 입증하기 위해 실험을 수행하였다. 아래에 상세히 기재된 것과 같이, 실험 결과 리신 회수 경로가 사람에게 존재한다는 것이 확실히 입증되었다. 또한, 이들 실험은 모호한 현상을 밝혀내었는데, 소위 소수의 당뇨병 환자에서는 당뇨병성 합병증이 발병되는 반면, 다른 환자, 더 심한 혈당증 대조군의 당뇨병 환자는 이런 합병증을 발병하지 않는다. 이 현상의 원인은 본원에 제시된 데이터로부터 명백하다. 당뇨병 환자는 3DG를 탈독성화하는 다른 능력을 가지고 있다. 한 부류의 당뇨병 집단은 대다수의 당뇨병 환자에 비해 비교적 높은 알데히드 환원효소 활성을 가지고 있다. 결과적으로, 이들 개체는 정상 레벨보다 높은 3DG를 유효하게 탈독성화함으로써 리신 회수 경로를 통한 유동의 증가를 조절할 수 있다. 손상된 능력을 가진 다른 환자는 상승된 3DG 레벨을 원활히 탈독성화할 수 없으며, 결과적으로 당뇨병성 합병증이 발병할 위험이 커지게 된다.

아래에서 더 상세히 설명하겠지만, 당화 단백질 식이를 사용하여 리신 회수 경로를 자극할 수 있다는 것이 실험적으로 입증되었다. 전술한 FL의 경우와 같이, 당화 단백질을 공급한 시험 동물에서 FL3P, 3DG 및 3DF의 상승이 관찰되었다.

본 발명의 효소 저해제 화합물은 FL3P로부터 독성 3DG의 형성을 방지하면서, 리신 회수 경로를 차단한다.

아래에 기재된 것은 적당한 효소 저해제가 본 발명의 수행중에 사용하기 위해 나타내어야 할 광범위한 기준의 세트, 및 임의의 추정된 저해제가 이들 기준을 만족하는지를 결정하기 위한 특정 시험이다. 본 발명에 사용되는 후보(candidate) 키나아제 저해제는 식물 또는 미생물로부터 분리된 천연 생성물일 수 있다. 또 다르게는, 이들이 효소 반응 및 그것의 메커니즘의 이론적 지식으로부터 유도된 합성 분자일 수도 있다. 또한, 저해제는 복합적인 방법으로 합성될 수 있다. 임의의 출발점으로부터 복합적인 라이브러리(library)가 생성될 수 있다. 게다가, 복합적인 방법을 사용하여 이미 확인된, 표적 FL3P 키나아제의 저해제에 관계된 광범위한 화합물들을 생성할 수 있다.

추정된 저해제의 공급원과 무관하게, 아래에 제시된 모든 기준을 만족시키지 않는 화합물은 리신 회수 경로를 저해함으로써 당뇨병성 합병증 또는 관계된 병인 질병의 발병을 예방, 감소 또는 지연시킬 수 있는 유용한 치료적 약제로 생각되지 않는다.

1. 저해제는 소분자이어야 하고, 세포에 의해 쉽게 흡수되어야 한다. 이 기준을 만족시키기 위해, 저해제는 2,000 달톤 미만의 분자량, 더 이상적으로는 약 1,000 달톤 이하의 분자량을 가져야 한다.

2. 저해제는 FL3P 키나아제의 경쟁적, 비경쟁적, 비가역적 또는 자멸적(suicide) 저해를 나타내어야 한다. 만약 저해제가 경쟁적 또는 비경쟁적인 저해제라면, 저해 상수(inhibition constant) K_i는 약 1 mM 미만이어야 한다. 100 μM 미만인 것이 이상적이며, 약 40 μM 이하인 것이 더 이상적이다. 저해제가 자멸적 또는 다른 비가역적인 저해를 나타내는 경우, 저해 상수의 조건은 의미가 없게 된다.

3. 저해제는 수용액중에 용해되어야 하고 생리학적 pH의 수용액중에서 안정해야 한다. 저해제 또는 저해제의 염이 생리 식염수 또는 혈청에 10 μM 이상의 농도로 용해되기만 하면 용해도 조건을 만족시키는 것이다. 37℃의 생리 식염수중에 저해제를 용해시킨 저해제 용액이 1시간의 항온처리한 후에 그 활성의 50% 이상을 유지하기만 하면 상기 안정성 요건을 만족시키는 것이다. 1일 이상 항온처리한 후에 50% 이상의 활성을 유지하는 것이 이상적이다.

4. 저해제는 허용될 수 있는 약물동력학을 나타내야 한다. 이는 약제를 투여한 후 최소한 1시간동안 치료적 유효 농도를 유지해야 한다는 의미이다. 8시간이상에 걸쳐 유효 농도를 유지하는 것이 이상적이다. 1일 1회 투여만으로 저해제의 치료적 농도를 유지할 수 있는 것이 더 이상적이다. 상기 조건은, 저해제가 처음 투여한 후 치료적 농도를 확립할 수 있어야 한다는 것을 의미하는 것은 아니다. 성공한 약물 중, 약물의 효능이 연장된 투약시에만 나타내는 예는 다수이다. 상기 기준은 유효 농도에 도달한 후에 이 농도가 약물의 최종 투여후 1시간이상 지속될 수 있어야 한다는 것을 의미한다. 치료적 효능에 대한 시험은 본원에 기재되어 있다.

5. 저해제는 비독성이어야 한다. 이 기준은 저해제가 치료적 용량으로 투여되었을 때, 인체 독성을 나타내지 않을 것을 필요로 한다. 저해제가 치료적 효과를 위해 필요로 하는 레벨의 2배로 혈중 또는 표적 조직에 존재할 때, 독성이 분명하지 않은 것이 이상적이다. 치료적 범위의 6배 이상의 레벨에서 상당한 독성이 없는 것이 더 이상적이다. 당뇨병성 합병증은 장기간의 저해제 치료에 의해서 단지 예방될 수 있다. 그러므로, 비독성 조건은 급성 독성, 및 연장된 장기간의 사용시에 분명해 질 수 있는 만성 독성 모두를 포함하여야 한다. 후보 분자의 독성은 잘 확립된 동물 연구를 사용하여 쉽게 평가될 수 있다. 사람에 대한 독성은 제1상 임상 시험에서 평가될 수 있다.

하기 화학식의 화합물 및 이 화합물의 이성체와 약학적 허용염은 본 발명의 실시에 사용되는 화합물에 포함된다:

상기 식에서, X는 -NR′- 또는 -O-이고, R′는 H 및 직쇄 또는 분지쇄 알킬기 (C₁-C₄) 및 미치환되거나 또는 치환된 아릴 기(C₆-C₁₀) 또는 아랄킬기 (C₇-C₁₀)로 구성된 군에서 선택되고; R은 H, 아미노산 잔기, 폴리아미노산 잔기, 펩티드쇄, 질소 또는 산소를 함유하는 하나 이상의 치환체로 치환되거나 또는 미치환된 직쇄 또는 분지쇄 지방족기 (C₁-C₈), 질소 또는 산소를 함유하는 하나 이상의 치환체로 치환되거나 또는 미치환되고 하나 이상의 -O-, -NH-, 또는 -NR" 부에 의해 차단되는 직쇄 또는 분지쇄 지방족기 (C₁-C₈)로 구성된 군에서 선택되는 치환체인데, 여기서 R"는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기 (C₁-C₆) 및 미치환되거나 또는 치환된 아릴기 (C₆-C₁₀) 또는 아랄킬기 (C₇-C₁₀)이며, X가 -NR′-, R 및 R′를 나타낼 때 그들이 부착된 질소원자와 함께 5 내지 7 고리 원자를 갖는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클 고리를 또한 나타낼 수 있고 여기서 하나 이상의 질소 및 산소가 상기 고리에서 유일한 헤테로 원자이고, 상기 아릴기(C₆-C₁₀) 또는 아랄킬기 (C₇-C₁₀) 및 상기 헤테로사이클의 고리 치환체는 H, 알킬 (C₁-C₆), 할로겐, CF₃, CN, NO₂및 -O-알킬 (C₁-C₆)로 구성된 군에서 선택되며; R₁은 1 내지 4개의 선형 탄소 원자를 가진 폴리올 부이고; Y는 카르보닐 부또는 히드록시메틸렌 부이고; Z는 -H, -O-알킬 (C₁-C₆), -할로겐, -CF₃. -CN, -COOH 및 -SO₃H₂및 선택적으로 -OH로 구성된 군에서 선택된다.

질소 또는 산소를 함유하는 "R" 치환체의 구체적인 예는 감마-아미노-α-히드록시 부티르산 [-(CH₂)₂-CHOH-COOH], 1,2,4-트리아미노부탄 [-(CH₂)₂-CHNH₂-CH₂NH₃], 3,6-디아미노-5-히드록시헵타노산 [-CH₂-CH(OH)-CH₂-CH(NH₂)-CH₂-COOH] 등에서 유도된 것을 포함한다.

화학식 I의 구조는 비대칭 중심을 가지며 라세미체, 라세미 혼합물 및 다양한 입체 이성질체로 존재할 수 있고, 상기 모든 이성질체 형태 및 이들의 혼합물도 본 발명의 범위에 속한다.

상기 화학식 I의 구조를 가진 특정 화합물이 이미 공지되어 있으나, 기타의 화합물은 신규한 것으로 생각되고, 생체내에서 3DG의 효소 촉매적 생성을 저해하기 위해 화학식 I의 모든 화합물을 사용하는 것은 본 발명의 범위에 속한다.

상기 화학식의 저해제는 적절한 당, 예를 들어 포도당, 갈라토오스, 만노오스, 리보오스, 크실로오스, 또는 이들의 유도체를 아미노산 또는 기타 적절한 1차 또는 2차 아민과 반응시켜 카르보닐 부[즉, Y=-C(=0)-]를 가진 저해제를 생성함으로써 제조될 수 있다. 또 다르게는, 포도당, 갈락토오스, 만노오스, 리보오스, 크실로오스 등과 같은 당을 본원에 기재된 형태의 아미노- 또는 히드록실-치환된 반응물과 시프-염기 중간체를 아민으로 선택적으로 환원하는 NaBH₃CN과 같은 약제의 존재하에 반응시켜, 알콜 부[즉, Y=-CH(-OH)-]를 지닌 저해제를 생성한다. 아미노산 반응물의 반응성 부는 사용시에 알파-탄소상에 있는 아민기, 또는 산 측쇄상에 있는 아민기 또는 히드록실기일 수 있다. 적당한 아미노산은 필수 아미노산을 포함한다. 구체적인 예로는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 아스파르트산, 페닐알라닌, 티로신, 히스티딘 및 트립토판을 비제한적으로 포함한다. 기타 적당한 반응물은 아미노카르복실산의 넓은 부류, 예를 들어 피로글루탐산, 베타-알라닌, 감마-아미노부티르산, 엡실론-아미노 카프로산 등이다. 필요한 경우, 전술한 아미노산의 N-아실 유도체, 예를 들어 포르밀 리신 등도 또한 사용될 수 있다.

다른 적절한 반응물은 알킬 (C₁-C₃), 알콕시, 카르복시, 니트로 또는 할로겐기인 치환체로 치환되거나 또는 미치환된 아릴 (C₆-C₁₀)화합물, 하나 이상의 알콕시기인 치환체로 치환되거나 미치환된 알칸; 또는 알킬 (C₁-C₃), 아릴 (C₆-C₁₀), 알콕시, 카르복시, 니트로 또는 할로겐기인 치환체로 치환되거나 미치환된, 질소를 함유하는 헤테로사이클 화합물을 비제한적으로 포함한다. 마지막에 언급한 반응물 군의 구체적인 예로 m-메틸-, p-메틸, m-메톡시, o-메톡시- 및 m-니트로-아미노벤젠, o- 및 p-아미노벤조산; n-프로필아민, n-부틸아민, 3-메톡시프로필아민, 모르폴린 및 피페리딘이 포함된다.

상기 화학식을 가진 대표적인 저해제 화합물이 첨부된 표 A에 제시되어 있다. 본 발명을 실시하는 데 저해제로서 사용될 수 있는 공지된 화합물의 예는 메글루민, 소르비톨 리신 및 만니톨 리신을 비제한적으로 포함한다.

a - 리신 잔기

b - 감마-아미노 부티르산 잔기

c - 스페르민 잔기

본원에 기재된 저해제 화합물은 다양한 무기 또는 유기의 산 또는 염기를 가진 약학적 허용염을 형성할 수 있다. 적당한 염기는 예를 들어, 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염, 암모늄, 치환된 암모늄 및 기타 아민 염을 포함한다. 적당한 산은 예를 들어 염산, 염화브롬산 및 메탄설폰산을 포함한다.

화학식 I의 화합물의 약학적 허용염은 당업자에게 익숙한 방법에 따라 제조될 수 있다.

FL3P 키나아제를 저해하는 화합물의 능력은 광범위한 키나아제 활성 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 하나의 유용한 분석은 잠재적인 저해제를 신장 균질물 또는 다른 효소 공급원의 존재하에 프럭토오스-리신과 ATP로 배양하는 것을 포함한다. 분석 성분의 용액은 통상 본 발명의 저해제 화합물 1 mM이하, 프럭토오스 리신(FL) 1-10 mM, ATP 0.1-10 mM, 및 FL을 프럭토오스 리신-3-포스페이트로 전환시키기에 충분한 양의 효소 공급원을 함유하도록 제조된다. 배양은 4.5 내지 9.5의 pH 범위에서 수행되고, 중성 또는 중성에 근접한 pH에서 수행되는 것이 이상적이다. 배양은 효소 활성에 적합한 온도인 4 내지 40℃에서 수행되어야 한다. 배양은 생리학적 온도에서 수행되는 것이 이상적이다. 배양 후, 단백질을 산으로 침전시켜 반응을 중단시키고,³¹P-NMR 분광에 의해 FL3P의 생성을 측정했다. FL3P의 생성은 저해제가 없는 대조 샘플에 비해 저해제 화합물을 함유하는 샘플에서 감소되거나 배제될 수 있다.

기타 분석이 효소 저해를 신속히 측정하는 데 사용된다. 이런 분석의 하나는 프럭토오스-리신 및 감마-표지된³²P 또는³³P-ATP의 사용을 수반한다. FL3P는 Dow-1과 결합하지 않고 ATP와 결합하고 대부분의 다른 인산염은 Dow-1에 결합하므로, 예정된 반응 시간, 통상적으로 10분이 경과된 후, 분석 용액을 Dow-1 수지 컬럼에 통과시켜 생성물 FL3P를 잔류하는 반응 혼합물로부터 분리할 수 있다. 결과 생성된 용액은 신틸레이션 용액, 예를 들어 에코신트 A(Ecoscint A)를 함유한 용기에 첨가하고, 계수하여 생성된 방사능(radioactivity)의 양을 측정한다.

사람 조직을 다량으로 얻는 것이 어려우므로, 발현계, 예를 들어 이. 콜리(E. Coli)내로 복제된 키나아제의 재조합 이형(異形)을 사용하는 것이 바람직하다. 복제된 키나아제는 조직 특이성 cDNA 라이브러리의 "숏건(shotgun)" 클로닝으로부터 쉽게 얻을 수 있다. 상기 라이브러리는 시판되는 제품으로부터 쉽게 구할 수 있다. 예를 들어, 이들을 캐나다 팔로 알토의 클론테크(Clontech)로부터 입수할 수 있다. 고안된 숏건 클로닝은 캘리포니아주 샌 디에고에 위치한 스트라타겐(Stratagen)에서 시판하는 람다 클로닝 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 이 클로닝 키트는 그것의 사용을 위한 상세한 설명서를 포함하고 있다.

본 발명의 약학적 제제는 활성 성분으로서 전술한 하나 이상의 화합물과 함께 약학적 허용 담체 매체 또는 보조제를 포함한다.

이들 성분은 액체 및 고체를 포함하여, 다양한 투여 형태로 제조될 수 있다. 그러므로, 이 제제는 정제, 캐플릿(caplet), 환제 또는 당의정의 형태이거나 또는 캡슐과 같은 적당한 용기내에 충전되거나, 현탁액의 경우 병에 충전될 수 있다. 본원에 사용된 "약학적 허용 담체 매체"는 소정의 특정 제형에 적합한 임의의 모든 용매, 희석제 또는 기타 용액 비이클, 분산 또는 현탁 보조제. 표면활성제, 등장화제, 겔화제, 유화제, 방부제, 고체 결합제. 활택제 등을 포함한다. 적당한 담체 매체의 대표적인 예는 젤라틴, 유당, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 식물 및 동물의 지방 및 오일, 검, 폴리알킬렌 글리콜 등을 포함한다. 참고 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, PA 1975)]은 약학적 조성물을 제제화하는데 사용되는 다수의 담체 및 이들을 제조하는 공지된 기법을 개시하고 있다. 임의의 통상적인 담체 매체가 본 발명의 효소의 저해제에 부적합하다는 것, 예를 들어 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 또는 그렇지 않다면 약학적 제제의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용을 하는 것에 관한 것을 제외하고, 담체 매체의 사용은 본 발명의 범위에 속한다고 해석된다.

본 발명의 약학적 제제중에 활성 약제는 담체 매체 및/또는 보조제(존재하는 경우)를 포함하여, 제제의 총 중량을 기준으로 하여 약 5% 이상 일반적으로 98%이하의 함량으로 존재할 수 있다. 활성 약제의 비율이 조성물의 중량을 기준으로 65 내지 95%인 것이 바람직하다.

바람직한 추가의 활성 약제는 생체내에서 3DG에 결합하는 화합물이다. 이 부류의 화합물은 아미노구아니딘, 아미노벤조산과 그 유도체, 시스테인과 그 유도체, 아미노-치환된 이미다졸, 1,2-이치환된 벤지이미다졸, 치환된 1,2,4-트리아졸, 디아미노피리딘과 그 유도체, 아미노-치환된 피리미딘, 아미노알콜, 디아민 등을 비제한적으로 포함한다. 특히, 안지오텐신-전환 효소(angiotensin-converting enzyme; ACE) 저해제를 포함하는 항고혈압제는 본 발명의 약학적 제제중에 추가의 활성 약제로 또한 포함될 수 있다.

필요하거나 바람직한 경우, 위에서의 산 파괴로부터 활성 화합물을 보호하거나 또는 혈중으로 활성 화합물의 흡수를 촉진하는 화합물과 같은 보조제도 또한 본 약학적 제제중에 포함될 수 있다. 상기 보조제는 예를 들어, 보레이트, 또는 위의 산성 환경을 부분적으로 감쇄하는 다른 염과 같은 복합제(complexing agent) 등을 포함할 수 있다. 활성 화합물을 지방산 염으로 전달함으로써 흡수를 증가시킬 수 있다(활성 화합물이 하나 이상의 염기성 관능기를 함유하는 경우).

임의의 추가의 활성 성분과 함께, 본 발명의 화합물은 FL3P 리신 회수 경로를 저해하는 데 유효한 임의의 투여 경로 및 임의의 양을 사용하여 투여될 수 있다. 그러므로, 본원에 사용된 "치료적 유효량"이라는 표현은 비독성이면서, 당뇨병성 합병증을 방지하거나, 또는 기타 의학적 원인으로 인한 3DG의 대사적 생성을 저해하는 바람직한 치료법, 예를 들어 AGE-단백질 형성이 원인적 역할을 하는 노화 또는 기타 사람의 질병 상태의 효과를 감소시키기에 충분한 양의 효소 저해제를 의미한다. 필요로 하는 정확한 양은 환자의 종, 연령 및 일반적인 상태, 합병증의 성질, 특이적인 효소 저해 및 투여 방식 등에 따라 좌우되어 다를 수 있다.

본 발명의 화합물은 투여하기 쉬운 제형 및 균일한 용량으로 제제화되는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료해야 할 환자에 대해 적절한 물리적으로 분리된 단위의 효소 저해제를 의미한다. 각각의 투여량은 소기의 치료 효과를 나타내도록 계산된 양의 활성 물질 그 자체 또는 선택된 약학적 담체 매체와 함께 활성 물질을 함유하여야 한다. 통상적으로, 본 발명의 화합물은 제제의 중량을 기준으로 하여 화합물 약 1 mg 내지 약 2,500 mg을 함유하는 투여량 단위로 투여될 것이며, 약 5 mg 내지 약 250 mg이 바람직하다.

본 발명의 화합물은 치료해야 할 당뇨병성 합병증의 성질에 따라 좌우되어 경구로, 비경구로, 예를 들어 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥 주입 등의 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 소기의 치료적 효과를 얻기 위해, 1일 1회 이상, 환자의 체중을 기준으로 1일 kg당 약 0.7 ㎍ 내지 약 20 mg, 바람직하게는 약 30 ㎍ 내지 3.5 mg/kg의 용량 레벨로 경구 또는 비경구적으로 투여될 수 있다.

경구 용량이 치료적으로 활성인 저해제의 혈중 및/또는 표적 조직 레벨을 생성할 수 있는 경우는 경구적 활성 효소 저해제가 특히 바람직하다. 당업자는 혈액, 신장 및 기타 표적 조직의 탈단백질화 샘플 중 소분자 저해제의 레벨을 쉽게 측정할 수 있다. 이들 샘플 중 저해제의 농도를 예정된 저해제 상수와 비교할 수 있다. 저해 상수보다 훨씬 낮은 조직 레벨은 치료적 활성이 부족하다는 것을 나타낸다. 비가역적 저해제의 경우, 이런 부족은 각각의 조직중 FL3P 키나아제 레벨의 분석에 의해 확인되거나 또는 반증될 수 있다. 모든 경우에 있어서, 치료적 활성은 사람 또는 동물 피검체에 당화 리신 잔기 또는 프럭토오스-리신이 풍부한 식이를 공급하고, 공급 전후의 요중 3DG와 3DF의 양을 측정함으로써 평가될 수 있다. 아래에 더 상세히 설명된 것과 같이, 그들의 계에서 치료적 활성 저해제를 가진 피검체에서는 저해제 치료전에 동일한 피검체에 의해 분비된 레벨에 비해, 3DG와 3DF의 분비가 모두 감소될 것이고, 프럭토오스-리신의 요배설이 증가될 것이다.

본 발명의 화합물은 통상 선택된 정확한 저해제에 따라 좌우되어, 1일 1회 또는 1일 4회 내지 5회까지 투여될 수 있다. 1일 1회 투여 계획이 바람직하나, 당뇨병 환자는 그들의 질병 상태에 세심한 주의를 기울이는 데 익숙해져 있으므로, 필요한 경우, 전술한 1일 용량을 전달하기 위해 더 빈번한 투여 계획도 쉽게 이용할 수 있을 것이다. 그러나, 본원에 기재된 화합물 및 조성물의 투여를 위한 정확한 병용요법은 치료되어야 할 개별적인 환자의 필요성, 투여될 치료 유형 및 치료를 담당하는 내과 의사의 판단에 따라 달라져야 한다. 본원에 사용된 "환자"라는 용어는 사람 및 동물 모두를 포함한다.

본원에 기재된 저해제 화합물은 당뇨병성 합병증, 특히 40%이상의 당뇨병 환자에 영향을 미치고, 투석 및 이식을 요하는 말기 신장병의 1차적 원인인 당뇨병성 신증에 사용된다. 게다가, 이들 저해제는 AGE-단백질을 형성시키는 다른 병적 상태, 예를 들어 고혈압, 졸증, 알츠하이머형의 노인성 치매와 같은 신경퇴행성 질병, 순환 질병, 죽상동맥경화증, 골관절염, 백내장 및 노화에 따른 일반적인 쇠약화 효과를 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.

예비 실험 결과, 심각한 건강상의 역효과는 장기간의 당화 단백질의 소모를 통한 리신 회수 경로의 자극에 기인하였다. FL의 경우와 같이, FL3P, 3DG 및 3DF의 상승이 당화 단백질 식이를 공급한 시험 동물에서 관찰되었다(표 B 참조). 8개월간 이런 식이를 공급한 후, 당뇨병의 신장에서 발견되는 것과 유사한, 신장 병리의 분명한 징후가 당화 단백질 식이를 공급한 동물에서 나타났다(아래 실시예 10에 기재되어 있음). 또한, 소량의 당화 단백질을 섭취한 지원자의 요중 3DG 및 3DF 레벨의 일시적 상승이 관찰되었다.

당화 단백질 %	FL3P 농도(신장내, nM)	3DG/3DF 농도(혈장내- μM)
0	97	1.4/0.05
1	295	-
2.5	605	-
5	937	-
10	1066	3.6/0.12
20	1259	5.2/0.14
30	1267	6.2/0.28

새로이 발견된 리신 회수 경로의 자극이 전신 3DG 레벨을 실질적으로 증가시키므로, 당화 식이가 임신에 유의성 있는 효과를 유발하는가를 결정하기 위한 연구가 수행되었다. 아래 실시예에서 나타나는 것과 같이, 이제까지 얻은 결과는 상기 경로에 기인한 매우 강한 효과가 있다는 것을 암시한다.

또한, 감수성이 있는 래트 및 마우스의 종에서, 동물이 초년기(이유기 이후)에 유지한 식이는 제Ⅰ형 당뇨병의 발병에 있어서 발병률 10 내지 90%로 현저한 효과를 미칠 수 있다. 지난 10년동안 이 현상을 연구하기 위해 상당한 노력을 투입했다[예로서 참조; Diabetes, 46(4): 589-98 (1997) 및 Diabetes Metab. Rev. 12(4): 341-59 (1996) 및 본원에 참고로 인용된 문헌]. 본 발명자중 일부는 극단적으로 당뇨병을 유도하는 2가지 식이에 대한 연구를 수행했다. AIN-93(Dyets, Inc.)은 당뇨병을 가장 적게 발병시키고, 이제까지 관찰된 요중 3DF/크레아티닌의 최저 비율(1.0)을 생성한다. 퓨리나 500은 가장 높은 발병률로 당뇨병을 유발하며, 3DF/크레아티닌의 비를 2.5배 증가시킨다. FL3P, 3DG 및 3DF가 래트의 췌장에서 관찰되었기 때문에, 프럭토오스 키나아제 및 본 대사 경로의 대사체는 제Ⅰ형 당뇨병의 발병에 관계되어 있을 것으로 생각된다. 이 유형의 당뇨병에 감수성이 있는 동물(사람에서의 인슐린 의존형 또는 제Ⅰ형 당뇨병에 대한 유용한 모델)은 췌장의 β-세포에서 발생한 미지의 항원에 대해 이들을 민감하게 하는 비정상적인 면역계를 가지므로, 자신의 β-세포상에 있는 자기의 면역계에 의한 자가면역적 공격이 일어난다. 그 결과, 연속된 파괴가 일어나서, 동물은 인슐린을 생성하는 능력을 상실한다. 새로운 단백질과 반응하는 3DG가 새로운 항원성 부위를 생성할 수 있다는 것은 널리 알려져 있다. 그러므로, 다양한 식이에 있어 항원성의 근원은 췌장의 프럭토오스리신-3-포스페이트의 분해에 의해 형성된 3DG인 것으로 생각된다.

또한, 3DG는 일반적으로 아민과 상호작용하는 것으로 알려져 있기 때문에, DNA와 상호작용하여 돌연변이 및 발암성을 나타낼 수 있으며 단백질을 가교시킬 수 있다.

FL3P 리신 회수 경로의 발견에 의해 처음으로 당뇨병의 집단을 구별하고, 당뇨병성 합병증의 소인(素因)을 지닌 부류의 집단을 결정할 수 있게 되었다. 이 결정은 시험 피검체의 생물학적 유체, 예를 들어 요, 혈액 분획(특히 혈장 또는 혈청), 림프액, 조직간액 등에서 간편하게 수행될 수 있다.

밤새 절식한 후, 사람 피검체에게 비교적 고농도의 당화-리신 잔기를 함유하는 식이를 공급한다. 예를 들어, 이 식이는 아래 실시예 5에 기재된 카제인/당 "쿠키"의 형태이거나, 당화 잔기 또는 합성 프럭토오스-리신의 일부 다른 적당한 공급원일 수 있다. 당화-리신 잔기를 함유하는 단백질을 사용하면, 당화-리신의 함량은 총 아미노산의 0.02 내지 10%인 것이 바람직하고, 약 0.2 내지 0.4%인 것이 더 바람직하다. 경구 투여량에서 당화-리신 잔기의 총량은 약 0.3 g이다. 당화-리신 공급원을 소모하기 전, 소모 후 1시간, 3시간 및 5시간 또는 개별적인 임상적 상황에 의해 보증될 수 있는 기타 적절한 시간이 경과한 후 요 샘플을 수집한다.

이들 요중 3DG와 3DF 레벨을 측정하고, 이들 대사체의 비를 계산한다. 이 측정에 사용된 특정 방법이 본 발명을 실시하는 데 필수적인 것은 아니다. 필요한 경우, 아래 실시예 5에 기재된 GC 방법을 사용할 수 있다. 또 다르게는, 비색 분석 또는 면역학적 분석 방법을 사용할 수 있는데, 이는 당업자에게 분명할 것이다.

당뇨병 환자가 직면하는 주요 위험 인자는 혈당 조절임이 분명하며, 이는 최근 완료된 당뇨병 조절 및 합병증 실험(Diabetes Control and Complications Trail)에 의해 확실히 입증되었다. 그러나, 당뇨병성 합병증의 발병은 단순히 혈당 레벨로 설명될 수 없다; 당뇨병성 합병증의 발병을 조직학적 혈당 레벨과 비교할 때, 매우 광범위한 산포를 나타낸다.

당뇨병성 합병증을 발병할 위험이 가장 큰 당뇨병 집단의 부류를 결정하는 하나의 방법은 본 발명의 특히 중요한 측면이다. 이 방법은 당화 리신의 공급원을 섭취하기 전, 가장 바람직하게는 섭취 후 FL, 3DG 및 3DF 레벨을 측정하는 것을 수반한다.

예를 들어, 정상적인 피검체는 요중 절식시 3DG 대 3DF의 비가 0.025인 반면, 당뇨병 환자는 5배까지 또는 그 이상의 높은 비를 가진다. 이것은 도7의 데이터에 의해 지지되는데, 도7은 정상 혈당을 가진 개체의 3DG/3DF의 비는 0.025(1/39.77)이며 이 수치 주위에 매우 좁은 산포를 지니는 반면, 당뇨병 환자는 2배이상 높은 평균비(평균 0.069)와 이 평균 주위에 많이 흩어진 값을 지닌다는 것을 도시하고 있다.

본원에 입증된 것과 같이, 당뇨병 환자에서 3DG의 생성이 증가된다. 그러므로, 당뇨병성 합병증을 방지하기 위해서는 이 독성 대사체의 매우 효율적인 제거가 필요하다. 본원에 기재된 방법으로 계산한 3DG 대 3DF의 비로서 3DG 탈독성화 경로의 유효성을 평가할 수 있다. 낮은 비를 가진 개체는 일반적으로 당뇨병성 합병증의 발병에 대한 저항성을 가진다. 정상 범위로 함유된 비를 포함하여 높은 비를 가진 개체는 더 발병의 위험이 크지만, 정상 범위이상의 높은 비를 가진 개체는 이러한 합병증을 발병할 위험이 특히 크다.

4마리의 다른 래트 종의 혈장 및 요중 프럭토오스리신(FL)에 대한 최근의 측정 결과, 이들 각각의 신장이 혈중에서 FL을 처리하는 방법이 상당한 다양하다는 것이 입증되었다. 4마리 래트 종에서 2마리(롱 에반스, 브라운 노르웨이)에서는 크레아티닌에 대한 상기 화합물 및 그 대사물의 비를 토대로 판단하면, 신장에 의해 여과된 FL 거의 모두가 요중에 나타났다. 다른 2종(스프라그 다울리, 피스커)에서는 크레아티닌 여과율에 대한 비교를 토대로 하여, 혈장중 FL의 10 내지 20%가 요중에 나타났다. 이들 측정 결과, 포유 동물 신장내 FL 처리에서의 큰 변화성을 강하게 암시한다. 설치 동물의 신장 및 사람 신장의 기능적 동일성에 대해 공지된 사실이 주어진다면, FL 처리중 유사한 변화가 사람에서도 존재할 것이라는 것을 가정하는 것은 어렵지 않다. FL이 프럭토오스리신 회수 경로에 대한 주된 공급원이므로, 전체 경로는 다량의 FL이 초여과로부터 흡수되는 사람에 있어서 실질적으로 자극되는 경향이 있으므로, 그 결과 신장내 3-데옥시글루코손(3DG)의 국소 레벨 및 전신 레벨이 높아진다. 이 관찰은 진단 시험의 기초가 될 수 있는데, 상기 진단 시험에서는 동시에 얻은 혈장 또는 혈청 샘플을 요 샘플과 비교하여 신장으로 FL의 유출량 및 요중에 나타난 유출 분획을 측정한다. 이 비율이 실질적으로 1미만인 개체는 당뇨병성 신증, 노인성 신부전 및 신장 암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 신장의 병적 상태를 발병할 위험이 있다.

본 발명의 키나아제 저해제의 치료적 효능은 리신 회수 경로에 대한 시험을 사용하여 쉽게 그리고 안전하게 측정될 수 있다. 시험 프로토콜은 요중 3DG 및 DF 레벨 이외에 요중 프럭토오스리신을 측정하는 것을 제외하고는 바로 앞에서 제시한 것과 동일하다. 이 시험은 FL3P 키나아제 저해제 치료를 개시하기 전후 모두 수행되는 것이 유용하다. 3DG와 3DF의 요중 레벨을 각 시점에서 합하고, 동일한 샘플에서 측정한 프럭토오스-리신의 레벨과 비교한다.

당화-리신이 풍부한 식이를 섭취한 후 요중에 나타난 3DG 및 3DF의 최고 레벨은 리신 회수 경로의 활성에 기인한 것이다. 이들 대사체 대 미반응의 프럭토오스-리신(사람 요의 정상적인 성분)의 농도비는 이 경로의 활성을 반영한다. 리신 회수 경로의 저해는 배설되는 3DG와 3DF의 양을 감소시키고, 배설되는 프럭토오스-리신의 레벨을 증가시킨다. 그러므로, 키나아제 저해제의 치료적 효능은 치료 개시후 (3DG + 3DF)/프럭토오스-리신 비의 감소를 측정함으로써 정량될 수 있다. 요의 부피 또는 대사체 농도는 이 분석을 해석하는 데 있어서 인자가 아니라, 단지 대사체의 비로 간주된다는 사실이 주목할 만하다.

앞서 개시된 내용으로부터, 경구 섭취된 고농도의 당화-리신 잔기를 함유한 식이는 신장 및 혈청중 3DG를 생성시킨다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 당뇨병 환자와 같이 신장 질환의 소인을 가진 개체는 당화-리신 잔기를 고농도로 함유한 식이를 피하도록 주의를 하는 것이 합당하다. 당화-리신 잔기의 농도는 다수의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 한가지 측정 방법이 아래 실시예 4에 기재되어 있다. 그러나, 당화-리신 잔기의 레벨을 정확히 측정하는 임의의 적당한 측정 방법은 아래에 예시된 분석 방법 대신에 사용될 수 있다. 특히 고려되는 분석 방법의 예로서 비색 분석 방법과 면역학적 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

사용된 측정 방법에 무관히, 제조된 식이중 당화-리신 잔기의 함량을 측정하는 것 및 신장 기능장애의 소인을 가진 개체에게 이들 측정의 결과를 알림으로써 개체가 당화-리신의 함량이 높은 식이를 섭취하는 것을 방지하는 것은 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명을 더 상세히 설명하기 위해 하기 실시예를 제시한다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제시되며, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예에 주어진 온도는 다른 지시가 없는 한 섭씨 단위이다.

실시예 1

FL3P의 분리 및 확인:

당뇨병 래트 신장의 과염소산 추출물에 대한³¹P NMR 분석 결과, 비-신장 조직중에서는 관찰되지 않고 비당뇨병 신장에서 매우 낮은 레벨로 존재하는 새로운 당 일인산염 공명이 6.24 ppm에서 나타났다. 관찰된 공명의 원인이 되는 화합물은 용출제로 1-부탄올-아세트산-물(5:2:3)을 사용하여 미세결정질 셀룰로오스 컬럼상에서 추출물을 크로마토그래피함으로써 분리되었다. 그 구조는 프로톤 2D COSY에 의해 프럭토오스-리신 3-포스페이트로 결정되었다. 이것은 전술한 것과 같이 제조된 FL을 동물에게 주사하여[Finot 및 Mauson, Helv. Chim. Acta, 52: 1488 (1969)] FL3P로의 직접적인 인산화를 나타냄으로써 나중에 확인되었다. 특히 위치-3에 중수소화된 FL을 사용하여 탄소-3에 있는 인산염의 위치를 확인했다. 이것은 결합된³¹P NMR 스펙트럼과 탈결합된³¹P NMR 스펙트럼 양자를 분석함으로써 수행되었다. 정상 P-O-C-H 결합은 10.3 Hz의 J치를 가진 FL3P 중에서 이중선(doublet)을 생성하는 반면, P-O-C-D는 결합을 가지지 않았고, 3-중수소화된 FL3P에서 발견되는 것과 같은 결합된 단일선(singlet) 및 탈결합된 단일선을 생성했다. FL3P의 특이한 성질은 나트륨 보로하이드라이드로 처리되었을 때, 이것이 만니톨 및 소르비톨-리신 3-포스페이트에 상응하는 5.85 및 5.95 ppm에서 2개의 새로운 공명으로 전환된다는 것이다.

실시예 2

FL3P의 합성:

디벤질글루코오스 3-포스페이트 1 mmol 및 α-카르보벤즈옥시-리신 0.25 mmol을 MeOH 50 ml중에서 3시간동안 환류시켰다. 이 용액을 100 ml의 물로 희석하고 피리디늄형으로 Dow-5 컬럼(2.5 x 20 cm)상에서 크로마토그래피하고, 처음에는 물(200 ml)로, 나중에는 600 ml의 완충액(0.1 M 피리딘 및 0.3 M의 아세트산)으로 용출시켰다. 표적 화합물은 최종 수세시 그리고 완충액 세척의 시작 단계에서 용출되었다. cbz 및 벤질 차단기를 수소 20 psi에서 5% Pd/C로 제거시켜 수율 6%로 FL3P를 수득했다.

실시예 3

FL 및 ATP로부터 FL3P의 효소적 생성 및 저해제 스크리닝 분석:

초기에³¹P NMR을 사용하여 신장 피질에 있는 키나아제 활성을 입증하였다. 신선한 돼지 신장 피질의 샘플 3 g을 150 mM KCl, 5 mM DTT, 15 mM MgCl₂를 함유하는 pH 7.5의 50 mM Tris·HCl 9 ml중에 균질화했다. 이것을 10,000 g로 30분간 원심분리한 후, 상청액을 100,000 g로 60분간 원심분리했다. 황산 암모늄을 첨가해서 60% 포화시켰다. 4℃에서 1시간 경과 후, 원심분리하여 침전물을 수집하고 5 ml의 최초 완충액 중에 용해시켰다. 상기 용액의 2 ml 분액을 10 mM의 ATP 및 10 mM의 FL(상기 실시예 1에서와 동일하게 제조)을 사용하여 2시간동안 37℃에서 배양했다. 이 반응물을 과염소산 300 ㎕로 급냉하고, 원심분리하여 단백질을 제거한 후 세파덱스 G 10 (5 x 10 cm)의 컬럼상에서 탈염했다. 이 반응 혼합물을³¹P NMR 분석하여 FL3P의 형성을 검출했다.

이렇게 수득한 키나아제 활성의 증거를 기초로 하여, 방사능 분석이 개발되었다. 이 분석은 FL3P에 의한 Dow-1 음이온 교환 수지로의 결합 부족을 이용하도록 고안되었다. FL3P의 이런 특징은 그것을 분리하기 위해 노력하는 과정에서 발견되었다. 대부분의 인산염이 상기 수지에 결합하므로, 용액중에 FL3P를 남기고 ATP와 반응하는 모든 화합물 중의 대부분과 임의의 과량의 ATP는 수지에 결합할 것으로 생각되었다. 제1단계는 분석에서 ATP를 제거하는데 필요한 수지의 양을 측정하는 것이었다. 이것은 0.9 ml의 수중에 200 mg의 Dow-1을 현탁시킨 현탁액에 혼합물을 피펫으로 옮기고, 진탕 및 원심분리하여 수지를 눌러서 굳힘으로써 수행되었다. 이것으로부터 상청액 0.8 ml를 200 mg의 신선한 건조 수지상에 피펫으로 옮기고, 진탕 및 원심분리했다. 상청액 0.5 ml를 10 ml의 에코신트 A에 피펫으로 옮기고 계수했다. 잔류하는 개수는 85 cpm이었다. 이 과정은 분석에 사용되었다. 미정제 피질 균질물을 황산 암모늄으로 침전시킨 침전물을 4℃의 균질물 완충액 중에 재용해시켰다. 이 분석물은 pH 7.5의 50 mM Tris·HCl중에 10 mM 감마³³P-ATP(40,000 cpm), 10 mM FL, 150 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 5 mM DTT를 함유한다. FL3P의 생성속도와 효소 농도의 관계는 1, 2 및 4 mg의 단백질을 37℃에서 30분간 3회 측정하여 결정되었다. FL없이 동일하게 수행된 공시험값을 감하고, 데이터를 기록했다. 관찰된 활성은 20 nmol/시/mg(단백질)의 대략적인 FL3P의 합성속도에 상응한다.

실시예 4

메글루민 및 다양한 폴리올리신에 의한 3-데옥시글루코손의 형성 저해

a. 일반적인 폴리올리신 합성:

당(11 mmole), α-카르보벤즈옥시-리신(10 mmol) 및 NaBH₃CN(15 mmole)을 50 ml의 MeOH-H₂O (3:2)에 용해시키고 25℃에서 18시간동안 교반시켰다. 용액을 과량의 Dow-50 (H) 이온 교환수지로 처리하여 과량의 NaBH₃CN을 분해시켰다. 이 혼합물(액체와 수지가 합해진 것)을 Dow-50 (H) 컬럼(2.5 x 15 cm)상으로 이동시키고 물로 잘 세척하여 과량의 당 및 붕산을 제거하였다. 카르보벤즈옥시-폴리올리신을 5% NH₄OH로 용출시켰다. 증발 후, 수득한 잔류물을 물-에탄올(9:1)중에 용해시키고, 10% 목탄상 팔라듐 촉매를 사용하여 수소 기체(20 psi)로 환원시켰다. 여과 및 증발후 폴리올리신을 수득했다.

b. 소르비톨리신, 만니톨리신 및 갈락티톨리신에 의해 요 및 혈장의 3-데옥시글루코손을 감소시키기 위한 실험적 프로토콜:

3시간동안 6마리의 래트로부터 요를 수집했다. 또한, 혈장 샘플을 얻었다. 이어서, 동물에 10 μmol의 소르비톨리신, 만니톨리신 또는 갈락티톨리신 중 하나를 복강내 주사로 주입했다. 추가로 3시간동안 요를 수집하고, 3시간의 종반부에 혈장 샘플을 얻었다.

아래 실시예 5에 기재된 것과 같이, 이들 샘플내에서 3-데옥시글루코손을 측정했고, 일정하지 않은 부피를 크레아티닌에 대해 표준화했다. 소르비톨리신, 만니톨리신 및 갈락티톨리신에 의한 요의 3-데옥시글루코손의 평균적인 감소는 각각 50%, 35% 및 35%였다. 혈장 3-데옥시글루코손은 소르비톨리신, 만니톨리신 및 갈락티톨에 의해 각각 40%, 58% 및 50% 감소되었다.

c. 요의 3-데옥시글루코손을 감소시키기 위한 메글루민의 사용

3마리의 래트는 메글루민(100 μmol)이 전술한 리신 유도체 대신 복강내 주사된 것을 제외하고는, 상기 b에서와 동일하게 처리되었다. 주사후 3시간 경과시에 요중 평균 3-데옥시글루코손 농도가 42% 감소되었다.

실시예 5

당화 단백질의 겁취에 따른 사람에서의 요의 FL, 3DG 및 3DF의 상승:

a. 당화 단백질을 함유하는 식이 생성물의 제조:

카제인 260 g, 포도당 120 g 및 물 720 ml를 혼합하여 균질 혼합물을 제조했다. 혼합물을 금속 플레이트로 옮기고, 65℃에서 68시간동안 요리했다. 이어서, 그 결과 생성된 케이크를 중간 분말로 분쇄했다.

상기 분말은 킬달(kjeldahl) 방법에 의해 측정시 60%의 단백질을 함유했다.

b. 당화 리신 함량의 측정:

상기 a 단계에서와 같이 제조된 분말 1 g을 6N HCl로 20시간동안 환류시켜 가수분해했다. 그 결과 생성된 용액은 NaOH 용액을 사용하여 pH를 1.8로 조정했고, 100 ml로 희석했다. 프럭토오스리신 함량은 아미노산 분석기 상에서 프럭토오스리신의 산 가수분해로부터 얻은 생성물인 푸로신(furosine)으로 측정되었다. 이런 방식으로, 케이크는 5.5%(w/w) 프럭토오스 리신을 함유한 것으로 측정되었다.

c. 실험적 프로토콜:

지원자들은 2일간 프럭토오스리신이 없는 식이를 소모한 후, 본원에 기재된 것과 동일하게 제조된 식이 생성물 22.5 g을 소모하여 2 g용량의 프럭토오스리신을 유효하게 공급받았다. 14시간동안 2시간 간격으로 요를 수집하고, 24시간이 되었을 때, 최종적으로 요를 수집했다.

d. 요중 FL, 3DG 및 3DF의 측정:

46℃의 워터스(Waters) C18 유리 아미노산 칼럼, 및 아세토니트릴 메틸 알콜-물(45:15:40)로부터 1 ml/분으로 아세토니트릴-나트륨 아세테이트-물(6:2:92)로의 경사(gradient) 용출계를 사용하여, 워터스 996 디옥사이드 어레이(Array)를 지닌 HPLC에 의해 FL을 측정했다. 메글루민의 내부 표준을 사용하여 정량했다.

샘플을 탈이온화 후, HPLC로 3DF를 측정했다. 분석은 PA1 컬럼(디오넥스)을 사용하며 1 ml/분의 속도로 32 mM 수산화나트륨으로 용출시키는 디오넥스 DX-500 HPLC 시스템 상에서 수행되었다. 합성 3DF를 사용하여 매일 얻어진 표준 곡선으로부터 정량을 수행했다.

3DG는 샘플을 탈이온화한 후, GC-MS에 의해 측정되었다. 3DG는 PBS중 10배 과량의 디아미노나프탈렌으로 유도되었다. 에틸 아세테이트 추출물은 트리-실(피어스)에 의해 트리메틸 실릴 에테르로 전환되는 무염 분획을 생성했다. 분석은 휴렛 팩커드 3890 선택된 이온을 모니터하는 GC-MS 시스템 상에서 수행되었다. GC는 하기의 온도 프로그램을 사용하여 용융 실리카 모세관 컬럼(DB-5, 25 mx. 25 mm) 상에서 수행되었다: 주사기 입구의 온도를 250℃로, 그리고 초기 컬럼 온도를 150℃로 1분간 유지시킨 후, 16℃/분으로 290℃까지 상승시키고 15분간 유지시켰다. U-13C-3DG의 내부 표준을 사용하는, 선택된 이온 모니터로 3DG를 정량했다.

도3에 도시된 그래프는 당화 단백질을 소모한 후 한 명의 지원자의 요중 FL, 3DF 및 3DG의 생성을 나타낸다. 3개 대사체 모두가 신속히 출현하는 것이 분명하다. 24시간 경과후에도 3DF 및 DG 모두 약간의 상승을 나타낸다.

도4에 도시된 그래프는 7명의 시험군의 각각의 구성원에서 3DG의 형성을나타낸다. 모든 경우에서 유사한 패턴을 나타내었다. 도4에 나타난 것과 같이, FL 환약(bolus) 투여 후 약 4시간이 경과되었을 때 3DF 배설은 최고점을 나타내고, 환약 투여후 24시간 경과시에도 3DF의 약한 상승을 관찰할 수 있었다.

실시예 6

공급 실험

N-아세틸-β-글루코사미니다아제(NAGase)는 당뇨병 환자에서 높은 농도로 요중 배설되는 효소이다. 이것은 세뇨관 손상의 초기 마커로 생각되나, 요중 증가된 NAGase의 병인론은 잘 이해되지 않는다. 당뇨병 환자에서 증가된 NAGase의 요배설은 세포 파괴보다 증가된 요중 배설을 가진 당뇨병에 의해 유도된 근위 세뇨관의 리소좀의 활성에 기인한다는 것이 제안되었다.

본 실시예에서 얻은 결과는 모든 비교에서 3DF 및 NAGase 레벨은 대조군에 비해 실험군에서 증가된다는 것을 보여준다. 따라서, 당화 단백질을 공급한 동물은 당뇨병 환자에서 얻은 결과와 유사하게 과량의 NAGAse를 요중 배설한다. 대조 동물에 비해 NAGase 배설이 약 50% 증가된다. 또한, 이들 동물은 대조군에 비해 요중 3DG가 5배 증가된다. 도5 및 도6에서 볼 수 있는 것과 같이, 요중 3DF는 3DG와 관계가 깊다. 두가지 화합물은 재흡수되지 않고 사구체 여과속도로 혈장으로부터 제거된다.

실시예 7

신장 단백질의 SDS 겔

두마리의 래트에 매일 5 μmol의 FL 또는 만니톨(대조군으로 사용됨)을 5일간 주사했다. 이 동물을 치사시키고 신장을 제거하여 피질과 척수로 절개했다. 조직을 150 mM KCl, 15 mM MgCl₂및 5 Mm DTT를 함유하는 pH 7.5의 50 mM Tris·HCl 5부피 중에 균질화했다. 10,000 g로 15분간 원심분리하여 세포의 파편을 제거한 후, 상청액을 150,000 g로 70분간 원심분리했다. 가용성 단백질을 12% 폴리아크릴아미드 겔, 및 4-15% 그리고, 10-20% 경사 겔 상에서 분석했다. 모든 경우, 저분자량의 밴드는 소실되거나, 만니톨을 주사한 동물에 비해 FL을 주사한 동물의 신장 추출물에서 현저히 감소되었다.

실시예 8

3-O-메틸프럭토오스 리신의 합성:

30 ml의 메탄올 및 15 ml의 글리세롤 중에 19.4 g(0.1 mol)의 무수 3-O-메틸 글루코오스 및 1 g의 아황산수소나트륨을 현탁시킨 현탁액을 30분간 환류시킨 후, 0.035 mmol의 α-카르보벤즈옥시-리신 및 4 ml의 아세트산을 첨가했다. 이 용액을 3시간동안 환류시켰다. 이 용액을 1부피의 물로 처리하고 피리디늄형의 Dowex-5 컬럼 (4 x 50 cm) 상에서 크로마토그래피하고, 처음에는 물로 나중에는 피리디늄 아세테이트로 용출시켰다. 순수한 물질을 함유하는 분획을 혼합하고 중발시켰다. 결과 생성된 물질을 50 ml의 물-메탄올(9:1) 중에 용해시키고, 10% 목탄상 팔라듐 촉매를 사용하여 수소 기체(20 psi)로 환원시켰다. 여과 및 증발 후 3-O-메틸프럭토오스리신을 생성했다.

상기 화학식 (I)의 구조를 가진 기타 특정 화합물은 예를 들어, 선택된 질소 또는 산소를 함유하는 출발 물질의 당화에 의해 제조될 수 있는데, 상기 출발 물질은 필요한 경우, 당업자에게 널리 알려진 방법에 따라 화학적으로 개질 가능한 프럭토오스와 같은 당화제를 가진 아미노산, 폴리아미노산, 펩티드 등일 수 있다.

실시예 9

FL3P 키나아제 활성에 대한 추가 분석:

a. 저장 용액의 제조:

pH 8.0의 100 Mm HEPES, 10 mM ATP, 2 mM MgCl₂, 5 mM DTT 및 0.5 mM PMSF인 분석 완충액을 제조했다. 2 mM 프럭토실-스페르민 HCl인 프럭토실-스페르민 저장 용액을 제조했다. 2mM 스페르민 HCl인 스페르민 대조 용액을 제조했다.

b. 프럭토실-스페르민의 합성:

프럭토실-스페르민의 합성은 공지된 방법을 사용하여 수행되었다[J. Hodge 및 B. Fisher, Methods Carbohydr. Chem., 2: 99-107 (1963)]. 스페르민(500 mg), 포도당 (500 mg) 및 나트륨 피로설피트(80 mg)의 혼합물은 50 ml의 메탄올-물(1:1) 중에 8:4:1(스페르민:포도당:피로설피트)의 몰비로 제조되었고, 12시간동안 환류시켰다. 물을 사용하여 생성물을 200 ml로 희석하고, Dow-50 컬럼 (5 x 90 cm)상에 로드했다. 2 컬럼 부피의 물로 미반응의 포도당을 제거하고, 0.1 M NH₄OH를 사용하여 생성물과 미반응의 스페르민을 제거했다. 모아진 생성물의 피크 분획을 동결건조하고, 프럭토실-스페르민의 농도는 생성물의 정량적¹³C NMR 스펙트럼중 C-2 프럭토실 피크의 적분값을 측정함으로써 결정되었다.

c. 정제에 대한 키나아제 분석:

효소 제제 10 ㎕, 분석 완충액 10 ㎕,³³P ATP 1.0 μCi, 프럭토실-스페르민 저장 용액 10 ㎕ 및 물 70 ㎕를 포함하는 배양 혼합물을 제조하고 37℃에서 1시간동안 배양했다. 배양의 종반부에 샘플 90 ㎕(2 x 45 ㎕)를 직경이 2.5 cm인 셀룰로오스 포스페이트 평원반(Whatman P-81) 상에 스폿하고 방치하여 건조시켰다. 이 평원반을 물로 광범위하게 세척했다. 건조시킨 후, 평원반을 신틸레이션 바이알에 위치시키고 계수했다.

각 효소 분획은 적절한 스페르민 대조군으로 2회 분석되었다.

실시예 10

당화 단백질 식이를 공급한 시험 동물에서 관찰된 신장 병리

3마리의 래트에 8개월간 당화 단백질 식이(20% 총 단백질; 3% 당화)를 유지시키고 대조 식이를 유지시킨 동일한 연령의 9마리의 래트와 비교했다. 당화 식이를 공급한 동물에서 사구체 손상의 실질적인 증가가 1차적으로 발견되었다. 이들 동물에서 관찰된 전형적인 병변은 보우만 주머니에 부착된 사구체 방상(tuft)의 부분적 경화증, 체벽 상피의 세뇨관 후형질화(metaplasia) 및 조직간 섬유증(intestitial fibrosis)이었다. 당화 단백질 식이를 공급한 동물 3마리 모두와 대조 식이를 공급한 동물중 1마리가 13% 이상의 사구체 손상을 나타내었다. 이것이 우연히 발생할 수 있는 가능성은 2%미만이다. 사구체에서 관찰된 병적 상태 외에, 세뇨관에서 다수의 관상구조(hylinated cast)가 관찰되었다. 이들을 정량하지는 않았으나, 이들중 다수는 당화 식이를 공급한 동물에서 발견되었다. 또한, 당화 식이를 공급한 동물에서는 NAGase의 레벨이 상승되었다.

이 실험의 결과, 당화 식이는 시험 동물에서 당뇨병의 신장에서 볼 수 있는 것과 유사한 일련의 조직학적 병변을 발병시키는 것으로 생각되었다.

실시예 11

임신에 대한 당화 식이의 효과

예비 실험에서, 5쌍의 마우스에 당화 식이(18%의 총 단백질; 3% 당화)를 공급하였고, 이들은 7개월에 걸쳐 6회 번식했다. 6회의 임신으로 다음에 제시된 수의 생존한 새끼를 낳았다; 17, 23, 13, 0, 3 및 0. 제3의 번식후 생존한 새끼의 급격한 감소의 측면에서, 10쌍을 2군으로 나눠 각각에 당화 식이(13% 총 단백질; 3% 당화) 또는 대조 식이(13% 총 단백질; 0% 당화)를 공급했다. 그 결과, 양쪽 군은 유사한 결과를 얻으면서, 4회 번식했다. 첫번째 임신에서 49/20(당화 식이/대조 식이) 새끼를 낳았고; 두번째 임신에서 18/41; 세번째 임신에서 37/27; 및 네번째 임신에서 20/23의 새끼를 낳았다. 다섯번째 임신은 현재 진행중이다. 마우스 쌍을 과혈당증에 대해 시험했다. 혈당 레벨은 실험군에서 및 대조군에서 각각 120 및 112 mg/dl이다.

마우스 요중3DF 레벨의 예비 측정 결과, 예상 한 것과 같이 본원에 기재된 당화 식이를 공급하였을 때 전체 3DF의 실질적인 증가를 나타내었다(약 5 내지 10배).

실시예 12

프럭토오스 리신 경로의 발암 효과

프럭토오스 리신 경로에서 형성된 대사체의 발암능력을 조사하기 위해, 신장 암종에 대해 높은 감수성을 지닌 래트 종에서 실험을 수행했다. 4마리의 래트에는 당화 단백질 식이를 공급하고 3마리의 래트에는 대조 식이를 공급했다. 10주간 식이를 공급한 후 동물을 치사시키고 이들의 신장을 검사했다. 당화 식이를 공급한 4마리의 동물 모두에서 1 mm이상 크기의 암종이 발견된 반면, 대조 동물에서는 그렇게 큰 병변이 발견되지 않았다. 이것이 우연히 발생할 가능성은 2% 미만이다. 이 데이터는, 신장 세뇨관 세포(대부분의 신장 암종의 기원이 되는 세포로 알려져 있음)에서 발견된 동물 식이중의 당화 단백질로부터 생겨난 과량의 프럭토오스리신에 기인한 높은 3DG 레벨은 세포의 DNA와 상호작용하여 다양한 돌연변이를 일으켜 결과적으로 발암성 결과를 유발한다는 것을 보여준다. 상기 과정이 신장 및 기타 부위에서 사람의 암을 발병하는 데 중요한 역할을 할 가능성이 존재한다.

본 발명의 특정 구체예를 앞에서 기재하였거나 예를 들었으나, 다양한 다른 구체예가 앞서 개시한 것으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로, 본 발명은 기재되고 및/또는 예시된 특정 구체예에 한정되지 않고, 첨부된 청구 범위로부터 이탈되지 않는 변화 및 개질을 생각할 수 있다.

Claims

프럭토오스-리신에서 프럭토오스-리신-3-포스페이트로의 효소적 전환을 저해하는 데 유효한 효소 저해 활성을 가진 화합물로서, 상기 활성은 예정된 양의 프럭토오스-리신, 아데노신 트리포스페이트, 프럭토오스-리신-3-포스페이트 키나아제의 공급원 및 상기 화합물을 함유하는 수용액을 제공하는 단계, 상기 키나아제, 프럭토오스-리신 및 아데노신 트리포스페이트의 상호 작용의 생성물로서 프럭토오스-리신-3-포스페이트 및 아데노신 디포스페이트의 형성을 촉진하는 조건에 상기 용액을 적용시키는 단계, 하나 이상의 상기 생성물의 생성을 측정하는 단계로서, 상기 화합물을 첨가하지 않고 동일한 상대적인 양의 프럭토오스-리신, 아데노신 트리포스페이트 및 프럭토오스-리신-3-포스페이트 키나아제의 공급원의 수용액과 비교하여, 상기 화합물이 상기 생성물의 양을 감소시키는 단계를 포함하는 분석 방법에 의해 측정되는 화합물.
제1항에 있어서,

프럭토오스-리신-3-포스페이트 키나아제의 공급원이 신장 조직인 화합물.
제1항에 있어서,

프럭토오스-리신-3-포스페이트 키나아제의 공급원이 적혈구 또는 이들의 전구세포(progenitor)인 화합물.
제1항에 있어서,

프럭토오스-리신-3-포스페이트 키나아제의 공급원이 말초 신경 조직인 화합물.
제1항에 있어서,

프럭토오스-리신-3-포스페이트 키나아제의 공급원이 수정체 조직인 화합물.
제1항에 있어서,

프럭토오스-리신-3-포스페이트의 공급원이 췌장 조직인 화합물.
제1항에 있어서,

상기 화합물이 경쟁적 또는 비경쟁적 효소 저해를 나타내고, 저해 상수(Ki)가 약 1 mM 미만인 화합물.
제1항에 있어서,

(ⅰ) 약 2,000 달톤 미만의 분자량; (ⅱ) 10 μM이상의 생리 식염액 또는 혈청 중의 용해도; 및 (ⅲ) 1시간 이상 생리 식염액 또는 혈청 중에서 배양한 후 효소 저해 활성의 50% 이상을 유지하는 특징을 추가로 갖는 화합물.
하기의 화학식을 가진 화합물 및 이 화합물의 이성체와 약학적 허용염:

상기 식에서, X는 -NR′- 또는 -O-이고, R′는 H 및 직쇄 또는 분지쇄 알킬기 (C₁-C₄) 및 미치환되거나 또는 치환된 아릴 기(C₆-C₁₀) 또는 아랄킬기 (C₇-C₁₀)로 구성된 군에서 선택되고; R은 H, 아미노산 잔기, 폴리아미노산 잔기, 펩티드쇄, 질소 또는 산소를 함유하는 하나 이상의 치환체로 치환되거나 또는 미치환된 직쇄 또는 분지쇄 지방족기 (C₁-C₈), 질소 또는 산소를 함유하는 하나 이상의 치환체로 치환되거나 또는 미치환되고 하나 이상의 -O-, -NH-, 또는 -NR" 부에 의해 차단되는 직쇄 또는 분지쇄 지방족기 (C₁-C₈)로 구성된 군에서 선택되는 치환체인데, 여기서 R"는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기 (C₁-C₆) 및 미치환되거나 또는 치환된 아릴기 (C₆-C₁₀) 또는 아랄킬기 (C₇-C₁₀)이며, X가 -NR′-, R 및 R′를 나타낼 때 그들이 부착된 질소원자와 함께 5 내지 7개의 고리 원자를 갖는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클 고리를 또한 나타낼 수 있으며 여기서 하나 이상의 질소와 산소가 상기 고리에서 유일한 헤테로 원자이며, 상기 아릴기(C₆-C₁₀) 또는 아랄킬기 (C₇-C₁₀) 및 상기 헤테로사이클의 고리 치환체는 H, 알킬 (C₁-C₆), 할로겐, CF₃, CN, NO₂및 -O-알킬 (C₁-C₆)로 구성된 군에서 선택되며; R₁은 1 내지 4개의 직선상 탄소 원자를 가진 폴리올 부이고; Y는 카르보닐 부또는 히드록시메틸렌 부이고; Z는 -H, -O-알킬 (C₁-C₆), -할로겐, -CF₃. -CN, -COOH 및 -SO₃H₂로 구성된 군에서 선택된다.
활성제로서 제1항에 따른 화합물과 약학적 허용 비이클(vehicle)을 포함하는, 당뇨병 환자에서 당뇨병성 합병증의 발병을 예방, 감소 또는 지연시키기 위한 약학적 제제.
제10항에 있어서,

항고혈압제 및 추가 활성제를 부가적으로 포함하는 약학적 제제.
제10항에 있어서,

액체 형태의 약학적 제제.
제12항에 있어서,

상기 약학적 허용 비이클은 상기 활성제가 용해될 수 있는 액체인 약학적 제제.
제10항에 있어서,

정제 형태의 약학적 제제.
제14항에 있어서,

상기 정제가 시간에 따라 방출되는 코팅(time-release coating)을 가진 약학적 제제.
제14항에 있어서,

상기 정제가 장용 코팅(enteric coating)을 가진 약학적 제제.
당뇨병성 합병증을 발병할 위험이 있는 환자에서 상기 합병증의 발병을 예방, 감소 또는 지연시키는 방법으로서, 프럭토오스-리신에서 프럭토오스-리신-3-포스페이트로의 효소적 전환을 저해하는 데 유효한 화합물을 상기 전환을 저해하기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제17항에 있어서,

상기 화합물이 하기의 화학식을 가진 화합물 및 이 화합물의 이성체와 약학적 허용염인 방법:

상기 식에서, X는 -NR′- 또는 -O-이고, R′는 H 및 직쇄 또는 분지쇄 알킬기 (C₁-C₄) 및 미치환되거나 또는 치환된 아릴 기(C₆-C₁₀) 또는 아랄킬기 (C₇-C₁₀)로 구성된 군에서 선택되고; R은 H, 아미노산 잔기, 폴리아미노산 잔기, 펩티드쇄, 질소 또는 산소를 함유하는 하나 이상의 치환체로 치환되거나 또는 미치환된 직쇄 또는 분지쇄 지방족기 (C₁-C₈), 질소 또는 산소를 함유하는 하나 이상의 치환체로 치환되거나 또는 미치환되고 하나 이상의 -O-, -NH-, 또는 -NR" 부에 의해 차단되는 직쇄 또는 분지쇄 지방족기 (C₁-C₈)로 구성된 군에서 선택되는 치환체인데, 여기서 R"는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기 (C₁-C₆) 및 미치환되거나 또는 치환된 아릴기 (C₆-C₁₀) 또는 아랄킬기 (C₇-C₁₀)이며, X가 -NR′-, R 및 R′를 나타낼 때 그들이 부착된 질소원자와 함께 5 내지 7개의 고리 원자를 갖는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클 고리를 또한 나타낼 수 있으며 여기서 하나 이상의 질소와 산소가 상기 고리에서 유일한 헤테로 원자이며, 상기 아릴기(C₆-C₁₀) 또는 아랄킬기 (C₇-C₁₀) 및 상기 헤테로사이클의 고리 치환체는 H, 알킬 (C₁-C₆), 할로겐, CF₃, CN, NO₂및 -O-알킬 (C₁-C₆)로 구성된 군에서 선택되며; R₁은 1 내지 4개의 직선상 탄소 원자를 가진 폴리올 부이고; Y는 카르보닐 부또는 히드록시메틸렌 부이고; Z는 -H, -O-알킬 (C₁-C₆), -할로겐, -CF₃. -CN, -COOH 및 -SO₃H₂로 구성된 군에서 선택된다.
제18항에 있어서,

상기 화합물은 메글루민, 소르비톨리신, 만니톨리신 및 갈락티톨리신으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물인 방법.
제17항에 있어서,

상기 화합물을 추가 활성제로서 항고혈압제와 함께 투여하는 방법.
제17항에 있어서,

상기 당뇨병에 관련된 병적 상태가 당뇨병성 신증, 당뇨병성 망막증, 또는 당뇨병성 말초 신경장애로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제17항에 있어서,

상기 화합물을 경구적으로 투여하는 방법.
당뇨병 환자가 당뇨병에 관련된 병적 상태에 걸릴 위험을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은 체중 kg당 약 0.05 내지 약 0.3 g 이상의 당화-리신 잔기를 제공하는 양의 당화-리신 잔기의 공급원을 상기 환자에게 투여하는 단계, 및 당뇨병의 임상적 증후가 없는 피검체 중 3-데옥시글루코손 대 3-데옥시프럭토오스의 비를 기준으로 하여, 환자에서 얻은 하나 이상의 생물학적 샘플 중에서 3-데옥시글루코손 대 3-데옥시프럭토오스의 비를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 무증후성 개체와의 비교시 당뇨병 환자의 경우 3-데옥시글루코손 대 3-데옥시프럭토오스의 비가 더 높은 것은 당뇨병에 관련된 병적 상태에 걸릴 위험이 크다는 것을 나타내는 방법.
제23항에 있어서,

상기 당뇨병에 관련된 병적 상태가 당뇨병성 신증, 당뇨병성 망막증 또는 당뇨병성 말초 신경장애로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제23항에 있어서,

당화-리신 잔기의 공급원을 상기 당뇨병 환자에게 경구적으로 투여하는 방법.
제23항에 있어서,

상기 생물학적 샘플이 요(urine)인 방법.
당뇨병 환자가 당뇨병과 관련된 병적 상태에 걸릴 위험을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은 당뇨병의 임상적 증후가 없는 절식한 개체 중 3-데옥시글루코손 대 3-데옥시프럭토오스의 비를 기준으로 하여, 절식 기간 후 상기 환자에서 얻은 하나 이상의 생물학적 샘플 중에서 3-데옥시글루코손 대 3-데옥시프럭토오스의 비를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 당뇨병 환자에서 3-데옥시글루코손 대 3-데옥시프럭토오스의 비가 높은 것은 당뇨병 환자가 당뇨병과 관련된 합병증을 발병할 위험이 크다는 것을 나타내는 방법.
제27항에 있어서,

상기 당뇨병과 관련된 병적 상태는 당뇨병성 신증, 당뇨병성 망막염 또는 당뇨병성 말초 신경장애로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제27항에 있어서,

상기 당화-리신 잔기의 공급원을 상기 당뇨병 환자에게 경구 투여하는 방법.
제27항에 있어서,

상기 생물학적 샘플이 요인 방법.
당뇨병성 합병증을 예방하는 데 치료적 개입의 효능을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은 치료적 개입을 시작하기 전후에 상기 당뇨병 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 중에서 3-데옥시글루코손, 3-데옥시프럭토오스 및 프럭토오스-리신의 농도를 측정하는 단계 및 상기 샘플 중에서 3-데옥시글루코손 및 3-데옥시프럭토오스 농도의 합을 프럭토오스-리신의 농도와 비교하는 단계를 포함하며, 치료적 개입을 시작하기 전에 취한 생물학적 샘플에 비해 치료적 개입을 시작한 후에 취한 생물학적 샘플 중에서 프럭토오스-리신의 농도에 비례하여 3-데옥시글루코손 및 3-데옥시프럭토오스 농도의 합의 감소는 상기 치료적 개입의 효능을 나타내는 방법.
제31항에 있어서,

상기 생물학적 샘플이 요인 방법.
제31항에 있어서,

절식 기간 이후에 상기 생물학적 샘플을 얻는 방법.
제31항에 있어서,

체중 kg 당 0.05 내지 약 0.3 g의 당화 리신을 함유하는 당화 리신의 공급원을 경구 투여한 후 상기 생물학적 샘플을 얻는 방법.
당뇨병에 관련된 병적 상태를 발병시키는 포장된 음식물의 능력을 당뇨병 환자에게 알리는 방법으로서, 상기 음식물 중 당화-리신 잔기의 함량을 측정하는 단계, 및 음식물의 포장에 또는 당뇨병 환자에 의해 사용되는 것을 목적으로 하는 간행물 중에 상기 측정의 결과를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
AGE-단백질의 형성에 의해 유발되는 환자의 병적 상태를 예방하는 방법으로서, 환자에 의한 3-데옥시글루코손의 생성을 저해하는 화합물의 치료적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제36항에 있어서,

상기 병적 상태가 고혈압, 졸증, 알츠하이머형의 노인성 치매와 같은 신경퇴행성 질병, 순환 장애, 죽상동맥경화증, 골관절염, 백내장으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제36항에 있어서,

상기 화합물은 하기의 화학식을 가진 화합물 및 이 화합물의 이성체와 약학적 허용염인 방법:

상기 식에서, X는 -NR′- 또는 -O-이고, R′는 H 및 직쇄 또는 분지쇄 알킬기 (C₁-C₄) 및 미치환되거나 또는 치환된 아릴 기(C₆-C₁₀) 또는 아랄킬기 (C₇-C₁₀)로 구성된 군에서 선택되고; R은 H, 아미노산 잔기, 폴리아미노산 잔기, 펩티드쇄, 질소 또는 산소를 함유하는 하나 이상의 치환체로 치환되거나 또는 미치환된 직쇄 또는 분지쇄 지방족기 (C₁-C₈), 질소 또는 산소를 함유하는 하나 이상의 치환체로 치환되거나 또는 미치환되고 하나 이상의 -O-, -NH-, 또는 -NR" 부에 의해 차단되는 직쇄 또는 분지쇄 지방족기 (C₁-C₈)로 구성된 군에서 선택되는 치환체인데, 여기서 R"는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기 (C₁-C₆) 및 미치환되거나 또는 치환된 아릴기 (C₆-C₁₀) 또는 아랄킬기 (C₇-C₁₀)이며, X가 -NR′-, R 및 R′를 나타낼 때 그들이 부착된 질소원자와 함께 5 내지 7개의 고리 원자를 갖는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클 고리를 또한 나타낼 수 있으며 여기서 하나 이상의 질소와 산소가 상기 고리에서 유일한 헤테로 원자이며, 상기 아릴기(C₆-C₁₀) 또는 아랄킬기 (C₇-C₁₀) 및 상기 헤테로사이클의 고리 치환체는 H, 알킬 (C₁-C₆), 할로겐, CF₃, CN, NO₂및 -O-알킬 (C₁-C₆)로 구성된 군에서 선택되며; R₁은 1 내지 4개의 직선상 탄소 원자를 가진 폴리올 부이고; Y는 카르보닐 부또는 히드록시메틸렌 부이고; Z는 -H, -O-알킬 (C₁-C₆), -할로겐, -CF₃. -CN, -COOH 및 -SO₃H₂로 구성된 군에서 선택된다.
제38항에 있어서,

상기 화합물은 메글루민, 소르비톨리신, 만니톨리신 및 갈락티톨리신으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물인 방법.
시험 동물에서 병적 상태를 유발하는 방법으로서, 상기 병적 상태는 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경장애, 당뇨병성 거대혈관병증, 당뇨병성 망막증, 심혈관의 질병, 신경퇴행성 질병, 인슐린 의존형 당뇨병, 당뇨병에 관련된 출산 결손(birth defect) 및 암으로 구성된 군에서 선택되며, 상기 방법은 당화 단백질이 거의 없는 식이를 공급한 동일한 종의 동물에서 얻은 생물학적 유체 중 3DG의 함량에 대하여 시험 동물의 생물학적 유체중 3DG의 함량을 유지하기에 충분한 양 및 시간동안 시험 동물에게 당화 단백질 식이를 공급하는 것을 포함하는 방법.